TWI354026B - Biochemical synthesis of 1,4-butanediamine - Google Patents

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1354026 Ο) 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明關於一種於微生物中生化合成1，4-丁二胺（CAS 編號 110-60-1;亦稱爲四甲撐基二胺之化合物；於生物 化學文獻中亦稱爲腐胺）之新穎方法，該微生物具有與天 然之鳥胺酸脫羧酶活性相比較下增加之鳥胺酸脫羧酶活性 【先前技術】 鳥胺酸脫羧酶於本文中亦簡稱爲ODC。增加之鳥胺酸 脫羧酶活性於本文中亦簡稱爲增加之ODC活性。已知通 常具有ODC活性之微生物能夠產製多胺類，諸如亞精胺 (spermidine)和精胺（spermine)，其係分別爲 N-(3-胺基丙 基）-1，4-丁二胺和N，N’·二- (3-胺基丙基）·1，4-丁二胺產物 之俗名。該等化合物及各種不同之短線形二胺（諸如，例 • 如，1,4-丁二胺和1，5·戊二胺（亦稱爲屍胺））通常在生化硏 究中統稱爲多胺類，雖然在多胺的嚴格化學定義上，存有 較高數目之胺基方稱爲多胺。然而，基於本專利申請案之 目的，本文所使用之“多胺”—詞係基於其生物化學上之意 義，因此包括1，4 -丁二胺。 1，4-丁二胺係產製某些主要工程塑膠之重要原料，該 工程塑膠係諸如聚醯胺-4,6 (其爲均聚物之型式或與例如約 5重量％之聚醯胺-6單體（己內醯胺）共聚合）》聚醯胺·4,6 均聚物（耐綸（nylon)-4,6)早已揭示於1938年（參閱uS-A- -5- ⑧ (2) 1354026 2,130,948，Car others)。其係爲單體 1,4 -丁 二胺和己二酸 之縮聚產物。目前，聚醯胺-4,6之特殊化合物（商品名爲 STANYL®)係由荷蘭DSM公司產製並販售。 已知許多化學途徑可用於合成1,4-丁二胺。所有這些 化學途徑所忍受的不利條件是起始物必須得自於被視爲不 能更新之來源。因此，對起始自可更新之碳源並利用活細 胞之生物化學方法（亦稱爲“生物轉化法”）以提供合成1，4· φ 丁二胺之新穎且可實施之途徑存有實質上的需求。一般而 言，多胺類被認爲是對生化製程中所使用之任何細胞或微 生物具有毒性。因此，迄今咸信該新穎之生化合成途徑仍 不能吸引吾人之注意。 可參閱例如下述之文獻：Fukuchi et al.，J. Biol. Chem·，Vol. 270 ( 1 995)，ρ· 1 8 8 3 1 · 1 8 8 3 5 及 S uzuki et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91 (1 994), p. 8930-8934 o • Fukuchi清楚地描述歸因於在大腸桿菌（£. C〇h)缺乏亞 精胺乙醯基轉移酶之細胞（即缺乏乙醯基轉移酶SPeG之細 胞）中累積亞精胺，導致細胞存活（及幾乎所有蛋白質之合 成）降低。亞精胺係由細胞自作爲中間產物之1，4-丁二胺 所產製之產物。因此，1，心丁二胺之生物合成不可避免地 亦將導致亞精胺之生成。 另一方面，Suzuki et al.利用鼠細胞亦證實過度產製 ODC導致多胺類（特別是亞精胺）之累積，及經由添加少量 之亞精胺觀察到細胞早已死亡之現象，即使對未缺少 -6- (3) 1354026 基因之細胞亦然。 須注意的是，文獻 Limsuwum et al.，J. Bacteriol.， Vol. 182 (2 0 00)，p. 5373-5380已顯示在低溫下藉由過度表 現該基因可克服該問題。Suzuki et al.建議此細胞存 活之降低係歸因於經由抗酶（antizymes)對ODC不充分之 反饋抑制作用且可經由過度產製另一適當之抗酶而加以克 月g »該抗酶之過度產製將使細胞減少多胺類之產製，並因 φ 此不適於1，4_二胺基丁烷（DAB)之產製》 進一步，如文獻 Kashiwagi et al·，J. Bacteriol.，Vol. 1 70 ( 1 98 8)，p. 3131-3135所描述者，藉由過度表現編碼鳥 胺酸脫羧酶（ODC)之基因（特別是結構表現之speC基因）可 調整大腸桿菌中多胺類之含量。對該實驗，用於選殖者係 質體pODC(其製備係揭示於文獻Boyle et al·，Methods in Enzymology, Vol. 94 (1983)，p. 117-121 中）。如該文獻 Kashiwagi et al.所教示者，在天然轉錄和轉譯之控制下（ φ 即利用由核糖體結合部位和啓動子所構成之天然基因元件 )，高達70倍過度產製之鳥胺酸脫羧酶SpeC並未導致細 胞內和細胞外1，4·丁二胺總含量之些微增加。該引證 Kashiwagi et al.文獻之作者未能達到超過約25 mg/L(未餵 入鳥胺酸）之較高產量的I，4-丁二胺。再者，該引證文獻 顯示細胞內過度產製ODC確實造成細胞內鳥胺酸含量之 明顯減少（自約65 pmol/L至低於1 μ"10171^)，且其結論爲 當過度產製ODC時’該細胞轉而缺少鳥胺酸。Kashiwagi et al.嘗試藉由外部餵入鳥胺酸以排除所觀察到之鳥胺酸含 (4) 1354026 量的限制，但是雖有些微之改善，1，4-丁二胺之產量仍然 未能超過約30 mg/L。基於所描述的藉由ODC過度產製之 前驅物供給的限制及進一步因爲預期較高量之蛋白質（諸 如ODC)將會因存在較高量之多胺類而於細胞內致使毒性 之增加，熟習此技藝之人士基於上述引證文獻將會假定提 供生化合成方法以產製1,4-丁二胺至超過30 mg/丨之顯著 較高產量將是不可能的。 • 迄今，EP-A-0726240仍是極少數有關多胺（包括1,4- 丁二胺）之生化合成的專利文獻之一。然而，該文獻描述 藉由天然物（含有蛋白質爲主要成份）之醱酵以產製特別是 1，4-丁二胺。該方法中，天然物係首先經部分或全部降解 處理，並於醱酵步驟前，除去任何不欲之化合物（例如Hg 、Cr、As、Cd、Se及Pb)、細胞生長抑制劑、農藥、抗生 素、去垢劑、皂、脂、油、氰化物及酚。經此方法產製之 腐胺和其他二胺係（再）用於作爲肥料和糞肥，但其含有多 9 種不適於作爲產製例如聚醯胺-4,6之原料的其他物質。 於是，仍然需要一種合成1,4-丁二胺至超過30 mg/1 之顯著較高產量的有效率之生物合成途徑，其適宜地無需 外部餵給（昂貴之）鳥胺酸。此改善1,4-二胺基丁烷之可得 到性的需要主要係基於其作爲起始物以例如產製聚醯胺· 4,6上之用途。通常，迄今所習知之產製1,4-丁二胺的途 徑係相當耗費人力且煩雜的，並可導致產物之品質在該產 物未經進一步之純化下係難於用於耐綸之產製。已知產製 1，4 - 丁二胺之化學途徑需要相對上昂貴之起始物和反應劑（ -8- (5) 1354026 包括難以處理操作之反應劑）及在多個步驟和多個反應器 設計上溫度和壓力相對上嚴格之反應條件，以及使用昂貴 之觸媒系統。於是，仍有需要產製1,4· 丁二胺之可替換的 途徑，其適宜地係起始自較不昂貴之原料並避免操作諸如 氫氰酸之反應劑的問題。已知自農業生產所得到之天然生 長並因此可更新之材料係爲諸如葡萄糖之碳源（或其他適 宜之碳源及其混合物）基礎，其可用於醱酵。該可更新之 φ 材料相對上較爲便宜且可得到之來源豐富。通常，若可更 新之材料可作爲製造所有化學品之起始物，則視爲是非常 便利的。 因此，本發明之目標係提供藉由生物轉化法規模化工 業產製1,4-丁二胺之改良可能性。 【發明內容】 本案發明人令人驚訝地發現藉由利用一種於微生物中 • 生化合成1，4·丁二胺之新穎方法可達成此目標，該微生物 具有與天然之鳥胺酸脫羧酶（ODC)活性相比較下增加之 ODC活性，其中該增加之ODC活性係藉由過度表現具有 增強之轉錄及/或轉譯功效之ODC編碼基因，且其中經該 微生物藉由生物轉化法所產製之1，4-丁二胺係分泌至醱酵 培養液中並係自該醱酵培養液中回收。 因此，本發明提供一種合成1，4·丁二胺之改良生化方 法，且所生成之1，4-丁二胺係優異地適於作爲例如產製聚 醯胺-4,6之原料。 -9- (6) 1354026 本專利申請案中，“生化合成”一詞（於本文中可替代 地稱爲“生物轉化”）不僅包括，除涉及多個純化學反應步 驟外，亦涉及一或多個利用適當生產菌株之全細胞的生物 催化反應之方法，亦包括利用適當生產菌株之全細胞的純 生化方法。若該生化合成起始自適當之碳源，該純生化方 法稱爲醱酵；若該生物合成起始自已具有碳骨架之中間產 物且自該中間產物可得到欲合成之標的分子，則該純生化 • 方法稱爲前體醱酵。該等方法可於需氧或厭氧條件下進行 〇 本發明之生化合成的生物催化反應可於活體內或活體 外進行。一般而言，活體內反應係利用活細胞（該“活細胞 ”一詞因此亦包括所謂之靜息細胞）進行之反應；另一方面 ，通常係利用細胞溶胞產物或（部分）純化之酶以進行活體 外反應。本發明之生化合成係於微生物中進行。利用適當 產製菌株之全細胞可進行該生化合成，但亦可利用可通透 # 之細胞進行該生化合成；然而，對利用可通透之細胞或固 定化宿主細胞所進行之反應而言，區別活體內和活體外反 應並無意義。明顯的是，當藉由例如利用固定化酶等以實 施本發明時，個別之生物催化步驟被視爲等同於本文所指 之生化合成中的步驟。 鳥胺酸脫羧酶（即具有鳥胺酸脫羧作用活性之酶或 ODCs)係歸類於分類上E.C. 4.1.K17之酶。若鳥胺酸脫羧 酶係過度產製，其活性藉由利用Sigma Diagnostics二氧 化碳偵測組套（Sigma)(該分析係描述於文獻Osterman，A· -10- (7) 1354026 L. et al. 1 994, Biochemistry 33，p. 1 3 6 6 2 - 1 3 6 6 7 中）在不含 有細胞之萃取液中且於標準條件（3 7°C及存有鳥胺酸和 PLP)下可輕易地與天然（即未過度產製）之鳥胺酸脫羧酶活 性相比較。於是，熟習此技藝之人士經由測定蛋白質含量 或RNA含量可輕易地得知與所使用之微生物中天然之鳥 胺酸脫羧酶活性相比較，所使用之ODC基於增強之轉譯 及/或轉錄功效是否具有增加之鳥胺酸脫羧酶活性（即增加 • 之ODC活性）。各種不同之測定蛋白質含量的標準方法（例 如比色法和分光光譜法）係描述於文獻 Lottspeich and Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag GmbH，Heidelberg/Berlin, ISBN 3-8274-004 1 -4 (1 998)，第 3、5、21、22及24章中。測定蛋白質含量和RNA含量之 方法，例如印迹雜交法（Northern hybridization)、RT-PCR 及許多其他之方法，係描述於文獻 J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0- 8 79 69-3 09-6 ( 1 98 9)中。然而，許多其他之標準方 法係爲熟習此分析領域之人士所習知，因此無需於本文中 贅述。 可用於本發明方法中適當之鳥胺酸脫羧酶係能夠使鳥 胺酸脫去羧基之所有酶及其突變體。任何該酶可於增加之 活性下（即藉由過度表現具有增加之轉錄及/或轉譯功效之 鳥胺酸脫羧酶基因的過度產製型式下）用於本發明之方法 中。此外，須注意的是，對任何特定酶之活性，本文所使 -11 - ⑧ (8) 1354026 用之“增加之活性”一詞亦欲包括該酶（例如鳥胺酸脫羧酶） 之活性完全未存在於天然之微生物來源中之情況，其中該 反應之發生係藉由目的性導入具有增加轉錄及/或轉譯功 效之基因修飾。 如前所述，於1，4-丁二胺之生化合成中，可使用任何 增加活性之ODC，該增加之ODC活性係藉由過度表現具 有增加之轉錄及/或轉譯功效之ODC編碼基因。適宜地， • 藉由使用強且經調節之啓動子（適宜地係使用強且可經誘 導之啓動子）以得到該增加之轉錄及/或轉譯功效。 最適宜地，藉由使用可經異丙基- β- D-硫代半乳糖吡 喃糖苷（IPTG)誘導之強啓動子以得到該增加之轉錄及/或轉 譯功效。適當之強啓動子係描述於文獻J. Sambrook，E. F. Fritsch and T. Maniatis，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969·3 09- 6 (1 989)中。 ® 特別地，增加轉錄及/或轉譯功效係藉由利用選自T7 、或p/flcr之啓動子。熟習此技藝之人士當了解 的是，啓動子之最佳選擇將取決於所使用之宿主和所實施 之反應條件。 於本發明之另一較佳體系中，該鳥胺酸脫羧酶編碼基 因具有位於該基因之編碼區域上端的核糖體結合部位 (RBS)，該RBS係經修改以使核糖體對RNA模板能有較佳 之辨識。可藉由熟習此技藝之人士所習知之任何方法進行 該RBS之修改，且該修改將考慮所使用之宿主等的特有性 (9) 1354026 質。 最適宜地，該過度表現之鳥胺酸脫羧酶編碼基因係鳥 胺酸脫羧酶基因或speC(該等鳥胺酸脫羧酶皆屬於 E.C. 4.1.1.17)。迄今在文獻上，SpeC比SpeF已被較爲廣 泛地硏究。然而，最爲令人驚訝且最爲適宜的是，依據本 發明之方法所達到之最佳結果是當鳥胺酸脫羧酶編碼基因 係· ipeF基因時。 φ 特別適宜地，本發明之方法所使用之過度表現的鳥胺 酸脫羧酶編碼基因係鳥胺酸脫羧酶基因或ipeC，該 基因係源自選自埃希氏菌屬^^^心/^^/^‘^^’志賀氏菌屬 (•SA/ge/Za)、沙門氏菌屬、耶爾森氏菌屬 或希瓦氏菌屬（SAewaneZ/fl)之菌屬。該鳥胺酸脫 羧酶speF係可誘導之鳥胺酸脫羧酶，而鳥胺酸脫羧酶 speC係結構性之鳥胺酸脫羧酶。 較適宜地，該過度表現之鳥胺酸脫羧酶編碼基因係源 ^ 自選自大腸桿菌c<W〇、弗氏志賀氏菌 (Shigella flexneri)、鼠傷寒沙門氏菌（Sfl/wo/ieZ/fl typhimurium) '鼠疫耶爾森氏菌（yerhnifl 或污染降 解希瓦氏菌（S/iewawe/Za oweiVerti/·?)之菌種的鳥胺酸脫殘 酶基因。最適宜地，該過度表現之鳥胺酸脫羧酶編碼基因 係，其係源自選自大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌或污染 降解希瓦氏菌之菌種。若與利用過度表現之結構性鳥胺酸 脫羧酶編碼基因ipeC之結果相比較時，當利用時確 能達成本發明之最佳結果。 -13- (10) 1354026 特別地，依據本發明，所有可使用之鳥胺酸脫羧酶與 源自大腸桿菌之ODC具有充分之一致性，即具有至少 30%、較適宜地至少45%且最爲適宜地至少65%之一致性 ，並能夠催化該鳥胺酸脫羧反應。已知許多ODCs具有與 源自大腸桿菌之對應酶相對上爲高之一致性。 藉由熟習此技藝之人士所習知之方法可進行與對應酶 一致性％之測定，例如藉由利用對應酶之蛋白質序列作爲“ • 質問序列（query sequence)”以進行公開·資料庫之捜尋以例 如鑑定其他之族群成員或相關序列。該搜尋可藉由BLAST 程式（第2.2版）並利用各別程式之欠缺參數而加以進行。 參閱網址 http://www.ncbi.nlm_nih.gov。 因此，本發明提供一種合成1，4-丁二胺之改良生化方 法，且所生成之1，4-丁二胺係優異地適於作爲產製聚醯 胺-4,6及/或其他多胺類之原料。 明顯地，在本發明中，任何與編碼上述之鳥胺酸脫羧 • 酶及編碼具有足夠與所示之鳥胺酸脫羧酶相比較之鳥胺酸 脫羧酶活性的酶同源之基因係視爲等同並適用於本發明之 方法中。該等等同基因可適宜地經由熟習此技藝之人士所 習知之任何適當的選殖技術所獲得，該適當的選殖技術係 例如下述實驗部分所描述之方法。另一方面，該等等同之 鳥胺酸脫羧酶基因亦可經由目的性構築而獲得。 進一步，於本發明之另一較佳體系中，係於微生物中 進行生化合成1,4-丁二胺之方法，其中除了該增加之0DC 活性之外，藉由過度表現下述之基因亦增加至少2種其他 -14- ⑧ (11) 1354026

I 酶之活性： (〇精胺酸脫羧酶編碼基因^^^((屬於£.(：.4.1.1.19)和 緋精胺酶（agmatinase)編碼基因 (屬於 E.C. 3.5.3.11 ; 亦稱爲緋精胺（agmatine)尿素水解酶編碼基因）：或 (ii)精胺酸脫羧酶編碼基因(屬於E.C. 4.K1.19) 、緋精胺亞胺水解酶編碼基因(屬於E.C. 3.5.3.12; 亦稱爲鯡精胺去亞胺酶編碼基因）、及N-氨基甲醯基腐胺 • 醯胺水解酶編碼基因屬於E.C. 3.5.1.53)、及可選擇 之緋精胺酶編碼基因屬於E.C. 3.5.3.11)» 對該額外增加之酶活性，可藉由熟習此技藝之人士所 習知之任何方法達成該過度表現（例如藉由增加各別基因 之轉錄及/或轉譯功效）或藉由任何其他習知之方法以達成 該過度表現，其係諸如藉由增加相同基因數目、藉由突變 手段以增加該酶之內源活性或結構、或藉由利用未調控之

酶β如述於前揭另一較佳體系之部分（i)，該SpeA和SpeB φ 之組合欲代表SpeA和SpeB之任一功能性組合（是否爲組 合之融合蛋白質或爲各別之酶活性）。事實上，該組合亦 可稱爲SpeAB。前述部分（ii)代表於該SpeA和SpeB之組 合中，該SpeB部分本身可藉由AguA和AguB之任一功能 性組合（是否爲組合之融合蛋白質或爲各別之酶活性）替代 〇 文獻 Janowitz et al·，FEBS Letters 544 (2003 )，25 8-261已描述緋精胺去亞胺酶AguA係涉入高等植物中精胺 酸脫羧酶途徑。進一步，自文獻 Nakada et al.， -15- ⑧ (12) 1354026

Microbiology, 149 (2003)，707-714 可知，藉由 SpeB 催化 之轉化亦可藉由存在於植物中之酶所催化，即藉由緋精胺 去亞胺酶AguA和N-氨基甲醯基腐胺醯胺水解酶AguB之 組合作用。於是，亦可使用AguA和AguB以替代或甚至 倂用本文所揭示之SpeB。該和基因之來源可 爲阿拉伯芥和番節 ，但其可相比較之基因可發現於綠濃桿菌 (•Psewi/owowiisflerog/’wojfl)之突變株中。 明顯地，於本案說明書中，與任一上述之精胺酸脫羧 酶（各別地係鲱精胺酶、或鲱精胺亞胺水解酶或N-氨基甲 醯基腐胺醯胺水解酶）同源及編碼具有精胺酸脫羧酶（各別 地係緋精胺酶、或緋精胺亞胺水解酶或N-氨基甲醯基腐 胺醯胺水解酶）活性之該各別酶（該各別酶活性係足以與前 述之精胺酸脫羧酶（各別地係緋精胺酶、或鮮精胺亞胺水 解酶或N-氨基甲醯基腐胺醯胺水解酶）活性相比較）的任何 φ 基因係視爲等同且適用於本發明方法之該另一較佳體系中 。該等等同基因可適宜地經由熟習此技藝之人士所習知之 任何適當的選殖技術所獲得，該適當的選殖技術係例如下 述實驗部分所描述之方法。另一方面，該等等同基因亦可 經由目的性構築而獲得。 於是，於本發明方法之該較佳體系中，亦使用過度表 現基因之額外組合，即編碼（i)精胺酸脫羧酶和緋精胺酶、 或（Π)精胺酸脫羧酶、緋精胺亞胺水解酶及N-氨基甲醯基 腐胺醯胺水解酶、以及可選擇之緋精胺酶的基因。 -16- (13) 1354026 於本發明之該較佳體系中，該過度表現之精胺酸脫羧 酶編碼基因適宜地係源自選自埃希氏菌屬（£^(：/1£；*/'£：/7/〇)、 志賀氏菌屬（SA/gW/i?)、沙門氏菌屬、耶爾森 氏菌屬（hm/jh)、巴斯德氏菌屬或奈瑟氏球 菌屬之菌屬的精胺酸脫竣酶基因。較適宜 地，該過度表現之精胺酸脫羧酶編碼基因適宜地係源自選 自大腸桿菌（£κΛβ/·ί·£：/π_α co//)、弗氏志賀氏菌 //ejcweri·)、腸炎沙門氏菌（S^/wowe/Za ewiericfl)、鼠疫耶爾 森氏菌、多殺巴斯德氏菌（Pflj/ewre//i7 7««//〇£：/<5?0)或腦膜炎奈瑟氏球菌（_/\^/1515^，/<3；^；7/；7容"/心1〇之 菌種的精胺酸脫羧酶基因spe J。 依據本發明，特別地，所有可使用之精胺酸脫羧酶與 源自大腸桿菌之精胺酸脫羧酶具有充分之一致性，即具有 至少30%、較適宜地至少45%且最爲適宜地至少65%之一 致性，並能夠催化該精胺酸脫羧反應。已知許多精胺酸脫 # 羧酶具有與源自大腸桿菌之對應酶相對上爲高之一致性。 於本發明之該較佳體系中，該過度表現之鲱精胺酶編 碼基因係源自選自埃希氏菌屬（五、沙門氏菌屬 {Salmonella) 變形菌屬（/VoRwj)、 發光菌屬 (P/jo/orhflZ^w·?)、弧菌屬或奈瑟氏球菌屬 (Λ^/wer/a)之菌屬的緋精胺酶基因。較適宜地，該過 度表現之緋精胺酶編碼基因係源自選自大腸桿菌 c〇/z_)、腸炎沙門氏菌en/erz’cfl)、 奇異變形菌（户、發光桿菌（尸Λοίο/Άσόβι/·? (14) 1354026 /wwzwescewj)、霍亂弧菌c/io/erae)或腦膜炎奈瑟氏 球菌（A^eiweria /πβ«ϊ·π^7·η·ί/ί5)之菌種的緋精胺險基因SP e Β

Q 依據本發明，特別地，所有可使用之緋精胺酶與源自 大腸桿菌之緋精胺酶具有充分之一致性，即具有至少30% 、較適宜地至少45 %且最爲適宜地至少60 %之一致性，並 能夠催化該緋精胺酶之反應。已知許多緋精胺酶具有與源 φ 自大腸桿菌之對應酶相對上爲高之一致性。 進一步，於本發明之該較佳體系中，該過度表現之緋 精胺亞胺水解酶編碼基因及/或該過度表現之N-氨基甲醯 基腐胺醯胺水解酶編碼基因適宜地係源自選自假單胞菌屬 {Pseudomonas)、鏈球菌屬（•S/re/iiococcM·?)、鏈霉菌屬 (i r eί o w c e ?)、固氮菌屬（J ζ ο ί 〇 6 a c / e r )、擬南芥屬 、新鞘桿菌屬（v ο sA ί« g 〇 6 i w w )或芽孢桿菌 屬之屬的鯡精胺亞胺水解酶基因及/或Ν-# 氨基甲醯基腐胺醯胺水解酶基因。較適宜地，該過 度表現之鯡精胺亞胺水解酶編碼基因及/或該過度表現之 N-氨基甲醯基腐胺醯胺水解酶編碼基因係源自選自綠濃桿 ^ {Pseudomonas aeruginosa) ' 轉糖鏈球菌(S/rep/ococct/s 阿維鍵霉菌（iSire/Wow少cei flverwin-/，··?）、維涅蘭 德固氮菌、阿拉伯芥（JrflrZwYo/M/j ihaliana)、芳香 新 鞘 桿 菌{Novosphingobium flromfln_cz_vo/*fl«J)或蠟狀芽孢桿菌cerewj·)之物種 的鯡精胺亞胺水解酶基因flgwd及/或N-氨基甲醯基腐胺醯 (15) 1354026 胺水解酶基因 依據本發明，特別地，所有可使用之緋精胺亞胺水解 酶及/或N-氨基甲醯基腐胺醯胺水解酶與源自假單胞菌屬 之鲱精胺亞胺水解酶及/或N-氨基甲醯基腐 胺醯胺水解酶具有充分之一致性，即具有至少30%且最爲 適宜地至少4G%之一致性，並能夠催化該緋精胺亞胺水解 酶之反應，各別地該N·氨基甲醯基腐胺醯胺水解酶之反 # 應。已知許多緋精胺亞胺水解酶和N_氨基甲醯基腐胺醯 胺水解酶具有與源自假單胞菌屬之對應酶相對上爲高之一 致性。 適宜地，實施本發明之方法時，同時確保增加細胞內 之鳥胺酸含量。此增加可藉由例如外部餵入鳥胺酸而達成 〇 本發明之方法可於任何適當之宿主生物中進行。該宿 主可選自熟習此技藝之人士所一般習知之用於生合成的產 # 製生物（或細胞）。該生物可爲真核物種或較適宜地爲原核 物種。真核細胞可爲例如植物細胞和真菌細胞及各種不同 種類之其他細胞，該各種不同種類統稱爲“原生生物 (Protista)’’。 特別適宜地，於宿主生物中進行本發明之方法，該宿 主生物係選自酵母菌（5"flcc/7flr〇7w_yce5 sp.)、芽孢桿菌 (5aci//ws sp.)、棒桿菌（Cor少sp.)、埃希氏菌 於本發明之方法中，特別適宜的是所使用作爲宿主之 -19- (16) 1354026 微生物能夠產製胺基酸鳥胺酸及/或精胺酸。大多數天然 微生物能符合此要求，因爲所有野生型菌株通常具有此種 能力，基於精胺酸係必需胺基酸。 該等物種中，埃希氏菌（五sp.)係適宜的， 因爲其易於藉由基因操作處理以提供具有所欲之過度表現 的酶活性之菌株。再者，埃希氏菌已天然含有幾乎所有上 述之酶活性（即除植物flgM基因之外），使得大多數過度表 現之基因可作爲问源基因。棒桿菌（C 〇 w e 6 £/c ί e r f w 777 s p.) 亦爲特別適宜的（雖然其缺少天然之鳥胺酸脫羧酶），因爲 其係適當之谷胺酸產製菌株且可於醱酵製程中易於操作。 於本發明之方法中，谷胺酸係非常適當之前驅物。因 此’該方法適宜地係於能夠生成谷胺酸之宿主菌株（例如 合胺酸棒桿菌（Cory/ieftflcierz-ww g/wia/w;’cw/w))中進行。 當本發明之方法係於選自釀酒酵母/?〇/<? wycei '棒桿菌或埃希氏菌之宿主生物中進行時，可 Φ 達到最佳之結果’其中除了鳥胺酸脫羧酶活性外，於該宿 主微生物中，亦增加精胺酸脫羧酶和至少緋精胺酶或鯡精 胺亞胺水解酶和N-氨基甲醯基腐胺醯胺水解酶之活性（與 該宿主微生物中各別該等酶之天然活性相比較）。 很清楚地’實施本發明之方法適宜地係於亦爲通常之 醱酵條件的反應條件下進行。因此，可以批式及所欲之進 料批式的方式實施該方法。對所生成之】，4-二胺基丁烷， 合宜的係確認所使用之作爲宿主生物的生物具有或提供適 當之輸出系統’適宜地該輸出系統係天然的。 -20- (17) 1354026 當然’本發明亦包含所有之載體、質體及宿主，其具 有記載於申請專利範圍中之一或多個上述酶所增加之酶活 性。 本發明將藉由某些實驗結果加以說明，但是該實驗結 果絕非用於限制本發明之範圍。 【實施方式】 φ實驗部分 一般方法 所有之DNA操作係使用標準方法（文獻Sambrook, J. et a 1. (1989)，Molecular cloning: a laboratory manual, 2n<l Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，New York)。若未特別地指明，自大腸桿菌LJ110( 文獻 Zeppenfeld, et al. (2000)，J. Bacteriol. ]82，4443 -4452)之染色體DNA放大DNA。利用校對（proofreading) 酶 SAWADY P w 〇 - D N A -聚合酶（p e q 1 a b Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany)或 Platinum Pfx DNA 聚合酶 (Invitrogen, Karlsruhe，Germany)並依循製造商之方法步 驟，進行PCR放大反應，然而藉由集落PCR並利用Taq 聚合酶 READYMIX(Sigma, Taufkirchen，Germany)進行構 築菌株之驗證。利用購自 MWG-Biotech (Ebersberg, Germany)之寡核苷酸導入用於隨後之選殖及進一步之突變 的限制酶切部位。利用 MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen，Hilden, Germany)並依循製造商之方法步驟，純 (18) (18)1354026 化 DNA 片段。利用 QIAprep spin Miniprep Kit (Qiagen， Hilden，Germany)，完成質體DNA之製備。藉由限制酶切 分析和隨後之定序（Ag〇wa，Berlin，Germany)，進行構築質 體之驗證。 質體構築 ⑴構築質體 pDAB3(pJF119EH-veC„HS) 將大腸桿菌LJ110(文獻Zeppenfeld，et al. ’參閱前揭 一般方法部分）之該（結構型、生物合成之）鳥胺酸脫羧酶編 碼基因MeC選殖至該表現載體PJF119EH(文獻？(^^,】· P. et al. ( 1 98 6)，Gene 48，119-131)中，該載體允許強基因 表現，其係基於在可經異丙基-P-D-硫代半乳糖吡喃糖苷 (IPTG)誘導之Me啓動子及he阻遏系統（lacIQ)下之轉錄 控制。因此，利用原始之RBS及起始和終止密碼子選殖該 編碼基因 利用下述之寡核苷酸，自大腸桿菌LJ 110之染色體 DMA，放大含有 223 5 bp ipeCass之 DNA片段（編號 AE000379，核苷酸 2650-4867)： S'-GAG CTC TAG ACC AGT TTG ACC CAT ATC T-35 [SEQ ID NO: 1] (突變部位係粗體字，斜體字係心al限制酶切部位） 及

5’-TTT T(?C CTT ACT TCA ACA CAT AAC CGT AC-35 [SEQ ID NO: 2] (19) 1354026 (突變部位係粗體字，斜體字係心限制酶切部位） 利用限制內切酶和5/7ΛΙ終端修飾該PCR產物後 ，將該PCR產物連接至該質體PJF119EH中，該質體 pJFl 19EH已經相同之限制酶切。經轉形至大腸桿菌DH5a 細胞（Invitrogen，Karlsruhe，Germany)後，在含有 100 mg/L胺苄青黴素之LB瓊脂盤上選取轉形株。經製備後， 藉由限制酶切分析和隨後之定序，驗證所得到之質體 • pDAB3 (pJF 1 \ 9EU-speC nRBS J 7491 bp) » 將大腸桿菌LJ110(文獻Zeppenfeld，et al.，參閱前揭 一般方法部分）之該（結構型、生物合成之）鳥胺酸脫羧酶編 碼基因選殖至該表現載體pJF119EH(文獻Fiirste，J. Ρ· et al. ( 1 986)，Gene 48，119-131)中，該載體允許強基因 表現，其係基於在可經異丙基-P-D-硫代半乳糖吡喃糖苷 # (IPTG)誘導之Me啓動子及/crc阻遏系統（lacIQ)下之轉錄 控制。因此，利用原始之起始和終止密碼子選殖該編碼基 因speC。因爲利用原位（/« ii/fero)硏究對ipeC不能決定保 留之核糖體結合部位（RBS)，因此藉由定點突變將位於該 起始密碼子之前端7 bp位置上的RBS置入大腸桿菌 之共同序列中。 利用下述之寡核苷酸，自大腸桿菌LJ110之染色體 DNA，放大含有 22 3 5 bp speCMM之 DNA片段（編號 AE0003 79，核苷酸 265 0 -4867): -23- (20) 1354026 55-GAG CTC TAG ACC AGT TTG AGG AAT ATC T-35 [SEQ ID NO: 3] (突變部位係粗體字，斜體字係Dal限制酶切部位） 及

5，TTT JGC ATG CTT ACT TCA ACA CAT AAC CGT AC-3’ [SEQ ID NO: 2] (突變部位係粗體字，斜體字係以λΐ限制酶切部位） # 利用限制內切酶和⑪/ίΐ終端修飾該片段後，將 該 PCR 產物連接至該質體 PJF119EH 中，該質體 pJFl 19ΕΗ已經相同之限制酶切。經轉形至大腸桿菌DH5oc 細胞（Invitrogen，Karlsruhe，Germany)後，在含有 100 mg/L胺苄青黴素之LB瓊脂盤上選取轉形株。經製備後， 藉由限制酶切分析和隨後之定序，驗證所得到之質體 pDAB4(pJF 1 1 9EH- speCaRBs ' 749 1 bp)。 φ (iii)構築質體 pDAB2(pJFl 19ΕΗ-ί/^^) 將大腸桿菌LJ1 10(文獻Zeppenfeld，et al.，參閱前揭 一般方法部分）之該（可誘導、生物可降解之）鳥胺酸脫羧酶 編碼基因ipef選殖至該表現載體PJF119EH(文獻Fiirste， J. P. et al. ( 1 986)，Gene 48，119-131)中。該載體允許高量 蛋白質產製，其係基於在可經異丙基-P-D·硫代半乳糖吡 喃糖苷（IPTG)誘導之Me啓動子及Me阻遏系統（丨acIQ)T 選殖基因之轉錄控制。爲構築表現質體pDAB2(pJFl〗9EH-，經由原始核糖體結合部位（RBS)並自起始和終止密 -24 * (21) 1354026 碼子選殖編碼基因。 利用下述之寡核苷酸，自大腸桿菌LJllO之染色體 DNA ’放大含有 2247 bp veF 之 DNA 片段（編號 AE000 1 72，核苷酸 1 0242- 1 2468): S^GAC CTG C1G GTA CCT AAA ΑΤΑ AAG AGA TGA AA-3 5 [SEQ ID NO: 4] (突變部位係粗體字，斜體字係&»1限制酶切部位） • 及 S'-TCG ATC TAG ACT GAC TCA TAA TTT TTC CCC-3，[SEQ ID NO: 5] (突變部位係粗體字，斜體字係Del限制酶切部位） 利用限制內切酶和义hi終端修飾該片段並將其 連接至該表現載體PJF119EH中，該表現載體PJF119EH 已經相同之限制酶切。經轉形至大腸桿菌 DH5(x細胞 (Invitrogen, Karlsruhe, Germany)後，在含有 100 mg/L 胺 φ 苄青黴素之LB瓊脂盤上選取轉形株。經製備後，藉由限 制酶切分析和隨後之定序，驗證所得到之質體 pDAB2(pJFl I 9ΕΗ··ϊ/?β 尸，7502 bp)。 (iv)構築質體 pDAB7(pJF119EH-ipd5) 將大腸桿菌LJ110(文獻Zeppenfeld，et al.，參閱前揭 —般方法部分）之精胺酸脫羧酶編碼基因和緋精胺酶 編碼基因選殖至該表現載體pJF119EH(文獻Fiirste， J. Ρ· et al. ( 1 986)，Gene 48，119-131)中。該載體允許高量 -25- ⑧ (22) 1354026 蛋白質產製，其係基於在可經異丙基-P-D-硫代半乳糖吡 喃糖苷（IPTG)誘導之啓動子及/μ阻遏系統（lacIQ)下 選殖基因之轉錄控制。如此，維持該等基因及RBS、起始 和終止密碼子之原始操縱子結構。 利用下述之寡核苷酸，自大腸桿菌LJ110之染色體 DNA，放大含有 3079 bp 之 DNA片段（編號 AE000377，核苷酸 1 1 90-4247):

• 5y-ACA CTT TCT AGA ΑΤΑ ATT TGA GGT TCG CTA TG-3，[SEQ ID NO: 6] (突變部位係粗體字，斜體字係限制酶切部位） 及 55 -CAT GGC ATG CGG TGC TTA CTC G-3’ [SEQ ID NO: 7] (突變部位係粗體字，斜體字係SpM限制酶切部位） 利用限制內切酶/hi和終端修飾該片段，並隨 φ 後將該DNA片段連接至該表現質體pJF119EH中，該質體 pJFl 19EH已經相同之限制酶切。經轉形至大腸桿菌DH5cc 細胞（Invitrogen, Karlsruhe, Germany)後，在含有 100 mg/L胺苄青黴素之LB瓊脂盤上選取轉形株。經製備後， 藉由限制酶切分析和隨後之定序，驗證所得到之質體 pDAB7(pJF 1 1 9EH-5j3e^5 > 8 3 3 9 bp)。 (v)構築質體 pDAB8(pJF119EH-i/?eF-i；?d5) 爲能平行產製該鳥胺酸脫羧酶SpeF、精胺酸脫羧酶 -26- ⑧ (23) 1354026

SpeA及鯡精胺酶 SpeB，將大腸桿菌 LJ110(文獻 Zeppenfeld，et al.，參閱前揭一般方法部分）之基因 選殖至該ipef·表現載體pDAB2(參閱前述（iii))中。 利用限制內切酶义hi和SpAI對該質體PDAB7(參閱 前述（iv))進行酶切，分離包含基因之操縱子（3067 bp)，並將其連接至該含有並經相同酶切之質體 pDAB2(參閱前述（iii))中。經轉形至大腸桿菌DH5a細胞 籲（Invitrogen，Karlsruhe, Germany)後，在含有 100 mg/L 胺 苄青黴素之LB瓊脂盤上選取轉形株。經製備後，藉由限 制酶切分析，驗證用於平行產製SpeFAB所得到之質體 pDAB8(pJHl 19EH-5^eF/45 - 1 0547 bp)。 實施例1:藉由過度表現具有增加之轉譯及/或轉錄功效的 鳥胺酸脫羧酶編碼基因以改良DAB之產製 實施例1.1經由過度產製鳥胺酸脫羧酶以製造1，4-丁二胺 Φ (搖瓶） 在帶有質體pDAB2(參閱前述（iii))或PDAB3(參閱前 述（i))或pDAB4(參閱前述（ii))之大腸桿菌宿主菌株LJn〇( 文獻Zeppenfeld，et al.，參閱前揭一般方法部分）中，硏究 過度表現鳥胺酸脫羧酶編碼基因ί/^厂或 (具有增加之 轉譯及/或轉錄功效）對DAB產製上之影響。 藉由搖瓶試驗並利用最低鹽培養基以測試該等菌株， 該最低鹽培養基係由 MgS〇4‘7H2〇 (300 mg/L)、 CaCl2.2H20 (15 mg/L)、KH2P〇4 (3 g/L)、Κ2ΗΡ04 (12 g/L) -27- (24) 1354026 、NaCl (100 mg/L)、（NH4)2S04 (5 g/L)、檸檬酸鈉 3H20 (1 g/L)、FeS047H20 (75 mg/L)' 硫胺素 HC1(維生素 Bl) (5 mg/L)及稀有元素 A丨2(S〇4)3_18H20 (3 mg/L)、

CoC12.6H20 (1.05 mg/L)、CuS04 5H20 (3.75 mg/L)、 H3BO3 (0.75 mg/L) 、 MnCl2*4H2〇 (30 mg/L)、 Na2Mo04-2H2〇 (4.5 m g/L)、N i S 04 · 6 H2 0 ( 3 m g/L)及 ZnS04_7H20 (22.5 mg/L)所組成。葡萄糖儲存液（500 g/L) # 經各別高壓滅菌後加入至該滅菌後之培養基中以達至最終 濃度10 g/L。 將1至5 μΐ/ml儲備液接種於含有1〇〇 mg/L胺苄青黴 素之最低鹽培養基的先期培養物中，並於3 3 °C和180 rpm 下培育16小時達至其〇D62Q値爲2。隨後利用該培養物（5 ml)接種由50 m]相同培養基所構成之主要培養基，其係 於33°C和180 rpm下培育24小時。當細胞達到OD62〇値 爲1 .5時（經約7小時後），藉由加入50 μΜ IPTG以誘導基 #因表現。 爲觀察時間相關之DAB產製，於培養期間在不同之 時間點抽取樣品。利用離心經分離細胞後，藉由HPLC分 析稀釋之上清液。此處，藉由Hewlett-Packard 1100系列 儀器，利用經50 %緩衝液B(緩衝液A : 0.1 Μ乙酸鈉，pH 7.2:緩衝液B:甲醇）平衡之C18逆相管柱（1^11<^(^1120-5 Cis，Macherey & Nagel, Diiren，Germany)，在 23 0 nm 下測得所含有之胺類係原酞醛（OPA)衍生物類。爲進行分 離，利用下述之梯度：50至75 %緩衝液B線性梯度，1 -28- (25) 1354026 至7分鐘，流速爲0.5 ml/分；75至85 %緩衝液b梯度， 7至13分鐘，流速爲0.5 ml /分；85至50 %緩衝液b梯度 ，13至14.5分鐘，最低速率爲1 ml/分：50 %緩衝液B， 14.5至17分鐘，流速爲1 ml/分；及，50 %緩衝液B，17 至20分鐘，流速爲0.5 ml/分。 經由利用標準物進行校正，可測定下述之DAB濃度（ 參閱表1)並藉由N MR光譜進行驗證。

表1:在大腸桿菌中利用ODC之過度產製所生成之DAB 所使用之菌株 表現之 基因 DAB濃度 Cmg/Ll 附註 LJ 1 1 0 pDAB2 spe F 869 IPTG誘導； „RBS LJ 1 1 0 p D A B 3 sp e C„只3s ~50 IPTG誘導； „RBS LJ 1 1 0 p D A B 4 speCaRBS 7 15 修改之RBS : IPTG 誘 導

實施例1.2在餵料批式（fed batch，2 L)培養中經由過度產 製鳥胺酸脫羧酶以製造1，4·丁二胺 於實驗用（labfors)生物反應器（Infors，Einsbach， Germany)中，藉由利用高DAB產量之菌株LJ110 pDAB2 ，硏究在餵料批式之條件下醱酵產製DAB之能力。因爲 該DAB產製菌株之生長並不依賴胺基酸，因此爲限制其 細胞生長，使用經開發之限制磷酸鹽培養的方法。於是， -29- (26) 1354026 « 使用限制磷酸鹽之最低鹽培養基，其係由MgS04‘7H20 (3 g / L)、C a C12.2 Η 2 〇 (1 5 m g / L)、K Η 2 P 0 4 (4 0 0 m g / L)、N a C1 (1 g/L)、（NH4)2S04 (5 g/L)、及稀有元素 A12(S04)318H20 (3 mg/L)、CoC12.6H20 ( 1 . 0 5 m g/L)、C u S 04.5 H2 O (3 · 7 5 mg/L)、H3B03 (0.75 mg/L)、MnCl2.4H2〇 (30 mg/L)、 Na2Mo04-2H2〇 (4.5 m g/L) 、N i S 0 4 · 6 H 2 0 (3 mg/L)及

ZnS04-7H20 (22.5 mg/L)所組成。經高壓滅菌後，在無菌 φ 條件下將檸檬酸鈉·3Η2〇 (1 .5 g/L)、FeS04‘7H20 (1 12.5 mg/L)、硫胺素_HC1(維生素Bl) (7.5 mg/L)、胺苄青黴素 (100 mg/L)及葡萄糖（10 g/L)加入至該生物反應器中。 將1至5 μΐ/ml儲備液接種於含有1〇〇 mg/L胺苄青黴 素之最低鹽培養基（參閱該1.1節）的先期培養物中，並於 33°C和180 rpm下培育16小時達至其光學密度OD 6 2 0値 爲2。隨後該培養物以1:10之比例接種於主要培養基中， 該主要培養基係由2L限制磷酸鹽之最低鹽培養基所組成 # 。在培養期間，維持溫度固定於33°C並藉由添加5N KOH 以控制pH値爲6.8 ± 0.1。在生長期間，使用穩定之攪拌 速率1 500 rpm。爲避免氧氣限制，在培養期間流入該反應 槽之氣體自2.5 L/分鐘增加爲1〇 L/分鐘。如有需要加入 抗發泡劑Dehysan。 於〇D62()値爲5之條件下，利用50 μΜ IPTG以誘導 細胞，隨後加入結合之葡萄糖（500 g/L)和硫酸銨（200 g/L) 餵料，然而調整餵料速率以達到穩定之葡萄糖（10 g/L)和 氨（1.5 g/L)濃度。經誘導後2小時，起始18 g/L KH2P〇4 -30- ⑧ (27) 1354026 之磷酸鹽餵料（餵料速率爲7 ml/小時）達8小時。此時，限 制細胞生長至〇D62G値爲約50。 爲觀察時間相關之DAB產製，於培養期間在不同之 時間點抽取樣品。利用離心經分離細胞後，藉由HPLC分 析上清液（參閱該1.1節），測定DAB量爲5.1 g/L (0.403 g/gBDW ; BDW =生物質量乾重）並經由NMR光譜進行驗證 實施例2 :於批式製程中起始自鳥胺酸和精胺酸之I，4-丁 二胺的產製（搖瓶試驗） 爲證實起始自鳥胺酸和精胺酸對DAB生成之進一步 改良，硏究結合鳥胺酸脫羧酶SpeF(具有增加之轉錄功效） 、精胺酸脫羧酶SpeA及鯡精胺酶SpeB之過度產製的影響 〇 於是，藉由利用帶有該質體pDAB8(參閱前述（v))之大 肇腸桿菌宿主菌株LJ110(文獻Zeppenfeld，et al.，參閱前揭 一般方法部分），於最低鹽培養基（參閱該1.1節）中進行搖 瓶培養。因此，將1至5 μΐ/rnl儲備液接種於含有100 m g/L胺苄青黴素之最低鹽培養基的先期培養物中，並於 33°C和180 rpm下培育16小時達至其〇D62Q値爲2。隨 後利用該培養物（5 ml)接種由50 ml相同培養基所構成之 主要培養基，其係於33*^和180 rpm下培育24小時。當 細胞達到OD62〇値爲1.5時（經約7小時後），藉由加入10 μΜ IPTG以誘導基因表現。 -31 - (28) 1354026 爲觀察時間相關之dab產製，於培養期間在不同之 時間點抽取樣品。利用離心經分離細胞後，藉由HPLC分 析上清液（參閱該1.1節）。經由利用標準物進行校正，可 測定下述之DAB濃度（參閱表2)。 表2:在大腸桿菌中起始自鳥胺酸和精胺酸之DAB生成

所使用之菌株 表現之基因 DAB 濃度[mg/L] LJ1 1 0 pDAB8 spe FAB 1025

-32-

Claims (1)

1354026 . ·-···· I ^ . a I I - __ ·.--·· \^'r *7 *! U 3 · ^) ；：-; 附件4 :第094124158號專利申請案中文序列表 民國100年7月11日呈 序列表 <110> DSM 智慧財產有限公司(DSM IP Assets B.V.) <120>生化合成1,4-丁二胺之方法 <140〉TW 094124158 <141> 2005-07-15 <150 EP 04077047.1 <151> 2004-07-15 <160〉7

<170>PatentIn 版本 3.1 <210〉 1 <211>28 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223>引子 <400〉1 gagctctaga ccagtttgac ccatatct 28

<210〉2 <211>32 <212〉DNA <213>人工序列 <220〉 <223>引子 <400〉2 ttttgcatgc ttacttcaac acataaccgt ac 32 <210>3 <211>28 <212〉DNA <213>人工序列 <220〉 <223>引子 <400〉3 1354026 gagctctaga ccagtttgag gaatatct 28 <210>4 <211>32 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引子 <400> 4 gacctgctgg tacctaaaat aaagagatga aa 32

<210>5 <211>30 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引子 <400> 5 tcgatctaga ctgactcata atttttcccc 30 <210〉6 <211>32 <212>DNA <213>人工序列 <220>

<223>引子 <400〉 6 acactttcta gaataatttg aggttcgcta tg 32 <210>7 <211>22 <212> DNA <213>人工序列 <220 <223>引子 <400 7 catggcatgc ggtgcttact eg 22 1354026 . ,·”，·丨丨，曰修(声)正 • ....... * — -rj 附件3A :第094124158號申請專利範圍修正本 - 民國100年 7月11日修正 . 十、申請專利範圍 1·—種於經編碼大腸桿菌之鳥胺酸脫羧酶（ODC)的多 核苷酸轉形之微生物中生化合成1,4-丁二胺之方法，其特 徵在於與未經轉形之微生物的天然ODC活性相比較，該 經轉形之微生物具有增加之ODC活性，其中與該天然 φ 〇DC活性相比較’該增加之ODC活性係藉由於可經異丙 基_β·〇_硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG)誘導之啓動子的控制下 使編碼大腸桿菌ODC之多核苷酸過度表現而獲致，且該 經轉形之微生物所產製之1，4-丁二胺係分泌至醱酵培養液 中並自該醱酵培養液中回收。 2·如申請專利範圍第1項之方法，其中該可經IPTG 誘導之啓動子係選自T7、T5、ptac或plac之啓動子。 3 .如申請專利範圍第1項之方法，其中該鳥胺酸脫羧 • 酶編碼基因具有位於該基因之編碼區域上端的核糖體結合 部位（RBS)，該RBS係經修改以使核糖體對RNA模板能有 較佳之辨識。 4 .如申請專利範圍第1項之方法，其中該過度表現之 鳥胺酸脫羧酶編碼基因係鳥胺酸脫羧酶speF或speC基因 (其皆屬於 E.C. 4. 1 · 1 . 1 7)。 5 .如申請專利範圍第4項之方法，其中該過度表現之 鳥胺酸脫羧酶編碼基因係鳥胺酸脫羧酶speF基因。 6.如申請專利範圍第1項之方法，其中除了增加之 1354026 〇DC活性之外，藉由過度表現下述之基因亦增加至少2種 其他酶之活性： (〇精胺酸脫羧酶編碼基因3?^(屬於£工.4.1.1.19)和 緋精胺酶（agmatinase)編碼基因speB(屬於E.C. 3.5.3.11 ; 亦稱爲緋精胺（agmatine)尿素水解酶編碼基因）；或 (ii)精胺酸脫羧酶編碼基因speA(屬於E.C. 4.1.1.19) 、鮮精胺亞胺水解酶編碼基因aguA(屬於E.C. 3.5.3.12; 亦稱爲緋精胺去亞胺酶編碼基因）、及N-氨基甲醯基腐胺 醯胺水解酶編碼基因aguB(屬於E.C. 3.5.1.53)、及可選擇 之鯡精胺酶編碼基因speB (屬於E.C. 3.5.3.1 1)。 7 .如申請專利範圍第6項之方法，其中該過度表現之 精胺酸脫羧酶編碼基因係源自選自埃希氏菌屬 (Escherichia)、志賀氏菌屬（Shigella)、沙門氏菌屬 (Salmonella)、耶爾森氏菌屬（Yersinia)、巴斯德氏菌屬 (Pasteurella)或奈瑟氏球菌屬（Neisseria)之菌屬的精胺酸脫 殘酶基因speA ^ 8 .如申請專利範圍第7項之方法·，其中該過度表現之 精胺酸脫羧酶編碼基因係源自選自大腸桿菌（Escherichia coli)、弗氏志賀氏菌（Shigella flexneri)、腸炎沙門氏菌 (Salmonella enterica)、鼠疫耶爾森氏菌（Yersinia pestis) 、多殺巴斯德氏菌（Pasteurella multocida)或腦膜炎奈瑟氏 球菌（Neisseria meningitidis)之菌種的精胺酸脫羧酶基因 s p e A 〇 9.如申請專利範圍第8項之方法，其中該過度表現之 -2- 1354026 緋精胺酶編碼基因係源自選自埃希氏菌屬（Escherichia)、 沙門氏菌屬（Salmonella)、變形菌屬（Proteus)、發光菌屬 (Photorhabdus)、弧菌屬（Vibrio)或奈瑟氏球菌屬 (Neisseria)之菌屬的鮮精胺酶基因speB。 10.如申請專利範圍第9項之方法，其中該過度表現 之緋精胺酶編碼基因係源自選自大腸桿菌（Escherichia coli)、腸炎沙門氏菌（Salmonella enterica)、奇異變形菌 (Proteus mirabilis)、發光桿菌（Photorhabdus luminescens) 、霍亂弧菌（Vibrio cholerae)或腦膜炎奈瑟氏球菌 (Neisseria meningitidis)之菌種的緋精胺酶基因speB。 1 1 .如申請專利範圍第1 0項之方法，其中該過度表現 之鮮精胺亞胺水解酶編碼基因及/或該過度表現之N-氨基 甲醯基腐胺醯胺水解酶編碼基因係源自選自假單胞菌屬

(Pseudomonas)、鏈球菌屬（Streptococcus)、鏈霉菌屬 (Streptomyces)、固氮菌屬（Azotobacter)、擬南芥屬 (Arabidopsis)、新鞘桿菌屬（Novosphingobium)或芽孢桿菌 屬（Bacillus)之屬的緋精胺亞胺水解酶基因aguA及/或N-氨基甲醯基腐胺醯胺水解酶基因aguB。 12.如申請專利範圍第11項之方法，其中該過度表現 之緋精胺亞胺水解酶編碼基因及/或該過度表現之N-氨基 甲醯基腐胺醯胺水解酶編碼基因係源自選自綠濃桿菌 (Pseudomonas aeruginosa)、轉糖鏈球菌（Streptococcus mutans)、阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis)、維涅蘭 德固氮菌（Azotobacter vinelandii)、阿拉伯芥（Arabidopsis 1354026 thaliana)、 芳香新鞘桿 aromaticivorans)或蠟·狀芽孢桿菌（B 的緋精胺亞胺水解酶基因aguA » /试

aguA及/或N_氨基甲醯基腐胺醯 胺水解酶基因aguB。 1 3 ·如申ββ專利範圍桌1至1 2項中任—項之方法，其 中實施該方法時，同時確保增加細胞內之鳥胺酸含量。 14.如申請專利範圍第1至12項中任一項之方法，其 中係於宿主生物中進行該方法，該宿主生物係選自酵母菌 (Saccharomyces sp.)、芽孢桿菌（Bacillus sp )、棒桿菌 (Corynebacterium sp.)、埃希氏菌（Escherichia sp_)或畢赤 酵母菌（Pichia sp.)。 1 5 ·如申請專利範圍第1至1 2項中任一項之方法，其 中係於宿主生物中進行該方法，該宿主生物係選自釀酒酵 母（Saccharomyces cerevisiae)、棒桿菌或埃希氏菌，且其 中除了增加鳥胺酸脫羧酶活性之外，至少亦增加精胺酸脫 羧酶和緋精胺酶及/或緋精胺亞胺水解酶和N ·氨基甲醯基 腐胺醯胺水解酶之活性。 -4