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CN116059401B - 一种双功能纳米探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种双功能纳米探针及其制备方法和应用 Download PDF

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CN116059401B CN202310148588.4A CN202310148588A CN116059401B CN 116059401 B CN116059401 B CN 116059401B CN 202310148588 A CN202310148588 A CN 202310148588A CN 116059401 B CN116059401 B CN 116059401B
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Abstract

本发明公开了一种双功能纳米探针，所述的双功能纳米探针为CICe@M‑K，包括负载在介孔硅/二氧化铈复合纳米球内的姜黄素和IR780碘化物，及连接在介孔硅/二氧化铈复合纳米球外层的K肽；所述K肽的序列为CKLVFFAED。本发明提供的双功能纳米探针CICe@M‑K，可以从两个不同途径协同作用治疗阿尔兹海默症，同时起到抑制Aβ聚集和缓解氧化应激的效果。

Description

一种双功能纳米探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种双功能纳米探针及其制备方法和应用。
背景技术
随着世界人口老龄化加剧，作为一种典型的神经退行性疾病，阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease，AD)引起了广泛的关注。β-淀粉样蛋白(Aβ)是AD众多标志物中的一种，它是由淀粉样蛋白前体(APP)被β-和γ-分泌酶剪切而产生的。正常生理条件下，Aβ的产生和降解是处于动态平衡的；但在病理条件下，可溶性的Aβ会发生错误折叠和聚集，最终形成不可溶的老年斑。这些沉积会促进神经细胞产生活性氧(ROS)，增加脑部环境的氧化压力，诱导神经元细胞坏死，从而加重患上AD的风险。研究表明Aβ聚集是AD发病的关键步骤，且老年斑是重要的临床症状。所以，清除细胞内的ROS和抑制Aβ聚集是治疗AD的有效手段。
姜黄素(Cur)是一种多酚类小分子，具有优异的抗氧化、抗炎、抑制Aβ聚集和解聚淀粉样蛋白纤维(Aβf)性能，被认为是治疗AD的理想药物。但因其疏水，大大限制了其在生物医学方面的应用。二氧化铈纳米粒子(CeO2 NPs)同时具有超氧化物歧化酶(SOD)和催化酶(CAT)的性质，被认为是优秀的生物抗氧化纳米材料。在生理条件下，CeO2 NPs可以将具有细胞毒性的ROS(如：单线态氧1O2和过氧化氢H2O2)转化为无毒的H2O和O2。尤其是小粒径的CeO2 NPs,因为有着更大的比表面积，抗氧化能力更强。
然而目前有关AD的研究中，复杂的脑部环境和血脑屏障(BBB)限制大多数药物分子和小粒径纳米材料在脑部的渗透和利用，药物难以在脑内分布仍是治疗AD的难点。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种双功能纳米探针CICe@M-K。
本发明还要解决的技术问题是提供了上述双功能纳米探针的制备方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供了上述双功能纳米探针在治疗阿尔兹海默症中的应用。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种双功能纳米探针所述的双功能纳米探针为CICe@M-K，包括负载在介孔硅/二氧化铈复合纳米球内的姜黄素和IR780碘化物，及连接在介孔硅/二氧化铈复合纳米球外层的K肽；所述K肽的序列为CKLVFFAED。
介孔硅(MSNs)作为一种无机多孔材料，具有优秀的载药能力，可以将小分子药物装载在其孔道内，提高小分子药物穿越血脑屏障(BBB)的能力；同时，MSNs无毒、生物相容性好、表面易功能化。
CICe@M-K可通过两种不同的途径协同作用于阿尔兹海默症：(1)K肽和Cur靶向Aβ并抑制Aβ聚集；(2)CeO2 NPs和Cur协同清除ROS，缓解脑部氧化压力。
本发明还提供了上述双功能纳米探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将氨基化介孔硅纳米颗粒和羧基化二氧化铈纳米粒子溶于DMF溶液中，混合均匀，反应结束后得到复合纳米球溶液，记为Ce@M；
本步骤中，氨基化后的介孔硅纳米颗粒和羧基化后的二氧化铈纳米粒子通过酰胺反应复合得到Ce@M；
(2)将姜黄素、IR780碘化物粉末与Ce@M溶液混合均匀，得到内腔载药的Ce@M纳米球，记为CICe@M；
(3)将K肽通过Sulfo-SMCC连接在CICe@M上，即得到双功能纳米探针CICe@M-K；所述的K肽的序列为CKLVFFAED。
进一步地，步骤(1)还包括水解硅酸四乙酯制备固体介孔硅纳米颗粒和使其氨基化的步骤。
进一步地，所述制备固体介孔硅的步骤包括：所述制备固体介孔硅的步骤包括：将十六烷基三甲基氯化铵、三乙胺和超纯水混合，得到混合溶液，加入硅酸四乙酯，反应结束后离心，去除十六烷基三甲基氯化铵后，得到的沉淀为固体介孔硅纳米颗粒。
进一步地，所述混合溶液的反应温度为95℃，反应条件为1000rmp min-1搅拌1小时。
进一步地，步骤(1)还包括制备二氧化铈纳米粒子和使其羧基化的步骤。所述的二氧化铈纳米粒子由油胺制备得到，直径约为3nm。
进一步地，所述制备二氧化铈纳米粒子的步骤包括：将醋酸钠和油胺加入到对二甲苯中室温下剧烈搅拌24小时得到混合溶液，升温至90℃后加入超纯水，老化3h。
进一步地，步骤(2)中所述的混合条件为避光、振荡条件下反应24小时。
进一步地，步骤(3)的具体步骤包括：将Sulfo-SMCC加入CICe@M，反应结束后得到CICe@M-S；再将K肽加入CICe@M-S，反应结束后得到CICe@M-K。
本发明还提供了上述双功能纳米探针在制备治疗阿尔兹海默症的药物或试剂中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明提供的双功能纳米探针CICe@M-K，可以从两个不同途径协同作用治疗阿尔兹海默症，同时起到抑制Aβ聚集和缓解氧化应激的效果。
附图说明
图1为纳米材料的表征结果图，其中，A为MSNs修饰氨基(-NH2)前后的红外图谱；B为MSNs修饰氨基(-NH2)前后的DLS分析图像；C为MSNs、MSNs-NH2、BMPA-CeO2、Ce@M的Zeta电位分析图；D为MSNs的HRTEM图像；E为CeO2 NPs的HRTEM图；F为Ce@M的HRTEM图像；G为Ce@M的STEM的图像；H为Si元素的EDX元素映射图；I为Ce元素的EDX元素映射图。数据以平均值±标准差表示。
图2为纳米探针抑制Aβ聚集的体外验证相关结果图，其中，A为Aβf形成的时间曲线图；B为CICe@M-K抑制Aβ聚集的荧光谱图；C为CICe@M-K抑制Aβ聚集的ThT荧光强度；D为CICe@M-K抑制Aβ聚集的STEM图像。数据以平均值±标准差表示。****p<0.0001。
图3为CICe@M-K的生物相容性和抗氧化能力测试相关结果图，其中，A为PC12细胞随探针浓度变化的存活率；B为PC12细胞随探针孵育时间变化的存活率；C为PC12细胞随探针H2O2浓度变化的存活率；D为CICe@M-K抗氧化能力测试的荧光共聚焦图像；E为定量监测PC12细胞凋亡的流式图(图D/E的实验对象用对照(PC12细胞液)、H2O2、CICe@M-K、H2O2+CICe@M-K和H2O2+CICe@M-K+NIR处理并孵育的PC12细胞)。
图4为纳米探针缓解Aβo诱导的PC12细胞氧化损伤相关结果测定图(实验对象为用对照(PC12细胞液)、Aβo、Aβo+CICe@M-K和Aβo+CICe@M-K+NIR处理并孵育的PC12细胞),其中，A为Aβo诱导PC12细胞产生ROS的荧光共聚焦图像；B为Aβo诱导PC12细胞产生ROS的流式图像；C为Aβo诱导PC12细胞产生ROS的DCF荧光值；D为Aβo诱导的PC12细胞线粒体膜电位变化的结果图；E为定量监测PC12细胞凋亡的流式图。比例尺为50μm。数据以平均值±标准差表示。****p<0.0001。
图5为纳米探针穿越BBB的相关结果测定图。其中，A为ELISA试剂盒测定K肽对Aβo的靶向性；B为体外模拟BBB构建的血脑屏障示意图；C为CICe@M和CICe@M-K穿越BBB的穿透效率的荧光共聚焦图。比例尺为50μm。数据以平均值±标准差表示。
图6为体内秀丽隐杆线虫分析相关结果图，其中，A为N2野生型菌株中Aβo的ThT染色图；B为CL 2006菌株中Aβo的ThT染色图；C为CL 2006+CICe@M-K菌株中Aβo的ThT染色图；D为CL 2006+CICe@M-K+NIR菌株中Aβo的ThT染色图(箭头表示Aβo斑块)；E为CL2006菌株的生存曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
本实验中用到的试剂和仪器：
十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、硅酸四乙酯(TEOS)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、醋酸钠、对二甲苯(98.5％)、2-溴代异丁酸(BMPA)购买于阿拉丁(中国)。醋酸钠、醋酸钠、油胺、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)购于中国国药控股化学试剂有限公司。IR780碘化物、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)、姜黄素(Cur)购于麦克林生化科技股份有限公司(中国，上海)。硫黄素T(ThT)购买于Sigma-Aldrich(中国北京)。CCK-8试剂盒和5,5'，6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基-吡达碳菁碘化(JC-1)检测试剂盒由碧云天生物技术有限公司(中国上海)提供。K肽(序列：CKLVFFAED)购自金斯瑞生物技术有限公司(中国南京)。Aβ42和Aβ42酶联免疫试剂盒由生工生物技术有限公司(中国上海)提供(实施例中所使用的Aβo为Aβ42制备得到)。Dulbecco’s ModifiedEagle培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)和Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。
Talos F200X高分辨透射电镜(赛默飞科技，美国)、多角度粒度电位分析仪(NanoBrook Omni，Brookhaven，美国)、荧光分光光度计(fluormax-4，HORIBA Jobin Yvon，日本)、傅里叶红外光谱仪(NICOLET iS10，赛默飞科技，美国)、激光共聚焦扫描显微镜(CLSM，fluviewtm FV1000，奥林巴斯，日本)、酶标仪(Multiskan，赛默飞科技，美国)、流式细胞仪(BD Bioscience，美国)。
本发明所有的实施例中的PBS的pH为7.4，按137mM NaCl、10mM NaH2PO4、2.7mMKCl、2mM KH2PO4的配比混合制备。线虫生长培养基(NGM)的pH为6.0，按1mM CaCl2、1mMMgSO4、5mg L-1胆固醇、250mM KH2PO4、17g L-1琼脂、2.5g L-1蛋白胨和3g L-1NaCl的配比混合得到。其余溶液均是在超纯水中溶解得到。
实施例1双功能纳米探针的制备和表征
1、双功能纳米探针的制备
将25％的十六烷基三甲基氯化铵(CTAC，2g)、三乙胺(TEA，0.8g)和超纯水(95℃，20mL)加入圆底烧瓶中，并放入95℃的水浴锅，以1000rmp min-1的速度搅拌1h；用流动泵以200mg min-1的速度注入1.5mL硅酸四乙酯(TEOS)，继续搅拌1h，随后进行离心分离(1000rpm,10min)。得到的沉淀用乙醇和超纯水分别洗涤三次，然后用盐酸和乙醇的混合溶液(体积比1:10)分散回流12h(80℃)，去模板CTAC。制备得到固体介孔硅纳米颗粒(MSNs)。将25mg固体MSNs和100μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)加入到25mL乙醇溶液中，回流4h(80℃)，通过离心(13000rpm,5min)收集产物，得到氨基化的MSNs(MSNs-NH2)。
将0.43g醋酸钠和3.2g油胺加入到15mL对二甲苯中，剧烈搅拌24h。将混合溶液缓慢升温至90℃后迅速加入1mL超纯水，继续在90℃的温度下老化3h。通过离心(13000rpm,30min)收集产物(CeO2 NPs)。将0.5g 2-溴代异丁酸(BMPA)、0.05g醋酸钠和15mg CeO2 NPs加入到15mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和氯仿的混合溶液(体积比1:1)，在30℃水浴环境中搅拌6h，得到产物为羧基化的二氧化铈纳米粒子BMPA-CeO2 NPs。
将5mg MSNs-NH2和15mg BMPA-CeO2 NPs溶于DMF中，搅拌3h，通过离心(1000rpm,10min)收集产物(Ce@M)，并用水和乙醇分别洗3次。
将3mg Ce@M、60mL Cur(10mg mL-1)和15mL IR780(1mg mL-1)加入到3mL PBS中，在黑暗条件下振荡12-24h。通过离心(1000rpm,10min)除去过量的Cur和IR780，得到产物CICe@M。
将5μL Sulfo-SMCC(20mg mL-1)加入到100μL CICe@M(1mg mL-1)中，振荡2h后，加入100μL K肽溶液(1mg mL-1)，继续在4℃下振荡12h。通过离心(1000rpm,10min)得到双功能纳米探针CICe@M-K。
2、CICe@M-K的表征
用傅里叶红外光谱(FTIR)仪和动态光散射(DLS)对MSNs和MSNs-NH2进行了表征(图1A和1B)。用高分辨透射电镜(HRTEM)对制备的双功能纳米探针及各中间产物的粒径和形貌特征进行了表征。MSNs-NH2的直径约为60nm(图1D)。CeO2 NPs的直径约为3nm(图1E)。形成的复合纳米颗粒尺寸略大于MSNs-NH2的尺寸(图1F)。通过zeta电位测量、扫描透射电子显微镜(STEM)、EDX能谱来验证CICe@M-K的修饰过程(图1C、1G和1H-I)。
实施例2纳米探针对体外Aβ聚集抑制的评估
本发明中所使用的K肽CKLVFFAED是一种可以靶向Aβ并进一步抑制Aβ聚集的肽。
Cur是一种疏水性药物小分子，具有抗氧化能力，同时可以靶向Aβ并进一步抑制Aβ聚集。
IR780是一种光敏剂，可以在808nm的近红外(NIR)光照下产生热量，促进Cur从MSNs中释放。
ThT是一种荧光小分子，本身荧光很弱，可以与Aβ聚集物结合并发出强荧光，与Aβ单体的结合能力弱，几乎不发光。
本实施例首先对Aβ聚集物Aβf的形成的时间进行了测定，将Aβ42在37℃水浴锅孵育(图2A)，结果表明48h即可形成Aβ聚集物。本实施例采用经典的硫黄素T(ThT)法测定CICe@M-K对抑制Aβ的聚集能力。将Aβ、Aβ+CICe@M-K在37℃下共孵育48h，然后加入ThT。与对照组(Aβ42)相比，CICe@M-K具有明显抑制Aβ聚集的能力，同时NIR照射有利于Cur的释放，进一步增强了CICe@M-K抑制Aβ聚集的能力(图2B和2C)。STEM成像也说明CICe@M-K具有抑制Aβ聚集的能力，且NIR照射可以增强CICe@M-K对Aβ聚集的抑制。
实施例3纳米探针对体外ROS清除的测定
本实施例选取PC12细胞为模型验证CICe@M-K对ROS的清除作用。配置浓度分别为25μg mL-1、50μg mL-1、100μg mL-1、150μg mL-1的Cur和CICe@M-K溶液用于细胞毒性测定。选用CCK-8作为活细胞指示剂，细胞增殖的越多越快，颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。结果如图3A和3B所示，Cur和CICe@M-K对PC12的毒性较小。
本实施例还对H2O2的浓度进行了筛选。配置浓度分别为50μM、100μM、150μM、200μM、300μM的H2O2，与PC12细胞共培养，当H2O2浓度达到200μM时，细胞存活率将不足80％(图3C)。
本实施例还采用共聚焦显微成像技术对CICe@M-K在细胞水平清除ROS的能力进行了评估。DCFH-DA是一种ROS敏感探针，通常用于测定细胞内的ROS水平，DCFH-DA本身没有荧光，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH，再由细胞内的ROS将非荧光的DCFH氧化成有荧光的DCF。因此，细胞内ROS含量越高，DCF荧光强度越大。实验对象用对照(PC12细胞液)、H2O2、CICe@M-K、H2O2+CICe@M-K和H2O2+CICe@M-K+NIR处理并孵育的PC12细胞。从图3D可以看出，相比于对照组，H2O2组的荧光信号明显增强，但在加入CICe@M-K后，DCF的绿色荧光大幅降低，H2O2+CICe@M-K+NIR组荧光则进一步降低，说明双功能纳米探针CICe@M-K具有良好的ROS清除能力。同时细胞凋亡实验也证明了这一观点(图3E)。选用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒来进行细胞凋亡实验，Annexin V-FITC可以进入坏死细胞的细胞浆内，与位于细胞膜内侧的磷脂酰胺丝氨酸结合，从而使坏死细胞呈现绿色荧光。
实施例4缓解Aβo诱导的神经元细胞损伤
Aβ的错误折叠和异常聚集(形成Aβo)会引起脑内ROS的产生，反过来，ROS的增加又会加剧Aβ的错误折叠和异常聚集，从而加重AD的发生。本实施例同样选择DCFH-DA作为ROS的指示剂，通过DCF荧光的强弱来判断神经元细胞内ROS含量的多少，从而评估CICe@M-K的ROS清除能力和Aβ聚集抑制能力。分别用对照、Aβo、Aβo+CICe@M-K和Aβo+CICe@M-K+NIR处理并孵育PC12细胞。从图4A可以看出，Aβo确实可以诱导细胞内ROS增加，而CICe@M-K可以抑制这种增加，NIR照射后，DCF的荧光进一步降低，说明近红外光照有利于Cur的释放。与此同时，通过流式细胞仪的测量结果也可以证明CICe@M-K可以降低Aβo诱导的神经细胞毒性(图4B和4C)。
此外，线粒体膜电位(MMP)也可以用来评判细胞凋亡。选用5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基-吡达碳菁碘化(JC-1)作为指示剂，在细胞未受损时，MMP处于正常状态，JC-1呈聚集状，显红色；当细胞受损时，MMP异常，JC-1以单体形式存在，显绿色。从图4D可以看出，对照组的MMP正常，在共聚焦显微镜下呈红色；当Aβo存在时，细胞MMP异常，主要呈绿色；当加入CICe@M-K后，绿色减弱，红色增强，说明CICe@M-K可以缓解Aβo造成的细胞损伤；NIR照射后，该损伤得到进一步缓解，绿色荧光更弱，红色荧光更强。同时，流式细胞仪得到的凋亡数据也可以证明CICe@M-K具有缓解Aβo诱导的神经元细胞损伤的能力(图4E)。
实施例5纳米探针穿越血脑屏障(BBB)的测定
本实施例首先用Aβ42酶联免疫试剂盒探究了K肽CKLVFFAED对Aβ的靶向能力。配置浓度分别为10mg mL-1、20mg mL-1、30mg mL-1和40mg mL-1的CICe@M-K和CICe@M溶液用于测定。结果如图5A所示，CICe@M-K组对Aβo的捕获率远高于CICe@M组，且随着浓度从0增加到20mg mL-1，CICe@M-K对Aβo的捕获率不断增加。
本实施例利用脑内皮细胞bEnd.3和神经元细胞PC12构建了一个体外的BBB模型(图5B)，在Transwell小室的上层培养致密的bEnd.3细胞层模拟BBB，下层共培养PC12细胞。在上层培养基中加入FAM标记的纳米探针CICe@M-K或CICe@M，通过检测下层PC12细胞中FAM的荧光强度来判定其穿越BBB的能力。结果如图5C所示，CICe@M-K组荧光强度明显高于CICe@M组，说明K肽CKLVFFAED的修饰有利于纳米探针穿越BBB。
实施例6秀丽隐杆线虫实验进行体内评估
CL2006是一种转基因秀丽隐杆线虫，在20℃温度诱导下肌肉组织特异性表达人类Aβ42，Aβ42在肌肉组织中聚集，最终导致线虫麻痹瘫痪。秀丽隐杆线虫的所有基因已被测序，且与人的基因组有70％的相似度，常被用做体外细胞水平到体内小鼠水平复筛药物的桥梁。
本实施例用ThT对秀丽隐杆线虫CL2006进行了染色实验，野生型秀丽隐杆线虫N2作为对照组。实验结果如图6所示，相比于野生型N2菌株，CL2006菌株呈现更多的Aβo斑块(图6B)。加入纳米探针CICe@M-K后，Aβo斑块明显减少(图6C)。在NIR照射释药后，CICe@M-K的作用加强，Aβo斑块进一步减少(图6D)。同时，麻痹实验结果也表明CICe@M-K可以将CL2006菌株的寿命从12天延长至14天；NIR光照释药后，进一步延长至17天。以上结果说明，CICe@M-K纳米探针可以有效延长AD线虫的寿命。

Claims (10)

1.一种双功能纳米探针，其特征在于，所述的双功能纳米探针为CICe@M-K，包括负载在介孔硅/二氧化铈复合纳米球内的姜黄素和IR780碘化物，及连接在介孔硅/二氧化铈复合纳米球外层的K肽；所述K肽的序列为CKLVFFAED；
所述介孔硅/二氧化铈复合纳米球通过以下方法制备得到：将氨基化的介孔硅纳米颗粒和羧基化的二氧化铈纳米粒子溶于DMF溶液中，混合均匀，反应结束后得到介孔硅/二氧化铈复合纳米球溶液。
2.权利要求1所述的双功能纳米探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将氨基化的介孔硅纳米颗粒和羧基化的二氧化铈纳米粒子溶于DMF溶液中，混合均匀，反应结束后得到介孔硅/二氧化铈复合纳米球溶液，记为Ce@M；
（2）将姜黄素、IR780碘化物粉末与Ce@M溶液混合均匀，得到内腔载药的Ce@M纳米球，记为CICe@M；
（3）将K肽通过Sulfo-SMCC连接在CICe@M上，即得到双功能纳米探针CICe@M-K；所述的K肽的序列为CKLVFFAED。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）还包括水解硅酸四乙酯制备固体介孔硅纳米颗粒和使其氨基化的步骤。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备固体介孔硅的步骤包括：将十六烷基三甲基氯化铵、三乙胺和超纯水混合，得到混合溶液，加入硅酸四乙酯，反应结束后离心，去除十六烷基三甲基氯化铵后，得到的沉淀为固体介孔硅纳米颗粒。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述混合溶液的反应温度为90-100℃，反应条件为1000-1500 rmp min-1搅拌1小时以上。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）还包括制备二氧化铈纳米粒子和使其羧基化的步骤。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制备二氧化铈纳米粒子的步骤包括：将醋酸钠和油胺加入到对二甲苯中室温下剧烈搅拌24小时以上得到混合溶液，升温，待温度升至90 ℃以上，加入超纯水，老化3-4 h。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的混合条件为避光、振荡、室温条件下反应12-24小时。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）的具体步骤包括：将Sulfo-SMCC加入CICe@M，反应结束后得到CICe@M-S；再将K肽加入CICe@M-S，反应结束后得到CICe@M-K。
10.权利要求1所述的双功能纳米探针在制备治疗阿尔兹海默症的药物或试剂中的应用。
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