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TWI830761B - 針對cldn18.2和cd3之抗體構建體 - Google Patents

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珊卓 蘿絲
茱莉 貝里斯
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Abstract

本發明係關於抗體構建體，該抗體構建體包含結合緊密連接蛋白18.2（CLDN18.2）的結構域和結合CD3的另一個結構域。此外，本發明提供了編碼該抗體構建體的多核苷酸、包含所述多核苷酸的載體、以及用所述多核苷酸或載體轉化或轉染的宿主細胞。此外，本發明提供了用於產生本發明的抗體構建體的方法、所述抗體構建體的醫學用途、以及包含所述抗體構建體的套組。

Description

針對CLDN18.2和CD3之抗體構建體
本發明係關於抗體構建體，該抗體構建體包含結合緊密連接蛋白18.2(CLDN18.2)的結構域和結合CD3的另一個結構域。此外，本發明提供了編碼該抗體構建體之多核苷酸、包含所述多核苷酸之載體、以及用所述多核苷酸或載體轉化或轉染之宿主細胞。此外，本發明提供了用於產生本發明的抗體構建體的方法、所述抗體構建體之醫學用途、以及包含所述抗體構建體之套組(kit)。
緊密連接蛋白(Claudin)係上皮緊密連接的關鍵結構和功能組分，其作用係調節細胞-細胞通透性、維持離子穩態、並且支持細胞黏附和極性。緊密連接蛋白係22-27kDa的四分子交聯體(tetraspan)跨膜蛋白，其在細胞膜內或跨細胞膜進行多聚化以形成保護屏障。已經報導的24種緊密連接蛋白由於它們的組織定位特異性和由於它們與其他蛋白質的相互作用而不同。
緊密連接蛋白18(CLDN18)最初被鑒定為轉錄因子T/EBP/NKX2.1的靶基因。符合其與其他緊密連接蛋白家族成員的同源性，CLDN18被證實定位於小鼠和人的細胞緊密連接處。已顯示CLDN18編碼由可變 剪接產生的兩種同種型：在正常肺中特異性表現的CLDN18.1、和在胃黏膜的分化細胞中表現的CLDN18.2。
CLDN18.2係具有兩個細胞外環的261個胺基酸的蛋白質，並且與CLDN18.1具有92%的序列同一性。與第二個細胞外環不同，CLDN18.2的第一個細胞外環與CLDN18.1具有八個胺基酸差異。CLDN18.2與其他家族成員的同源性更為有限，與CLDN1、CLDN6和CLDN7具有29%-34%的總體同一性。
CLDN18.2在幾種腫瘤類型(包括胃癌、胰髒癌、食管癌、黏液性卵巢癌和非小細胞肺癌)中表現。CLDN18.2在胃癌中的表現包括浸潤性前沿和轉移部位，但是據報導CLDN18的絕對水平在該等環境中降低了。CLDN18.2在多種腫瘤類型中的表現(其中正常組織表現主要限於胃中的分化細胞)已經導致將CLDN18.2視為胃癌和其他適應症的治療靶標。
胃癌和胃食管癌仍然是醫療需求未得到滿足的適應症，全球每年報導至少140萬新病例和110萬例死亡(Lordick和Janjigian,Nat Rev Cancer[癌症自然評論]2016)。典型的一線治療包括手術和組合化學療法(包括鉑和氟嘧啶化合物)。雖然這種方案可以潛在地提高生活品質並將中值存活期延長8-10個月，但是5年存活率仍然很低。
靶向療法提供了替代性治療策略。抗Her2單株抗體曲妥珠單抗(trastuzumab)被批准用於與化學療法組合的Her2陽性胃癌和胃食管癌的一線治療(Bang等人，The Lancet[柳葉刀]2010)。抗VEGFR2抗體雷莫蘆單抗(ramucirumab)被批准用於治療在化學療法之後已經進展的胃癌和胃食管癌(Fuchs等人，The Lancet[柳葉刀]2014)。雖然與單獨化學療法相比，該等靶向 藥劑進一步增加了存活期，但是它們的功效受到靶標表現的異質性和受到抗性機制的限制。
最近，免疫檢查點療法已經在選擇環境中表現出活性：派姆單抗(pembrolizumab)在美國被批准用於治療微衛星不穩定性高(MSI-H)腫瘤，包括胃癌(Le等人，Science[科學]2017)，並且用於治療在兩線或更多線的化學療法之後已進展的不可切除的晚期或復發性胃癌(Fuchs等人，J Clin Oncol[臨床腫瘤學雜誌]2017)。納武單抗(nivolumab)在日本被批准用於治療在化學療法之後已進展的不可切除的晚期或復發性胃癌(Kang等人，The Lancet[柳葉刀]，2017)。在該等研究中，在未選擇人群中僅1%-2%的患者、和MSI-H(微衛星不穩定性高)人群(占總體胃和胃食管病例的9%)的60%表現出完全緩解。因此，仍然需要具有為更大的患者群體提供持久反應的潛力的新療法。
相比胃癌或胃食管癌，已證明胰髒癌對可用療法的反應甚至更低。全球每年報導了有來自胰髒癌的至少338,000例病例和331,000例死亡，其中中值存活期為6個月(Ilic和Ilic,World J Gastroenterol[世界胃腸病學雜誌]2016)。僅有20%-30%的患者係手術切除的候選人。直到最近當組合化學療法方案FOLFIRINOX(5-氟尿嘧啶、甲醯四氫葉酸、奧沙利鉑(oxaliplatin,)、伊立替康(irinotecan))、以及吉西他濱與白蛋白結合型紫杉醇(nab-paclitaxel)組合顯示，與單獨的吉西他濱治療相比，總體存活期增加約2-5個月(Uccello等人，Curr Oncol[現代腫瘤學]2018)時，吉西他濱(gemcitabine)一直被考慮為一線療法。其他化學療法組合典型地被用於二線療法。已經在晚期胰髒癌中評估了幾種靶向療法和免疫治療劑，但成效有限。胰腺腫瘤的特徵在於結締組織 形成和免疫抑制性免疫浸潤，這導致缺乏反應。需要具有克服這種免疫抑制環境和延長存活期的潛力的新療法。
包含與T細胞上的CD3結合的一個結構域和與在靶細胞上表現的蛋白質結合的一個結構域的雙特異性抗體構建體直接將T細胞連接到靶細胞，以誘導T細胞重定向裂解。這種作用機制不同於化學療法、靶向療法和其他免疫療法，因為它可以與任何CD3陽性T細胞一起工作，而不依賴共刺激激活訊號(Klinger等人，Immunol Reviews[免疫學評論]2016)。CLDN18.2在胃癌、胃食管癌和胰髒癌的細胞表面上的表現提供了用CLDN18.2 x CD3抗體構建體靶向該等腫瘤類型的基礎。此外，CLDN18.2 x CD3抗體構建體具有靶向表現CLDN18.2的另外的腫瘤類型(包括黏液性卵巢癌、結直腸癌和非小細胞肺癌)的潛力。
因此，在一個方面，本發明提供了一種抗體構建體，該抗體構建體包含與靶細胞表面上的CLDN18.2結合的第一結構域和與T細胞表面上的CD3結合的第二結構域。
還設想：(1)本發明的抗體構建體的第一結構域與CLDN18.2的第一細胞外環(環1)結合；(2)本發明的抗體構建體的第一結構域與如下抗體或抗體構建體一樣結合相同的CLDN18.2表位，該抗體或抗體構建體包含如下結構域，該結構域與靶細胞表面上的CLDN18.2結合並且包含： a)VH區以及VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：121中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：122中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：123中所描述的CDR-H3，該VL區包含如SEQ ID NO：124中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：125中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：126中所描述的CDR-L3；b)VH區以及VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：133中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：134中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：135中所描述的CDR-H3，該VL區包含如SEQ ID NO：136中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：137中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：138中所描述的CDR-L3；c)如SEQ ID NO：127中所描述的VH區，以及如SEQ ID NO：128中所描述的VL區；或d)如SEQ ID NO：139中所描述的VH區，以及如SEQ ID NO：140中所描述的VL區；(3)本發明的抗體構建體與如下抗體或抗體構建體競爭結合，該抗體或抗體構建體包含如下結構域，該結構域與靶細胞表面上的CLDN18.2結合並且包含：a)VH區以及VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：121中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：122中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：123中所描述的CDR-H3，該VL區包含如SEQ ID NO：124中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：125中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：126中所描述的CDR-L3；b)VH區以及VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：133中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：134中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：135中所描述的CDR-H3，該VL區包含如SEQ ID NO：136中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：137中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：138中所描述的CDR-L3； c)如SEQ ID NO：127中所描述的VH區，以及如SEQ ID NO：128中所描述的VL區；或d)如SEQ ID NO：139中所描述的VH區，以及如SEQ ID NO：140中所描述的VL區；(4)本發明的抗體構建體的第一結構域結合在靶細胞表面上的具有如SEQ ID NO：22中所描述的胺基酸序列的CLDN18.2突變體，並且視需要還結合在靶細胞表面上的具有如SEQ ID NO：24中所描述的胺基酸序列的CLDN18.2突變體，但不結合在靶細胞表面上的具有如SEQ ID NO：23中所描述的胺基酸序列的CLDN18.2突變體；(5)本發明的抗體構建體的第一結構域結合在靶細胞表面上的具有如SEQ ID NO：14中所描述的胺基酸序列的CLDN18.2突變體和/或在靶細胞表面上的具有胺基酸序列SEQ ID NO15的CLDN18.2突變體，並且視需要還結合在靶細胞表面上的具有選自以下群組的胺基酸序列中的一個或多個CLDN18.2突變體，該組由SEQ ID NO：11、12、13、16、17、19、20和21中所描述的那些胺基酸序列組成，但不結合在靶細胞表面上的具有如SEQ ID NO：18中所描述的胺基酸序列的CLDN18.2突變體；(6)本發明的抗體構建體的第一結構域結合在靶細胞表面上的人CLDN18.2，其中在人CLDN18.2的位置56處的Glu(E)對於第一結構域的結合係必需的，並且在人CLDN18.2的位置42處的Ala(A)和/或位置45處的Asn(N)對於第一結構域的結合不是必需的；和/或(7)本發明的抗體構建體的第一結構域結合CLDN18.2的表位，該表位包含如SEQ ID NO：266中所描述的胺基酸序列，但不包含如SEQ ID NO：265中所描述的胺基酸序列，並且視需要還不包含如SEQ ID NO：267中所描述的胺基酸序列。
有利地，靶向被本發明的抗體構建體識別的CLDN18.2的表位(還參見實例2)提供以下益處：(1)CLDN18.2xCD3抗體構建體的選擇性優於CLDN18.1(參見實例6)，以及(2)對CLDN18.2xCD3抗體構建體的出乎意料的高細胞毒性效力(參見實例7.4)。
術語「抗體構建體」係指其中結構和/或功能係基於抗體，例如全長免疫球蛋白分子的結構和/或功能的分子。因此，抗體構建體免疫特異性地結合其靶標或抗原，和/或其包含抗體的重鏈可變區(VH)和/或輕鏈可變區(VL)，或包含由其衍生的結構域。根據本發明的抗體構建體包含允許免疫特異性靶標結合的抗體最小結構要求。這種最小要求可以例如藉由至少三個輕鏈CDR(即VL區的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三個重鏈CDR(即VH區的CDR1、CDR2和CDR3)、較佳的是全部六個CDR的存在來定義。因此，抗體構建體的特徵可能在於在一個或兩個結合結構域中存在三個或六個CDR，並且技術人員知道那些CDR在結合結構域內位於哪裡(以什麼順序)。
根據本發明的「抗體」的定義包括全長抗體，還包括藉由生物技術或蛋白質工程方法或過程產生的駱駝抗體和其他免疫球蛋白。該等全長抗體可以是例如單株抗體、重組抗體、嵌合抗體、去免疫化(deimmunized)抗體、人源化抗體和人抗體，以及來自其他物種(如小鼠、倉鼠、兔、大鼠、山羊或非人靈長類動物)的抗體。
本發明的「抗體構建體」可以具有天然存在的全長免疫球蛋白結構。例如，它們可以包含(至少)兩條全長抗體重鏈和兩條全長抗體輕鏈。然而，鑒於根據本發明的抗體構建體包含結合CLDN18.2的一個結構域和結合CD3的另一個結構域，它們不是天然存在的，並且它們在其功能方面與天然存在的產物明顯不同。因此，本發明的抗體構建體係包含至少兩個具有不同特異性的不同結合結構域的人工「雜合」分子。
本發明的「抗體構建體」還可以包含全長抗體的片段，如VH、VHH、VL、(s)dAb、Fv、輕鏈(VL-CL)、Fd(VH-CH1)、重鏈、Fab、Fab'、F(ab')2或「r IgG」(由重鏈和輕鏈組成的「半抗體」)。根據本發明的抗體構建體還可以包含經修飾的抗體片段，也稱為抗體變體或抗體衍生物。實例包括但不限於scFv、二-scFv或聯(s)-scFv、scFv-Fc、scFv-拉鍊、scFab、Fab2、Fab3、雙抗體、單鏈雙抗體、串聯雙抗體(Tandab's)、串聯二-scFv、串聯三-scFv、微型抗體(由如下結構例示：(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2、((scFv)2-CH3+CH3)、((scFv)2-CH3)或(scFv-CH3-scFv)2)、多抗體(如三抗體或四抗體)、以及單結構域抗體(如奈米抗體或單可變結構域抗體)(僅包含一個可變區，其可以是VHH、VH或VL，其獨立於其他可變區或結構域而特異性地結合抗原或靶標)。根據本發明的抗體構建體的進一步可能形式係交叉體(cross bodies)、超長體(maxi bodies)、雜Fc構建體、單Fc構建體和scFc構建體。那些形式的實例將在本文下面進行描述。
此外，術語「抗體構建體」的定義包括藉由不同的結合結構域特異性地結合兩個、三個或更多個抗原結構的二價和多價(polyvalent/multivalent)構建體以及雙特異性和多特異性(polyspecific/multispecific)構建體。抗體構建體可以具有比特異性更多的結合價，例如在其中兩個結合結構域針對第一靶標 (Cldn18.2)並且一個結合結構域針對第二靶標(CD3)或反之亦然的情況下，在這種情況下，構建體係三價的和雙特異性的。通常，術語「雙特異性」包括抗體構建體結合(至少)兩種不同抗原(如Cldn18.2和CD3)的含義。
此外，術語「抗體構建體」的定義包括僅由一條多肽鏈組成的分子以及由兩條、三條、四條或更多條多肽鏈組成的分子，該等鏈可以是相同的(同源二聚體、同源三聚體或同源寡聚物)或不同的(異源二聚體、異源三聚體或異源寡聚物)。上述鑒定的抗體及其片段、變體、衍生物和由其衍生的抗體構建體的實例尤其描述於Harlow和Lane,Antibodies：A laboratory manual[抗體：實驗室手冊]，CSHL Press[冷泉港實驗室出版社](1988)；Kontermann和Dübel,Antibody Engineering[抗體工程]，Springer[斯普林格出版社]，第2版2010；以及Little,Recombinant Antibodies for Immunotherapy[用於免疫療法的重組抗體]，Cambridge University Press[劍橋大學出版社]2009。
術語「結合結構域」或「與......結合的結構域」與本發明相關地表徵抗體構建體的結構域，其免疫特異性地與在靶標或抗原(此處：在第一結構域的情況下為CLDN18.2，以及在第二結構域的情況下為CD3)上的表位結合/相互作用/識別該表位。第一結構域(結合CLDN18.2)的結構和功能，以及還較佳的是第二結構域(結合CD3)的結構和/或功能係基於抗體(例如全長免疫球蛋白分子)的結構和/或功能。因此，「結合結構域」或「與......結合的結構域」可以包含允許免疫特異性靶標結合的抗體最小結構要求。第一結構域的這種最小結構要求可以例如藉由至少三個輕鏈CDR(即VL區的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三個重鏈CDR(即VH區的CDR1、CDR2和CDR3)、較佳的是全部六個CDR的存在來定義。設想第二結構域還包含允許免疫特異性靶標結合的這種抗體最小結構要求。更較佳的是，第二結構域還包含至少三個輕鏈CDR(即VL區的 CDR1、CDR2和CDR3)和/或三個重鏈CDR(即VH區的CDR1、CDR2和CDR3)、較佳的是全部六個CDR。「與......結合的結構域」(或「結合結構域」)典型地可以包含抗體輕鏈可變區(VL)和抗體重鏈可變區(VH)；然而，它不必須包含兩者，但可以包含VH或VL中的僅一者。例如，Fd片段通常保留完整抗原結合結構域的一些抗原結合功能。
「與......結合的結構域」(或「結合結構域」)的形式的實例包括但不限於全長抗體、全長抗體的片段(如VH、VHH、VL)、(s)dAb、Fv、輕鏈(VL-CL)、Fd(VH-CH1)、重鏈、Fab、Fab'、F(ab')2或「r IgG」(「半抗體」))、抗體變體或衍生物(如scFv、二-scFv或聯(s)-scFv、scFv-Fc、scFv-拉鍊、scFab、Fab2、Fab3、雙抗體、單鏈雙抗體、串聯雙抗體(Tandab's)、串聯二-scFv、串聯三-scFv、「微型抗體」(選自形式如(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2、((scFv)2-CH3+CH3))、((scFv)2-CH3)或(scFv-CH3-scFv)2)、多抗體(如三抗體或四抗體)、以及單結構域抗體(如奈米抗體或單可變結構域抗體)(僅包含一個可變區，其可以是VHH、VH或VL)。「與......結合的結構域」(或「結合結構域」)的形式的進一步實例包括(1)包含VL、VH、CL和CH1的抗體片段或變體(如Fab)；(2)包含兩個連接的Fab片段的抗體片段或變體(如F(ab')2)；(3)包含VH和CH1的抗體片段或變體(如Fd)；(4)包含VL和CL的抗體片段或變體(如輕鏈)；(5)包含VL和VH的抗體片段或變體(如Fv)；(5)具有VH結構域的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature[自然]341：544-546)；(6)包含重鏈和/或輕鏈的至少三個分離的CDR的抗體變體；以及(7)單鏈Fv(scFv)。根據本發明的抗體構建體的實施方式的實例例如描述於以下中：WO 00/006605、WO 2005/040220、WO 2008/119567、WO 2010/037838、WO 2013/026837、WO 2013/026833、US 2014/0308285、US 2014/0302037、WO 2014/144722、WO 2014/151910和WO 2015/048272。
對於本發明的抗體構建體，設想a)該抗體構建體係單鏈多肽或單鏈抗體構建體，b)該第一結構域處於scFv的形式，c)該第二結構域處於scFv的形式，d)該第一結構域和該第二結構域經由連接子(linker)、較佳的是肽連接子、更較佳的是甘胺酸/絲胺酸連接子連接，和/或e)該抗體構建體包含提供延長的血清半衰期的結構域，如基於Fc的結構域。
本發明的抗體構建體較佳的是「體外產生的抗體構建體」和/或「重組抗體構建體」。在本發明的上下文中，術語「體外產生的」係指根據上述定義的抗體構建體，其中結合結構域或可變區的全部或部分(例如，至少一個CDR)在非免疫細胞選擇中(例如，在體外噬菌體展示中、在蛋白質晶片上或在其中可以測試候選胺基酸序列結合抗原的能力的任何其他方法中)產生。因此，這個術語較佳的是排除僅由動物中免疫細胞中基因組重排產生的序列。設想抗體構建體的第一和/或第二結構域係藉由噬菌體展示或文庫篩選方法產生或可藉由其獲得的，而不是藉由將來自預先存在的(單株)抗體的CDR序列移植到支架中產生或可藉由其獲得的。「重組抗體構建體」係使用(尤其)重組DNA技術或基因工程產生或生產的抗體構建體。
設想本發明的抗體構建體係單株的。如本文使用的，命名為「單株」(mAb)的抗體或抗體構建體獲自基本上同質的抗體/抗體構建體的群體，即除了可以以少量存在的可能的天然發生的突變和/或翻譯後修飾(例如，異構 化、醯胺化)之外，在群體中包含的各個抗體/抗體構建體係相同的(具體地，關於它們的胺基酸序列)。與典型地包括針對不同決定簇(或表位)的不同抗體的多株抗體製劑相比，單株抗體/抗體構建體針對抗原內的單一表位具有高度特異性。除了它們的特異性之外，單株抗體還在它們藉由雜交瘤培養物合成，因此不被其他免疫球蛋白污染方面係有優勢的。修飾語「單株」指示獲得自實質上均質的抗體群體的抗體/抗體構建體的特徵，並且不應理解為要求藉由任何特定方法產生抗體。
對於單株抗體的製備，可以使用提供由連續細胞系培養物產生的抗體的任何技術。例如，有待使用的單株抗體可以藉由Koehler等人，Nature[自然]，256：495(1975)首次描述的雜交瘤方法，或可以藉由重組DNA方法(參見，例如美國專利案號4,816,567)製備。用於產生人單株抗體的另外技術的實例包括三源雜交瘤技術、人B細胞雜交瘤技術(Kozbor,Immunology Today[今日免疫學]4(1983),72)和EBV-雜交瘤技術(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy[單株抗體和癌症治療]，Alan R.Liss公司(1985),77-96)。
然後可以使用標準方法(如酶聯免疫吸附測定(ELISA)和表面電漿共振(BIACORETM)分析篩選雜交瘤，以鑒定一種或多種產生與指定抗原免疫特異性結合的抗體的雜交瘤。任何形式的相關抗原均可以用作免疫原，例如重組抗原、天然存在形式、其任何變體或片段以及其抗原肽。如在BIAcoreTM系統中採用的表面電漿共振可以用於增加與靶抗原的表位結合的噬菌體抗體/抗體構建體的效率(Schier,Human Antibodies Hybridomas[人抗體雜交瘤]7(1996),97-105；Malmborg,J.Immunol.Methods[免疫學方法雜誌]183(1995),7-13)。
另一種製備抗體構建體或結合結構域的示例性方法包括篩選蛋白質表現文庫，例如噬菌體展示或核糖體展示文庫。噬菌體展示例如描述於以 下中：Ladner等人，美國專利案號5,223,409；Smith(1985)Science[科學]228：1315-1317；Clackson等人，Nature[自然]，352：624-628(1991)以及Marks等人，J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]，222：581-597(1991)。
除了使用展示文庫之外，還可以使用相關抗原來免疫非人動物，例如齧齒動物(諸如小鼠、倉鼠、兔或大鼠)。在一個實施方式中，非人動物包括人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，有可能用人Ig(免疫球蛋白)基因座的大片段來工程化小鼠抗體產生缺陷的小鼠品系。使用雜交瘤技術，可以產生並選擇衍生自具有所希望的特異性的基因的抗原特異性單株抗體。參見，例如XenomouseTM；Green等人(1994)Nature Genetics[自然遺傳學]7：13-21；US 2003-0070185；WO 96/34096和WO 96/33735。
單株抗體也可以獲得自非人動物，並且然後使用本領域中已知的重組DNA技術進行修飾，例如人源化、去免疫、呈現嵌合等。經修飾的抗體構建體或結合結構域的實例包括非人抗體/抗體構建體的人源化變體、「親和力成熟」抗體構建體或結合結構域(參見，例如Hawkins等人J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]254,889-896(1992)以及Lowman等人，Biochemistry[生物化學]30,10832-10837(1991))以及具有改變的效應子功能的抗體變體或突變體(參見，例如美國專利5,648,260；Kontermann和Dübel(2010)，上述引文；以及Little(2009),上述引文)。
在免疫學中，親和力成熟係這樣的過程：藉由該過程，在免疫應答的過程中B細胞產生與抗原的親和力增加的抗體。由於反復暴露於相同的抗原，宿主會產生依次更大親和力的抗體。如天然原型一樣，體外親和力成熟係基於突變和選擇的原則。體外親和力成熟已成功用於優化抗體、抗體片段、抗體變體、抗體構建體或結合結構域。使用輻射、化學誘變劑或易錯PCR在CDR 內引入隨機突變。此外，遺傳多樣性可以藉由鏈改組來增加。使用展示方法(如噬菌體展示)進行兩輪或三輪突變和選擇通常產生具有低納莫耳範圍內的親和力的抗體、抗體片段、抗體變體、抗體構建體或結合結構域。
本發明的抗體構建體或結合結構域的胺基酸取代變化的較佳的類型涉及取代親本抗體結構(例如人源化或人抗體結構)的高變區內的一個或多個殘基。一般來講，選擇用於進一步開發的一種或多種所得變體相對於產生它們的親本抗體結構將具有改善的生物特性。用於產生此類取代變體的便利方式涉及使用噬菌體展示的親和力成熟。簡言之，將高變區的幾個位點(例如6-7個位點)突變以在每個位點產生所有可能的胺基酸取代。由此產生的變體以單價方式從絲狀噬菌體顆粒展示為與每個顆粒內包裝的M13的基因III產物的融合物。然後如本文所揭露那樣篩選噬菌體展示的變體的生物活性(例如結合親和力)。為了鑒定對抗原結合有顯著貢獻的候選高變區位點(修飾候選物)，還可以進行丙胺酸掃描誘變。可替代地或另外地，分析在抗原與抗體構建體或結合結構域之間的複合物的晶體結構以鑒定在結合結構域與其特異性抗原之間的接觸點可能是有益的。根據本文闡述的技術，此類接觸殘基和相鄰殘基係用於取代的候選者。一旦產生了此類變體，就如本文所述對這組變體進行篩選，並且可以選擇在一種或多種相關測定中具有優異特性的抗體、其抗原結合片段、抗體構建體或結合結構域用於進一步的開發。
本發明的抗體構建體和結合結構域具體地包括「嵌合」形式(其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而一條或多條鏈的其餘部分與衍生自另一物種或屬於另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源)，以及此類抗體的片段或變體，只要它們表現出期望的生物活性即可(美國專利案號4,816,567； Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]，81：6851-6855(1984))。本文感興趣的嵌合抗體構建體或結合結構域包括「靈長類化」抗體構建體，該等抗體構建體包含衍生自非人靈長類動物(例如，舊大陸猴、猿等)的可變結構域抗原結合序列、和人恒定區序列。已經描述了多種用於製備嵌合抗體或抗體構建體的方法。參見，例如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.[美國國家科學院院刊]81：6851,1985；Takeda等人，Nature[自然]314：452,1985；Cabilly等人，美國專利案號4,816,567；Boss等人，美國專利案號4,816,397；Tanaguchi等人，EP 0171496；EP 0173494；和GB 2177096。
抗體、抗體構建體、抗體片段、抗體變體或結合結構域還可以藉由使用例如在WO 98/52976或WO 00/34317中所揭露的方法將人T細胞表位特異性缺失(稱為「去免疫」的方法)來進行修飾。簡言之，可以針對與MHC II類結合的肽分析抗體、抗體構建體或結合結構域的重鏈和輕鏈可變區；該等肽代表潛在的T細胞表位(如例如在WO 98/52976和WO 00/34317中所定義的)。為了檢測潛在T細胞表位，可以應用稱為「肽穿線」的電腦建模方法，並且此外針對VH和VL序列中存在的模體，可以搜索人MHC II類結合肽的數據庫，如WO 98/52976和WO 00/34317中所述。該等模體與18種主要的MHC II類DR同種異型中的任一種結合，並且因此構成潛在T細胞表位。檢測到的潛在T細胞表位可以藉由取代可變結構域或可變區中的少量胺基酸殘基，或者較佳的是藉由單個胺基酸取代來消除。典型地，進行保守取代。通常但不排他地，可以使用人種系抗體序列中的位置共有的胺基酸。人種系序列例如揭露於以下中：Tomlinson等人(1992)J.MoI.Biol.[分子生物學雜誌]227：776-798；Cook,G.P.等人(1995)Immunol.Today[今日免疫學]第16卷(5)：237-242；和Tomlinson等人(1995)EMBO J.[歐洲分子生物學學會雜誌]14：14：4628-4638。V BASE目錄 (www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php)提供了人免疫球蛋白可變區序列的綜合目錄(由Tomlinson,LA.等人彙編MRC Centre for Protein Engineering,Cambridge,UK[英國劍橋MRC蛋白質工程中心])。該等序列可以用作人序列的來源，例如用於框架區和CDR。也可以使用共有的人框架區，例如如美國專利案號6,300,064中所述。
「人源化」抗體、其變體或片段、抗體構建體和結合結構域係基於主要人序列的免疫球蛋白，該等主要人序列含有一種或多種衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多數情況下，人源化抗體、其變體或片段、抗體構建體和結合結構域係基於人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自高變區或CDR的殘基被具有期望的特異性、親和力、能力和/或生物活性的來自非人物種(如齧齒動物(例如小鼠、倉鼠、大鼠或兔))(供體抗體)的高變區或CDR的殘基替代。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架區(FR)殘基被相應的非人類殘基替換。此外，如本文使用的「人源化」抗體、其變體或片段、抗體構建體和結合結構域也可以包含在受體抗體和供體抗體中均未發現的殘基。進行該等修飾以進一步改進和優化抗體性能。人源化抗體、其變體或片段、抗體構建體和結合結構域也可以包含免疫球蛋白恒定區(如Fc)的至少一部分，典型地人免疫球蛋白的至少一部分。關於進一步的細節，參見Jones等人Nature[自然]，321：522-525(1986)；Reichmann等人，Nature[自然]，332：323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.[結構生物學新見]，2：593-596(1992)。
人源化抗體、其變體或片段、抗體構建體和結合結構域可以藉由用人(Fv)可變區的等效序列替代不直接參與抗原結合的(Fv)可變區的序列來產生。用於產生此類分子的示例性方法由以下提供：Morrison(1985)Science[科學]229：1202-1207；Oi等人(1986)BioTechniques[生物技術]4：214；以及US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762；US 5,859,205；和US 6,407,213。該等方法包括分離、操縱和表現編碼來自重鏈或輕鏈中的至少一者的全部或部分免疫球蛋白(Fv)可變區的核酸序列。此類核酸可以獲得自如上所述的產生針對預定靶標的抗體的雜交瘤，以及其他來源。然後可以將編碼人源化抗體、其變體或片段、抗體構建體或結合結構域的重組DNA選殖到合適的表現載體中。
人源化抗體、其變體或片段、抗體構建體和結合結構域還可以使用轉基因動物(如表現人重鏈和輕鏈基因但不能表現內源性小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因的小鼠)來產生。Winter描述了可用於製備本文所述的人源化分子的示例性CDR移植方法(美國專利案號5,225,539)。特定人序列的全部CDR可以用至少一部分非人CDR替代，或者僅一些CDR可以用非人CDR替代。僅需要替代用於將人源化分子與預定抗原結合所需的CDR數量。
可以藉由引入保守取代、共有序列取代、種系取代和/或回復突變來優化人源化抗體、其變體或片段、抗體構建體或結合結構域。此類改變的免疫球蛋白分子可以藉由本領域已知的幾種技術中的任何一種來製備(例如，Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美國國家科學院院刊]，80：7308-7312,1983；Kozbor等人，Immunology Today[今日免疫學]，4：7279,1983；Olsson等人，Meth.Enzymol.[酶學方法]，92：3-16,1982，以及EP 239 400)。
人抗小鼠抗體(HAMA)應答已經導致該行業製備嵌合或其他人源化抗體/抗體構建體。然而，據預期，特別是在抗體或抗體構建體的長期或多劑量利用中，會觀察到某些人抗嵌合抗體(HACA)應答。因此，期望提供抗體構建體，該等抗體構建體包含針對CLDN18.2的人結合結構域和/或針對CD3的人結合結構域，以便消除HAMA或HACA反應的問題和/或效應。
因此，根據一個實施方式，抗體構建體、第一結合結構域和/或第二結合結構域係「人」的。術語「人抗體」、「人抗體構建體」和「人結合結構域」分別包括具有抗體衍生區域的抗體、抗體構建體和結合結構域，該等抗體衍生區域係如實質上對應於本領域中已知的人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區或結構域，包括例如由Kabat等人(1991)(上述引文)描述的那些。本發明的人抗體構建體或結合結構域可以包括例如CDR中且特別是CDR3中不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變引入的突變)。人抗體構建體或結合結構域可以具有至少1個、2個、3個、4個、5個或更多個被不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基替換的位置。然而，如本文使用的人抗體、抗體構建體和結合結構域的定義還涵蓋僅包括非人工和/或遺傳改變的人抗體序列(如可以藉由使用技術或系統(如Xenomouse)衍生的那些)的完全人抗體、抗體構建體和結合結構域。
包含至少一個人結合結構域的抗體和抗體構建體避免了與具有非人(如齧齒動物(例如鼠類、大鼠、倉鼠或兔))可變區和/或恒定區的抗體構建體相關的一些問題。此類齧齒動物衍生的蛋白質的存在可以導致抗體或抗體構建體快速清除或可以導致患者產生針對抗體或抗體構建體的免疫應答。為了避免使用齧齒動物衍生的抗體構建體，可以藉由將人抗體功能引入齧齒動物中以便使齧齒動物產生完全人抗體來產生人源化或完全人抗體構建體。
在YAC中選殖和重構兆鹼基大小的人基因座並將它們引入到小鼠種系中的能力為闡明非常大或粗略定位的基因座的功能組分以及產生有用的人疾病模型提供了強有力的方法。此外，使用這種技術將小鼠基因座取代為其人等效物可以提供關於人基因產物在發育過程中的表現和調控、其與其他系統的通信以及其參與疾病誘導和進展的獨特見解。
這種策略的重要實際應用係小鼠體液免疫系統的「人源化」。將人免疫球蛋白(Ig)基因座引入到其中內源性Ig基因已經失活的小鼠中提供了研究抗體的程式化表現和組裝的根本機制以及其在B細胞發育中的作用的機會。此外，這種策略可以為完全人單株抗體(mAb)的產生提供理想來源-這係有助於實現抗體療法在人疾病中的前景的重要里程碑。預期完全人抗體或由其衍生的抗體構建體將小鼠或小鼠衍生的mAb所固有的免疫原性和變應性應答最小化，並且由此增加投與的抗體/抗體構建體的功效和安全性。可以預期使用完全人抗體或抗體構建體可以在治療需要重複投與化合物的慢性和復發性人疾病(諸如炎症、自體免疫和癌症)中提供顯著的優勢。
實現這一目標的一種方法係用人Ig基因座的大片段工程化小鼠抗體產生缺陷的小鼠品系，預期這種小鼠在不存在小鼠抗體的情況下將產生大的人抗體組庫。大的人Ig片段將保持大的可變基因多樣性以及對抗體產生和表現的適當調控。藉由利用小鼠機構實現抗體多樣化和選擇以及缺乏對人蛋白質的免疫耐受性，在該等小鼠品系中再生的人抗體組庫應產生針對任何感興趣的抗原(包括人抗原)的高親和力抗體。使用雜交瘤技術，可以容易地產生和選擇具有所希望特異性的抗原特異性人mAb。結合第一種XenoMouse小鼠品系的產生證明了這個一般策略(參見Green等人Nature Genetics[自然遺傳學]7：13-21(1994))。用含有人重鏈基因座和κ輕鏈基因座的分別245kb和190kb大小的種系構型片段的酵母人工染色體(YAC)將XenoMouse品系工程化，該等種系構型片段含有核心可變區和恒定區序列。證明含有人Ig的YAC與小鼠系統相容以重排和表現抗體，並且該等YAC能夠取代失活的小鼠Ig基因。這藉由其誘導B細胞發育、產生完全人抗體的成人樣人組庫和產生抗原特異性人mAb的能力來證明。該等結果還表明，引入含有更多數量的V基因、額外的調控元件和人Ig恒定 區的更大部分的人Ig基因座可以實質上再現作為對感染和免疫的人體液應答的特徵的完整組庫。Green等人的工作擴展到藉由分別引入兆鹼基大小的人重鏈基因座和k輕鏈基因座的種系構型YAC片段來引入大於約80%的人抗體組庫。參見Mendez等人Nature Genetics[自然遺傳學]15：146-156(1997)以及美國專利申請序號08/759,620。
XenoMouse模型的產生進一步論述和描述於以下中：美國專利申請序號07/466,008、序號07/610,515、序號07/919,297、序號07/922,649、序號08/031,801、序號08/112,848、序號08/234,145、序號08/376,279、序號08/430,938、序號08/464,584、序號08/464,582、序號08/463,191、序號08/462,837、序號08/486,853、序號08/486,857、序號08/486,859、序號08/462,513、序號08/724,752和序號08/759,620；和美國專利案號6,162,963、6,150,584、6,114,598、6,075,181和5,939,598以及日本專利案號3 068 180 B2、3 068 506 B2和3 068 507 B2。還參見Mendez等人Nature Genetics[自然遺傳學]15：146-156(1997)以及Green和Jakobovits J.Exp.Med.[實驗醫學雜誌]188：483-495(1998)、EP 0 463 151 B1、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893、WO 00/76310和WO 03/47336。
在一個替代性方法中，包括真藥物國際公司(GenPharm International,Inc.)的其他公司利用了「微基因座」方法。在微基因座方法中，藉由包含來自Ig基因座的碎片(單獨的基因)來模擬外源性Ig基因座。因此，將一個或多個VH基因、一個或多個DH基因、一個或多個JH基因、μ恒定區和第二恒定區(較佳的是γ恒定區)形成為用於插入動物中的構建體。該方法描述於Surani等人的美國專利案號5,545,807；以及每一個都屬於Lonberg和Kay的美國專利案號5,545,806；5,625,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；5,770,429；5,789,650；5,814,318；5,877,397；5,874,299；和6,255,458；Krimpenfort和Berns 的美國專利案號5,591,669和6,023.010；Berns等人的美國專利案號5,612,205；5,721,367；和5,789,215；和Choi和Dunn的美國專利案號5,643,763；以及GenPharm International公司的美國專利申請序號07/574,748、序號07/575,962、序號07/810,279、序號07/853,408、序號07/904,068、序號07/990,860、序號08/053,131、序號08/096,762、序號08/155,301、序號08/161,739、序號08/165,699、序號08/209,741中。還參見EP 0 546 073 B1、WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884以及美國專利案號5,981,175。進一步參見Taylor等人(1992)，Chen等人(1993)，Tuaillon等人(1993)，Choi等人(1993)，Lonberg等人(1994)，Taylor等人(1994)，以及Tuaillon等人(1995)，Fishwild等人(1996)。
Kirin也展示了從藉由微細胞融合引入大段染色體或整個染色體的小鼠產生人抗體。參見歐洲專利申請號773 288和843 961。Xenerex Biosciences正在開發用於人抗體的潛在產生的技術。在這種技術中，用人淋巴細胞(例如B和/或T細胞)重構SCID小鼠。然後將小鼠用抗原免疫並且可產生針對抗原的免疫應答。參見美國專利案號5,476,996；5,698,767；和5,958,765。
在一些實施方式中，本發明的抗體構建體係「分離的」或「實質上純的」抗體構建體。當用於描述本文揭露的抗體構建體時，「分離的」或「實質上純的」意指抗體構建體已從其產生環境的組分中鑒定、分離和/或回收。較佳的是，抗體構建體不與或實質上不與來自其產生環境的所有其他組分締合。其產生環境的污染組分，諸如由重組轉染細胞產生的污染組分，係可能干擾抗體構建體的診斷或治療用途的物質，並且可能包括酶、激素和其他蛋白質或非蛋白質化合物。應當理解，根據情況，分離的或基本上純的抗體構建體可以構 成給定樣本中總蛋白質/多肽含量的以重量計從5%至99.9%。藉由使用誘導型啟動子或高表現啟動子，可以以顯著更高的濃度生產所期望的抗體構建體。該定義包括在本領域中已知的多種生物體和/或宿主細胞中產生抗體構建體。在某些實施方式中，抗體構建體(1)藉由使用旋杯式序列分析儀純化至足以獲得至少15個N末端或內部胺基酸序列的殘基的程度，或(2)可以藉由SDS-PAGE在非還原或還原條件下使用考馬斯藍或較佳的是銀染色純化至均質。然而，通常藉由至少一個純化步驟來製備分離的抗體構建體。
根據一個實施方式，整個抗體構建體和/或結合結構域呈一種或多種多肽的形式或處於蛋白質的形式。除了蛋白質部分以外，此類多肽或蛋白質可以包括非蛋白質部分(例如化學連接子或化學交聯劑如戊二醛)。
肽係藉由共價肽(醯胺)鍵連接的胺基酸單體的短鏈。因此，肽被列為生物低聚物和聚合物的寬的化學類別。作為肽或多肽鏈的一部分的胺基酸被稱為「殘基」並且可以被連續編號。除環肽以外的所有肽在肽的一個末端具有N末端殘基，並且在另一個末端具有C末端殘基。寡肽僅由少數胺基酸(通常在兩個至二十個之間)組成。多肽係更長的連續的且無分支的肽鏈。肽根據大小與蛋白質不同，並且作為任意基準可以理解為含有約50個或更少個胺基酸。蛋白質由通常以生物功能方式排列的一種或多種多肽組成。雖然應用於肽與多肽和蛋白質的實驗室技術的各方面不同(例如，電泳的特性、層析等)，但區分肽與多肽和蛋白質的大小邊界不是絕對的。因此，在本發明的上下文中，術語「肽」、「多肽」和「蛋白質」可以互換使用，並且術語「多肽」通常是較佳的。
多肽可以進一步形成多聚體如二聚體、三聚體和更高級的寡聚物，該等多聚體由多於一個多肽分子組成。形成此類二聚體、三聚體等的多肽 分子可以是相同的或不相同的。因此，此類多聚體的相應高階結構被稱為同或異二聚體、同或異三聚體等。異多聚體的實例係抗體或免疫球蛋白分子，其天然存在形式由兩條相同的輕多肽鏈和兩條相同的重多肽鏈組成。術語「肽」、「多肽」和「蛋白質」還是指天然修飾的肽/多肽/蛋白質，其中修飾例如藉由翻譯後修飾(如糖基化、乙醯化、磷酸化等)來實現。當在本文中提及時，「肽」、「多肽」或「蛋白質」也可以是經化學修飾的，如聚乙二醇化的。此類修飾在本領域中是熟知的並且在下文描述。
術語「(特異性地或免疫特異性地)結合」、「(特異性地或免疫特異性地)識別」、或「與......(特異性或免疫特異性地)反應」根據本發明意指抗體構建體或結合結構域與靶分子(抗原)(此處：分別為CLDN18.2和CD3)上的給定表位相互作用或(免疫)特異性地相互作用。對於特定靶標上的表位而不是替代物質(非靶分子)，這種相互作用或關聯以更大的持續時間、以更大的親和力、或以上述的一些組合更頻繁地、更快速地發生。但是，由於不同物種中同源蛋白質之間的序列相似性，免疫特異性地結合其靶標(如人靶標)的抗體構建體或結合結構域可能與來自不同物種(如，來自非人靈長類動物)的同源靶分子交叉反應。因此，術語「特異性/免疫特異性結合」可以包括抗體構建體或結合結構域與多於一個物種中的表位或結構相關表位的結合。
在本發明的上下文中，術語「表位」係指由結合結構域識別/免疫特異性地識別的抗原的部分或區域。「表位」係抗原性的，並且因此術語表位有時也被稱為「抗原結構」或「抗原決定簇」。與表位結合的結合結構域部分被稱為互補位(paratope)。認為特異性結合係藉由結合結構域和抗原的胺基酸序列中的特定模體實現的。因此，作為它們的一級、二級和/或三級結構以及所述結構的潛在二次修飾的結果，結合得以實現。互補位與其抗原決定簇的特異 性相互作用可以導致所述位點與抗原的簡單結合。在一些情況下，特異性相互作用可以替代地或另外地導致訊號的引發，例如由於誘導抗原構象的變化、抗原的寡聚化等。
基於蛋白質抗原的結構和與互補位的相互作用，蛋白質抗原的表位被分為兩大類：構象表位和線性表位。構象表位由抗原的胺基酸序列的不連續部分構成。該等表位基於抗原的三維表面特徵和形狀或三級結構(折疊)與互補位發生相互作用。確定表位構象的方法包括但不限於x射線晶體學、二維核磁共振(2D-NMR)光譜學和定點自旋標記和電子順磁共振(EPR)光譜學。相反，線性表位基於其一級結構與互補位發生相互作用。線性表位由來自抗原的連續胺基酸序列形成，並且典型地在獨特序列中包括至少3個或至少4個、且更通常地至少5個或至少6個或至少7個，例如約8個至約10個胺基酸。
以下描述了用於CLDN18.2表位定位的方法：在人CLDN18.2蛋白的細胞外環內的預定義區域(連續胺基酸延伸)與CLDN18.2旁系同源物(如人CLDN6或人CLDN9，但也可以想到其他旁系同源物，只要結合結構域不與所使用的旁系同源物發生交叉反應即可)的相應區域交換/替換。該等人CLDN18.2/旁系同源嵌合體在宿主細胞(如CHO細胞)的表面上表現。可以經由FACS分析測試抗體或抗體構建體的結合。當抗體或抗體構建體與嵌合分子的結合完全消除時，或當觀察到顯著的結合減少時，可以得出結論，從這種嵌合分子中去除的人CLDN18.2區域與免疫特異性表位-互補位識別相關。與人(野生型)CLDN18.2的結合相比，所述結合降低較佳的是至少10%、20%、30%、40%或50%；更較佳的是至少60%、70%或80%，並且最較佳的是90%、95%或甚至100%，由此，與人CLDN18.2的結合被設定為100%。可替代地，可以藉由將一個或多個點突變引入CLDN18.2的序列(特別是細胞外環1或環2的序列)中來改進上述表 位定位分析。該等點突變可以例如反映在CLDN18.2與其密切相關的旁系同源物CLDN18.1之間的差異。例如，突變可以選自由以下組成之群組：Q29M、N37D、A42S、N45Q、Q47E、E56Q、G65P和L69I。參見實例1和2。
確定靶抗原的特定殘基對抗體構建體或結合結構域的識別的貢獻的另一種方法係丙胺酸掃描(參見，例如Morrison KL和Weiss GA.Curr Opin Chem Biol.[化學生物學新見]2001年6月；5(3)：302-7)，其中待分析的每個殘基例如經由定點誘變被丙胺酸替代。丙胺酸的使用係因為其具有非巨大的、化學惰性的甲基官能基，但仍然模仿許多其他胺基酸所具有的二級結構參考。在需要保守突變殘基的大小的情形下，有時可以使用巨大的胺基酸(諸如纈胺酸或亮胺酸)。
在結合結構域與靶抗原的表位之間的相互作用意味著結合結構域對表位/靶抗原(此處：分別為CLDN18.2和CD3)表現出相當可觀或顯著的親和力，並且通常對除靶抗原(此處：CLDN18.2/CD3)以外的蛋白質或抗原不表現出顯著的親和力-儘管上面論述過與例如來自其他物種的同源靶標的交叉反應。「顯著的親和力」包括以
Figure 108127615-A0305-02-0027-662
10-6M的親和力(解離常數，KD)結合。較佳的是，當結合親和力為
Figure 108127615-A0305-02-0027-663
10-7M、
Figure 108127615-A0305-02-0027-664
10-8M、
Figure 108127615-A0305-02-0027-665
10-9M、
Figure 108127615-A0305-02-0027-666
10-10M、或甚至
Figure 108127615-A0305-02-0027-667
10-11M、或
Figure 108127615-A0305-02-0027-668
10-12M時，結合被認為係特異性的。例如藉由比較所述結合結構域對其期望的靶蛋白質或抗原的親和力與所述結合結構域對非靶蛋白質或抗原的親和力(此處：分別為除CLDN18.2或CD3以外的蛋白質)，可以容易地測試結合結構域是否與靶標(免疫)特異性地反應或結合。較佳的是，本發明的抗體構建體不分別與除CLDN18.2或CD3以外的蛋白質或抗原顯著結合(即，第一結構域不與除CLDN18.2以外的蛋白質結合，並且第二結構域不與除CD3以外的蛋白質結合)-除非針對另外的靶標的任何一個或多個另外的結合結構域被刻意引入本發 明的抗體構建體中，在這種情況下，本發明還提供該結合結構域與其特異性靶標的結合。
設想第一結構域對CLDN18.2(例如人CLDN18.2)的親和力為
Figure 108127615-A0305-02-0028-669
100nM、
Figure 108127615-A0305-02-0028-670
90nM、
Figure 108127615-A0305-02-0028-671
80nM、
Figure 108127615-A0305-02-0028-672
70nM、
Figure 108127615-A0305-02-0028-673
60nM、
Figure 108127615-A0305-02-0028-674
50nM、
Figure 108127615-A0305-02-0028-675
40nM、
Figure 108127615-A0305-02-0028-676
30nM或
Figure 108127615-A0305-02-0028-677
20nM。較佳的是在基於細胞的測定(如Scatchard測定)中測量該等值。參見實例4。確定親和力的其他方法也是熟知的。進一步設想第二結構域對CD3(例如人CD3)的親和力為
Figure 108127615-A0305-02-0028-678
100nM、
Figure 108127615-A0305-02-0028-679
90nM、
Figure 108127615-A0305-02-0028-680
80nM、
Figure 108127615-A0305-02-0028-681
70nM、
Figure 108127615-A0305-02-0028-682
60nM、
Figure 108127615-A0305-02-0028-683
50nM、
Figure 108127615-A0305-02-0028-684
40nM、
Figure 108127615-A0305-02-0028-685
30nM、
Figure 108127615-A0305-02-0028-686
20nM或
Figure 108127615-A0305-02-0028-687
10nM。較佳的是在表面電漿共振測定(如Biacore測定)中測量該等值。參見實例3。
術語「不顯著結合」意指當所述蛋白質或抗原在細胞表面上表現時，本發明的抗體構建體或結合結構域不與除CLDN18.2或CD3以外的蛋白質或抗原結合。因此，抗體構建體顯示出
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30%、較佳的是
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20%、更較佳的是
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10%、特別較佳的是
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9%、
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8%、
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7%、
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6%、
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5%、
Figure 108127615-A0305-02-0028-696
4%、
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3%、
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2%或
Figure 108127615-A0305-02-0028-699
1%的與除CLDN18.2或CD3以外的蛋白質或抗原(當所述蛋白質或抗原在細胞表面上表現時)的反應性，由此，分別與CLDN18.2或CD3的結合被設定為100%。「反應性」可以例如以親和力值表現(參見上文)。
設想本發明的抗體構建體(並且更具體地，其第一結構域)不結合或不顯著結合CLDN18.2旁系同源物、更具體地人CLDN18.2旁系同源物和/或獼猴/食蟹猴CLDN18.2旁系同源物。還設想抗體構建體不結合或不顯著結合在靶細胞表面上的(人或獼猴/食蟹猴)CLDN18.2旁系同源物。CLDN18.2旁系同源物包括-但不限於-CLDN18.1、CLDN1、CLDN2、CLDN3、CLDN4、CLDN6和CLDN9。根據一個實施方式，CLDN18.2的人旁系同源物具有如SEQ ID NO：2-10所描述的序列。參見實例6和圖6。因此，設想本發明的抗體構建體的第一結 構域不結合或不顯著結合(在靶細胞的表面上的)CLDN18.1、CLDN1、CLDN2、CLDN3、CLDN4、CLDN6和/或CLDN9。
本發明的抗體構建體的第一結構域結合在靶細胞表面上的CLDN18.2。「靶細胞」可以是在其表面上表現CLDN18.2的任何原核或真核細胞；較佳的是，靶細胞係作為人體或動物體的一部分的細胞，如表現特定CLDN18.2的癌症或腫瘤細胞或CLDN18.2陽性腫瘤的細胞。應當理解，在本發明的上下文中，術語「在表面上」意指抗體構建體的第一結構域特異性地結合在第一CLDN18.2細胞外環(CLDN18.2 ECL1)內、在第二CLDN18.2細胞外環(CLDN18.2 ECL2)內包含的表位、或在兩個環的組合內包含的表位。因此，設想本發明的抗體構建體的第一結構域結合CLDN18.2(較佳的是人CLDN18.2)的細胞外環。細胞外環可以是第一環或第二環。還設想兩個環都有助於結合。在這種情況下，有可能一個環(如第一環)代表抗體構建體的主要結合配偶體，而另一個環(如第二環)例如作為穩定化配偶體有助於結合，但對於結合並非絕對必要的。因此，當CLDN18.2被天然表現的細胞或細胞系(如人胃癌細胞系SNU-601、SNU-620、或還有SNU-16、NUGC、NUG-C4、GSU或IM95)和/或被用CLDN18.2轉化或(穩定地/暫態地)轉染的細胞或細胞系表現時，根據本發明的第一結構域可以與CLDN18.2結合。在一個實施方式中，在基於細胞的結合測定如Scatchard測定中，當CLDN18.2被用作靶分子時，第一結構域與CLDN18.2結合(參見例如實例4)。此外，設想抗體構建體/其第一結構域與靶細胞表面上的人CLDN18.2結合。人CLDN18.2的較佳的胺基酸序列描述於SEQ ID NO：1中。
設想根據本發明的抗體構建體(並且更具體地，所述抗體構建體的第一結構域)結合CLDN18.2的第一細胞外環(ECL1，環1)。這並不一定排除第二細胞外環也促成互補位-表位相互作用位點，儘管程度較小。術語 「CLDN18.2 ECL」(ECL=細胞外環)係指CLDN18.2的那些部分，其基本上不含CLDN18.2的跨膜和細胞質結構域。應當理解，按照本領域常規使用的用於鑒定該疏水結構欄位型別的標準來鑒定針對本發明的CLDN18.2多肽所鑒定的跨膜結構域。跨膜結構域的確切邊界可以改變，但最有可能的是在本文具體提及的結構域的任一末端改變不超過約5個胺基酸。在SEQ ID NO：2中顯示出較佳的人CLDN18.2 ECL1，並且在SEQ ID NO：3中顯示出較佳的人CLDN18.2 ECL2。
此外，本發明提供了：˙本發明的抗體構建體的第一結構域與如下抗體或抗體構建體一樣結合相同的CLDN18.2表位，該抗體或抗體構建體包含如下結構域，該結構域與靶細胞表面上的CLDN18.2結合並且包含：a)VH區以及VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：121中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：122中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：123中所描述的CDR-H3，該VL區包含如SEQ ID NO：124中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：125中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：126中所描述的CDR-L3；b)VH區以及VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：133中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：134中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：135中所描述的CDR-H3，該VL區包含如SEQ ID NO：136中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：137中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：138中所描述的CDR-L3；c)如SEQ ID NO：127中所描述的VH區，以及如SEQ ID NO：128中所描述的VL區；或d)如SEQ ID NO：139中所描述的VH區，以及如SEQ ID NO：140中所描述的VL區； ˙本發明的抗體構建體與包含如下結構域的抗體或抗體構建體競爭結合，該結構域與靶細胞表面上的CLDN18.2結合並且包含：a)VH區以及VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：121中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：122中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：123中所描述的CDR-H3，該VL區包含如SEQ ID NO：124中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：125中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：126中所描述的CDR-L3；b)VH區以及VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：133中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：134中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：135中所描述的CDR-H3，該VL區包含如SEQ ID NO：136中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：137中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：138中所描述的CDR-L3；c)如SEQ ID NO：127中所描述的VH區，以及如SEQ ID NO：128中所描述的VL區；或d)如SEQ ID NO：139中所描述的VH區，以及如SEQ ID NO：140中所描述的VL區；˙本發明的抗體構建體的第一結構域結合在靶細胞表面上的具有如SEQ ID NO：22中所描述的胺基酸序列的CLDN18.2突變體，並且視需要還結合在靶細胞表面上的具有如SEQ ID NO：24中所描述的胺基酸序列的CLDN18.2突變體，但不結合在靶細胞表面上的具有如SEQ ID NO：23中所描述的胺基酸序列的CLDN18.2突變體；˙本發明的抗體構建體的第一結構域結合在靶細胞表面上的具有如SEQ ID NO：14中所描述的胺基酸序列的CLDN18.2突變體和/或在靶細胞表面上的具有胺基酸序列SEQ ID NO15的CLDN18.2突變體，並且視需要還結合在靶細胞表面上的具有選自以下群組的胺基酸序列中的一個或多個CLDN18.2突變體，該組 由SEQ ID NO：11、12、13、16、17、19、20和21中所描述的那些胺基酸序列組成，但不結合在靶細胞表面上的具有如SEQ ID NO：18中所描述的胺基酸序列的CLDN18.2突變體；˙本發明的抗體構建體的第一結構域結合在靶細胞表面上的人CLDN18.2，其中在人CLDN18.2的位置56處的Glu(E)對於第一結構域的結合係必需的，並且在人CLDN18.2的位置42處的Ala(A)和/或位置45處的Asn(N)對於第一結構域的結合不是必需的；和/或˙本發明的抗體構建體的第一結構域結合CLDN18.2的表位，該表位包含如SEQ ID NO：266中所描述的胺基酸序列，但不包含如SEQ ID NO：265中所描述的胺基酸序列，並且視需要還不包含如SEQ ID NO：267中所描述的胺基酸序列。
在表位定位中還分析了其他抗CLDN18.2結合物(CL-3、CL-4)的CLDN18.2結合特異性(參見實例2)。發現該等CLDN18.2xCD3抗體構建體具有不同的表位特異性，並且同時顯示出，與本發明的抗體構建體相比具有顯著較差的細胞毒性潛力。在實例7.4中，證明了儘管對CLDN18.2具有相似的親和力，本發明的抗體構建體顯示在2位數皮莫耳範圍內的EC50值，而比較構建體顯示在3位數至5位數皮莫耳範圍內的EC50值。顯示後一範圍的細胞毒性活性的抗體構建體可能不夠有效用於在指導患者的免疫系統(更具體地T細胞對癌細胞的細胞毒性活性)中的治療用途。另一方面，根據本發明的抗體構建體以非常有利的表位-活性關係存在，因此支持有效的抗體構建體介導的細胞毒性活性。
抗體、抗體構建體或結合結構域是否與另一種給定抗體、抗體構建體或結合結構域一樣結合在靶細胞表面上的相同的CLDN18.2表位，可以藉由如本文所述的不同分析(例如，藉由用嵌合或突變的CLDN18.2分子進行表位定 位)來測量，如本文上面或在實例1和2中所述的。本文描述了確定表位的其他方法，如丙胺酸掃描。
可以在競爭性測定如競爭性ELISA中測量抗體或抗體構建體是否與另一種給定抗體或抗體構建體競爭與靶細胞表面上的抗原(如CLDN18.2)結合。也可以使用抗生物素蛋白偶聯的微粒(珠粒)。與抗生物素蛋白塗覆的ELISA板類似，當與生物素化蛋白質反應時，該等珠粒中的每一個都可用作可在其上進行測定的底物。將抗原塗覆在珠粒上，並且然後用第一抗體預塗覆。添加第二抗體並且確定任何另外的結合。讀數經由流動式細胞術發生。較佳的是使用基於細胞的競爭測定，使用天然表現CLDN18.2的細胞或用CLDN18.2穩定地或暫態地轉化的細胞。在本發明的上下文中，術語「競爭結合」意指在至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的兩種測試抗體之間發生競爭，如藉由上文揭露的任何一種測定(較佳的是基於細胞的測定)確定的。當然，相同的分析可以應用於其他靶標，如CD3。
競爭性抗體結合測定包括確定兩種抗體/抗體構建體與細胞表面結合抗原的競爭性結合的測定。旨在檢測兩種抗體/抗體構建體A和B與細胞表面上的相同抗原的結合的常用方法可以包括以下步驟：a)藉由將細胞與抗體/抗體構建體A一起預孵育、隨後次最大程度地添加標記的抗體/抗體構建體B來阻斷細胞表面抗原，並檢測與在不存在A的情況下的結合相比B的結合；b)在次最大量的標記的抗體/抗體構建體B的存在下滴定(即添加不同量的)抗體/抗體構建體A，並檢測對B的結合的影響；或 c)共滴定A和B，其中兩種抗體/抗體構建體以最大濃度一起孵育，並檢測總結合是否等於或超過單獨的A或B的結合，即不受添加的順序或抗體/抗體構建體的相對量影響的方法。
當兩種抗體/抗體構建體A和B競爭細胞表面結合的抗原時，抗體將經常在不依賴於添加抗體的順序的阻斷測定中彼此競爭。換句話說，如果在任一方向上進行測定，則競爭得以檢測。然而，情況並非總是如此，並且在某些情況下，抗體添加的順序或測定的方向可能對產生的訊號具有影響。這可能是由於潛在競爭性抗體/抗體構建體的親和力或親合力的差異。如果添加的順序對產生的訊號具有顯著影響，則推斷如果在至少一個順序中檢測到競爭，則兩種抗體/抗體構建體確實有競爭。
根據一個實施方式，本發明的抗體構建體的第一結構域結合在靶細胞表面上的人CLDN18.2，其中在人CLDN18.2的位置56處的Glu(E)對於第一結構域的結合係必需的，並且在人CLDN18.2的位置42處的Ala(A)和/或位置45處的Asn(N)對於第一結構域的結合不是必需的。在這個背景下，術語「對於結合係必需的」意指特定胺基酸(在位置56處的Glu)係抗體構建體與CLDN18.2的結合發生所必需的。如果在位置56處的胺基酸Glu被交換成例如Gln(→E56Q)，抗體構建體的結合被消除或顯著降低(參見圖4，命名為「P6」的列)。術語「對於結合不是必需的」意指特定胺基酸(在位置42處的Ala和/或在位置45處的Asn)不是抗體構建體與CLDN18.2的結合發生所必需的。如果在位置42處的胺基酸Ala和/或在位置45處的Asn被交換成例如在位置42處的Ser(→A42S)和/或在位置45處的Gln(→N45Q)，在抗體構建體的結合不被降低或不被顯著降低(參見圖4，命名為「P3」和「P4」的列)。
根據一個實施方式，本發明的抗體構建體的第一結構域包含含有選自以下群組的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH區和含有選自以下群組的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL區，該群組由以下組成：a)如SEQ ID NO：121中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：122中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：123中所描述的CDR-H3，如SEQ ID NO：124中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：125中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：126中所描述的CDR-L3；以及b)如SEQ ID NO：133中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：134中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：135中所描述的CDR-H3，以及如SEQ ID NO：136中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：137中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：138中所描述的CDR-L3。
在本發明的上下文中，術語「可變」係指抗體或免疫球蛋白結構域表現出其序列可變性並且參與確定特定抗體的特異性和結合親和力的那些部分(即「一個或多個可變區」)。通常，重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的配對一起形成單個抗原結合位點。
可變性在整個抗體的可變區中並非均勻分佈；它集中在重鏈可變區和輕鏈可變區中的每一個的子結構域中。該等子結構域稱為「超變區」或「互補決定區」(CDR)。可變區的更保守的(即非超變)部分被稱為「框架」(FR)區，並且為三維空間中的六個CDR提供支架以形成抗原結合表面。天然存在的抗體重鏈和輕鏈的可變區各自包含主要採用β-折疊構型的四個FR區(FR1、FR2、FR3和FR4)。與CDR一起，它們在可變重鏈或輕鏈內形成以下序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。每條鏈中的超變區藉由框架區緊密靠近 在一起，並通常與來自另一條鏈的超變區一起有助於抗原結合位點的形成(參見Kabat等人，上述引文)。
術語「CDR」及其複數「CDR」係指其中三個構成輕鏈可變區(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)的結合特徵並且三個構成重鏈可變區(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)的結合特徵的互補決定區。CDR包含大多數負責抗體(或抗體構建體或結合結構域)與抗原的特異性相互作用的殘基，並且因此有助於抗體分子的功能活性：它們係抗原特異性的主要決定因素。
CDR邊界和長度的準確定義受制於不同的分類和編號系統。因此，CDR可以藉由Kabat、Chothia、contact或任何其他邊界定義(包括本文所述的編號系統)來引用。儘管有不同的邊界，但該等系統中的每一者在構成可變序列內所謂的「超變區」的方面具有一定程度的重疊。因此，根據該等系統的CDR定義可以在相對於相鄰框架區的長度和邊界區域中不同。參見例如Kabat(基於跨物種序列變異性的方法)、Chothia(基於抗原-抗體複合物的晶體學研究的方法)、和/或MacCallum(Kabat等人，上述引文；Chothia等人，J.MoI.Biol[分子生物學雜誌]，1987,196：901-917；以及MacCallum等人，J.MoI.Biol[分子生物學雜誌]，1996,262：732)。表徵抗原結合位點的還另一標準係由牛津大學分子公司(Oxfbrd Molecular)的AbM抗體建模軟體使用的AbM定義。參見例如，Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[抗體可變結構域的蛋白質序列和結構分析]在：Antibody Engineering Lab Manual[抗體工程實驗室手冊](編輯：Duebel,S.和Kontermann,R.，施普林格出版社(Springer-Verlag)，海德爾堡)。就兩種殘基鑒定技術定義重疊區而非相同區而言，可以將它們組合以定義雜合CDR。然而，根據所謂的Kabat系統進行編號係較佳的。
典型地，CDR形成可以分類為規範結構的環結構。術語「規範結構」係指由抗原結合(CDR)環所採用的主鏈構象。從比較結構研究中，已經發現六個抗原結合環中的五個僅具有有限的可用構象組庫。每個規範結構可以藉由多肽骨架的扭轉角來表徵。因此，在抗體之間的相應環可以具有非常相似的三維結構，儘管在環的大部分種具有高的胺基酸序列可變性(Chothia和Lesk,J.MoI.Biol.[分子生物學雜誌]，1987,196：901；Chothia等人.，Nature[自然]，1989,342：877；Martin和Thornton,J.MoI.Biol[分子生物學雜誌]，1996,263：800)。此外，所採用的環結構與其周圍的胺基酸序列之間存在關係。特定規範類別的構象由環的長度和位於環內關鍵位置以及保守框架內(即，環外)的胺基酸殘基決定。因此，可以基於該等關鍵胺基酸殘基的存在對特定的規範類別進行分配。
術語「規範結構」還可以包括關於抗體的線性序列的考慮因素，例如，如藉由Kabat(Kabat等人，上述引文)編目的。Kabat編號方案(系統)係以一致方式對抗體可變區的胺基酸殘基進行編號的廣泛採用的標準，並且是本發明應用的較佳的方案，也如本文其他地方所提及。另外的結構考慮因素也可以用於確定抗體的規範結構。例如，Kabat編號未完全反映的那些差異可以藉由Chothia等人的編號系統來描述，並且/或者藉由其他技術(例如結晶學和二維或三維計算建模)來揭示。因此，可以將給定抗體序列置於規範的類別中，該類別尤其允許鑒定適當的類別序列(例如，基於在文庫中包括多種規範結構的期望)。文獻中描述了抗體胺基酸序列的Kabat編號和如由Chothia等人，上述引文所述的結構考慮因素以及其參與解釋抗體結構的規範方面。不同類別免疫球蛋白的亞單位結構和三維構型在本領域中是熟知的。有關抗體結構的綜述，參見Antibodies：A Laboratory Manual[抗體：實驗室手冊]，Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港實驗室]，Harlow等人編輯，1988。
輕鏈的CDR3以及特別是重鏈的CDR3可以構成輕鏈可變區和重鏈可變區內抗原結合中最重要的決定簇。在一些抗體或抗體構建體/結合結構域中，重鏈CDR3似乎構成抗原與抗體之間的主要接觸區域。其中僅僅改變CDR3的體外選擇方案可以用於改變抗體或抗體構建體/結合結構域的結合特性或確定哪些殘基有助於抗原的結合。因此，CDR3典型地是抗體結合位點內分子多樣性的最大來源。例如，CDR-H3可以短至兩個胺基酸殘基或大於26個胺基酸。
在經典的全長抗體或免疫球蛋白中，每條輕(L)鏈藉由一個共價二硫鍵與重(H)鏈連接，而兩條H鏈藉由一個或多個二硫鍵彼此連接，這取決於H鏈同種型。通常將最靠近VH的重鏈恒定(CH)結構域命名為CH1。恒定(「C」)結構域不直接參與抗原結合，但表現出各種效應子功能，如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和補體激活(補體依賴性細胞毒性，CDC)。抗體的Fc區係經典抗體的「尾部」區域，其與被稱為Fc受體的細胞表面受體和補體系統的一些蛋白質相互作用。在IgG、IgA和IgD抗體同種型中，Fc區由從抗體的兩條重鏈的第二和第三恒定結構域(CH2和CH3)衍生的兩個相同的蛋白質片段構成。IgM和IgE Fc區在每條多肽鏈中含有三個重鏈恒定結構域(CH2、CH3和CH4)。Fc區還含有藉由一個或多個二硫鍵和非共價相互作用保持在一起的所謂「鉸鏈」區的部分。天然存在的IgG的Fc區具有高度保守的N-糖基化位點。Fc片段的糖基化係Fc受體介導的活性所必需的。
ADCC係細胞介導的免疫防禦機制，由此免疫系統的效應細胞主動裂解靶細胞，該靶細胞的膜表面抗原已被特異性抗體結合。ADCC需要免疫效應細胞，其通常已知係典型地與IgG抗體相互作用的天然殺傷(NK)細胞。然而，ADCC也可以由巨噬細胞、嗜中性球和嗜酸性球介導。ADCC涉及藉由表現Fc部分的抗體激活表現Fc受體的效應細胞。例如，NK細胞表面上最常見的Fc受 體被稱為CD16或FcγRIII。一旦Fc受體結合IgG的Fc區，NK細胞就釋放導致靶細胞死亡的細胞毒性因子。同樣，嗜酸性球的Fc受體(FceRI)將識別IgE。相比之下，在CDC中，由於經典途徑補體激活，補體系統的分子「C1q」與抗體Fc區結合，並且這種結合觸發補體級聯，其導致在靶細胞表面形成膜攻擊複合物(MAC)。在治療性抗體或抗體構建體中，ADCC和CDC兩者都可以藉由Fc同種型工程、Fc基因突變或Fc糖基化譜修飾來調節。
組裝和體細胞突變後的抗體基因的序列高度改變，並且估計該等改變的基因編碼1010種不同抗體分子(Immunoglobulin Genes[免疫球蛋白基因]，第2版，Jonio等人編輯，Academic Press[學術出版社]，San Diego,CA[加利福尼亞州聖地牙哥]，1995)。因此，免疫系統提供了免疫球蛋白組庫。術語「組庫」係指完全或部分衍生自至少一種編碼至少一種免疫球蛋白的序列的至少一種核苷酸序列。一種或多種序列可以藉由重鏈的V、D和J區段以及輕鏈的V和J區段的體內重排來產生。可替代地，一種或多種序列可以響應於發生重排(例如體外刺激)而從細胞產生。可替代地，一種或多種序列的一部分或全部可以藉由DNA剪接、核苷酸合成、誘變和其他方法獲得，參見例如美國專利5,565,332。組庫可以僅包括一種序列或可以包括多種序列，包括遺傳多樣性集合中的序列。
設想抗體構建體在第一結構域內具有半胱胺酸夾具(cysteine clamp)。可以引入這種半胱胺酸夾具以改善構建體的穩定性。參見例如US 2016/0193295。
在本發明的一個實施方式中，本發明的抗體構建體的第一結構域包含具有如SEQ ID NO：127或SEQ ID NO：139中所描述的胺基酸序列的VH區。在另外的實施方式中，本發明的抗體構建體的第一結構域包含具有如SEQ ID NO：128或SEQ ID NO：140中所描述的胺基酸序列的VL區。在另一個實施方式 中，本發明的抗體構建體的第一結構域包含VH區和VL區，該VH區和VL區具有如SEQ ID NO：127+128(VH+VL)或SEQ ID NO：139+140(VH+VL)中所描述的胺基酸序列。在又另外的實施方式中，本發明的抗體構建體的第一結構域包含具有如SEQ ID NO：129或SEQ ID NO：141中所描述的胺基酸序列的多肽。
如本文上面所述，本發明提供了如下實施方式，其中抗體構建體處於選擇下組的形式，該群組由以下組成(scFv)2、scFv-單結構域mAb、任何上述形式的雙抗體和寡聚物。術語「處於......形式」並不排除可以被進一步修飾的構建體(例如藉由附接或融合到其他部分)，如本文所述。根據本發明的抗體構建體的一個實施方式，第一結構域和/或第二結構域處於scFv的形式。在scFv中，VH區和VL區以VH-VL或VL-VH(從N末端至C末端)的順序排列。設想第一和/或第二結合結構域的VH和VL區經由連接子、較佳的是肽連接子連接。根據第一和/或第二結構域的一個實施方式，VH區位於連接子的N末端，並且VL區位於連接子的C末端。換句話說，在第一和/或第二結構域的一個實施方式中，scFv從N末端至C末端包含：VH-連接子-VL。進一步設想，抗體構建體的第一結構域和第二結構域經由連接子、較佳的是肽連接子連接。抗體構建體可以例如包含以第一結構域-連接子-第二結構域的順序(從N末端至C末端)的結構域。逆序(第二結構域-連接子-第一結構域)也是可能的。
連接子較佳的是肽連接子，更較佳的是短肽連接子。根據本發明，「肽連接子」包含將抗體構建體的一個結構域的胺基酸序列與另一個(可變和/或結合)結構域(例如可變結構域或結合結構域)連接的胺基酸序列。這種肽連接子的基本技術特徵在於它不包含任何聚合活性。合適的肽連接子係在美國專利4,751,180和4,935,233或WO 88/09344中描述的那些。肽連接子也可用於將其他結構域或模組或區(諸如半衰期延長結構域)連接到本發明的抗體 構建體。在SEQ ID NO：155-168中顯示了有用的肽連接子的實例。在本發明的上下文中，「短」連接子具有在2個與50個之間的胺基酸，較佳的是在3個與35個之間、在4個與30個之間、在5個與25個之間、在6個與20個之間或在6個與17個之間的胺基酸。在一個結合結構域的兩個可變區之間的連接子可以具有與在兩個結合結構域之間的連接子不同的長度(例如可以更長)。例如，在一個結合結構域的兩個可變區之間的連接子可以具有在7個與15個之間(較佳的是在9個與13個之間)的胺基酸的長度，並且在兩個結合結構域之間的連接子可以具有在3個與10個(較佳的是在4個與8個之間)的胺基酸的長度。進一步設想，肽連接子係甘胺酸/絲胺酸連接子，如SEQ ID NO：156和158-168中所描述的那些。在甘胺酸/絲胺酸連接子中的大多數胺基酸選自甘胺酸和絲胺酸。
在使用連接子的情況下，該連接子較佳的是具有足以確保第一結構域和第二結構域中的每一者均可以彼此獨立地保留其差異結合特異性的長度和序列。對於連接抗體構建體中的至少兩個結合結構域(或形成一個結合結構域的兩個可變區)的肽連接子，設想包含僅少數幾個胺基酸殘基(例如12個胺基酸殘基或更少)的那些肽連接子。因此，12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個或5個胺基酸殘基的肽連接子係較佳的。設想的具有少於5個胺基酸的肽連接子包含4個、3個、2個或1個胺基酸，其中富含Gly的連接子係較佳的。在所述「肽連接子」的上下文中的「單個胺基酸」連接子係Gly。肽連接子的另一個實施方式的特徵在於胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(即Gly4Ser(SEQ ID NO：156))或其聚合物(即(Gly4Ser)x，其中x係1或更大(例如2或3)的整數)。在SEQ ID NO：155-163中描述了有用的連接子。所述肽連接子的特徵在本領域中是已知的並且描述於例如Dall'Acqua等人(Biochem.[生物化學](1998) 37,9266-9273)、Cheadle等人(Mol Immunol[分子免疫學](1992)29,21-30)以及Raag和Whitlow(FASEB[美國實驗生物學聯合會會誌](1995)9(1),73-80)中。不促進任何二級結構的肽連接子係較佳的。所述結構域彼此的連接可以例如藉由基因工程提供。用於製備融合的且可操作地連接的雙特異性單鏈構建體並在哺乳動物細胞或細菌中表現它們的方法係本領域中熟知的(例如WO 99/54440或Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子選殖：實驗室手冊]，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港實驗室出版社]，Cold Spring Harbor,New York[紐約冷泉港]，2001)。
根據本發明的一個實施方式，本發明的抗體構建體係「單鏈抗體構建體」。還設想第一結合結構域或第二結合結構域或兩個結合結構域可以處於「單鏈Fv」(scFv)的形式。儘管Fv片段的兩個結構域VL和VH由獨立的基因編碼，但使用重組方法可以將這兩個結構域藉由人工連接子接合，如上文所述，該人工連接子使它們能夠製成單條蛋白質鏈，其中VL和VH區配對以形成單價分子；參見，例如Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA[美國國家科學院院刊]85：5879-5883。使用熟悉該項技術者已知的常規技術獲得該等抗體片段，並且按照與全長抗體或IgG相同的方式評價片段的功能。因此，單鏈可變片段(scFv)係免疫球蛋白的重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區的融合蛋白，通常用短連接子肽連接。為了靈活性，連接子通常富含甘胺酸，以及為了溶解性通常富含絲胺酸或還有蘇胺酸，並且可以連接VH的N末端和VL的C末端，或反之亦然。儘管去除了恒定區並引入了連接子，但該蛋白質保留了原始免疫球蛋白的特異性。
雙特異性單鏈分子在本領域中是已知的並描述於以下中：WO 99/54440；Mack,J.Immunol.[免疫學雜誌](1997),158,3965-3970；Mack,PNAS [美國國家科學院院刊]，(1995),92,7021-7025；Kufer,Cancer Immunol.Immunother.[癌症免疫學免疫治療]，(1997),45,193-197；Löffler,Blood[血液]，(2000),95,6,2098-2103；Brühl,Immunol.[免疫學]，(2001),166,2420-2426；Kipriyanov,J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]，(1999),293,41-56。描述的用於產生單鏈抗體構建體的技術(尤其參見美國專利4,946,778；Kontermann和Dübel(2010)，上述引文，以及Little(2009)，上述引文)可以適用於產生特異性識別一種或多種所選擇的靶標的單鏈抗體構建體。
二價(bivalent)(也稱為雙價(divalent))或雙特異性單鏈可變片段(具有形式(scFv)2的聯-scFv或二-scFv)可以藉由連接兩個scFv分子(例如利用如上文所述的連接子)來工程化。連接可以藉由產生具有兩個VH區和兩個VL區的單一多肽鏈從而產生串聯scFv來進行(參見，例如Kufer P.等人，(2004)Trends in Biotechnology[生物技術趨勢]22(5)：238-244)。另一種可能性係產生具有連接子肽的scFv分子，該等連接子肽對於兩個可變區來說太短以致於不能折疊在一起(例如約五個胺基酸)，從而迫使scFv二聚化。在這種情況下，結合結構域(與靶抗原CLDN18.2或CD3結合)的VH和VL不經由肽連接子直接連接。因此，CD3結合結構域的VH可以例如經由肽連接子與CLDN18.2結合結構域的VL融合，並且CLDN18.2結合結構域的VH經由這種肽連接子與CD3結合結構域的VL融合。這種類型被稱為雙抗體(參見，例如Hollinger,Philipp等人，(1993年7月)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America[美國國家科學院院刊]90(14)：6444-8)。
命名為「單結構域抗體」的抗體構建體包含一個(單體)抗體可變區，該抗體可變區能夠獨立於其他可變區選擇性地結合特定抗原。第一單結構域抗體係從駱駝中發現的重鏈抗體工程化而來，並且該等被稱為VHH片段。軟 骨魚類也具有重鏈抗體(IgNAR)，可以從該等重鏈抗體中獲得稱為VNAR片段的單結構域抗體。替代性方法係將來自常見免疫球蛋白的二聚體可變區分裂成單體，因此獲得VH或VL作為單結構域Ab。儘管對單結構域抗體的大多數研究目前都是基於重鏈可變區，但衍生自輕鏈的奈米抗體也顯示出與靶表位特異性結合。單結構域抗體的實例係所謂的sdAb、奈米抗體或單一可變結構域抗體。因此，(單結構域mAb)2係由單獨地選自以下群組的(至少)兩個單結構域單株抗體構建體構成的單株抗體構建體，該群組由以下組成：VH、VL、VHH和VNAR。連接子較佳的是呈肽連接子的形式。類似地，「scFv-單結構域mAb」係由至少一個如上所述的單結構域抗體和一個如上所述的scFv分子構成的單株抗體構建體。同樣，連接子較佳的是呈肽連接子的形式。
還設想本發明的抗體構建體除了具有與靶分子CLDN18.2和CD3結合的功能外，還具有另外的功能。在這種形式中，藉由CLDN18.2結合靶向靶細胞，藉由CD3結合介導細胞毒性T細胞活性，並且提供另外的功能(如增強或延長血清半衰期的手段或結構域、藉由募集效應細胞介導ADCC的完全功能或經修飾的Fc恒定結構域、標記(螢光等)、治療劑如毒素或放射性核素等)，抗體構建體可以是三功能或多功能抗體構建體。
延長本發明的抗體構建體的血清半衰期的手段或結構域的實例包括與抗體構建體融合或以其他方式附接的肽、蛋白質或蛋白質的結構域。肽、蛋白質或蛋白質的結構域的組包括在人體中以較佳的是藥物動力學特徵與其他蛋白質結合的肽，如血清白蛋白(參見WO 2009/127691)。此類半衰期延長的肽的替代性概念包括與新生兒Fc受體(FcRn，參見WO 2007/098420)結合的肽，其也可用於本發明的抗體構建體中。附接較大蛋白質結構域或完整蛋白質的概念包括人血清白蛋白、人血清白蛋白的變體或突變體(參見WO 2011/051489、 WO 2012/059486、WO 2012/150319、WO 2013/135896、WO 2014/072481、WO 2013/075066)或其結構域的融合，以及免疫球蛋白恒定區(Fc結構域)及其變體的融合。Fc結構域的此類變體被稱為基於Fc的結構域，並且可以例如被優化/修飾以便允許期望的二聚體或多聚體配對，以消除Fc受體結合(例如避免ADCC或CDC)或出於其他原因。在本領域中已知延長物質或分子在人體中的半衰期的另外的概念係那些分子(如本發明的抗體構建體)的聚乙二醇化。
在一個實施方式中，例如出於延長構建體的血清半衰期的目的，根據本發明的抗體構建體與融合配偶體(如蛋白質、多肽或肽)連接(例如經由肽鍵)。該等融合配偶體可以選自人血清白蛋白(「HSA」或「HALB」)以及其序列變體、與HSA結合的肽、與FcRn結合的肽(「FcRn BP」)、或包含(抗體衍生的)Fc區的構建體。在SEQ ID NO：170-232中描述了該等融合配偶體的示例性序列。通常，融合配偶體可以直接(例如經由肽鍵)或藉由肽連接子如(GGGGS)n(其中「n」係2或更大的整數，例如2或3或4)與根據本發明的抗體構建體的N末端或C末端連接。在SEQ ID NO：155-163中描述了合適的肽連接子。
因此，設想根據本發明的抗體構建體包含：(a)從N末端至C末端按以下順序構成的多肽：˙多肽，該多肽具有選自由SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：141組成的組的胺基酸序列；其中包含在那些序列中並且具有SEQ ID NO：163的肽連接子可以被SEQ ID NO：155-162和164-168中的任何一者替代；˙肽連接子，該肽連接子具有選自由SEQ ID NO：155-163組成的組的胺基酸序列；以及˙多肽，該多肽具有選自由SEQ ID NO：36、45、54、63、72、81、90、99、108、117、120、246、247、248、249、250、251、252、253、254和255組成的 組的胺基酸序列；其中包含在那些序列中並且具有SEQ ID NO：163的肽連接子可以被SEQ ID NO：155-162和164-168中的任何一者替代；以及˙視需要His-標籤，例如選自SEQ ID NO：169、269、270或271；(b)從N末端至C末端按以下順序構成的多肽：˙多肽，該多肽具有選自由SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：141組成的組的胺基酸序列；其中包含在那些序列中並且具有SEQ ID NO：163的肽連接子可以被SEQ ID NO：155-162和164-168中的任何一者替代；˙肽連接子，該肽連接子具有選自由SEQ ID NO：155-163組成的組的胺基酸序列；˙多肽，該多肽具有選自由SEQ ID NO：36、45、54、63、72、81、90、99、108、117、120、246、247、248、249、250、251、252、253、254和255組成的組的胺基酸序列；其中包含在那些序列中並且具有SEQ ID NO：163的肽連接子可以被SEQ ID NO：155-162和164-168中的任何一者替代；˙視需要肽連接子，該肽連接子具有選自由SEQ ID NO：155-163組成的組的胺基酸序列；˙多肽，該多肽具有選自由SEQ ID NO：170和176-205組成的組的胺基酸序列；以及˙視需要His-標籤，例如選自SEQ ID NO：169、269、270或271；(c)從N末端至C末端按以下順序構成的多肽：˙多肽，該多肽具有胺基酸序列QRFVTGHFGGLX1PANG(SEQ ID NO：171)，其中X1係Y或H；以及 ˙多肽，該多肽具有選自由SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：141組成的組的胺基酸序列；其中包含在那些序列中並且具有SEQ ID NO：163的肽連接子可以被SEQ ID NO：155-162和164-168中的任何一者替代；˙肽連接子，該肽連接子具有選自由SEQ ID NO：155-163組成的組的胺基酸序列；˙多肽，該多肽具有選自由SEQ ID NO：36、45、54、63、72、81、90、99、108、117、120、246、247、248、249、250、251、252、253、254和255組成的組的胺基酸序列；其中包含在那些序列中並且具有SEQ ID NO：163的肽連接子可以被SEQ ID NO：155-162和164-168中的任何一者替代；˙多肽，該多肽具有如SEQ ID NO：173或SEQ ID NO：175中所描述的胺基酸序列；以及˙視需要His-標籤，例如選自SEQ ID NO：169、269、270或271；(d)從N末端至C末端按以下順序構成的多肽：˙多肽，該多肽具有選自由SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：115、和SEQ ID NO：118組成的組的胺基酸序列；˙肽連接子，該肽連接子具有SEQ ID NO：162所描述的胺基酸序列；˙多肽，該多肽具有選自由SEQ ID NO：128和SEQ ID NO：140組成的組的胺基酸序列，隨後是在C末端處的絲胺酸殘基；˙多肽，該多肽具有SEQ ID NO：206中所描述的胺基酸序列；以及從N末端至C末端按以下順序構成的多肽： ˙多肽，該多肽具有選自由SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：139組成的組的胺基酸序列；˙肽連接子，該肽連接子具有SEQ ID NO：162所描述的胺基酸序列；˙多肽，該多肽具有選自由SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：116、和SEQ ID NO：119組成的組的胺基酸序列；隨後是在C末端處的絲胺酸殘基；以及˙多肽，該多肽具有SEQ ID NO：207中所描述的胺基酸序列；(e)從N末端至C末端按以下順序構成的多肽：˙多肽，該多肽具有選自由SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：115、和SEQ ID NO：118組成的組的胺基酸序列；˙肽連接子，該肽連接子具有SEQ ID NO：162所描述的胺基酸序列；˙多肽，該多肽具有選自由SEQ ID NO：128和SEQ ID NO：140組成的組的胺基酸序列；以及˙多肽，該多肽具有SEQ ID NO：208中所描述的胺基酸序列；以及從N末端至C末端按以下順序構成的多肽：˙多肽，該多肽具有選自由SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：139組成的組的胺基酸序列；˙肽連接子，該肽連接子具有SEQ ID NO：162所描述的胺基酸序列；˙多肽，該多肽具有選自由SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：116、和SEQ ID NO：119組成的組的胺基酸序列，隨後是在C末端處的絲胺酸殘基；以及˙多肽，該多肽具有SEQ ID NO：209中所描述的胺基酸序列；(f)從N末端至C末端按以下順序構成的多肽：˙多肽，該多肽具有選自由SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：141組成的組的胺基酸序列；其中包含在那些序列中並且具有SEQ ID NO：163的肽連接子可以被SEQ ID NO：155-162和164-168中的任何一者替代；˙肽連接子，該肽連接子具有選自由SEQ ID NO：155-163組成的組的胺基酸序列；˙多肽，該多肽具有選自由SEQ ID NO：36、45、54、63、72、81、90、99、108、117、120、246、247、248、249、250、251、252、253、254和255組成的組的胺基酸序列；其中包含在那些序列中並且具有SEQ ID NO：163的肽連接子可以被SEQ ID NO：155-162和164-168中的任何一者替代；˙多肽，該多肽具有SEQ ID NO：210中所描述的胺基酸序列；以及多肽，該多肽具有SEQ ID NO：211中所描述的胺基酸序列；(g)從N末端至C末端按以下順序構成的多肽：˙多肽，該多肽具有選自由SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：141組成的組的胺基酸序列；其中包含在那些序列中並且具有SEQ ID NO：163的肽連接子可以被SEQ ID NO：155-162和164-168中的任何一者替代；以及˙多肽，該多肽具有SEQ ID NO：212中所描述的胺基酸序列；以及從N末端開始按以下順序構成的多肽：˙多肽，該多肽具有選自由SEQ ID NO：36、45、54、63、72、81、90、99、108、117、120、246、247、248、249、250、251、252、253、254和255組成的 組的胺基酸序列；其中包含在那些序列中並且具有SEQ ID NO：163的肽連接子可以被SEQ ID NO：155-162和164-168中的任何一者替代；以及˙多肽，該多肽具有SEQ ID NO：213中所描述的胺基酸序列；(h)從N末端至C末端按以下順序構成的多肽：˙多肽，該多肽具有選自由SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：141組成的組的胺基酸序列；其中包含在那些序列中並且具有SEQ ID NO：163的肽連接子可以被SEQ ID NO：155-162和164-168中的任何一者替代；以及˙多肽，該多肽具有SEQ ID NO：214中所描述的胺基酸序列；以及從N末端開始按以下順序構成的多肽：˙多肽，該多肽具有選自由SEQ ID NO：36、45、54、63、72、81、90、99、108、117、120、246、247、248、249、250、251、252、253、254和255組成的組的胺基酸序列；其中包含在那些序列中並且具有SEQ ID NO：163的肽連接子可以被SEQ ID NO：155-162和164-168中的任何一者替代；以及˙多肽，該多肽具有SEQ ID NO：215中所描述的胺基酸序列；或(i)從N末端至C末端按以下順序構成的多肽：˙多肽，該多肽具有選自由SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：141組成的組的胺基酸序列；其中包含在那些序列中並且具有SEQ ID NO：163的肽連接子可以被SEQ ID NO：155-162和164-168中的任何一者替代；˙肽連接子，該肽連接子具有選自由SEQ ID NO：155-163組成的組的胺基酸序列；˙多肽，該多肽具有選自由SEQ ID NO：36、45、54、63、72、81、90、99、108、117、120、246、247、248、249、250、251、252、253、254和255組成的 組的胺基酸序列；其中包含在那些序列中並且具有SEQ ID NO：163的肽連接子可以被SEQ ID NO：155-162和164-168中的任何一者替代；以及˙多肽，該多肽具有SEQ ID NO：216中所描述的胺基酸序列。
根據另一個實施方式，本發明的抗體構建體包含(除了第一和第二結構域以外)第三結構域，該第三結構域包含兩個多肽單體，每個多肽單體包含鉸鏈、CH2和CH3結構域，其中所述兩個多肽單體經由肽連接子彼此融合。設想所述第三結構域按N末端至C末端的順序包含：鉸鏈-CH2-CH3-連接子-鉸鏈-CH2-CH3。在SEQ ID NO：225-232中描述了可以用於所述第三結構域的胺基酸序列。所述多肽單體中的每一種可以具有選自由SEQ ID NO：217-224組成的組、或與那些序列至少90%相同的胺基酸序列。在另一個實施方式中，本發明的抗體構建體的第一和第二結構域經由肽連接子與第三結構域融合，所述肽連接子例如選自由SEQ ID NO：155、156、157、158、159、160、161、162或163組成的組。
根據本發明，「鉸鏈」係IgG鉸鏈區。該區域可以使用Kabat編號藉由模擬來鑒定，參見例如Kabat位置223-243。與上述一致，對於「鉸鏈」的最低要求係與根據Kabat編號的D231至P243的IgG1序列延伸物對應的胺基酸殘基。術語「CH2」和「CH3」係指免疫球蛋白重鏈恒定區2和3。該等區域也可以使用Kabat編號藉由模擬來鑒定，參見例如Kabat位置244-360(對於CH2)和Kabat位置361-478(對於CH3)。應當理解，在免疫球蛋白之間在其IgG1 Fc區、IgG2 Fc區、IgG3 Fc區、IgG4 Fc區、IgM Fc區、IgA Fc區、IgD Fc區和IgE Fc區方面存在一些變化(參見例如，Padlan,Molecular Immunology[分子免疫學]，31(3),169-217(1993))。術語Fc區係指IgA、IgD和IgG的最後兩個重鏈恒定區、以及IgE和IgM的最後三個重鏈恒定區。Fc區還可以包括該等結構域的N末端的柔性鉸鏈。對於IgA和IgM，Fc區可以包括J鏈。對於IgG，Fc區包含免疫球蛋白結構域CH2和 CH3、以及在前兩個結構域與CH2之間的鉸鏈。儘管免疫球蛋白的Fc區的邊界可以改變，但是但包含功能鉸鏈、CH2和CH3結構域的人IgG重鏈Fc部分的實例可以定義為例如分別包含殘基D231(鉸鏈結構域的殘基)至P476(CH3結構域的C末端的殘基)、或D231至L476，其中編號係根據Kabat。
因此，本發明的抗體構建體按N末端至C末端的順序可以包含：(a)第一結構域；(b)肽連接子，該肽連接子具有選自由SEQ ID NO：156、162和163組成的組的胺基酸序列；(c)第二結構域；(d)肽連接子，該肽連接子具有選自由SEQ ID NO：155、156、158、159、160、162和163的胺基酸序列；(e)第三結構域(包含鉸鏈、CH2和CH3結構域)的第一多肽單體；(f)肽連接子，該肽連接子具有選自由SEQ ID NO：165、166、167和168組成的組的胺基酸序列；以及(g)第三結構域(包含鉸鏈、CH2和CH3結構域)的第二多肽單體。
還設想本發明的抗體構建體按N末端至C末端的順序包含：˙第一結構域，該第一結構域具有選自由SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：141組成的組的胺基酸序列；其中包含在那些序列中並且具有SEQ ID NO：163的肽連接子可以被SEQ ID NO：155-162和164-168中的任何一者替代；˙肽連接子，該肽連接子具有選自由SEQ ID NO：156、162和163組成的組的胺基酸序列；˙第二結構域，該第二結構域具有選自由SEQ ID NO：36、45、54、63、72、81、90、99、108、117、120、246、247、248、249、250、251、252、253、254 和255組成的組的胺基酸序列；其中包含在那些序列中並且具有SEQ ID NO：163的肽連接子可以被SEQ ID NO：155-162和164-168中的任何一者替代；˙肽連接子，該肽連接子具有選自由SEQ ID NO：155、156、158、159、160、162和163的胺基酸序列；以及˙第三結構域，該第三結構域具有選自由SEQ ID NO：225-232組成的組的胺基酸序列。
因此，在一個實施方式中，本發明的抗體構建體包含如下多肽或由其組成，該多肽具有選自在SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：143或SEQ ID NO：144中所描述的那些胺基酸序列的組的胺基酸序列。
抗體構建體的共價修飾也包括在本發明的範圍內，並且通常但不總是在翻譯後進行。例如，藉由使抗體構建體的特定胺基酸殘基與能夠與選擇的側鏈或與N末端或C末端殘基反應的有機衍生劑反應，將抗體構建體的若干種類型的共價修飾引入到分子中。用雙功能劑衍生化可用於將本發明的抗體構建體交聯到水不溶性支持基質或表面以用於多種方法中。麩醯胺酸醯殘基和天冬醯胺醯殘基通常分別脫醯胺成相應的穀胺醯殘基和天冬胺醯殘基。可替代地，該等殘基在弱酸性條件下脫醯胺。該等殘基的任一形式都屬於本發明的範圍。其他修飾包括對脯胺酸和離胺酸的羥基化、對絲胺醯或蘇胺醯殘基的羥基基團的磷酸化、對離胺酸、精胺酸和組胺酸側鏈的α-胺基基團的甲基化(T.E.Creighton,Proteins：Structure and Molecular Properties[蛋白質：結構和分子特性]，W.H.Freeman & Co.[W.H.弗裡曼公司]，San Francisco[三藩市]，1983，第79-86頁)、對N末端胺的乙醯化和對任何C末端羧基基團的醯胺化。
包括在本發明範圍內的抗體構建體的另一種類型的共價修飾包括改變蛋白質的糖基化模式。如本領域中已知的，糖基化模式可以取決於蛋白 質的序列(例如，下文論述的特定糖基化胺基酸殘基的存在或不存在)或其中產生蛋白質的宿主細胞或生物體。下面論述特定的表現系統。多肽的糖基化典型地是N-連接或O-連接的。N-連接係指碳水化合物部分連接至天冬醯胺殘基的側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸和天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸以外的任何胺基酸)係將碳水化合物部分酶促連接至天冬醯胺側鏈的識別序列。因此，在多肽中該等三肽序列中的任一者的存在產生潛在的糖基化位點。O-連接糖基化係指將糖N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一種連接至羥基胺基酸，最常見的是絲胺酸或蘇胺酸，但是也可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
藉由改變胺基酸序列以使得它含有上述三肽序列中的一者或多者而方便地完成向抗體構建體添加糖基化位點(用於N-連接的糖基化位點)。還可以藉由向起始序列添加一個或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或由一個或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代來作出改變(用於O-連接的糖基化位點)。為了方便起見，抗體構建體的胺基酸序列可以藉由DNA水平的變化來改變，特別是藉由在預選鹼基處突變編碼多肽的DNA，以使得產生將翻譯成所希望胺基酸的密碼子。
增加抗體構建體上的碳水化合物部分的數量的另一種手段係藉由將糖苷化學或酶促偶聯至蛋白質。該等程式的有利之處在於它們不需要在具有用於N-和O-連接的糖基化的糖基化能力的宿主細胞中產生蛋白質。取決於所使用的偶聯方式，一種或多種糖可連接至(a)精胺酸和組胺酸，(b)游離羧基基團，(c)游離巰基基團，諸如半胱胺酸的那些，(d)游離羥基基團，諸如絲胺酸、蘇胺酸或羥基脯胺酸的那些，(e)芳香族殘基，諸如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸的那些，或(f)麩醯胺酸的醯胺基團。該等方法描述於WO 87/05330以及Aplin 和Wriston,1981,CRC Crit.Rev.Biochem.[CRC生物化學關鍵評論]，第259-306頁中。
存在於起始抗體構建體上的碳水化合物部分的去除可以化學或酶促方式完成。化學去糖基化要求將蛋白質暴露於化合物三氟甲磺酸，或等效化合物。該處理導致除連接糖(N-乙醯葡糖胺或N-乙醯半乳糖胺)以外的大多數或所有糖裂解，同時使多肽保持完整。化學去糖基化由Hakimuddin等人，1987,Arch.Biochem.Biophys.[生物化學與生物物理學集刊]259：52以及Edge等人，1981,Anal.Biochem.[分析生物化學]118：131描述。多肽上碳水化合物部分的酶促裂解可以藉由使用多種內切糖苷酶和外切糖苷酶實現，如由Thotakura等人，1987,Meth.Enzymol.[酶學方法]138：350所述的。可以藉由使用化合物衣黴素預防潛在糖基化位點處的糖基化，如由Duskin等人，1982,J.Biol.Chem.[生物化學雜誌]257：3105所述的。衣黴素阻斷蛋白質-N-糖苷鍵的形成。
本文還考慮抗體構建體的其他修飾。例如，抗體構建體的另一種類型的共價修飾包括以在美國專利案號4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所述的方式將抗體構建體與各種非蛋白質聚合物(包括多元醇)連接。此外，如本領域中已知的，可以在抗體構建體內的不同位置進行胺基酸取代，例如以有利於添加聚合物如聚乙二醇(PEG)。
在一些實施方式中，本發明的抗體構建體的共價修飾包括添加一個或多個標記。標記基團可以經由各種長度的間隔臂與抗體構建體偶聯以減少潛在的空間位阻。用於標記蛋白質的各種方法在本領域中是已知的並且可以用於進行本發明。術語「標記」或「標記基團」係指任何可檢測的標記。一般來講，標記屬於多種類別，這取決於將檢測它們的測定-以下實例包括但不限於：
a)同位素標記，該等同位素標記可以是放射性同位素或重同位素，如放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、89Zr、90Y、99Tc、111In、125I、131I)
b)磁性標記(例如，磁性顆粒)
c)氧化還原活性部分
d)光學染料(包括但不限於，生色團、磷光體和螢光團)，如螢光基團(例如，FITC、玫瑰紅、鑭系元素磷光體)、化學發光基團和螢光團，該等螢光團可以是「小分子」螢光劑或蛋白質螢光劑
e)酶促基團(例如，辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)
f)生物素化基團
g)由第二報導基因識別的預定多肽表位(例如，亮胺酸拉鍊對序列、第二抗體的結合位點、金屬結合結構域、表位標籤等)
「螢光標記」意指可以經由其固有的螢光特性檢測到的任何分子。合適的螢光標記包括但不限於螢光素、玫瑰紅、四甲基玫瑰紅、伊紅、赤蘚紅、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀石綠、二苯乙烯、螢光黃、瀑布藍J、德克薩斯紅、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC紅640、Cy5、Cy5.5、LC紅705、俄勒岡綠、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、瀑布藍、瀑布黃和R-藻紅蛋白(PE)(俄勒岡州尤金市的分子探針公司(Molecular Probes,Eugene,OR))、FITC、玫瑰紅和德克薩斯紅(伊利諾州羅克福德的皮爾斯公司(Pierce,Rockford,IL))、Cy5、Cy5.5、Cy7(賓夕法尼亞州匹茲堡市的阿默舍姆生命科學公司(Amersham Life Science,Pittsburgh,PA))。合適的光學染料(包括螢光團)描述於Richard P.Haugland的Molecular Probes Handbook[分子探針手冊]中。
合適的蛋白質螢光標記還包括但不限於，綠色螢光蛋白，包括GFP的Renilla、Ptilosarcus、或Aequorea種類(Chalfie等人，1994,Science[科學]263：802-805)、EGFP(Clontech實驗室公司，Genbank®登錄號U55762)、藍色螢光蛋白(BFP，量子生物技術公司(Quantum Biotechnologies,Inc.)，加拿大魁北克省蒙特利爾市邁松納夫大道西1801號第8層(郵編：H3H 1J9)(1801 de Maisonneuve Blvd.West,8th Floor,Montreal,Quebec,Canada H3H 1J9)；Stauber,1998,Biotechniques[生物技術]24：462-471；Heim等人，1996,Curr.Biol.[現代生物學]6：178-182)、增強的黃色螢光蛋白(EYFP，Clontech實驗室公司)、螢光素酶(Ichiki等人，1993,J.Immunol.[免疫學雜誌]150：5408-5417)、β半乳糖苷酶(Nolan等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美國國家科學院院刊]85：2603-2607)和Renilla(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美國專利案號5,292,658；5,418,155；5,683,888；5,741,668；5,777,079；5,804,387；5,874,304；5,876,995；5,925,558)。
亮胺酸拉鍊結構域係促進在其中發現它們的蛋白質的寡聚化的肽。亮胺酸拉鍊最初在幾種DNA結合蛋白中被鑒定(Landschulz等人，1988,Science[科學]240：1759)，並且自此以後已經在多種不同的蛋白質中發現。已知的亮胺酸拉鍊包括天然存在的肽及其二聚化或三聚化的衍生物。適合用於產生可溶性寡聚蛋白質的亮胺酸拉鍊結構域的實例描述於PCT申請WO 94/10308中，並且從肺表面活性蛋白D(SPD)衍生的亮胺酸拉鍊描述於Hoppe等人，1994,FEBS Letters[歐洲生物化學會聯盟通訊]344：191中。允許與其融合的異源蛋白 質的穩定三聚化的經修飾的亮胺酸拉鍊的使用描述於Fanslow等人，1994,Semin.Immunol.[免疫學研討文輯]6：267-78中。
本發明的抗體構建體還可以包含另外的結構域，該等結構域例如有助於分離分子或係關於分子的適應性藥物動力學曲線。有助於分離抗體構建體的結構域可以選自肽模體或輔助性地引入的部分，該等部分可以在分離方法(例如分離柱)中捕獲。此類另外的結構域的非限制性實施方式包括稱為Myc-標籤、HAT-標籤、HA-標籤、TAP-標籤、GST-標籤、幾丁質結合結構域(CBD-標籤)、麥芽糖結合蛋白(MBP-標籤)、Flag-標籤、Strep-標籤以及其變體(例如StrepII-標籤)和His標籤的肽模體。本文揭露的所有抗體構建體(以鑒定的CDR為特徵)可以包含His-標籤結構域，該His-標籤結構域通常被稱為分子的胺基酸序列中的連續His殘基的重複序列，例如五個His殘基的重複序列(SEQ ID NO：269)或六個His殘基的重複序列(六組胺酸，SEQ ID NO：169)。His-標籤可以位於例如抗體構建體的N末端或C末端。在一個實施方式中，六組胺酸標籤(HHHHHH)經由肽鍵連接至根據本發明的抗體構建體的C末端。
還設想本發明的抗體構建體包含如下多肽或由其組成，該多肽具有選自由SEQ ID NO：130和142中所描述的那些胺基酸序列組成的組的胺基酸序列並且在其N末端或其C末端與蛋白質純化標籤連接(較佳的是經由肽鍵(醯胺鍵))。蛋白質純化標籤在多肽的C末端的連接係較佳的。設想蛋白質純化標籤係短肽。例如，短肽的長度可以是2個-30個胺基酸、4個-25個胺基酸、5個-20個胺基酸或6個-19個胺基酸。蛋白質純化標籤的實例包括但不限於AU1表位(例如，如SEQ ID NO：272中所描述)、AU5表位(例如，如SEQ ID NO：273中所描述)、T7-標籤(例如，如SEQ ID NO：274中所描述)、V5-標籤(例如，如SEQ ID NO：275中所描述)、B-標籤(例如，如SEQ ID NO：276中所描 述)、E2表位(例如，如SEQ ID NO：277中所描述)、FLAG表位/FLAG標籤(例如，如SEQ ID NO：278中所描述)、Glu-Glu標籤(例如，如SEQ ID NO：279或280中所描述)、HA標籤、組胺酸親和力標籤(例如，如SEQ ID NO：281中所描述)、HSV表位(例如，如SEQ ID NO：282中所描述)、KT3表位(例如，如SEQ ID NO：283中所描述)、Myc表位(例如，如SEQ ID NO：284中所描述)、聚精胺酸標籤(5個-6個Arg殘基)、聚天冬胺酸標籤(5個-16個Asp殘基)、聚組胺酸標籤(2個-10個His殘基，通常6個His殘基，參見例如，SEQ ID NO：169和269-271)、聚苯丙胺酸標籤(通常11個Phe殘基)、S1標籤(例如，如SEQ ID NO：285中所描述)、S-標籤(例如，如SEQ ID NO：286中所描述)、Strep-標籤(例如，如SEQ ID NO：287或288中所描述)、通用標籤(例如，如SEQ ID NO：289中所描述)、VSV-G(例如，如SEQ ID NO：290中所描述)、蛋白質C(例如，如SEQ ID NO：291中所描述)和蛋白質A。組胺酸標籤係較佳的，尤其是6x His標籤(SEQ ID NO：169)。因此，進一步設想本發明的抗體構建體由如下多肽組成：該多肽具有選自由SEQ ID NO：130和142中所描述的那些胺基酸序列組成的組的胺基酸序列並且在其C末端經由肽鍵與6x His標籤連接。本發明的抗體構建體的實施方式具有如SEQ ID NO：131或SEQ ID NO：143中所描述的胺基酸序列。
T細胞或T淋巴細胞係在細胞介導的免疫中發揮核心作用的一類淋巴細胞(其本身是一類白血球)。有若干個T細胞亞組，每個亞組具有不同的功能。T細胞可以藉由細胞表面上存在T細胞受體(TCR)而與其他淋巴細胞(諸如B細胞和NK細胞)區分開。TCR負責識別與主要組織相容性複合體(MHC)分子結合的抗原，並且由兩種不同的蛋白質鏈構成。在95%的T細胞中，TCR由阿爾法(α)和貝塔(β)鏈組成。當TCR與抗原肽和MHC(肽/MHC複合物)接 合時，T淋巴細胞藉由一系列由相關酶、共受體、專門化銜接子分子和激活或釋放的轉錄因子介導的生物化學事件而被激活。
本發明的抗體構建體包含與T細胞表面上的CD3結合的結構域。「CD3」(分化簇3)係由四條鏈構成的T細胞共受體。在哺乳動物中，CD3蛋白質複合物含有CD3γ(伽馬)鏈、CD3δ(德爾塔)鏈和兩條CD3ε(伊蒲賽龍)鏈。這四條鏈與T細胞受體(TCR)和所謂的ζ(截塔)鏈締合以形成「T細胞受體複合物」並在T淋巴細胞中產生激活訊號。CD3γ(伽馬)、CD3δ(德爾塔)和CD3ε(伊蒲賽龍)鏈係免疫球蛋白超家族的高度相關的細胞表面蛋白，並且每一種都含有單一細胞外免疫球蛋白結構域。CD3分子的細胞內尾含有對於TCR的訊號傳導能力所必需的單一保守模體，稱為基於免疫受體酪胺酸的激活模體(ITAM)。CD3ε分子係一種多肽，該多肽在人中由位於染色體11上的CD3E基因編碼。
藉由與T細胞上的CD3和與靶細胞上的靶蛋白結合的抗體構建體募集T細胞來將靶細胞重定向裂解通常涉及溶細胞突觸形成以及穿孔素和顆粒酶的遞送。接合的T細胞能夠進行連續靶細胞溶解，並且不受干擾肽抗原加工和呈遞或選殖T細胞分化的免疫逃逸機制的影響；參見例如WO 2007/042261。
由CLDN18.2xCD3抗體構建體介導的細胞毒性可以以各種方式測量。參見實例7。「半數最大有效濃度」(EC50)通常用作生物活性分子(如本發明的抗體構建體)的效力的量度。它可以按莫耳單位表示。在測量細胞毒性的當前情況下，EC50值係指在基線和最大值之間的中途誘導細胞毒性反應(靶細胞裂解)的抗體構建體的濃度。細胞毒性測定中的效應細胞可以例如是刺激的富集的(人)CD8陽性T細胞或未刺激的(人)外周血單核細胞(PBMC)。與未刺激的PBMC相比，當將刺激的/富集的CD8+ T細胞用作效應細胞時，通常預 期EC50值較低。如果靶細胞係獼猴起源或表現的或用獼猴CLDN18.2轉染的，則效應細胞也應係獼猴起源的，如獼猴T細胞系，例如4119LnPx。靶細胞應在細胞表面上表現CLDN18.2，如人或獼猴CLDN18.2。較佳的是，靶細胞應在細胞表面上至少表現CLDN18.2的一個或多個細胞外環，如CLDN18.2環1和/或環2。靶細胞可以是用CLDN18.2(例如人或獼猴CLDN18.2)穩定或暫態轉染的細胞系(如CHO)。可替代地，靶細胞可以是CLDN18.2陽性天然表現細胞系，如人胃癌細胞系SNU-601或SNU-620，或者也可以是SNU-16、NUGC、NUG-C4、GSU或IM95。通常，與具有較低靶標表現率的靶細胞相比，當使用在細胞表面上表現較高的CLDN18.2水平的靶細胞時，預期EC50值較低。
在細胞毒性測定中效應細胞與靶細胞(E：T)比率通常為約10：1，但也可以改變。可以在51-鉻釋放測定中(例如，孵育時間為約18小時)或在基於FACS的細胞毒性測定中(例如，孵育時間為約48小時)測量CLDN18.2xCD3抗體構建體的細胞毒性活性。還設想了孵育時間(細胞毒性反應)的修飾。其他測量細胞毒性的方法係熟知的，並且包括MTT或MTS測定、基於ATP的測定(包括生物發光測定)、磺基玫瑰紅B(SRB)測定、WST測定、選殖生成測定和ECIS技術。
根據一個實施方式，在基於細胞的細胞毒性測定中測量由本發明的CLDN18.2xCD3抗體構建體介導的細胞毒性活性。它也可以在51-鉻釋放測定中進行測量。設想本發明的抗體構建體的EC50值為
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可以在不同的測定中和在不同條件下測量上述給定的EC50值。例如，當將人PBMC用作效應細胞並且將CLDN18.2轉染細胞如CHO細胞用作靶細胞時，設想CLDN18.2xCD3抗體構建體的EC50值為
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10pM或
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5pM。當將人PBMC用作效應細胞時，並且當靶細胞係CLDN18.2陽性細胞系如SNU-601或SNU-620時，可以設想CLDN18.2xCD3抗體構建體的EC50值為
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Figure 108127615-A0305-02-0062-768
70pM、
Figure 108127615-A0305-02-0062-776
60pM、
Figure 108127615-A0305-02-0062-775
50pM、
Figure 108127615-A0305-02-0062-774
40pM、
Figure 108127615-A0305-02-0062-773
30pM、
Figure 108127615-A0305-02-0062-772
20pM、
Figure 108127615-A0305-02-0062-771
15pM、
Figure 108127615-A0305-02-0062-770
10pM或
Figure 108127615-A0305-02-0062-769
5pM。
根據一個實施方式，本發明的CLDN18.2xCD3抗體構建體不誘導/介導不在其表面上表現CLDN18.2的細胞(CLDN18.2陰性細胞)如CHO細胞的裂解或基本上不誘導/介導裂解。術語「不誘導溶解」、「基本上不誘導溶解」、「不介導溶解」或「基本不介導溶解」意指本發明的抗體構建體不誘導或介導超過30%、較佳的是不超過20%、更較佳的是不超過10%、特別較佳的是不超過9%、8%、7%、6%或5%的CLDN18.2陰性細胞的溶解，由此表現CLDN18.2的靶細胞(如用CLDN18.2轉化或轉染的細胞或天然表現細胞系如人胃癌細胞系SNU-601或SNU-620)的裂解被設定為100%。這通常適用於濃度高達500nM的抗體構建體。細胞裂解測量係常規技術。此外，本說明書教導了如何測量細胞溶解的具體說明。
單個的CLDN18.2xCD3抗體構建體的單體與二聚體同種型之間的細胞毒性活性的差異被稱為「效力差距」。該效力差距可以例如計算為分子的單體與二聚體形式的EC50值之間的比率。在確定該差距的一種方法中，如下文所述(實例7.1和7.2)用純化的抗體構建體單體和二聚體進行了18小時51-鉻釋放測定或48h基於FACS的細胞毒性測定。效應細胞係刺激的富集的人CD8+ T細胞或未刺激的人PBMC。靶細胞係hu CLDN18.2轉染的CHO細胞。效應細胞與靶細胞(E：T)的比率為10：1。本發明的CLDN18.2xCD3抗體構建體的效力差距較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0063-777
5、更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0063-778
4、甚至更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0063-779
3、甚至更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0063-780
2，並且最較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0063-781
1。
本發明的抗體構建體的第一結構域和/或第二結構域較佳的是對於靈長類哺乳動物目的成員(如獼猴)具有跨物種特異性。跨物種特異性CD3結合結構域例如描述於WO 2008/119567中。根據一個實施方式，除了與人CD3結合之外，第二結構域還將與靈長類動物的CD3結合，該靈長類動物包括(但不限於)新大陸靈長類動物(如普通狨(Callithrix jacchus)、絨頂檉柳猴(Saguinus Oedipus)或松鼠猴(Saimiri sciureus))、舊大陸靈長類動物(如狒狒和獼猴)、長臂猿、猩猩和非人類人亞科(homininae)。設想與在T細胞表面上的人CD3結合的第二結構域還至少與獼猴CD3結合。較佳的獼猴係食蟹猴(Macaca fascicularis)。還設想了獼猴(Macaca mulatta)(恒河猴)。本發明的一種抗體構建體包含與在靶細胞表面上的人CLDN18.2結合的第一結構域和與在T細胞表面上的人CD3和至少獼猴CD3結合的第二結構域。
在一個實施方式中，根據本發明的抗體構建體對於結合獼猴CD3與人CD3的親和力差距[KD ma CD3：KD hu CD3](如藉由例如BiaCore或Scatchard分析確定的)為在0.01與100之間、較佳的是在0.1與10之間、更較佳的 是在0.2與5之間、更較佳的是在0.3與4之間、甚至更較佳的是在0.5與3之間或在0.5與2.5之間，並且最較佳的是在0.5與1之間。參見實例3。
本發明的抗體構建體的第二結構域與CD3結合。更較佳的是，它與T細胞表面上的CD3結合。此外，設想第二結構域與人CD3結合，較佳的是與T細胞表面上的人CD3結合。還設想第二結構域與CD3ε結合。更較佳的是，它與人CD3ε結合，例如與T細胞表面上的人CD3ε結合。人CD3ε的細胞外結構域的較佳的胺基酸序列描述於SEQ ID NO：256中。
在本發明的一個實施方式中，抗體構建體的第二結構域與人CD3ε(或T細胞表面上的人CD3ε)和與普通狨(Callithrix jacchus)或松鼠猴(Saimiri sciureus)CD3ε結合。還設想第二結構域與CD3ε的細胞外表位結合，較佳的是與人CD3ε的細胞外表位結合。還設想第二結構域與人和獼猴屬(Macaca)CD3ε鏈的細胞外表位結合。CD3ε的一個較佳的表位包含在人CD3ε細胞外結構域的胺基酸殘基1-27內(參見SEQ ID NO：257)。甚至更具體地，表位至少包含胺基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu。普通狨係屬於狨猴科(Callitrichidae)的新大陸靈長類動物，而松鼠猴係屬於懸猴科(Cebidae)的新大陸靈長類動物。具有此類特徵的結合物在WO 2008/119567中有詳細描述。
針對(人)CD3或特異性針對CD3ε的抗體或雙特異性抗體構建體在本領域中是已知的，並且它們的CDR、VH和VL序列可以作為本發明的抗體構建體的第二結合結構域的基礎。例如，Kung等人在1979年報導了OKT3(Ortho Kung T3)的開發，這係識別人T細胞上的CD3(特別是CD3的ε鏈)的第一個mAb。OKT3(muromonab)係可用於人類治療的第一種鼠類起源的單株抗體。較新的抗CD3單株抗體包括奧昔珠單抗(otelixizumab)(TRX4)、替利珠單抗(teplizumab)(MGA031)、弗羅魯單抗(foralumab)和維西珠單抗(visilizumab)， 它們全部都靶向CD3的ε鏈。針對(癌症)靶標和CD3的雙特異性抗體構建體也正在進行開發和(預)臨床測試，並且它們的CD3結合結構域(CDR、VH、VL)可以用作本發明的抗體構建體的第二結合結構域的基礎。實例包括但不限於博納吐單抗(Blinatumomab)、索利托單抗(Solitomab)(MT110、AMG 110)、卡妥索單抗(Catumaxomab)、Duvortuxizumab、厄妥索單抗(Ertumaxomab)、Mosunetuzumab、FBTA05(Bi20、TPBs05)、CEA-TCB(RG7802、RO6958688)、AFM11、和MGD006(S80880)。例如在US 7,994,289 B2、US 7,728,114 B2、US 7,381,803 B1、US 6,706,265 B1中揭露了CD3結合結構域的其他實例。
對於本發明的抗體構建體，設想與T細胞表面上的CD3結合的第二結構域包含VL區，該VL區包含選自以下的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3：(a)如SEQ ID NO：37中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：38中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：39中所描述的CDR-L3；(b)如SEQ ID NO：82中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：83中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：84中所描述的CDR-L3；以及(c)如SEQ ID NO：100中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：101中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：102中所描述的CDR-L3。
對於本發明的抗體構建體，還設想與T細胞表面上的CD3結合的第二結構域包含VH區，該VH區包含選自以下的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3：(a)如SEQ ID NO：31中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：32中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：33中所描述的CDR-H3；(b)如SEQ ID NO：40中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：41中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：42中所描述的CDR-H3； (c)如SEQ ID NO：49中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：50中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：51中所描述的CDR-H3；(d)如SEQ ID NO：58中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：59中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：60中所描述的CDR-H3；(e)如SEQ ID NO：67中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：68中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：69中所描述的CDR-H3；(f)如SEQ ID NO：76中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：77中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：78中所描述的CDR-H3；(g)如SEQ ID NO：85中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：86中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：87中所描述的CDR-H3；(h)如SEQ ID NO：94中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：95中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：96中所描述的CDR-H3；(i)如SEQ ID NO：103中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：104中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：105中所描述的CDR-H3；以及(j)如SEQ ID NO：112中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：113中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：114中所描述的CDR-H3。
此外，對於本發明的抗體構建體，設想與CD3結合的第二結構域包含含有選自以下的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL區，以及含有選自以下的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH區：(a)如SEQ ID NO：28中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：29中所描述的CDR-L2、如SEQ ID NO：30中所描述的CDR-L3、如SEQ ID NO：31中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：32中所描述的CDR-H2、和如SEQ ID NO：33中所描述的CDR-H3； (b)如SEQ ID NO：37中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：38中所描述的CDR-L2、如SEQ ID NO：39中所描述的CDR-L3、如SEQ ID NO：40中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：41中所描述的CDR-H2、和如SEQ ID NO：42中所描述的CDR-H3；(c)如SEQ ID NO：46中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：47中所描述的CDR-L2、如SEQ ID NO：48中所描述的CDR-L3、如SEQ ID NO：49中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：50中所描述的CDR-H2、和如SEQ ID NO：51中所描述的CDR-H3；(d)如SEQ ID NO：55中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：56中所描述的CDR-L2、如SEQ ID NO：57中所描述的CDR-L3、如SEQ ID NO：58中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：59中所描述的CDR-H2、和如SEQ ID NO：60中所描述的CDR-H3；(e)如SEQ ID NO：64中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：65中所描述的CDR-L2、如SEQ ID NO：66中所描述的CDR-L3、如SEQ ID NO：67中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：68中所描述的CDR-H2、和如SEQ ID NO：69中所描述的CDR-H3；(f)如SEQ ID NO：73中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：74中所描述的CDR-L2、如SEQ ID NO：75中所描述的CDR-L3、如SEQ ID NO：76中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：77中所描述的CDR-H2、和如SEQ ID NO：78中所描述的CDR-H3；(g)如SEQ ID NO：82中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：83中所描述的CDR-L2、如SEQ ID NO：84中所描述的CDR-L3、如SEQ ID NO：85中所描述的 CDR-H1、如SEQ ID NO：86中所描述的CDR-H2、和如SEQ ID NO：87中所描述的CDR-H3；(h)如SEQ ID NO：91中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：92中所描述的CDR-L2、如SEQ ID NO：93中所描述的CDR-L3、如SEQ ID NO：94中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：95中所描述的CDR-H2、和如SEQ ID NO：96中所描述的CDR-H3；(i)如SEQ ID NO：100中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：101中所描述的CDR-L2、如SEQ ID NO：102中所描述的CDR-L3、如SEQ ID NO：103中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：104中所描述的CDR-H2、和如SEQ ID NO：105中所描述的CDR-H3；以及(j)如SEQ ID NO：109中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：110中所描述的CDR-L2、如SEQ ID NO：111中所描述的CDR-L3、如SEQ ID NO：112中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：113中所描述的CDR-H2、和如SEQ ID NO：114中所描述的CDR-H3。
對於本發明的抗體構建體，設想與T細胞表面上的CD3結合的第二結構域包含選自以下群組的VL區，該群組由以下組成：如SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：233、SEQ ID NO：234和SEQ ID NO：235中的任一者中所描述的VL區。
還設想與T細胞表面上的CD3結合的第二結構域包含選自以下群組的VH區，該群組由以下組成：如SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：236、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：240、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：244和SEQ ID NO：245中的任一者中所描述的VH區。
更較佳的是，本發明的抗體構建體的特徵在於與T細胞表面上的CD3結合的包含選自以下群組的VL區和VH區的第二結構域，該群組由以下組成：(a)如SEQ ID NO：35或233中所描述的VL區和如SEQ ID NO：34或236中所描述的VH區；(b)如SEQ ID NO：44或233中所描述的VL區和如SEQ ID NO：43或237中所描述的VH區；(c)如SEQ ID NO：53或233中所描述的VL區和如SEQ ID NO：52或238中所描述的VH區；(d)如SEQ ID NO：62或233中所描述的VL區和如SEQ ID NO：61或239中所描述的VH區；(e)如SEQ ID NO：71或234中所描述的VL區和如SEQ ID NO：70或240中所描述的VH區；(f)如SEQ ID NO：80或233中所描述的VL區和如SEQ ID NO：79或241中所描述的VH區；(g)如SEQ ID NO：89或234中所描述的VL區和如SEQ ID NO：88或242中所描述的VH區；(h)如SEQ ID NO：98或233中所描述的VL區和如SEQ ID NO：97或243中所描述的VH區；(i)如SEQ ID NO：107或235中所描述的VL區和如SEQ ID NO：106或244中所描述的VH區； (j)如SEQ ID NO：116或235中所描述的VL區和如SEQ ID NO：115或245中所描述的VH區；以及(k)如SEQ ID NO：119中所描述的VL區和如SEQ ID NO：118中所描述的VH區。
上面描述的本發明的抗體構建體的較佳的實施方式的特徵在於與T細胞表面上的CD3結合的第二結構域，該第二結構域包含選自以下群組的胺基酸序列，該群組由以下組成：SEQ ID NO：36、45、54、63、72、81、90、99、108、117、120、246、247、248、249、250、251、252、253、254和255。
還考慮了本文所述的抗體構建體的胺基酸序列修飾。例如，可能需要改善抗體構建體的結合親和力和/或其他生物特性。藉由肽合成或藉由將合適的核苷酸變化引入編碼抗體構建體的核酸分子中來製備抗體構建體的胺基酸序列變體。所有下面描述的胺基酸序列修飾應產生保留了未經修飾的親本分子的期望的生物活性(如結合CLDN18.2和CD3，誘導針對CLDN18.2陽性靶細胞的細胞毒性)的抗體構建體。
術語「胺基酸」或「胺基酸殘基」典型地是指具有其本領域公認的定義的胺基酸，諸如選自以下群組的胺基酸，該群組由以下組成：丙胺酸(Ala或A)；精胺酸(Arg或R)；天冬醯胺(Asn或N)；天冬胺酸(Asp或D)；半胱胺酸(Cys或C)；麩醯胺酸(Gln或Q)；麩胺酸(Glu或E)；甘胺酸(Gly或G)；組胺酸(His或H)；異亮胺酸(Ile或I)；亮胺酸(Leu或L)；離胺酸(Lys或K)；甲硫胺酸(Met或M)；苯丙胺酸(Phe或F)；脯胺酸(Pro或P)；絲胺酸(Ser或S)；蘇胺酸(Thr或T)；色胺酸(Trp或W)；酪胺酸(Tyr或Y)；以及纈胺酸(Val或V)，但可以根據需要使用修飾的、合成的或稀有的胺基酸。基本上存在由不同的側鏈決定的四種不同類別的胺基酸：
(1)非極性和中性(不帶電荷)：Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Val
(2)極性和中性(不帶電荷)：Asn、Cys(僅略微極性)、Gln、Ser、Thr、Trp(僅略微極性)、Tyr
(3)酸性和極性(帶負電荷)：Asp和Glu
(4)鹼性和極性(帶正電荷)：Arg、His、Lys
疏水性胺基酸可以根據它們是否具有脂肪族或芳香族側鏈來分開。Phe和Trp(非常大的疏水性)、Tyr和His(較小疏水性)被分類為芳香族胺基酸。嚴格地說，脂肪族意味著側鏈僅含有氫和碳原子。藉由這種嚴格的定義，具有脂肪族側鏈的胺基酸係丙胺酸、異亮胺酸、亮胺酸(也是正亮胺酸)、脯胺酸和纈胺酸。丙胺酸的側鏈非常短，意味著它不是特別具有疏水性，並且脯胺酸具有不尋常的幾何形狀，使其在蛋白質中起特殊作用。通常方便地將甲硫胺酸考慮為與異亮胺酸、亮胺酸和纈胺酸在同一類別，儘管它還含有硫原子。統一的主題係該等胺基酸主要含有非反應性和柔性側鏈。通常將胺基酸丙胺酸、半胱胺酸、甘胺酸、脯胺酸、絲胺酸和蘇胺酸分組在一起，原因係它們的大小全部都很小。Gly和Pro可能影響鏈取向。
胺基酸修飾包括，例如，抗體構建體的胺基酸序列內殘基的缺失、殘基的插入和/或殘基的取代。進行缺失、插入和/或取代的任何組合以獲得最終的抗體構建體，條件係最終的構建體擁有所期望的特徵，例如，未經修飾的親本分子的生物活性(如結合CLDN18.2和CD3，誘導針對CLDN18.2陽性靶細胞的細胞毒性)。胺基酸變化還可以改變抗體構建體的翻譯後過程，諸如改變糖基化位點的數目或位置。
例如，可以在每個CDR中插入、缺失和/或取代1個、2個、3個、4個、5個或6個胺基酸(當然，取決於它們各自的長度)，而可以在每個FR中插 入、缺失和/或取代1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或25個胺基酸。胺基酸序列插入還包括N末端和/或C末端胺基酸添加，其長度範圍為例如從1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個殘基至含有超過10個例如一百個或更多個殘基的多肽，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。本發明的抗體構建體的插入變體包括將增加或延長抗體構建體的血清半衰期的多肽融合至抗體構建體的N末端或C末端。還可以想到，這樣的插入發生在抗體構建體內，例如在第一結構域與第二結構域之間。
對於胺基酸修飾(特別是對於胺基酸取代)最感興趣的位點包括高變區，特別是重鏈和/或輕鏈的各個CDR，但是也考慮重鏈和/或輕鏈中的FR變化。取代可以是如本文所述的保守取代。較佳的是，可以在CDR中取代1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸，而可以在框架區(FR)中取代1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或25個胺基酸，這分別取決於CDR或FR的長度。例如，如果CDR序列包含6個胺基酸，則設想該等胺基酸中的1個、2個或3個被取代。類似地，如果CDR序列包含15個胺基酸，則設想該等胺基酸中的1個、2個、3個、4個、5個或6個被取代。
用於鑒定作為較佳的誘變位置的抗體構建體內的某些殘基或區域的有用方法被稱為「丙胺酸掃描誘變」，並且描述於例如Cunningham B.C.和Wells J.A.(Science[科學].1989年6月2日；244(4908)：1081-5)中。此處，鑒定抗體構建體內的殘基或殘基組(例如帶電殘基，如Arg、His、Lys、Asp和Glu)，並其將其用中性或非極性胺基酸(最較佳的是丙胺酸或聚丙胺酸)替代，以影響各個胺基酸與靶蛋白表位的相互作用。丙胺酸掃描係用於確定特定殘基對給 定蛋白質的穩定性或功能的貢獻的技術。丙胺酸的使用係因為其具有非巨大的、化學惰性的甲基官能基，但仍然模仿許多其他胺基酸所具有的二級結構偏好。在需要突變殘基大小保守的情況下，有時可以使用巨大的胺基酸(如纈胺酸或亮胺酸)。該技術還可以用於確定特定殘基的側鏈是否在生物活性中起重要作用。丙胺酸掃描通常藉由定點誘變或隨機藉由創建PCR文庫來完成。此外，已經開發了基於理論丙胺酸取代來估計熱力學參數的計算方法。數據可以藉由IR、NMR波譜法、數學方法、生物測定等進行測試。
然後，藉由在取代位點處或為取代位點引入另外的或其他變體來精確對取代展示功能敏感性的那些胺基酸位置(如例如藉由丙胺酸掃描確定的)。因此，雖然用於引入胺基酸序列變化的位點或區域係預定的，但突變本身的性質無需預定。例如，為了分析或優化給定位點處突變的性能，可以在靶密碼子或區處進行丙胺酸掃描或隨機誘變，並且篩選所表現的抗體構建體變體以獲得所希望活性的最優組合。用於在具有已知序列的DNA中的預定位點進行取代突變的技術係熟知的，例如，M13引物誘變和PCR誘變。例如使用抗原(例如CLDN18.2或CD3)結合活性和/或細胞毒性活性的測定來進行突變體篩選。
一般來講，如果在重鏈和/或輕鏈的一個或多個或所有CDR中胺基酸被取代，則設想當時獲得的「經取代的」序列與「原始」或「親本」CDR序列係至少60%或65%、更較佳的是70%或75%、甚至更較佳的是80%或85%並且特別較佳的是90%或95%相同的/同源的。這意味著原始序列與經取代的序列之間的同一性/同源性程度取決於CDR的長度。例如，總共具有5個胺基酸並且包含一個胺基酸取代的CDR與「原始」或「親本」CDR序列係80%相同的，而總共具有10個胺基酸並且包含一個胺基酸取代的CDR與「原始」或「親本」CDR序列係90%相同的。因此，本發明的抗體構建體的經取代的CDR可以與其原始序列 具有不同的同一性程度，例如，CDRL1可以具有80%的同源性，而CDRL3可以具有90%的同源性。相同的考慮適用於框架區和整個VH和VL區。
「變體CDR」係與本發明的親本CDR具有特定序列同源性、相似性或同一性的CDR，並且與親本CDR共用生物學功能，包括但不限於至少60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的親本CDR的特異性和/或活性。一般來講，各個變體CDR之間的胺基酸同源性、相似性或同一性為本文所描述的親本序列的至少60%，並且更典型地具有至少65%或70%、較佳的是至少75%或80%、更較佳的是至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、並且最較佳的是95%、96%、97%、98%、99%、和幾乎100%的漸增的同源性、相似性或同一性。這同樣適用於「變體VH」和「變體VL」。根據一個實施方式，「變體VH」和/或「變體VL」內的序列變化不延伸至CDR。因此，本發明涉及如本文所定義的抗體構建體，該抗體構建體包含與本文所定義的特定序列(「親本」VH和VL)具有某些序列同源性(參見上文)的VH和VL序列，其中該等CDR序列與本文所定義的特定CDR序列(「親本」CDR)係100%相同的。
較佳的取代(或替代)係保守取代。然而，設想了任何取代(包括非保守取代或來自下表1中列出的「示例性取代」中的一個或多個)，只要抗體構建體保留其經由第一結構域與CLDN18.2結合並且經由第二結構域與CD3或CD3ε結合的能力，和/或只要其CDR、FR、VH和/或VL序列與原始或親本序列具有至少60%或65%、更較佳的是至少70%或75%、甚至更較佳的是至少80%或85%、並且特別較佳的是至少90%或95%的同一性程度即可。
保守替代(也稱為保守突變或保守取代)係將給定胺基酸改變為具有相似的生物化學特性(例如電荷、疏水性、大小)的不同胺基酸的胺基酸取代。與非保守替代相比，蛋白質中的保守替代通常對蛋白質功能具有較小的影響。在表1中顯示了保守取代。示例性保守取代顯示為「示例性取代」。如果此類取代導致生物活性的變化，那麼可以引入如本文中參考胺基酸類別進一步描述的更多實質性變化，並篩選產物的期望特徵。
Figure 108127615-A0305-02-0075-1
本發明的抗體構建體的生物特性的實質性修飾係藉由選擇在保持以下的效應方面顯著不同的取代來完成：(a)取代區域中的多肽骨架的結構，例如呈片層或螺旋構象，(b)分子在靶位點的電荷或疏水性，或(c)側鏈的大部分。非保守取代通常需要將上面所定義的胺基酸類別之一(如極性、中性、酸性、鹼性、脂肪族、芳香族、小......)的成員交換為另一種類別。任何不參與維 持抗體構建體的適當構象的半胱胺酸殘基通常可以被絲胺酸取代以改善抗體構建體的氧化穩定性。
胺基酸序列的序列同一性、同源性和/或相似性藉由使用在本領域中已知的標準技術，較佳的是使用預設設置或藉由檢驗來確定，該等標準技術包括但不限於Smith和Waterman(1981,Adv.Appl.Math.[應用數學進展]2：482)的局部序列同一性演算法，Needleman和Wunsch(J Mol Biol.[分子生物學雜誌]1970年3月；48(3)：443-53)的序列同一性比對演算法，Pearson和Lipman(Proc Natl Acad Sci USA.[美國國家科學院院刊]1988年4月；85(8)：2444-8)的相似性搜索方法，該等演算法的電腦化實現(威斯康辛遺傳學套裝軟體(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，威斯康辛州麥迪森市科學大道575號遺傳學電腦組(Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wis.))，由Devereux等人(Nucleic Acids Res.[核酸研究]1984年1月11日；12(1Pt1)：387-95)描述的最佳擬合序列程式。設想了百分比同一性藉由FastDB基於以下參數來計算：錯配罰分為1；空位罰分為1；空位大小罰分為0.33；以及連接罰分為30。還參見「Current Methods in Sequence Comparison and Analysis[序列比較和分析的當前方法]」，Macromolecule Sequencing and Synthesis[大分子測序與合成]，Selected Methods and Applications[所選擇的方法與應用]，第127-149頁(1988),Alan R.Liss公司。
有用的演算法的實例係PILEUP。PILEUP使用漸進式成對比對從一組相關序列中創建多序列比對。它還可以繪製顯示用於創建比對的聚類關係的樹狀圖。PILEUP使用Feng和Doolittle(J Mol Evol.[分子進化雜誌]1987；25(4)：351-60)的漸進式比對方法的簡單化；該方法類似於由Higgins和Sharp(Comput Appl Biosci.[電腦在生物科學中的應用]1989年4月；5(2)：151-3)所描 述的方法。有用的PILEUP參數包括預設空位權重為3.00、預設空位長度權重為0.10、和加權末端空位。
有用演算法的另一個實例係BLAST演算法，描述於以下中：Altschul等人(J Mol Biol.[分子生物學雜誌]1990年10月5日；215(3)：403-10。)；Altschul等人(Nucleic Acids Res.[核酸研究]1997年9月1日；25(17)：3389-402)；以及Karlin和Altschul(Proc Natl Acad Sci U S A.[美國國家科學院院刊]1993年6月15日；90(12)：5873-7)。特別有用的BLAST程式係從Altschul等人(Methods Enzymol.[酶學方法]1996；266：460-80)獲得的WU-Blast-2程式。WU-Blast-2使用多個搜索參數，其中大部分都設定為預設值。可調節的參數設定為以下值：重疊跨度=1，重疊分數=0.125，單詞閾值(T)=II。HSP S和HSP S2參數係動態值，並且由程式本身根據特定序列的組成和特定數據庫的組成來確立，根據該特定數據庫來搜索感興趣的序列；然而，可以調整該等值以提高靈敏度。
另外的有用演算法係空位BLAST，如由Altschul等人(Nucleic Acids Res.[核酸研究]1997年9月1日；25(17)：3389-402)報導的。空位BLAST使用BLOSUM-62取代評分；閾值T參數設定為9；觸發非空位擴展的按兩下方法，對k的空位長度收取10+k的成本；Xu設定為16，並且Xg設定為40(用於數據庫搜索階段)以及67(用於演算法的輸出階段)。空位比對由對應於約22比特的評分觸發。
與此一致，關於編碼本文鑒定的抗體構建體的核酸序列的術語「核酸序列同一性/同源性/相似性的百分比(%)」被定義為候選序列中與抗體構建體的編碼序列中的核苷酸殘基相同的核苷酸殘基的百分比。比對兩個序列並從而確定它們的同源性的一種方法使用WU-Blast2(設定為預設參數)的BLASTN模組，其中重疊跨度和重疊分數分別設定為1和0.125。一般來講，編 碼各個變體CDR的核苷酸序列與本文所描述的核苷酸序列之間的核酸序列同源性、相似性或同一性係至少60%，並且更典型地具有至少65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%和幾乎100%的漸增的同源性、相似性或同一性。再次，這同樣適用於編碼「變體VH」和/或「變體VL」的核酸序列。
在一個實施方式中，與根據本發明的抗體構建體的人種系或該等抗體構建體的第一和第二結構域(結合結構域)的人種系的同一性百分比係
Figure 108127615-A0305-02-0078-782
70%或
Figure 108127615-A0305-02-0078-783
75%、更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0078-784
80%或
Figure 108127615-A0305-02-0078-785
85%、甚至更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0078-786
90%、並且最較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0078-787
91%、
Figure 108127615-A0305-02-0078-788
92%、
Figure 108127615-A0305-02-0078-789
93%、
Figure 108127615-A0305-02-0078-790
94%、
Figure 108127615-A0305-02-0078-791
95%或甚至
Figure 108127615-A0305-02-0078-792
96%。與人抗體種系基因產物的同一性被認為係降低治療期間治療性蛋白引發患者中針對藥物的免疫應答的風險的重要特徵。Hwang W.Y.和Foote J.(Methods.[方法]2005年5月；36(1)：3-10)證明了藥物抗體構建體的非人部分的減少導致治療期間患者中誘導抗藥物抗體的風險降低。藉由比較無數臨床評價的抗體藥物和對應的免疫原性數據，顯示以下趨勢：抗體/抗體構建體的可變區的人源化使得蛋白質免疫原性(平均5.1%的患者)比攜帶未改變的非人可變區的抗體/抗體構建體(平均23.59%的患者)更低。因此，基於可變區和呈抗體構建體的形式的蛋白質治療劑需要與人序列具有較高程度的同一性。出於確定種系同一性的目的，可以使用Vector NTI軟體將VL的V區與人種系V區段和J區段(http：//www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/)的胺基酸序列進行比對並且藉由將相同的胺基酸殘基除以VL的胺基酸殘基總數計算胺基酸序列(以百分比計)。對於VH區段(http：//www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/)同樣可以進行，只是由於VH CDR3的高度多樣性和缺少現有人種系VH CDR3比對配偶體，可以將VH CDR3排除。然後可以使用重組技術來增加與人抗體種系基因的序列同一性。
在另外的實施方式中，本發明的抗體構建體在標準研究規模條件下，例如在標準的兩步純化過程中表現出高的單體產率。設想根據本發明的抗體構建體的單體產率為
Figure 108127615-A0305-02-0079-793
0.25mg/L上清液(SN)、較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0079-794
0.5mg/L SN、更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0079-795
1mg/L SN、甚至更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0079-796
2mg/L SN、並且最較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0079-797
3mg/L SN。命名為「CL-1 x I2C-6His」的抗體構建體的產率顯示為4.1mg/L上清液，並且命名為「CL-1 x I2C-scFc」的抗體構建體的產率顯示為36.5mg/L上清液。
同樣地，可以確定抗體構建體的二聚體抗體構建體同種型的產率，並由此確定單體百分比(即，單體：(單體+二聚體))。單體和二聚體抗體構建體的生產率和計算的單體百分比可以例如在對來自在滾瓶中標準化研究規模生產的培養物上清液的SEC純化步驟中獲得。根據一個實施方式，本發明的抗體構建體的單體百分比為
Figure 108127615-A0305-02-0079-798
80%、更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0079-799
85%、甚至更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0079-800
90%、並且最較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0079-801
95%。
根據一個實施方式，本發明的抗體構建體的血漿穩定性(具有血漿的EC50與不具有血漿的EC50的比率)為
Figure 108127615-A0305-02-0079-802
5或
Figure 108127615-A0305-02-0079-803
4、更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0079-804
3.5或
Figure 108127615-A0305-02-0079-805
3、甚至更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0079-806
2.5或
Figure 108127615-A0305-02-0079-807
2、並且最較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0079-808
1.5或
Figure 108127615-A0305-02-0079-809
1。可以藉由例如以2-20μg/ml的濃度將純化的構建體在人血漿中於37℃下孵育24至96小時來測試抗體構建體的血漿穩定性，隨後在18h 51-鉻釋放或48h FACS細胞毒性測定(例如，如在實例7.1和7.2中所描述的測定)中進行EC50確定。細胞毒性測定中的效應細胞可以是刺激的富集的人CD8陽性T細胞(較佳的)或未刺激的人PBMC。靶細胞可以例如是用人CLDN18.2轉染的CHO細胞。效應細胞與靶細胞(E：T)的比率可以是10：1。細胞毒性測定中抗體構建體的起始濃度可以是0.01-0.1μg/ml。 用於此目的的人血漿庫來源於由EDTA塗覆的注射器收集的健康供體的血液。藉由離心去除細胞組分，並且收集上層血漿相並隨後彙集。作為對照，在細胞毒性測定之前在適當的培養基如RPMI-1640中立即稀釋未孵育的抗體構建體。將血漿穩定性計算為EC50(在血漿孵育之後)與EC50(對照/無孵育)的比率。
此外，設想本發明的抗體構建體的單體與二聚體轉化較低。可以在不同條件下測量轉化並且藉由高性能尺寸排阻層析進行分析。參見實例8。例如，抗體構建體的單體同種型的孵育可以在培養箱中在通用配製緩衝液中並且以例如100μg/ml或250μg/ml的濃度在37℃下進行7天，隨後進行高性能SEC以確定已轉化為二聚體抗體構建體的最初單體抗體構建體的百分比。在該等條件下，設想本發明的抗體構建體顯示出
Figure 108127615-A0305-02-0080-810
8%、較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0080-811
6%、更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0080-812
5%、更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0080-813
4%、甚至更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0080-814
3%、甚至更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0080-815
2.5%、甚至更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0080-816
2%、甚至更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0080-817
1.5%、並且最較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0080-818
1%或
Figure 108127615-A0305-02-0080-819
0.5%或甚至0%的二聚體百分比。
同樣，設想本發明的抗體構建體在幾次冷凍/解凍循環之後呈現非常低的二聚體轉化。例如，將抗體構建體單體在例如通用配製緩衝液中調整至濃度為250μg/ml，並且進行三個冷凍/解凍循環(在-80℃下冷凍30min，之後在室溫下解凍30min)，之後進行高性能SEC以確定已經轉化成二聚體抗體構建體的最初單體抗體構建體的百分比。設想，例如在三次冷凍/解凍循環之後，抗體構建體的二聚體百分比為
Figure 108127615-A0305-02-0080-820
8%、較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0080-821
6%、更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0080-822
5%、更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0080-823
4%、甚至更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0080-824
3%、甚至更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0080-825
2.5%、甚至更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0080-826
2%、甚至更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0080-827
1.5%、並且最較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0080-828
1%或
Figure 108127615-A0305-02-0080-829
0.5%或甚至0%。
根據一個實施方式，本發明的抗體構建體顯示出聚集溫度
Figure 108127615-A0305-02-0080-830
45℃或
Figure 108127615-A0305-02-0080-831
46℃、更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0080-832
47℃或
Figure 108127615-A0305-02-0080-833
48℃、甚至更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0080-834
49℃或
Figure 108127615-A0305-02-0080-835
50℃、並 且最較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0081-836
51℃的有利熱穩定性。熱穩定性參數可以根據抗體聚集溫度如下確定：將濃度為250μg/ml的抗體溶液轉移到一次性比色杯中並置於動態光散射(DLS)裝置中。將樣本以0.5℃/min的加熱速率從40℃加熱至70℃，恒定獲取測量的半徑。使用指示蛋白質和聚集物熔融的半徑增加來計算抗體的聚集溫度。參見實例9。
可替代地，可以藉由差示掃描量熱法(DSC)確定溫度熔融曲線以確定抗體構建體的固有生物物理學蛋白質穩定性。該等實驗可以使用微凱爾有限公司(MicroCal LLC)VP-DSC裝置進行。從20℃至90℃記錄與僅含有配製緩衝液的樣本相比含有抗體構建體的樣本的能量攝取。例如在SEC運行緩衝液中將抗體構建體調整至終濃度為250μg/ml。為了記錄對應的熔融曲線，逐步升高整個樣本溫度。在每個溫度下記錄樣本和配製緩衝液參考物的能量吸收。將樣本的能量吸收Cp(千卡/莫耳/℃)減去參考物的差針對對應的溫度作圖。熔融溫度被定義為第一次最大能量吸收時的溫度。
還設想本發明的抗體構建體具有
Figure 108127615-A0305-02-0081-837
0.2或
Figure 108127615-A0305-02-0081-838
0.15、較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0081-839
0.10或
Figure 108127615-A0305-02-0081-840
0.08、更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0081-841
0.06或
Figure 108127615-A0305-02-0081-842
0.05、並且最較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0081-843
0.04或
Figure 108127615-A0305-02-0081-844
0.03的濁度。可以藉由在2.5mg/ml的抗體構建體濃度下的OD340和在5℃下孵育16h來測量濁度。參見實例10。
可以測量隨著在不存在T細胞的情況下在靶細胞上的預孵育的變化，靶標x CD3抗體構建體的效力的變化。如果抗體構建體被內化，則預期其將經歷溶酶體降解。因此，預期有效濃度隨時間降低，並因此表觀效力也應降低。已經觀察到一些靶標的效果，對於它們這係已知的現象。設想本發明的抗體構建體不被靶細胞內化或不經歷顯著的靶細胞內化。可以測定內化率，例如如以下所述：將T細胞計數並在測定培養基中稀釋至1 x 105個/ml的濃度。將靶標陽性 靶細胞計數並例如以2500個細胞/孔(cpw)鋪板。將抗體構建體例如以100nM的起始濃度以1：2連續稀釋。將抗體構建體添加到培養測定板中，以允許在添加T細胞之前孵育0小時、1小時或2小時。然後將T細胞以25000cpw(E：T=10：1)鋪板，並將測定在37℃下孵育48小時。例如使用Steady-Glo®系統(25μl/孔)分析靶細胞存活。較佳的是，在抗體構建體與靶細胞(預)孵育2小時之後，內化率(例如，測量為細胞毒性的降低)為
Figure 108127615-A0305-02-0082-845
20%、更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0082-846
15%、甚至更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0082-847
10%、並且最較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0082-848
5%。
此外，對於本發明的抗體構建體，設想脫落的或可溶性靶標不會顯著損害其功效或生物活性。這可以例如在細胞毒性測定中測量，其中將可溶性靶標以漸增的濃度(例如，以0nM-0.3nM-0.7nM-1nM-3nM-7nM-12nM)添加到測定中。示例性E：T值為10：1。在可溶性靶標的存在下，測試的抗體構建體的EC50值不應顯著增加。
在另外的實施方式中，根據本發明的抗體構建體在酸性pH下是穩定的。抗體構建體在非生理pH(如pH 5.5)(運行例如陽離子交換層析所需的pH)下的表現越耐受，從離子交換柱洗脫的抗體構建體相對於載入蛋白質總量的回收率越高。抗體構建體從pH 5.5的離子(例如陽離子)交換柱的回收率較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0082-849
30%、更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0082-850
40%、更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0082-851
50%、甚至更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0082-852
60%、甚至更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0082-853
70%、甚至更較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0082-854
80%、並且最較佳的是
Figure 108127615-A0305-02-0082-855
95%。百分比代表主峰的曲線下面積(=AUC)。參見實例11。
此外，設想本發明的抗體構建體表現出治療功效，其表現為抗腫瘤活性或腫瘤生長抑制。這可以例如在實例13或14中所揭露的研究中進行評估。在一個實施方式中，本發明的抗體構建體的腫瘤生長抑制T/C[%]為
Figure 108127615-A0305-02-0082-856
70、
Figure 108127615-A0305-02-0082-857
60、
Figure 108127615-A0305-02-0082-858
50、
Figure 108127615-A0305-02-0082-859
40、
Figure 108127615-A0305-02-0082-860
30、
Figure 108127615-A0305-02-0082-861
20、
Figure 108127615-A0305-02-0082-862
10、
Figure 108127615-A0305-02-0082-863
5、
Figure 108127615-A0305-02-0082-864
4、
Figure 108127615-A0305-02-0082-865
3或
Figure 108127615-A0305-02-0082-866
2。還設想修改或調整該 等研究的某些參數(如注射的腫瘤細胞的數量、注射部位、移植的人T細胞的數量、待投與的抗體構建體的量和時間線)，同時仍然獲得了有意義且可再現的結果。
本發明進一步提供了一種多核苷酸/核酸分子，該多核苷酸/核酸分子編碼本發明的抗體構建體。核酸分子係由核苷酸構成的生物聚合物。多核苷酸係由共價鍵合在鏈中的13個或更多個核苷酸單體構成的生物聚合物。DNA(如cDNA)和RNA(如mRNA)係具有不同生物功能的多核苷酸/核酸分子的實例。核苷酸係充當核酸分子如DNA或RNA的單體或亞單位的有機分子。本發明的核酸分子或多核苷酸可以是雙鏈的或單鏈的、線性的或環狀的。設想核酸分子或多核苷酸被包含在載體中。此外，設想這樣的載體被包含在宿主細胞中。所述宿主細胞例如在用本發明的載體或多核苷酸/核酸分子轉化或轉染後能夠表現抗體構建體。為此目的，將多核苷酸或核酸分子可操作地連接至控制序列。
遺傳密碼係將遺傳物質(核酸)內編碼的資訊翻譯成蛋白質的一組規則。活細胞中的生物解碼係藉由以由mRNA指定的順序連接胺基酸的核糖體、使用tRNA分子攜帶胺基酸並一次讀出mRNA三個核苷酸來完成。該密碼定義了該等核苷酸三聯體的序列(稱為密碼子)如何指定在蛋白質合成期間接下來將添加哪種胺基酸。除了一些例外，核酸序列中的三核苷酸密碼子指定單一胺基酸。因為絕大多數基因都使用完全相同的密碼進行編碼，所以該特定密碼通常稱為規範或標準遺傳密碼。
密碼子的簡並性係遺傳密碼的冗餘，表現為指定胺基酸的三鹼基對密碼子組合的多樣性。簡並性發生係因為存在比可編碼的胺基酸更多的密碼子。編碼一種胺基酸的密碼子在它們的三個位置中的任何一個都可以不同；然而，這種差異通常是在第二或第三位置。例如，密碼子GAA和GAG都指定麩胺 酸並表現出冗餘；但是，都沒有指定任何其他胺基酸，並因此沒有表現出歧義。不同生物體的遺傳密碼可能偏向於使用編碼相同胺基酸的幾個密碼子之一而不是其他密碼子-也就是說，將發現比偶然預期具有更大頻率的一個。例如，亮胺酸由六種不同的密碼子指定，其中一些很少被使用。可獲得詳細說明大多數生物體的基因組密碼子使用頻率的密碼子使用表。重組基因技術通常藉由實施稱為密碼子優化的技術來利用這種效應，其中將那些密碼子用於設計被各自宿主細胞(如人倉鼠起源的細胞、大腸桿菌(Escherichia coli)細胞或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞)偏好的多核苷酸，例如以便增加蛋白質表現。因此，設想本揭露的多核苷酸/核酸分子係密碼子優化的。然而，可以使用編碼所希望的胺基酸的任何密碼子來設計編碼本發明的抗體構建體的多核苷酸/核酸分子。
根據一個實施方式，編碼本發明的抗體構建體的本發明的多核苷酸/核酸分子呈一個單一分子的形式或兩個或更多個分開的分子的形式。如果本發明的抗體構建體係單鏈抗體構建體，則編碼這種構建體的多核苷酸/核酸分子將最可能也呈一個單一分子的形式。然而，還設想抗體構建體的不同組分(如不同結構域，例如結合CLDN18.2的結構域、結合CD3的結構域、和/或另外的結構域如抗體恒定結構域)位於單獨的多肽鏈上，在這種情況下，多核苷酸/核酸分子最可能呈兩個或更多個分開的分子的形式。
這同樣適用於包含本發明的多核苷酸/核酸分子的載體。如果本發明的抗體構建體係單鏈抗體構建體，則一個載體可以在一個單一位置(作為一個單一開放閱讀框，ORF)包含編碼抗體構建體的多核苷酸。一個載體還可以在分開的位置(具有單獨的ORF)包含兩個或更多個多核苷酸/核酸分子，它們中的每一個編碼本發明的抗體構建體的不同組分。設想包含本發明的多核苷酸/ 核酸分子的載體呈一個單一載體的形式或處於兩個或更多個分開的載體的形式。在一個實施方式中，並且出於在宿主細胞中表現抗體構建體的目的，本發明的宿主細胞應包含編碼抗體構建體的多核苷酸/核酸分子或包含這種多核苷酸/核酸分子的載體全部，這意味著抗體構建體的所有組分-無論是編碼為一個單一分子還是在單獨的分子/位置編碼-將在翻譯之後組裝並一起形成本發明的生物學活性的抗體構建體。
本發明還提供了包含本發明的多核苷酸/核酸分子的載體。載體係用作將(外來)遺傳物質轉移到細胞中的運載體的核酸分子，通常出於複製和/或表現的目的。術語「載體」涵蓋但不限於質體、病毒、黏粒和人造染色體。一些載體專門設計用於選殖(選殖載體)，其他載體設計用於蛋白質表現(表現載體)。所謂的轉錄載體主要用於擴增其插入物。通常在含有其在大腸桿菌中維持所需的元件的大腸桿菌載體上進行DNA操作。然而，載體也可以具有允許它們維持在另一種生物體如酵母、植物或哺乳動物細胞中的元件，並且該等載體被稱為穿梭載體。將載體插入靶標或宿主細胞中通常被稱為轉化(對於細菌細胞)和轉染(對於真核細胞)，而病毒載體的插入通常被稱為轉導。
一般來講，工程化載體包含複製起點、多株位點和選擇性標誌物。載體本身通常是包含插入物(轉基因)和充當載體「骨架」的較大序列的核苷酸序列(通常為DNA序列)。雖然遺傳密碼決定了給定編碼區的多肽序列，但其他基因組區域可能會影響該等多肽產生的時間和地點。因此，現代載體可以涵蓋除轉基因插入物和骨架之外的額外特徵：啟動子、遺傳標記、抗生素抗性、報告基因、靶向序列、蛋白質純化標籤。稱為表現載體(表現構建體)的載體尤其用於在靶細胞中表現轉基因，並且通常具有控制序列。
術語「控制序列」係指在特定宿主生物體中表現可操作連接的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適用於原核生物的控制序列包括啟動子、視需要的操縱子序列和核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化訊號、Kozak序列和增強子。
當核酸置處於與另一核酸序列的功能關係中時，該核酸係「可操作地連接的」。例如，如果將前序列或分泌前導序列的DNA表現為參與多肽分泌的前蛋白，則該前序列或分泌前導序列的DNA可操作地連接至該多肽的DNA；如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，則該啟動子或增強子可操作地連接至該序列；或者如果核糖體結合位點被定位成使得有助於翻譯，則該核糖體結合側可操作地連接至編碼序列。一般來講，「可操作地連接」意指所連接的核苷酸序列係連續的，並且在分泌性前導序列的情形下是連續的並處於閱讀相(reading phase)中。然而，增強子不必是連續的。連接藉由在方便的限制性位點進行接連接合來完成。如果不存在此類位點，則根據常規實踐使用合成的寡核苷酸銜接子或連接子。
「轉染」係有意將核酸分子或多核苷酸(包括載體)引入到靶細胞中的過程。該術語主要用於真核細胞中的非病毒方法。轉導通常用於描述病毒介導的核酸分子或多核苷酸的轉移。轉染動物細胞典型地涉及打開細胞膜中的暫態孔或「洞」，以允許攝取物質。轉染可以使用生物粒子(如病毒轉染，也稱為病毒轉導)、基於化學的方法(如使用磷酸鈣、脂質轉染、Fugene、陽離子聚合物、奈米粒子)或物理處理(如電穿孔、顯微注射、基因槍、細胞擠壓、磁轉染、靜水壓力、穿刺轉染(impalefection)、超音波、光學轉染、熱休克)進行。
術語「轉化」用於描述核酸分子或多核苷酸(包括載體)向細菌中，以及向非動物真核細胞(包括植物細胞中的非病毒轉移。因此，轉化係細菌或非動物真核細胞的基因改變，該基因改變係因藉由一個或多個細胞膜從其周圍直接攝取並隨後併入外源遺傳物質(核酸分子)而產生。轉化可以藉由人為手段來實現。為了發生轉化，細胞或細菌必須處於感受態，這可能作為對諸如饑餓等環境條件和細胞密度的時間限制反應而發生，並且也可以被人工誘導。
此外，本發明提供了一種宿主細胞，該宿主細胞用本發明的多核苷酸/核酸分子或用本發明的載體轉化或轉染。
如本文使用的，術語「宿主細胞」或「受體細胞」旨在包括可以是或已經是載體、外源性核酸分子和/或編碼本發明抗體構建體的多核苷酸的受體、和/或抗體構建體本身的受體的任何單個細胞或細胞培養物。藉由轉化、轉染等方式將對應的物質引入細胞中(參見上文)。術語「宿主細胞」還旨在包括單細胞的後代或潛在後代。因為某些改變可能由於天然的、意外的或有意的突變或由於環境影響而在隨後世代中發生，所以這種後代事實上可能不會與親本細胞完全相同(在形態或基因組或全部DNA補體中)，但仍包括在本文所用術語的範圍內。合適的宿主細胞包括原核細胞或真核細胞，並且還包括但不限於-細菌(如大腸桿菌)、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞和動物細胞，諸如昆蟲細胞和哺乳動物細胞，例如倉鼠、鼠類、大鼠、獼猴或人。
除了原核生物之外，真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母)係本發明的抗體構建體的合適的植株或表現宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通麵包酵母係低等真核宿主微生物中最常用的。然而，許多其他屬、物種和菌株通常是可獲得的並且可用於本文中，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克魯維酵母屬(Kluyveromyce)宿主，如乳酸 克魯維酵母(K.lactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC 12424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16045)、威克克魯維酵母(K.wickeramii)(ATCC 24178)、瓦爾提魯維酵母(K.waltii)(ATCC 56500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)和馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)；耶氏酵母屬(yarrowia)(EP 402 226)；巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183 070)；假絲酵母屬(Candida)；瑞氏木黴(Trichoderma reesia)(EP 244 234)；粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)；許旺酵母屬(Schwanniomyces)，如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和絲狀真菌，如脈孢菌屬(Neurospora)、青黴屬(Penicillium)、彎頸黴屬(Tolypocladium)；和麯黴屬(Aspergillus)宿主，如構巢麯黴(A.nidulans)和黑麯黴(A.niger)。
用於表現糖基化抗體構建體的合適宿主細胞衍生自多細胞生物體。無脊椎動物細胞的實例包括植物和昆蟲細胞。已經鑒定了來自諸如草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(果蠅)和家蠶(Bombyx mori)的宿主的許多桿狀病毒株和變體以及相應的許可性昆蟲宿主細胞。用於轉染的多種病毒株係公眾可獲得的，例如苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1變體和家蠶NPV的Bm-5株，並且根據本發明，此類病毒可以用作本文的病毒，特別是用於轉染草地貪夜蛾細胞。
棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄、擬南芥和煙草的植物細胞培養物也可以用作宿主。可用於在植物細胞培養物中產生蛋白質的植株和表現載體係熟悉該項技術者已知的。參見例如Hiatt等人，Nature[自然](1989)342：76-78；Owen等人(1992)Bio/Technology[生物技術]10：790-794；Artsaenko 等人(1995)The Plant J[植物雜誌]8：745-750；以及Fecker等人(1996)Plant Mol Biol[植物分子生物學]32：979-986。
然而，對脊椎動物細胞的興趣最大，並且培養物(細胞培養物)中脊椎動物細胞的繁殖已成為常規程序。有用的哺乳動物宿主細胞系的實例係由SV40(如COS-7，ATCC CRL 1651)轉化的猴腎CV1系；人胚胎腎系(如293細胞或亞選殖用於在懸浮培養物中生長的293細胞，Graham等人，J.Gen Virol.[遺傳病毒學雜誌]36：59(1977))；幼倉鼠腎細胞(如BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(如CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]77：4216(1980))；小鼠塞托利細胞(如TM4，Mather,Biol.Reprod.[生殖生物學]23：243-251(1980))；猴腎細胞(如CVI ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(如VERO-76，ATCC CRL1587)；人子宮頸癌細胞(如HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(如MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝細胞(如BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(如W138，ATCC CCL 75)；人肝細胞(如Hep G2,14138065)；小鼠乳腺腫瘤(如MMT 060562,ATCC CCL-51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y Acad.Sci.[紐約科學院年刊](1982)383：44-68)；MRC 5細胞；FS4細胞；和人肝癌細胞系(如Hep G2)。
在另一個實施方式中，本發明提供了一種用於產生本發明的抗體構建體的方法，所述方法包括在允許表現本發明的抗體構建體的條件下培養本發明的宿主細胞並且從該培養中回收所產生的抗體構建體。
如本文使用的，術語「培養」係指細胞在合適的條件下在培養基中的體外維持、分化、生長、增殖和/或繁殖。使細胞在適當的溫度和氣體混合物下在細胞生長培養基中生長並維持。對於每種細胞類型，培養條件變化很大。典型的生長條件係約37℃的溫度、約5%的CO2濃度和約95%的濕度。生長培養 基的配方可以例如在pH值、碳源(如葡萄糖)濃度、生長因子的性質和濃度、以及其他營養素(如胺基酸或維生素)的存在方面變化。用於補充培養基的生長因子通常源自於動物血液的血清，如胎牛血清(FBS)、牛小牛血清(FCS)、馬血清和豬血清。細胞可以在懸浮液中生長或作為貼壁培養物生長。還存在如下細胞系，該等細胞系已經被修飾以能夠在懸浮培養物中存活，因此它們可以按比貼壁條件將允許的更高密度生長。
術語「表現」包括涉及產生本發明的抗體構建體的任何步驟，包括但不限於轉錄、轉錄後修飾、翻譯、折疊、翻譯後修飾、靶向特定亞細胞或細胞外位置、和分泌。術語「回收」係指旨在從細胞培養物中分離抗體構建體的一系列過程。「回收」或「純化」過程可以分離細胞培養物的蛋白質和非蛋白質部分，並最終將所希望的抗體構建體與所有其他多肽和蛋白質分離。分離步驟通常利用蛋白質大小、物理化學特性、結合親和力和生物活性的差異。製備型純化旨在產生相對大量的純化蛋白質供後續使用，而分析型純化產生相對少量的蛋白質用於各種研究或分析目的。
當使用重組技術時，抗體構建體可以在周質空間中細胞內產生，或直接分泌到培養基中。如果抗體構建體係在細胞內產生，則作為第一步，例如藉由離心或超濾去除宿主細胞或溶解片段的微粒狀碎片。本發明的抗體構建體可以例如在諸如大腸桿菌等細菌中產生。在表現之後，將構建體從可溶性級分中的細菌細胞糊中分離出來，並且可以例如經由親和層析和/或尺寸排阻進行純化。最終純化可以以與用於純化在哺乳動物細胞中表現並分泌到培養基中的抗體構建體的方法類似的方式進行。Carter等人(Biotechnology(NY)[生物技術(NY)]1992年2月；10(2)：163-7)描述了用於分離分泌到大腸桿菌的周質間隙中的抗體的程序。
在抗體分泌到培養基中的情況下，通常首先使用可商購的蛋白質濃縮濾器(例如，超濾單元自此類表現系統的上清液進行濃縮。
可以使用例如羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析回收或純化從宿主細胞製備的本發明的抗體構建體。根據待回收的抗體構建體，也可獲得用於蛋白質純化的其他技術，如離子交換柱上分級分離、混合模式離子交換、HIC、乙醇沈澱、尺寸排阻層析、反相HPLC、在二氧化矽上進行的層析、在肝素瓊脂糖上進行的層析、在陰離子或陽離子交換樹脂(如聚天冬胺酸柱)上進行的層析、免疫親和(如蛋白質A/G/L)層析、層析聚焦、SDS-PAGE、超速離心和硫酸銨沈澱。
蛋白酶抑制劑可以被包括在任何前述步驟中以便抑制蛋白水解，並且抗生素可以被包括來防止污染物的生長。
此外，本發明提供了一種藥物組成物或配製物，該藥物組成物或配製物包含本發明的抗體構建體或根據本發明的方法產生的抗體構建體。
如本文使用的，術語「藥物組成物」涉及適合投與至患者、較佳的是人患者的組成物。本發明的特別較佳的藥物組成物包含較佳的是治療有效量的一種或多種本發明的抗體構建體。較佳的是，藥物組成物進一步包含一種或多種(藥學上有效的)載劑、穩定劑、賦形劑、稀釋劑、增溶劑、表面活性劑、乳化劑、防腐劑和/或佐劑的合適配製物。組成物的可接受成分較佳的是在所採用的劑量和濃度下是對接受者無毒性的。本發明的藥物組成物包括但不限於液體、冷凍和凍乾組成物。
該等組成物可以包含藥學上可接受的載體。一般來講，如本文使用的，「藥學上可接受的載體」意指與藥物投與、特別是腸胃外投與相容的任何和所有的水性和非水性溶液、無菌溶液、溶劑、緩衝液(例如磷酸鹽緩衝鹽 水(PBS)溶液)、水、懸浮液、乳液(諸如油/水乳液)、各種類型的潤濕劑、脂質體、分散介質和包衣。此類介質和藥劑在藥物組成物中的使用在本領域中是熟知的，並且包含此類載劑的組成物可以藉由熟知的常規方法配製。
某些實施方式提供了藥物組成物，該等藥物組成物包含本發明的抗體構建體和另外一種或多種賦形劑，諸如在本部分和本文其他地方說明性描述的那些賦形劑。賦形劑在本發明中可用於多種目的，諸如調整配製物的物理、化學或生物特性，諸如調整黏度和/或本發明的方法以改善有效性和/或穩定此類配製物和方法，以防止例如由於在製造、運輸、存儲、使用前製備、投與和其後過程中發生的壓力而導致的降解和腐壞。賦形劑通常應以其最低有效濃度使用。
在某些實施方式中，出於改變、保持或保存組成物的某些特徵(如pH、莫耳滲透壓濃度、黏度、透明度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸附性或滲透性)的目的，藥物組成物可以含有配製物質(參見Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明登氏藥學全書]，第18版，1990,Mack Publishing Company[馬克出版公司])。在此類實施方式中，合適的配製物質可以包括但不限於：
˙胺基酸
˙抗微生物劑，如抗細菌劑和抗真菌劑
˙抗氧化劑
˙用於將組成物維持在生理pH或稍低的pH下(通常在約5至約8或9的pH範圍內)的緩沖液、緩衝系統和緩沖劑
˙非水性溶劑、植物油和可注射的有機酯
˙水性載體包括水、醇/水性溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質
˙可生物降解聚合物，如聚酯
˙增積劑
˙螯合劑
˙等滲劑和吸收延遲劑
˙錯合劑
˙填充劑
˙碳水化合物
˙(低分子量)蛋白質、多肽或蛋白質載體，較佳的是人起源的
˙著色劑和調味劑
˙含硫還原劑
˙稀釋劑
˙乳化劑
˙親水性聚合物
˙成鹽抗衡離子
˙防腐劑
˙金屬錯合物
˙溶劑和助溶劑
˙糖和糖醇
˙懸浮劑
˙表面活性劑或潤濕劑
˙穩定性增強劑
˙張力增強劑
˙腸胃外遞送運載體
˙靜脈內遞送運載體
眾所周知，例如，藥物組成物的不同成分可以具有不同的效應，並且胺基酸可以充當緩衝液、穩定劑和/或抗氧化劑；甘露醇可以充當增積劑和/或張力增強劑；氯化鈉可以充當遞送運載體和/或張力增強劑；等等。
在本發明的上下文中，藥物組成物可以包含：(a)如本文所述的抗體構建體，(b)至少一種緩衝劑，(c)至少一種糖，以及(d)至少一種表面活性劑；其中該藥物組成物的pH在3.5至6的範圍內。
在上面所述的組成物中，第一結構域較佳的是具有在4至9.5的範圍內的等電點(pI)；第二結構域具有在8至10(較佳的是8.5至9.0)的範圍內的pI；並且抗體構建體視需要包含第三結構域，該第三結構域包含兩個多肽單體，每個多肽單體包含鉸鏈、CH2結構域和CH3結構域，其中所述兩個多肽單體經由肽連接子彼此融合；在上面所述的組成物中，進一步設想所述至少一種緩衝劑以5mM至200mM的濃度範圍、更較佳的是以10mM至50mM的濃度範圍存在。還設想所述至少一種糖選自由以下組成之群組：單糖、二糖、環狀多糖、糖醇、線性支鏈葡聚糖或線性非支鏈葡聚糖。還設想該二糖選自由以下組成之群組：蔗糖、海藻糖和甘露糖醇、山梨醇及其組合。進一步設想該糖醇係山梨糖醇。還設想所述至少一種糖以1%至15%(m/V)的範圍內的濃度存在，較佳的是以9%至12%(m/V)的濃度範圍存在。進一步設想該抗體構建體以0.1mg/ml至8mg/ml、較佳的是0.2-2.5mg/ml、更較佳的是0.25-1.0mg/ml的濃度範圍存在。
根據上面所述的組成物的一個實施方式，所述至少一種表面活性劑選自由以下組成之群組：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆188、普朗尼克F68、曲拉通X-100、聚氧乙烯(polyoxyethylen)、PEG 3350、PEG 4000及其組合。進一步設想所述至少一種表面活性劑以在0.004%至0.5%(m/V)的範圍內(較佳的是在0.001%至0.01%(m/V)的範圍內)的濃度存在。設想該組成物的pH在4.0至5.0的範圍內，較佳的是4.2。還設想該藥物組成物具有150mOsm至500mOsm的莫耳滲透壓濃度。進一步設想該藥物組成物進一步包含選自以下群組的賦形劑，該群組由以下組成：一種或多種多元醇和一種或多種胺基酸。在本發明的上下文中，設想所述一種或多種賦形劑以0.1%至15%(w/V)的濃度範圍存在。
本發明還提供了藥物組成物，其包含(a)如本文所述的抗體構建體，較佳的是在0.1mg/ml至8mg/ml、較佳的是0.2mg/ml-2.5mg/ml、更較佳的是0.25mg/ml-1.0mg/ml的濃度範圍內；(b)10mM麩胺酸鹽或乙酸鹽；(c)9%(m/V)蔗糖或6%(m/V)蔗糖和6%(m/V)羥丙基-β-環糊精；(d)0.01%(m/V)聚山梨醇酯80；其中該液體藥物組成物的pH為4.2。
設想除了本文定義的本發明的抗體構建體之外，本發明的組成物可以包含另外的生物活性劑，這取決於組成物的預期用途。此類劑可以是作用於胃腸系統的藥物、充當細胞抑制劑的藥物、預防高尿酸血症的藥物、抑制免疫應答的藥物、調節炎症反應的藥物、作用於循環系統的藥物和/或本領域中已知的劑諸如細胞介素。還設想將本發明的抗體構建體應用於共療法中，即與另一種抗癌藥物組合。
在這個背景下，設想本發明的藥物組成物(其包含抗體構建體，該抗體構建體包含與靶細胞表面上的CLDN18.2結合的第一結構域和與T細胞表面上的CD3結合的第二結構域，如本文上面更詳細描述的)此外包含與免疫檢查點途徑的蛋白質(如PD-1或CTLA-4)或與共刺激免疫檢查點受體(如4-1BB)結合的藥劑(較佳的是抗體或抗體構建體)。本發明還涉及根據本發明的抗體構建體(其包含抗體構建體，該抗體構建體包含與靶細胞表面上的CLDN18.2結合的第一結構域和與T細胞表面上的CD3結合的第二結構域，如本文上面更詳細描述的)和與免疫檢查點途徑的蛋白質(如PD-1或CTLA-4)或與共刺激免疫檢查點受體(如4-1BB)結合的藥劑(較佳的是抗體或抗體構建體)的組合。由於該組合的至少兩種成分的性質，即它們的藥物活性，該組合也可以被稱為治療性組合。在一些實施方式中，該組合可以呈藥物組成物或套組的形式。根據一個實施方式，該藥物組成物或該組合包含本發明的抗體構建體和與PD-1結合的抗體或抗體構建體。例如在PCT/US 2019/013205中詳細描述了可用於該目的的抗PD-1結合蛋白。
因此，在另外的方面，本發明涉及藥物組成物或組合，該藥物組成物或組合包含：˙抗體構建體，其包含與靶細胞表面上的CLDN18.2結合的第一結構域和與T細胞表面上的CD3結合的第二結構域，如本文上面更詳細描述的，以及˙抗體或抗體構建體，其與PD-1結合並且包含：a)VH區和/或VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：292中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：293中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：294中所描述的CDR-H3，該VL區包含如SEQ ID NO：295中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：296中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：297中所描述的CDR-L3； b)VH區和/或VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：302中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：303中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：304中所描述的CDR-H3，該VL區包含如SEQ ID NO：305中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：306中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：307中所描述的CDR-L3；c)VH區和/或VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：312中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：313中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：314中所描述的CDR-H3，該VL區包含如SEQ ID NO：315中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：316中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：317中所描述的CDR-L3；d)VH區和/或VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：322中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：323中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：324中所描述的CDR-H3，該VL區包含如SEQ ID NO：325中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：326中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：327中所描述的CDR-L3；e)VH區和/或VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：332中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：333中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：334中所描述的CDR-H3，該VL區包含如SEQ ID NO：335中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：336中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：337中所描述的CDR-L3；f)VH區和/或VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：342中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：343中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：344中所描述的CDR-H3，該VL區包含如SEQ ID NO：345中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：346中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：347中所描述的CDR-L3；g)VH區和/或VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：352中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：353中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：354中所描述的 CDR-H3，該VL區包含如SEQ ID NO：355中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：356中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：357中所描述的CDR-L3；或h)VH區和/或VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：362中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：363中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：364中所描述的CDR-H3，該VL區包含如SEQ ID NO：365中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：366中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：367中所描述的CDR-L3。
在一個實施方式中，上文所述的與PD-1結合的抗體或抗體構建體包含a)如SEQ ID NO：298中所描述的VH區，以及如SEQ ID NO：299中所描述的VL區；b)如SEQ ID NO：308中所描述的VH區，以及如SEQ ID NO：309中所描述的VL區；c)如SEQ ID NO：318中所描述的VH區，以及如SEQ ID NO：319中所描述的VL區；d)如SEQ ID NO：328中所描述的VH區，以及如SEQ ID NO：329中所描述的VL區；e)如SEQ ID NO：338中所描述的VH區，以及如SEQ ID NO：339中所描述的VL區；f)如SEQ ID NO：348中所描述的VH區，以及如SEQ ID NO：349中所描述的VL區；g)如SEQ ID NO：358中所描述的VH區，以及如SEQ ID NO：359中所描述的VL區；或 h)如SEQ ID NO：368中所描述的VH區，以及如SEQ ID NO：369中所描述的VL區。
在一個實施方式中，與PD-1結合的上述抗體或抗體構建體包含：a)如SEQ ID NO：300中所描述的重鏈、和如SEQ ID NO：301中所描述的輕鏈；b)如SEQ ID NO：310中所描述的重鏈、和如SEQ ID NO：311中所描述的輕鏈；c)如SEQ ID NO：320中所描述的重鏈、和如SEQ ID NO：321中所描述的輕鏈；d)如SEQ ID NO：330中所描述的重鏈、和如SEQ ID NO：331中所描述的輕鏈；e)如SEQ ID NO：340中所描述的重鏈、和如SEQ ID NO：341中所描述的輕鏈；f)如SEQ ID NO：350中所描述的重鏈、和如SEQ ID NO：351中所描述的輕鏈；g)如SEQ ID NO：360中所描述的重鏈、和如SEQ ID NO：361中所描述的輕鏈；或h)如SEQ ID NO：370中所描述的重鏈、和如SEQ ID NO：371中所描述的輕鏈。
在某些實施方式中，最佳藥物組成物將根據例如預期投與途徑、遞送形式和所希望的劑量來確定。參見，例如Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明登氏藥學全書]，同上。在某些實施方式中，此類組成物可以影響本發明的抗體構建體的物理狀態、穩定性、體內釋放速率和體內清除速率。在某些實施 方式中，藥物組成物中的主要媒介物或載劑本質上可以是水性的或非水性的。例如，合適的運載體或載體可以是注射用水或生理鹽水溶液，可能補充有用於腸胃外投與的組成物中常見的其他物質。在某些實施方式中，包含本發明的抗體構建體的組成物可以藉由將具有所希望純度的選擇成分與視需要的配製劑(Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明登氏藥學全書]，同上)以凍乾餅或水性溶液的形式混合來製備用於儲存。此外，在某些實施方式中，可以使用合適的賦形劑將本發明的抗體構建體配製成凍乾物。
當考慮腸胃外投與時，用於本發明的治療組成物可以以無熱原的腸胃外可接受的水性溶液的形式提供，該水性溶液包含在藥學上可接受的媒介物中的本發明的所希望抗體構建體。用於腸胃外注射的特別合適的媒介物係無菌蒸餾水，其中將本發明的抗體構建體配製成適當保存的無菌等滲溶液。在某些實施方式中，製劑可以包括用可以提供產品的控制釋放或持續釋放的試劑配製所希望的分子，該產品可以經由積存注射遞送，或者可以促進在循環中持久的持續時間。在某些實施方式中，可植入藥物遞送裝置可用於引入所希望的抗體構建體。
另外的藥物組成物對於熟悉該項技術者將是明顯的，包括涉及在持續或控制遞送配製物中包括本發明的抗體構建體的配製物。用於配製各種持續或控制遞送手段的技術對熟悉該項技術者而言係已知的。抗體構建體也可以包埋在例如藉由凝聚技術或藉由介面聚合製備的微膠囊中、在膠體藥物遞送系統中或在粗乳液中。在Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明登氏藥學全書]，同上中揭露了此類技術。
用於體內投與的藥物組成物典型地作為無菌製劑提供。滅菌可以藉由無菌濾膜過濾完成。當組成物凍乾時，可以在凍乾和重構之前或之後進行 使用該方法的滅菌。用於腸胃外投與的組成物可以以凍乾形式或於溶液中儲存。通常將腸胃外組成物置於具有無菌進入口的容器(例如具有可由皮下注射針刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)中。
本發明的另一個方面包括包含本發明的抗體構建體的自緩衝配製物，該等自緩衝配製物可以用作藥物組成物，如在國際專利申請WO 2006/138181中所述。關於可用於這方面的蛋白質穩定化和配製材料和方法，有多種出版物可用，如Arawaka T.等人，Pharm Res.1991年3月；8(3)：285-91；Kendrick等人，「Physical stabilization of proteins in aqueous solution」[蛋白質在水性溶液中的物理穩定化]在：Rational Design of Stable Protein Formulations：Theory and Practice[穩定蛋白質配製物的合理設計：理論與實踐]，Carpenter和Manning編輯Pharmaceutical Biotechnology[藥物生物技術].13：61-84(2002)，以及Randolph和Jones,Pharm Biotechnol.[藥物生物技術]2002；13：159-75，尤其參見與用於自緩衝蛋白質配製物的賦形劑和方法有關的部分，特別是關於用於獸醫和/或人類醫學用途的蛋白質藥物產品和方法。
根據本發明的某些實施方式，可以使用鹽例如以便調整組成物或配製物的離子強度和/或等滲性和/或改善根據本發明的組成物的抗體構建體或其他成分的溶解度和/或物理穩定性。離子可以藉由與蛋白質表面上的帶電荷的殘基結合並藉由遮罩蛋白質中的帶電荷基團和極性基團並降低其靜電相互作用、吸引和排斥相互作用的強度來穩定蛋白質的天然狀態。離子還可以藉由特別地與蛋白質的變性肽鍵(--CONH)結合來穩定蛋白質的變性狀態。此外，與蛋白質中的帶電荷基團和極性基團的離子相互作用還可以減少分子間靜電相互作用，並且從而防止或減少蛋白質聚集和不溶解。
離子物種對蛋白質的作用顯著不同。已經開發了多種對可用於配製根據本發明的藥物組成物的離子及其對蛋白質的作用的分類評級。一個實例係Hofmeister系列，該系列藉由對溶液中蛋白質的構象穩定性的作用來對離子和極性非離子溶質進行評級。穩定溶質稱為「親液的」。不穩定溶質稱為「離液的」。通常使用高濃度的親液劑以從溶液中沈澱蛋白質(「鹽析」)。通常使用離液劑來使蛋白質變性和/或溶解(「鹽溶」)。離子對「鹽溶」和「鹽析」的相對有效性限定了其在Hofmeister系列中的位置。
根據本發明的各種實施方式，游離胺基酸可用於包含本發明的抗體構建體的配製物或組成物中，以作為增積劑、穩定劑和抗氧化劑以及用於其他標準用途。可以將某些胺基酸用於穩定配製物中的蛋白質，其他胺基酸可用於凍乾過程中以確保正確餅結構和活性成分的特性。可以將一些胺基酸用於抑制液體和凍乾配製物中的蛋白質聚集，而其他胺基酸可用作抗氧化劑。
多元醇係親液的，並且可用作液體和凍乾配製物中的穩定劑，以保護蛋白質免受物理和化學降解過程。多元醇還可用於調節配製物的張力並且用於防止在運輸過程中的冷凍-解凍應力或防止在製造過程中製備團塊。在本發明的上下文中多元醇也可以用作冷凍保護劑。
包含本發明的抗體構建體的配製物或組成物的某些實施方式可以包含表面活性劑。蛋白質可能易於吸附在表面上並且易於變性和在空氣-液體、固體-液體和液體-液體介面處產生聚集。該等有害的相互作用通常與蛋白質濃度成反比，並且典型地因物理振盪(如在產品運輸和處理過程中產生的物理振盪)而加劇。常規使用表面活性劑來防止、最小化或減少表面吸附。表面活性劑也常用於控制蛋白質構象穩定性。在這方面使用表面活性劑係蛋白質特異 性的，因為一種特定的表面活性劑典型地會穩定一些蛋白質並使其他蛋白質不穩定。
包含本發明的抗體構建體的配製物或組成物的某些實施方式可以包含一種或多種抗氧化劑。藉由保持適當水平的環境氧氣和溫度並避免暴露於光下，可以在某種程度上防止藥物配製物中蛋白質的有害氧化。抗氧化賦形劑也可以用於防止蛋白質的氧化降解。設想用於根據本發明的治療性蛋白質配製物的抗氧化劑可以是水溶性的並且在產品(包含抗體構建體的組成物)的整個保質期內保持其活性。抗氧化劑也可能破壞蛋白質，並且因此應該除了別的之外以一種方式選擇，以消除或充分降低抗氧化劑破壞配製物中的抗體構建體或其他蛋白質的可能性。
包含本發明的抗體構建體的配製物或組成物的某些實施方式可以包含一種或多種防腐劑。例如，當開發涉及從相同容器中提取超過一次的多劑量腸胃外配製物時，防腐劑係必需的。其主要功能係抑制微生物生長並確保在藥物產品的整個保質期或使用期限內的產品無菌性。儘管防腐劑與小分子腸胃外藥物一起使用有很長的歷史，但是開發包括防腐劑的蛋白質配製物可能具有挑戰性。防腐劑通常對蛋白質具有不穩定效應(聚集)，並且這已成為限制其在多劑量蛋白質製劑中使用的主要因素。迄今為止，大部分蛋白質藥物僅配製用於一次性使用。然而，當多劑量配製物係可能時，它們具有使患者方便的附加優勢和增加的可銷售性。一個良好的實例係人生長激素(hGH)，其中防腐配製物的開發已經導致更方便、多次使用的注射筆展示的商業化。在防腐劑型的配製和開發期間需要考慮若干個方面。必須優化藥物產品中有效的防腐劑濃度。這需要以賦予抗微生物有效性而不損害蛋白質穩定性的濃度範圍測試劑型中給定的防腐劑。
正如可以預期的那樣，含有防腐劑的液體配製物的開發比凍乾配製物更具挑戰性。冷凍乾燥的產品可以在沒有防腐劑的情況下凍乾，並且在使用時用含有防腐劑的稀釋劑重構。這縮短了防腐劑與抗體構建體接觸的時間，從而顯著最小化相關的穩定性風險。在液體配製物的情況下，應在整個產品保質期內保持防腐劑有效性和穩定性。要指出的重點係，防腐劑有效性應在含有活性藥物和所有賦形劑組分的最終配製物中得到證實。一旦配製了藥物組成物，可以將它作為溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體、晶體或作為脫水或凍乾粉末儲存在無菌小瓶中。此類配製物可以以即用形式或以在投與前重構的形式(例如凍乾形式)儲存。
本文定義的藥物組成物的生物活性可以例如藉由細胞毒性測定來確定，如在以下實例、WO 99/54440中或由Schlereth等人(Cancer Immunol.Immunother.[癌症免疫學免疫治療]20(2005),1-12)所述的。如本文使用的，「功效」或「體內功效」係指使用例如標準化NCI應答標準對本發明的藥物組成物或配製物治療的應答。使用本發明的藥物組成物的療法的成功或體內功效係指組成物對於其預期用途的有效性，即組成物引起其所希望效應，即耗盡病理細胞(例如腫瘤細胞)的能力。體內功效可以藉由已建立的對應疾病實體的標準方法進行監測，該等方法包括但不限於白血球計數、差異、螢光激活細胞分選法、骨髓抽吸。另外，可以使用各種疾病特異性臨床化學參數和其他建立的標準方法。此外，可以使用電腦輔助斷層攝影、X射線、核磁共振斷層攝影、正電子發射斷層攝影掃描、淋巴結活組織檢查/組織學和其他已建立的標準方法。
開發藥物(諸如本發明的藥物組成物)的另一主要挑戰係藥物動力學特性的可預測調節。為此，可以建立候選藥物的藥物動力學曲線，即影響特定藥物治療給定病狀的能力的藥物動力學參數的曲線。影響藥物治療某種疾 病實體的能力的藥物的藥物動力學參數包括但不限於：半衰期、分佈容量、肝臟首過代謝和血清結合程度。給定藥物劑的功效可以受到上文提及的每個參數的影響。
「半衰期」係將量減少到其初始值的一半所需的時間。醫學科學係指物質或藥物在人體內的半衰期。在醫學背景下，半衰期可以是指物質/藥物失去其活性(例如藥理學、生理學或放射學活性)的一半所花費的時間。半衰期還可以描述藥物或物質(例如，本發明的抗體構建體)在血漿/血清中的濃度達到其穩態值的一半所花費的時間(「血清半衰期」)。典型地，所投與的物質/藥物的清除或去除係指藉由諸如代謝、排泄等生物過程(還涉及腎臟和肝臟的功能)進行身體清潔。「首過代謝」係藥物代謝、由此在藥物到達循環之前使藥物濃度降低的現象。它係吸收過程中藥物損失的部分。因此，「肝臟首過代謝」意指藥物在首次與肝臟接觸時(即在其首次通過肝臟期間)被代謝的傾向。「分佈容量」(VD)意指藥物在身體組織而非血漿中分佈的程度，較高的VD表示較大的組織分佈量。藥物的保留可以發生在遍佈身體的各個隔室，如細胞內和細胞外空間、組織和器官等。「血清結合程度」意指藥物與血清蛋白(如白蛋白)相互作用並結合的傾向，從而導致藥物生物活性的降低或喪失。
藥物動力學參數還包括就所給予的給定量的藥物而言的生體可用率、滯後時間(T滯後)、Tmax、吸收速率、和/或Cmax。「生體可用率」係指到達體循環(血液隔室)的所投與藥物/物質劑量的分數。當靜脈內投與藥物時，其生體可用率被認為係100%。然而，當經由其他途徑(如口服地)投與藥物時，其生體可用率通常會降低。「滯後時間」意指藥物投與與其在血液或血漿中的檢測和可測量性之間的時間延遲。Cmax係藥物在其投與之後(以及在投與第二劑量之前)達到的最大血漿濃度。Tmax係達到Cmax的時間。達到其生物 效應所需的藥物的血液或組織濃度的時間受到所有參數的影響。如上面所概述和例如在Schlereth等人(同上)中所示的，可以在非黑猩猩靈長類動物的臨床前動物測試中確定表現出跨物種特異性的抗體構建體的藥物動力學參數。
一個實施方式提供了本發明的抗體構建體(或根據本發明的方法產生的抗體構建體)，用於在預防、治療或緩解疾病(較佳的是腫瘤)中使用。另一個實施方式提供了本發明的抗體構建體(或根據本發明的方法產生的抗體構建體)在製造用於預防、治療或緩解疾病(較佳的是腫瘤)的藥物中的用途。還設想提供用於預防、治療或緩解疾病(較佳的是腫瘤)之方法，該方法包括向對其有需要的受試者投與本發明的抗體構建體(或根據本發明的方法產生的抗體構建體)的步驟。術語「有需要的受試者」、「患者」或「需要治療」的那些包括已經患有該疾病的那些，以及將要預防該疾病的那些。該等術語還包括接受預防性或治療性治療的人和其他哺乳動物受試者。
本發明的抗體構建體和本文描述的配製物/藥物組成物可用於治療、緩解和/或預防對其有需要的患者中的如本文所述的醫學病症。術語「治療」係指治療性治療和預防性(prophylactic或preventative)措施兩者。治療包括將抗體構建體/藥物組成物施用或投與至患有如本文所述的疾病/障礙、具有這種疾病/障礙的症狀或具有患這種疾病/障礙的傾向的患者或有需要的受試者的體內、分離組織或細胞，目的是治癒、痊癒、緩和、減輕、改變、補救、緩解、改善或影響該疾病、該疾病症狀或患該疾病的傾向。如本文使用的，術語「緩解」係指藉由將根據本發明的抗體構建體投與至此類患者或有需要的受試者而對患者的疾病狀態的任何改善。這樣的改善可以被視為患者疾病的進展減緩或停止、和/或疾病症狀的嚴重程度降低、無疾病症狀期的頻率或持續時間增加、或由於疾病導致的損害或殘疾的預防。如本文使用的，術語「預防」意指藉由 將根據本發明的抗體構建體的投與至對其有需要的受試者來避免如本文所指定的疾病的發生或復發。
術語「疾病」係指將受益於用本文所述的抗體構建體或藥物組成物治療的任何病狀。這包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳動物易患所考慮疾病的病理學病狀。該疾病較佳的是腫瘤、癌症或腫瘤。該疾病、腫瘤、癌症或腫瘤較佳的是CLDN18.2陽性的，即其特徵在於CLDN18.2的表現或過表現。
「腫瘤」係組織的異常生長，通常但不總是形成腫塊。當也形成腫塊時，通常稱之為「腫瘤」。在腦腫瘤中，不受控制的細胞分裂意指腫瘤腫塊的大小增加，並且在諸如顱內腔等密閉空間中這很快變得有問題，因為腫塊侵入大腦空間將其推到一邊，導致腦組織壓縮和顱內壓增高和腦實質的破壞。腫瘤或腫瘤可以是良性的、潛在惡性的(癌前)、或惡性的(癌性)。惡性腫瘤/腫瘤通常被稱為癌症。它們通常侵入並破壞周圍組織，並可能形成轉移，即它們擴散到身體的其他部位、組織或器官。「原發性腫瘤」係在腫瘤進展開始並繼續產生癌性腫塊的解剖部位處生長的腫瘤。例如，當在腦內形成異常細胞時，就會發生腦腫瘤。大多數癌症在其原發部位發展，但然後繼續轉移或擴散至身體的其他部分(例如組織和器官)。該等另外的腫瘤係「繼發性腫瘤」。大多數癌症在它們的原發部位之後、甚至在它們已經擴散到身體的其他部分之後繼續被調用。
淋巴瘤和白血病係淋巴腫瘤。出於本發明的目的，它們也被術語「腫瘤」或「癌症」涵蓋。出於本發明的目的，術語「腫瘤」、「腫瘤」和「癌症」可以互換使用，並且它們既包含原發性腫瘤/癌症又包含繼發性腫瘤/癌症(或 「轉移瘤」)、連同腫塊形成腫瘤(腫瘤)和淋巴腫瘤(如淋巴瘤和白血病)以及MRD。
術語「微小殘留病」(MRD)係指在癌症治療之後，例如當患者處於緩解期(沒有疾病症狀或體征)時，留在患者體內的少量殘留癌細胞存在的證據。藉由常規手段通常不能檢測到極少量的剩餘癌細胞，因為用於評估或檢測癌症的標準測試不夠敏感以檢測MRD。如今，對於MRD非常敏感的分子生物學測試係可用的，如流動式細胞術、PCR和下一代測序。該等測試可以測量組織樣本中最低水平的癌細胞，有時低至百萬個正常細胞中的一個癌細胞。在本發明的上下文中，設想術語癌症的「預防」、「治療」或「緩解」還涵蓋「MRD的預防、治療或緩解」，無論是否檢測到MRD。
在本發明的一個實施方式中，腫瘤、癌症或腫瘤選自以下群組，該組包括但不限於胃腸癌、卵巢癌和肺癌(或由其組成)。根據本發明的一個實施方式，胃腸癌選自由以下組成之群組：胃癌(gastric或stomach cancer)、食管癌、胃食管癌、胰髒癌和結直腸癌。根據本發明的另一個實施方式，卵巢癌係黏液性卵巢癌。根據本發明的另外的實施方式，肺癌係非小細胞肺癌。
本發明的抗體構建體通常將針對特定投與途徑和方法、特定投與劑量和頻率、特定疾病的特定治療、生體可用率和持久性範圍等來設計。組成物的物質較佳的是以對於投與位點可接受的濃度配製。因此可以根據本發明設計配製物和組成物以藉由任何合適的投與途徑遞送。在本發明的上下文中，投與途徑包括但不限於局部途徑、腸內途徑和腸胃外途徑。
如果藥物組成物已被凍乾，則在投與之前首先將凍乾材料在適當液體中重構。可以將凍乾材料在例如抑菌注射用水(BWFI)、生理鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或與冷凍乾燥前蛋白質所處於的相同配製物中重構。本發明 的藥物組成物和抗體構建體特別可用於腸胃外投與，例如靜脈內遞送，例如藉由注射或輸注。藥物組成物可以使用醫療裝置來投與。用於投與藥物組成物的醫學設備的實例描述於美國專利案號4,475,196；4,439,196；4,447,224；4,447,233；4,486,194；4,487,603；4,596,556；4,790,824；4,941,880；5,064,413；5,312,335；5,312,335；5,383,851；和5,399,163中。
本發明的組成物可以以合適的劑量投與至受試者，該劑量可以例如在劑量遞增研究中確定。如上所述，表現出本文所述的種間特異性的本發明的抗體構建體還可以有利地用於非黑猩猩靈長類動物的臨床前測試。劑量方案將由主治醫師和臨床因素決定。如在醫學領域中熟知的，任何一個患者的劑量取決於許多因素，包括患者體型、體表面積、年齡、有待投與的具體化合物、性別、投與時間和途徑、一般健康狀況和同時投與的其他藥物。
「有效劑量」係足以實現或至少部分地實現所希望的效果的治療劑的量。「治療有效劑量」係足以治癒或至少部分地阻止患有疾病的患者的疾病及其併發症、體征和症狀的量。對此用途有效的量或劑量將取決於待治療的疾病(適應症)、遞送的抗體構建體、治療背景和目標、疾病的嚴重程度、先前療法、患者的臨床病史和對治療劑的應答、投與途徑、患者的體型(體重、體表)和/或病狀(年齡和一般健康狀況)以及患者自體免疫系統的一般狀態。可以根據主治醫師的判斷調整適當的劑量，以便獲得最佳治療效果。
治療有效量的本發明的抗體構建體較佳的是導致疾病症狀的嚴重程度降低、無疾病症狀期的頻率或持續時間增加或預防由於疾病引起的損害或殘疾。相對於未經治療的患者，在表現CLDN18.2的腫瘤的治療中，治療有效量的本發明的抗體構建體較佳的是將腫瘤細胞生長抑制了至少約20%、至少 約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。可以在預測在人腫瘤中的功效的動物模型中評價化合物抑制腫瘤生長的能力。
在另外的實施方式中，本發明提供了套組，該套組包含本發明的抗體構建體、根據本發明的方法產生的抗體構建體、本發明的多核苷酸、本發明的載體和/或本發明的宿主細胞。在本發明的背景下，術語「套組」意指兩種或更多種組分(其中一種對應於本發明的抗體構建體、藥物組成物、多核苷酸、載體或宿主細胞)一起包裝在容器、接受器或其他中。因此，套組可以被描述為足以實現某一目標的一組產品和/或器具，其可以作為單一單元銷售。
設想本發明的套組的另外的組分係與免疫檢查點途徑的蛋白質(如PD-1或CTLA-4)或與共刺激免疫檢查點受體(如4-1BB)結合的藥劑(較佳的是抗體或抗體構建體)。該等藥劑在本文上面更詳細地描述。根據一個實施方式，該套組包含本發明的抗體構建體和與PD-1結合的抗體或抗體構建體。例如在PCT/US 2019/013205中詳細描述了可用於該目的的抗PD-1結合蛋白。在某些實施方式中，該套組允許組分的同時和/或依次投與。
套組可以包括一個或多個具有任何適當形狀、大小和材料(較佳的是防水的，例如塑膠或玻璃)的接受器(諸如小瓶、安瓿、容器、注射器、小瓶、袋)，該一個或多個接收器含有適於投與的劑量的本發明的抗體構建體或藥物組成物(參見上文)。套組可以另外含有使用說明(例如以小冊子或說明手冊的形式)、用於投與本發明的抗體構建體或藥物組成物的裝置(如注射器、泵、輸注器等)、用於重構本發明的抗體構建體的裝置和/或用於稀釋本發明的抗體構建體的裝置。
本發明還提供了用於單劑量投與單元的套組。本發明的套組還可以含有包含乾燥/凍乾的抗體構建體或藥物組成物的第一接受器和包含水性配製 物的第二接受器。在本發明的某些實施方式中，提供了含有單室和多室預填充注射器的套組。
本發明涉及以下項目：
項目1.一種抗體構建體，其包含與靶細胞表面上的CLDN18.2(較佳的是具有SEQ ID NO：1)結合的第一結構域和與T細胞表面上的CD3結合的第二結構域。
項目2.根據項目1所述的抗體構建體，其中該第一結構域與CLDN18.2的第一細胞外環(環1)結合，該環較佳的是具有SEQ ID NO：2。
項目3.根據項目1或2所述的抗體構建體，其包含˙與靶細胞表面上的CLDN18.2結合的第一結構域，以及˙與T細胞表面上的人CD3結合的第二結構域，其中該第一結構域與如下抗體或抗體構建體一樣結合相同的CLDN18.2表位，該抗體或抗體構建體包含如下結構域，該結構域與靶細胞表面上的CLDN18.2結合並且包含：a)VH區以及VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：121中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：122中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：123中所描述的CDR-H3，該VL區包含如SEQ ID NO：124中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：125中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：126中所描述的CDR-L3；b)VH區以及VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：133中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：134中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：135中所描述的CDR-H3，該VL區包含如SEQ ID NO：136中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：137中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：138中所描述的CDR-L3；c)如SEQ ID NO：127中所描述的VH區，以及如SEQ ID NO：128中所描述的VL區；或 d)如SEQ ID NO：139中所描述的VH區，以及如SEQ ID NO：140中所描述的VL區。
項目4.根據前述項目中任一項所述的抗體構建體，其中該抗體構建體與包含如下結構域的抗體或抗體構建體競爭結合，該結構域與靶細胞表面上的CLDN18.2結合並且包含：a)VH區以及VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：121中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：122中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：123中所描述的CDR-H3，該VL區包含如SEQ ID NO：124中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：125中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：126中所描述的CDR-L3；b)VH區以及VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：133中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：134中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：135中所描述的CDR-H3，該VL區包含如SEQ ID NO：136中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：137中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：138中所描述的CDR-L3；c)如SEQ ID NO：127中所描述的VH區，以及如SEQ ID NO：128中所描述的VL區；或d)如SEQ ID NO：139中所描述的VH區，以及如SEQ ID NO：140中所描述的VL區。
項目5.根據前述項目中任一項所述的抗體構建體，其中該抗體構建體的第一結構域結合在靶細胞表面上的具有如SEQ ID NO：22中所描述的胺基酸序列的CLDN18.2突變體，並且視需要還結合在靶細胞表面上的具有如SEQ ID NO：24中所描述的胺基酸序列的CLDN18.2突變體，但不結合在靶細胞表面上的具有如SEQ ID NO：23中所描述的胺基酸序列的CLDN18.2突變體；
項目6.根據前述項目中任一項所述的抗體構建體，其中該抗體構建體的第一結構域結合在靶細胞表面上的具有如SEQ ID NO：14中所描述的胺基酸序列的CLDN18.2突變體和/或在靶細胞表面上的具有胺基酸序列SEQ ID NO 15的CLDN18.2突變體，並且視需要還結合在靶細胞表面上的具有選自以下群組的胺基酸序列中的一個或多個CLDN18.2突變體，該組由SEQ ID NO：11、12、13、16、17、19、20和21中所描述的那些胺基酸序列組成，但不結合在靶細胞表面上的具有如SEQ ID NO：18中所描述的胺基酸序列的CLDN18.2突變體；
項目7.根據前述項目中任一項所述的抗體構建體，其中該抗體構建體的第一結構域結合在靶細胞表面上的人CLDN18.2，其中在人CLDN18.2的位置56處的Glu(E)對於該第一結構域的結合係必需的，並且在人CLDN18.2的位置42處的Ala(A)和/或位置45處的Asn(N)對於該第一結構域的結合不是必需的；和/或
項目8.根據前述項目中任一項所述的抗體構建體，其中該抗體構建體的第一結構域結合CLDN18.2的表位，該表位包含如SEQ ID NO：266中所描述的胺基酸序列，但不包含如SEQ ID NO：265中所描述的胺基酸序列，並且視需要還不包含如SEQ ID NO：267中所描述的胺基酸序列。
項目9.根據前述項目中任一項所述的抗體構建體，其中該第二結構域結合人CD3ε和普通狨或松鼠猴CD3ε。
項目10. 根據前述項目中任一項所述的抗體構建體，其中a)該抗體構建體、該第一結構域和/或該第二結構域係人的或人源化的，b)該抗體構建體係單鏈抗體構建體，c)該第一結構域處於scFv的形式，d)該第二結構域處於scFv的形式， e)該第一結構域和該第二結構域經由連接子、較佳的是肽連接子、更較佳的是甘胺酸/絲胺酸連接子連接，和/或f)該抗體構建體包含提供延長的血清半衰期的結構域，如基於Fc的結構域。
項目11. 根據前述項目中任一項所述的抗體構建體，其中該第一結構域不結合或不顯著結合CLDN18.1、CLDN1、CLDN2、CLDN3、CLDN4、CLDN6和/或CLDN9。
項目12 根據前述項目中任一項所述的抗體構建體，其中a)該第一結構域對CLDN18.2(例如hu CLDN18.2)的親和力為
Figure 108127615-A0305-02-0114-867
100nM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-868
90nM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-869
80nM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-870
70nM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-871
60nM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-872
50nM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-873
40nM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-874
30nM或
Figure 108127615-A0305-02-0114-875
20nM，如較佳的是在基於細胞的測定如Scatchard測定中測量的；b)該第二結構域對CD3(例如hu CD3，例如hu CD3ε)的親和力為
Figure 108127615-A0305-02-0114-876
100nM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-877
90nM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-878
80nM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-879
70nM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-880
60nM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-881
50nM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-882
40nM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-883
30nM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-884
20nM或
Figure 108127615-A0305-02-0114-885
10nM，如較佳的是在表面電漿共振測定如Biacore測定中測量的；和/或c)該抗體構建體的EC50值為
Figure 108127615-A0305-02-0114-886
500pM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-887
400pM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-888
300pM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-889
280pM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-890
260pM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-891
250pM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-892
240pM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-893
220pM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-894
200pM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-895
180pM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-896
160pM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-897
150pM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-898
140pM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-899
120pM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-900
100pM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-901
90pM、
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80pM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-903
70pM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-904
60pM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-905
50pM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-906
40pM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-907
30pM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-908
20pM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-909
15pM、
Figure 108127615-A0305-02-0114-910
10pM或
Figure 108127615-A0305-02-0114-911
5pM，如較佳的是在用CLDN18.2陽性靶細胞(如SNU-601、SNU-620或CLDN18.2轉染的CHO細胞)和刺激的富集的(人)CD8陽性T細胞或未刺激的(人)外周血單核細胞作為效應細胞進行的細胞毒性測定中測量的。
項目13. 根據前述項目中任一項所述的抗體構建體，其中該第一結構域包含含有選自以下群組的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH區和含有選自以下群組的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL區，該群組由以下組成：a)如SEQ ID NO：121中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：122中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：123中所描述的CDR-H3，如SEQ ID NO：124中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：125中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：126中所描述的CDR-L3；以及b)如SEQ ID NO：133中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：134中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：135中所描述的CDR-H3，以及如SEQ ID NO：136中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：137中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：138中所描述的CDR-L3。
項目14. 根據前述項目中任一項所述的抗體構建體，其中該第一結構域包含具有如SEQ ID NO：127或SEQ ID NO：139中所描述的胺基酸序列的VH區。
項目15. 根據前述項目中的一項所述的抗體構建體，其中該第一結構域包含具有如SEQ ID NO：128或SEQ ID NO：140中所描述的胺基酸序列的VL區。
項目16. 根據前述項目中的一項所述的抗體構建體，其中該第一結構域包含VH區和VL區，該VH區和VL區具有如SEQ ID NO：127+128或SEQ ID NO：139+140中所描述的胺基酸序列。
項目17. 根據前述項目中的一項所述的抗體構建體，其中該第一結構域包含具有如SEQ ID NO：129或SEQ ID NO：141中所描述的胺基酸序列的多肽。
項目18. 根據前述項目中的一項所述的抗體構建體，其包含如下多肽或由其組成，該多肽具有選自在SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：144中所描述的那些胺基酸序列的組的胺基酸序列。
項目19. 一種多核苷酸，其編碼如前述項目中任一項所定義的抗體構建體。
項目20. 一種載體，其包含如項目19中所定義的多核苷酸。
項目21. 一種宿主細胞，其用如項目19中所定義的多核苷酸或如項目20中所定義的載體轉化或轉染。
項目22. 用於產生如項目1至18中任一項所定義的抗體構建體的方法，所述方法包括在允許所述抗體構建體表現的條件下培養如項目21中所定義的宿主細胞並從培養物中回收所產生的抗體構建體。
項目23. 一種藥物組成物，其包含如項目1至18中任一項所定義的或根據項目22的方法產生的抗體構建體。
項目24. 根據項目1至18中任一項所述的或根據項目22的方法產生的抗體構建體，用於在預防、治療或緩解疾病、較佳的是腫瘤、更較佳的是CLDN18.2陽性腫瘤中使用。
項目25. 根據項目24所述的抗體構建體，其中該疾病或腫瘤選自由以下組成之群組：胃腸癌、卵巢癌和肺癌。
項目26. 根據項目25所述的抗體構建體，其中該胃腸癌選自由以下組成之群組：胃癌、食管癌、胃食管癌、胰髒癌和結直腸癌。
項目27. 一種套組，其包含如項目1至18中任一項所定義的抗體構建體、根據項目22的方法產生的抗體構建體、如項目19中所定義的多核苷酸、如項目20中所定義的載體、和/或如項目21中所定義的宿主細胞。
項目28. 如項目23所述的藥物組成物或如項目27所述的套組，該藥物組成物或套組進一步包含與該免疫檢查點途徑的蛋白質(如PD-1或CTLA-4)或與共刺激免疫檢查點受體(如4-1BB)結合的藥劑(較佳的是抗體或抗體構建體)。
項目29. 如項目23或28所述的藥物組成物或如項目27或28所述的套組，用於治療用途，較佳的是用於在預防、治療或緩解疾病、較佳的是腫瘤、更較佳的是CLDN18.2陽性腫瘤中使用。
＊＊＊＊＊
應指出的是，除非上下文另有明確指明，否則單數形式「一種(a)」、「一種(an)」和「該」包括複數指示物。因此，例如，對「一種試劑」的提及包括此類不同試劑中的一種或多種，並且對「該方法」的提及包括提及熟悉該項技術者已知的可以修改或取代本文所述的方法的等效步驟和方法。
除非另外指明，否則在一系列元素前面的術語「至少」應被理解為指該系列中的每一個元素。熟悉該項技術者僅使用常規實驗就將認識到或能夠確定本文所述的本發明的具體實施方式的許多等效物。此類等效物旨在由本發明所涵蓋。
術語「和/或」在本文使用時包括「和」、「或」和「由所述術語連接的要素的全部或任何其他組合」的含義。
如本文使用的，術語「約」或「大約」係指在給定值或範圍的±20%內、較佳的是±15%內、更較佳的是±10%內、並且最較佳的是±5%內。它還包括具體值，例如，「約50」包括值「50」。
貫穿本說明書和申請專利範圍，除非上下文另有要求，否則字詞「包含(comprise)」以及變型諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」應當被理解成隱含包括所陳述的整體或步驟或者整體或步驟的組，但不排除任何其他整體或步驟或者整體或步驟的組。當在本文中使用時，術語「包含(comprising)」可以用術語「含有」或「包括(including)」來取代，或者有時在本文中使用時用術語「具有」取代。
如本文使用的「由......組成」排除了在申請專利範圍要素中未指定的任何要素、步驟或成分。如本文使用的，「基本上由......組成」並不排除不實質性地影響申請專利範圍的基本和新穎特徵的材料或步驟。
在本文的每種情況下，術語「包含」、「基本上由......組成」和「由......組成」中的任一者都可以用另外兩個術語中的任一者來替環。
應當理解，以上描述和以下實例提供了示例性的佈置，但是本發明不限於本文描述的特定方法、技術、方案、材料、試劑、物質等，並且因此可以變化。本文使用的術語僅用於描述特定實施方式的目的，而不打算限制僅由申請專利範圍限定的本發明的範圍。在獨立申請專利範圍中提供了本發明的各個方面。在從屬申請專利範圍中提供了本發明的一些可選特性。
本說明書全文中引用的所有出版物和專利(包括所有專利、專利申請、科學出版物、製造商的說明書、說明書等)，無論是上文還是下文，均據此藉由引用整體併入。本文沒有任何內容應解釋為承認本發明無權由於先前 發明而早於該等揭露內容。藉由引用併入的材料在一定程度上與本說明書發生衝突或不一致時，本說明書將替代任何此類材料。
將從以下實例中獲得對本發明及其優點的更好理解，該等實例僅用於說明目的。該等實例不旨在並且不應被解釋為以任何方式限制本發明的範圍。
實例1
產生表現CLDN18.2突變的CHO細胞
出於表位定位的目的，將CLDN18.2的E1(細胞外環1；ECL1，SEQ ID NO：2)分成四個亞結構域(E1A、E1B、E1C和E1D)，並且將E2(細胞外環2；ECL2，SEQ ID NO：3)分成兩個亞結構域(E2A和E2B)。將人CLDN18.2(E1、E1A、E1B、E1C、E1D、E2、E2A和E2B)的各自表位區(環/結構域或亞結構域)的胺基酸序列交換為人CLDN6的對應序列，除了以下兩個例外(參見圖1和2)：E2被交換為來源於人CLDN9的序列；並且在具有突變的E1C的構建體(將CLDN18.2 E1C交換為對應的CLDN6區)中，CLDN18.2的E2也被交換為來源於人CLDN9的序列。後者用作檢測CLDN18.2/CLDN6-嵌合體的表現的手段。經由FACS分析驗證了CHO細胞中所有嵌合構建體的表現(參見下文)。由於沒有E1和E1A嵌合構建體表現的證據，因此該等構建體不用於表位定位分析。因此，產生了以下構建體並將其用於表位定位：CLDN18.2-E1B(CLDN6)→SEQ ID NO：22
CLDN18.2-E1C(CLDN6)-E2(CLDN9)→SEQ ID NO：23
CLDN18.2-E1D(CLDN6)→SEQ ID NO：24
CLDN18.2-E2(CLDN9)→SEQ ID NO：25
CLDN18.2-E2A(CLDN6)→SEQ ID NO：26
CLDN18.2-E2B(CLDN6)→SEQ ID NO：27
人CLDN18.2-ECL2和人CLDN18.1-ECL2的胺基酸序列相同，但在細胞外環1內，CLDN18.2和CLDN18.1在八個位置(29、37、42、45、47、56、65和69)上不同。因此，產生了另外的CLDN18.2突變體並在CHO細胞中表現，其中這八個CLDN18.2位置「P1」至「P8」單獨地或按兩個或三個位置一組被它們各自的CLDN18.1對應物交換。因此產生了以下構建體：CLDN18.2-P1-CLDN18.1(Q29M突變)→SEQ ID NO：11
CLDN18.2-P2-CLDN18.1(N37D突變)→SEQ ID NO：12
CLDN18.2-P1/P2-CLDN18.1(Q29M/N37D突變)→SEQ ID NO：13
CLDN18.2-P3-CLDN18.1(A42S突變)→SEQ ID NO：14
CLDN18.2-P4-CLDN18.1(N45Q突變)→SEQ ID NO：15
CLDN18.2-P5-CLDN18.1(Q47E突變)→SEQ ID NO：16
CLDN18.2-P3/P4/P5-CLDN18.1(A42S/N45Q/Q47E突變)→SEQ ID NO：17
CLDN18.2-P6-CLDN18.1(E56Q突變)→SEQ ID NO：18
CLDN18.2-P7-CLDN18.1(G65P突變)→SEQ ID NO：19
CLDN18.2-P8-CLDN18.1(L69I突變)→SEQ ID NO：20
CLDN18.2-P7/P8-CLDN18.1(G65P/L69I突變)→SEQ ID NO：21
為了產生表現上述構建體的CHO細胞，以及產生作為對照的表現hu-CLDN18.2、hu-CLDN18.1、hu-CLDN6和hu-CLDN9(SEQ ID NO：1、4、9和10)的CHO細胞，將各自的編碼序列選殖到命名為pEF-DHFR的質體中(pEF-DHFR描述於Raum等人Cancer Immunol Immunother[癌症免疫學免疫治療]50(2001)141-150中)。所有選殖程序均按照標準方案進行(Sambrook,Molecular Cloning；A Laboratory Manual[分子選殖：實驗室手冊]，第3版，Cold Spring Harbour Laboratory Press[冷泉港實驗室出版社]，Cold Spring Harbour,New York[紐約冷泉港](2001))。對於每種構建體，將相應的質體轉染到DHFR缺陷的CHO細胞中用於真核表現，如由Kaufman R.J.(1990)Methods Enzymol.[酶學方法]185,537-566所述。
分別使用以5μg/ml濃度的針對CLDN18.2(內部製造的單株抗hu CLDN18.2抗體)、CLDN18.1(內部製造的單株抗hu CLDN18.1抗體)、CLDN6(R&D小鼠抗人CLDN6單株抗體MAB3656)和CLDN9(大鼠抗人CLDN9單株抗體ABIN1720917)的抗體，在FACS測定中驗證上述構建體在CHO細胞上的表現。作為陰性對照，將細胞與代替第一抗體的同種型對照抗體(BD 553454/R&D MAB0041/R&D MAB0061)一起孵育。用第二抗小鼠/抗大鼠/抗人IgG Fc-γ-PE(傑克遜免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)115-116-071/112-116-071/109-116-098)檢測結合的單株抗體。藉由流動式細胞術測量該等樣本。
實例2
抗CLDN18.2抗體構建體的表位定位
將用實例1中所描述的構建體轉染的CHO細胞用濃度為20μg/ml的純化的CLDN18.2xCD3抗體構建體染色。用抗人IgG Fc-γ-PE(傑克遜免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)；1：100)檢測結合的抗體構建體。將所有抗體在PBS/2% FCS中稀釋。作為陰性對照，將細胞與PBS/2% FCS一起孵育，隨後與抗人IgG Fc-γ-PE一起孵育。藉由流動式細胞術測量該等樣本。
表位定位分析的結果顯示在圖3和4中。當觀察到表現某種CLDN18.2嵌合體或突變的細胞喪失FACS訊號時，假定各自的CLDN18.2xCD3抗體構建體結合表位(環/結構域/亞結構域)或結合在該CLDN18.2嵌合或突變分子中被交換的特定胺基酸。換句話說，該表位區域或胺基酸係結合被分析的 CLDN18.2xCD3抗體構建體所必需的。除了用於證明各自靶標的正確表現的對照抗體外，還在表位定位分析中特異性地測試了以下CLDN18.2xCD3抗體構建體：CL-1 x I2C-scFc(SEQ ID NO：132)
CL-2 x I2C-scFc(SEQ ID NO：144)
CL-3 x I2C-scFc(SEQ ID NO：149)
CL-4 x I2C-scFc(SEQ ID NO：154)
雖然CL-1 x I2C-scFc和CL-2 x I2C-scFc係根據本發明的抗體構建體，但是CL-3 x I2C-scFc和CL-4 x I2C-scFc具有抗CLDN18.2 VH和VL區(分別被揭露為WO 2014/075788的SEQ ID NO：8+15和SEQ ID NO：6+11)。
如圖4所示，CL-3 x I2C-scFc抗體構建體明顯需要位置P3(A42)、P4(N45)和P6(E56)來進行其與CLDN18.2的特異性結合。位置P4位於命名為E1B的亞結構域內，並且位置P6位於命名為E1C的亞結構域內。因此並且同樣地，該等亞結構域與CLDN6對應序列的交換導致FACS訊號喪失。觀察到這三個位置對於CL-3 x I2C-scFc與CLDN18.2的結合係相關的，證實了先前公佈的結果。以CL-4 x I2C-scFc命名的抗體構建體具有非常相似的結合模式(參見圖4)。
相比之下，CL-1 x I2C-scFc和CL-2 x I2C-scFc兩種抗體構建體明顯需要位置P6(E56)來進行其與CLDN18.2的特異性結合。但是，其他位置(特別是P3和P4)的交換似乎對CL-1 x I2C-scFc或CL-2 x I2C-scFc與CLDN18.2的結合沒有任何影響。與該觀察結果一致，亞結構域E1C(位置P6位於其中)與CLDN6對應序列的交換-但不是E1B或E1D的交換-導致FACS訊號喪失。因此，圖4中所描繪的表位定位結果顯示CL-1 x I2C-scFc和CL-2 x I2C-scFc結合CLDN18.2的ECL1內的相同表位，並且該表位不同於CL-3 x I2C-scFc和CL-4 x I2C-scFc的表位。
實例3
基於Biacore確定對人和食蟹猴CD3和FcRn的親和力
使用重組人/獼猴CD3-ECD(ECD=細胞外結構域)融合蛋白與雞白蛋白進行Biacore分析實驗，以確定本發明的抗體構建體的靶標結合。
詳細地，根據製造商的手冊，使用pH 4.5的乙酸鹽緩衝液，用大約600-800RU的相應重組抗原固定CM5感測器晶片(GE醫療集團(GE Healthcare))。按以下濃度的稀釋系列載入CLDN18.2xCD3抗體構建體：在HBS-EP運行緩衝液(GE醫療集團)中稀釋的50nM、25nM、12.5nM、6.25nM和3.13nM。流速為30μl/min，持續3min，然後再次以30μl/ml的流速應用HBS-EP運行緩衝液8min至20min。使用10mM甘胺酸10mM NaCl pH 1.5溶液進行晶片的再生。使用BiaEval軟體分析數據集。通常，進行兩次獨立實驗。
根據本發明的CLDN18.2xCD3抗體構建體顯示出對納莫耳範圍內的人CD3的高親和力。使與獼猴CD3的結合平衡，也顯示出在相似範圍內的親和力。在表2中顯示了親和力值以及計算的親和力差距。
Figure 108127615-A0305-02-0125-2
同樣，對於命名為CL-1 x I2C-scFc、CL-2 x I2C-scFc、CL-3 x I2C-scFc和CL-4 x I2C-scFc的構建體，經由Biacore測定證實了對人和食蟹猴FcRn的平衡結合。
實例4
對靶抗原陽性細胞上的人和獼猴CLDN18.2的親和力的基於Scatchard的分析
藉由Scatchard分析確定了CLDN18.2xCD3抗體構建體對用人或獼猴CLDN18.2轉染的CHO細胞的親和力。對於該分析，使用單價檢測系統進行飽和結合實驗，以精確確定CLDN18.2xCD3抗體構建體與相應細胞系的單價結合。
將重組表現人CLDN18.2的CHO細胞系的2 x 104個細胞各自與相應抗體構建體的50μl的起始於100-200nM的稀釋系列(以1：2進行的十二個稀釋液)一起孵育(直至達到飽和)，隨後是在攪拌下在4℃下孵育16h和一個殘餘物洗滌步驟。然後，將細胞與30μl的Alexa FluorTM 488-軛合的(conjugated)AffiniPureTM Fab片段山羊抗人IgG(H+L)溶液一起孵育另一小時。在一個洗滌步驟之後，將細胞重懸於含有3.5%甲醛的150μl FACS緩衝液中，再孵育15min，離心，重懸於FACS緩衝液中並經由FACS軟體進行分析。數據產生自兩組獨立的實驗，每組使用一式三份。計算各自的一個位點特異性結合評價以外推最大結合(Bmax)。確定在半數最大結合處的抗體構建體的濃度，反映各自的KD。將一式三份測量的值繪製為雙曲線和S形曲線，以展示從最小到最佳結合的適當濃度範圍。
表3中描述的值源自於每個抗體構建體的兩個獨立實驗。基於細胞的Scatchard分析證實，本發明的CLDN18.2xCD3抗體構建體對人CLDN18.2的親和力為納莫耳級的，並且由於人和獼猴細胞外結構域的序列同一性，呈現的食蟹猴/人種間親和力差距為1。
[表3]：如在基於細胞的Scatchard分析中確定的CLDN18.2xCD3抗體構建體對CLDN18.2的親和力(KD)。在兩個獨立的實驗中測量了抗體構建體，每個實 驗使用稀釋系列。*人和食蟹猴CLDN18.2在細胞外結構域中共用相同的胺基酸序列。因此，按照定義親和力差距等於「1」
Figure 108127615-A0305-02-0127-661
在相同條件下進行的單獨Scatchard測定中，在相同條件下測量CL-2 x I2C-scFc對於人CLDN18.2的基於細胞的親和力為11.13±2.72。
實例5
確認與CLDN18.2和人/食蟹猴CD3表現細胞的結合
為了確認與人CLDN18.2和CD3以及與食蟹猴CD3的結合，藉由流動式細胞術使用以下細胞測試了本發明的抗體構建體：˙用人CLDN18.2轉染的CHO細胞，˙表現CD3的人T細胞白血病細胞系HPB-all(德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)，布倫瑞克(Braunschweig)，ACC483)，以及˙表現食蟹猴CD3的T細胞系LnPx 4119
對於流動式細胞術，將各自細胞系的200,000個細胞在4℃下與濃度為5μg/ml的純化抗體構建體一起孵育60min。在洗滌之後，用山羊抗人Fc-γ-PE(1：100)在4℃下檢測具有Fc結構域的結合抗體構建體持續30min。用對CD3結合部分具有特異性的內部製造的小鼠抗體、隨後用山羊抗小鼠Fc-γ-PE(1：100)在4℃下檢測具有his標籤的抗體構建體持續30min。藉由流動式細胞術測量樣本。將未轉染的CHO細胞用作陰性對照。
將結果顯示於圖5中。本發明的CLDN18.2xCD3抗體構建體將用人CLDN18.2轉染的CHO細胞染色。抗體構建體還識別表現CD3的人和食蟹猴T細 胞系。未轉染的CHO細胞沒有染色，並且CLDN18.2轉染的CHO細胞沒有被陰性對照抗EGFRvIII xI2C-scFc抗體構建體染色。
實例6
確認不存在與人CLDN18.2旁系同源物的結合
將人CLDN18.2旁系同源物CLDN18.1、CLDN1、CLDN2、CLDN3、CLDN4、CLDN6和CLDN9穩定轉染到CHO細胞中。如在本實例中使用的旁系同源物的序列描述於SEQ ID NO：4-10中。在FACS分析中使用對各個旁系同源物具有特異性的抗體證實了蛋白質表現：CLDN1：大鼠抗人(5μg/ml最終)儲液：100μg/ml R&D，MAB4618
CLDN2：內部製造的小鼠Ab(1：100-200)
CLDN3：小鼠抗人(5μg/ml最終)儲液：500μg/ml R&D，MAB4620
CLDN4：小鼠抗人(5μg/ml最終)儲液：500μg/ml R&D，MAB4219
CLDN6：小鼠抗人(5μg/ml最終)儲液：500μg/ml R&D，MAB3656
CLDN9：大鼠抗人(5μg/ml最終)儲液：2mg/ml，antibodies-online.com，ABIN1720917
CLDN18.1：內部製造的單株小鼠Ab(5μg/ml最終)
將轉染的CHO細胞與濃度為5μg/ml的各自的抗體(參見上文)在4℃下孵育60min，隨後與相應的PE軛合的抗體山羊抗小鼠IgG,Fc-γ片段PE軛合的(1：100)(傑克遜公司(Jackson)115-116-071)或山羊抗大鼠IgG,Fc-γ片段PE軛合的(1：100)(傑克遜公司(Jackson)112-116-071)在4℃下孵育30min。
如實例5中所描述的進行流動式細胞術測定。將結果顯示於圖6中。分析證實，在該測定中測試的本發明的CLDN18.2xCD3抗體構建體不與人CLDN18.2旁系同源物交叉反應。
實例7
細胞毒性活性
在不同的體外細胞毒性測定中分析了本發明的CLDN18.2xCD3抗體構建體在針對表現CLDN18.2的靶細胞將效應T細胞重定向方面的效力：
˙在48小時基於FACS的細胞毒性測定中測量了CLDN18.2xCD3抗體構建體在針對人CLDN18.2轉染的CHO細胞將刺激的人CD8+效應T細胞重定向方面的效力。
˙在48小時基於FACS的細胞毒性測定中測量了CLDN18.2xCD3抗體構建體在針對人CLDN18.2轉染的CHO細胞將獼猴T細胞系重定向方面的效力。
˙在48小時基於FACS的細胞毒性測定中測量了CLDN18.2xCD3抗體構建體在針對人CLDN18.2轉染的CHO細胞(以及使用人CLDN18.1轉染的CHO細胞的陰性對照)將在未刺激的人PBMC中的T細胞重定向方面的效力。
˙在48小時基於FACS的細胞毒性測定中測量了CLDN18.2xCD3抗體構建體在針對CLDN18.2陽性人胃癌細胞系如SNU-601或SNU-620將在未刺激的人PBMC中的T細胞重定向方面的效力。
實例7.1
用刺激的人T細胞進行的鉻釋放測定
如下獲得富集CD8+ T細胞的刺激的T細胞：將皮氏培養皿(直徑145mm)用終濃度為1μg/ml的可商購的抗CD3特異性抗體(OKT3，強生公司(Orthoclone))在37℃下包被1小時。藉由用PBS的一個洗滌步驟除去未結合的蛋白質。將3-5 x 107個人PBMC添加到在含有穩定的麩醯胺酸/10% FCS/20U/ml IL-2的120ml RPMI 1640中預包被的皮氏培養皿中並刺激2天。在第三天，將細胞收集並用RPMI 1640洗滌一次。將IL-2添加至終濃度為20U/ml，並將細胞在與 上述相同的細胞培養基中再次培養一天。根據製造商的方案，使用Dynal-Beads藉由耗盡CD4+ T細胞和CD56+ NK細胞來富集CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。
將人CLDN18.2轉染的CHO靶細胞用PBS洗滌兩次，並在具有50% FCS的100μl RPMI終體積中用11.1 MBq 51Cr在37℃下標記60分鐘。隨後，用5ml RPMI將標記的靶細胞洗滌3次，並且然後用於細胞毒性測定中。在96孔板中在200μl補充RPMI的總體積中按10：1的E：T比進行該測定。使用起始濃度為0.01-1μg/ml的純化抗體構建體及其三倍稀釋液。該測定的孵育時間為18小時。細胞毒性被確定為在上清液中釋放的鉻相對於最大裂解(添加Triton-X)和自發裂解(沒有效應細胞)的差異的相對值。所有測量均以一式四份進行。在γ計數器中進行上清液中鉻活性的測量。使用適當的軟體對結果進行分析。將藉由分析程式從S形劑量響應曲線計算的EC50值用於比較細胞毒性活性。
實例7.2
用未刺激的人PBMC進行的基於FACS的細胞毒性測定
效應細胞的分離
藉由Ficoll密度梯度離心從富集的淋巴細胞製劑(血沈棕黃層)中製備人外周血單核細胞(PBMC)。在采血當天製備PBMC。在Ficoll密度離心和用達爾伯克氏PBS進行大量洗滌之後，經由與紅血球裂解緩衝液(155mM NH4Cl、10mM KHCO3、100μM EDTA)一起孵育，從PBMC中除去剩餘的紅血球。在100 x g下離心PBMC後，經由上清液除去血小板。剩餘的淋巴細胞主要包括B淋巴細胞、T淋巴細胞、NK細胞和單核細胞。將PBMC在含有10% FCS的RPMI培養基中於37℃/5% CO2下保持培養。
CD14 + 和CD56 + 細胞的耗盡
為了耗盡CD14+細胞，使用人CD14 MicroBeads(美天旎生物技術有限公司(Miltenyi Biotec)，MACS，#130-050-201)。為了耗盡NK細胞，使用人CD56 MicroBeads(美天旎生物技術有限公司，MACS，#130-050-401)。對PBMC計數並將其在室溫下以300xg離心10min。棄去上清液，並將細胞沈澱重懸於MACS分離緩衝液(80μl/107個細胞；PBS、0.5%(v/v)FBS、2mM EDTA)中。添加CD14 MicroBeads和CD56 MicroBeads(20μl/107個細胞)並在4℃-8℃下孵育15min。用MACS分離緩衝液(1-2ml/107個細胞)洗滌細胞。在離心(參見上文)之後，棄去上清液並將細胞重懸於MACS分離緩衝液(500μl/108個細胞)中。然後使用LS柱(美天旎生物技術有限公司，#130-042-401)分離CD14/CD56陰性細胞。將沒有CD14+/CD56+細胞的PBMC在培養箱中在RPMI完全培養基(即補充有10% FBS、1x非必需胺基酸、10mM Hepes緩衝液、1mM丙酮酸鈉和100U/ml青黴素/鏈黴素的RPMI1640)中在37℃下培養直至需要時。
靶細胞標記
為了在流動式細胞術測定中分析細胞裂解，將螢光膜染料DiOC18(DiO)(分子探針公司(Molecular Probes))用於標記靶細胞(如人CLDN18.2轉染的CHO細胞)並將它們與效應細胞區分開。簡言之，將細胞收穫，用PBS洗滌一次，並在含有2%(v/v)FBS和膜染料DiO(5μl/106個細胞)的PBS中調節至106個細胞/ml。在37℃下孵育3min之後，將細胞在完全RPMI培養基中洗滌兩次，並將細胞數目調節至1.25 x 105個細胞/ml。使用0.5%(v/v)等滲EosinG溶液確定細胞的活力。
基於流動式細胞術的分析
設計該測定以在CLDN18.2xCD3抗體構建體的連續稀釋液的存在下定量靶細胞(如人CLDN18.2轉染的CHO細胞)的裂解。將等體積的DiO標記 的靶細胞和效應細胞(即，沒有CD14+細胞的PBMC)混合，得到10：1的E：T細胞比。將160μl該懸浮液轉移到96孔板的每個孔中。添加40μl待分析的CLDN18.2xCD3抗體構建體系列稀釋液(以及可能的話，識別無關靶抗原的陰性對照抗體構建體如基於抗CD3(I2C)的雙特異性抗體構建體)或RPMI完全培養基作為另外的陰性對照。抗體構建體介導的細胞毒性反應在7% CO2加濕培養箱中進行48小時。然後將細胞轉移到新的96孔板中，並且藉由添加終濃度為1μg/ml的碘化丙啶(PI)監測靶細胞膜完整性的喪失。PI係通常被排除在活細胞之外的膜不可透過染料，然而死細胞則藉由螢光發射將其吸收並變得可鑒定。
在FACSCanto II儀器上藉由流動式細胞術測量樣本，並藉由FACSDiva軟體(均來自BD公司(Becton Dickinson))進行分析。將靶細胞鑒定為DiO陽性細胞。PI陰性靶細胞被分類為活的靶細胞。細胞毒性的百分比根據下式計算：
Figure 108127615-A0305-02-0132-4
n=事件數
使用Prism軟體(圖板軟體公司(GraphPad Software Inc.))，將細胞毒性的百分比相對於相應的抗體構建體濃度繪圖。使用四個參數邏輯回歸模型來分析劑量反應曲線，用於評價具有固定坡面的S形劑量反應曲線，並計算EC50值。
實例7.3
針對靶細胞將未刺激的人PBMC重定向的效力
在基於FACS的48h細胞毒性測定中，使用未刺激的人PBMC(CD14陰性/CD56陰性)作為效應細胞和使用以下作為靶細胞按10：1的E：T比分析CLDN18.2xCD3抗體構建體的細胞毒性活性：(1)用人CLDN18.2轉染的CHO細胞， (2)用人CLDN18.1轉染的CHO細胞，以及(3)天然表現細胞系SNU-601和SNU-620。
如上文實例7.2中所描述的進行該測定。將細胞毒性測定的結果顯示在表4中。
Figure 108127615-A0305-02-0133-5
該測定證明，本發明的抗體構建體對用CLDN18.2旁系同源物CLDN18.1轉染的CHO細胞沒有表現出顯著的不希望的細胞毒性活性(以灰色突出顯示的行)。在命名為「CL-1 x I2C-6His」的構建體的情況下，CLDN18.2-CHO的EC50值與CLDN18.1-CHO的EC50值之間的因子幾乎為4.000。此外，在命名為「CL-1 x I2C-scFc」的構建體的情況下，CLDN18.2-CHO的EC50值與CLDN18.1-CHO的EC50值之間的因子幾乎為20.000。
通常，與具有較低靶標表現率的靶細胞相比，當使用在細胞表面上表現較高的CLDN18.2水平的靶細胞時，預期EC50值較低。因此，通常觀察到，並且在本測定中證明，與使用天然表現物相比，用CLDN18.2轉染的CHO細胞的使用傾向於導致較低的EC50值。
實例7.4
針對天然表現靶細胞將人PBMC重定向的效力
將本發明的CLDN18.2xCD3抗體構建體的細胞毒性活性與結合CLDN18.2靶標(CL-3和CL-4，參見實例2)內的不同表位的其他CLDN18.2xCD3抗體構建體進行比較。將穩定表現內源水平的CLDN18.2的癌症細胞系(GSU、NUGC、IM95、SNU620、SNU601)和CLDN18.2陰性對照細胞系AGS用螢光素酶(Luc)穩定標記。此外，穩定轉染CHO細胞以過表現CLDN18.2。將兩個人T細胞供體用作效應細胞的來源。細胞毒性測定的E：T比為10：1。抗體構建體的1：3系列滴定開始於30nM的濃度。將測定在37℃下孵育48h。對於Luc標記的細胞，藉由螢光素酶測定系統ONE-GloTM(普洛麥格公司(Promega))進行細胞毒性讀數，並且對於CLDN18.2轉染的CHO細胞，藉由發光細胞活力測定CellTiter-GloTM(普洛麥格公司)進行細胞毒性讀數。
除了抗CLDN18.2 VH和VL區的序列外，抗體構建體CL-3和CL-4與在本實例的細胞毒性測定中分析的本發明的抗體構建體相同。在，兩種抗體構建體CL-3和CL-4的VH和VL區分別被揭露為WO 2014/075788中的SEQ ID NO：8+15和SEQ ID NO：6+11。還參見如本文所揭露的SEQ ID NO：145+146和SEQ ID NO：150+151。
將結果顯示在下表5和圖7中。不考慮靶細胞，顯示本發明的抗體構建體(此處：CL-1、CL-2)具有比結合不同CLDN18.2表位的抗體構建體(CL-3、CL-4)顯著更高的細胞毒性效力。雖然本發明的抗體構建體顯示在2位數皮莫耳範圍內的EC50值，但比較構建體顯示在三位數至5位數皮莫耳範圍內的EC50值。沒有一種構建體顯示出對靶標陰性細胞系的任何活性(數據未顯示)。
Figure 108127615-A0305-02-0135-6
為了排除該等觀察結果係由於與對照構建體(此處：CL-3)相比，本發明的抗體構建體(此處：CL-1、CL-2)具有顯著更高的親和力，使用用hu Cldn18.2轉染的CHO細胞進行基於細胞的親和力測定。表明，三種測試構建體CL-1、CL-2和CL-3的親和力處於非常相似的範圍內。這意味著對於本發明的抗體構建體所展示的有利的表位/活性關係不是由於對照構建體僅具有較低的親和力並因此表現出較低的細胞毒性活性。相反，效力似乎係因為由本發明的抗體構建體識別的CLDN18.2內的特定表位。
實例7.5
針對表現CLDN18.2的CHO細胞將獼猴T細胞重定向的效力
在48h基於FACS的細胞毒性測定中使用用人CLDN18.2轉染的CHO細胞作為靶細胞和獼猴T細胞系4119LnPx(Knappe等人Blood[血液]95：3256-61(2000))作為效應細胞來源按10：1的E：T比分析CLDN18.2xCD3抗體構建體的細胞毒性活性。注意，人和食蟹猴CLDN18.2在細胞外結構域中共用相同的胺基酸序列。如上文實例7.2中所描述的進行轉染的CHO細胞的靶細胞標記和基於流動式細胞術的細胞毒性活性分析。
將結果顯示在表6中。藉由根據本發明的CLDN18.2xCD3抗體構建體誘導來自細胞系4119LnPx的獼猴T細胞，以有效殺死CLDN18.2轉染的CHO細 胞。在該測定中，抗體構建體有效地呈現1位數至2位數皮莫耳EC50值，證實它們在獼猴系統中非常有活性。
Figure 108127615-A0305-02-0136-7
實例8
在(i)三次冷凍/解凍循環和(ii)在37℃下孵育7天之後單體向二聚體的轉化
使CLDN18.2xCD3單體抗體構建體經受不同的脅迫條件，隨後進行高性能SEC，以確定已轉化為二聚體抗體構建體的初始單體抗體構建體的百分比。
(i)用通用配製緩衝液將25μg單體抗體構建體調節至250μg/ml的濃度，並且然後在-80℃下冷凍30min，隨後在室溫下解凍30min。在三次冷凍/解凍循環之後，藉由HP-SEC確定二聚體含量。
(ii)用通用配製緩衝液將25μg單體抗體構建體調節至250μg/ml的濃度，隨後在37℃下孵育7天。藉由HP-SEC確定二聚體含量。
將基於高性能(HP)二氧化矽的尺寸排阻液相層析(SEC)柱連接到配備有自動進樣器的FPLC。柱平衡和運行緩衝液由調節至pH 6.6的100mM KH2PO4-200mM Na2SO4組成。將抗體構建體溶液(25μg蛋白質)應用於平衡的柱上，並且在7MPa的最大壓力下以0.75ml/min的流速進行洗脫。在280、254和210nm光學吸光度下監測整個運行。藉由軟體運行評價表中記錄的210nm訊 號的峰積分進行分析。藉由將二聚體峰的面積除以單體加二聚體峰的總面積來計算二聚體含量。
將結果顯示於下表7中。分析的CLDN18.2xCD3抗體構建體在三次冷凍/解凍循環之後呈現0.0%的二聚體百分比，並且在37℃下孵育7天之後呈現
Figure 108127615-A0305-02-0137-912
2%的二聚體百分比。
Figure 108127615-A0305-02-0137-8
實例9
熱穩定性
如下確定抗體聚集溫度：將濃度為250μg/ml的40μl抗體構建體溶液轉移到一次性比色杯中並置於動態光散射裝置中。將樣本以0.5℃/min的加熱速率從40℃加熱至70℃，恒定獲取測量的半徑。藉由隨DLS裝置遞送的套裝軟體使用指示蛋白質和聚集物熔融的半徑增加來計算抗體構建體的聚集溫度。
顯示抗體構建體CL-1 x I2C-scFc具有
Figure 108127615-A0305-02-0137-913
51℃(更具體地51.7℃)的有益聚集溫度。在單獨的分析中，顯示命名為CL-1 x I2C-6His的分子的聚集溫度具有
Figure 108127615-A0305-02-0137-914
45℃(更具體地49.7℃)的值。
實例10
在單體抗體構建體濃度為2.5mg/ml下的濁度
將濃度為250μg/ml的1ml純化抗體構建體溶液藉由自旋濃縮單元(spin concentration unit)濃縮至2500μg/ml。在5℃下儲存16h之後，溶液的濁度藉由針對通用配製緩衝液的OD340nm光學吸收測量來確定。
抗體構建體CL-1 x I2C-scFc顯示具有
Figure 108127615-A0305-02-0138-915
0.021的非常有利的濁度，而CL-1 x I2C-6His顯示具有
Figure 108127615-A0305-02-0138-916
0.029的非常有利的濁度。在三次冷凍/解凍循環之後的類似濁度測量導致CL-1 x I2C-scFc的濁度為0.021。
實例11
藉由高解析度陽離子交換層析分析蛋白質同質性
藉由高解析度陽離子交換層析(CIEX)分析本發明的抗體構建體的蛋白質同質性。
在一個測定中，用50ml結合緩衝液A(20mM磷酸二氫鈉、30mM NaCl、0.01%辛酸鈉，pH 5.5)稀釋50μg抗體構建體單體，並將40ml該溶液應用於連接到FPLC設備的1ml BioPro SP-F柱(YMC公司，德國)。在樣本結合之後，用另外的結合緩衝液進行洗滌步驟。對於蛋白質洗脫，在10個柱體積內應用使用緩衝液B(20mM磷酸二氫鈉、1000mM NaCl、0.01%辛酸鈉，pH 5.5)至50%百分比的緩衝液B的線性遞增鹽梯度。在280、254和210nm光學吸光度下監測整個運行。藉由軟體運行評價表中記錄的280nm訊號的峰積分進行分析。在該測定中，命名為「CL-1 x I2C-6His」的分子(SEQ ID NO：131)的同質性顯示具有82.5%的值。
在另一個測定中，將Bio SCX分析型CIEX柱(安捷倫公司(Agilent)，德國法蘭克福(Frankfurt,Germany))連接至UPLC設備(沃特斯公司(Waters)，德國埃施波恩(Eschborn,Germany))，並用由50mM MES(pH 5.6)、0.05%疊氮化鈉組成的緩衝液A(結合緩衝液)平衡。將10μg抗體 構建體單體應用於柱並與柱基質結合。在樣本結合之後，用另外的結合緩衝液B進行洗滌步驟。對於蛋白質洗脫，應用使用由50mM MES、1000mM氯化鈉pH 5.6、0.05%疊氮化鈉組成的緩衝液B至50%百分比的緩衝液B的線性遞增鹽梯度。在280nm光學吸光度下監測整個運行。藉由軟體運行評價表中記錄的280nm訊號的峰積分進行分析。在該測定中，命名為「CL-1 x I2C-scFc」的分子(SEQ ID NO：132)顯示具有97.6%的同質性(主峰的曲線下面積(=AUC))。
實例12
如藉由HIC丁基測量的表面疏水性
在疏水性相互作用層析HIC中在流通模式中測試抗體構建體CL-1 x I2C-scFc和CL-1 x I2C-6His的表面疏水性。
將50μg單體抗體構建體用通用配製緩衝液稀釋至終體積500μl(10mM檸檬酸、75mM離胺酸HCl、4%海藻糖，pH 7.0)並應用於連接至Äkta淨化器FPLC系統的1ml丁基瓊脂糖凝膠FF柱上。在280、254和210nm光學吸光度下監測整個運行。藉由Äkta Unicorn軟體運行評價表中記錄的280nm訊號的峰積分進行分析。藉由比較蛋白質訊號的上升和下降的面積和速度來評價洗脫行為，從而表明抗體構建體與基質的相互作用的強度。
抗體構建體具有良好的洗脫行為，其快速且完整。
實例13
CLDN18.2xCD3抗體構建體在NOD/SCID小鼠的GSU-luc晚期胃癌模型中的功效評價
在雌性NOD/SCID小鼠模型中測試了具有SEQ ID NO：132的CLDN18.2xCD3抗體構建體(CL-1 x I2C-scFc)的抗腫瘤活性，該小鼠在第1天用5x106個GSU-luc(螢光素酶)細胞皮下注射。在第8天腹膜內注射2x107個效應 細胞(體外擴增和激活的人CD3+ T細胞)。治療發生在第12天、第19天和第26天(Q7Dx3)。將兩個對照組(一個沒有T細胞(第1組)、另一個具有T細胞(第2組))用0.1ml/投與的運載體(25mM L-離胺酸、0.002%(w/v)聚山梨醇酯80於0.9%(w/v)氯化鈉pH 7.0中)藉由靜脈推注注射進行治療。將抗體構建體以1mg/kg/投與的濃度在0.1ml的終體積中藉由靜脈推注注射投與(第3組)。每組的小鼠數目為5隻(第1組)、10隻(第2組)和10隻(第3組)。
在研究期間藉由卡尺測量腫瘤並且藉由腫瘤體積(TV)的組間比較評價進展。藉由將腫瘤體積計算為T/C(%)=100 x(分析組的中值TV)/(對照組的中值TV)來確定第x天的腫瘤生長抑制T/C[%]，並且將計算的值描述在表8中。
Figure 108127615-A0305-02-0140-9
此外，將結果顯示在圖8中。在本發明的晚期腫瘤分析中，在NOD/SCID小鼠模型中顯示出顯著的腫瘤生長抑制。此外，用CLDN18.2xCD3抗體構建體治療對小鼠的體重沒有影響(數據未顯示)。
實例14
CLDN18.2xCD3抗體構建體在雌性無胸腺裸鼠的SNU620-luc腫瘤形成異種移植模型中的抗腫瘤活性的評價
在雌性無胸腺裸鼠模型中測試了具有SEQ ID NO：132的CLDN18.2xCD3抗體構建體(CL-1 x I2C-scFc)的抗腫瘤活性，該小鼠在第1天用在50%基質膠中的SNU620-luc(5 x 106個靶細胞)/PBMC(2.5 x 106個效應細胞)混合物皮下注射。第1-4組的治療發生在第3天、第10天和第17天(Q7D)。將接受腫瘤/PBMC混合物(第1組)的對照組用運載體(25mM L-離胺酸、0.002%(w/v)聚山梨醇酯80於0.9%(w/v)氯化鈉pH 7.0中)以0.1ml/投與藉由靜脈推注注射投與。將抗體構建體以1mg/kg/投與(第2組)、0.1mg/kg/投與(第3組)和0.01mg/kg/投與(第4組)的濃度以0.1ml的體積藉由靜脈內推注注射投與。每組的小鼠數目為10隻。
在研究期間藉由卡尺測量腫瘤並且藉由腫瘤體積(TV)的組間比較評價進展。藉由將腫瘤體積計算為T/C(%)=100 x(分析組的中值TV)/(對照組的中值TV)來確定第x天的腫瘤生長抑制T/C[%]，並且將計算的值描述在表9中。
Figure 108127615-A0305-02-0141-10
此外，將結果顯示在圖9中。使用所有測試濃度的CLDN18.2xCD3抗體構建體在無胸腺裸鼠模型中顯示顯著的腫瘤生長抑制。此外，用CLDN18.2xCD3抗體構建體治療對小鼠的體重沒有影響(數據未顯示)。
實例15
食蟹猴探索性毒理學研究
使用CLDN18.2xCD3抗體構建體CL-1 x I2C-6His(SEQ ID NO：131)藉由靜脈內投與進行探索性NHP耐受性研究。在25μg/kg/天的起始劑量(約20x人EC90)之後達到的全身暴露耐受性良好。劑量遞增至125μg/kg/天(約120x人EC90)導致從靶向CLDN18.2的T細胞接合抗體構建體預期的臨床和組織病理學效應。
實例16
體外組合療法研究
用CL-1xI2C-scFc治療激活人T細胞，導致T細胞上PD-1的上調(數據未顯示)。該治療還可能導致腫瘤細胞上PD-L1的上調。將CLDN18.2陽性的GSU和NUG-C4胃癌細胞系工程化以過表現PD-L1。在不存在或存在抗PD-1抗體的情況下，將細胞與CL-1xI2C-scFc和與激活的人T細胞一起孵育，該抗PD-1抗體具有如SEQ ID NO：360中所描述的重鏈胺基酸序列和如SEQ ID NO：361中所描述的輕鏈胺基酸序列。在孵育24h之後評估細胞毒性。將結果顯示在下表10中。
Figure 108127615-A0305-02-0142-11
該測定證明，添加抗PD-1抗體增加了本發明的CD3xCLDN18.2抗體構建體的功效。
實例17
小鼠中的組合療法研究
使用人/鼠嵌合CD3ε敲入小鼠模型，評價抗體/抗體構建體的治療組合潛在地增強如本文所述的雙特異性抗體構建體的功效。產生雙特異性單鏈抗人CD3(「I2C」scFv)x抗小鼠CLDN18.2(scFv)-scFc替代抗體構建體。該分子在體外展示了針對小鼠CLDN18.2表現細胞的有效活性。然後在遺傳修飾的免疫活性小鼠模型(人/鼠嵌合CD3ε敲入)中測試該分子與抗小鼠PD-1、抗小鼠CTLA4和抗小鼠4-1BB(CD137)抗體組合對抗CLDN18.2陽性皮下植入腫瘤(B16F10 muCLDN18.2同源模型)的抗腫瘤活性。根據研究設計，在第10天將具有約50-100mm3的腫瘤體積的小鼠隨機化。在每組中包括10隻小鼠。在第11天和第18天投與(iv.)CD3xCLDN18.2抗體構建體(150μg/kg)或對照(抗CD3 x抗EGFRvIII，150μg/kg)雙特異性抗體構建體(iv)，並且在第11天、第14天、第17天和第20天投與抗體(抗PD-1 100μg；抗4-1BB 150μg；抗CTLA4 300μg；抗體同種型作為對照)。在第10天、第13天、第17天、第20天和第25天(終末收穫，所有組)測量腫瘤體積。
所有三種抗體都增強了雙特異性構建體的功效。激動性抗4-1BB單株抗體證明沒有針對CLDN18.2陽性腫瘤的單一藥劑活性。具體地，將在第25天的腫瘤生長抑制(TGI)確定如下：對照雙特異性抗體構建體+抗體同種型→0%(標準)
對照雙特異性抗體構建體+抗4-1BB ab→不顯著
對照雙特異性抗體構建體+抗CTLA-4 ab→21%
CD3xCLDN18.2抗體構建體+抗體同種型→36%
對照雙特異性抗體構建體+抗PD-1 ab→57%
CD3xCLDN18.2抗體構建體+抗CTLA-4 ab→76%
CD3xCLDN18.2抗體構建體+抗4-1BB ab→77%
CD3xCLDN18.2抗體構建體+抗PD-1 ab→79%
[圖1]
人CLDN18.1和CLDN18.2胺基酸序列的比對。突出顯示第一和第二細胞外結構域(=細胞外環)，以及CLDN18.1與CLDN18.2之間不同的胺基酸位置。在細胞外環1內，CLDN18.2與CLDN18.1在8個位置處不同。還參見實例1。
[圖2]
該圖描繪了為實例2的表位定位分析產生的CLDN18.2構建體(嵌合體/點突變)。它還顯示了人CLDN18.1環1與人CLDN18.2環1之間的序列比對，並突出顯示了這兩個分子不同的八個位置P1-P8。還參見實例1。
[圖3]
表位定位分析的結果，參見實例2。該圖顯示了未轉染的CHO細胞以及用hu CLDN18.1、hu CLDN18.2、hu CLDN6和hu CLDN9轉染的CHO細胞(左側)的FACS分析。在右側，該圖顯示了用三種不同的嵌合hu CLDN18.2構建體轉染的CHO細胞的FACS分析：將整個環2(ECL2，E2)的胺基酸序列交換為來源於人CLDN9的序列，並且將區域E2A和E2B交換為人CLDN6的對應序列。以5μg/ml的濃度測試所有抗體/抗體構建體。
[圖4]
表位定位分析的結果，參見實例2。該圖顯示了未轉染的CHO細胞以及用hu CLDN18.1、hu CLDN18.2、hu CLDN6和hu CLDN9轉染的CHO細胞的FACS分析。此外，該圖顯示了用在指定位置P1-P8處具有一個、兩個或三個點突變的十一種不同的hu CLDN18.2構建體轉染的CHO細胞的FACS分析(有關進一步的細節，還參見實例1)，以及用四種不同的嵌合hu CLDN18.2構建體轉染的CHO細胞：將整個環2(ECL2，E2)的胺基酸序列交換為來源於人CLDN9的序列，並且將區域E1B、E1D和E1C交換為人CLDN6的對應序列(有關進一步的細節，還參見實例1)。以5μg/ml的濃度測試所有單特異性抗體，而以20μg/ml的濃度測試CD3xCLDN18.2雙特異性抗體構建體。
第1行：內部製造的α-hu CLDN-18.1
第2行：內部製造的α-hu CLDN-18.2
第3行：α-hu CLDN-6(R&D；MAB3656)
第4行：α-hu CLDN-9(ABIN1720917)
第5行：CL-1xI2C-scFc
第6行：CL-2xI2C-scFc
第7行：CL-4xI2C-scFc
第8行：CL-3xI2C-scFc
[圖5]
實例5中描述的FACS測定的結果。
[圖6]
實例6中描述的FACS測定的結果。
[圖7]
實例7.4中描述的基於FACS的細胞毒性測定的結果。在測試的所有六種細胞系(五種天然表現細胞系和用hu CLDN18.2轉染的CHO細胞)中，與結合不同的CLDN18.2表位的對照構建體(CL-3和CL-4)相比，本發明的抗體構建體(CL-1和CL-2)顯示出顯著更高的EC50值。
[圖8]
CLDN18.2xCD3抗體構建體的抗腫瘤活性(平均腫瘤體積與平均值的標準誤差(SEM))。參見實例13。
[圖9]
CLDN18.2xCD3抗體構建體的抗腫瘤形成活性(平均腫瘤體積與平均值的標準誤差(SEM))。參見實例14。
＊＊＊＊＊
<110> 德商安美基研究(慕尼黑)公司(Amgen Research(Munich)GmbH) 美商安進公司(Amgen Inc.)
<120> 針對CLDN18.2和CD3之抗體構建體
<130> A-2279-US-PSP
<140> TW 108127615
<141> 2019-08-02
<150> US 62/714,366
<151> 2018-08-03
<160> 371
<170> PatentOn版本3.5
<210> 1
<211> 261
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 1
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<210> 2
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<213> 智人(Homo Sapiens)
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<213> 智人(Homo Sapiens)
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<213> 智人(Homo Sapiens)
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<213> 智人(Homo Sapiens)
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<213> 智人(Homo Sapiens)
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<213> 人工序列
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<223> 合成的多肽
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<213> 人工序列
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<223> 合成的多肽
<400> 32
Figure 108127615-A0305-02-0179-71
<210> 33
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 33
Figure 108127615-A0305-02-0179-72
<210> 34
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 34
Figure 108127615-A0305-02-0180-75
<210> 35
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 35
Figure 108127615-A0305-02-0180-76
Figure 108127615-A0305-02-0181-77
<210> 36
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 36
Figure 108127615-A0305-02-0181-78
Figure 108127615-A0305-02-0182-79
<210> 37
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 37
Figure 108127615-A0305-02-0182-80
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 38
Figure 108127615-A0305-02-0183-81
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 39
Figure 108127615-A0305-02-0183-82
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 40
Figure 108127615-A0305-02-0183-84
<210> 41
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 41
Figure 108127615-A0305-02-0183-83
<210> 42
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 42
Figure 108127615-A0305-02-0184-85
<210> 43
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 43
Figure 108127615-A0305-02-0184-86
<210> 44
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 44
Figure 108127615-A0305-02-0185-87
<210> 45
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 45
Figure 108127615-A0305-02-0185-88
Figure 108127615-A0305-02-0186-89
<210> 46
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 46
Figure 108127615-A0305-02-0187-90
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 47
Figure 108127615-A0305-02-0187-91
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 48
Figure 108127615-A0305-02-0187-92
<210> 49
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 49
Figure 108127615-A0305-02-0187-93
<210> 50
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 50
Figure 108127615-A0305-02-0188-96
<210> 51
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 51
Figure 108127615-A0305-02-0188-95
<210> 52
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 52
Figure 108127615-A0305-02-0188-94
Figure 108127615-A0305-02-0189-97
<210> 53
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 53
Figure 108127615-A0305-02-0189-98
<210> 54
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 54
Figure 108127615-A0305-02-0190-99
Figure 108127615-A0305-02-0191-100
<210> 55
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 55
Figure 108127615-A0305-02-0191-101
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 56
Figure 108127615-A0305-02-0191-102
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 57
Figure 108127615-A0305-02-0191-103
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 58
Figure 108127615-A0305-02-0192-107
<210> 59
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 59
Figure 108127615-A0305-02-0192-106
<210> 60
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 60
Figure 108127615-A0305-02-0192-105
<210> 61
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 61
Figure 108127615-A0305-02-0192-104
Figure 108127615-A0305-02-0193-108
<210> 62
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 62
Figure 108127615-A0305-02-0193-109
Figure 108127615-A0305-02-0194-110
<210> 63
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 63
Figure 108127615-A0305-02-0194-111
Figure 108127615-A0305-02-0195-112
<210> 64
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 64
Figure 108127615-A0305-02-0195-113
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 65
Figure 108127615-A0305-02-0195-114
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 66
Figure 108127615-A0305-02-0196-118
<210> 67
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 67
Figure 108127615-A0305-02-0196-117
<210> 68
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 68
Figure 108127615-A0305-02-0196-116
<210> 69
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 69
Figure 108127615-A0305-02-0196-115
<210> 70
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 70
Figure 108127615-A0305-02-0197-119
<210> 71
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 71
Figure 108127615-A0305-02-0197-120
Figure 108127615-A0305-02-0198-121
<210> 72
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 72
Figure 108127615-A0305-02-0198-122
Figure 108127615-A0305-02-0199-123
<210> 73
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 73
Figure 108127615-A0305-02-0199-124
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 74
Figure 108127615-A0305-02-0200-128
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 75
Figure 108127615-A0305-02-0200-127
<210> 76
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 76
Figure 108127615-A0305-02-0200-126
<210> 77
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 77
Figure 108127615-A0305-02-0200-125
<210> 78
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 78
Figure 108127615-A0305-02-0201-129
<210> 79
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 79
Figure 108127615-A0305-02-0201-130
<210> 80
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 80
Figure 108127615-A0305-02-0202-131
<210> 81
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 81
Figure 108127615-A0305-02-0202-132
Figure 108127615-A0305-02-0203-133
<210> 82
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 82
Figure 108127615-A0305-02-0204-134
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 83
Figure 108127615-A0305-02-0204-135
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 84
Figure 108127615-A0305-02-0204-136
<210> 85
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 85
Figure 108127615-A0305-02-0204-137
<210> 86
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 86
Figure 108127615-A0305-02-0205-138
<210> 87
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 87
Figure 108127615-A0305-02-0205-140
<210> 88
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 88
Figure 108127615-A0305-02-0205-139
Figure 108127615-A0305-02-0206-141
<210> 89
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 89
Figure 108127615-A0305-02-0206-142
<210> 90
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 90
Figure 108127615-A0305-02-0206-145
Figure 108127615-A0305-02-0207-146
Figure 108127615-A0305-02-0208-147
<210> 91
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 91
Figure 108127615-A0305-02-0208-148
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 92
Figure 108127615-A0305-02-0208-151
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 93
Figure 108127615-A0305-02-0208-149
<210> 94
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 94
Figure 108127615-A0305-02-0209-152
<210> 95
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 95
Figure 108127615-A0305-02-0209-153
<210> 96
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 96
Figure 108127615-A0305-02-0209-154
<210> 97
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 97
Figure 108127615-A0305-02-0209-155
Figure 108127615-A0305-02-0210-156
<210> 98
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 98
Figure 108127615-A0305-02-0210-157
Figure 108127615-A0305-02-0211-158
<210> 99
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 99
Figure 108127615-A0305-02-0211-159
Figure 108127615-A0305-02-0212-160
<210> 100
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 100
Figure 108127615-A0305-02-0212-161
<210> 101
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 101
Figure 108127615-A0305-02-0212-162
<210> 102
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 102
Figure 108127615-A0305-02-0213-166
<210> 103
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 103
Figure 108127615-A0305-02-0213-165
<210> 104
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 104
Figure 108127615-A0305-02-0213-164
<210> 105
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 105
Figure 108127615-A0305-02-0213-163
<210> 106
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 106
Figure 108127615-A0305-02-0214-167
<210> 107
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 107
Figure 108127615-A0305-02-0214-168
Figure 108127615-A0305-02-0215-169
<210> 108
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 108
Figure 108127615-A0305-02-0215-171
Figure 108127615-A0305-02-0216-172
<210> 109
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 109
Figure 108127615-A0305-02-0216-173
<210> 110
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 110
Figure 108127615-A0305-02-0217-175
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 111
Figure 108127615-A0305-02-0217-176
<210> 112
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 112
Figure 108127615-A0305-02-0217-178
<210> 113
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 113
Figure 108127615-A0305-02-0217-177
<210> 114
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 114
Figure 108127615-A0305-02-0218-180
<210> 115
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 115
Figure 108127615-A0305-02-0218-179
<210> 116
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 116
Figure 108127615-A0305-02-0219-181
<210> 117
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 117
Figure 108127615-A0305-02-0219-182
Figure 108127615-A0305-02-0220-183
<210> 118
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 118
Figure 108127615-A0305-02-0221-184
<210> 119
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 119
Figure 108127615-A0305-02-0221-185
Figure 108127615-A0305-02-0222-186
<210> 120
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 120
Figure 108127615-A0305-02-0222-187
Figure 108127615-A0305-02-0223-188
<210> 121
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 121
Figure 108127615-A0305-02-0223-189
<210> 122
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 122
Figure 108127615-A0305-02-0223-190
Figure 108127615-A0305-02-0224-191
<210> 123
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 123
Figure 108127615-A0305-02-0224-192
<210> 124
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 124
Figure 108127615-A0305-02-0224-193
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 125
Figure 108127615-A0305-02-0224-194
<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 126
Figure 108127615-A0305-02-0225-196
<210> 127
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 127
Figure 108127615-A0305-02-0225-195
<210> 128
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 128
Figure 108127615-A0305-02-0226-197
<210> 129
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 129
Figure 108127615-A0305-02-0226-198
Figure 108127615-A0305-02-0227-199
<210> 130
<211> 502
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 130
Figure 108127615-A0305-02-0227-200
Figure 108127615-A0305-02-0228-201
Figure 108127615-A0305-02-0229-202
Figure 108127615-A0305-02-0230-203
<210> 131
<211> 508
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 131
Figure 108127615-A0305-02-0230-204
Figure 108127615-A0305-02-0231-205
Figure 108127615-A0305-02-0232-206
<210> 132
<211> 990
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 132
Figure 108127615-A0305-02-0232-207
Figure 108127615-A0305-02-0233-208
Figure 108127615-A0305-02-0234-209
Figure 108127615-A0305-02-0235-210
Figure 108127615-A0305-02-0236-211
Figure 108127615-A0305-02-0237-212
<210> 133
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 133
Figure 108127615-A0305-02-0237-215
<210> 134
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 134
Figure 108127615-A0305-02-0237-213
<210> 135
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 135
Figure 108127615-A0305-02-0237-214
<210> 136
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 136
Figure 108127615-A0305-02-0238-217
<210> 137
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 137
Figure 108127615-A0305-02-0238-218
<210> 138
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 138
Figure 108127615-A0305-02-0238-220
<210> 139
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 139
Figure 108127615-A0305-02-0238-216
Figure 108127615-A0305-02-0239-221
<210> 140
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 140
Figure 108127615-A0305-02-0239-222
Figure 108127615-A0305-02-0240-223
<210> 141
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 141
Figure 108127615-A0305-02-0240-224
Figure 108127615-A0305-02-0241-225
<210> 142
<211> 502
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 142
Figure 108127615-A0305-02-0241-226
Figure 108127615-A0305-02-0242-227
Figure 108127615-A0305-02-0243-228
<210> 143
<211> 508
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 143
Figure 108127615-A0305-02-0244-229
Figure 108127615-A0305-02-0245-230
Figure 108127615-A0305-02-0246-231
<210> 144
<211> 990
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 144
Figure 108127615-A0305-02-0246-232
Figure 108127615-A0305-02-0247-233
Figure 108127615-A0305-02-0248-234
Figure 108127615-A0305-02-0249-235
Figure 108127615-A0305-02-0250-236
<210> 145
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 145
Figure 108127615-A0305-02-0250-237
Figure 108127615-A0305-02-0251-238
<210> 146
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 146
Figure 108127615-A0305-02-0251-239
Figure 108127615-A0305-02-0252-240
<210> 147
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 147
Figure 108127615-A0305-02-0252-241
Figure 108127615-A0305-02-0253-242
<210> 148
<211> 501
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 148
Figure 108127615-A0305-02-0253-243
Figure 108127615-A0305-02-0254-244
Figure 108127615-A0305-02-0255-245
<210> 149
<211> 989
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 149
Figure 108127615-A0305-02-0256-246
Figure 108127615-A0305-02-0257-247
Figure 108127615-A0305-02-0258-248
Figure 108127615-A0305-02-0259-249
Figure 108127615-A0305-02-0260-250
<210> 150
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 150
Figure 108127615-A0305-02-0260-251
Figure 108127615-A0305-02-0261-252
<210> 151
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 151
Figure 108127615-A0305-02-0261-253
<210> 152
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 152
Figure 108127615-A0305-02-0262-923
Figure 108127615-A0305-02-0263-255
<210> 153
<211> 501
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 153
Figure 108127615-A0305-02-0263-256
Figure 108127615-A0305-02-0264-257
Figure 108127615-A0305-02-0265-258
<210> 154
<211> 989
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 154
Figure 108127615-A0305-02-0265-259
Figure 108127615-A0305-02-0266-260
Figure 108127615-A0305-02-0267-261
Figure 108127615-A0305-02-0268-262
Figure 108127615-A0305-02-0269-263
Figure 108127615-A0305-02-0270-264
<210> 155
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 155
Figure 108127615-A0305-02-0270-265
<210> 156
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 156
Figure 108127615-A0305-02-0270-266
<210> 157
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 157
Figure 108127615-A0305-02-0270-267
<210> 158
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 158
Figure 108127615-A0305-02-0271-271
<210> 159
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 159
Figure 108127615-A0305-02-0271-270
<210> 160
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 160
Figure 108127615-A0305-02-0271-269
<210> 161
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 161
Figure 108127615-A0305-02-0271-268
<210> 162
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 162
Figure 108127615-A0305-02-0272-272
<210> 163
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 163
Figure 108127615-A0305-02-0272-273
<210> 164
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 164
Figure 108127615-A0305-02-0272-274
<210> 165
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 165
Figure 108127615-A0305-02-0272-917
Figure 108127615-A0305-02-0273-279
<210> 166
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 166
Figure 108127615-A0305-02-0273-278
<210> 167
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 167
Figure 108127615-A0305-02-0273-277
<210> 168
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 168
Figure 108127615-A0305-02-0273-276
Figure 108127615-A0305-02-0274-280
<210> 169
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 169
Figure 108127615-A0305-02-0274-283
<210> 170
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 170
Figure 108127615-A0305-02-0274-281
<210> 171
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可以是任何天然存在的胺基酸
<400> 171
Figure 108127615-A0305-02-0274-282
<210> 172
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 172
Figure 108127615-A0305-02-0275-287
<210> 173
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 173
Figure 108127615-A0305-02-0275-286
<210> 174
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 174
Figure 108127615-A0305-02-0275-285
<210> 175
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 175
Figure 108127615-A0305-02-0275-284
<210> 176
<211> 585
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 176
Figure 108127615-A0305-02-0276-288
Figure 108127615-A0305-02-0277-289
Figure 108127615-A0305-02-0278-290
<210> 177
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 177
Figure 108127615-A0305-02-0278-291
Figure 108127615-A0305-02-0279-292
Figure 108127615-A0305-02-0280-293
Figure 108127615-A0305-02-0281-294
<210> 178
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 178
Figure 108127615-A0305-02-0281-296
Figure 108127615-A0305-02-0282-298
Figure 108127615-A0305-02-0283-299
Figure 108127615-A0305-02-0284-300
<210> 179
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 179
Figure 108127615-A0305-02-0284-301
Figure 108127615-A0305-02-0285-302
Figure 108127615-A0305-02-0286-303
<210> 180
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 180
Figure 108127615-A0305-02-0287-304
Figure 108127615-A0305-02-0288-305
Figure 108127615-A0305-02-0289-306
<210> 181
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 181
Figure 108127615-A0305-02-0289-307
Figure 108127615-A0305-02-0290-308
Figure 108127615-A0305-02-0291-309
Figure 108127615-A0305-02-0292-310
<210> 182
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 182
Figure 108127615-A0305-02-0292-311
Figure 108127615-A0305-02-0293-312
Figure 108127615-A0305-02-0294-313
Figure 108127615-A0305-02-0295-314
<210> 183
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 183
Figure 108127615-A0305-02-0295-315
Figure 108127615-A0305-02-0296-316
Figure 108127615-A0305-02-0297-317
Figure 108127615-A0305-02-0298-318
<210> 184
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 184
Figure 108127615-A0305-02-0298-319
Figure 108127615-A0305-02-0299-320
Figure 108127615-A0305-02-0300-321
<210> 185
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 185
Figure 108127615-A0305-02-0301-322
Figure 108127615-A0305-02-0302-323
Figure 108127615-A0305-02-0303-324
<210> 186
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 186
Figure 108127615-A0305-02-0303-325
Figure 108127615-A0305-02-0304-326
Figure 108127615-A0305-02-0305-327
Figure 108127615-A0305-02-0306-328
<210> 187
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 187
Figure 108127615-A0305-02-0306-329
Figure 108127615-A0305-02-0307-330
Figure 108127615-A0305-02-0308-331
Figure 108127615-A0305-02-0309-332
<210> 188
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 188
Figure 108127615-A0305-02-0309-924
Figure 108127615-A0305-02-0310-334
Figure 108127615-A0305-02-0311-335
<210> 189
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 189
Figure 108127615-A0305-02-0312-336
Figure 108127615-A0305-02-0313-337
Figure 108127615-A0305-02-0314-338
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<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 190
Figure 108127615-A0305-02-0314-339
Figure 108127615-A0305-02-0315-340
Figure 108127615-A0305-02-0316-341
Figure 108127615-A0305-02-0317-342
<210> 191
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 191
Figure 108127615-A0305-02-0317-343
Figure 108127615-A0305-02-0318-344
Figure 108127615-A0305-02-0319-925
Figure 108127615-A0305-02-0320-346
<210> 192
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 192
Figure 108127615-A0305-02-0320-347
Figure 108127615-A0305-02-0321-348
Figure 108127615-A0305-02-0322-349
<210> 193
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 193
Figure 108127615-A0305-02-0323-350
Figure 108127615-A0305-02-0324-351
Figure 108127615-A0305-02-0325-352
<210> 194
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 194
Figure 108127615-A0305-02-0325-353
Figure 108127615-A0305-02-0326-354
Figure 108127615-A0305-02-0327-355
Figure 108127615-A0305-02-0328-356
<210> 195
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 195
Figure 108127615-A0305-02-0328-357
Figure 108127615-A0305-02-0329-358
Figure 108127615-A0305-02-0330-359
Figure 108127615-A0305-02-0331-360
<210> 196
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 196
Figure 108127615-A0305-02-0331-361
Figure 108127615-A0305-02-0332-362
Figure 108127615-A0305-02-0333-918
Figure 108127615-A0305-02-0334-364
<210> 197
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 197
Figure 108127615-A0305-02-0334-365
Figure 108127615-A0305-02-0335-366
Figure 108127615-A0305-02-0336-367
<210> 198
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 198
Figure 108127615-A0305-02-0337-920
Figure 108127615-A0305-02-0338-369
Figure 108127615-A0305-02-0339-370
<210> 199
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 199
Figure 108127615-A0305-02-0339-921
Figure 108127615-A0305-02-0340-372
Figure 108127615-A0305-02-0341-373
Figure 108127615-A0305-02-0342-374
<210> 200
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 200
Figure 108127615-A0305-02-0342-375
Figure 108127615-A0305-02-0343-376
Figure 108127615-A0305-02-0344-377
Figure 108127615-A0305-02-0345-378
<210> 201
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 201
Figure 108127615-A0305-02-0345-379
Figure 108127615-A0305-02-0346-380
Figure 108127615-A0305-02-0347-381
<210> 202
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 202
Figure 108127615-A0305-02-0348-382
Figure 108127615-A0305-02-0349-922
Figure 108127615-A0305-02-0350-384
<210> 203
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 203
Figure 108127615-A0305-02-0350-385
Figure 108127615-A0305-02-0351-386
Figure 108127615-A0305-02-0352-387
Figure 108127615-A0305-02-0353-388
<210> 204
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 204
Figure 108127615-A0305-02-0353-389
Figure 108127615-A0305-02-0354-390
Figure 108127615-A0305-02-0355-391
Figure 108127615-A0305-02-0356-392
<210> 205
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 205
Figure 108127615-A0305-02-0356-393
Figure 108127615-A0305-02-0357-394
Figure 108127615-A0305-02-0358-395
Figure 108127615-A0305-02-0359-396
<210> 206
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 206
Figure 108127615-A0305-02-0359-397
Figure 108127615-A0305-02-0360-398
<210> 207
<211> 333
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 207
Figure 108127615-A0305-02-0360-399
Figure 108127615-A0305-02-0361-400
Figure 108127615-A0305-02-0362-401
<210> 208
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 208
Figure 108127615-A0305-02-0362-402
Figure 108127615-A0305-02-0363-403
<210> 209
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 209
Figure 108127615-A0305-02-0364-404
Figure 108127615-A0305-02-0365-405
<210> 210
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 210
Figure 108127615-A0305-02-0365-406
Figure 108127615-A0305-02-0366-407
<210> 211
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 211
Figure 108127615-A0305-02-0367-919
Figure 108127615-A0305-02-0368-409
<210> 212
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 212
Figure 108127615-A0305-02-0368-411
Figure 108127615-A0305-02-0369-412
<210> 213
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 213
Figure 108127615-A0305-02-0369-413
Figure 108127615-A0305-02-0370-414
<210> 214
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 214
Figure 108127615-A0305-02-0370-415
Figure 108127615-A0305-02-0371-416
<210> 215
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 215
Figure 108127615-A0305-02-0372-417
Figure 108127615-A0305-02-0373-418
<210> 216
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 216
Figure 108127615-A0305-02-0373-419
Figure 108127615-A0305-02-0374-420
<210> 217
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 217
Figure 108127615-A0305-02-0374-421
Figure 108127615-A0305-02-0375-422
<210> 218
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 218
Figure 108127615-A0305-02-0375-423
Figure 108127615-A0305-02-0376-424
<210> 219
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 219
Figure 108127615-A0305-02-0376-425
Figure 108127615-A0305-02-0377-426
<210> 220
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 220
Figure 108127615-A0305-02-0378-427
Figure 108127615-A0305-02-0379-428
<210> 221
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 221
Figure 108127615-A0305-02-0379-429
Figure 108127615-A0305-02-0380-430
<210> 222
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 222
Figure 108127615-A0305-02-0380-431
Figure 108127615-A0305-02-0381-432
<210> 223
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 223
Figure 108127615-A0305-02-0381-433
Figure 108127615-A0305-02-0382-434
<210> 224
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 224
Figure 108127615-A0305-02-0383-435
Figure 108127615-A0305-02-0384-436
<210> 225
<211> 484
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 225
Figure 108127615-A0305-02-0384-437
Figure 108127615-A0305-02-0385-438
Figure 108127615-A0305-02-0386-439
<210> 226
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 226
Figure 108127615-A0305-02-0386-440
Figure 108127615-A0305-02-0387-441
Figure 108127615-A0305-02-0388-442
<210> 227
<211> 484
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 227
Figure 108127615-A0305-02-0388-443
Figure 108127615-A0305-02-0389-444
Figure 108127615-A0305-02-0390-445
Figure 108127615-A0305-02-0391-446
<210> 228
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 228
Figure 108127615-A0305-02-0391-447
Figure 108127615-A0305-02-0392-448
Figure 108127615-A0305-02-0393-449
<210> 229
<211> 484
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 229
Figure 108127615-A0305-02-0393-450
Figure 108127615-A0305-02-0394-451
Figure 108127615-A0305-02-0395-452
<210> 230
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 230
Figure 108127615-A0305-02-0395-453
Figure 108127615-A0305-02-0396-454
Figure 108127615-A0305-02-0397-455
<210> 231
<211> 484
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 231
Figure 108127615-A0305-02-0398-456
Figure 108127615-A0305-02-0399-457
Figure 108127615-A0305-02-0400-458
<210> 232
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 232
Figure 108127615-A0305-02-0400-459
Figure 108127615-A0305-02-0401-460
Figure 108127615-A0305-02-0402-461
<210> 233
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 233
Figure 108127615-A0305-02-0402-462
Figure 108127615-A0305-02-0403-463
<210> 234
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 234
Figure 108127615-A0305-02-0403-464
<210> 235
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 235
Figure 108127615-A0305-02-0404-466
<210> 236
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 236
Figure 108127615-A0305-02-0404-465
Figure 108127615-A0305-02-0405-467
<210> 237
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 237
Figure 108127615-A0305-02-0405-468
Figure 108127615-A0305-02-0406-469
<210> 238
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 238
Figure 108127615-A0305-02-0406-470
<210> 239
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 239
Figure 108127615-A0305-02-0407-471
<210> 240
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 240
Figure 108127615-A0305-02-0407-472
Figure 108127615-A0305-02-0408-473
<210> 241
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 241
Figure 108127615-A0305-02-0408-474
<210> 242
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 242
Figure 108127615-A0305-02-0409-476
<210> 243
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 243
Figure 108127615-A0305-02-0409-475
Figure 108127615-A0305-02-0410-477
<210> 244
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 244
Figure 108127615-A0305-02-0410-478
Figure 108127615-A0305-02-0411-479
<210> 245
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 245
Figure 108127615-A0305-02-0411-480
<210> 246
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 246
Figure 108127615-A0305-02-0412-481
Figure 108127615-A0305-02-0413-482
<210> 247
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 247
Figure 108127615-A0305-02-0413-483
Figure 108127615-A0305-02-0414-484
<210> 248
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 248
Figure 108127615-A0305-02-0414-485
Figure 108127615-A0305-02-0415-486
<210> 249
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 249
Figure 108127615-A0305-02-0416-487
Figure 108127615-A0305-02-0417-488
<210> 250
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 250
Figure 108127615-A0305-02-0417-489
Figure 108127615-A0305-02-0418-490
<210> 251
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 251
Figure 108127615-A0305-02-0418-491
Figure 108127615-A0305-02-0419-492
<210> 252
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 252
Figure 108127615-A0305-02-0419-493
Figure 108127615-A0305-02-0420-494
Figure 108127615-A0305-02-0421-495
<210> 253
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 253
Figure 108127615-A0305-02-0421-496
Figure 108127615-A0305-02-0422-497
<210> 254
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 254
Figure 108127615-A0305-02-0422-498
Figure 108127615-A0305-02-0423-499
<210> 255
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 255
Figure 108127615-A0305-02-0423-500
Figure 108127615-A0305-02-0424-501
<210> 256
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 256
Figure 108127615-A0305-02-0425-504
<210> 257
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 257
Figure 108127615-A0305-02-0425-503
<210> 258
<211> 96
<212> PRT
<213> 普通狨(Callithrix jacchus)
<400> 258
Figure 108127615-A0305-02-0425-502
Figure 108127615-A0305-02-0426-505
<210> 259
<211> 27
<212> PRT
<213> 狨毛猴(Callithrix jacchus)
<400> 259
Figure 108127615-A0305-02-0426-506
<210> 260
<211> 96
<212> PRT
<213> 絨頂檉柳猴(Saguinus oedipus)
<400> 260
Figure 108127615-A0305-02-0426-508
Figure 108127615-A0305-02-0427-509
<210> 261
<211> 27
<212> PRT
<213> 絨頂檉柳猴(Saguinus oedipus)
<400> 261
Figure 108127615-A0305-02-0427-510
<210> 262
<211> 96
<212> PRT
<213> 松鼠猴(Saimiri sciureus)
<400> 262
Figure 108127615-A0305-02-0427-511
<210> 263
<211> 27
<212> PRT
<213> 松鼠猴(Saimiri sciureus)
<400> 263
Figure 108127615-A0305-02-0428-516
<210> 264
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 264
Figure 108127615-A0305-02-0428-515
<210> 265
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 265
Figure 108127615-A0305-02-0428-514
<210> 266
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 266
Figure 108127615-A0305-02-0428-513
<210> 267
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 267
Figure 108127615-A0305-02-0428-512
<210> 268
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 268
Figure 108127615-A0305-02-0429-517
<210> 269
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 269
Figure 108127615-A0305-02-0429-518
<210> 270
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 270
Figure 108127615-A0305-02-0429-519
<210> 271
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 271
Figure 108127615-A0305-02-0429-520
<210> 272
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 272
Figure 108127615-A0305-02-0430-524
<210> 273
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 273
Figure 108127615-A0305-02-0430-523
<210> 274
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 274
Figure 108127615-A0305-02-0430-522
<210> 275
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 275
Figure 108127615-A0305-02-0430-521
<210> 276
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 276
Figure 108127615-A0305-02-0431-529
<210> 277
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 277
Figure 108127615-A0305-02-0431-527
<210> 278
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 278
Figure 108127615-A0305-02-0431-526
<210> 279
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 279
Figure 108127615-A0305-02-0431-525
<210> 280
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 280
Figure 108127615-A0305-02-0432-530
<210> 281
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 281
Figure 108127615-A0305-02-0432-531
<210> 282
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 282
Figure 108127615-A0305-02-0432-532
<210> 283
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 283
Figure 108127615-A0305-02-0432-533
Figure 108127615-A0305-02-0433-534
<210> 284
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 284
Figure 108127615-A0305-02-0433-539
<210> 285
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 285
Figure 108127615-A0305-02-0433-538
<210> 286
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 286
Figure 108127615-A0305-02-0433-536
<210> 287
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 287
Figure 108127615-A0305-02-0433-535
<210> 288
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 288
Figure 108127615-A0305-02-0434-540
<210> 289
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 289
Figure 108127615-A0305-02-0434-541
<210> 290
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 290
Figure 108127615-A0305-02-0434-542
<210> 291
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 291
Figure 108127615-A0305-02-0434-543
<210> 292
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 292
Figure 108127615-A0305-02-0435-545
<210> 293
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 293
Figure 108127615-A0305-02-0435-546
<210> 294
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 294
Figure 108127615-A0305-02-0435-547
<210> 295
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 295
Figure 108127615-A0305-02-0435-548
Figure 108127615-A0305-02-0436-549
<210> 296
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 296
Figure 108127615-A0305-02-0436-551
<210> 297
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 297
Figure 108127615-A0305-02-0436-552
<210> 298
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 298
Figure 108127615-A0305-02-0436-553
Figure 108127615-A0305-02-0437-555
<210> 299
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 299
Figure 108127615-A0305-02-0437-554
<210> 300
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 300
Figure 108127615-A0305-02-0438-556
Figure 108127615-A0305-02-0439-557
Figure 108127615-A0305-02-0440-558
<210> 301
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 301
Figure 108127615-A0305-02-0440-559
Figure 108127615-A0305-02-0441-560
<210> 302
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 302
Figure 108127615-A0305-02-0441-562
<210> 303
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 303
Figure 108127615-A0305-02-0441-561
<210> 304
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 304
Figure 108127615-A0305-02-0442-563
<210> 305
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 305
Figure 108127615-A0305-02-0442-564
<210> 306
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 306
Figure 108127615-A0305-02-0442-565
<210> 307
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 307
Figure 108127615-A0305-02-0442-566
<210> 308
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 308
Figure 108127615-A0305-02-0443-568
<210> 309
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 309
Figure 108127615-A0305-02-0443-567
Figure 108127615-A0305-02-0444-569
<210> 310
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 310
Figure 108127615-A0305-02-0444-570
Figure 108127615-A0305-02-0445-571
Figure 108127615-A0305-02-0446-572
<210> 311
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 311
Figure 108127615-A0305-02-0446-573
Figure 108127615-A0305-02-0447-574
<210> 312
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 312
Figure 108127615-A0305-02-0448-578
<210> 313
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 313
Figure 108127615-A0305-02-0448-577
<210> 314
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 314
Figure 108127615-A0305-02-0448-576
<210> 315
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 315
Figure 108127615-A0305-02-0448-575
<210> 316
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 316
Figure 108127615-A0305-02-0449-579
<210> 317
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 317
Figure 108127615-A0305-02-0449-580
<210> 318
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 318
Figure 108127615-A0305-02-0449-581
Figure 108127615-A0305-02-0450-582
<210> 319
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 319
Figure 108127615-A0305-02-0450-583
<210> 320
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 320
Figure 108127615-A0305-02-0451-584
Figure 108127615-A0305-02-0452-585
Figure 108127615-A0305-02-0453-586
<210> 321
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 321
Figure 108127615-A0305-02-0453-587
Figure 108127615-A0305-02-0454-588
<210> 322
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 322
Figure 108127615-A0305-02-0454-589
<210> 323
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 323
Figure 108127615-A0305-02-0454-590
<210> 324
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 324
Figure 108127615-A0305-02-0455-594
<210> 325
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 325
Figure 108127615-A0305-02-0455-593
<210> 326
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 326
Figure 108127615-A0305-02-0455-592
<210> 327
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 327
Figure 108127615-A0305-02-0455-591
<210> 328
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 328
Figure 108127615-A0305-02-0456-595
<210> 329
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 329
Figure 108127615-A0305-02-0456-596
Figure 108127615-A0305-02-0457-597
<210> 330
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 330
Figure 108127615-A0305-02-0457-598
Figure 108127615-A0305-02-0458-599
Figure 108127615-A0305-02-0459-600
<210> 331
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 331
Figure 108127615-A0305-02-0459-601
Figure 108127615-A0305-02-0460-602
<210> 332
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 332
Figure 108127615-A0305-02-0461-603
<210> 333
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 333
Figure 108127615-A0305-02-0461-604
<210> 334
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 334
Figure 108127615-A0305-02-0461-605
<210> 335
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 335
Figure 108127615-A0305-02-0461-606
<210> 336
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 336
Figure 108127615-A0305-02-0462-609
<210> 337
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 337
Figure 108127615-A0305-02-0462-608
<210> 338
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 338
Figure 108127615-A0305-02-0462-607
Figure 108127615-A0305-02-0463-610
<210> 339
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 339
Figure 108127615-A0305-02-0463-611
<210> 340
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 340
Figure 108127615-A0305-02-0463-612
Figure 108127615-A0305-02-0464-613
Figure 108127615-A0305-02-0465-614
Figure 108127615-A0305-02-0466-615
<210> 341
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 341
Figure 108127615-A0305-02-0466-616
Figure 108127615-A0305-02-0467-617
<210> 342
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 342
Figure 108127615-A0305-02-0467-618
<210> 343
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 343
Figure 108127615-A0305-02-0467-619
<210> 344
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 344
Figure 108127615-A0305-02-0468-620
<210> 345
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 345
Figure 108127615-A0305-02-0468-621
<210> 346
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 346
Figure 108127615-A0305-02-0468-622
<210> 347
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 347
Figure 108127615-A0305-02-0468-624
<210> 348
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 348
Figure 108127615-A0305-02-0469-625
<210> 349
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 349
Figure 108127615-A0305-02-0469-626
Figure 108127615-A0305-02-0470-627
<210> 350
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 350
Figure 108127615-A0305-02-0470-628
Figure 108127615-A0305-02-0471-629
Figure 108127615-A0305-02-0472-630
<210> 351
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 351
Figure 108127615-A0305-02-0472-631
Figure 108127615-A0305-02-0473-632
<210> 352
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 352
Figure 108127615-A0305-02-0473-633
<210> 353
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 353
Figure 108127615-A0305-02-0474-635
<210> 354
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 354
Figure 108127615-A0305-02-0474-636
<210> 355
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 355
Figure 108127615-A0305-02-0474-637
<210> 356
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 356
Figure 108127615-A0305-02-0474-634
<210> 357
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 357
Figure 108127615-A0305-02-0475-638
<210> 358
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 358
Figure 108127615-A0305-02-0475-639
<210> 359
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 359
Figure 108127615-A0305-02-0476-641
<210> 360
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 360
Figure 108127615-A0305-02-0476-640
Figure 108127615-A0305-02-0477-642
Figure 108127615-A0305-02-0478-643
<210> 361
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 361
Figure 108127615-A0305-02-0479-644
Figure 108127615-A0305-02-0480-645
<210> 362
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 362
Figure 108127615-A0305-02-0480-646
<210> 363
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 363
Figure 108127615-A0305-02-0480-647
<210> 364
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 364
Figure 108127615-A0305-02-0480-648
<210> 365
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 365
Figure 108127615-A0305-02-0481-650
<210> 366
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 366
Figure 108127615-A0305-02-0481-651
<210> 367
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 367
Figure 108127615-A0305-02-0481-652
<210> 368
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 368
Figure 108127615-A0305-02-0481-649
Figure 108127615-A0305-02-0482-653
<210> 369
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 369
Figure 108127615-A0305-02-0482-654
Figure 108127615-A0305-02-0483-655
<210> 370
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 370
Figure 108127615-A0305-02-0483-656
Figure 108127615-A0305-02-0484-657
Figure 108127615-A0305-02-0485-658
<210> 371
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 371
Figure 108127615-A0305-02-0485-659
Figure 108127615-A0305-02-0486-660

Claims (19)

  1. 一種抗體構建體，其包含‧與靶細胞表面上的CLDN18.2結合的第一結構域，以及‧與T細胞表面上的人CD3結合的第二結構域，其中該第一結構域包含：VH區以及VL區，該VH區包含如SEQ ID NO：121中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO：122中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO：123中所描述的CDR-H3，該VL區包含如SEQ ID NO：124中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO：125中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO：126中所描述的CDR-L3。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗體構建體，其中該第二結構域結合人CD3ε和普通狨或松鼠猴CD3ε。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之抗體構建體，其中a)該抗體構建體係單鏈抗體構建體，b)該第一結構域處於scFv的形式，c)該第二結構域處於scFv的形式，d)該第一結構域和該第二結構域經由連接子連接，和/或e)該抗體構建體包含提供延長的血清半衰期的結構域。
  4. 如申請專利範圍第1或2項之抗體構建體，其中該第一結構域不結合或不顯著結合CLDN18.1、CLDN1、CLDN2、CLDN3、CLDN4、CLDN6和/或CLDN9。
  5. 如申請專利範圍第1或2項之抗體構建體，其中該第一結構域包含具有如SEQ ID NO：127或SEQ ID NO：139中所描述的胺基酸序列的VH區。
  6. 如申請專利範圍第1或2項之抗體構建體，其中該第一結構域包含具有如SEQ ID NO：128或SEQ ID NO：140中所描述的胺基酸序列的VL區。
  7. 如申請專利範圍第1或2項之抗體構建體，其中該第一結構域包含VH區和VL區，該VH區和VL區具有如SEQ ID NO：127+128或SEQ ID NO：139+140中所描述的胺基酸序列。
  8. 如申請專利範圍第1或2項之抗體構建體，其中該第一結構域包含具有如SEQ ID NO：129或SEQ ID NO：141中所描述的胺基酸序列的多肽。
  9. 如申請專利範圍第1或2項之抗體構建體，其包含如下多肽或由其組成，該多肽具有選自在SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：144中所描述的那些胺基酸序列的組的胺基酸序列。
  10. 一種多核苷酸，其編碼如申請專利範圍第1至9項中任一項所定義的抗體構建體。
  11. 一種載體，其包含如申請專利範圍第10項中所定義之多核苷酸。
  12. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第10項中所定義之多核苷酸或如申請專利範圍第11項中所定義之載體。
  13. 一種用於產生如申請專利範圍第1至9項中任一項所定義之抗體構建體之方法，所述方法包括：在允許表現所述抗體構建體的條件下培養如申請專利範圍第12項中所定義之宿主細胞並且從培養物中回收所產生的抗體構建體。
  14. 一種抗體構建體，其係由如申請專利範圍第13項之方法產生。
  15. 一種藥物組成物，其包含如申請專利範圍第1至9及14項中任一項所定義的抗體構建體。
  16. 一種如申請專利範圍第1至9及14項中任一項所述之抗體構建體之用途，其係用於製造預防、治療或緩解腫瘤的藥物。
  17. 如申請專利範圍第16項之用途，其中該腫瘤選自由以下組成之群組：胃腸癌、卵巢癌和肺癌。
  18. 如申請專利範圍第17項之用途，其中該胃腸癌選自由以下組成之群組：胃癌、食管癌、胃食管癌、胰髒癌和結直腸癌。
  19. 一種套組，其包含如申請專利範圍第1至9及14項中任一項所定義的抗體構建體、如申請專利範圍第10項中所定義之多核苷酸、如申請專利範圍第11項中所定義之載體、和/或如申請專利範圍第12項中所定義之宿主細胞。
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