TW201936923A

TW201936923A - 免疫刺激性寡核苷酸

Info

Publication number: TW201936923A
Application number: TW107144947A
Authority: TW
Inventors: 湯瑪士伊爾格
Original assignee: 德商拜耳動物保健有限公司
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2019-09-16
Also published as: AU2018382419A1; PH12020550906A1; US20210062192A1; SG11202004773SA; SG11202004952UA; CR20200260A; PH12020550903A1; US11932857B2; CN120519464A; CO2020007120A2; US20240076681A1; IL275086A; US20250215439A1; EP3694549A1; IL274975A; RU2020122545A3; EP3701032A1; JP7770769B2; EP4647437A2; DOP2020000113A

Abstract

本發明提供用於刺激類鐸受體9(TLR9)的組成物以及方法。更具體而言，本文揭示免疫刺激性寡核苷酸、提高寡核苷酸之免疫刺激性性質的方法，以及引起免疫反應的方法。

Description

免疫刺激性寡核苷酸

涉及的相關申請案

本申請案請求各自於2017年12月15日提申之歐洲專利申請案第EP17207740.6號、第EP17207746.3號，以及第EP17207750.5號的優先權以及權益，其等之揭示內容以其全文引用的方式併入本文。

序列表

本申請案含有序列表，序列表已呈ASCII格式電子呈交並且以其全文引用的方式併入。在2018年11月27日產生的該份ASCII抄本被命名為103976.000119 SEQ LISTING_ST25.txt且大小為2,233位元組。

抗生素抗性是一個不利地影響眾多產業的全球性難題。抗二甲苯青黴素金黃色葡萄球菌(MRSA)以及其他「超級細菌(super bugs)」在醫院以及醫生執業處產生破壞，使得逗留在健康中心可能變得有危險。農業也經歷類似問題。因為空間有限且沒有無菌環境，所有畜群處於病原菌感染的風險之下。舉例來說，一頭與其畜群緊密靠近的病牛可能以指數的方式增加發病率和死亡率。儘管有感染風險，由於成本增加還有消費者需要不曾暴露於抗生素的肉品和乳製品，已變得不偏好抗生素治療。而那些使用抗生素療法的生產者了解到，即便是廣效抗生素，也不全都能有效對抗畜群所接觸到的每一種病原菌。

因此，需要以非抗生素為基礎的療法，以供在動物體內治療或預防感染。所揭示的組成物以及方法是針對這些以及其他重要需求。

本文揭示免疫刺激性寡核苷酸，其包含至少一個CpG模體(motif)以及一個3’膽固醇基部分。

本文亦提供包含免疫刺激性寡核苷酸的免疫刺激性組成物。

亦揭示用於提高TLR9配位體之免疫性的方法，包含使一膽固醇基部分經由一連接子附接至TLR9配位體的3’端，其中TLR9配位體是具有至少一個CpG模體的寡核苷酸。

亦提供用於在個體體內引起TLR9-媒介之免疫反應的方法，包含向該個體投與本文所述免疫刺激性寡核苷酸或免疫刺激性組成物中的任一者。

當與附圖一起閱讀時會進一步了解發明內容以及以下的詳述說明。為了說明所揭示的組成物以及方法，圖式中顯示組成物以及方法的例示性具體例；但是，該等組成物以及方法並不限於揭示的特定具體例。在圖式中：圖1描述附接至一個己二醇連接子之膽固醇基部分的化學結構。

圖2A與2B比較寡核苷酸PTO-2006、具有3’ TTTTGGGGGTTTT序列(SEQ ID NO：9)序列的寡核苷酸PDE-2006 (「2006-3dT4G5T4」)，以及具有經由一個如圖1中所示己二醇連接子附接的3’膽固醇基部分的寡核苷酸2006-3dT4G5T4(「2006-3dT4G5T43C」)在HEKBlue-hTLR9細胞中的TLR9刺激活性。

圖3描述具有3’ TTTT序列的寡核苷酸PDE-2006(「2006-T4-PDE」)以及具有經由一個圖1之己二醇連接子附接至寡核苷酸3’端之膽固醇基部分的寡核苷酸2006-T4-PDE(「3Chol-2006-T4-PDE」)在HEKBlue-hTLR9細胞中引起TLR9媒介之免疫反應的能力。

圖4A與4B比較寡核苷酸2006-3dT4G5T4以及寡核苷酸2006-3dT4G5T4C的TLR9刺激特徵。

圖5比較寡核苷酸2006-3dT4G5T4以及寡核苷酸2006-3dT4G5T4C的TLR9刺激特徵。

圖6描述附接至一個六乙二醇連接子之膽固醇基部分的化學結構。

圖7比較寡核苷酸2006-T4G5T4以及具有圖6之膽固醇基-連接子部分附接至其3’端的寡核苷酸2006-T4G5T4(「2006-T4G5T4-3Chol」或「2006-T4G5T4-3C」)的TLR9刺激活性。

圖8比較有與沒有3’膽固醇基修飾之寡核苷酸的免疫性。圖8A比較寡核苷酸2007-PDE-T4寡核苷酸在HEKBlue-hTLR9細胞中引起TLR9媒介之免疫反應的能力以及具有經由一個圖1之己二醇連接子附接之膽固醇基部分的寡核苷酸2007-PDE-T4寡核苷酸(「2007-PDE-T4-3Ch」)在HEKBlue-hTLR9細胞中引起TLR9媒介之免疫反應的能力，而圖8B比較具有3’ GGGGGTTTT序列之寡核苷酸2007-PDE-T4(「2007-T4G5T4」)，以及帶有經由一個圖1中所示己二醇連接子附接之膽固醇基部分的寡核苷酸2007-T4G5T4(「2007-T4G5T4-3Ch」)在HEKBlue-hTLR9細胞中的能力。

圖9A及9B比較有與沒有3’膽固醇基修飾之寡核苷酸的免疫性。更具體來說，圖9A說明2006-PTO、2006-3dT4G5T4以及2006-3dT4G5T4C寡核苷酸在Ramos-Blue細胞中經由TLR9-媒介之免疫反應的免疫性，而圖9B說明圖9A在更窄的濃度範圍內所描述的結果。

圖10A與10B比較有或沒有經由一個己二醇連接子附接之3’膽固醇基部分的寡核苷酸在Ramos-Blue細胞中引起TLR9-媒介之免疫反應的能力。更具體來說，圖10A說明寡核苷酸2006-3dT4G5T4以及2006-3dT4G5T4C引起TLR9-媒介之免疫反應的相對能力。圖10說明圖10A在更窄的濃度範圍內所描述的結果。

圖11比較寡核苷酸2006-T4-PDE以及具有經由一個圖1中所示己二醇連接子附接之3’膽固醇基部分的寡核苷酸2006-T4-PDE(「3Chol-2006-T4-PD」)在Ramos-Blue中的免疫性。

圖12比較寡核苷酸2006-3dT4G5T4以及寡核苷酸2006-3dT4G5T4-3Chol在Ramos-Blue細胞中引起TLR9媒介之免疫反應的能力。

圖13A、13B與13C比較在有或沒有附接至寡核苷酸3’端之膽固醇基部分的情況下，2007-PDE-T4、2007-T4G5T4以及TCG8-T4寡核苷酸在Ramos-Blue細胞中刺激TLR9的能力。圖13A說明寡核苷酸2007-PDE-T4與2007-PDE-T4-Ch3的差異免疫性。圖13B說明寡核苷酸2007-T4G5T4與2007-T4G5T4-3Ch的差異免疫性。圖13C說明寡核苷酸TCG8-T4與TCG8-T4-Ch3的差異免疫性。

圖14A、14B、14C以及14D比較數種寡核苷酸以及經膽固醇基修飾之寡核苷酸在HEKBlue-mTLR9細胞中對於小鼠TLR9(「mTLR9」)的刺激活性。圖14A比較未經修飾2007-PDE-T4寡核苷酸以及寡核苷酸 2007-PDE-T4-3Ch在HEKBlue-mTLR9細胞中引起TLR9媒介之反應的能力。圖14B比較未經修飾2007-T4G5T4寡核苷酸以及寡核苷酸2007-T4G5T4-3Ch在HEKBlue-mTLR9細胞中引起TLR9媒介之反應的能力。圖14C比較寡核苷酸TCG8-T4以及寡核苷酸TCG8-T4-3Ch在HEKBlue-mTLR9細胞中引起TLR9-媒介之反應的能力；而圖14D比較TCG8-T4G5T4寡核苷酸以及具有經由一個圖1中所示己二醇連接子附接之3’膽固醇基部分的寡核苷酸TCG8-T4G5T4在HEKBlue-mTLR9細胞中引起TLR9-媒介之反應的能力。

圖15描述附接至六乙二醇連接子之膽固醇基部分的化學結構。

圖16A、16B、16C以及16D描述利用膽固醇基部分修飾寡核苷酸的3’端或5’端對於寡核苷酸引起TLR9-媒介之免疫反應的能力的影響。圖16A以圖描述寡核苷酸2006-PDE-T4、2006-PDE-T4-Chol以及具有經由一個圖15中所示六乙二醇連接子附接之5’膽固醇基部分的寡核苷酸2006-PDE-T4(「2006-PDE-T4-5Chol」)在HEKBlue-hTLR9細胞中刺激TLR9的能力。圖16B以圖描述寡核苷酸2006-PTO、具有GGGGG3’端序列之寡核胺酸2006-PDE(「2006-G5」)、具有經由一個圖6中所示六乙二醇連接子附接之3’膽固醇基部分的寡核苷酸2006-G5(「2006-G5-3Chol」)，以及具有經由一個圖15中所示六乙二醇連接子附接之5’膽固醇基部分的寡核苷酸2006-G5(「2006-G5-5Chol」)在HEKBlue-hTLR9細胞中刺激TLR9的能力。圖16C以圖描述寡核苷酸2006-PTO、2006-T4G5T4、2006-T4G5T4-3Chol以及具有經由一個圖15中所示六乙二醇連接子附接之5’膽固醇基部分的寡核苷酸2006-T4G5T4(「2006-T4G5T4-5Chol」)在HEKBlue-hTLR9細胞中刺激TLR9-媒介之免疫反應的能力。圖16D以圖描述寡核苷酸TCG8-T4G5T4、具有經由一個圖6中所示六乙二醇連接子附接之3’膽固醇基部分寡核苷酸TCG8-T4G5T4(「TCG8-T4G5T4-3Chol」)，以及具有經由一個圖15中所示六乙二醇連接子附接之5’膽固醇基部分的寡核苷酸TCG8-T4G5T4(「TCG8-T4G5T4-5Chol」)在HEKBlue-hTLR9細胞中刺激TLR9-媒介之免疫反應的能力。.

圖17A、17B、17C以及17D說明利用膽固醇基部分修飾寡核苷酸3’端或5’端的影響。圖17A以圖描述寡核胺酸2006-PDE-T4、2006-PDE-T4-Chol以及2006-PDE-T4-5Chol在Ramos-Blue細胞中刺激TLR9的能力。圖17B以圖描述寡核苷酸2006-PTO、2006-G5、2006-G5-3Chol以及2006-G5-5Chol在Ramos-Blue細胞中刺激TLR9的能力。圖17C以圖描述寡核苷酸2006-PTO、2006-T4G5T4、2006-T4G5T4-3Chol以及寡核苷酸2006-T4G5T4-5Chol在Ramos-Blue細胞中刺激TLR9-媒介之免疫反應的能力。圖17D以圖描述寡核苷酸TCG8-T4G5T4、TCG8-T4G5T4-3Chol以及TCG8-T4G5T4-5Chol在Ramos-Blue細胞中刺激TLR9-媒介之免疫反應的能力。

透過參照形成本揭示內容一部分的以下詳細說明以及隨附圖式，可以更容易地理解所揭示的組成物以及方法。應理解，所揭示的組成物以及方法不限於本文所述及/或所示的特定組成物與方法，且本文所使用的術語僅是為了例示的方式來說明特定具體例，而不希望是限制所請求的組成物與方法。

除非另有明確說明，否則任何改良用的可能作用機制或模式或理由的說明表示僅為說明性，且所揭示的組成物以及方法不囿限於任何此等暗示之改良用作用機制或模式或理由的正確性或不正確性。

本文通篇之中，說明提到組成物以及使用組成物的方法。若揭示內容描述或請求與組成物相關的特徵或具體例，則此一特徵或具體例同樣適用於使用該組成物的方法。相同地，若揭示內容說明或請求與使用某一組成物之方法有關的特徵或具體例，則此一特徵或具體例同樣適用於該組成物。

表示數值範圍時，另一個具體例包括從一個特定數值及/或至其他特定數值。此外，提到範圍內所指明的數值時包括那個範圍內的各個與每個數值。所有的範圍都是包含性且可組合。若數值表示為近似值，則使用先行詞「約」將理解為該特定數值構成另一個具體例。除非上下文另有清楚指明，否則提到特定數值包括至少一個那個特定數值。

要理解所揭示組成物以及方法的某些特徵(為清楚起見，在本文個別具體例的內文中說明)也可組合在單一具體例中提供。相反地，所揭示組成物以及方法的不同特徵(為簡明起見，在單一具體例的內文中說明)也可以分別或以任一種子組合提供。

如本文所用，單數型「一(a、an)」以及「該(the)」包括複數型。

如本文所用，「CpG模體」意指胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸序列。本文所述的免疫刺激性核酸含有一或多個CpG模體，當其為未甲基化時可與類鐸受體蛋白(TLR)交互作用並且引起免疫反應。

術語「個體」如本文所用意欲表示任何動物，具體而言為哺乳動物，且任何類型的禽類、哺乳動物，或水生物種也可以使用所揭示的方法予以治療。

於說明書以及申請專利範圍通篇中使用與發明說明之態樣相關的各種術語。除非另有指明，否則此等術語以其在技藝中的通常意義提供。其他特別定義的術語以與本文提供之定義一致的方式來解釋。

本文揭示包含至少一個CpG模體以及一個3’端膽固醇基部分的寡核苷酸。先前已證明，寡去氧核苷酸(ODN)中的CpG模體可以在哺乳動物體內引起免疫反應。在一些情況下，CpG模體是受到類鐸受體(TLR)所辨識。辨識CpG之TLR的實例包括(但不限於)TLR9的哺乳動物同系物。因此，在本揭示內容的一些態樣中，辨識CpG的TLR為小鼠、人類、牛、豬、馬或綿羊TLR9同系物。ODN的免疫性可能不足以在易染病群體或感染個體中引起能夠避開感染的免疫反應。如本文所證明，ODN的免疫刺激性性質可以透過修飾寡核苷酸而被提高，特別是在ODN的3’端處添加胸嘧啶連串序列(run)、鳥嘌呤連串序列，及/或膽固醇基部分。

本揭示內容的免疫刺激性寡核苷酸包含至少一個CpG模體。在一些具體例中，免疫刺激性寡核苷酸包含介於一至十個CpG模體。在其他具體例中，免疫刺激性寡核苷酸可包含甚至二十個CpG模體。因此，在一些具體例中，本揭示內容的免疫刺激性寡核苷酸包含一、二、三、四、五、六、七、八、九或十個CpG模體。在其他具體例中，免疫刺激性寡核苷酸包含介於十一至十五個CpG模體或甚至介於十五與二十個CpG模體。

本文預期在核苷酸之間包含磷酸二酯及/或硫代磷酸酯鍵結(linkage)的寡核苷酸。在一些態樣中，本揭示內容之寡核苷酸在寡核苷酸的核苷酸之間包含磷酸二酯鍵結。在其他態樣中，寡核苷酸在寡核苷酸的核苷酸之間包含硫代磷酸酯鍵結。本文也預期其他鍵結。例如，本揭示內容之寡核苷酸可包含其他鍵結，包含(但不限於)磷酸乙酸酯、甲基磷酸酯，以及磷酸甲酸酯鍵結。該等鍵結中的一些可提供更甚於其他鍵結的期望優點，諸如生產成本、生產的簡易性及/或品質，以及免疫刺激性影響提高。

在本揭示內容的一些態樣中，由於CpG模體，寡核苷酸的免疫性可能進一步受到非CpG序列所提高。如實例中所示，將胸嘧啶連串序列添加至寡核苷酸的3’端可能增進寡核苷酸的穩定性，以便引起TLR9媒介的免疫反應。基於這個理由，在本揭示內容的一些具體例中，免疫刺激性寡核苷酸的3’端序列包含複數個胸嘧啶作為3’端序列。在一些態樣中，這複數個胸嘧啶核苷酸包含連續的胸嘧啶核苷酸。在一些態樣中，該複數個胸嘧啶核苷酸包含四個與六個之間的連續胸嘧啶核苷酸。例如，在本揭示內容的一些具體例中，3’端序列包含SEQ ID NO：9。在一些具體例中，寡核苷酸包含SEQ ID NO：2、3、4、5、6或8。而在一些態樣中，寡核苷酸序列的3’端序列為TTTT。

對免疫刺激性寡核苷酸的3’末端進行其他序列修飾也可能有助於提高免疫性。例如，在本揭示內容的一些具體例中，免疫刺激性寡核苷酸在3’端序列處或鄰近3’端序列處包含複數個鳥嘌呤。在一些態樣中，免疫刺激性寡核苷酸的3’端序列包含複數個鳥嘌呤核苷酸。在一些態樣中，複數個尿嘌呤核苷酸包含連續的鳥嘌呤核苷酸，諸如依據本揭示內容具有3’端序列GGGGG的寡核苷酸。在一些態樣中，寡核苷酸包含SEQ ID NO：7。

增加免疫刺激性寡核苷酸的免疫性不限於修飾寡苷酸的3’端。也可以修飾內部序列(例如)來增加CpG模體的數量。在一些態樣中，寡核苷酸可以在寡核苷酸的5’末端與3’末端之間含有額外CpG模體的方式來合成。在一些態樣中，免疫刺激性寡核苷酸包含序列(TCG)_n，其中n介於三與十。因此，在本揭示內容的一些態樣中，寡核苷酸包含序列(TCG)_n，其中n為3、4、5、6、7、8、9或10。

在本揭示內容的一些具體例中，免疫刺激性寡核苷酸在3’端可包含脂質部分以提高寡核苷酸的免疫性質。因此，在一些具體例中，膽固醇基部分經由連接子共價地附接至免疫刺激性寡核苷酸的3’端核苷酸。膽固醇基部分可能透過防止降解、增加溶解性、藉由形成更高級的結構(例如微胞)產生配體多價數、增加寡核苷酸在醫藥組成物中的穩定性或其任何組合來增加寡核苷酸的免疫性。具有至少兩個能夠形成共價鍵之部分的連接子可以與膽固醇基部分以及與寡核苷酸鍵結。例如，在一些具體例中，連接子與膽固醇基部分的羥基交互作用而形成共價鍵，且與寡核苷酸的3'端核苷酸交互作用。在一些態樣中，膽固醇基部分共價結合至連接子而形成膽固醇基-連接子部分。在一些態樣中，連接子先附接至膽固醇基部分，而所生成的膽固醇基-連接子又附接至寡核苷酸。在其他態樣中，連接子先附接至寡核苷酸，然後附接至膽固醇基部分。在一些態樣中，膽固醇基-連接子為商業上可取得。

除了具有可以結合至寡核苷酸還有膽固醇基部分的部分以外，連接子的一些具體例包含碳鏈，而在一些態樣中該碳鏈包含介於3至12個碳原子。舉例而言，因為末端羥基可與寡核苷酸的羥基以及膽固醇基部分的羥基共價鍵結，二醇可用作為膽固醇基部分以及寡核苷酸之間的連接子。在一些態樣中，連接子包含己二醇。在一些態樣中，膽固醇基-連接子部份具有圖1中所示的化學結構。其他具體例提供含有重複化學單元的連接子。在一些態樣中，化學單元重複介於兩次至十二次。在一些態樣中，重複化學單元包含乙二醇，且其中該乙二醇化學單元重複六次，則連接子包含六乙二醇。包含六乙二醇的連接子可具有圖6中所示的化學結構。

在一些具體例中，將會希望向有需要的個體遞送如本文所述的寡核苷酸。寡核苷酸可以做為免疫刺激性組成物遞送。提供包含本文揭示之任一寡核苷酸的免疫刺激性組成物。在一些態樣中，這些免疫刺激性組成物包含寡核苷酸以及影響組成物之免疫性、有效性和效率的其他組份。在本揭示內容的一些具體例中，除了免疫刺激性寡核苷酸以外，免疫刺激性組成物可包括用於預防或治療傳染病的疫苗、用於向個體遞送寡核苷酸的載體、醫藥載劑，或其任何組合。例如，在一些態樣中，寡核苷酸被包裹在允許目標遞送寡核苷酸的病毒載體內。在一些態樣中，寡核苷酸可以被添加至陽離子脂質體遞送媒劑中，以提高寡核苷酸越過含有TLR9的脂質細胞膜及/或細胞胞器的膜的能力。

可以藉由投與本文揭示之免疫刺激性寡核苷酸或免疫刺激性組成物而獲得治療或預防的傳染病包括，但不限於病毒、細菌、真菌、蠕蟲或其他寄生蟲感染。預期投與本揭示內容之免疫刺激性寡核苷酸或組成物會產生對侵入病原菌不友善的免疫反應。因此，侵入病原菌可能無法建立起足以在宿主生物體內造成變為不利之健康狀態的感染。投與免疫刺激性寡核苷酸及/或組成物可提供非抗原特異性免疫反應，其加強抗原特異性免疫反應對抗侵入病原菌或與其並行作用。

在一些態樣中，包含寡核苷酸的免疫刺激性組成物可進一步包含用於預防或治療傳染病的疫苗。當個別遞送多種藥劑會增加治療成本時，基於效率之故可以做出寡核苷酸與疫苗的組合。寡核苷酸與疫苗也可以作為單一免疫刺激性組成物來遞送以引起非抗原特異性免疫反應，對抗任何現有感染且引發抗原特異性免疫反應生成。

本文亦預期包含如本文所述之寡核苷酸以及醫藥上可接受載劑的免疫刺激性組成物。在一些態樣中，醫藥上可接受載劑可以是任一種醫藥上可接受載劑。醫藥上可接受載劑調整組成以供透過選自以下的某一種路徑投與：靜脈內、肌肉內、乳房內、皮內、腹膜內、皮下、藉由噴霧、藉由氣溶膠、卵內、黏膜、穿皮、藉由浸入、經口、眼內、氣管內、鼻內、肺、直腸或那些習於技藝已知的其他方式。醫藥上可接受載劑可以是稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑，免疫刺激性組成物可與其一起投與。此等媒劑可以是液體，諸如水與油，包括那些石油、動物、植物或合成來源的液體，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油以及類似者。例如，可使用0.4%食鹽水以及0.3%甘油。這些溶液為無菌的且通常不含顆粒物質。它們可以透過習知的已知滅菌技術(例如過濾)而被滅菌。若需要的話，組成物可含有醫藥上可接受輔助物質以近似生理條件，諸如pH調節劑以及緩衝劑、安定劑、增稠劑、潤滑劑與著色劑等。本發明分子在此等醫藥調配物中的濃度可能會大幅地改變，亦即以重量計從少於約0.5%通常到至少約1%，至多達15或20%，且主要將根據選定的特定投與模式基於所需劑量、流體體積、黏度等來選定。舉例而言，在例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，21^st Edition，Troy,D.B.ed.,Lipincott Williams and Wilkins，Philadelphia，PA 2006，Part 5，Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092(see especially pp.958-989)中描述了適當的媒劑以及調配物(包括其他人類蛋白質，例如人類血清白蛋白在內)。

在一些具體例中，寡核苷酸以及載劑偶合，例如化學偶合。用來說明寡核苷酸與載劑之間的關係時，「偶合」意指寡核苷酸以及載劑的物理締合。若寡核苷酸與載體彼此結合、彼此交互作用或組合或以其他方式接合，則它們被視為是偶合的。

在一些具體例中，本文所述的免疫刺激性組成物進一步包含半抗原。在一些態樣中，免疫刺激性寡核苷酸連接至半抗原。半抗原可引起免疫反應對抗特定微生物，諸如大腸桿菌或沙門氏菌，而免疫刺激性寡核苷酸引起由TLR9與寡核苷酸交互作用所媒介之非特異性免疫反應。這些以及其他傳染性微生物對於大型農業生產者(諸如牛、綿羊與豬生產者)來說特別重要。

亦提供提高TLR9配位體之免疫性的方法，該方法包含將膽固醇基部分附接至配位體，其中該配位體是具有至少一個CpG模體的免疫刺激性寡核苷酸且其中該膽固醇基部分是經由連接子而附接至寡核苷酸的3’端核苷酸。

本文揭示的其他方法在有需要的個體體內提供引起TLR9媒介之免疫反應，包含向該個體投與寡核苷酸，該寡核苷酸具有複數個CpG模體以及一個附接至寡核苷酸之3’端核苷酸的膽固醇基-連接子部分。在用於引起TLR9媒介之免疫反應的方法的一些態樣中，該寡核苷酸是作為免疫刺激性組成物投與。

在本揭示內容的一些具體例中，免疫刺激性寡核苷酸或免疫刺激性組成物所投與的個體為動物。在一些態樣中，動物是處於受到病原菌且特別是具有以CpG為主之病原菌相關分子型態(PAMP)的高感染風險下。若免疫刺激性寡核苷酸及/或免疫刺激性組成物被投與給這樣的一個動物時，則TLR9-媒介的免疫反應將促進預防遭受病原菌感染或者減輕由病原菌所導致的症狀。那些習於技藝者應理解到，本發明的免疫刺激性寡核苷酸不必然是對特定病原菌具有特異性，而是可以刺激非抗原特異性免疫反應。寡核苷酸也不必然是對特定動物具有特異性。因此，在本揭示內容的一些態樣中，個體為畜類或家畜，諸如豬、牛、馬或綿羊。向畜類動物投藥可能有助於在擁擠條件下預防傳染擴散到更大的動物群(諸如關禽，及/或共享飼料或水源)。本揭示內容的寡核苷酸提供更勝於傳統預防性治療傳染形式的明確優勢，因為使用抗體越來越不受到歡迎，特別是出現對抗生素療法的細菌抗性。

在一些具體例中，個體可以是人類。如同在禽類動物的情況下，在細菌中越來越常見對人類使用之抗生素產生抗性，而且用於抗性感染的治療選項有限。本揭示內容的寡核苷酸以及方法為諸如抗二甲苯青黴素金黃色葡萄球菌的所謂「超級細菌」提供一個諸如亟需解決的方案。

在本文中也預期到，免疫刺激性寡核苷酸或組成物所投與的個體可能是小鼠、大鼠、倉鼠、沙鼠或其他齧齒類動物。個體也可以是非哺乳動物。例如，在一些態樣中，個體是水生物種。

實例

提供以下實例以便進一步說明本文所揭示的一些具體例。該等實例希望用於說明，而不是限制所揭示的具體例。

實例1：ODN的3’-膽固醇基修飾造成TLR9刺激活性強烈增加

人類TLR9，在HEKBlue中的重組表現

PDE-ODN的3’-膽固醇基修飾(I)

將3’-膽固醇基修飾(關於膽固醇基-連接子部分的化學結構參見圖1)施加至PDE-ODN(表1，2006-3dT4G5T4)，其對人類TLR9具有一般活性。在活體外於HEKBlue-hTLR9細胞(一種表現人類TLR9的細胞株)(Invivogen)中測試經修飾以及未經修飾形式。

結果暗示，關於EC₅₀，2006-3dT4G5T4的TLR9刺激活性在3’-膽固醇基修飾之後增進相當多，其比2006-3dT4G5T43C低了幾乎30倍(表2，圖2A、2B)。

PDE-ODN的3’-膽固醇基修飾(II)

將膽固醇基部分(關於膽固醇基-連接子部分的化學結構參見圖1)附接至2006-T4-PDE的3’端核苷酸(SEQ ID NO：3，表3)，其已知是人類TLR9的不良活化配位體。在活體外向HEKBlue-hTLR9細胞投與經修飾以及未經修飾2006-T4-PDE寡核苷酸來確定3’-膽固醇基修飾的免疫刺激影響。

結果暗示，2006-T4-PDE的人類TLR9刺激活性在3’膽固醇基修飾之後增進相當多(表2，圖3)。

PDE-ODN的3’-膽固醇基修飾(III)

將3’-膽固醇基修飾(關於膽固醇基-連接子部分的化學結構參見圖1)施加至PDE-ODN(2006-3dT4G5T4)，其對人類TLR9具有一般活性(表4)。在活體外於HEKBlue-hTLR9細胞中測試經修飾以及未經修飾形式。

結果暗示，關於EC₅₀，2006-3dT4G5T4的TLR9刺激活性在3’膽固醇基修飾之後增進相當多，其比2006-3dT4G5T43C低了超過3倍(表5，圖4A、4B)。

PDE-ODN的3’-膽固醇基修飾(IV)

將3’-膽固醇基修飾(關於膽固醇基-連接子部分的化學結構參見圖1)施加至PDE-ODN(2006-3dT4G5T4)，其對人類TLR9具有一般活性(表8)。在活體外於HEKBlue-hTLR9細胞中測試經修飾以及未經修飾形式。

結果暗示，關於EC₅₀，2006-3dT4G5T4的TLR9刺激活性在3’膽固醇基修飾之後增進相當多，其比2006-3dT4G5T43C低了超過36倍(表9，圖5)。

PDE-ODN的3’-膽固醇基修飾(V)

施加至PDE-ODN的3’-膽固醇基修飾(關於膽固醇基-連接子部分的化學結構參見圖6)(2006-3dT4G5T4)對人類TLR9具有相當差的活性(表10)。在活體外於HEKBlue-hTLR9細胞中測試經修飾以及未經修飾形式。

結果暗示，2006-3dT4G5T4的TLR9刺激活性在3’膽固醇基修飾之後大規模地增進，從差不多零到EC₅₀為68nM(表11，圖7)。

PDE-ODN的3’-膽固醇基修飾(VI)

將3’-膽固醇基修飾(關於膽固醇基-連接子部分的化學結構參見圖1)施加至PDE-ODN(2007-PDE-T4或2007-PDE-T4G5T4)，其對人類TLR9具有相當差的活性或無活性(表12)。在活體外於HEKBlue-hTLR9細胞中測試經修飾以及未經修飾形式。

結果暗示，2007-PDE-T4與2007-PDE-T4G5T4的TLR9刺激活性在3’-膽固醇基修飾之後均大規模地增進(圖8A與8B)，在2007-T4G5T4-3Ch中達到EC₅₀為24.9nM(表13)。

實例2：人類TLR9，在Ramos-Blue細胞中的天然表現

3’-膽固醇基修飾(I)

將3’-膽固醇基修飾(關於膽固醇基-連接子部分的化學結構參見圖1)施加至PDE-ODN(2006-3dT4G5T4)，其對人類TLR9具有一般活性(表14)。在活體外於Ramos-Blue細胞中測試經修飾以及未經修飾形式。Ramos-Blue B淋巴球細胞株(Invivogen,San Diego,CA)穩定地表現NF-κB/AP-1-誘導型報導基因，該報導基因允許偵測TLR9傳訊。

結果暗示，關於EC₅₀，2006-3dT4G5T4的TLR9刺激活性在3’-膽固醇基修飾之後增進相當多，其比2006-3dT4G5T43C低了超過8倍(表15，圖9A、9B)。還有，經修飾的ODN 2006-3dT4G5T43C優於「業界標準」ODN 2006-PTO的活性。

3’-膽固醇基修飾(II)

將3’-膽固醇基修飾(關於膽固醇基-連接子部分的化學結構參見圖1)施加至PDE-ODN(2006-3dT4G5T4)，其對人類TLR9具有一般活性 (表16)。在活體外於Ramos-Blue細胞中測試經修飾以及未經修飾形式。

結果暗示，關於EC₅₀，2006-3dT4G5T4的TLR9刺激活性在3’-膽固醇基修飾之後大規模地增進，其比2006-3dT4G5T43C低了超過7倍(圖10A、10B)。

PDE-ODN的3’-膽固醇基修飾(III)

將3’-膽固醇基修飾(關於膽固醇基-連接子部分的化學結構參見圖1)施加至PDE-ODN(2006-T4-PDE)，其對人類TLR9只有很差的活性(表18)。在活體外於Ramos-Blue細胞中測試經修飾以及未經修飾形式。

結果暗示，2006-T4-PDE的人類TLR9刺激活性在膽固醇基修飾之後大規模地增進(表18，圖11)。

PDE-ODN的3’-膽固醇基修飾(IV)

將3’-膽固醇基修飾(關於膽固醇基-連接子部分的化學結構參見圖6)施加至PDE-ODN(2006-3dT4G5T4)，其對人類TLR9具有非常差的活性(表19)。在活體外於Ramos-Blue細胞中測試經修飾以及未經修飾形式。

結果暗示，2006-3dT4G5T4對Ramos-Blue細胞的人類TLR9刺激活性在3’-膽固醇基修飾之後大規模地增進(表20，圖12)，關於EC₅₀的係數為13。

PDE-ODN的3’-膽固醇基修飾(V)

將3’-膽固醇基修飾(關於膽固醇基-連接子部分的化學結構參見圖6)施加至PDE-ODN(2007-PDE-T4或2007-PDE-T4G5T4)，其對人類TLR9具有非常差的活性或無活性(表21)。在活體外於Ramos-Blue細胞中測試經修飾以及未經修飾形式。

表22：半最大有效濃度(EC₅₀)以及最大信號速度(V_max)

結果暗示，這個實驗中所考量的全部ODN在3’-膽固醇基修飾之後，2006-3dT4G5T4在Ramos-Blue細胞中的人類TLR9刺激活性大規模地增進(2007-PDE-T4、2007-T4G5T4、TCG8-T4，表22、圖13A、13B和13C)。在2007-T4G5T4-Ch中，相較於非修飾同源物，關於EC₅₀，活性增進的係數達幾乎14。

實例3：小鼠TLR9，在HEKBlue中的重組過度表現

PDE-ODN的3’-膽固醇基修飾

將3’-膽固醇基修飾(關於膽固醇基-連接子部分的化學結構參見圖1)施加至2007-PDE-T4、2007-PDE-T4G5T4以及TCG8-T4，其對人類TLR9具有非常差的活性(表23)。在活體外於HEKBlue-mTLR9細胞(Invivogen)中測試經修飾以及未經修飾形式。

結果暗示，於這個實驗中所考量的全部ODN(2007-PDE-T4、2007-T4G5T4、TCG8-T4，表23)在3’-膽固醇基修飾之後，於HEKBlue-mTLR9中的小鼠TLR9-刺激活性在三種情況下大規模地增進(圖14A、14B與14C)，且在第四個實例中略微在低濃度下(圖14D)。

實例4：就未經修飾、經3’-膽固醇基修飾以及經5’-膽固醇基修飾的ODN對HEKBlue-hTLR9與Ramos-Blue細胞的全面研究：結構-活性相關性(SAR)

HEKBlue-hTLR9

將3’-膽固醇基或5’-膽固醇基修飾(關於膽固醇基-連接子部分的化學結構分別參見圖6與15)施用至4個不同ODN(表24)。在活體外於HEKBlue-hTLR9細胞中測試經修飾以及未經修飾形式。

在這個實驗中，因為背景讀數相對高，故將EC50與Vmax計算結果的每個數據點扣除零ODN值。

就在本實驗中所研究的每個ODN來說，3’-膽固醇基修飾對於HEKblue細胞中表現之人類TLR9的活性最為有利(表24，圖16A、16B、16C、16D)。在那些EC₅₀/V_max計算結果為可行的情況下(2006-G5、2006-T4G5T4，表25)，發現到未經修飾ODN的EC₅₀較低(係數分別為2.5與48)，而5’-膽固醇基修飾則導致活性喪失。2006-G5-3Chol與2006-T4G5T4-3Chol的EC₅₀比「業界標準」2006-PTO者更低，使得它們成為免疫調節性干預的候選物。

Ramos-Blue

將3’-膽固醇基或5’-膽固醇基修飾(關於膽固醇基-連接子部分的化學結構分別參見圖6與15)施用至4個不同ODN(表26)。在活體外於Ramos-Blue細胞中測試經修飾以及未經修飾形式。

在這個實驗中，關於EC以及Vmax計算結果，每個數據點扣除零ODN值，以求與表25一致)。

就本實驗中所研究的每個ODN來說，3’-膽固醇基修飾對於Ramos-Blue細胞中內源性存在之人類TLR9的活性最為有利(表26，圖17A-17D)。在那些EC₅₀/V_max計算結果為可行的情況下(2006-G5、2006-T4G5T4，表25)，發現到未經修飾ODN的EC₅₀較低(係數分別為3與10)，而除了TCG8-T4G5T4(其中兩種衍生均造成活性增進)以外，5’-膽固醇基修飾導致活性喪失，且3’-膽固醇基比5’-膽固醇基更多(圖17D，表26)。2006-G5-3Chol與2006-T4G5T4-3Chol的EC₅₀比「業界標準」2006-PTO者更低，使得它們成為免疫調節性干預的候選物。

那些習於技藝者將理解到，可對本發明的較佳具體例進行許多變化以及修飾，且此等變化以及修飾可在不偏離本發明精神的情況下進行。是故，正因為落在本發明的真正精神和範疇內，預期隨附申請專利範圍含括所有這些等效變化。

在本文件中所引用或所述的每一件專利案、專利申請案以及公開案的揭示內容以其整體併入本文做為參考資料。

<110> Bayer Animal Health GmbH

<120> 免疫刺激性寡核苷酸

<130> BHC168026-FC

<150> EP17207740.6

<151> 2017-12-15

<150> EP17207746.3

<151> 2017-12-15

<150> EP17207750.5

<151> 2017-12-15

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> 硫代磷酸酯(PTO)鍵結

<223> 合成寡核苷酸2006-PTO

<400> 1

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸2006-3dT4G5T4

<400> 2

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸2006-T4-PDE

<400> 3

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸2007-PDE-T4

<400> 4

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸2007-T4G5T4

<400> 5

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸TCG8-T4

<400> 6

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸2006-G5

<400> 7

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸TCG8-T4G5T4

<400> 8

<210> 9

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸PDE-2006

<400> 9

Claims

一種免疫刺激性寡核苷酸，其包含至少一個CpG模體(motif)以及一個3’膽固醇基部分。
如請求項1之免疫刺激性寡核苷酸，其在該免疫刺激性寡核苷酸的核苷酸之間包含磷酸二酯鍵結。
如請求項1之免疫刺激性寡核苷酸，其在該免疫刺激性寡核苷酸的核苷酸之間包含硫代磷酸酯鍵結。
如請求項1至3中任一項之免疫刺激性寡核苷酸，其中該膽固醇基部分經由一個連接子共價附接至該免疫刺激性寡核苷酸的3’-端核苷酸。
如請求項1至4中任一項之免疫刺激性寡核苷酸，其包含含有複數個胸嘧啶核苷酸的3’端序列。
如請求項5之免疫刺激性寡核苷酸，其中該複數個胸嘧啶核苷酸包含連續的胸嘧啶核苷酸。
如請求項5或6之免疫刺激性寡核苷酸，其中該複數個胸嘧啶寡核苷酸包含介於4與6個的連續胸嘧啶核苷酸。
如請求項5至7中任一項之免疫刺激性寡核苷酸，其中3’端序列包含SEQ ID NO：9。
如前述請求項中任一項之免疫刺激性寡核苷酸，其中該免疫刺激性寡核苷酸包含SEQ ID NO：2、3、4、5、6或8。
如請求項5至8中任一項之免疫刺激性寡核苷酸，其中該3’端序列為TTTT。
如請求項5至8中任一項之免疫刺激性寡核苷酸，其中該免疫刺激性寡核苷酸的3’端序列包含複數個鳥嘌呤核苷酸。
如請求項11之免疫刺激性寡核苷酸，其中該複數個鳥嘌呤核苷酸包含連續的鳥嘌呤核苷酸。
如請求項11或12之免疫刺激性寡核苷酸，其中該3’端序列為GGGGG。
如請求項11至13中任一項之免疫刺激性寡核苷酸，其中該免疫刺激性寡核苷酸包含SEQ ID NO：7。
如請求項1至8中任一項之免疫刺激性寡核苷酸，其中該免疫刺激性寡核苷酸包含(TCG) _n，其中n介於3與10。
如請求項4至15中任一項之免疫刺激性寡核苷酸，其中該連接子包含一個碳鏈。
如請求項16之免疫刺激性寡核苷酸，其中該碳鏈包含介於3與12個的碳原子。
如請求項4至17中任一項之免疫刺激性寡核苷酸，其中該連接子包含己二醇。
如請求項16至18中任一項之免疫刺激性寡核苷酸，其包含具有下列結構的膽固醇基-連接子部分：
如請求項4至17中任一項之免疫刺激性寡核苷酸，其中該連接子包含重複的化學單元。
如請求項20之免疫刺激性寡核苷酸，其中該重複化學單元重複介於2與12次。
如請求項20之免疫刺激性寡核苷酸，其中該重複化學單元為乙二醇。
如請求項20至22中任一項之免疫刺激性寡核苷酸，其中該連接子包含六乙二醇。
如請求項20至23中任一項之免疫刺激性寡核苷酸，其中該膽固醇基部分共價結合至該連接子以形成膽固醇基-連接子部分。
如請求項24之免疫刺激性寡核苷酸，其包含具有下列結構的膽固醇基-連接子部分：
一種免疫刺激性組成物，其包含如請求項1至25中任一項之免疫刺激性寡核苷酸。
如請求項26之免疫刺激性組成物，其進一步包含用於預防或治療傳染病的疫苗。
如請求項26或27之免疫刺激性組成物，其進一步包含載體。
如請求項28之免疫刺激性組成物，其中該載體為病毒載體。
如請求項29之免疫刺激性組成物，其中該寡核苷酸是被包裹在該病毒載體內。
如請求項26至30中任一項之免疫刺激性組成物，其進一步包含醫藥上可接受載劑。
如請求項31之免疫刺激性組成物，其中該寡核苷酸以及醫藥上可接受載劑是共價偶合。
如請求項26至32中任一項之免疫刺激性組成物，其進一步包含半抗原。
如請求項33之免疫刺激性組成物，其中該寡核苷酸以及半抗原是共價偶合。
一種提高TLR9配位體之免疫性的方法，其包含使一個膽固醇基部分經由一個連接子附接至TLR9配位體的3’端，其中該TLR9配位體是具有至少一個CpG模體的寡核苷酸。
如請求項35之方法，其中該膽固醇基部分共價結合至該連接子以形成膽固醇基-連接子部分。
如請求項36之免疫刺激性寡核苷酸，其中該膽固醇基-連接子部分包含：
如請求項36之免疫刺激性寡核苷酸，其中該膽固醇基-連接子部分包含：
一種在個體體內引起TLR9媒介之免疫反應的方法，其包含向該個體投與如請求項1至25中任一項之免疫刺激性寡核苷酸或如請求項26至34中任一項之免疫刺激性組成物。
如請求項39之方法，其中投與是靜脈內、肌肉內、乳房內、皮內、腹膜內、皮下、藉由噴霧、藉由氣溶膠、卵內、黏膜、穿皮、藉由浸入、經口、眼內、氣管內或鼻內進行。
如請求項39或40之方法，其中該個體為動物。
如請求項39至41中任一項之方法，其中該個體為哺乳動物。
如請求項39至42中任一項之方法，其中該個體為水生物種。
如請求項39至42中任一項之方法，其中該個體為小鼠、豬、牛、馬、綿羊或人類。