CN101006183A

CN101006183A - 1,4－丁二胺的生物化学合成

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Publication number: CN101006183A
Application number: CNA2005800238076A
Authority: CN
Inventors: 卡特林·艾浦勒玛恩; 彼得吕斯·马蒂纳斯·马特乌斯·诺斯恩; 苏珊娜·玛丽亚·克里玛; 马塞尔·格哈杜斯·乌博尔特斯
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2004-07-15
Filing date: 2005-07-11
Publication date: 2007-07-25
Anticipated expiration: 2025-07-11
Also published as: EP2236613B1; JP5010470B2; JP2012130343A; TWI354026B; ZA200700072B; US20160319311A1; EA011232B1; AU2005261862B2; US9523083B2; PL2236613T3; EP2236613A1; UA91686C2; JP2008505652A; TW200613558A; MX2007000565A; CA2571531A1; EP1781799B1; NZ552628A; PL1781799T3; AU2005261862A1

Abstract

本发明涉及一种方法，用于对1，4－丁二胺进行生物化学合成，这是在下述微生物中进行的，所述微生物具有较之鸟氨酸脱羧酶活性的天然水平来说增加的鸟氨酸脱羧酶活性(增加的ODC活性)水平，其中，增加的ODC活性是通过具有增加的翻译和/或转录效率的鸟氨酸脱羧酶编码基因的过量表达来获得的，并且其中，微生物中产生的1，4－丁二胺被排出到发酵培养液中，从发酵培养液中对其进行回收。在优选的实施方式中，增加的酶活性还通过过量表达下述基因来实现(i)精氨酸脱羧酶编码基因speA和胍基丁胺酶编码基因speB，或(ii)精氨酸脱羧酶编码基因speA和胍基丁胺亚氨水解酶编码基因aguA以及N－氨基甲酰腐胺酰胺水解酶编码基因aguB，以及可选地，还有胍基丁胺酶编码基因speB。本发明还涉及携带有增加的活性水平的上述一种或多种酶活性的载体、质粒和宿主。

Description

1，4-丁二胺的生物化学合成

本发明涉及一种新的方法，用于对1，4-丁二胺(CAS编号110-60-1；也被称为四亚甲基二胺的化合物；在生物化学文献中还被称为腐胺)进行生物化学合成，这是在下述微生物中进行的，所述微生物具有较之鸟氨酸脱羧酶活性的天然水平来说增加的鸟氨酸脱羧酶活性水平。鸟氨酸脱羧酶在下文中还将被称为“ODC”。“增加的鸟氨酸脱羧酶活性水平”在下文中还将被称为“增加的ODC活性”。通常，具有ODC活性的微生物已知能生产多胺，例如亚精胺和精胺，这分别是产品N-(3-氨基丙基)-1，4-丁二胺和N，N’-二(3-氨基丙基)-1，4-丁二胺的俗名。此类化合物，以及多种短的线性二胺自身，例如1，4-丁二胺和1，5-戊二胺(也被称为尸胺)通常在生物化学研究中被称为多胺，即使从严格化学定义多胺的角度来说，将期待更高数量的氨基。但是，就本专利申请的目的而言，术语多胺按照其生物化学含义来使用，因此其包括1，4-丁二胺。

化合物1，4-丁二胺是生产一些主要工程塑料(聚酰胺-4，6，均聚物或共聚物形式的，例如，与大约5wt.％的聚酰胺-6单体(己内酰胺)的共聚物)的重要原材料。均聚物聚酰胺-4，6(尼龙-4，6)早在1938年就描述过了(US-A-2，130,948，Carothers)。其是单体1，4-丁二胺和己二酸的缩聚产物。目前，尤其是聚酰胺-4，6的化合物是荷兰DSM以STANYL的商品名生产销售的。

为合成1，4-丁二胺，已知大量化学途径。所有这些化学途径有如下缺点：起始材料不得不从被认为是不可更新的来源获得。但是人们非常需要提供新的可行途径，用于从可更新碳源以及使用活细胞内的生物化学方法(也被称为“生物转化”)来合成1，4-丁二胺。通常，多胺被认为对于生物化学生产中使用的任何细胞或微生物来说都是有毒的。因此，直到现在，人们仍相信此类通过生物化学合成的新途径是没有吸引力的。

这可例如从下述参考文献中了解到：Fukuchi et al.，J.Biol.Chem.，Vol.270(1995)，pages 18831-18835和Suzuki et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.91(1994)，pages 8930-8934。

Fukuchi清楚地描述了由于在亚精胺乙酰转移酶缺陷型E.coli细胞中(即，在缺乏乙酰转移酶SpeG的细胞中)亚精胺的积累导致的细胞存活率(以及对几乎所有种类蛋白质的合成)降低。亚精胺是细胞中从1，4-丁二胺生产的作为中间产物的产品。因此，对1，4-丁二胺生物合成不可避免也会导致亚精胺的产生。

Suzuki一方面也展示了(在小鼠细胞中)ODC的过量产生导致多胺尤其是亚精胺的积累，并且，加入少量亚精胺，甚至在非speG缺陷型的细胞中也已观察到了细胞死亡。

应当注意到，Limsuwum et al.(J.Bacteriol.Vol.182(2000)，pages 5373-5380)已经显示，低温下，此类问题可通过专用的基因speG的过量表达来克服。Suzuki et al.(上述的)表示，降低的细胞存活率是由于抗酶对ODC不足够的反馈抑制导致的，其可以通过合适的抗酶的过量生产来克服。对抗酶的此类过量生产还将减少细胞中多胺的产生，因此对于DAB生产来说是不可行的。

此外，如Kashiwagi et al.在J.Bacteriol.Vol.170(1988)，pages 3131-3135中所述，可通过鸟氨酸脱羧酶(ODC)编码基因(特别是组成型表达的speC)的过量表达来调节E.coli中多胺的含量。为进行他们的实验，如通过Boyle et al.(Methods in Enzymology，Vol.94(1983)，pages 117-121所生产的质粒pODC被用于克隆。如Kashiwagi et al.所教导的，天然转录和翻译控制(即使用由核糖体结合位点和启动子构成的天然遗传元件)下，鸟氨酸脱羧酶SpeC甚至70倍的过量生产也仅导致1，4-丁二胺细胞内和细胞外含量总和水平的略微增加。从引用的Kashiwagi参考文献可以看出，所述作者不能达到比大约25mg/l更高的1，4-丁二胺生产水平(没有鸟氨酸进料的情况下)。此外，他们显示，细胞中ODC的过量生产导致细胞中鸟氨酸含量强烈降低(从大约65μmol/l至小于1μmol/l)，推断出，当ODC过量产生时细胞会变得缺少鸟氨酸。Kashiwagi et al.尝试了通过外界进料鸟氨酸来消除所观察到的鸟氨酸含量限制，但是，虽然获得了略微的改进，但是1，4-丁二胺的生产水平并没有高于大约30mg/l。由于所述的ODC过量产生导致的对前体供应的限制，还因为预计蛋白质例如ODC的更高水平会导致细胞中毒性作用增加(由于存在更高含量的多胺)，本领域技术人员考虑到上述文献，将推测到，不可能提供能以明显高于30mg/l的水平生产1，4-丁二胺的生物化学合成方法。

EP-A-0726240直到目前仍是涉及对多胺(包括1，4-丁二胺)进行生物化学合成的非常稀少的专利文献之一。但是，其除了其它方面之外，描述的是通过对含有蛋白质作为主要组分的天然产品进行发酵来生产1，4-丁二胺。在所述方法中，首先通过将其部分或完全降解来处理天然产品，然后在发酵步骤之前除去任何不想要的化合物(例如，Hg、Cr、As、Cd、Se和Pb)、细胞生长抑制剂、杀虫剂、抗生素、去垢剂、皂、脂肪、油、氰化物和苯酚。此类途径产生的腐胺和其它二胺被(再)利用作为肥料，但是含有不适合作为生产例如聚酰胺-4，6的原材料的上述大量其它物质。

因此，人们仍需要高效的生物合成途径，用于以显著高于大约30mg/l的滴定浓度来合成1，4-丁二胺，优选地，不需要外界进料(昂贵的)鸟氨酸。对1，4-丁二胺的提高的可获得性的需要主要基于其作为起始材料的期望用途，例如用于生产聚酰胺-4，6。通常，至今已知的获得1，4-丁二胺的途径都相当麻烦费力，而且可能导致所述产品的质量(未经进一步纯化的情况下)难以用于生产尼龙。已知获得1，4-丁二胺的化学途径需要相对昂贵的起始材料和反应物(包括难以操作的反应物)以及多步骤和多反应器设计中关于温度和压力的相对严格的反应条件，以及要用到昂贵的催化剂体系。因此，人们仍需要替代性的获得1，4-丁二胺的途径，优选从廉价得多的原材料来进行，并且要避免操作例如氢氰酸的反应物的问题。已知天然生长的(因此可更新的)、来源于农业生产的材料是可用于发酵中的碳源例如葡萄糖(或其它合适碳源及其混合物)的基础。此类可更新的材料相对廉价并且资源丰富。通常，如果可更新材料可被用作为针对所有种类的化学材料的起始材料，这会被认为是非常有利的。

因此，本发明的一个目的是提供用于通过生物转化大规模工业生产1，4-丁二胺的改进可能性。

本发明的发明人令人吃惊地发现，该目的可用用于生物化学合成1，4-丁二胺的新方法来获得，所述生物化学合成在微生物中进行，所述微生物具有较之鸟氨酸脱羧酶活性的天然水平来说增加的鸟氨酸脱羧酶活性(增加的ODC活性)水平，其中，增加的ODC活性是通过具有增加的翻译和/或转录效率的鸟氨酸脱羧酶编码基因的过量表达来获得的，并且其中，通过生物转化在此类微生物中产生的1，4-丁二胺被排出到发酵培养液中，从发酵培养液中对其进行回收。

因此根据本发明，提供了用于合成1，4-丁二胺的改进生物化学方法，得到的1，4-丁二胺非常适合用作为原材料，例如，用于生产聚酰胺-4，6。

本专利申请中，术语“生物化学合成”(在本专利申请上下文中，该术语或者可称为“生物转化”)不仅包括：除大量纯粹的化学反应步骤之外，包括使用合适的生产菌株的全细胞进行的一种或多种生物催化反应的方法，而且还包括使用合适的生产菌株的全细胞进行的纯粹的生物化学方法。此类纯粹的生物化学方法，在生物化学合成起始自合适的碳源的情况下被称为发酵，在生物合成起始自已具有由其可获得待合成目标分子的碳骨架的中间产物的情况下，被称为前体发酵。该方法可在需氧或厌氧条件下进行。

本发明生物化学合成中的生物催化反应可在体内或体外进行。通常，体内方法是用活细胞进行的方法(术语“活细胞”由此包括所谓的静止细胞)；另一方面，在体外方法中，通常是使用细胞裂解物或(部分)纯化的酶进行的。根据本发明的生物化学合成在微生物中进行。这可以用合适的生产菌株的全细胞来进行，也可以用透过的(permabilized)细胞来进行；但是体内和体外之间的差异对于可用透过的细胞或固定的宿主细胞进行的方法来说不会产生多大意义。但是，明显地，本发明方法的各个生物催化步骤，例如用固定的酶来进行时，被认为与本申请上下文中所指的生物化学合成中的此类步骤等同。

鸟氨酸脱羧酶(即，具有鸟氨酸脱羧基活性的酶，或ODCs)是分类进E.C.4.1.1.17类的酶。可容易地在标准条件(存在鸟氨酸和PLP的情况下，37℃)下、不含细胞的提取物中、使用Sigma Diagnostics二氧化碳检测试剂盒(Sigma)，对如果过量生产的鸟氨酸脱羧酶的活性水平与鸟氨酸脱羧酶的天然(非过量生产的)水平加以比较；试验描述于Osterman，A.L.et al.1994，Biochemistry 33，p.13662-13667中。因此，技术人员能通过测定蛋白含量或通过测定RNA水平容易地判定：基于增加的翻译和/或转录效率，所用的ODC较之所用的微生物中鸟氨酸脱羧酶的天然水平是否具有增加的鸟氨酸脱羧酶活性水平(增加的ODC活性)。用于测定蛋白含量的多种标准流程，例如比色法或分光光度法在Lottspeich and Zorbas，Bioanalytik，Spektrum Akademischer Verlag GmbH，Heidelberg/Berlin，ISBN3-8274-0041-4(1998)，Chapters 3，5，21，22and24中有所描述。用于测定蛋白水平以及RNA水平的方法，例如Northern杂交、RT-PCR和很多其它技术，描述于J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-309-6(1989)中。但是，很多其它标准流程对于该分析领域的技术人员来说是已知的，无须在此提到。

可用于本发明方法的合适的鸟氨酸脱羧酶是能对鸟氨酸进行脱羧的所有酶及其突变体。任何此类酶可以以增加的活性水平用于本发明的方法中，即，以通过过量表达具有增加的转录和/或翻译效率的鸟氨酸脱羧酶基因方式的过量产生的形式用于本发明的方法。此外还应提到，在本文中，针对任何具体命名的酶活性的术语“增加的活性水平”，还包括下述情况：其中，此类酶活性(例如鸟氨酸脱羧酶)的活性在反应发生于其中的微生物的天然来源中根本不存在，但是通过具有增加的转录和/或翻译效率的遗传修饰有目的地引入该微生物中。

如上所述，在对1，4-丁二胺的生物化学合成中，可以使用任何ODC酶，其中，增加的ODC活性是通过过量表达具有增加的翻译和/或转录效率的ODC编码基因来获得的。优选地，增加的翻译和/或转录效率是通过用强的、被调控的启动子来获得的，优选通过使用强的诱导型启动子来获得。

最优选地，增加的翻译和/或转录效率是通过使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导型强启动子来获得的。合适的强启动子描述于J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-309-6(1989)中。

特别地，增加的翻译和/或转录效率是使用选自T7、T5、ptac和plac启动子构成的组的启动子来获得的。对启动子的最佳选择取决于所用的宿主和所应用的反应条件，这对于本领域的技术人员来说是清楚的。

在本发明的一种非常优选的实施方式中，鸟氨酸脱羧酶编码基因具有核糖体结合位点(RBS)，其定位于所述基因编码区域的上游，所述RBS被改造为能获得核糖体对RNA模板的更好识别。对RBS的改造可通过技术人员已知的任何方法来进行，并将考虑到所用的宿主的特殊属性等。

最优选地，过量表达的鸟氨酸脱羧酶编码基因是鸟氨酸脱羧酶speF或speC基因(每种都属于E.C.4.1.1.17)。迄今为止，在文献中对SpeC的研究比对SpeF的研究要多得多。然而，最令人吃惊地，也是最优选地，根据本发明的最佳结果是用鸟氨酸脱羧酶speF基因的时候获得的。

特别优选地，用于本发明的方法中的过量表达的鸟氨酸脱羧酶编码基因是来自选自Escherichia、Shigella、Salmonella、Yersinia和Shewanella构成的组的属之一的鸟氨酸脱羧酶基因speF或speC。鸟氨酸脱羧酶speF是诱导型鸟氨酸脱羧酶；鸟氨酸脱羧酶speC是组成型鸟氨酸脱羧酶。

更优选地，过量表达的鸟氨酸脱羧酶编码基因是来自选自Escherichiacoli、Shigella flexneri、Salmonella typhimutium、Yersinia pestis和Shewanella oneidensis的组的种之一的鸟氨酸脱羧酶基因。最优选地，过量表达的鸟氨酸脱羧酶编码基因是来自选自Escherichia coli、Salmonellatyphimutium和Shewanella oneidensis的组的种之一的speF。当与用组成型鸟氨酸脱羧酶编码基因speC的过量表达获得的结果相比较时，迄今为止根据本发明的最佳结果事实上是使用speF的时候获得的。

根据本发明，特别地，具有与来自E.coli对照酶的ODC足够的相同性，即至少30％，更优选至少45％，最优选至少65％的相同性，并能催化鸟氨酸脱羧反应的所有鸟氨酸脱羧酶都可使用。很多ODC已知与E.coli对照酶具有上述相对高水平的相同性。

测定与对照酶的相同性百分比可通过技术人员已知的方法来进行，例如通过用对照酶的蛋白序列作为“查询序列”以针对公众数据库进行搜索，来例如鉴定出其它家族成员或相关序列。此类搜索可使用BLAST程序(2.2版)，采用相应程序的缺省参数来进行。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。

因此，根据本发明，提供了一种改进的生物化学方法，用于合成1，4-丁二胺，得到的1，4-丁二胺非常适用于作为原材料，用于生产聚酰胺-4，6和/或其它多胺。

在本发明的上下文中，与编码上述鸟氨酸脱羧酶的任何基因同源，并且编码具有足以与所示鸟氨酸脱羧酶相当的鸟氨酸脱羧酶活性的酶的任何基因可被认为是其等同物，并且适合用于本发明的方法，这将是清楚的。适合地，此类等同基因可通过技术人员已知的任何合适的克隆策略来获得，例如，通过本文实验部分描述的方法来获得。或者，此类等同鸟氨酸脱羧酶基因还可通过有目的的构建来获得。

在本发明的另一种优选的实施方式中，用于生物化学合成1，4-丁二胺的方法在下述微生物中进行，其中，除增加的ODC活性之外，另外对于至少两种其它的酶也获得增加的酶活性，这是通过过量表达下述酶来获得：

(i)精氨酸脱羧酶编码基因speA(属于E.C.4.1.1.19)和胍基丁胺酶编码基因speB(属于E.C.3.5.3.11；还被称为胍基丁胺脲水解酶(agmatine ureahydrolase)编码基因)；或

(ii)精氨酸脱羧酶编码基因speA(属于E.C.4.1.1.19)和胍基丁胺亚氨水解酶编码基因aguA(属于E.C.3.5.3.12；还被称为胍基丁胺脱亚氨酶编码基因)以及N-氨基甲酰腐胺酰胺水解酶编码基因aguB(属于E.C.3.5.1.53)，以及可选地，还有胍基丁胺酶编码基因speB(属于E.C.3.5.3.11)。

本文中针对这些额外增加的酶活性的过量表达可通过技术人员已知的任何方法来获得；例如通过增加各个基因的翻译和/或转录效率来获得，还可以通过任何其它已知技术，例如增加基因拷贝数，或者通过突变增加酶的内源活性或结构，或者使用被去调节的酶来获得。在上述另一种优选实施方式的部分(i)中，SpeA和SpeB的组合被用于代表SpeA和SpeB的任何功能型组合(无论是融合蛋白的形式，或单独的酶活性)。事实上，该组合还可被命名为SpeAB。部分(ii)代表：在SpeA和SpeB的此类组合中，SpeB部分自身可被AguA和AguB的任何功能性组合(无论是融合蛋白的形式，或单独的酶活性)替代。

Janowitz et al.，FEBS Letters 544(2003)，258-261已描述了胍基丁胺脱亚氨酶AguA在高等植物中用于精氨酸脱羧酶途径。还从Nakada et al.，Microbiology，149(2003)，707-714已知，SpeB催化的转化还可由植物中存在的酶来催化，即，通过胍基丁胺脱亚氨酶AguA与N-氨基甲酰腐胺酰胺水解酶AguB的组合作用来催化。因此，AguB和AguB在本发明的上下文中可代替SpeB或者甚至可以与其组合使用。此类aguA和aguB基因的来源可以是Arabidopsis thaliana和Lycopersicon esculentum，但是在Pseudomonas aeroginosa的突变体中可发现相当的基因。

在本发明的上下文中，与编码上述精氨酸脱羧酶的基因(分别是胍基丁胺酶或胍基丁胺亚氨基水解酶或N-氨基甲酰腐胺酰胺水解酶)同源，并能编码具有足以与各个酶相当的精氨酸脱羧酶(分别是胍基丁胺酶或胍基丁胺亚氨基水解酶或N-氨基甲酰腐胺酰胺水解酶)活性的此类各个酶的任何基因(根据各个情况而定)可被认为是其等同物，并且适合用于本发明方法的该另一种优选的实施方式，这将是清楚的。适合地，此类等同基因可通过技术人员已知的任何合适的克隆策略来获得，例如，通过本文实验部分描述的方法来获得。或者，此类等同基因还可通过有目的的构建来获得。

因此，在本发明方法的该优选实施方式中，还使用过量表达的基因的其它组合，即编码(i)精氨酸脱羧酶以及胍基丁胺酶，或(ii)精氨酸脱羧酶以及胍基丁胺亚氨基水解酶以及N-氨基甲酰腐胺酰胺水解酶，和可选地，胍基丁胺酶的基因。

在本发明的该另一种优选的实施方式中，过量表达的精氨酸脱羧酶编码基因优选是来自选自Escherichia、shigella、Salmonella、Yersinia、Pasteurella和Neisseria构成的组的属之一的精氨酸脱羧酶基因speA。更优选地，过量表达的精氨酸脱羧酶编码基因是来自选自Escherichia coli、Shigella flexneri、Salmonella enterica、Yersinia pestis、Pasteurella multocida和Neisseria meningitidis构成的组的种之一的精氨酸脱羧酶基因speA。

根据本发明，特别地，具有与来自E.coli对照酶的精氨酸脱羧酶足够的相同性，即至少30％，更优选至少45％，最优选至少65％的相同性，并能催化精氨酸脱羧反应的所有精氨酸脱羧酶都可使用。很多精氨酸脱羧酶已知与E.coli对照酶具有上述相对高水平的相同性。

在本发明的该另一种优选的实施方式中，过量表达的胍基丁胺酶编码基因优选是来自选自Escherichia、Salmonella、Proteus、Photorhabdus、Vibrio和Neisseria构成的组的属之一的胍基丁胺酶基因speB。更优选地，过量表达的胍基丁胺酶编码基因是来自选自Escherichia coli、Salmonellaenterica、Proteus mirabilis、Photorhabdus luminescens、Vibrio cholerae和Neisseria meningitidis构成的组的种之一的胍基丁胺酶基因speB。

根据本发明，特别地，具有与来自E.coli对照酶的胍基丁胺酶足够的相同性，即至少30％，更优选至少45％，最优选至少60％的相同性，并能催化胍基丁胺酶反应的所有胍基丁胺酶都可使用。很多胍基丁胺酶已知与E.coli对照酶具有上述相对高水平的相同性。

在本发明的该另一种优选的实施方式中，此外，过量表达的胍基丁胺亚氨基水解酶编码基因和/或过量表达的N-氨基甲酰腐胺酰胺水解酶编码基因优选是来自选自Pseudomonas、Streptococcus、Streptomyces、Azotobacter、Arabidopsis、Novosphingobium和Bacillus构成的组的属之一的胍基丁胺亚氨基水解酶基因aguA和/或N-氨基甲酰腐胺酰胺水解酶基因aguB。更优选地，过量表达的胍基丁胺亚氨基水解酶编码基因和/或过量表达的N-氨基甲酰腐胺酰胺水解酶编码基因是来自选自Pseudomonasaeruginosa、Streptococcus mutans、Streptomyces avermitilis、Azotobactervinelandii、Arabidopsis thaliana、Novosphingobium aromaticivorans和Bacillus cereus构成的组的种之一的胍基丁胺亚氨基水解酶基因aguA和/或N-氨基甲酰腐胺酰胺水解酶基因aguB。

根据本发明，特别地，具有与来自Pseudomonas对照酶的胍基丁胺亚氨基水解酶和/或N-氨基甲酰腐胺酰胺水解酶足够的相同性，即至少30％，最优选至少40％的相同性，并能催化胍基丁胺亚氨基水解酶、N-氨基甲酰腐胺酰胺水解酶分别的反应的所有胍基丁胺亚氨基水解酶和/或N-氨基甲酰腐胺酰胺水解酶都可使用。很多胍基丁胺亚氨基水解酶和/或N-氨基甲酰腐胺酰胺水解酶已知与Pseudomonas对照酶具有上述相对高水平的相同性。

优选地，根据本发明的方法在确保鸟氨酸细胞内水平增加的情况下进行。这可例如通过鸟氨酸的外界进料来获得。

本发明的方法可在任何合适的宿主生物中进行。宿主可选自生物合成领域技术人员通常已知的生产用生物(或细胞)的组。此类生物可以来自真核生物来源，或者更优选地，来自原核生物来源。真核细胞，例如，可以是来自植物和真菌的细胞，以及来自多种其它组的细胞，其它组可被合称为“原生生物界”。

特别优选地，本发明的方法在选自由Saccharomyces sp.、Bacillussp.、Corynebacterium sp.、Escherichia sp.和Pichia sp.构成的组的宿主生物中进行。

在本发明的方法中，尤其优选地，用作为宿主的微生物能生产鸟氨酸和/或精氨酸。对于大多数天然的微生物而言，该要求可达到，因为此类能力在所有野生型菌株中都是可获得的，因为精氨酸是必要的氨基酸。

这些种中，Escherichia sp.是优选的，因为它们易于通过遗传操作进行操纵，以提供具有想要的过量表达酶活性的菌株。此外，Escherichia sp.已天然含有几乎每一种上述酶活性(即，除来自植物的agu基因之外)，使得大多数过量表达的基因可被用作为同源基因。此外，Corynebacterium sp.(虽然缺乏天然鸟氨酸脱羧酶)是特别优选的，因为其是合适的谷氨酸盐/酯生产菌株，易于在发酵过程中被操纵。

在本发明的方法中，谷氨酸盐/酯是非常合适的前体。因此，该方法优选在能形成谷氨酸盐/酯的宿主菌株(例如，Corynebacterium glutamicum)中进行。

当根据本发明的方法在选自Saccharomyces cerevisiae、Corynebacterium sp.和Escherichia sp.构成的组的宿主生物中进行时，获得最佳结果，其中，除鸟氨酸脱羧酶活性之外，精氨酸脱羧酶和至少胍基丁胺酶或胍基丁胺亚氨基水解酶以及N-氨基甲酰腐胺酰胺水解酶酶活性以较之与宿主微生物同源的所述酶活性的天然水平而言增加的活性水平存在于宿主微生物中。

本发明的方法优选在也可用作为发酵条件的反应条件下进行，这将是清楚的。该方法因此可以以分批方式进行，如果需要的话也可以以补料方式进行。可以方便地确保用作为宿主生物的生物具有或被提供了用于所形成的1，4-丁二胺的合适的出口系统：优选地，此类出口系统是天然的。

本发明当然还包括下述所有载体、质粒和宿主，它们携带有活性水平增加的、所附权利要求所述的上述酶活性的一种或多种。

一些实验结果将阐述本发明，但并以任何方式来限制本发明的范围。

实验部分

常规流程

标准流程被用于所有DNA操作(Sambrook，J.et al.(1989)，Molecularcloning：a laboratory manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。如果没有另外指明的话，DNA是从E.coli LJ110(Zeppenfeld，et al.(2000)，J Bacteriol.182，4443-4452)的染色体DNA扩增来的。PCR扩增是用校正型酶SAWADY Pwo-DNA-聚合酶(Peqlab Biotechnologie GmbH，Erlangen，Germany)或Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)按照厂商提供的方案来进行的，而对构建的菌株的验证是利用Taq聚合酶READYMIX(Sigma，Taufkirchen，Germany)通过菌落PCR来进行的。用于随后克隆以及进一步突变的限制性位点是用从MWG-Biotech(Ebersberg，Germany)购得的寡核苷酸引入的。DNA片段是用MinElute凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)按照厂商提供的方案来纯化的。对质粒DNA的制备是利用QIAprep spin Miniprep Kit(Qiagen，Hilden，Germany)来完成的。对构建的质粒的验证是通过限制性分析以及随后的测序来进行的(Agowa，Berlin，Germany)。

构建质粒

(i)构建质粒pDAB3(pJF119EH-speC_nRBS)

将E.coli LJ110(Zeppenfeld，et al.，见常规流程)的(组成型、生物合成)鸟氨酸脱羧酶编码基因speC克隆进表达载体pJF119EH(Fürste，J.P.et al.(1986)，Gene48，119-131)，允许在基于异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导型tac启动子和lac遏制子系统(lacl^Q)的转录控制下的强基因表达。因此，编码基因speC与原始RBS、起始密码子和终止密码子一起被克隆。

从E.coli LJ110的染色体DNA扩增得到2235 bp的含speC_nRBS的DNA片段(编号AE000379；2650-4867位核苷酸)，其中使用下述寡核苷酸：

5′-GAG CTC TAG ACC AGT TTG ACC CAT ATC T-3′[SEQ ID：No.1]

(突变以粗体显示，XbaI限制性位点以斜体显示)

以及

5′-TTT TGC ATG CTT ACT TCA ACA CAT AAC CGT AC-3′[SEQ ID：No.2]

(突变以粗体显示，SphI限制性位点以斜体显示)

用内切核酸酶XbaI和SphI进行末端修饰之后，将PCR产物连接进以同样手段切割的质粒pJF119EH中。转化进E.coli DH5α细胞(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)后，在含有100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化子。制备之后，对获得的质粒pDAB3(pJF119EH-speC_nRBS，7491bp)的验证通过限制性分析和随后的测序来进行。

(ii)构建质粒pDAB4(pJF119EH-speC_aRBS)

将E.coli LJ110(Zeppenfeld，et al.，见常规流程)的(组成型、生物合成)鸟氨酸脱羧酶编码基因speC克隆进表达载体pJF119EH(Fürste，J.P.et al.(1986)，Gene 48，119-131)，允许在基于异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导型tac启动子和lac遏制子系统(lacl^Q)的转录控制下的强基因表达。因此，编码基因speC与原始的起始密码子和终止密码子一起被克隆。因为利用硅片上研究没有确定针对cpeC的保守核糖体结合位点(RBS)，位于speC起始密码子上游7bp的RBS通过定点诱变被改造为E.coli的保守序列。

从E.coli LJ110的染色体DNA扩增得到2235 bp的含speC_aRBS的DNA片段(编号AE000379；2650-4867位核苷酸)，其中使用下述寡核苷酸：

5′-GAG CTC TAG ACC AGT TTG AGG AAT ATC T-3′[SEQ ID：No.3]

(突变以粗体显示，XbaI限制性位点以斜体显示)

以及

5′-TTT TGC ATG CTT ACT TCA ACA CAT AAC CGT AC-3′[SEQ ID：No.2]

(突变以粗体显示，SphI限制性位点以斜体显示)

用内切核酸酶XbaI和SphI进行末端修饰之后，将PCR产物连接进以同样手段切割的质粒pJF119EH中。转化进E.coli DH5α细胞(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)后，在含有100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化子。制备之后，对获得的质粒pDAB4(pJF119EH-speC_aRBS，7491bp)的验证通过限制性分析和随后的测序来进行。

(iii)构建质粒pDAB2(pJF119EH-speF)

将E.coli LJ110(Zeppenfeld，et al.，见常规流程)的(组成型、生物降解)鸟氨酸脱羧酶编码基因speF克隆进表达载体pJF119EH(Fürste，J.P.et al.(1986)，Gene 48，119-131)。该载体允许在基于异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导型tac启动子和lac遏制子系统(lacl^Q)对克隆基因的转录控制下的高水平蛋白生产。为构建表达质粒pDAB2(pJF119EH-speF)，编码基因speF与原始的RBS(核糖体结合位点)、起始密码子和终止密码子一起被克隆。

从E.coli LJ110的染色体DNA扩增得到2247bp的含speF的DNA片段(编号AE000172；10242-12468位核苷酸)，其中使用下述寡核苷酸：

5′-GAC CTG CTG GTA CCT AAA ATA AAG AGA TGA AA-3′[SEQ ID：No.4]

(突变以粗体显示，KpnI限制性位点以斜体显示)

以及

5′-TCG ATC TAG ACT GAC TCA TAA TTT TTC CCC-3′[SEQ ID：No.5]

(突变以粗体显示，XbaI限制性位点以斜体显示)

用内切核酸酶KpnI和XbaI对该片段进行末端修饰，并连接进以同样手段切割的质粒pJF119EH中。转化进E.coli DH5α细胞(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)后，在含有100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化子。制备之后，对获得的质粒pDAB2(pJF119EH-speF，7502bp)的验证通过限制性分析和随后的测序来进行。

(iv)构建质粒pDAB7(pJF119EH-speAB)

将E.coli LJ110(Zeppenfeld，et al.，见常规流程)的编码胍基丁胺酶的speB和精氨酸脱羧酶编码基因speA克隆进表达载体pJF119EH(Fürste，J.P.et al.(1986)，Gene 48，119-131)，允许在基于异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导型tac启动子和lac遏制子系统(lacl^Q)对克隆基因的转录控制下的高水平蛋白生产。以这种方式，保留了基因的原始操纵子结构以及RBS、起始密码子和终止密码子。

从E.coli LJ110的染色体DNA扩增得到3079bp的含speAB的DNA片段(编号AE000377；1190-4247位核苷酸)，其中使用下述寡核苷酸：

5′-ACA CTT TCT AGA ATA ATT TGA GGT TCG CTA TG-3′[SEQ ID：No.6]

(突变以粗体显示，XbaI限制性位点以斜体显示)

以及

5′-CAT GGC ATG CGG TGC TTA CTC G-3′[SEQ ID：No.7]

(突变以粗体显示，SphI限制性位点以斜体显示)

用内切核酸酶XbaI和SphI进行末端修饰之后，将DNA片段连接进以同样手段切割的质粒pJF 119EH中。转化进E.coli DH5α细胞(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)后，在含有100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化子。制备之后，对获得的质粒pDAB7(pJF119EH-speAB，8339bp)的验证通过限制性分析和随后的测序来进行。

(v)构建质粒pDAB8(pJF119EH-speF-speAB)

为允许平行生产鸟氨酸脱羧酶SpeF、精氨酸脱羧酶SpeA和胍基丁胺酶SpeB，将E.coli LJ110(Zeppenfeld，et al.，见常规流程)的speAB基因克隆进speF表达载体pDAB2(见(iii))。

通过用限制性内切核酸酶XbaI和SphI对质粒pDAB7(见(iv))进行消化，分离出3067bp的包含speAB基因的操纵子，将其连接进以同样手段切割的含speF的质粒pDAB2(见(iii))中。转化进E.coli DH5α细胞(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)后，在含有100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化子。制备之后，对获得的允许对SpeFAB进行平行生产的质粒pDAB8(pJF119EH-speFAB，10547bp)的验证通过限制性分析来进行。

实施例1通过过量表达具有增加的翻译和/或转录效率的鸟氨酸脱羧酶编码基因来提高对DAB的生产

实施例1.1通过过量产生鸟氨酸脱羧酶来生产1，4-丁二胺(摇瓶)

在携带有质粒pDAB2(见(iii))或pDAB3(见(i))或pDAB4(见ii))的E.coli宿主菌株LJ110(Zeppenfeld，et al.，见常规流程)中对鸟氨酸脱羧酶编码基因speF或speC(具有增加的翻译和/或转录效率)的过量表达对于DAB生产的影响进行了研究。

在摇瓶实验中，利用最小程度盐培养基对这些菌株进行了检验，所述培养基由MgSO₄·7H₂O(300mg/l)、CaCl₂·2H₂O(15mg/l)、KH₂PO₄(3g/l)、K₂HPO₄(12g/l)、NaCl(100mg/l)、(NH₄)₂SO₄(5g/l)、柠檬酸钠·3H₂O(1g/l)、FeSO₄·7H₂O(75mg/l)、硫胺·HCl(维生素B1)(5mg/l)以及痕量元素Al₂(SO₄)₃·18H₂O(3mg/l)、CoCl₂·6H₂O(1.05mg/l)、CuSO₄·5H₂O(3.75mg/l)、H₃BO₃(0.75mg/l)、MnCl₂·4H₂O(30mg/l)、Na₂MoO₄·2H₂O(4.5mg/l)、NiSO₄·6H₂O(3mg/l)和ZnSO₄·7H₂O(22.5mg/l)构成。单独对葡萄糖贮液(500g/l)进行高压灭菌，加入到灭菌培养基中，达到10g/l的终浓度。

用1-5μl/ml贮液接种含有100mg/l氨苄青霉素的最小程度盐培养基的预培养物，在33℃、180rpm下温育16小时，直到OD₆₂₀为2。随后将5ml该培养物用于接种由50ml同样的培养基构成的主培养物，其在33℃和180rpm下温育24小时。自从细胞达到1.5的OD_620nm(大约7小时后)，通过加入50μM IPTG来诱导基因表达。

为观察依赖时间的DAB生产，在培养期间的不同时间点取样。利用离心分离细胞之后，通过HPLC来分析稀释的上清液。此时，使用平衡为50％缓冲液B(缓冲液A，O.1M乙酸钠，pH7.2；缓冲液B甲醇)的C18-反相柱(Nucleosil 120-5C18，Macherey & Nagel，Duren，Germany)，在Hewlett-Parkard 1100 Series仪器上，于230nm处，含有的胺作为邻苯二醛(OPA)衍生物被检测。为进行分离，应用下述梯度：1-7分钟线性梯度，从50％至75％的缓冲液B，流速为0.5ml/分钟；7-13分钟，75％至85％的缓冲液B，流速为0.5ml/分钟；13-14.5分钟，85％至50％的缓冲液B，流速为lml/分钟；14.5-17分钟，50％的缓冲液B，流速为1ml/分钟；以及17-20分钟，以50％的缓冲液B进行，流速为0.5ml/分钟。

通过利用标准物质进行校正，可以测定下述DAB浓度(见表1)，通过NMR光谱法进行验证。

所用的菌株	表达的基因	DAB浓度(mg/l)	备注
所用的菌株	表达的基因	DAB浓度(mg/l)	备注	LJllOpDAB2	speF	869	IPTG诱导；_nRBS
LJllOpDAB3	speC_nRBS	～50	IPTG诱导；_nRBS	LJllOpDAB2	speF	869	IPTG诱导；_nRBS
LJllOpDAB3	speC_nRBS	～50	IPTG诱导；_nRBS	LJll0pDAB4	speC_aRBS	715	改造的RBS+IPTG诱导

表1：利用在E.coli中的ODC过量生产获得的DAB形成

实施例1.2通过在补料分批(21)培养中过量产生鸟氨酸脱羧酶来生产 1.4-丁二胺

通过在实验室用生物反应器(Infors，Einsbach，Germany)中，利用高水平DAB生产菌株LJl10pDAB2对补料分批条件下发酵DAB生产的潜力加以研究。因为DAB生产菌株对其生长来说并非是氨基酸依赖型的，因此开发用于磷酸盐受限培养的方案，使用其来限制细胞生长。因此，使用磷酸盐受限的最小程度盐培养基，所述培养基由MgSO₄·7H₂O(3g/l)、CaCl₂·2H₂O(15mg/l)、KH₂PO₄(400mg/l)、NaCl(1g/l)、(NH₄)₂SO₄(5g/l)以及痕量元素Al₂(SO₄)₃·18H₂O(3mg/l)、CoCl₂·6H₂O(1.05mg/l)、CuSO₄·5H₂O(3.75mg/l)、H₃BO₃(0.75mg/l)、MnCl₂·4H₂O(30mg/l)、Na₂MoO₄·2H₂O(4.5mg/l)、NiSO₄·6H₂O(3mg/l)和ZnSO₄·7H₂O(22.5mg/l)构成。高压灭菌之后，将柠檬酸钠·3H₂O(1.5g/l)、FeSO₄·7H₂O(112.5mg/l)、硫胺·HCl(维生素B1)(7.5mg/l)、氨苄青霉素(100mg/l)和葡萄糖(10g/l)在灭菌条件下加入到生物反应器中。

用1-5μl/ml贮液接种含有100mg/l氨苄青霉素的最小程度盐培养基(见1.1)的预培养物，在33℃、180rpm下温育16小时，直到在620nm处的光密度为2。之后，该培养物被用于对由21磷酸盐受限最小程度盐培养基构成的主培养物进行1∶10的接种。培养期间，温度保持为恒定33℃，通过加入5NKOH将pH控制为6.8±0.1。生长期间，使用1500rpm的稳定搅拌速率。为避免氧限制，培养期间，流入容器的气流从2.51/分钟增加至101/分钟。需要的话加入Antifoam Dehysan。

用50μMIPTG在OD₆₂₀为5时对细胞进行诱导，接着补料组合的葡萄糖(500g/l)/硫酸铵(200g/l)，同时对补料速度加以调整，以获得稳定的10g/l葡萄糖和1.5g/l氨浓度。诱导后两小时，由18g/lKH₂PO₄构成的磷酸盐补料以补料速率7ml/h开始补料，进行8小时。以这种方式，可将细胞生长限制为大约50的OD₆₂₀。

为观察依赖时间的DAB生产，在培养期间的不同时间点取样。利用离心分离细胞之后，通过HPLC来分析稀释的上清液(见1.1)，通过NMR光谱法测定的DAB含量为5.1g/l(0.403g/gBDW；BDW表示生物质干重)。

实施例2从鸟氨酸和精氨酸开始以分批方式(摇瓶)生产1，4-丁二胺

为展示从鸟氨酸和精氨酸开始对DAB形成的进一步改进，对鸟氨酸脱羧酶SpeF(具有增加的转录效率)、精氨酸脱羧酶SpeA和胍基丁胺酶SpeB的组合过量生产的影响进行了研究。

因此，通过利用携带有质粒pDAB8(见(v))的E.coli宿主菌株LJ110(Zeppenfeld，et al.，见常规流程)在最小程度的盐培养基(见1.1)中进行摇瓶培养。因此，用1-5μl/ml贮液接种含有100mg/l氨苄青霉素的最小程度盐培养基的预培养物，在33℃、180rpm下温育16小时，直到620nm处的光密度为2。随后将5ml该培养物用于接种由50ml同样的培养基构成的主培养物，其在33℃和180rpm下温育24小时。自从细胞达到1.5的OD_620nm(大约7小时后)，通过加入10μM IPTG来诱导基因表达。

为观察依赖时间的DAB生产，在培养期间的不同时间点取样。利用离心分离细胞之后，通过HPLC来分析稀释的上清液(见1.1)。通过利用标准物质用于校正，可测定出下述DAB浓度(见表2)。

菌株	表达的基因	DAB浓度(mg/l)
菌株	表达的基因	DAB浓度(mg/l)	LJ100pDAB8	speFAB	1025

表2：在E.coli中从鸟氨酸以及精氨酸开始的DAB形成

序列表

<110>帝斯曼知识产权资产管理有限公司

<120>1，4-丁二胺的生物化学合成

<130>24264WO

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

gagctctaga ccagtttgac ccatatct

28

<210>2

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

ttttgcatgc ttacttcaac acataaccgt ac

32

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

gagctctaga ccagtttgag gaatatct

28

<210>4

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

gacctgctgg tacctaaaat aaagagatga aa

32

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

tcgatctaga ctgactcata atttttcccc

30

<210>6

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

acactttcta gaataatttg aggttcgcta tg

32

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

catggcatgc ggtgcttact cg

22

Claims

1.对1，4-丁二胺进行生物化学合成的方法，所述生物化学合成在下述微生物中进行的，所述微生物具有较之鸟氨酸脱羧酶活性的天然水平来说增加的鸟氨酸脱羧酶活性水平(增加的ODC活性)，

其特征在于，

所述增加的ODC活性是通过具有增加的翻译和/或转录效率的鸟氨酸脱羧酶编码基因的过量表达来获得的，并且，所述微生物中产生的1，4-丁二胺被排出到发酵培养液中，从所述发酵培养液中对所述1，4-丁二胺进行回收。

2.如权利要求1所述的方法，

其中，

所述增加的翻译和/或转录效率是通过使用强的、受调控的启动子来获得的，优选通过使用强的诱导型启动子来获得。

3.如权利要求2所述的方法，

其中，

所述增加的翻译和/或转录效率是通过使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导型强启动子来获得的。

4.如权利要求1至3中任意一项所述的方法，

其中，

所述增加的翻译和/或转录效率是通过使用选自T7、T5、ptac和plac启动子构成的组的启动子来获得的。

5.如权利要求1至4中任意一项所述的方法，

其中，

所述鸟氨酸脱羧酶编码基因具有核糖体结合位点(RBS)，所述位点定位于所述基因的编码区域的上游，所述RBS被改造为能获得核糖体对RNA模板的更好识别。

6.如权利要求1至5中任意一项所述的方法，

其中，

所述过量表达的鸟氨酸脱羧酶编码基因是鸟氨酸脱羧酶speF或speC基因(每种都属于E.C.4.1.1.17)。

7.如权利要求6所述的方法，

其中，

所述过量表达的鸟氨酸脱羧酶编码基因是鸟氨酸脱羧酶speF基因。

8.如权利要求6或7任意一项所述的方法，

其中，

所述过量表达的鸟氨酸脱羧酶编码基因是来自选自Escherichia、Shigella、Salmonella、Yersinia和Shewanella构成的组的属之一的鸟氨酸脱羧酶基因speF或speC。

9.如权利要求8所述的方法，

其中，

所述过量表达的鸟氨酸脱羧酶编码基因是来自选自Escherichia coli、Shigella flexneri、Salmonella typhimutium、Yersinia pestis和Shewanellaoneidensis的组的种之一的鸟氨酸脱羧酶基因。

10.如权利要求9所述的方法，

其中，

所述过量表达的鸟氨酸脱羧酶编码基因是来自选自Escherichia coli、Salmonella typhimutium和Shewanella oneidensis的组的种之一的speF。

11.如权利要求1至10中任意一项所述的方法，

其中，

除增加的ODC活性之外，对于至少两种其它的酶也获得增加的酶活性，这是通过过量表达下述酶来获得的：

(i)精氨酸脱羧酶编码基因speA(属于E.C.4.1.1.19)和胍基丁胺酶编码基因speB(属于E.C.3.5.3.11；还被称为胍基丁胺脲水解酶编码基因)；或

12.如权利要求11所述的方法，

其中，

所述过量表达的精氨酸脱羧酶编码基因是来自选自Escherichia、Shigella、Salmonella、Yersinia、Pasteurella和Neisseria构成的组的属之一的精氨酸脱羧酶基因speA。

13.如权利要求12所述的方法，

其中，

所述过量表达的精氨酸脱羧酶编码基因是来自选自Escherichia coli、Shigella flexneri、Sahnonella enterica、Yersinia pestis、Pasteurella multocida和Neisseria meningitidis构成的组的种之一的精氨酸脱羧酶基因speA。

14.如权利要求13所述的方法，

其中，

所述过量表达的胍基丁胺编码基因是来自选自Escherichia、Salmonella、Proteus、Photorhabdus、Vibrio和Neisseria构成的组的属之一的胍基丁胺酶基因speB。

15.如权利要求14所述的方法，

其中，

所述过量表达的胍基丁胺编码基因是来自选自Escherichia coli、Salmonella enterica、Proteus mirabilis、Photorhabdus luminescens、Vibriocholerae和Neisseria meningitidis构成的组的种之一的胍基丁胺酶基因speB。

16.如权利要求15所述的方法，

其中，

所述过量表达的胍基丁胺亚氨基水解酶编码基因和/或所述过量表达的N-氨基甲酰腐胺酰胺水解酶编码基因优选是来自选自Pseudomonas、Streptococcus、Streptomyces、Azotobacter、Arabidopsis、Novosphingobium和Bacillus构成的组的属之一的胍基丁胺亚氨基水解酶基因aguA和/或N-氨基甲酰腐胺酰胺水解酶基因aguB。

17.如权利要求16所述的方法，

其中，

所述过量表达的胍基丁胺亚氨基水解酶编码基因和/或所述过量表达的N-氨基甲酰腐胺酰胺水解酶编码基因是来自选自Pseudomonasaeruginosa、Streptococcus mutans、Streptomyces avermitilis、Azotobactervinelandii、Arabidopsis thaliana、Novosphingobium aromaticivorans和Bacillus cereus构成的组的种之一的胍基丁胺亚氨基水解酶基因aguA和/或N-氨基甲酰腐胺酰胺水解酶基因aguB。

18.如权利要求1至17中任意一项所述的方法，

其中，

所述方法是在确保鸟氨酸细胞内水平增加的情况下进行的。

19.如权利要求1至18中任意一项所述的方法，

其中，

所述方法在选自由Saccharomyces sp.、Bacillus sp.、Corynebacteriumsp.、Escherichiasp.和Pichia sp.构成的组的宿主生物中进行。

20.如权利要求1至19中任意一项所述的方法，

其中，

所述方法在选自Saccharomyces cerevisiae、Corynebacterium sp.和Escherichia sp.构成的组的宿主生物中进行，并且，除鸟氨酸脱羧酶活性水平增加之外，至少精氨酸脱羧酶连同胍基丁胺酶利/或胍基丁胺亚氨基水解酶以及N-氨基甲酰腐胺酰胺水解酶酶活性的水平也增加。

21.携带有权利要求1-20中一项或多项提到的具有增加的活性水平的酶活性中的一种或多种的载体、质粒和宿主。