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TW202519556A - 雙特異性抗體在製備治療癌症的藥物中的用途 - Google Patents

雙特異性抗體在製備治療癌症的藥物中的用途 Download PDF

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TW202519556A
TW202519556A TW113137140A TW113137140A TW202519556A TW 202519556 A TW202519556 A TW 202519556A TW 113137140 A TW113137140 A TW 113137140A TW 113137140 A TW113137140 A TW 113137140A TW 202519556 A TW202519556 A TW 202519556A
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cancer
egfr
seq
antibody
bispecific antibody
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TW113137140A
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馬曉瑩
錢輝
周遠鋒
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大陸商上海翰森生物醫藥科技有限公司
大陸商常州恒邦藥業有限公司
大陸商普米斯生物技術（珠海）有限公司
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Abstract

提供一種雙特異性抗體作為抗癌藥物的用途，尤其在製備用於治療治療晚期實體瘤的藥物中的用途。

Description

雙特異性抗體在製備治療癌症的藥物中的用途
本發明屬於醫藥領域，涉及一種雙特異性抗體在製備治療癌症的藥物中的用途，其中雙特異性抗體為同時抑制人表皮生長因子受體和酪胺酸激酶Met雙靶點的藥物，基於其獨特的結構和新的作用機制，雙抗有潛力實現單藥或聯合用藥難以實現的臨床獲益。
本申請要求申請日為2023/9/28的中國專利申請2023112834484的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
EGFR是人表皮生長因子受體（HER）家族成員之一，廣泛分佈於上皮、間充質和神經元來源的組織或細胞表面。在生理條件下，與其配體（如表皮生長因子EGF）結合後，可促進細胞分化、增殖、遷移和存活。在病理條件下，EGFR作為促癌基因，可通過基因突變、表達上調等方式促進腫瘤的發生發展。常見的EGFR基因突變位點為18-21號外顯子，主要為19號外顯子缺失（Exon 19del）、21號外顯子L858R點突變（L858R）、20號外顯子插入突變（Exon 20ins）等。EGFR突變或過表達在NSCLC（50%突變）、頭頸癌（80%過表達）、結腸癌（25%突變）和乳腺癌（11%過表達/突變）中均具有較高的發生率，已有多個靶向於EGFR的藥物在上述適應症中得到了臨床有效性的確證。
MET基因屬於原癌基因，編碼細胞間質表皮轉化因子（c-MET），又稱肝細胞生長因子受體（HGFR），c-MET/HGFR同樣屬受體酪胺酸激酶（RTK）家族，是一種跨膜酪胺酸激酶受體，與其配體肝細胞生長因子（HGF）結合後，可誘導MET二聚化並將其底物磷酸化，進而激活下游傳訊路徑，參與調節細胞的增殖、分化、遷移和血管生成等過程。
c-MET通路與EGFR耐藥關係密切。MET基因表達繞過被抑制的EGFR磷酸化激酶途徑，通過激活ERBB3和MET下游的PI3K/AKT通路，提供旁路途徑。MET通過這條旁路通路激活並促進下游訊息傳導，避免EGFR TKI導致的細胞凋亡，同時促進腫瘤細胞增殖，最終導致EGFR TKI耐藥。因此，同時抑制EGFR和c-MET通路，以克服MET途徑激活導致的EGFR TKI耐藥是非常有必要的，這為c-MET通路抑制聯合EGFR通路抑制治療晚期實體瘤提供理論依據。
EGFR Exon 20ins由於突變結構特殊，對現有一至三代EGFR TKIs均不敏感，化療、免疫治療同樣效果不佳。2022年CSCO指南推薦的一線標準治療仍然是以鉑類藥物為基礎的化療。對於c-MET路徑激活導致的EGFR靶點耐藥的晚期實體瘤患者，目前尚無標準治療。因此尋找有效的治療手段是臨床的迫切需求。
本發明提供了一種特異性結合c-Met和EGFR的雙特異性抗體在製備預防或治療癌症的藥物中的用途。
本發明還提供了一種特異性結合c-Met和EGFR的雙特異性抗體的藥物組合物在製備預防或治療癌症的藥物中的用途。
本發明還提供了一種特異性結合c-Met和EGFR的雙特異性抗體，或雙特異性抗體的藥物組合物，與EGFR 抑制劑聯合，在製備預防或治療癌症的藥物中的用途。
在一些實施方案中，EGFR 抑制劑選自埃羅替尼（erlotinib），吉非替尼（gefitinib），貝福替尼（befotertinib），奧希替尼（osimertinib），阿美替尼（almonertinib），伏美替尼（furmonertinib），奧瑞替尼（oritinib），瑞澤替尼（Rezetinib），艾維替尼（Avitinib），奧美替尼（olmutinib），羅西替尼（rociletinib）；優選為阿美替尼（almonertinib），奧希替尼（osimertinib）。
在一些實施方案中，上述雙特異性抗體或雙特異性抗體藥物組合物，EGFR 抑制劑分別作為活性成分包含在不同製劑中，並且同時、並行、序貫、連續、交替或分開施用。
在一些實施方案中，上述雙特異性抗體包含針對第一靶標c-Met的第一抗體或抗原結合片段，以及針對第二靶標EGFR的第二抗體或抗原結合片段；其中第一抗體或抗原結合片段包含如SEQ ID NO: 01 所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 02 所示的HCDR2、如SEQ ID NO: 03 所示的HCDR3；和，如SEQ ID NO: 04 所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 05 所示的LCDR2、如SEQ ID NO: 06 所示的LCDR3；其中第二抗體或抗原結合片段包含如SEQ ID NO: 09 所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 10 所示的HCDR2、如SEQ ID NO: 11 所示的HCDR3；和，如SEQ ID NO: 12 所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 13 所示的LCDR2、如SEQ ID NO: 14 所示的LCDR3。
在一些實施方案中，上述雙特異性抗體包含針對第一靶標c-Met的第一抗體或抗原結合片段，以及針對第二靶標EGFR的第二抗體或抗原結合片段，第一抗體或抗原結合片段包含如SEQ ID NO: 07 所示的重鏈可變區、如SEQ ID NO: 08 所示的輕鏈可變區；所述第二抗體或抗原結合片段包含如SEQ ID NO: 15 所示的重鏈可變區、如SEQ ID NO: 16所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中，雙特異性抗體的c-Met結合結構域是由第一重鏈與第一輕鏈形成的Fab區域，EGFR結合結構域是由第二重鏈與第二輕鏈形成的Fab區域，第一重鏈與第二重鏈相互結合形成異源二聚體Fc區域。
在一些實施方案中，雙特異性抗體包含針對第一靶標c-Met的第一抗體或抗原結合片段，以及針對第二靶標EGFR的第二抗體或抗原結合片段，第一抗體或抗原結合片段包含如SEQ ID NO: 21 所示的重鏈、如SEQ ID NO: 22 所示的輕鏈；所述第二抗體或抗原結合片段包含如SEQ ID NO: 23 所示的重鏈、如SEQ ID NO: 24所示的輕鏈。
在一些實施方案中，上述癌症為表達c-Met或/和EGFR的癌症。
在一些實施方案中，上述癌症為表達c-Met的癌症。
在一些實施方案中，上述癌症為表達EGFR的癌症。
在一些實施方案中，上述癌症為表達c-Met和EGFR的癌症。
在一些實施方案中，表達c-Met或/和EGFR的癌症由野生型EGFR、EGFR激活突變、EGFR基因擴增、循環HGF的水平升高、野生型c-Met、c-Met激活突變、c-Met基因擴增、MET基因擴增、或突變體KRAS介導，優選由EGFR激活突變、MET基因擴增介導。
可與癌症相關聯的示例性EGFR激活突變包括引起EGFR的至少一種生物活性增加(諸如酪胺酸激酶活性升高、受體同源二聚體和異源二聚體形成、配體結合增強等)的點突變、缺失突變、插入突變、倒置或基因擴增。突變可以位於EGFR基因或與EGFR基因相關聯的調控區域的任何部分中，並且包括外顯子18、19、20或21中的突變或激酶結構域中的突變。EGFR激活突變的其他示例在本領域中是已知的(參見例如美國專利公佈US2005/0272083)。關於EGFR和其他ErbB受體(包括受體同源二聚體和異源二聚體、受體配體、自磷酸化位點和參與ErbB介導的訊息傳導的訊息傳導分子)的信息在本領域中是已知的(參見例如Hynesand Lane,Nature Reviews Cancer 5:341-354,2005)。
在一些實施方案中，上述癌症為由EGFR激活突變介導的表達EGFR或/和c-Met的癌症。在一些實施方案中，所述EGFR激活突變包括選自以下組成的組的至少一個突變：G719X(X為任何胺基酸)、L861X(X為任何胺基酸)。
在一些實施方案中，所述EGFR激活突變包括選自以下組成的組的至少一個突變：L718Q、L718V、G719A、G719S、G719C、G719D、L858R、L858P、L861Q、G724S、E746K、L747S、E749Q、A750P、A755V、V765M、C797S、S768I、或T790M置換；E746-A750的缺失；R748-P753的缺失；M766與A767之間Ala(A)的插入；S768與V769之間Ser、Val和Ala(SVA)的插入；P772與H773之間Asn和Ser(NS)的插入；D761與E762之間、A763與Y764之間、Y764與Y765之間、M766與A767之間、A767與V768之間、S768與V769之間、V769與D770之間、D770與N771之間、N771與P772之間、P772與H773之間、H773與V774之間、V774與C775之間一個或多個胺基酸的插入；EGFR外顯子19中的一個或多個胺基酸的缺失；或EGFR外顯子19中的一個或多個胺基酸的插入；EGFR外顯子20中的一個或多個缺失；或EGFR外顯子20中的一個或多個插入；或它們的任何組合。
在一些實施方案中，所述EGFR激活突變包括選自以下組成的組的至少一個突變：L858R突變，T790M突變，L861Q突變，EGFR外顯子20中的一個或多個插入突變，EGFR外顯子19中的一個或多個胺基酸的缺失突變。
在一些實施方案中，上述癌症選自實體瘤，優選為晚期實體瘤。
在一些實施方案中，上述癌症選自上皮細胞癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、直腸癌、肛門癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、咽癌、鼻癌、胰腺癌、皮膚癌、口腔癌、舌癌、食管癌、陰道癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、脾癌、睪丸癌、胃癌、胸腺癌、結腸癌、甲狀腺癌、肝癌或黑色素瘤，優選為肺癌或肝癌。
在一些實施方案中，癌症選自非小細胞肺癌 (NSCLC)、肺腺癌、肺鱗癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌、肺肉瘤樣癌、肝細胞癌 (HCC)。
在優選的實施方案中，上述癌症選自非鱗非小細胞肺癌。在優選的實施方案中，癌症選自局部晚期或轉移性非鱗非小細胞肺癌。
在優選的實施方案中，上述癌症選自局部晚期或轉移性非小細胞肺癌，攜帶EGFR激活突變包括選自以下組成的組的至少一個突變：L858R突變，T790M突變，L861Q突變，C797S突變，EGFR外顯子20中的一個或多個插入突變，EGFR外顯子19中的一個或多個胺基酸的缺失突變。
在優選的實施方案中，上述癌症選自局部晚期或轉移性非鱗非小細胞肺癌，攜帶EGFR激活突變包括選自以下組成的組的至少一個突變：L858R突變，EGFR外顯子20中的一個或多個插入突變，EGFR外顯子19中的一個或多個胺基酸的缺失突變。
在優選的實施方案中，上述癌症選自包括EGFR外顯子19中的一個或多個胺基酸的缺失突變或L858R突變的局部晚期或轉移性非鱗非小細胞肺癌。
在優選的實施方案中，上述癌症選自包括EGFR外顯子20中的一個或多個插入突變的局部晚期或轉移性非小細胞肺癌。
在一些實施方案中，上述EGFR 抑制劑給藥劑量為10-500mg，優選為10-200mg，更優選為100mg，110 mg，120 mg，130 mg，140 mg，150 mg，160 mg，170 mg，180 mg，190 mg，200 mg。
在一些實施方案中，上述EGFR 抑制劑給藥頻次為每天兩次、每天一次、兩天一次、三天一次，優選為每天一次、兩天一次。
在優選的實施方案中，上述EGFR 抑制劑給藥劑量為110 mg，給藥頻次為每天一次。
雙特異性抗EGFR/c-Met抗體可以在藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體中施用。
「載體」是指本發明抗體與之一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。此類媒介物可以是液體，諸如水和油，包括來源於石油、動物、植物的油或合成的那些油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。例如，0.4％鹽水和0.3％甘胺酸可用於配製雙特異性抗EGFR/c-Met抗體。這些溶液是無菌的，並且通常不含顆粒物。它們可通過常規的公知滅菌技術(例如過濾)進行滅菌。對於腸胃外施用，載體可包括無菌水，並且可添加其他賦形劑以增加溶解度或防腐性。注射用混懸劑或溶液劑也可以利用水基載體連同合適的添加劑來製備。包含其他人蛋白(例如，人血清白蛋白)在內的合適的媒介物和配製物。
在一些實施方案中，雙特異性抗體組合物單位濃度為約1mg/mL至約100mg/mL，優選為約5mg/mL至約50mg/mL，更優選為約10mg/mL至約30mg/mL。
在一些實施方案中，雙特異性抗體藥物組合物單位濃度為約10mg/mL、約15mg/mL、約20mg/mL、約25mg/mL、約30mg/mL。
在一些實施方案中，雙特異性抗體藥物組合物規格為每支10mL：10mg至10mL：1000mg，優選10mL：100mg至10mL：500mg，更優選10mL：100mg、10mL：200mg、10mL：300mg、10mL：400mg、10mL：500mg。
施用方式可以是將雙特異性抗EGFRxc-Met抗體遞送至宿主的任何合適的途徑，諸如胃腸外施用，例如真皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內或皮下、肺部、經黏膜(口腔、鼻內、陰道內、直腸)，使用片劑、膠囊、溶液、粉末、凝膠、顆粒形式的製劑；以及包含在注射器、植入裝置、滲透泵、盒、微型泵中；或通常知識者所理解的本領域熟知的其他方式。可通過例如以下方式實現位點特異性施用：瘤內、胃腸外、支氣管內、腹內、囊內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、結腸內、頸管內、胃內、肝內、心臟內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊柱內、滑膜內、胸內、子宮內、血管內、膀胱內、病灶內、陰道、直腸、口腔、舌下、鼻內或經皮遞送。
在一些實施方案中，雙特異性抗EGFR/c-Met抗體或其藥物組合物以介於約100mg到約5000mg之間的劑量施用。
在一些實施方案中，雙特異性抗EGFR/c-Met抗體或其藥物組合物以介於約400mg到約2000mg之間的劑量施用。
在一些實施方案中，雙特異性抗EGFR/c-Met抗體或其藥物組合物以約400mg、約410mg、約420mg、約430mg、約440mg、約450mg、約460mg、約470mg、約480mg、約490mg、約500mg、約510mg、約520mg、約530mg、約540mg、約550mg、約560mg、約570mg、約580mg、約590mg、約600mg、約610mg、約620mg、約630mg、約640mg、約650mg、約660mg、約670mg、約680mg、約690mg、約700mg、約710mg、約720mg、約730mg、約740mg、約750mg、約760mg、約770mg、約780mg、約790mg、約800mg、約810mg、約820mg、約830mg、約840mg、約850mg、約860mg、約870mg、約880mg、約890mg、約900mg、約910mg、約920mg、約930mg、約940mg、約950mg、約960mg、約970mg、約980mg、約990mg、約1000mg、約1010mg、約1020mg、約1030mg、約1040mg、約1050mg、約1060mg、約1070mg、約1080mg、約1090mg、約1100mg、約1110mg、約1120mg、約1130mg、約1140mg、約1150mg、約1160mg、約1170mg、約1180mg、約1190mg、約1200mg、約1210mg、約1220mg、約1230mg、約1240mg、約1250mg、約1260mg、約1270mg、約1280mg、約1290mg、約1300mg、約1310mg、約1320mg、約1330mg、約1340mg、約1350mg、約1360mg、約1370mg、約1380mg、約1390mg、約1400mg、約1410mg、約1420mg、約1430mg、約1440mg、約1450mg、約1460mg、約1470mg、約1480mg、約1490mg、約1500mg、約1510mg、約1520mg、約1530mg、約1540mg、約1550mg、約1560mg、約1570mg、約1580mg、約1590mg、約1600mg、約1610mg、1620mg、約1630mg、約1640mg、約1650mg、約1660mg、約1670mg、約1680mg、約1690mg、約1700mg、約1710mg、約1720mg、約1730mg、約1740mg、約1750mg、約1760mg、約1770mg、約1780mg、約1790mg、約1800mg、約1810mg、約1820mg、約1830mg、約1840mg、約1850mg、約1860mg、約1870mg、約1880mg、1890mg、約1900mg、約1910mg、約1920mg、約1930mg、約1940mg、約1950mg、約1960mg、約1970mg、約1980mg、約1990mg或約2000mg的劑量施用。
在優選的實施方案中，上述雙特異性抗EGFR/c-Met抗體或其藥物組合物以400mg，800mg，1000mg，1200mg，1400mg，1600mg，1800mg，2000mg的劑量施用。
在優選的實施方案中，上述雙特異性抗EGFR/c-Met抗體或其藥物組合物以400mg，800mg，1200mg，1600mg，2000mg的劑量施用。
在一些實施方案中，雙特異性抗EGFR/c-Met抗體或其藥物組合物每日施用一次。在一些實施方案中，雙特異性抗EGFR/c-Met抗體或其組合物每兩日施用一次。在一些實施方案中，雙特異性抗EGFR/c-Met抗體或其組合物每三日施用一次。在一些實施方案中，雙特異性抗EGFR/c-Met抗體或其組合物每週施用兩次。在一些實施方案中，雙特異性抗EGFR/c-Met抗體或其組合物每週施用一次。在一些實施方案中，雙特異性抗EGFR/c-Met抗體或其組合物每兩週施用一次。在一些實施方案中，雙特異性抗EGFR/c-Met抗體或其組合物每三週施用一次。在一些實施方案中，雙特異性抗EGFR/c-Met抗體或其組合物每月施用一次。
在優選的實施方案中，雙特異性抗EGFR/c-Met抗體或其藥物組合物給藥頻次為，第一治療週期一週一次、之後兩週一次，每四週為一個治療週期。
在優選的實施方案中，雙特異性抗EGFR/c-Met抗體或其藥物組合物給藥頻次為，第一治療週期一週一次、之後三週一次，每三週為一個治療週期。
在優選的實施方案中，雙特異性抗EGFR/c-Met抗體或其藥物組合物以400mg，800mg，1200mg，1600mg，2000mg的劑量施用；給藥頻次為，第一治療週期一週一次、第二治療週期起兩週一次，每四週為一個治療週期。
本發明提供了一種治療或預防癌症的方法，該方法包括向有需要的受試者施用上述的雙特異性抗體或雙特異性抗體藥物組合物。
本發明提供了一種治療或預防癌症的方法，該方法包括向有需要的受試者組合施用上述的雙特異性抗體或雙特異性抗體藥物組合物，上述的EGFR 抑制劑，所述組合施用可以是同時、並行、序貫、連續、交替或分開施用。
在一些實施方案中，上述癌症為實體瘤，優選為上皮細胞癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、直腸癌、肛門癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、咽癌、鼻癌、胰腺癌、皮膚癌、口腔癌、舌癌、食管癌、陰道癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、脾癌、睪丸癌、胃癌、胸腺癌、結腸癌、甲狀腺癌、肝癌或黑色素瘤，更優選為非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌、肺肉瘤樣癌、肝細胞癌。
在優選實施方案中，上述癌症為局部晚期或轉移性非小細胞肺癌。優選為EGFR突變的局部晚期或轉移性非小細胞肺癌。
在一些實施方案中，上述EGFR突變包括選自以下組成的組的至少一個突變：L858R突變，T790M突變，L861Q突變，C797S突變，EGFR外顯子20中的一個或多個插入突變，EGFR外顯子19中的一個或多個胺基酸的缺失突變。
在優選實施方案中，上述癌症為EGFR外顯子19中的一個或多個胺基酸的缺失突變或L858R突變的非小細胞肺癌。
體外藥效學試驗結果表明，本發明雙特異性抗EGFRxc-Met抗體或其組合物可與食蟹猴EGFR和c-MET結合，可檢出增強的ADCC活性。體內藥效學試驗結果顯示，本發明雙特異性抗EGFRxc-Met抑瘤作用優於已上市的同類藥物Amivantamab。本發明雙特異性抗EGFRxc-Met聯合奧希替尼的抑瘤作用明顯強於兩個單藥，展示出良好的聯合增效作用；聯合給藥組動物均未見新增毒性。EGFR三突變、EGFR-20外顯子插入突變腫瘤模型中所有動物耐受良好，較好的抑制腫瘤的生長。具有用於晚期惡性腫瘤治療的生物活性和治療潛力。
發明詳述 一、術語
為了更容易理解本申請，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本文件中的它處另有明確定義，否則本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本發明所屬技術領域中具有通常知識者通常理解的含義。
當提供一個列表時，除非另行指出，否則應當理解，該列表中的每個單獨元素和該列表的每種組合都是單獨的實施方案。例如，作為「A、B或C」呈現的實施方案的列表將被理解為包括實施方案「A」、「B」、「C」、「A或B」、「A或C」、「B或C」或者「A、B或C」。
「約」是指處於如本發明所屬技術領域中具有通常知識者所確定的特定值的可接受誤差範圍之內，其將部分取決於該值是如何測量或測定的，即測量系統的限制。在特定測定、結果或實施方案的上下文中，除非實施例或說明書其他地方內另有明確說明，否則「約」意指在根據本領域慣例的一個標准偏差之內或多至5％的範圍(取較大者)。
本申請所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J. Biol. Chem，243，p3558(1968)中所述。
本申請所述的術語「抗體」指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈通過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為µ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈通過恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在本申請中，本申請所述的抗體輕鏈可變區可進一步包含輕鏈恆定區，所述的輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。
在本申請中，本申請所述的抗體重鏈可變區可進一步包含重鏈恆定區，所述的重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG 3、IgG 4或其變體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區（V區）；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區（C區）。可變區包括3個高變區（HVR）和4個序列相對保守的骨架區（FR）。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區（CDR）。每條輕鏈可變區（VL）和重鏈可變區（VH）由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2，和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本申請所述的抗體或抗原結合片段的VL區和VH區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則和Kabat或ABM定義規則（http://bioinf.org.uk/abs/）。
本申請所述的術語「EGFR」是指人表皮生長因子受體1，也被稱為ErbB-1或HER1。EGFR是包含細胞外配體結合結構域，膜-跨結構域和細胞內激酶結構域的受體酪胺酸激酶。結合其配體（例如表皮生長因子(EGF)及轉化生長因子α(TGFα)）之後，EGFR形成同源二聚體或與其他ErbB受體形成異源二聚體，和其激酶功能活化，導致細胞內結構域的幾個酪胺酸的自磷酸化。抗-EGFR抗體是能特異性結合EGFR的抗體。在特定實施方式中，抗-EGFR抗體能干擾或抑制EGFR的活化，例如通過預防配體結合和/或受體二聚化。EGFR活化後可將訊息傳遞至下游效應因子，包括PI3-K，RAS-RAF-MAPK P44/P42和蛋白激酶C傳訊路徑，最終可把訊息傳遞至細胞核，調節細胞增殖。
本申請所述的術語「EGFR外顯子20插入突變」或「EGFR第20外顯子突變」、或「EGFR Exon 20ins」或「Exon20ins」是指包含至少一個在人類EGFR 第762~823位胺基酸發生鹼基的插入或複製突變。EGFR 外顯子20插入突變可以使用已知方法檢測，例如測序，包括下一代測序(NGS)、螢光原位雜交、免疫組織化學、流式細胞術或蛋白質印跡。
「表達EGFR和/或c-Met的癌症」是指具有可檢測的EGFR和/或c-Met表達或具有EGFR和/或c-Met突變或擴增的癌症。可以使用已知方法檢測EGFR或c-Met表達、擴增和突變狀態，例如測序，包括下一代測序、螢光原位雜交、免疫組織化學、流式細胞術或蛋白質印跡。
術語「重組人抗體」包括通過重組方法製備、表達、創建或分離的人抗體，所涉及的技術和方法在本領域中是熟知的，諸如： 1. 從人免疫球蛋白基因的轉基因、轉染色體動物（例如小鼠）或由其製備的雜交瘤中分離的抗體； 2. 從經轉化以表達抗體的宿主細胞如轉染瘤中分離的抗體； 3. 從重組組合人抗體文庫中分離的抗體；以及 4. 通過將人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列等方法製備、表達、創建或分離的抗體。
此類重組人抗體包含可變區和恆定區，這些區域利用特定的由種系基因編碼的人種系免疫球蛋白序列，但也包括隨後諸如在抗體成熟過程中發生的重排和突變。
術語「人源化抗體（humanized antibody）」，也稱為CDR移植抗體（CDR-grafted antibody），是指將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架中產生的抗體。人源化抗體可以克服嵌合抗體由於攜帶大量小鼠蛋白成分，從而誘導的強烈的免疫反應的缺點。為避免在免疫原性下降的同時引起活性的下降，可對所述的人抗體可變區可進行最少反向突變，以保持活性。
術語「抗原結合片段」是指抗體的抗原結合片段及抗體類似物，其通常包括至少部分母體抗體（parental antibody）的抗原結合區或可變區（例如一個或多個CDR）。抗體片段保留母體抗體的至少某些結合特異性。通常，當基於莫耳來表示活性時，抗體片段保留至少10％的母體結合活性。優選地，抗體片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的母體抗體對靶標的結合親和力。抗原結合片段實例包括但不限於：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、線性抗體（linear antibody）、單鏈抗體、奈米抗體、結構域抗體和多特異性抗體。工程改造的抗體變體綜述於Holliger和Hudson，2005，Nat.Biotechnol.23：1126-11中。
「Fab片段」由一條輕鏈和一條重鏈的CH1及可變區組成。Fab分子的重鏈不能與另一個重鏈分子形成二硫鍵。
「Fc」區含有包含抗體的CH1和CH2結構域的兩個重鏈片段。兩個重鏈片段由兩個或多個二硫鍵並通過CH3結構域的疏水作用保持在一起。
「Fab’片段」含有一條輕鏈和包含VH結構域和CH1結構域以及CH1和CH2結構域之間區域的一條重鏈的部分，由此可在兩個Fab’片段的兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab’)2分子。
「F(ab’)2片段」含有兩條輕鏈和兩條包含CH1和CH2結構域之間的恆定區的部分的重鏈，由此在兩條重鏈間形成鏈間二硫鍵。因此，F(ab’)2片段由通過兩條重鏈間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab’片段組成。
「Fv區」包含來自重鏈和輕鏈二者的可變區，但缺少恆定區。
術語「多特異性抗體」按其最廣義使用，涵蓋具有多表位特異性的抗體。這些多特異性抗體包括但不限於：包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗體，其中該VH-VL單元具有多表位特異性；具有兩個或多個VL和VH區的抗體，每個VH-VL單元與不同的靶點或同一個靶點的不同表位結合；具有兩個或更多個單可變區的抗體，每個單可變區與不同的靶點或同一個靶點的不同的表位結合；全長抗體、抗體片段、雙抗體（diabodies）、雙特異性雙抗體和三抗體（triabodies）、己共價或非共價連接在一起的抗體片段等。
術語「單鏈抗體」是由抗體的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL通過一段連接肽連接而成的單鏈重組蛋白，它是具有完全抗原結合位點的最小抗體片段。
術語「結構域抗體片段」是僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區鏈的具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。在某些情況下，兩個或多個VH區與肽接頭共價連接以形成二價結構域抗體片段。二價結構域抗體片段的兩個VH區可靶向相同或不同抗原。
本申請所述的術語「單臂抗體」是指包含Fab段和Fc段的抗原結合片段，通常Fab 段包含重鏈（例如，VH 和CH1）以及輕鏈（例如，VL和CL），Fc段包含恆定區（例如，CH2和CH3）。所述Fab 段和Fc段可以通過接頭或不通過接頭連接。本發明的單臂抗體可以通過多種方法進行製備或合成，例如，將編碼Fab 重鏈的序列和編碼Fc的序列構建至同一載體中，並將編碼Fab輕鏈的序列構建至另一載體中，將兩種載體分別轉化至宿主細胞中，以獲得單臂抗體。
本申請的術語「抗原結合位點」指本申請抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。
術語「表位」是指抗原上與免疫球蛋白或抗體特異性結合的位點。表位可以由相鄰的胺基酸、或通過蛋白質的三級折疊而並列的不相鄰的胺基酸形成。由相鄰的胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後保持，而通過三級折疊形成的表位通常在變性溶劑處理後喪失。表位通常以獨特的空間構象包括至少3-15個胺基酸。確定什麼表位由給定的抗體結合的方法在本領域中是熟知的，包括免疫印跡和免疫沉澱檢測分析等。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術和本文所述的技術，例如X射線晶體分析法和二維核磁共振等。
本申請所用的術語「特異性結合」、「選擇性結合」是指抗體與預定的抗原上的表位結合。通常，當使用人EGFR或c-Met作為分析物並使用抗體作為配體，在儀器中通過表面等離子體共振（SPR）技術測定時，抗體以大約低於10 -7M或甚至更小的平衡解離常數（K D）與預定的抗原結合，並且其與預定抗原結合的親和力是其與預定抗原或緊密相關的抗原之外的非特異性抗原（如BSA等）結合的親和力的至少兩倍。術語「識別抗原的抗體」在本文中可以與術語「特異性結合的抗體」互換使用。
術語「抑制」或「阻斷」可互換使用，並涵蓋部分和完全抑制/阻斷這兩者。配體的抑制/阻斷優選地降低或改變無抑制或阻斷的情況下發生配體結合時出現活性的正常水平或類型。抑制和阻斷也旨在包括與抗體接觸時，與未與抗體接觸的配體相比，任何可測量的配體結合親和力降低。
術語「抑制生長」（例如涉及細胞）旨在包括細胞生長任何可測量的降低。
術語「誘導免疫反應」和「增強免疫反應」可互換使用，並指免疫反應對特定抗原的剌激（即，被動或適應性的）。針對誘導CDC或ADCC的術語「誘導」是指剌激特定的直接細胞殺傷機制。
本申請中所述的「ADCC」，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用，是指表達Fc受體的細胞通過識別抗體的Fc段直接殺傷被抗體包被的靶細胞。可通過對IgG上Fc段的修飾，增強或降低或消除抗體的ADCC效應功能。所述的修飾指在抗體的重鏈恆定區進行突變。
生產和純化抗體和抗原結合片段的方法在現有技術中熟知和能找到，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。如，小鼠可以用人BCMA或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人FR區。人FR種系序列可以從ImMunoGeneTics（IMGT）的網站http://imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
本申請工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。相應抗體的cDNA序列可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在F C區的高度保守N端。通過表達與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的殖株。陽性的殖株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化、收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
術語「藥物組合物」是以任選地特定的量包含一種或多種活性成分(例如抗體、小分子藥物)的產物，以及任何通過以任選地特定的量組合一種或多種活性成分直接或間接產生的任何產物。藥物組合物中的不同活性成分可以分別以單獨的製劑形式獨立施用，包括同時或在不同時間點的施用而聯合增效。在本公開中，「藥物組合物」和「製劑」不相互排斥。
術語「聯合」或「聯用」是一種給藥方式，是指在一定時間期限內給予至少一種劑量的雙特異性抗體或雙特異性抗體藥物組合物和至少一種劑量的另外的治療劑，其中兩種物質都顯示藥理學作用。所述的時間期限可以是一個給藥週期內，優選4週內，3週內，2週內，1週內，或24小時以內，更優選12小時以內。可以同時或依次給予雙特異性抗體或雙特異性抗體藥物組合物和另外的治療劑。這種期限包括這樣的治療，其中通過相同給藥途徑或不同給藥途徑給予雙特異性抗體或雙特異性抗體藥物組合物和另外的治療劑。本申請所述聯合的給藥方式選自同時給藥、獨立地配製並共給藥或獨立地配製並相繼給藥。
術語「施用」、「給予」和「處理」當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。「施用」、「給予」和「處理」可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中所述流體與細胞接觸。「施用」、「給予」和「處理」還意指通過試劑、診斷、結合組合物或通過另一種細胞體外和離體處理例如細胞。「處理」當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
術語「治療」意指給予患者內用或外用治療劑，諸如包含本申請的任一種抗體，所述患者具有一種或多種疾病症狀，而已知所述治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是通過誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量（也稱作「治療有效量」）可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。通過醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。盡本申請的實施方案（例如治療方法或製品）在緩解每個患者都有的目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗（H檢驗）、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
術語「預防」疾病或病症意指預防受試者中出現病症。
術語「診斷」是指確定受試者是否患有給定疾病或病症或者是否可能在將來發展成給定疾病或病症或者是否可能響應先前診斷的疾病或病症的治療(即根據響應治療的可能性對患者群體進行分層)的方法。診斷通常由醫師基於待診斷的疾病的一般指南或指示受試者可能響應特定治療的其他標準來執行。
整個說明書和申請專利範圍中使用的術語「基本上由……組成」或其變形表示包括所有所述元件或元件組，並且任選包括與所述元件類似或不同性質的其它元件，所述其它元件非顯著改變指定給藥方案、方法或組合物的基本性質或新性質。
本申請所述的應用於某個對象的術語「天然存在的」是指這樣的事實，即該對象可在自然界中發現。例如存在於可從自然界來源分離得到的生物體（包括病毒）、且未經人工在實驗室中有意修飾的多肽序列或多核苷酸序列即是天然存在的。
術語「有效量」包含足以改善或預防醫學病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
術語「外源性」指根據背景在生物、細胞或人體外產生的物質。
術語「內源性」指根據背景在細胞、生物或人體內產生的物質。
術語「同源性」是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼所述分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100%的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。
本文使用的表述「細胞」、「細胞系」和「細胞培養物」可互換使用，並且所有這類名稱都包括其後代。因此，單詞「轉化體」和「轉化細胞」包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。
「任選」或「任選地」意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，「任選包含1-3個抗體重鏈可變區」意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
實施例
以下結合實施例用於進一步描述本申請，但這些實施例並非限制著本申請的範圍。本申請實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例1. 雙特異性抗體構建與製備
單株抗體的篩選
本申請使用的抗c-MET抗體-1的序列是由間質表皮轉化因子（c-MET）抗原（購自AcroBiosystems），免疫小鼠，提取總RNA並進行反轉錄，並通過PCR擴增構建酵母展示文庫篩選獲得。並且經測序獲得抗體-1的序列，其中，抗體的CDR序列由IMGT編號系統（Lefranc et al.,Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003）確定。
具體來說，首先構建來自五隻免疫小鼠的抗c-MET全人源抗體文庫，多樣性達到3×10^7，並按照生物素標記試劑盒（購自Thermo）產品說明書標記人c-MET蛋白。通過MACS 富集能與c-MET特異性結合的酵母，並經過多輪的流式分選最終獲得與生物素標記的c-MET蛋白特異性結合並有較高親和力的酵母細胞。以最終分選出的酵母為模板調取出抗體重輕鏈的序列，並構建到表達載體中製備抗體。 表1. cMET抗體-1序列信息
cMET抗體-1
HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
SEQ ID No:01 SEQ ID No:02 SEQ ID No:03 SEQ ID No:04 SEQ ID No:05 SEQ ID No:06
GGSVTSVNYY ISYSGNT VRAPYYYMDV QGISSW AVS QQANSFPLT
重鏈可變區VH(SEQ ID NO:07) 輕鏈可變區VL(SEQ ID NO:08)
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVTSVNYYWKWIRQPPGKGLEWIGYISYSGNTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCVRAPYYYMDVWSKGTTVTVSS DIVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAVSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPLTFGGGTKVEIK
抗體製備後進行ForteBio親和力測定，按照已報導的方法（Estep, P等人，基於高通量法的抗體-抗原親和力和表位結合的測定。MAbs, 2013.5(2):p.270-8）進行。結果顯示，抗c-MET抗體-1與人的c-MET蛋白以及猴的c-MET蛋白有很好的結合活性。 表2. 候選分子與人c-Met的親和力
編號 KD(M) Kon(1/Ms) Koff(1/s)
c-MET抗體-1 2.93E-11 2.29E+05 6.71E-06
表3. 候選分子與猴c-Met的親和力
編號 KD(M) Kon(1/Ms) Koff(1/s)
c-MET抗體-1 1.16E-09 3.69E+05 4.26E-04
抗cMet和EGFR雙抗的構建
按照專利（專利申請號：201611016435.0）中描述的方法，合成編碼抗EGFR和抗cMet抗體可變區的核苷酸序列，並連接至可以自發形成異源二聚體的恆定區上。其中，抗cMet抗體為上述篩選獲得的c-MET抗體-1，抗EGFR抗體重鏈可變區和輕鏈可變區公開自專利號：WO02/100348，其中將重鏈可變區第一位胺基酸Q突變為E，輕鏈可變區第一位胺基酸A突變為D，其序列具體如表4所示。 表4. EGFR抗體序列信息
EGFR抗體
HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
SEQ ID No:09 SEQ ID No:10 SEQ ID No:11 SEQ ID No:12 SEQ ID No:13 SEQ ID No:14
GFTFSTYG IWDDGSYK ARDGITMVRGVMKDYFDY QDISSA DAS QQFNSYPLT
重鏈可變區VH(SEQ ID NO:15) 輕鏈可變區VL(SEQ ID NO:16)
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSYKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGITMVRGVMKDYFDYWGQGTLVTVSS DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSALVWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSESGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK
使用CH1/CL偏好性突變（專利號：WO2021/067404A2）以及Knob in Hole 技術，構建EGFRxcMET-1分子，將抗cMet抗體和抗EGFR抗體的重鏈可變區分別構建入CH1突變型的重鏈恆定區CH SET1（SEQ NO：17）和CH SET2（SEQNO：18）上；將抗cMet 抗體和抗EGFR 抗體的輕鏈可變區分別構建入CL突變型的輕鏈恆定區上CL SET1（SEQ NO：19）和CL SET2（SEQ NO:20）上。構建了1+1非對稱式抗EGFRxcMet雙特異性抗體細胞株。 表5. EGFRxcMet 雙特異性抗體序列信息
CH SET1 SEQ ID NO:17 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCQVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYELSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
CH SET2 SEQ ID NO:18 ASTKGPSVFPRAPSSKSTSGGTAALGCLVRDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
CL SET1 SEQ ID NO:19 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGRASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSRLQLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CL SET2 SEQ ID NO:20 RTVAAPSVFIFPPSDEELKSGTASVQCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSELTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
cMet HC SEQ ID NO:21 EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVTSVNYYWKWIRQPPGKGLEWIGYISYSGNTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCVRAPYYYMDVWSKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCQVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYELSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
cMet LC SEQ ID NO:22 DIVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAVSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGRASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSRLQLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
EGFR HC SEQ ID NO:23 EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSYKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGITMVRGVMKDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPRAPSSKSTSGGTAALGCLVRDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
EGFR LC SEQ ID NO:24 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSALVWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSESGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEELKSGTASVQCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSELTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
採用電擊轉染的方法將含有編碼抗c-Met抗體重鏈（SEQ NO：21）的核苷酸序列和編碼輕鏈（SEQ NO：22）的核苷酸序列的載體pCHO2.0-GS-Puro-H1-L1以及含有編碼抗EGFR抗體重鏈（SEQ NO：23）的核苷酸序列和編碼輕鏈（SEQ NO：24）核苷酸序列的載體pCHO2.0-GS-Puro-H2-L2共轉入宿主細胞CHOS-ADP Fut8 KO（去岩藻糖化基因剔除細胞株），利用Puromycin和 MSX篩選壓力對細胞進行加壓篩選獲得高產minipool，然後通過一輪有限稀釋和單株鑑定，得到高產穩定的選殖細胞株。通過比較殖株的生長狀態、蛋白表達量和表達蛋白的物理化學性質，最終確定了選殖細胞株6F5為重組工程細胞株。
以Dynamis AGT Medium為基礎培養基，接種密度(1.0±0.2)×10 6cells/ml，培養至第3、5、7、9、11天分別流加5.0±0.5% (w/w)初始培養重量的7a 補料，流加0.5±0.05%(w/w)初始培養重量的7b。溶氧設置40%，初始培養溫度36.5℃，第4天降溫至33.0℃。每天根據葡萄糖濃度檢測結果，補加300 g/kg 葡萄糖濃縮液使細胞液中葡萄糖濃度達到6.0 g/L，收穫當天除外。培養至第14天或細胞活率低於80% 時結束培養。在培養過程中，使用 Vicell（Beckman公司）對細胞密度及活率進行檢測，從第7天開始，每天使用Cedex（Roche 公司）對抗體產量進行檢測，結果表4所示，雙特異性抗體的表達量達2.432g/L。 收集上清利用蛋白A 磁珠（購自金斯瑞）分選法純化目的蛋白。將磁珠用適當體積的結合緩衝液（PBS+0.1%吐溫20，pH7.4）重懸（1-4倍磁珠體積）後加入至待純化樣品中，室溫孵育1小時，期間溫柔振盪。樣品置於磁力架上（購自海狸），棄去上清，磁珠用結合緩衝液清洗 3遍。按照磁珠體積的3-5倍體積加入洗脫緩衝液（0.1M檸檬酸鈉, pH3.2）室溫振盪5-10min，置回磁力架上，收集洗脫緩衝液，轉移至已加入中和緩衝液（1M Tris，pH 8.54）的收集管中混勻，獲得雙特異性抗體樣品EGFRxcMET-1。
利用HPLC檢測獲得蛋白的純度。HPLC方法如下，流動相：150mM Na2HPO4•12H2O，pH7.0。色譜條件：檢測波長280nm，柱溫25℃，流速0.5 ml/min，檢測時間：30min，TSK gel G3000SWXL色譜柱。SEC結果如圖1A顯示，一步親和純化獲得的雙特異性抗體純度為98.18%。
利用高效液相質譜檢測獲得蛋白的重輕鏈配對情況，使用儀器為液相系統VanquishUHPLC（Thermo）、質譜儀Q Exactive（Thermo）及色譜柱Waters ACQUITY UPLCBEH C4，2.1mm×10 mm。取樣品50 μg，加入超純水稀釋至25μl，離心取20μl樣品至10進樣瓶，進樣 5μl，採用 LC-MS分析完整分子量。色譜條件為：柱溫：80℃；紫外檢測波長：280nm；流速：0.3mL/min；流動相A：水溶液（含0.1%甲酸）；流動相B：乙腈溶液（含0.1%甲酸）。質譜參數為：ESI離子源：離子傳輸管溫度320℃，電壓3.8kV，氣體流速36L/min；模式：正離子Full MS；分辨率：17500；掃描範圍：600-4000m/z。結果如圖1B所示，純化的雙特異性抗體的正確配對產物比例為＞98%。
實施例2. 抗EGFRxc-Met雙特異性抗體注射液製備
使用枸櫞酸-枸櫞酸鈉鹽（簡稱：CA）緩衝液，製備濃度為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50mg/mL的雙特異性抗體液體製劑，可任選的加入蔗糖。 表6. EGFRxcMet 雙特異性抗體注射液成分
成分 終濃度
EGFRxcMET-1 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50mg/mL
枸櫞酸-枸櫞酸鈉鹽緩衝液 10mM
蔗糖 40 mg/mL
製備1kg的10mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液，稱取0.282g一水合枸櫞酸(C 6H 8O 7·H 2O)，2.547g二水合枸櫞酸鈉(C 6H 5Na 3O 7·2H 2O)，加水定容至1Kg，並將緩衝液進行過濾。通過透析換液的方式，將EGFRxcMET-1置換到上述製備的10mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液中，分別加入蔗糖母液配製成目標配製劑，蛋白濃度為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50mg/mL，在生物安全櫃中使用0.22μm PVDF濾膜過濾後分裝至西林瓶中加塞並壓蓋，製備得到雙特異性抗體注射液。
實施例3. 抗EGFRxc-Met雙特異性抗體與EGFR和c-Met陽性腫瘤細胞結合活性
A375細胞是購自於（Addexbio）的人惡性黑色素瘤細胞，低表達EGFR和c-Met受體。H292細胞是購自於（procell）的人肺腺癌細胞，較高表達EGFR 和c-Met受體。HCC827 細胞是購自於（中科院典藏細胞庫）的人非小細胞肺癌細胞，高表達EGFR和c-Met受體。將擴大培養的細胞調整至合適細胞密度加入96孔流式板，離心後加入梯度稀釋的待測樣品，4℃孵育1h。PBS清洗兩次，加入對應稀釋至合適濃度的螢光二抗, 4℃孵育30min, PBS 清洗兩次。加入PBS重懸細胞，在CytoFlex流式細胞儀上進行檢測並計算對應的MFI。
對於不同EGFR和MET表達峰度的腫瘤細胞，EGFRxc-Met雙特異性抗體待選分子EGFRxcMET-1顯示出了較強的細胞結合活性抗體，結合強度EC 50值具體如下表7。 表7. 抗體與腫瘤細胞結合活性
A375 EC 50(nM) H292 EC 50(nM) HCC827 EC 50(nM)
EGFRxcMET-1 1.35 2.34 3.67
實施例4. 抗EGFRxc-Met雙特異性抗體誘導ADCC效應
A375細胞是購自於（Addexbio）的人惡性黑色素瘤細胞，表達EGFR和c-Met受體。H1975細胞是購自於（Addexbio）的人肺腺癌細胞，較高表達EGFR和c-Met受體。HCC827細胞是購自於（中科院典藏細胞庫）的人非小細胞肺癌細胞，高表達EGFR和c-Met受體。將擴大培養的A375/H1975/HCC827細胞用1640培養基重懸，細胞密度為1.2x10 6cells/ml；CD16a-NFAT-Luc Jurkat報導基因細胞（自建，將CD16a和NFAT-Luc基因序列構建在pCDNA3.1載體上，然後轉染Jurkat細胞，通過抗生素抗性加壓篩選得到CD16a-NFAT-Luc Jurkat報導基因細胞）用1640培養基重懸，細胞密度調整為6x10 6cells/ml cells/ml；用1640培養基將抗體稀釋至300nM，然後4倍梯度稀釋，在96孔細胞培養板中每孔加入25 ul上述梯度稀釋的抗體，同時每孔加入25 ul上述靶細胞，混合後室溫孵育30 min，然後每孔加入25 ul上述效應細胞，混合後放入37℃，5% CO 2條件下培養6 h後，每孔75 ul加入Bio-turbo試劑（購自瑞安），混勻後用酶標儀收集化學發光信號。
EGFRxc-Met雙特異性抗體EGFRxMET-1誘導了ADCC效應，並且呈現出了對於抗原表達量的依賴性（HCC827＞H1975＞A375）。
實施例5. 不同劑量EGFRxc-Met雙特異性抗體在H292荷瘤CB-17 SCID小鼠模型的腫瘤抑制作用
本研究通過在CB-17 SCID小鼠皮下接種人肺癌細胞H292（高表達EGFR/c-MET）建立荷瘤模型，該可用於評價與供試品作機制相關的抗腫和疾病狀態下的安全性特徵。本試驗共分4組，每組6隻，分別腹腔注射給予PBS、3個不同劑量（2、8、32 mg/kg）的EGFRxcMET-1，每4~6天給藥1次，共給藥3次。考察不同劑量雙特異性抗體對CB-17 SCID小鼠皮下接種的人肺癌細胞H292腫瘤模型的生長抑制作用及其安全性。
陰性對照PBS組小鼠腫瘤快速增長，至試驗終點（D30）時平均腫瘤體積達到900 mm 3以上，表明本次試驗腫瘤模型建立成功。
試驗結束時，PBS組和2、8、32 mg/kg的EGFRxcMET-1組的腫瘤體積分別為 930.82 mm 3、587.42 mm 3（P＜0.05）、65.03 mm 3（P＜0.0001）、45.35 mm 3（P＜0.0001）。 與陰性對照PBS組相比，EGFRxcMET-1各劑量組可依賴性地抑制腫瘤的生長，TGI分別為45%、113%和115%，腫瘤重量分別為0.53 g、0.30 g（P＜0.01）、0.03 g（P＜0.0001）、 0.01 g（P＜0.0001），結果詳見表8。各組小鼠狀態未見異常；與對照組相比，各給藥組小鼠體重未見明顯降低；試驗結束時各組小鼠大體解剖主要臟器均未見明顯異常，表明各組藥物在本試驗所採用的給藥劑量下對小鼠未產生明顯的毒性。 表8. 試驗終點（D30）時各處理組對H292皮下移植瘤體積、重量和TGI 的影響
組別 給藥類別 腫瘤體積（mm 3） 腫瘤生長抑制率TGI（%） 腫瘤重量（g）
Group 1 PBS 930.82 N/A 0.53
Group 2 2 mg/kg EGFRxcMET-1 587.42* 45% 0.30**
Group 3 8 mg/kg EGFRxcMET-1 65.03**** 113% 0.03****
Group 4 32 mg/kg EGFRxcMET-1 45.35**** 115% 0.01****
注：與 PBS組相比，「NS」P＞0.05；「*」P＜0.05；「**」P＜0.01；「****」P＜0.0001
實施例6. 聯合奧希替尼對 NOD/SCID 小鼠皮下接種的 H1975-HGF腫瘤模型的生長抑制作用研究
本研究通過在NOD/SCID小鼠皮下接種H1975-HGF（高表達EGFR（T790M/L858R）、c-MET）人肺癌細胞建立腫瘤模型，該模型可用於評價與供試品作用機制相關的抗腫瘤作用和疾病狀態下的安全性特徵。本試驗共分6 組，每組6隻，分別腹腔注射給予 PBS、3mg/kg 埃萬妥單抗（Rybrevant）、3mg/kg EGFRxcMET-1、3mg/k奧希替尼（Osimertinib）、3mg/kg埃萬妥單抗 聯合3mg/kg奧希替尼、3mg/kg EGFRxcMET-1聯合 3mg/kg 奧希替尼。奧希替尼每天給藥1次，共給藥6次；EGFRxcMET-1/埃萬妥單抗每2天給藥1次，共給藥2次。考察EGFRxcMET-1聯合奧希替尼對NOD/SCID小鼠皮下接種的H1975-HGF腫瘤模型的生長抑制作用及其安全性。
綜合考慮試驗終點腫瘤體積、TGI指標以及腫瘤重量的結果，EGFRxcMET-1聯合奧希替尼組有1/6腫瘤消退，其它各組未見腫瘤消退。EGFRxcMET-1聯合奧希替尼的抑瘤作用明顯強於兩個單藥，展示出良好的聯合增效作用；且EGFRxcMET-1聯合奧希替尼的抑瘤作用優於埃萬妥單抗聯合奧希替尼。 表9. 各處理組對 H1975-HGF腫瘤體積、重量和TGI的影響
組別 給藥類別 腫瘤體積（mm 3） 腫瘤生長抑制率TGI（%） 腫瘤重量（g） 腫瘤消退數
Group 1 PBS 1619.09 N/A 1.12 0/6
Group 2 3 mg/kg 埃萬妥單抗 1026.62** 49% 0.79* 0/6
Group 3 3 mg/kg EGFRxcMET-1 593.88*** 85% 0.53*** 0/6
Group 4 3 mg/kg 奧希替尼 1030.39** 49% 0.84* 0/6
Group 5 3 mg/kg 埃萬妥單抗 + 3 mg/kg 奧希替尼 483.72**** 94% 0.35**** 0/6
Group 6 3 mg/kg EGFRxcMET-1 + 3 mg/kg 奧希替尼 146.23**** 122% 0.10**** 1/6
注：與 PBS 組相比，「NS」P＞0.05；「*」P＜0.05；「**」P＜0.01；「***」P＜0.001；「****」P＜0.0001；N/A 未進行統計分析。
實施例7. Ba/F3 EGFR D770-N771 ins_SVD裸小鼠皮下移植瘤模型體內藥效學研究
在含有 EGFR 20外顯子插入突變的小鼠原B細胞Ba/F3 EGFR D770-N771 ins_SVD 裸小鼠皮下異種移植瘤模型中，每週2次腹腔注射給藥，連續給藥2週（共給藥4次），分別給予10mg/kg的埃萬妥單抗，3、10mg/kg的EGFRxcMET-1，對應的腫瘤抑制率TGI分別為53.35%、49.23%、58.41%。在同等劑量（10mg/kg）下，EGFRxcMET-1抑瘤效果與埃萬妥單抗相當，且所有動物耐受良好。 表10. 對Ba/F3 EGFR-D770-N771ins_SVD異種移植瘤模型的抑瘤藥效評價
組別 腫瘤體積(mm 3) T/C (%) TGI (%) p值
Vehicle (溶劑對照) 1003.01±64.41 - - -
Human IgG對照 1087.45±121.15 108.42 -9.46 -
埃萬妥單抗 (10 mg/kg) 523.49±75.01 52.19 53.35 ＜0.0001
EGFRxcMET-1 (3 mg/kg) 559.94±35.20 55.83 49.23 ＜0.0001
EGFRxcMET-1 (10 mg/kg ) 478.67±51.79 47.72 58.41 ＜0.0001
實施例8. Ba/F3 EGFR-Del19/T790M/C797S裸小鼠皮下移植瘤模型體內藥效學研究
在含有EGFR三突變的小鼠原 B 細胞Ba/F3 EGFR-Del19/T790M/C797S裸小鼠皮下異種移植瘤模型中，每週2次腹腔注射給藥，連續給藥2週（共給藥4次），分別給予10 mg/kg的埃萬妥單抗，3、10和30 mg/kg的EGFRxcMET-1，對應的腫瘤抑制率TGI分別為97.17%、75.81%、96.57%、121.57%。EGFRxcMET-1抑瘤效果顯著且呈現出良好的量效關係，同等劑量（10 mg/kg）抑瘤效果與埃萬妥單抗相當，且所有動物耐受良好。 表11. 對Ba/F3 EGFR-Del19/T790M/C797S異種移植瘤模型的抑瘤藥效評價
組別 腫瘤體積(mm 3) T/C (%) TGI (%) p值
Vehicle (溶劑對照) 1164.27±113.75 - - -
Human IgG對照 1465.20±355.09 125.85 -28.61 -
埃萬妥單抗 (10mg/kg) 141.03±30.79 12.11 97.17 ＜0.0001
EGFRxcMET-1 (3mg/kg) 366.75±45.00 31.50 75.81 ＜0.0001
EGFRxcMET-1 (10mg/kg) 148.85±23.91 12.78 96.57 ＜0.0001
EGFRxcMET-1 (30mg/kg) 87.35±9.81 7.50 121.57 ＜0.0001
實施例9. 聯合阿美替尼對人非小細胞肺癌PC-9細胞系來源裸小鼠皮下移植瘤模型的體內藥效學研究
本研究評價EGFRxc-Met雙特異性抗體和阿美替尼聯合治療在含有EGFR 19外顯子缺失突變的非小細胞肺癌PC-9細胞系來源裸小鼠皮下異種移植瘤模型中的協同抗腫瘤作用。
PC-9細胞用含10%胎牛血清和1%青鏈黴素雙抗的RPMI 1640培養液，在37ºC、5% CO 2的培養箱中培養。待細胞長滿後分瓶傳代，收集對數生長期的細胞，計數。用PBS重懸細胞至終濃度為5.0×10 7cells/mL後接種。將0.1mL PC-9細胞懸液（含5x10 6個細胞）皮下接種於8-10週BALB/c裸鼠的右側背部。觀察腫瘤生長情況，根據腫瘤體積及動物體重進行隨機分組，分組時腫瘤平均體積為328mm 3。給藥當天定義為第1天，即Day 1。剩餘動物在實驗結束時實施安樂死。本試驗共分5組，每組1隻，實驗設計如下： 表12. PC-9裸小鼠皮下異種移植瘤模型實驗設計
分組 劑量 (mg/kg) 動物數量 給藥體積 (mL/kg) a 給藥 途徑 b 給藥頻率 c
Vehicle (溶劑對照) - 10 10 i.p. biw × 4w
IgG對照 10 10 10 i.p. biw × 4w
EGFRxcMET-1 10 10 10 i.p. biw × 8w
阿美替尼 10 10 10 p.o. qd × 90d
EGFRxcMET-1 + 阿美替尼 10+10 10 10 i.p./ p.o. biw/qd × 90d
a. 給藥體積：根據小鼠體重10 μl/g。如果體重下降超過15%，給藥方案應做出相應調整； b. p.o.：口服給藥；i .p.：腹腔給藥； c. qd：每天一次；biw：每週兩次。
Vehicle溶劑對照和IgG對照組小鼠連續給藥後第29天實施安樂死；EGFRxcMET-1組連續給藥後第60天實施安樂死；阿美替尼組和兩藥聯用組連續給藥90天後停藥，且在停藥後第65天實施安樂死。每個組的每個時間點的腫瘤體積數據以平均值和標準誤（SEM）表示。基於各組不同時間點腫瘤體積數據，運用Two-way或One-way ANOVA中Dunnett's multiple comparisons test進行組間差異分析。用GraphPad Prism 9進行所有數據分析，p＜0.05認為有顯著性差異。各組小鼠給後Day22的抑瘤率如表13所示，各組小鼠藥效終點的抑瘤率如表14所示。 表13. 雙特異性抗體和阿美替尼聯用對PC-9異種移植瘤模型的抑瘤藥效評價（給藥後第22天）
分組 腫瘤體積 (mm 3) T/C (%) TGI (%) p值
Vehicle (溶劑對照) 1510.99±154.57 - - -
IgG對照 1484.97±144.64 98.28 2.25 -
EGFRxcMET-1 (10mpk) 184.00±25.71 12.18 112.32 ＜0.0001
阿美替尼 (10mpk) 18.79±2.66 1.24 194.28 ＜0.0001
EGFRxcMET-1+阿美替尼 12.60±1.35 0.83 196.17 ＜0.0001
注：表中數據均為第22天的數據 表14. 雙特異性抗體和阿美替尼聯用對PC-9異種移植瘤模型抑瘤藥效評價（藥效終點第155天）
分組 腫瘤體積 (mm 3) T/C (%) 荷瘤小鼠（隻） p值
Vehicle (溶劑對照) 2169.44±275.75 - 10/10 -
阿美替尼 (10mpk) 903.91±360.28 41.67 7/10 ＜0.0001
EGFRxcMET-1+阿美替尼 111.77±111.77 5.15 1/10 ＜0.0001
注：表中數據均為各組藥效終點第155天
阿美替尼單藥組和EGFRxcMET-1+阿美替尼聯用組的藥效評價在Day155結束，剝取小鼠瘤塊拍照。阿美替尼單藥組，給藥3週後，平均瘤體積為18.79 mm 3，TGI為194.28%，隨後整組平均瘤體積不斷縮小。從第78天開始，平均瘤體積小於2mm 3，7小鼠腫瘤完全消退。停藥後阿美替尼單藥組消退的腫瘤陸續復發且不斷生長。藥效終點的平均瘤體積達到903.91mm 3，且之前腫瘤完全消退的7隻小鼠中，有4隻復發生長，藥效終點有7隻小鼠負荷腫瘤（7/10）。對於EGFRxcMET-1+阿美替尼聯用組，連續給藥3週後，平均瘤體積為12.60mm 3，TGI為196.17%，隨後整組平均瘤體積不斷縮小。從第78天開始，平均瘤體積小於1mm 3，9隻小鼠腫瘤完全消退。停藥後只有 3隻小鼠腫瘤復發，但其體積始終在5mm 3以下。藥效終點聯用組平均瘤體積為111.77mm 3，整組只有1隻小鼠負荷腫瘤（1/10）。各組在不同時間點的瘤體積如圖2所示。
EGFRxcMET-1對含有EGFR 19外顯子缺失突變的人非小細胞肺癌PC-9細胞系來源裸小鼠皮下異種移植瘤模型具有顯著的抑瘤作用。與EGFRxcMET-1單藥組相比，EGFRxcMET-1+阿美替尼聯用明顯增強腫瘤抑制效果；與阿美替尼單藥組相比，EGFRxcMET-1+阿美替尼聯用顯著延緩腫瘤的復發生長。
實施例10. EGFRxc-Met雙特異性抗體在晚期實體瘤患者中的安全性、耐受性、藥代動力學和有效性的I期臨床研究 1、研究目的
為評價EGFRxcMET-1在EGFR突變的局部晚期或轉移性NSCLC受試者中的安全性和耐受性，PK特徵，有效性，免疫原性，以及其他安全性指標。評價EGFRxcMET-1在晚期實體瘤受試者中的有效性，安全性，PK特徵，免疫原性，以及其他有效性指標。 2、研究藥物
受試藥物為EGFRxcMET-1注射液，序列如本發明中SEQ ID NO: 21-24。劑型：注射劑，規格：10ml: 200mg/支。本試驗中使用的研究藥物均由上海翰森生物醫藥科技有限公司提供。 3、給藥方案
劑量遞增試驗給予目標受試者靜脈滴注EGFRxcMET-1治療，劑量遞增將從預設起始劑量400 mg開始，按照400 mg、800 mg、1200 mg、1600 mg、2000 mg依次遞增。
Q2W組給藥方案：受試者從第1週期第1天（C1D1）開始每週一次，第2週期開始每2週一次靜脈滴注給藥，每4週為一個治療週期。400 mg劑量組，首劑在C1D1給藥；800 mg及以上劑量組，首劑在C1D1和C1D2兩天給藥，C1D1給藥400 mg，C1D2給藥本次餘下的劑量。第二劑及以後無需分次給藥。
Q3W組給藥方案：受試者在C1D1、C1D8、C1D15、C2D1每週一次，後續每3週一次靜脈滴注給藥，每3週為一個治療週期，首劑在C1D1和C1D2兩天給藥，C1D1給藥400 mg，C1D2給藥本次餘下的劑量。第二劑及以後無需分次給藥。 4、入組標準
Ia期：組織學或細胞學確診的經標準治療失敗或不耐受或無法獲得標準治療的且攜帶EGFR激活突變的局部晚期或轉移性NSCLC受試者。
Ib期：隊列1為組織學或細胞學確診的含鉑化療失敗或不耐受且攜帶EGFR Exon 20ins突變的局部晚期或轉移性NSCLC受試者。隊列2為組織學或細胞學確診的標準治療失敗或不耐受的其他晚期實體瘤。 5、臨床實驗結果
所有入組的19例受試者，14例受試者進行劑量遞增研究（400 mg Q2W組1例、800 mg Q2W組3例、1200 mg Q2W組4例和1600 mg Q2W組6例），5例受試者進行劑量拓展研究（800 mg Q2W組4例和2000 mg Q3W組1例）。
已完成4個劑量組的劑量遞增，均未觀察到劑量限制性毒性DLT事件。EGFRxcMET-1的最大耐受劑量MTD未達到。16例療效可評估受試者中，有1例受試者出現PR，有8例受試者出現SD（5例靶病灶縮小），DCR為56.3%。
綜上，目前研究結果顯示，EGFRxcMET-1在既往標準治療失敗或不耐受的晚期EGFR激活突變NSCLC受試者中具有抗腫瘤作用，各劑量組均觀察到初步的抗腫瘤活性。
實施例11. EGFRxc-Met雙特異性抗體聯合甲磺酸阿美替尼片在晚期非鱗非小細胞肺癌患者中的安全性、有效性、藥代動力學和免疫原性的Ib/III期臨床研究 1、研究目的
評估不同劑量水平的EGFRxcMET-1聯合阿美替尼用於攜帶EGFR突變的晚期階段未接受過系統性抗腫瘤治療的非鱗NSCLC受試者中的有效性、安全性、耐受性、PK特徵和免疫原性。 2、研究藥物
受試藥物為EGFRxcMET-1注射液，例如本發明中SEQ ID NO: 21-24。劑型：注射劑，規格：10ml: 200mg/支。本試驗中使用的研究藥物均由上海翰森生物醫藥科技有限公司提供。
受試藥物為甲磺酸阿美替尼片，劑型：片劑，規格：55mg/片。本試驗中使用的研究藥物均由上海翰森生物醫藥科技有限公司提供。 3、給藥方案
EGFRxcMET-1注射液兩個劑量（800 mg；1200 mg），從C1D1開始每週一次，第2週期開始每2週一次靜脈滴注給藥，每4週為一個治療週期，首劑在C1D1和C1D2兩天給藥，C1D1給藥400 mg，C1D2給藥本次餘下的劑量。第二劑及以後無需分次給藥。
阿美替尼從C1D1開始口服110 mg，每天一次，每4週為一個治療週期。 4、入組標準
組織學或細胞學確診的局部晚期或轉移性非鱗NSCLC，需攜帶EGFR敏感突變（L858R突變和/或19外顯子缺失突變），單突變或合併其他EGFR突變均可。受試者需在晚期階段未接受過系統性抗腫瘤治療和肺部姑息性治療。
儘管本發明的具體實施方式已經得到詳細的描述，但本發明所屬技術領域中具有通常知識者將理解：根據已經公佈的所有教導，可以對細節進行各種修改和變動，並且這些改變均在本發明的保護範圍之內。本發明的全部分為由所附申請專利範圍及其任何等同物給出。
圖1. 雙特異性抗體EGFRxc-Met-1的質量鑑定結果。其中1A顯示了親和純化獲得的雙特異性抗體的純度，1B顯示了純化的雙特異性抗體正確配對產物的比例。 圖2. 雙特異性抗體EGFRxc-Met-1和阿美替尼聯用對PC-9裸小鼠皮下移植瘤腫瘤生長的影響。
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Claims (25)

  1. 一種雙特異性抗體在製備預防或治療癌症的藥物中的用途，其中所述雙特異性抗體包含針對第一靶標c-Met的第一抗體或抗原結合片段，以及針對第二靶標EGFR的第二抗體或抗原結合片段； 其中第一抗體或抗原結合片段包含如SEQ ID NO: 01 所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 02 所示的HCDR2、如SEQ ID NO: 03 所示的HCDR3；和，如SEQ ID NO: 04 所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 05 所示的LCDR2、如SEQ ID NO: 06 所示的LCDR3； 其中第二抗體或抗原結合片段包含如SEQ ID NO: 09 所示的HCDR1、如SEQ ID NO: 10 所示的HCDR2、如SEQ ID NO: 11 所示的HCDR3；和，如SEQ ID NO: 12 所示的LCDR1、如SEQ ID NO: 13 所示的LCDR2、如SEQ ID NO: 14 所示的LCDR3。
  2. 如請求項1所述的用途，其中所述雙特異性抗體的c-Met結合結構域是由第一重鏈與第一輕鏈形成的Fab區域，EGFR結合結構域是由第二重鏈與第二輕鏈形成的Fab區域，第一重鏈與第二重鏈相互結合形成異源二聚體Fc區域。
  3. 一種雙特異性抗體的藥物組合物在製備預防或治療癌症的藥物中的用途，其中所述藥物組合物包含如請求項1或2所述的雙特異性抗體以及一種或多種可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
  4. 如請求項1-3中任一項所述的用途，其中所述雙特異性抗體或雙特異性抗體藥物組合物與EGFR 抑制劑聯合使用。
  5. 如請求項4所述的用途，其中所述EGFR 抑制劑選自埃羅替尼（erlotinib），吉非替尼（gefitinib），貝福替尼（befotertinib），奧希替尼（osimertinib），阿美替尼（almonertinib），伏美替尼（furmonertinib），奧瑞替尼（oritinib），瑞澤替尼（Rezetinib），艾維替尼（Avitinib），奧美替尼（olmutinib），羅西替尼（rociletinib）；優選為阿美替尼（almonertinib）、奧希替尼（osimertinib）。
  6. 如請求項1-5中任一項所述的用途，其中所述第一抗體或抗原結合片段包含如SEQ ID NO: 07 所示的重鏈可變區、如SEQ ID NO: 08 所示的輕鏈可變區；所述第二抗體或抗原結合片段包含如SEQ ID NO: 15 所示的重鏈可變區、如SEQ ID NO: 16所示的輕鏈可變區。
  7. 如請求項1-6中任一項所述的用途，其中所述第一抗體或抗原結合片段包含如SEQ ID NO: 21 所示的重鏈、如SEQ ID NO: 22 所示的輕鏈；所述第二抗體或抗原結合片段包含如SEQ ID NO: 23 所示的重鏈、如SEQ ID NO: 24所示的輕鏈。
  8. 如請求項1-7中任一項所述的用途，其中所述雙特異性抗體或雙特異性抗體藥物組合物，EGFR 抑制劑分別作為活性成分包含在不同製劑中，並且同時、並行、序貫、連續、交替或分開施用。
  9. 如請求項1-8中任一項所述的用途，其中所述癌症選自實體瘤，優選為晚期實體瘤。
  10. 如請求項1-9中任一項所述的用途，其中所述癌症為表達c-Met或/和EGFR的癌症。
  11. 如請求項10所述的用途，其中所述表達c-Met或/和EGFR的癌症由野生型EGFR、EGFR激活突變、EGFR基因擴增、循環HGF的水平升高、野生型c-Met、c-Met激活突變、c-Met基因擴增、MET基因擴增、或突變體KRAS介導，優選由EGFR激活突變、MET基因擴增介導。
  12. 如請求項11所述的用途，其中所述EGFR激活突變包括選自以下組成的組的至少一個突變：L718Q、L718V、G719A、G719S、G719C、G719D、L858R、L858P、L861Q、G724S、E746K、L747S、E749Q、A750P、A755V、V765M、C797S、S768I或T790M置換；E746-A750的缺失；R748-P753的缺失；M766與A767之間Ala (A)的插入；S768與V769之間Ser、Val和Ala (SVA)的插入；P772與H773之間Asn和Ser(NS)的插入；D761與E762之間、A763與Y764之間、Y764與Y765之間、M766與A767之間、A767與V768之間、S768與V769之間、V769與D770之間、D770與N771之間、N771與P772之間、P772與H773之間、H773與V774之間、V774與C775之間一個或多個胺基酸的插入；EGFR外顯子19中的一個或多個胺基酸的缺失；或EGFR外顯子19中的一個或多個胺基酸的插入；EGFR外顯子20中的一個或多個胺基酸的缺失；或EGFR外顯子20中的一個或多個胺基酸的插入。
  13. 如請求項1-12中任一項所述的用途，其中所述癌症選自上皮細胞癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、直腸癌、肛門癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、咽癌、鼻癌、胰腺癌、皮膚癌、口腔癌、舌癌、食管癌、陰道癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、脾癌、睪丸癌、胃癌、胸腺癌、結腸癌、甲狀腺癌、肝癌或黑色素瘤，優選為肺癌或肝癌。
  14. 如請求項12所述的用途，其中所述癌症是非小細胞肺癌 (NSCLC)、肺腺癌、肺鱗癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌、肺肉瘤樣癌、肝細胞癌 (HCC)。
  15. 如請求項14所述的用途，其中所述癌症是非鱗非小細胞肺癌。
  16. 如請求項4-15中任一項所述的用途，其中：所述EGFR 抑制劑給藥劑量為10-500mg，優選為10-200mg，更優選為100mg，110 mg，120 mg，130 mg，140 mg，150 mg，160 mg，170 mg，180 mg，190 mg，200 mg。
  17. 如請求項4-16中任一項所述的用途，其中：所述EGFR 抑制劑給藥頻次為每天兩次、每天一次、兩天一次、三天一次，優選為每天一次、兩天一次。
  18. 如請求項3-17中任一項所述的用途，其中：所述雙特異性抗體藥物組合物，單位濃度為約1mg/mL至約100mg/mL，優選為約5mg/mL至約50mg/mL，更優選為約10mg/mL至約30mg/mL。
  19. 如請求項3-18中任一項所述的用途，其中：所述雙特異性抗體藥物組合物，規格為每支10mL：10mg至10mL：1000mg，優選10mL：100mg至10mL：500mg，更優選10mL：100mg、10mL：200mg、10mL：300mg、10mL：400mg或10mL：500mg。
  20. 如請求項1-19中任一項所述的用途，其中：所述雙特異性抗體或雙特異性抗體藥物組合物的給藥劑量選自約100mg至約5000mg，優選400mg至約2000mg，更優選為400mg，800mg，1000mg，1200mg，1400mg，1600mg，1800mg，2000mg。
  21. 如請求項1-20中任一項所述的用途，其中：所述雙特異性抗體或雙特異性抗體藥物組合物的給藥頻次為一日一次、兩日一次、三日一次、一週兩次、一週一次、兩週一次、三週一次、一月一次，優選為一週一次、兩週一次、三週一次。
  22. 如請求項21所述的用途，其中：所述雙特異性抗體或雙特異性抗體藥物組合物的給藥頻次為： 1）第一治療週期一週一次、第二治療週期起兩週一次，每四週為一個治療週期；或 2）第一治療週期一週一次、第二治療週期起三週一次，每三週為一個治療週期。
  23. 一種治療或預防癌症的方法，該方法包括向有需要的受試者施用如請求項1-22中任一項所述的雙特異性抗體或雙特異性抗體藥物組合物。
  24. 一種治療或預防癌症的方法，該方法包括向有需要的受試者組合施用如請求項1-22中任一項所述的雙特異性抗體或雙特異性抗體藥物組合物，如請求項4-17中任一項所述的EGFR 抑制劑，所述組合施用可以是同時、並行、序貫、連續、交替或分開施用。
  25. 如請求項23或24所述的方法，其中所述癌症為實體瘤，優選為上皮細胞癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、直腸癌、肛門癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、咽癌、鼻癌、胰腺癌、皮膚癌、口腔癌、舌癌、食管癌、陰道癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、脾癌、睪丸癌、胃癌、胸腺癌、結腸癌、甲狀腺癌、肝癌或黑色素瘤，更優選為非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌、肺肉瘤樣癌、肝細胞癌。
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