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TW201936924A - 免疫刺激性寡核苷酸 - Google Patents

免疫刺激性寡核苷酸 Download PDF

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TW201936924A TW107144948A TW107144948A TW201936924A TW 201936924 A TW201936924 A TW 201936924A TW 107144948 A TW107144948 A TW 107144948A TW 107144948 A TW107144948 A TW 107144948A TW 201936924 A TW201936924 A TW 201936924A
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Abstract

本文揭示免疫刺激性寡核苷酸以及其組成物與使用方法。更具體而言，揭示免疫刺激性寡核苷酸、優化該等寡核苷酸之免疫刺激性性質的方法以及使用該等免疫刺激性寡核苷酸來引起類鐸受體21(TLR21)媒介之免疫反應的方法。

Description

免疫刺激性寡核苷酸 參考相關申請案
本申請案主張分別於2017年12月15日提申之歐洲專利申請案第EP17207740.6號、第EP17207746.3號，以及第EP17207750.5號的優先權以及權益，其等之揭示內容以其全文引用的方式併入本文。
本文揭示免疫刺激性寡核苷酸以及其組成物與使用方法。更具體而言，揭示免疫刺激性寡核苷酸、優化該等寡核苷酸之免疫刺激性性質的方法以及使用該等免疫刺激性寡核苷酸來引起類鐸(toll-like)受體21(TLR21)媒介之免疫反應的方法。
微生物的一些分子標誌(包括微生物表面上的蛋白質與其他抗原)，還有內部組成(諸如微生物基因體內所含的某些模體，例如未甲基化CpG模體)可以被宿主生物的免疫系統所辨識並且引起免疫反應。這些分子標誌或病原菌相關分子型態(pathogen associated molecular patterns,PAMP)與宿主的同源病原菌辨識受體之間的交互作用可能引起參與免疫反應的細胞信號傳導級聯。類鐸受體21(TLR21)是哺乳動物類鐸受體9(TLR9)的雞功能性同源物且是一個能夠辨識未甲基化CpG模體之PAMP受體。透過具有這些CpG模體的核酸活化TLR21已被證實會活化涉入針對微生物感染之免疫反應的細胞訊號。
對於TLR21在雞免疫反應中的角色的理解尚未能在家禽產業中產生疾病預防或治療的改變。因為素來擁擠與未消毒的環境，豢養在 育雛設施中的大批家禽在所有生命階段皆處於高微生物感染風險下，但是目前現有的預防性組成物以及感染後治療普遍無法引起PAMP媒介的免疫反應。大規模生產設施反而仰賴商業上可取得的疫苗與抗生素來防止或限制感染爆發。儘管抗生素因為抗性還有不希望食用經處理肉品的考量因素而變得不受偏好，但抗生素投藥在許多農業環境(包括大規模育雛舍)中仍是一項標準操作程序，而採用新方法可能昂貴到令人望而卻步且麻煩。採用TLR21促效劑作為感染的預防性措施或作為治療的一個阻礙包括與篩選大量候選化合物有關的無效率，其在實際上妨礙鑑定此類促效劑的研究。
因此，需要TLR21刺激性組成物、用於鑑別它們的方法，以及優化組成物之免疫刺激性性質的方法。所揭示的方法以及組成物是針對這些還有其他重要的需求。
本文揭示寡核苷酸，其包含至少一個CpG模體以及一個始於寡核苷酸5’端處或在寡核苷酸5’端的四個核苷酸內之富含鳥嘌呤核苷酸(「富含鳥嘌呤」)的序列。
本文亦揭示包含一個5’-膽固醇基修飾的寡核苷酸，其具有至少一個CpG模體且具有或不具有一個始於寡核苷酸5’端處或在寡核苷酸5’端的四個核苷酸內之富含鳥嘌呤核苷酸的序列。
亦提供刺激類鐸受體21(TLR21)的方法，包含向有需要的個體投與免疫刺激性寡核苷酸，該免疫刺激性寡核苷酸具有至少一個CpG模體以及一個始於寡核苷酸5’端處或在寡核苷酸5’端的四個核苷酸內之富含鳥嘌呤核苷酸的序列。
亦揭示用於增加具有至少一個CpG模體之寡核苷酸的TLR21刺激活性的方法，包含將該寡核苷酸的5’端融合至富含鳥嘌呤核苷酸的序列。
本文提供用於在個體體內引起免疫反應的方法，包含向個體投與寡核苷酸至該個體，該寡核苷酸具有至少一個CpG二核苷酸模體以及一 個始於寡核苷酸5’端處或在寡核苷酸5’端的四個核苷酸內之富含鳥嘌呤核苷酸的序列。
當與附圖一起閱讀時會進一步了解發明內容以及以下的詳述說明。為了說明所揭示的組成物以及方法，圖式中顯示組成物以及方法的例示性具體例；但是，該等組成物以及方法並不限於揭示的特定具體例。在圖式中：圖1是pcDNATM3.1(+)的質體圖譜。
圖2比較經TNF-α-刺激之HEK293-NFκB細胞與HEK293-NFκB-bsd-cTLR21的劑量反應曲線。
圖3A與3B以圖描述2006-PTO與2006-PDE對HEK293-bsd和HEK293-bsd-cTLR21細胞的刺激效用。
圖4A與4B以圖描述在2006-PDE寡核苷酸的3’端處增加鳥嘌呤殘基數目的刺激效用。
圖5A與5B以圖描述在2006-PDE寡核苷酸的5’端處增加鳥嘌呤殘基數目的刺激效用。
圖6說明在其3’端或5’端處帶有鳥嘌呤殘基數目增加之2006-PDE寡核苷酸的半最大有效濃度(pEC50)的負對數(log10)。
圖7A與7B分別說明在其5’端或3’端處具有鳥嘌呤數目增加之2006-PDE寡核苷酸的聚集。
圖8A與8B以圖描述在其5’端處帶有六個連續鳥嘌呤(5dG6)、腺嘌呤(5dA6)、胞嘧啶(5dC6)或胸嘧啶(5dT6)殘基之2006-PDE寡核苷酸的刺激效用。
圖9A與9B以圖描述擾亂CpG模體對於因為寡核苷酸引起之TLR21刺激的效用。
圖10A與10B分別以圖描述在帶有磷酸二酯骨架或硫代磷酸酯骨架之寡核苷酸的3’與5’端上之鳥嘌呤連串序列(run)的刺激效用。
圖11A與圖11B說明在一個具有數個CpG模體之寡核苷酸的5’端上之六個鳥嘌呤連串序列內的單一腺嘌呤置換對TLR21刺激的效用，而圖11D與圖11D說明在一個具有數個CpG模體之寡核苷酸的5’端上之六個鳥嘌呤連串序列內的兩個腺嘌呤置換對TLR21刺激的效用。
圖12A與圖12B說明在一個具有數個CpG模體之寡核苷酸的5’端上之六個鳥嘌呤連串序列內的單一胞嘧啶置換對TLR21刺激的效用，而圖12C與圖12D說明在一個具有數個CpG模體之寡核苷酸的5’端上之六個鳥嘌呤連串序列內的兩個胞嘧啶置換對TLR21刺激的效用。
圖13A與圖13B說明在一個具有數個CpG模體之寡核苷酸的5’端上之六個鳥嘌呤連串序列內的單一胸嘧啶置換對TLR21刺激的效用，而圖13C與圖13D說明在一個具有數個CpG模體之寡核苷酸的5’端上之六個鳥嘌呤連串序列內的兩個胸嘧啶置換對TLR21刺激的效用。
圖14證實在一個具有數個CpG模體之寡核苷酸的5’端上之六個鳥嘌呤連串序列(SEQ ID NO：272)內的單一核苷酸置換對TLR21刺激的位置性效用。
圖15證實在一個具有數個CpG模體之寡核苷酸的5’端上之六個鳥嘌呤連串序列(SEQ ID NO：272)內的雙重核苷酸置換對TLR21刺激的位置性效用。
圖16A與圖16B說明在一個具有數個CpG模體之寡核苷酸的5’端上之四個鳥嘌呤連串序列內的單一腺嘌呤置換對TLR21刺激的效用。
圖17A與圖17B說明在一個具有數個CpG模體之寡核苷酸的5’端上之四個鳥嘌呤連串序列內的單一胞嘧啶置換對TLR21刺激的效用。
圖18A與圖18B說明在一個具有數個CpG模體之寡核苷酸的5’端上之四個鳥嘌呤連串序列內的單一胸嘧啶置換對TLR21刺激的效用。
圖19證實在一個具有數個CpG模體之寡核苷酸的5’端上之四個鳥嘌呤連串序列(SEQ ID NO：273)內的單一核苷酸置換對TLR21刺激的位置性效用。
圖20A-20K說明將五鳥嘌呤連串序列融合至文獻中暗示之含CpG寡去氧核苷酸序列的3’端、將四鳥嘌呤連串序列融合至含CpG寡去氧 核苷酸序列的五端，以及將六鳥嘌呤連串序列融合至含CpG寡去氧核苷酸序列的5'端的效用。圖20A以圖說明ODN 1668、1668-3dG5、1668-5dG4以及1668-5dG6的TLR21刺激活性。圖20B以圖說明ODN 1826-3dG5、1826-5dG4以及1826-5dG6的TLR21刺激活性。圖20C以圖說明ODN BW006、BW006-3dG5、BW00-65dG4以及BW006-5dG6的TLR21刺激活性。圖20D以圖說明ODN D-SLO1、D-SLO1-3dG5、D-SLO1-5dG4以及D-SLO1-5dG6的TLR21刺激活性。圖20E以圖說明ODN M362、M362-3dG5、M362-5dG4以及M362-5dG6的TLR21刺激活性。圖20F以圖說明ODN 2395、2395-5dG4以及2395-5dG6的刺激活性。圖20G以圖說明ODN 2007-PDE、2007-PDE-3dG5、2007-PDE-5dG4以及2007-PDE-5dG6的TLR21刺激活性。圖20H以圖說明ODN CPG-685以及CPG-685-5dG6的TLR21刺激活性。圖20I以圖說明ODN CPG-202以及CPG-202-5dG6的TLR21刺激活性。圖20J以圖說明ODN CPG-2000以及CPG-2000-5dG6的TLR21刺激活性。圖20K以圖說明ODNCPG-2002以及CPG-2002-5dG6的TLR21刺激活性。
圖21A以圖描述將已知端粒序列融合至2006-PDE以及2006-PDE-T4的影響；圖21B與21C以圖描述將端粒或啟動子序列融合至2006-PDE-T4的影響。
圖22A與圖22B說明將已知端粒序列融合至2006-PDE的影響。
圖23A與圖23B分別顯示具有G-四聯體序列之寡核苷酸的四聚體的鹼基配對排列以及包含該四聚體之寡核苷酸的位向(「TGGGGT」揭示SEQ ID NO：265)；圖23C說明寡核苷酸當形成G-四聯體或G-線構型(SEQ ID NO：257)時的交互作用；圖23D是G-線構型(SEQ ID NO：257)的圖像。
圖24A與圖24B描述透過將富含鳥嘌呤核苷酸的序列添加至帶有CpG模體之寡核苷酸的5’端對TLR21刺激的效用。
圖25描述出現聚集之帶有G-線序列的寡去氧核苷酸。
圖26A、圖26B與圖26C以圖描述正好鄰接CpGpA模體之核苷酸的刺激影響。圖26A描述基本寡核苷酸的TLR21刺激活性。圖26B描述 帶有一個額外5’dG6序列之相同寡核苷酸。圖26C描述帶有一個額外5’Gwire2序列的基本寡核苷酸。
圖27A、圖27B與圖27C以圖描述正好鄰接CpGpG模體之核苷酸的刺激影響。圖27A描述基本寡核苷酸的TLR21刺激活性。圖27B描述帶有一個額外5’dG6序列之相同寡核苷酸。圖27C描述帶有一個額外5’Gwire2序列的相同寡核苷酸。
圖28A、圖28B與圖28C以圖描述正好鄰接CpGpC模體之核苷酸的刺激影響。圖28A描述基本寡核苷酸的TLR21刺激活性。圖28B描述帶有一個額外5’dG6序列之相同寡核苷酸。圖28C描述帶有一個額外5’Gwire2序列的相同寡核苷酸。
圖29A、圖29B、圖29C與圖29D以圖描述正好鄰接CpGpT模體之核苷酸的刺激影響。圖29A描述基本寡核苷酸的TLR21刺激活性。圖29B描述帶有一個額外5’dG6序列之相同寡核苷酸。圖29C與圖29D描述帶有一個額外5’Gwire2序列的相同寡核苷酸。
圖30說明在帶有5’G線序列的寡核苷酸中擾亂僅一個CpG模體的刺激性影響。
圖31說明在一個5’G線序列與一個CpG模體之間的距離的刺激性影響。
圖32說明在具有一個5’Gwire2序列與一個CpG模體之寡核苷酸的3’端處修飾胸嘧啶5’-單磷酸核苷酸數目的刺激性影響。
圖33A與圖33B比較具有不同5’G-線序列之寡核苷酸的免疫刺激性性質。
圖34描述帶有一個5’Gwire2序列之寡核苷酸的結構-活性。圖式按出現順序分別揭示SEQ ID NO：189、269以及270。
圖35A與圖35B比較在鄰近帶有5’Gwire2序列以及CpG模體之寡核苷酸的3’具有單、雙或三GCGT序列要素之寡核苷酸的免疫刺激力。
圖36A與圖36B比較在鄰近帶有5’Gwire2序列以及CpG模體之寡核苷酸的3’具有單、雙或三GCGA序列要素之寡核苷酸的免疫刺激力。
圖37A與圖37B比較在鄰近帶有5’Gwire2序列以及CpG模體之寡核苷酸的3’具有單、雙或三ACGC序列要素之寡核苷酸的免疫刺激力。
圖38A與圖38B比較在鄰近帶有5’Gwire2序列以及CpG模體之寡核苷酸的3’具有單、雙或三TCGC序列要素之寡核苷酸的免疫刺激力。
圖39A與圖39B比較在鄰近帶有5’Gwire2序列以及CpG模體之寡核苷酸的3’具有單、雙或三CCGC序列要素之寡核苷酸的免疫刺激力。
圖40A與圖40B比較在鄰近帶有5’Gwire2序列以及CpG模體之寡核苷酸的3’具有單、雙或三GCGG序列要素之寡核苷酸的免疫刺激力。
圖41A與圖41B比較在一個寡核苷酸中於兩個CpG模體之間插入一至四個胸嘧啶核苷酸的免疫刺激效用。
圖42A與圖42B說明在兩個CpG模體之間的單一核苷酸分隔或在兩個CpG模體之間的一個無鹼基間隔子的免疫刺激效用。
圖43A至43E描述在一個寡核苷酸中CpG要素之間的不同結構橋接。圖43A描述T1間隔子的結構。圖43B描述T3間隔子的結構。圖43C描述無鹼基間隔子的結構。圖43D描述1,3-丙二醇間隔子的結構。圖43E描述六乙二醇間隔子的結構。
圖44A與圖44B顯示在CpG模體之間插入一個C3與一個C18間隔子的免疫刺激影響。
圖45A與圖45B描述在一個包含一個5’-Gwire2模體之寡核苷酸中增加CpG模體數目的免疫刺激影響，該等CpG模體是被一個C3間隔子分隔開。
圖46A與圖46B以圖說明因為在5’端處帶有TGGGGT-序列(SEQ ID NO：265)以及介於一至五個CpG模體(各自被C3間隔子分隔開)之寡核苷酸所致的TLR21免疫刺激作用。
圖47描述無鹼基以二醇為基礎的間隔子。
圖48描述一個C8間隔子、一個基本間隔子以及一個無鹼基去氧核醣橋接間隔子。
圖49A與圖49B以圖表示因為帶有GGGGTTGGGG(SEQ ID NO：257)5’端序列以及CpG模體之寡核苷酸所致的TLR21刺激作用，且其中CpG模體被丙二醇或一個無鹼基去氧核醣橋接分隔開。
圖50A與圖50B說明具有CpG模體以及一個G-線序列之寡核苷酸的TLR21刺激力，其中CpG模體被乙二醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇以及己二醇分隔開。
圖51說明在CpG要素間之以二醇為基礎的不同間隔子對TLR21刺激作用的影響。
圖52A與圖52B描述在暴露於具有被丙二醇或六乙二醇分隔開之ACGC或CCGC CpG序列要素以及一個G-線5’端序列的寡核苷酸之後的TLR21刺激作用。
圖53A與圖53B描述在暴露於具有被丙二醇分隔開之ACGC或CCGC CpG序列要素以及一個TGGGGT(SEQ ID NO：265)5’端序列的寡核苷酸之後的TLR21刺激作用。
圖54A與圖54B描述在暴露於具有G-線5’端序列以及被丙二醇或六乙二醇分隔開之CpG模體的寡核苷酸之後的TLR21刺激作用。
圖55說明透過一個己二醇連接子連接至3’去氧核醣部分之膽固醇部分的化學結構。
圖56A與圖56B比較具有數個CpG模體以及一個5’Gwire2序列之寡核苷酸與聚有一個3’膽固醇基基團之相同寡核苷酸的TLR21刺激作用。
圖57A與圖57B比較具有一個TGGGGT(SEQ ID NO：265)5’端序列、數個CpG模體以及一個3’膽固醇基基團的兩個寡核苷酸。
圖58A與圖58B描述對兩個不同去氧核苷酸的5’膽固醇修飾。
圖59A與圖59B說明因為具有一個TGGGGT-5’端序列(SEQ ID NO：265)、數個CpG模體以及帶有或不帶有一個5’膽固醇修飾之寡核苷酸所致的TLR21刺激作用。
圖60A與圖60B說明因為帶有或不帶有5’膽固醇修飾之寡核苷酸的TLR21刺激作用，其中膽固醇衍生物是得自於不同供應商(Sigma Aldrich)。
圖61A與圖61B說明因為帶有或不帶有5’膽固醇修飾之寡核苷酸所致的TLR21刺激作用。
圖62A與圖62B說明因為帶有或不帶有5’膽固醇修飾之寡核苷酸所致的TLR21刺激作用。
圖63A與圖63B說明因為帶有或不帶有5’膽固醇修飾之寡核苷酸所致的TLR21刺激作用。
圖64說明因為帶有或不帶有5’膽固醇修飾之寡核苷酸所致的TLR21刺激作用。
圖65A與圖65B說明因為帶有或不帶有5’膽固醇修飾之寡核苷酸所致的TLR21刺激作用。
圖66A與圖66B說明因為帶有或不帶有5’膽固醇修飾之寡核苷酸所致的TLR21刺激作用。
圖67說明因為帶有或不帶有5’膽固醇修飾之寡核苷酸所致的TLR21刺激作用。
圖68A與圖68B分別以圖描述於小鼠以及人類細胞中，在寡核苷酸5’端上經數目漸增之鳥嘌呤核苷酸修飾之寡核苷酸的免疫刺激效用。
圖69A與圖69B分別以圖描述於小鼠以及人類細胞中，在寡核苷酸3’端上經數目漸增之鳥嘌呤核苷酸修飾之寡核苷酸的免疫刺激效用。
圖70描述在免疫接種之後(pv)第14天(上圖)以及第21天(下圖)，ODN1(GCGT3-TG4T-5Chol)的血球凝集抑制(HI)力價(Log2)(加上標準差)結果。星號表示顯著性程度(*=顯著，****=高度顯著)。
圖71描述在整個研究期間，ODN1(GCGT3-TG4T-5Chol)的平均HI力價(Log2)(加上標準差)結果。
圖72描述在免疫接種之後第14天(上圖)以及第21天(下圖)，ODN2(GCGT3-TG4T)的平均HI力價(Log2)(加上標準差)結果。星號表示顯著性程度(*=顯著，****=高度顯著)。
圖73描述在整個研究期間，ODN2(GCGT3-TG4T)的平均HI力價(Log2)(加上標準差)結果。
圖74描述在免疫接種之後第14天(上圖)以及第21天(下圖)，ODN3(2006-PTO)的平均HI力價(Log2)(加上標準差)結果。星號表示顯著性程度(*=顯著，****=高度顯著)。
圖75描述在整個研究期間，ODN3(2006-PTO)的平均HI力價(Log2)(加上標準差)結果。
圖76描述於免疫接種之後第14天(上圖)以及第21天(下圖)，陽性對照與陰性對照測試物的平均HI力價(Log2)(加上標準差)結果。星號表示顯著性程度(*=顯著，****=高度顯著)。
圖77描述在整個研究期間，陽性對照與陰性對照測試物的平均HI力價(Log2)(加上標準差)結果
圖78描述相較於單獨NDV疫苗，在整個研究期間於ODN最優濃度下的平均HI力價(Log2)(加上標準差)結果。
圖79描述相較於單獨NIDV疫苗，在pv第14天(上圖)以及第21天(下圖)於ODN最優濃度下的平均HI力價(Log2)(加上標準差)結果。
透過參照形成本揭示內容一部分的以下詳細說明以及隨附圖式，可以更容易地理解所揭示的組成物以及方法。應理解，所揭示的組成物以及方法不限於本文所述及/或所示的特定組成物與方法，且本文所使用的術語僅是為了以例示的方式來說明特定具體例，而不希望是限制所請求的組成物與方法。
除非另有明確說明，否則任何改良用的可能作用機制或模式或理由的說明表示僅為說明性，且所揭示的組成物以及方法不囿限於任何此等暗示之改良用作用機制或模式或理由的正確性或不正確性。
本文通篇之中，說明提到組成物以及使用該等組成物的方法。若揭示內容描述或請求與組成物相關的特徵或具體例，則此一特徵或具體例同樣適用於使用該組成物的方法。相同地，若揭示內容說明或請求 與使用某一組成物之方法有關的特徵或具體例，則此一特徵或具體例同樣適用於該組成物。
表示數值範圍時，另一個具體例包括從一個特定數值及/或至另一個特定數值。此外，提到範圍內所指明的數值時包括那個範圍內的各個與每個數值。所有的範圍都是包含性且可組合。若數值表示為近似值，則使用先行詞「約」將理解為該特定數值構成另一個具體例。除非上下文另有清楚指明，否則提到特定數值包括至少一個那個特定數值。
要理解所揭示組成物以及方法的某些特徵(為清楚起見，在本文個別具體例的內文中說明)也可組合在單一具體例中提供。相反地，所揭示組成物以及方法的不同特徵(為簡明起見，在單一具體例的內文中說明)也可以分別或以任一種子組合提供。
如本文所用，單數型「一(a、an)」以及「該(the)」包括複數型。
如本文所用，「融合(fuse)或(fusing)」意指在兩個化學反應性物質之間產生化學鍵。在本揭示內容的上下文中，融合多半意指將特定要素併入寡核苷酸中。例如，胸嘧啶寡核苷酸的連串序列(run)可融合至寡核苷酸的3’端。
如本文所用，「G-四聯體序列」意指鄰近寡核苷酸之5’端的一段連續鳥嘌呤殘基，其使得寡核苷酸可以與其他G-四聯體序列反應而形成G-四聯體。G-四聯體提高核酸的免疫刺激性性質。例如，含有G-四聯體序列的寡核苷酸可能發生交互作用，導致G-四聯體。存在於基因之啟動子區域內的G-四聯體序列可能形成涉入調節基因表現的四級結構。然而G-四聯體序列不限於任何特定序列，G-四聯體序列的一個實例為TGGGGT(SEQ ID NO：265)。
如本文所用，「G-線(G-wire)序列」、「G線(G wire、Gwire)序列」以及相關術語意指述複數個(大多為兩個)至少四個連續鳥嘌呤核苷酸。複數個鳥嘌呤核苷酸位在寡核苷酸的5’端處或鄰近寡核苷酸的5’端處，被兩個或更多個非鳥嘌呤核苷酸(亦即胸嘧啶核苷酸)分隔開。G-線序列能夠與其他G-線序列交互作用而形成G-線結構。G-線結構可以提高核酸的免疫刺激 性性質。例示性G-線序列為GGGGTTGGGG(SEQ ID NO：257)或GGGGTTGGGGTTTT(SEQ ID NO：258)。
如本文所用，術語「富含鳥嘌呤核苷酸的序列」、「富含鳥嘌呤的序列」以及類似者意指含有一個連串序列的連續鳥嘌呤核苷酸(通常在四個至六個鳥嘌呤核苷酸之間)的核酸序列，或一個核酸區(具有鳥嘌呤多過於腺嘌呤、胞嘧啶或胸嘧啶核苷酸，通常在寡核苷酸的5’端處或鄰近5’端處)。富含鳥嘌呤核苷酸的序列如本文揭示可提高寡核苷酸的免疫刺激性性質。G-四聯體以及G-線序列均為富含鳥嘌呤核苷酸之序列的類型。
如本文所用，「插入」意指於寡核苷酸合成期間在特定位置處添加特定核苷酸(等)。
如本文所用，「平行位向」意指不同寡核苷酸之間的方向性交互作用。例如，圖23B中的圓形圖顯示四個具有平行位向的寡核苷酸，作為寡核苷酸的四聚體彼此平行安置。在一些態樣中，單獨寡核苷酸可以相同5’至3’方向定向。
術語「個體」如本文所用意欲表示任何動物，包括任何類型的禽類、哺乳動物或水生物種，且尤其是雞。可以使用本文揭示的方法以及利用本文揭示的組成物來治療個體。
術語「TLR21測試」或其變化形式意指向實例2中所述之HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞株投與寡核苷酸以確定該寡核苷酸是否刺激TLR21。
說明書及申請專利範圍通篇使用與發明說明之態樣有關的各種術語。除非另有指明，否則此等術語是以其通常意思來提供。其他特別定義的術語被理解為與本文提供之定義一致。
本文揭示的是重組HEK293細胞株，其包含殺稻瘟菌素抗性基因以及合成SEAP報導基因構築體(「NFκB-SEAP」)；還有經NFκB-SEAP構築體和雞TLR21構築體共轉染的穩定細胞株(HEK293-NFκB-bsd-cTLR21)。後面這個細胞株可以被用來測試候選化合物之TLR21媒介的免疫刺激性性質。如在實例中所證實， HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞株可以用來鑑別能夠引起TLR21媒介之免疫反應的寡核苷酸。
本文亦提供用於活化或以其他方式刺激TLR21的寡核苷酸以及方法。在一些具體例中，寡核苷酸包含至少一個病原菌相關分子型態(PAMP)，具體而言是未甲基化二核苷酸CpG模體，其與宿主生物體中所表現的病原菌辨識受體交互作用。在一些具體例中，寡核苷酸也具有富含鳥嘌呤核苷酸的序列。這些序列可促使DNA股摺疊成四級結構，或在寡核苷酸的情況下增進一或多個含有該序列的寡核苷酸聚集。本文證明，若寡核苷酸進一步包含一個富含鳥嘌呤核苷酸的序列，則具有CpG二核苷酸模體的寡核苷酸的免疫性得以提高。富含鳥嘌呤核苷酸的序列不必然僅只包含鳥嘌呤核苷酸，但其必須是富含鳥嘌呤核苷酸。如上文所述且如在這些揭示內容中所例舉，富含鳥嘌呤的序列是一段含有鳥嘌呤核苷酸多於任何其他殘基(亦即腺嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶核苷酸)的寡核苷酸。在一些具體例中，寡核苷酸序列以及結構的額外操作可進一步提高寡核苷酸刺激TLR21的能力。因此，本揭示內容的一個具體例包含寡核苷酸，其包含至少一個CpG模體以及一個在寡核苷酸5’端處或寡核苷酸5’端之四個核苷酸內之富含鳥嘌呤核苷酸的序列。
先前已證明，將去氧鳥嘌呤(dG)核苷酸添加至含CpG之寡核苷酸的3’端會在活體外提高TLR9活化。由於TLR9是雞TLR21的哺乳動物功能等效物，預期3’dG連串序列也將會增進被設計成活化TLR21之寡核苷酸的免疫性。出乎意料，就TLR21活化來說，3’富含鳥嘌呤核苷酸的序列不見得是這樣。具有兩個或更多dG之3’連串序列的寡核苷酸無法活化TLR21(圖4A與4B)，而將dG連串序列至含CpG之寡核苷酸的5’端則明顯增進寡核苷酸的免疫性。
不僅富含鳥嘌呤核苷酸的序列在寡核苷酸中的位置會影響TLR21活化升高，序列的含量也同樣有影響。為此，在本揭示內容的一些具體例中，富含鳥嘌呤核苷酸的序列包含第一複數個連續鳥嘌呤核苷酸。在一些態樣中，該第一複數個鳥嘌呤核苷酸包含兩個至八個鳥嘌呤核苷酸。在一些態樣中，該第一複數個鳥嘌呤核苷酸包含兩個鳥嘌呤核苷酸。在一 些態樣中，該第一複數個鳥嘌呤核苷酸包含三個鳥嘌呤核苷酸。在一些態樣中，該第一複數個鳥嘌呤核苷酸包含四個鳥嘌呤核苷酸。在一些態樣中，該第一複數個鳥嘌呤核苷酸包含五個鳥嘌呤核苷酸。在一些態樣中，該第一複數個鳥嘌呤核苷酸包含六個鳥嘌呤核苷酸。在一些態樣中，該第一複數個鳥嘌呤核苷酸包含七個鳥嘌呤核苷酸。在一些態樣中，該第一複數個鳥嘌呤核苷酸包含八個鳥嘌呤核苷酸。在又其他態樣中，該第一複數個鳥嘌呤核苷酸包含超過八個鳥嘌呤核苷酸。
在本發明的一些具體例中，寡核苷酸包含SEQ ID NO：16、17、18、19、20、21、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、77、78、81、82、85、86、89、90、92、93、96、97、100、102、104、106、108或143。在一些具體例中，富含鳥嘌呤核苷酸的序列包含TTAGGG、TTAGGGTTAGGG(SEQ ID NO：261)、TTTTGGGG、GGGGTTTT、GGGGTTTTGGGG(SEQ ID NO：262)、TTAGGG、TTAGGGTTAGGGTTTT(SEQ ID NO：263)、TGTGGGTGTGTGTGGG(SEQ IDNO：268)、GGAGG、TGGAGGC或TGGAGGCTGGAGGC(SEQ ID NO：264)。在又其他具體例中，寡核苷酸包含SEQ ID NO：110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、124、125、126、127、129、130、131、134、136、137或138。
dG的單一連串序列不只是可以提高TLR21刺激的5’修飾。例如，富含腺嘌呤、胞嘧啶與胸嘧啶核苷酸的序列也可以被添加至具有至少一個CpG模體之寡核苷酸的5’端並且使得TLR21刺激得以提高，儘管比在寡核苷酸5’端處的富含鳥嘌呤序列所引起的還低(參見圖8A與8B)。雖然在寡核苷酸5’端處之單一複數個鳥嘌呤殘基可引起TLR21刺激，但在富含鳥嘌呤核苷酸序列中的額外複數個鳥嘌呤核苷酸可進一步提高寡核苷酸的刺激性性質。因此，在一些態樣中，本揭示內容之寡核苷酸在第一複數個鳥嘌呤核苷酸與至少一個CpG模體之間包含第二複數個鳥嘌呤核苷酸。
在一些態樣中，複數個鳥嘌呤核苷酸包含G-四聯體序列。 在一些具體例中，第一複數個鳥嘌呤核苷酸、第二複數個鳥嘌呤核苷酸或兩者包含G-四聯體序列。如上文所定義，G-四聯體序列也允許寡核苷酸間的交互作用。在不囿限於理論的情況下，寡核苷酸經由G-四聯體序列交互作用允許CpG二核苷酸模體集中以及對應提高受到TLR21辨識的機會。G-四聯體序列也提供多個TLR21受體交互作用(提高結合性)以及受體交聯的機會。在一些具體例中，免疫刺激性組成物進一步包含至少一個具有G-四聯體序列的額外寡核苷酸，其中該寡核苷酸以及該至少一個額外寡核苷酸於四級結構中具有平行位向。在一些態樣中，G-四聯體序列包含TGGGGT(SEQ ID NO：265)。
G-線序列是另一個可被添加至具有CpG模體之寡核苷酸5’端的富含鳥嘌呤核苷酸的序列。在本揭示內容的一些態樣中，第一與第二複數個鳥嘌呤核苷酸包含G-線序列。在一些態樣中，G-線序列包含SEQ ID NO：257或258。在又其他態樣中，G-線序列包含SEQ ID NO：141、142、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203或GCGT-Gwire3。兩個複數個鳥嘌呤核苷酸可以被非鳥嘌呤核苷酸、核苷酸類似物或任何其他間隔子或連接子分隔開。例如，在本揭示內容的一些態樣中，第一複數個鳥嘌呤核苷酸以及第二複數個鳥嘌呤核苷酸被至少一個核苷酸分隔開。如本文所用，術語「間隔子」意指類似核苷酸模體之間(亦即兩個CpG模體之間或兩個富含鳥嘌呤核苷酸的序列模體之間)的一個化學鍵聯(linkage)，而術語「連接子」意指不同核苷酸模體之間(亦即富含鳥嘌呤核苷酸的序列與另一個核苷酸模體(例如CpG模體)之間)的一個化學鍵聯。為清楚起見，術語「連接子」以及「間隔子」是用來說明所述寡核苷酸的態樣。但是，那些習於技藝者應明白，本文揭示關於間隔子的結構可與本文揭示關於連接子的結構互換，且反之亦然。
在不囿限於任何特定理論的情況下，G-線序列可以使得寡核苷酸與其他具有G-線序列的寡核苷酸交互作用並且聚集。這個寡核苷酸與其CpG模體的累積可能導致TLR21刺激提高。
在寡核苷酸內，富含鳥嘌呤核苷酸的序列與CpG核苷酸模體 可能被核苷酸、核苷酸類似物或其他連接子分隔開。因此，在本揭示內容的一些具體例中，寡核苷酸進一步在富含鳥嘌呤核苷酸的序列以及下游至少一個CpG模體之間包含一個連接子。連接子不必然直接鄰接富含鳥嘌呤核苷酸的序列或CpG模體，但連接子必須在兩個序列模體之間，不管富含尿嘌呤核苷酸的序列與連接子之間的插入序列，還有CpG模體與連接子之間的插入序列。在本揭示內容的一些具體例中，連接子包含至少三個核苷酸。在一些具體例中，連接子也可能不包含氮鹼基。例如，在一些態樣中，連接子是六乙二醇、丙二醇、三乙二醇或其衍生物。在其他實例中，具有連接子的寡核苷酸包含2006-PDE5dG4-X1或2006-PDE5dG4-X3。
咸信存在於本揭示內容之寡核苷酸中的二核苷酸CpG模體在雞隻體內是受到TLR21所辨識的PAMP。儘管單一個CpG模體可刺激TLR21，存在於寡核苷酸上的多個CpG可能增加TLR21的刺激訊號強度。為此，在本發明的一些態樣中，該至少一個CpG模體包含兩個、三個、四個或五個CpG模體。在一些態樣中，該至少一個CpG模體包含六個或更多個CpG模體。在一些態樣中，該至少一個CpG模體包含兩個CpG模體。在一些態樣中，該至少一個CpG模體包含三個CpG模體。在一些態樣中，該至少一個CpG模體包含四個CpG模體。在一些具體例中，該至少一個CpG模體包含四個CpG模體。
在目前所揭示之寡核苷酸的一些具體例中，各個CpG模體與其他CpG模體可能被至少一個核苷酸或核苷酸類似物分隔開。在一些態樣中，該至少一個核苷酸是兩個或三個胸嘧啶核苷酸。在其他態樣中，該至少一個核苷酸是介於一個與四個核苷酸之間，雖然插入的核苷酸數目可能因為插入核苷酸序列而有不同。在一些態樣中，寡核苷酸包含SEQ ID NO：217、218、219或220。鄰接CpG的核苷酸還有CpG模體本身組成CpG序列要素(例如XCGX，其中X=任一種核苷酸)。在一些具體例中，本揭示內容的寡核苷酸包含的CpG序列要素為GCGA、GCGG、ACGC、CCGC、GCGT、TCGC或其任何組合。
在本揭示內容的一些具體例中，該CpG模體包含具有四個核苷酸的CpG序列要素。在一些態樣中，該寡核苷酸包含至少兩個CpG序列要 素。在一些態樣中，該寡核苷酸包含至少三個CpG序列要素。在一些態樣中，該寡核苷酸包含至少四個CpG序列要素。在一些態樣中，該寡核苷酸包含至少五個CpG序列要素。在一些態樣中，該寡核苷酸包含至少六個CpG序列要素。在一些態樣中，該寡核苷酸包含超過八個、十個、十五個或甚至二十個CpG序列要素。
在目前揭示之寡核苷酸的其他具體例中，CpG模體的每一者與每一個其他CpG模體是被一個間隔子或一個間隔子與至少一個核苷酸的組合分隔開。在一些具體例中，該至少一個CpG模體與最接近的其他CpG模體是被一個間隔子或一個間隔子與至少一個核苷酸的組合分隔開，而至少兩個其他CpG模體彼此鄰接。儘管被分隔開的CpG模體可能提高所設計寡核苷酸的免疫刺激力，但確認彼此鄰接的CpG模體仍然可以刺激TLR21。
被用來在線性上分隔CpG模體的間隔子可以是任何一種橋接CpG模體之間的至少一部分寡核苷酸的鍵聯。間隔子可能包含，但不必然限於去氧核醣磷酸酯橋接、多碳鏈或重複化學單元。間隔子的一個重要性質是與寡核苷酸的核苷酸骨架形成化學鍵的能力。因此，在一些具體例中，間隔子是去氧核醣磷酸酯橋接。去氧核醣磷酸酯橋接在一些態樣中可能包含氮鹼基，而在其他態樣中去氧核醣磷酸酯橋接為無鹼基。在一些態樣中，寡核苷酸包含SEQ ID NO：221，其包含無鹼基去氧核醣磷酸酯橋接。
在本揭示內容的其他具體例中，間隔子包含碳鏈。碳鏈可能包含兩個至十二個碳原子。含有碳鏈的二醇可用作為末端醇基團，其可與末端醇基團及/或寡核苷酸的磷酸根基團反應。在一些具體例中，該碳鏈包含兩個碳原子，且在一些態樣中，該碳鏈是衍生自乙二醇。在一些具體例中，該寡核苷酸包含ODN-X2，其中X2為乙二醇。
本揭示內容的其他具體例提供包含三個碳原子的碳鏈。在這些具體例的一些態樣中，碳鏈是衍生自1,3-丙二醇。在一些具體例中，寡核苷酸包含CG-Gw2X2、CG-Gw2X2-2或ODN-X3、CG-Gw2X2-1、CG-Gw2X2-3、CG-Gw2X2-4、CG-Gw2X2-5、CG-G4T16X2-1、CG-G4T16X2-2、CG-G4T16X2-3、CG-G4T16X2-4或CG-G4T16X2-5，其中X2為三碳鏈；2006-PDE5dG4-X2，其中X2為一個衍生自1,3-丙二醇的三碳 鏈；或2006-PDE5dG4-X4，其中X4為一個衍生自1,3-丙二醇的三碳鏈。
在本揭示內容的又其他具體例中，該寡核苷酸包含碳鏈間隔子，其中碳鏈包含四個碳原子。在這些具體例的一些態樣中，碳鏈是衍生自1,4-丁二醇。在一些具體例中，寡核苷酸包含ODN-X4，其中X4為衍生自1,4-丁二醇的四碳鏈。
在本揭示內容的又其他具體例中，寡核苷酸包含具有一個重複化學單元的間隔子。例如，在一些具體例中，重複化學單元為乙二醇。重複化學單元可能重複兩次至十二次。在一些具體例中，乙二醇重複六次。因此，在一些態樣中，寡核苷酸包含CCGC-Gw2X1，其中X1為一個衍生自六乙二醇的間隔子。
儘管dG連串序列對寡核苷酸3’端造成沒有多少(若有的話)TLR21刺激，其他核苷酸連串序列可能給予寡核苷酸提高的免疫性。特別地，在本揭示內容的一些態樣中，寡核苷酸可進一步包含三-胸嘧啶核苷酸3’端。在一些態樣中，寡核苷酸包含SEQ ID NO：204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214或215。
關於本文揭示的各個寡核苷酸，習於技藝者應知道，核苷酸可以被核苷酸類似物置換。在一些具體例中，寡核苷酸包含磷酸二酯骨架，雖然本文揭示之寡核苷酸的其他具體例包含硫代磷酸酯骨架。
在本揭示內容的一些具體例中，寡核苷酸可包含一個脂質部分，其可增加寡核苷酸的免疫性。免疫性增加的一個可能解釋是脂質部分可以發揮提高寡核苷酸生物利用性的功能。在一些具體例中，脂質部分是在寡核苷酸的5’端處或鄰近5’端。這個脂質「帽」可防止降解、增加溶解度、增進寡核苷酸在醫藥組成物中的穩定性、可能經由微胞或其他聚集物形成而產生多牙配位體，或其任何組合。在一些態樣中，脂質部分為膽固醇。
因為所揭示的寡核苷酸經由TLR21刺激提高的免疫反應，本揭示內容的其他具體例包括透過向有需要的個體投與本文揭示之免疫刺激性寡核苷酸來預防或治療疾病的方法。
亦提供包含上文所揭示之免疫刺激性寡核苷酸的免疫刺激性組成物。儘管這些免疫刺激性組成物包含如本文所述的寡核苷酸，該等 組成物也可以包括影響組成物之免疫性、有效性和效率的其他組份。例如，在一些態樣中，免疫刺激性組成物包含醫藥上可接受載劑。醫藥上可接受載劑調整組成以供透過某一種選自以下的路徑投與：靜脈內、肌肉內、乳房內、皮內、腹膜內、皮下、藉由噴霧、藉由氣溶膠、卵內、黏膜、穿皮、藉由浸入、經口、眼內、氣管內、鼻內、肺、直腸或那些習於技藝已知的其他方式。醫藥上可接受載劑可以是稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑，免疫刺激性組成物可與其一起投與。此等媒劑可以是液體，諸如水與油，包括那些石油、動物、蔬菜或合成來源的液體，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油以及類似者。例如，可使用0.4%食鹽水以及0.3%甘油。這些溶液為無菌的且通常不含顆粒物質。它們可以透過習知的已知滅菌技術(例如過濾)而被滅菌。若需要的話，組成物可含有醫藥上可接受輔助物質以貼近生理條件，諸如pH調節劑以及緩衝劑、安定劑、增稠劑、潤滑劑與著色劑等。本發明分子在此等醫藥調配物中的濃度可能大大地改變，亦即以重量計從少於約0.5%通常到至少約1%，至多達15或20%，且主要將根據選定的特定投藥模式基於所需劑量、流體體積、黏度等來選定。舉例而言，在例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,Troy,D.B.ed.,Lipincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA 2006,Part 5,Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092(特別是參見pp.958-989)中描述了適當的媒劑以及調配物(包括其他人類蛋白質，例如人類血清白蛋白)。
在一些具體例中，寡核苷酸與載劑連結。用來說明寡核苷酸與載劑之間的關係時，「連結」意指寡核苷酸與載劑的物理締合。若寡核苷酸與載劑彼此結合、彼此交互作用或組合、偶合或以其他方式接合，則它們被視為是連結的。
在一些具體例中，本文所述的免疫刺激性組成物進一步包含一個半抗原。在一些態樣中，免疫刺激性寡核苷酸連結至半抗原。半抗原可引起免疫反應對抗特定微生物，諸如(但不限於)大腸桿菌或沙門氏菌，而免疫刺激性寡核苷酸引起由TLR21與寡核苷酸交互作用所媒介之非特異性免疫反應。這些以及其他感染性微生物對於處於高感染風險下的大規模育雛舍來說是特別嚴重的問題。
免疫刺激性組成物的一些具體例提供用於預防或治療傳染病的疫苗，該疫苗包含本文所述之免疫刺激性寡核苷酸中的至少一者。關於引起任何免疫反應的寡核苷酸，其必須有效地被遞送至其標的，不論標的為細胞培養物、雞隻或另一種脊椎動物。因此，本揭示內容的一個態樣提供包含本文所述免疫刺激性寡核苷酸的載體。
免疫刺激性寡核苷酸以及因此僅包含寡核苷酸作為活性成分之免疫刺激性組成物的效力可以透過其半最大有效濃度(EC50)來量測。EC50是一種誘發某一種反應之免疫刺激性組成物濃度的測量方法，該反應是可透過投與該組成物獲得之最大反應的一半。濃度越低，則寡核苷酸越有效。在本揭示內容的一些態樣中，免疫刺激性組成物具有在pM範圍內的EC50。在一些態樣中，EC50是介於約0.1與100pM。在一些態樣中，EC50是介於約100與200pM。在一些態樣中，EC50是介於約200與300pM。在一些態樣中，EC50是介於約300與400pM。在一些態樣中，EC50是介於約400與500pM。在一些態樣中，EC50是介於約500與600pM。在一些態樣中，EC50是介於約600與700pM。在一些態樣中，EC50是介於約700與800pM。在一些態樣中，EC50是介於約800與900pM。在一些態樣中，EC50是介於約900pM與1nM。在又其他態樣中，EC50少於約100pM。
關於免疫刺激性組成物中的寡核苷酸濃度，在一些態樣中，寡核苷酸濃度是介於約0.1與10nM。在一些態樣中，寡核苷酸濃度是介於約10與20nM。在一些態樣中，寡核苷酸濃度是介於約20與30nM。在一些態樣中，寡核苷酸濃度是介於約30與40nM。在一些態樣中，寡核苷酸濃度是介於約40與50nM。在一些態樣中，寡核苷酸濃度是介於約50與60nM。在一些態樣中，寡核苷酸濃度是介於約60與70nM。在一些態樣中，寡核苷酸.濃度是介於約70與80nM。在一些態樣中，寡核苷酸濃度是介於約80與90nM。在一些態樣中，寡核苷酸濃度是介於約90與1μM之間。在又其他態樣中，寡核苷酸濃度少於約20nM。
在本揭示內容的一些具體例中，免疫刺激性組成物可能進一步包含至少一個具有G-線序列的額外寡核苷酸。因為G-線序列促使具有相同或類似G-線序列的其他寡核苷酸聚集，因而免疫刺激性組成物的一個態 樣進一步包含至少一個具有G-線序列的額外寡核苷酸。在免疫刺激性組成物包含多個具有G-線序列的寡核苷酸的一些態樣中，寡核苷酸與該至少一個額外寡核苷酸具有G-線構型。
本文亦提供刺激類鐸受體21(TLR21)的方法，包含向有需要的個體投與一個寡核苷酸，該寡核苷酸具有至少一個CpG模體以及一個始於寡核苷酸5’端處或在寡核苷酸5’端的四個核苷酸內之富含鳥嘌呤核苷酸的序列。亦提供用於在個體體內引起免疫反應的方法，包含向有需要的個體投與免疫刺激性寡核苷酸，該免疫刺激性寡核苷酸具有至少一個CpG二核苷酸模體以及一個始於寡核苷酸5’端處或在寡核苷酸5’端的四個核苷酸內之富含鳥嘌呤核苷酸的序列。
寡核苷酸也可以呈如本文所述的免疫刺激性組成物形式投與。該免疫刺激性組成物可進一步包含如上文所述的半抗原、醫藥上可接受載劑或兩者。在一些態樣中，投與免疫刺激性組成物可以靜脈內、肌肉內、乳房內、皮內、腹膜內、皮下、藉由噴霧、藉由氣溶膠、卵內、黏膜、穿皮、藉由浸入、經口、眼內、氣管內或鼻內進行。需要投藥的個體為動物。在一些態樣中，個體為禽類物種的成員。例如，本文揭示的免疫刺激性組成物可以在卵內被投與給含胚雞蛋或肌肉內被投與給孵化雞或甚至成鳥。
本文亦提供用於增加具有至少一個CpG模體之寡核苷酸的TLR21刺激活性的方法，包含將該寡核苷酸的5’端融合至一個富含鳥嘌呤核苷酸的序列。在一些態樣中，富含鳥嘌呤核苷酸的序列為G-四聯體序列。在一些態樣中，該G-四聯體序列包含第一複數個鳥嘌呤核苷酸。這第一複數個鳥嘌呤核苷酸可包含部分的TGGGGT序列(SEQ ID NO：265)。在一些態樣中，該第一複數個鳥嘌呤核苷酸包含三個至八個鳥嘌呤核苷酸。在又其他態樣中，該G-四聯體序列包含TTAGGG、TTAGGGTTAGGG(SEQ ID NO：261)、TTTTGGGG、GGGGTTTT、GGGGTTTTGGGG(SEQ ID NO：262)、TTAGGG、TTAGGGTTAGGGTTTT(SEQ ID NO：263)、TGTGGGTGTGTGTGGG(SEQ ID NO：268)、GGAGG、TGGAGGC或TGGAGGCTGGAGGC(SEQ ID NO：264)。
本揭示內容的其他具體例提供富含鳥嘌呤核苷酸的序列以組成第一與第二複數個鳥嘌呤核苷酸。在其他態樣中，富含鳥嘌呤核苷酸的序列含有G-線序列。在一些態樣中，G-線序列包含SEQ ID NO：257或258。在方法的又其他態樣中，第一複數個鳥嘌呤核苷酸以及第二複數個鳥嘌呤核苷酸被至少一個核苷酸分隔開。
在一些具體例中，如本文所揭示的方法可進一步包含在第一複數個鳥嘌呤核苷酸以及至少一個CpG模體之間插入一個連接子。上文已描述該連接子且可包含，但不限於至少三個核苷酸或一個六乙二醇。
依據本發明的一些態樣，寡核苷酸刺激TLR21的能力可藉由在寡核苷酸中增加CpG模體數目而進一步獲得提高。在一些態樣中，該至少一個CpG模體是複數個CpG模體，而該複數個CpG模體包含至少兩個、三個、四個或五個CpG模體。CpG模體之間的距離可能影響到寡核苷酸的TLR21刺激性性質。為此，本文所揭示之方法的一些態樣提供在CpG模體之間插入至少一個核苷酸或核苷酸類似物。該至少一個核苷酸可以是兩個或三個胸嘧啶核苷酸。
方法的其他具體例提供在CpG模體的每一者之間插入一個間隔子。該間隔子必須能夠結合至一個相鄰核苷酸股的3’端以及另一個核苷酸股的5’端。在一些態樣中，該間隔子是去氧核醣磷酸酯橋接，其在一些態樣中可為無鹼基。
在一些態樣中，間隔子可包含一個碳鏈。在一些具體例中，碳鏈包含兩個碳原子。在一些態樣中，碳鏈是衍生自乙二醇。其他具體例提供一個包含三個碳原子的碳鏈。在一些態樣中，碳鏈是衍生自1,3-丙二醇。在一些具體例中，碳鏈包含四個碳原子，且在一些態樣中碳鏈是衍生自1,4-丁二醇。在又其他具體例中，間隔子包含重複化學單元。在一些態樣中，重複化學單元為一個乙二醇，且在一些態樣中間隔子是衍生自六乙二醇。
在提高寡核苷酸之TLR21刺激性性質的方法中，預期將至少一個核苷酸類似物或脂質部分併入至寡核苷酸中。在一些態樣中，脂質部 分是在寡核苷酸的5’端處或鄰近寡核苷酸的5’端。方法的又其他具體例包括修飾鄰接CpG模體的核苷酸。
實例
提供以下實例以便進一步說明本文揭示的一些具體例。實例希望說明，而非限制所揭示的具體例。
實例1：產生NFκB路徑報導基因HEK293細胞株
pNifTy2-SEAP(Invivogen)與其他商業上可取得的質體載體慣用於產生NFκB路徑報導基因細胞株。pNifTy2-SEAP的商業上可取得形式包含用於細菌和哺乳動物篩選的吉歐黴素抗性基因(其需要大量這種細胞生長抑制劑(多達400μg/ml)，且這個篩選有時候並不可靠)。因此，開始生成具有更佳篩選標記物(較佳為殺稻瘟菌素)的報導質體。
以經人類密碼子優化的形式來合成編碼開放閱讀框之由pNifty2-SEAP-編碼之SEAP(分泌型胚鹼性磷酸酶)基因。pNifty2-SEAP中在ATG起始密碼子上游的284bp區(其含括五個NFκB辨識位點以及一個內皮-白血球黏附分子(ELAM)啟動子位點)也被合成為帶有以下修飾：KpnI位點被直接構築在ATG起始密碼子上游(插入序列「GGTA」)，且在更上游引入一個5’至3’由EcoRV、MluI和NdeI位點組成的序列。此外，停止密碼子的下游引入NheI位點與第二個EcoRV位點。小心避免這些位點出現在SEAP開放閱讀框內。
NFκB-SEAP(經人類密碼子優化)(SEQ ID NO：1)(底線顯示用於次選殖的限制酶位點(MluI與NdeI)。起始密碼子ATG與停止密碼子TAA以粗體強調)。
藉由MluI/NheI雙重消化從選殖載體切出這個合成SEAP基因構築體(「NFκB-SEAP」)，並且藉由接合而引入至pcDNA3.1(+)載體(圖1)(pcDNA3.1(+)載體以MluI/NheI預先切開且經凝膠純化以移除CMV啟動子區)。以相同的方式處理pcDNA3.1(+)的自製變體(version)(其中新黴素抗性基因(NeoR/KanR))已被殺稻瘟菌素抗性基因所取代(bsd→pcDNA3.1(+)-bsd)或已被嘌呤黴素抗性基因所取代(puro→pcDNA3.1(+)-puro))且與NFκB-SEAP構築體接合。
從這組構築體中，選出含bsd的質體pcDNA3.1(+)-bsd-NFκB-SEAP用於HEK293轉染。為此，經PvuI-線形化的形式透過標準轉染方法被引入細胞中，而利用10μg/ml殺稻瘟菌素選出帶有構築體被基因體併入的細胞。針對腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘發SEAP生產來測試抗性細胞池，並且藉由單細胞選殖，挑出一個帶有尤佳信噪比的純系(HEK293-NFκB-SEAP-bsd或HEK293-NFκB-bsd)用於進一步研究。就這個細胞株來說，人類TNF-α的EC50為3.2ng/ml(圖2)。
實例2：產生雞TLR21轉殖細胞株
雞類鐸受體21(TLR21)是一個未甲基化CpG DNA受體，其與哺乳動物TLR9在功能上同源，但不是異種同源(Brownlie et al.2009，Keestra et al.2010)。編碼雞TLR21的基因是基於Genbank存取號NM_001030558的推論蛋白質序列來合成，並且針對人類密碼子使用習慣進行優化。將具有Kozak序列的KpnI位點引入至起始密碼子ATG上游，同時在停止密碼子下游添加一個NotI位點與一個EcoRV位點。TLR21基因透過KpnI/NotI雙重消化而從選殖載體被切下，經凝膠純化並且接合至KpnI/NotI-剪切哺乳動物表現載體pcDNA3.1(+)中。這個pcDNA3.1(+)-cTLR2用PvuI予以線性化並且與經PvuI-線性化的pcDNA3.1(+)-bsd-NFκB-SEAP一起被轉染至HEK293中，得到HEK293-NFκB-bsd-cTLR21或HEK293-bsd-cTLR21。
藉由同時施加殺稻瘟菌素以及G418來篩選細胞池，測試因 為TNF-α所致的功能性NFκB路徑還有因為硫代磷酸酯寡核苷酸2006-PTO(SEQ ID NO：3)所致的活性cTLR21來進行測試。單細胞選殖產生對2006-PTO反應具有絕佳信噪比的選殖細胞株。純系HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞株顯示優異的TNF-α敏感性(EC50=1.4ng/ml)，類似於HEK293-NFκB-bsd觀察到的結果(圖2)。
雞TLR21-Gen(基於NM_001030558)(SEQ ID NO：2)(透過底線強調起始ATG密碼子與停止TAG密碼子)：
硫代磷酸酯(PTO)寡去氧核苷酸(ODN)2006-PTO(ODN 2006)已知會活化TLR21。Keestra,A.M.,de Zoete,M.R.,Bouwman,L.I.,van Putten,J.P.,2010。雞TLR21是一個不同於哺乳動物TLR9的先天CpG DNA受體。J.Immunol.185,460-467。在這個研究的純系TLR21細胞株(HEK293-NFκB-bsd-cTLR21)中，2006-PTO也有活性，活化的EC50為~8,5nM。相反地，HEK293-NFκB-bsd未顯示有任何SEAP分泌(圖3A)。這證明了這個ODN的特異性交互作用是特別針對TLR21。2006-PDE(2006-PTO的磷酸二酯鍵結變體)就其對TLR21的刺激活性來說要弱的多。其EC50估算為>250nM，最大刺激相較於2006-PTO要低得多(圖3B)。
實例3：包含5’G-四聯體形成序列的ODN提高TLR21活性
3’去氧鳥嘌呤(dG)添加對2006-PDE(ODN2006，磷酸二酯形式)的TLR21辨識的影響
在實例2中所述的HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞株中，使用2006-PDE(2006-PTO的磷酸二酯鍵結變形)作為基礎來探究3’-dG修飾對於TLR21刺激活性之影響。為此，從20nM開始以15個稀釋步驟(1：2)達到約1pM作為最終稀釋來進行力價實驗。具體而言，HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞以10,000個細胞/孔在45μl生長培養基中被種入至384孔盤中。這些細胞暴露於溶解在生長培養基中的寡核苷酸並且在 37℃下培育3-4天。將每孔10μl培養物上清液轉移至384孔盤且添加90μl的50mM NaHCO3/Na2CO3、2mM MgCl2、5mM對-硝基苯基磷酸(pNP)pH 9.6，並在405nM下透過光學密度暫時變化(mOD405nm/min)的動力學測量來測定反應速率。
儘管一如預期，2006-PTO在奈莫耳範圍下刺激TLR21，但2006-PDE顯示無明顯的TLR21刺激活性。於3’端處添加一個dG在nM範圍內產生一些明顯的TLR21刺激活性，其在第二個(dG2)與第三個(dG3)dG添加出現時仍有，儘管要弱的多。添加第4個、第5個、第6個、第7個與第8個dG(dG4-dG8)產生TLR21無活性ODN(圖4A)。在高至0.33nM(330pM)的濃度範圍內，ODN中沒有一者顯示出TLR21活性(圖4B)。
5’dG添加對2006-PDE(ODN2006，磷酸二酯形式)的TLR21辨識的影響
使用2006-PDE(2006-PTO的磷酸二酯鍵結變體)作為基礎來探究5’-dG修飾對於TLR21刺激活性的影響。為此，從20nM開始以15個稀釋步驟(1：2)達到約1pM作為最終稀釋來進行力價實驗。
2006-PTO在奈莫耳範圍下刺激TLR21，而2006-PDE顯示無明顯的TLR21刺激活性。於2006-PDE的5’端處添加一個dG與兩個G在兩位數nM範圍內產生一些些微的TLR21刺激活性。第三個dG(dG3)導致TLR21活性巨幅增加，其中EC50計算為513皮莫耳(pM)(表3)。添加第4個dG進一步增加活性14倍(EC50計算為36pM，表3)，而第5個、第6個、第7個與第8個dG(dG4-dG8)導致EC50增加更多以及一個EC50介於17.1和22.2pM的TLR21刺激穩定狀態。總之，在5’端處添加3dG而不是兩個dG之後，似乎於ODN結構中發生一些十分重要的改變，其導致TLR21活性大大增加，從幾乎無活性到強烈的皮莫耳活性，這透過額外的5’dG又進一步增加。在3’端處添加等同的dG並不會導致高活性，對應的ODN衍生物大部分無活性(比較圖4A-B、5A-B與6，還有表3)。
為了探究所測試之ODN對TLR21的電泳移動行為，進行16%TBE聚丙烯醯胺凝膠電泳，然後進行亞甲藍染色。在2006-PDE-5dG0-8中，更高級結構的出現(圖7A、7B)與高TLR21刺激活性之間有明確的相關性。似乎可能是更高級結構是由G-四聯體結構產生所形成，其已知通常是透過連續的G所形成，而且可能牽涉到DNA的同一股(「分子內G-四聯體」)或不同股(「分子間G-四聯體」)。Williamson JR,G-Quartet Structures in Telomeric DNA,Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.,23：703-730(1994)；Simonsson T,G-Quadruplex DNA Structures-Variations on a Theme,Biol.Chem.382：621-628(2001)。但是，在2006-PDE-3dG0-8寡核苷酸中觀察到相同的聚集，但2006-PDE-3dG0-8寡核苷酸對TLR21的活性不佳或無活性。這暗示，單單聚集對於強烈TLR21刺激活性來說並不夠。連續鳥嘌呤與5’端的定位似乎會影響到TLR21刺激活性。
使用實例2006-PDE-5dG6進一步檢驗對強力TLR21刺激之5’鳥嘌呤連串序列的依賴性
2006-PDE-5dG6被挑出作為一個實例，因為其在2006-PDE的5’dGn掃描中似乎形成了TLR21刺激活性穩定狀態(參見圖5A、5B、6與表3)。5’-dG6連串序列被dA6、dT6或dC6所取代(表4)。
當2006-PDE在5’端處用dN6修飾時，每一個鹼基同聚體產生TLR21活性的若干增加，呈下列增進次序：dA6<dC6<dT6<<<<<<<<dG6(圖8A)。5’-dG6的增進明顯高出其他鹼基增進好幾個量級(在低濃度下尤其可見，圖8)，暗示著透過這個具有G-四聯體形成潛力的修飾而賦予特殊特性。
使用實例2006-PDE-5dG6檢驗對因為經5’-dG修飾2006-PDE所致之強力TLR21刺激的CpG要素存在的依賴性
2006-PDE-5dG6被挑出作為一個實例，因為其在2006-PDE的5’dGn掃描中似乎形成了TLR21刺激活性穩定狀態(參見圖5A、5B、6與表3)。透過下列來探究CpG模體對於TLR21刺激活性的影響：1)在四個CpG模體中用5-甲基-胞嘧啶取代每個胞嘧啶來合成這個ODN；2)將每個CpG模體倒置為GpC；以及3)將CpG模體中的每一個鳥嘌呤用腺嘌呤取代、每一個胞嘧啶用胸嘧啶取代，且同時分別用胸嘧啶與腺嘌呤取代胞嘧啶與鳥嘌呤。如實例3中所述，針對刺激TLR21的能力使用HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞來測試所得寡核苷酸。
這裡所探究的每一個修飾(在2006-PDE-5dG6中妨礙CpG模體的完整性)導致活性大幅喪失(圖9A)，其在低ODN濃度下尤其可見(圖9B)。
檢驗2006-PTO的3’-dG6修飾以及5’-dG6修飾對於TLR21刺激活性的影響並且與2006-PDE中的相同變化做比較
為了探究因為dG連串序列添加所導致的TLR21-刺激活性增進是否同樣適用於帶有硫代磷酸酯骨架(PTO-ODN)的寡去氧核苷酸，合成2006-PDE、2006-PDE-3dG5與2006-PDE-5dG6的PTO同源物(表6)，並且如實例3中所述使用HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞將其刺激TLR21的能力與每一個其他與其PDE-變體進行比較(表7，圖10A及10B)。
在5’-dG殘基不存在的情況下，相較於PDE變體，PTO修飾賦予ODN高出許多的活性(表7，圖10A與10B)。但相較於其PTO變體，經5’dG6修飾的2006-PDE並非如此。在此，PDE賦予甚至略高的活性(EC50)，這是出乎意料的(表7，圖10A與10B)。
在2006-PDE-5dG6的5dG6連串序列中檢驗dA取代對於TLR21刺激活性的影響
基於在2006-PDE 5’處的連續dG序列形成賦予TLR21刺激活性之G-四聯體的假設，預測在dG6連串序列中的dA取代(預期會擾亂G-四聯體形成)依據位置會對TLR21刺激活性有負面影響。為此，使用類似於技藝中的那些方法來合成單一與雙重dA取代2006-PDE-5dG6 ODN，並且如實例3中所述在NFκB-bsd-cTLR21細胞中測試其刺激TLR21的能力(表8與9，圖11A-D。
大體上，dG6連串序列內的所有dA取代於Vmax產生的變化不多(亦即，在比較實驗中所獲得的最大報導基因讀值)，而EC50變化相當多，高至超過兩個量級(表9，與圖11A和11B)。第1個位置與第6個位置中的單一取代對於EC50非常輕微，而第2個位置與第5個位置產生更為明顯的增 加。第3個位置與第4個位置觀察到最為強烈的變化，其使得EC50增加超過10倍。在雙重dA取代中(表9，圖11C與11D)，連續第1個與第2個，還有第5個與第6個產生相對溫和的EC50增加，而第4個與第5個則導致較強烈的增加。第2個與第3個還有第3個與第4個位置的雙重dA取代分別導致EC50增加685倍與459倍。鑒於已在本研究之前鑑別出3個連續dG作為強力TLR21活性的最小數目，且在dG3、dG4至dG5順序中注意到EC50增加，之後從dG5-dG8看到EC50穩定狀態(比較圖5A、5B、6與表3)，這些數據進一步支持以下見解：在2006-PDE 5’處的G-四聯體形成未遭受到破壞會是強烈TLR21刺激的必要條件。
在2006-PDE-5dG6的5dG6連串序列中檢驗dC取代對於TLR21刺激活性的影響
基於在2006-PDE 5’處的連續dG序列形成賦予TLR21刺激活性之G-四聯體的假設，預測在dG6連串序列中的dC取代(預期會擾亂G-四聯體形成)依據位置會對TLR21刺激活性有負面影響。為此，合成單一與雙重dC取代2006-PDE-5dG6 ODN，並且如實例3中所解釋測試其刺激TLR21的能力(表10與11，圖12A-D)
大體上，dG6連串序列內的所有dC取代於Vmax產生的變化不多(亦即，在比較實驗中所獲得的最大報導基因讀值)，而EC50變化相當多，高至超過兩個量級(表11，與圖12A和12B)。在寡核苷酸的第1個位置與第6個位置中的單一取代對於EC50非常輕微，如同寡核苷酸的第2個與第5個位置。寡核苷酸的第3個與第4個位置觀察到最為強烈的變化，其使得EC50增加超過10倍。在雙重dC取代中(表11，圖12C與12D)，寡核苷酸的連續第1個與第2個，還有第5個與第6個位置產生相對溫和的EC50增加，而第4個與第5個位置則導致較強烈的增加。第2個與第3個還有第3個與第4個位置的雙重dC取代分別導致EC50大大增加160倍與303倍。鑒於已在本研究之前鑑別 出3個連續dG作為強力TLR21活性的最小數目，而在dG3、dG4至dG5順序中注意到EC50增加，之後從dG5-dG8看到EC50穩定狀態(比較圖5A、5B、6與表3)，這些數據進一步支持以下見解：在2006-PDE 5’處的G-四聯體形成未遭受到破壞會是強烈TLR21刺激的必要條件。
在2006-PDE-5dG6的5dG6連串序列中檢驗dT取代對於TLR21刺激活性的影響
基於2006-PDE 5’端處的連續dG序列形成賦予TLR21刺激活性之G-四聯體的假設，預測在dG6連串序列中的dT取代(預期會擾亂G-四聯體形成)依據位置會對TLR21刺激活性有負面影響。為此，合成單一與雙重dT取代2006-PDE-5dG6 ODN，並且如實例3中所述在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞中測試其刺激TLR21的能力(表12、表13，圖13A-D)。
大體上，dG6連串序列內的所有dT取代於Vmax產生的變化不多，而EC50變化相當多，高至超過三個量級(表13，與圖13A和13B)。在寡核苷酸的第1個位置與第6個位置中的單一取代對於EC50非常輕微，如同寡核苷酸的第2個與第5個位置。在寡核苷酸的第3個與第4個位置觀察到最為強烈的變化，其使得EC50增加超過6倍。在雙重dT取代中(表13與圖13C和13D)，寡核苷酸的連續第1個與第2個，還有第5個與第6個位置產生相對溫和的EC50增加，而第4個與第5個位置則導致較強烈的增加。寡核苷酸的第2個與第3個位置還有第3個與第4個位置的雙重dT取代分別導致EC50大大增加1781倍與622倍。鑒於已在本研究之前鑑別出3個連續dG作為強力TLR21活性的最小數，而在dG3、dG4至dG5順序中注意到EC50增加，之後從dG5-dG8看到EC50穩定狀態(比較圖5A、5B、6與表3)，這些數據進一步支持以下見 解：在2006-PDE 5’處的G-四聯體形成未遭受到破壞會是強烈TLR21刺激的必要條件。
圖14說明在寡核苷酸的第1個與第6個位置處的dG取代確實是有益的。相反地，在寡核苷酸的位置3與4處的任何取代對於TLR21刺激效力確實具有明顯的負面影響。在寡核苷酸的位置1與2，還有位置5與6處的相鄰dGdG雙重取代也似乎是有益的。相反地，圖15說明在寡核苷酸的位置2與3，還有位置3與4處，相鄰dGdG被任何同二核苷酸(dCdC、dAdA還有特別是dTdT)取代導致TLR21刺激活性大幅喪失。在寡核苷酸之位置4與5處的相鄰dGdG雙重取代更為溫和，但也導致活性喪失。
這些數據指出，四個dG的連續連串序列對於高TLR21刺激活性來說是必要的，而且四個dG連串序列受到任何其他核苷酸擾亂會導致活性大幅度喪失。
在2006-PDE-5dG4的5dG4連串序列中檢驗dA取代對於TLR21刺激活性的影響
為了更嚴格地測試5’-dG4對於賦予2006-PDE高度刺激活性來說是必要且充分的假說，2006-PDE-5dG4中的dG部分被dA有系統地取代，並且如在實例3中所述於HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞中測試各種衍生物刺激TLR21的能力(表14，表15，圖16A與16B)。
dG4連串序列內的所有dA取代導致TLR21刺激活性喪失。有些意外的是，在位置1中注意到TLR21刺激活性大幅變化達到無法計算出EC50的程度(表15與圖16A及16B)。在2006-PDE5dG4的第2個位置與第3個位置中的單一dA取代也導致EC50大幅增加，係數分別為342與471。在dG4連串序列中位置4的dA取代觀察到最為輕微的活性喪失，EC50增加係數為16(表15與圖16A及16B)。這些數據進一步支持以下見解：2006-PDE 5’處的G-四聯體形成未遭受到破壞會是強烈TLR21刺激的必要條件。
在2006-PDE-5dG4的5dG4連串序列中檢驗dC取代對於TLR21刺激活性的影響
為了更嚴格地測試5’-dG4對於賦予2006-PDE高度刺激活性來說是必要且充分的假說，2006-PDE-5dG4中的dG部分被dC有系統地取代，並且如在實例3中所述於HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞中測試各種衍生物刺激TLR21的能力(表16，表17，圖17A與17B)。
dG4連串序列內的所有dC取代導致TLR21刺激活性喪失。在位置1中注意到TLR21刺激活性明顯喪失，EC50增加係數為89(表17與圖17A及17B)。第2個位置與第3個位置中的單一dC取代也導致EC50大幅增加，係數分別為831與545。在dG4連串序列中位置4的dC取代發現到最為輕微的活性喪失，EC50增加係數為15(表17與圖17A及17B)。這些數據進一步支持以下見解：2006-PDE 5’端處的G-四聯體形成未遭受到破壞會是強烈TLR21刺激的必要條件。
在2006-PDE-5dG4的5dG4連串序列中檢驗dT取代對於TLR21刺激活性的影響
為了更嚴格地測試5’-dG4模體對於賦予2006-PDE高度刺激活性來說是必要且充分的假說，在2006-PDE-5dG4中的dG部分被dT有系統地取代，並且如在實例3中所述於HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞中測試各種衍生物刺激TLR21的能力(表18，表19，圖18A與18B)。
dG4連串序列內的所有dT取代導致TLR21刺激活性喪失。就TLR21刺激活性來說，位置1觀察到有些驚訝且大幅度的變化，達到無法計算出EC50的程度(表19與圖18A及18B)。第2個位置與第3個位置中的單一dA替換也導致EC50大幅增加，係數分別為92與265。在dG4連串序列中位置4的dT取代發現到最為輕微的活性喪失，EC50增加係數為5(表19與圖18A及18B)。這些數據進一步支持以下見解：2006-PDE 5’處的G-四聯體形成未遭受到破壞會是強烈TLR21刺激的必要條件。
如圖19說明，dG4中的任何dG取代不利於TLR21刺激活性，其與高度活性需要四個連續dG的觀點相符。有趣的是，儘管保留了三個連續dG，但任何在位置1的取代仍會消除TLR21活性，而位置4 dG的取代(其意保留三個連續dG)為比較有益的。取代dG2或dG3同樣對TLR21活性不利。
向含CpG的PDE-ODN添加5’-dG4與5’-dG6對於賦予TLR21刺激活性的影響
選出在文獻中暗示對哺乳動物TLR9具有刺激性(但大多描述為PTO變體)的十一個含CpG的寡去氧核苷酸序列用來合成作為PDE衍生物(表20)。所有這些PDE ODN的TLR21交互作用均不明。針對這些PDE ODN中的五者，也合成其3’-dG5-、5’-dG4-與5’-dG6-變體。針對一個ODN，合成 其5’-dG4-與5’-dG6-變體；而針對另一者則合成其3’-dG5-與5’-dG6-變體；至於其他4個，僅合成對應5’-dG6-變體(表20)。這些ODN經過如實例3中所述的TLR21刺激測試(表21，圖20A-I)。
在未經修飾PDE ODN的TLR21活化測試中(表20)，只有1826、BW006、D-SLO1以及2007顯示有一些較少的活性(表21，圖20B、20C、20D、20G)。所有其他PDE ODN在測試濃度下展現出無TLR21刺激活性(表21，圖20A、20E、20F、20H、20I、20J與20K)。具有添加3’dG5的六個ODN衍生物並未展現出TLR21活性(表21)。這與2006-PDE的早先觀察結果相符。 關於具有較少TLR21刺激訊號的四個ODN(1826、BW006、D-SLO1以及2007)，3’dG5添加扼殺了它們的活性(圖20B、20C、20D、20G)。
相反地，添加5’dG4(六個ODN)或5’dG6(十一個ODN)在各個情況中導致TLR21刺激活性增加，包括在五者中有奈莫耳EC50以及在十三個他者中有皮莫耳(pM)EC50(表21)。有鑑於起始點趨近零，六個甚至有非常顯著的雙位數pM EC50(低至20pM)。總之，數據暗示著，可以透過將dG連串序列附接至先前活性不良或無活性之含CpG的PDE-ODN的5’-端(不是3’-端)而達到強力TLR21活性。
在此呈現的數據也暗示著，獲得活力與藉由經5’dGn修飾之ODN分子間形成G-四聯體DNA超結構有關。
5’dG添加對於2006-PDE之小鼠TLR9辨識的影響
使用2006-PDE(2006-PTO的磷酸二酯鍵變體)作為基礎來探究5’-dG修飾對於鼠類TLR9以及人類TLR9之刺激活性的影響。從2000nM或5000nM ODN濃度開始以15個稀釋步驟(1：2)達到約100pM或500pM作為最終稀釋來進行力價實驗。2006-PTE的衍生物ODN描述於表21-2中。
2006-PTO在奈莫耳範圍下刺激小鼠與人類TLR9。2006-PDE顯示僅有少許小鼠或人類TLR9刺激活性(圖68A與68B)。在2006-PDE的5’端處添加一個至八個dG導致小鼠的TLR9無活性或者僅有少許活性增加(圖68A)。於人類HEKBlue細胞中，在2006-PDE的5’端處添加一個至六個dG導致刺激活性沒有增加或甚至降低。在具有CpG模體的寡核苷酸的5’端處添加 dG7與dG8導致人類TLR9活性有一些略為增加(圖68B)。總體來說，這個圖與下列觀察結果形成強烈對比：2006-PDE的雞TLR21刺激活性因為在寡核苷酸的5’端處添加三個至八個dG而被強勁地提高。
3’dG添加對於2006-PDE之小鼠與人類TLR9辨識的影響
在2006-PDE的3’端處添加一至三個dG會略為逐漸地增加小鼠TLR9活性(圖69A)。在寡核苷酸的3’端處添加第四個dG會導致小鼠TLR9刺激活性強烈增加，其在向寡核苷酸之3’端添加第5個、第6個、第7個或第8個3’dG之後僅略為增進或維持著。
關於刺激人類TLR9，相對於親本2006-PDE，在2006-PDE的3’端處添加一至三個dG會導致刺激活性明顯逐漸增加。在寡核苷酸的3’端處添加第四個dG會導致人類TLR9刺激活性強烈增加。這個刺激效用在添加第5個、第6個、第7個或第8個3’dG之後略為僅增進或維持著。
總體來說，這個圖與下列觀察結果形成強烈對比：2006-PDE的雞TLR21刺激活性不因為在3’端處添加3至8個dG而被提高或甚至降低。總而言之，關於TLR刺激活性，就向2006-PDE添加5’-dG與3’-dG來說，小鼠與人類(且假設為哺乳動物)TLR9的結構-活性相關性與雞(且假設為禽類)TLR21相比基本上不同。這可能反映出TLR21在禽類中僅是TLR9的一個功能性同源物，而不是真正的遺傳同源物。
實例4：已知或懷疑會形成G-四聯體結構的序列當連結至大部分無活性2006-PDE的5’端時賦予TLR21刺激活性
測試第I期。具有建議G-四聯體形成潛力之一些端粒與啟動子序列要素被添加至2006-PDE的5’端。此外，5’經T4-修飾2006-PDE(2006-PDE-T4)如實例3中所述被用來測定HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞刺激TLR21的能力(表22)。
人類端粒序列融合至2006-PDE以及2006-PDE-T4產生能夠以奈莫耳(nM)EC50或甚至皮莫耳(pM)活性來活化TLR21的ODN(表23，圖21A)。酵母菌端粒序列給予高TLR21活性，其中EC50低至152pM。所測試的c-myc-啟動子衍生序列也能夠活化2006-PDE-T4對TLR21刺激，一個衍生物產生雙位數pM活性(表23，圖21B與21C)。
合成帶有纖毛蟲屬(Oxytricha spp.)端粒(端粒研究與G-四聯體結構研究的一個較佳早期模型物種)之序列要素的2006-PDE融合物(表22)，並測試它們的TLR21刺激效力(表24，圖22A與22B)。在這個研究中，被融合的序列包含下列：TTAGGG、TTAGGGTTAGGG(SEQ ID NO：261)、TTTTGGGG、GGGGTTTT、GGGGTTTTGGGG(SEQ ID NO：262)、TTAGGG、TTAGGGTTAGGGTTTT(SEQ ID NO：263)、TGTGGGTGTGTGTGGG(SEQ ID NO：268)、GGAGG、TGGAGGC或TGGAGGCTGGAGGC(SEQ ID NO：264)。
纖毛蟲屬端粒序列要素賦予無活性2006-PDE高度有效的TLR21活性。所得衍生物是針對這點所鑑定出的最有效衍生物。
測試第II期。選出經證實或預測參與G-四聯體形成的20個不同啟動子要素，並且合成包含2006-PDE與啟動子要素的5’融合構築體(表25)供在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞中進行測試，以測定其刺激TLR21的能力。
TLR21分析揭示，所有測試要素均賦予無活性2006-PDE活性。二十個測試要素中的十一個顯示超出TLR21促效劑(2006-5dG6)的效力，EC50值低於30pM並低至15.6pM(表26)。
實例5：新穎序列要素的鑑定、應用和優化以及對CpG-ODN賦予TLR21刺激活性的生物物理原理
G-四聯體(圖23A)可以在分子內或分子間形成，且呈平行或逆平行位向(圖23B、23C)。根據G-四聯體媒介之ODN聚集會透過產生帶有多個TLR21結合位點之配位體變異體來造成TLR21刺激活性增加(導致獲得交互作用結合性以及受體叢集)的假設，進一步假設優化位向以及結合位點多重性應該會更為提高活性。
測試第I期。帶有建議G-四聯體形成潛力的一些端粒與啟動子序列要素被融合至2006-PDE與2006-PDE-T4的5’端，以供在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞中進行測試來測定其刺激TLR21的能力(表27)。
在這個方面特別有趣的是，由ODN單體形成聚合G-四聯體結構被稱為G-線(圖23C與23D)，且其具有產生聚合TLR21配位體的潛力。Marsh TC,Vesenka J,Henderson E,A New DNA Nanostructure,the G-wire,Imaged by Scanning Probe Microscopy,Nucl.Acid Res.,23：696-700(1995)。具體來說，具有序列GGGGTTGGGG(SEQ ID NO：257)融合至其5’端的2006-PDE似乎有形成此等結構的傾向(表27)。因為CpG-ODN的排列「活化」過於接近由5’GGGGTTGGGG(SEQ ID NO：257)所形成的這樣一個聚合物可能會造成諸如受體交互作用的空間排列問題，也合成帶有dT4間隔子的衍生物(表27)。
先前已報導過，富含G的六核苷酸TGGGGT(SEQ ID NO： 265)偏好形成平行位向的四聚G-四聯體結構(Phillips K,Dauter Z,Murchie AI,Lilley DM,Luisi BJ,The Crystal Structure of a Parallel-Stranded Guanine Tetraplex at 0.95Å Resolution,J.Mol Biol.273：171-182(1997))(圖23B)。透過5’-平行G四聯體連結之這樣一個含CpG的ODN的四聚體排列預期會提供對TLR21有利的配位體排列。合成2006-PDE的這樣一個衍生物(表27)，並且與上面的衍生物一起進行測試以供與2006-PDE-5dG4和2006-PDE-5dG6相比較(表28，圖24A及24B)。
將GGGGTTGGGG(SEQ ID NO：257)添加至TLR21-無活性2006-PDE的5’端(2006-PDE-Gwirel)會造成ODN具有pM EC50，但其活性未達2006-PDE-5dG4與2006-PDE-5dG6的EC50(其在本研究中用作為水準點)表28，圖24A與24B)。但是，在G-線序列與2006-PDE(2006-PDE-Gwire2)之 間引入4dT核苷酸增進EC50(係數達5)，且產生優於水準點的活性(表28，圖24A與24B)。將TGGGGT(SEQ ID NO：265)添加至2006-PDE的5’端就此會產生對TLR21具有最低EC50的ODN(表28，圖24A與24B)。因為5’G-線修飾而形成更高級結構是透過聚丙烯醯胺凝膠電泳獲得證實(圖25)。
總之，在這個研究中鑑定出兩個推測導致2006-PDE的強效TLR21刺激活性之優異G-四聯體序列要素。在不囿限於理論的情況下，GGGGTTGGGG(SEQ ID NO：257)的強力TLR21活化力是與其形成所謂G-線結構的已知潛力有關(圖23C與23D)，提供了一個帶有有利位向的多牙配位體。TGGGGT(SEQ ID NO：265)的強力TLR21活化力也可能是與其形成平行四聚體分子間G-四聯體的已知潛力有關，提供了一個帶有有利位向的四牙配位體(圖23B)。
測試第II期。測試水準點序列GGGGGG之TLR21刺激提高活性的潛力並且與G-線序列GGGGTTGGGGTTTT(SEQ ID NO：258)(在先前研究中經證明為優異的)相比較。為此，設計16個寡核苷酸，其具有通用序列TTTTTTTXCGXTTT(SEQ ID NO：259)，其中X表示任一種鹼基(表29)。dT被用來產生具有可接受長度(14個鹼基)的寡核苷酸以便將四核苷酸CpG「彈頭」包裹在ODN情境(context)中，因為其在合成時不會產生問題且是因為其形成不樂見二級結構的傾向低。僅帶有一個CpG要素還有PDE鍵的這類短ODN預期具有低TLR21刺激活性。因此，對TLR21的測試起始濃度從20nM提高50倍至1000nM。這16個ODN也被合成為帶有5’-GGGGGG末端以及5’-GGGGTTGGGGTTTT(Gwire2；SEQ ID NO：258)末端(表29)，並且在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞中測試其刺激TLR21的能力。
含有所有可能四核苷酸排列以及一個主要CpG的十六個14-員ODN對TLR21大部分無活性，至高1000nM濃度，例外是含有ACGC與CCGC的類型(分別為ODN9與11)，其在最高濃度下顯示可測得訊號。
將dG6(GGGGGG)添加至基本ODN的5’端(SEQ ID NO：144-159)在大部分的情況下產生一些TLR21刺激活性，例外為CCGA(ODN 19)、CCGG(ODN 23)、GCGC(ODN 26)與CCGT(ODN 31)(圖26B、27B、28B與29B)。這確定了5’-GGGGGG將TLR21活性給予CpG ODN的可能性，雖然GCGG(ODN 22)、ACGA(ODN 25)與TCGC(ODN 28)為例外，各者的訊號強度微弱(圖27B與28B)。
將Gwire2(GGGGTTGGGGTTTT(SEQ ID NO：258))添加至基本ODN的5’端(SEQ ID NO：144-159)在所有情況下產生TLR21刺激活性，其中5dG6成功，此外還有CCGA(ODN 35)、CCGG(ODN 39)與GCGC(ODN 42)，而CCGT(ODN 47)維持不動(圖26C、27C、28C與29C及29D)。但是，利用Gwire2附接所得到的訊號強度遠高於5dG6者。這個就GCGA(ODN 18相對ODN 34(分別為圖26B與26C))、GCGG(ODN 22相對ODN 38(分別為圖27B與27C))、ACGC(ODN 25相對ODN 41(分別為圖28B與28C))、CCGC(ODN 27相對ODN 43(分別為圖28B與28C))、TCGC(ODN 28相對ODN 44(分別為圖28B與28C))，以及GCGT(ODN 30相對ODN 46(分別為圖29B與29C))來說尤其明顯。後面的ODN，46，GCGT-Gwire2是最值得注意的類型；其在皮莫耳濃度下表現傑出的TLR21刺激活性，且EC50經測定為接近2nM(圖29D)。
含CpG序列要素GCGA、GCGG、ACGC、CCGC GCGT且或許還有TCGC先前未曾描述於TLR21活化的情境中。
XCGA系列。XCGA系列的14員中沒有一者顯示有任何TLR21活性至高到1000nM。添加5’-dG6產生一些活性為 GCGA>ACGA>TCGA，而CCGA維持無活性。最值得注意的是，添加5’-Gwire2對所有四個衍生物都產生TLR21活性。注意到GCGA有大幅TLR21活性增加，而其他者的活性增加呈相對順序為TCGA>ACGA>CCGA(圖26A-C)。
XCGG系列。XCGG系列的14員中有兩者(GCGG、TCGG)在1000nM下顯示微弱的TLR21活性(若有的話)，而其他兩個寡核苷酸則是無活性。添加5’-dG6產生一些活性為GCGG>ACGG>=TCGG，而CCGG維持無活性。最值得注意的是，添加5’-Gwire2對所有四個衍生物都產生TLR21活性。注意到GCGG有大幅TLR21活性增加，而其他者的活性增加呈相對順序為TCGG>ACGG>CCGG(圖27A-C)。
XCGC系列。XCGC系列的14員中有兩者(ACGC、CCGC)在1000nM與500nM下顯示微弱的TLR21活性，而其他兩者則是無活性。添加5’-dG6產生強烈活性為TCGC>ACGC>CCGC，而GCGC維持無活性。最值得注意的是，添加5’-Gwire2又再對所有四個衍生物都產生TLR21活性。注意到有大幅TLR21活性增加(呈活性順序為TCGC>ACGC>CCGC)，而GCGC維持活性弱(圖28A-C)。
XCGT系列。XCGT系列的14員中沒有一者顯示有任何TLR21活性高至1000nM(圖29A)。添加5’-dG6對所有四者產生一些活性，呈活性順序為TCGT>GCGT>ACGT>CCGT(圖29B)。最值得注意的是，添加5’-Gwire2大幅增加GCGT的TLR21活性，而且注意到TCGT活性也大於TCGT-5dG6者(圖29C)。經Gwire2-修飾ACGT與CCGT的活性均不大於5dG6衍生物(圖29C及29D)。Gwire2 14員ODN單獨(GGGGTTGGGGTTTT(SEQ ID NO；258))(其附接至基本ODN)對TLR21無活性(參見表49，圖29)。
實例6：最強力序列的骨架是GCGT-Gwire2：結構-活性相關性(SAR)
GCGT-Gwire2之SAR探究包括透過反轉(GC)，以及嘧啶-嘧啶(TG)還有嘌呤-嘌呤(CA)互換來修飾主要CpG要素(表30)。如在實例3中所述在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞中針對這些衍生物刺激TLR21的能力的測試揭示，在這些操作之後活性完全喪失(表31，圖30)，確定了GCGT-Gwire2的強力TLR21刺激活性關鍵是取決於存在這個單一CpG要素。
也降低Gwire2要素與GCGT要素之間的dTG數目(表30)，並且測試對應ODN：
對GCGT-Gwire2刪除T1-T4的結果於Vmax產生的變化不大，除了T3以外，大部分的EC50值相似。但是T5與T6刪除造成EC50增加，而且尤其是Vmax降低，暗示著固有活性喪失(表31，圖31)。
關於第三個SAR研究，在ODN之3’端處側接GCGT要素的T數目減少(表30)，並且測試對應ODN。影響非常明顯。雖然喪失一個T(eT1)在保留EC50的情況下造成Vmax降低，但喪失兩個T(eT2)增加EC50並大幅降低Vmax，喪失三個dT則完全消除活性(表31，圖32)。
在第四個實驗中，探究併入一個額外GGGGTT模體(GCGT-Gwire3，表30)對於GCGT-Gwire2的固有TLR21刺激活性的影響。GCGT-Gwire3的活性優於親本GCGT-Gwire2者(表31，圖33A與33B)。EC50為8倍低而Vmax也增加(表31)。於圖34中說明免疫刺激性GCGT-Gwire2寡核苷酸的初步SAR結果。
實例7：CpG要素複本數對於選定XCGX-Gwire2類型的TLR21刺激活性的影響
GCGT-Gwire2顯示預期奈莫耳EC50。在3’端處添加第二個GCGTTTT要素(GCGT-Gwire2-do，表32)產生EC50巨幅增進(係數為~65)且Vmax增加(表33，圖35A與35B)。再添加一個GCGTTTT要素(GCGT-Gwire2-tri，表32)導致EC50又降低，係數為3(135複合)且Vmax略為增加(表33，圖35A與35B)。
GCGA-Gwire2顯示預期的奈莫耳EC50。在3’端處添加第二個GCGATTT要素(GCGA-Gwire2-do，表32)產生EC50強烈增進(係數為~24)以及Vmax增加(表33，圖36A與36B)。再添加一個GCGATTT要素(GCGT-Gwire2-tri，表32)導致EC50又降低(係數為2)(48複合)還有Vmax略為增加(表33，圖36A與36B)。
ACGC-Gwire2顯示預期的奈莫耳EC50。在3’端處添加第二個ACGCTTT要素(ACGC-Gwire2-do，表32)產生EC50輕微增進(係數為~8)以及Vmax增加(表33，圖37A與37B)。再添加一個ACGCTTT要素(ACGC-Gwire2-tri，表32)導致EC50又降低(係數為8)(64複合)還有Vmax略為增加(表33，圖37A與37B)。
TCGC-Gwire2顯示預期的奈莫耳EC50。在3’端處添加第二個TCGCTTT要素(TCGC-Gwire2-do，表32)產生EC50強烈增進(係數為~12)以及Vmax增加(表33，圖38A與38B)。再添加一個TCGCTTT要素(TCGC-Gwire2-tri，表32)導致EC50又降低(係數為7)(84複合)還有Vmax略為增加(表33，圖38A與38B)。
CCGC-Gwire2顯示預期的奈莫耳EC50。在3’端處添加第二個CCGCTTT要素(CCGC-Gwire2-do，表32)產生EC50(係數為~50)以及Vmax巨幅 增進(表33，圖39A與39B)。再添加一個CCGCTTT要素(CCGC-Gwire2-tri，表32)導致EC50又降低(係數為17)(850複合)還有Vmax略為增加(表33，圖39A與39B)。
GCGG-Gwire2在所考量的低濃度範圍內僅顯示微弱訊號。在3’端處添加第二個GCGGTTT要素(GCGG-Gwire2-do，表32)產生巨幅的EC50與Vmax增進(係數為~51)(表33，圖40)。再添加一個GCGGTTT要素(GCGG-Gwire2-tri，表32)導致EC50又降低(係數為4)(204複合)還有Vmax略為增加(表33，圖40)。
彙整來說，向具有Gwire2序列與一個單一CpG要素的寡核苷酸添加更多含CpG的TLR21刺激序列要素顯示會使EC50從係數8增進至係數55，而Vmax典型為倍增。添加第三個要素也一致地更為增進TLR21刺激活性。這似乎是一個從初始簡單低活性標的產生高活性的通用方法。
實例8：實現具有合成/產品成本優勢之高活性TLR21刺激性ODN：a)在含CpG序列要素之間，以及b)在G-四聯體形成部分內和在其與含CpG序列要素鄰接處添加烷基與乙二醇間隔子或經烷基與乙二醇間隔子取代核苷酸
5’-Gwire2-技術(GGGGTTGGGGTTTT(SEQ ID NO：258))被用來探究在概念上簡單的潛在刺激性序列的TLR21刺激效力：三個連續CpG，在5’端處受到四個dT所包圍而在3’端處受到三個dT所包含(表34，CG-Gw2-T0)。透過在三個CpG要素之間逐步地插入一個、兩個、三個與四個dT(產生CG-Gw2-T1-CG-Gw2-T4，表34)，探究CpG要素的間距對於TLR21刺激活性的影響。如在實例3中所述於HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞中進行TLR21刺激分析，以測定表34中的ODN刺激TLR21的能力，並且計算EC50與Vmax值(表35，圖41A和41B)。
明顯地，CG-Gw2-T0在所考量的濃度範圍內對TLR21完全無活性(高至20nM)，而CpG之間的一個間隔dT已產生強烈刺激性ODN，EC50在皮莫耳範圍內。CpG之間的第二個dT並未增進活性，但dT3與dT4分別產生EC50為16.6與11.3pM(表35，圖41A和41B)。這暗示著CpG要素的存在對於活性來說並不足夠，它們還需要處在正確的情境中。
TLR21刺激活性在間隔子基團中需要鹼基嗎？
合成一個在CpG之間具有去氧核醣磷酸酯橋接(「無鹼基位點」)來取代dT的ODN(CG-Gw2-abase)。如實例3中所述在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞中測試這個ODN以及親本CG-Gw2-T1刺激TLR21的能力(表36，圖42A與42B)。
出乎意外，CG-Gw2-abase(圖43)對TLR21比CG-Gw2-T1(EC50=133pM)顯示甚至一些更高的效力(EC50=34pM)，而Vmax則稍微較低(表37，圖42A與42B)。這個結果顯示，在CG-Gw2-T1 ODN中，間隔核苷酸中的鹼基對於TLR21刺激來說並非必需的，但是對EC50具有負面影響。
線性間隔子基團對於CG-Gw2 ODN之TLR21活性的影響
在本研究中，在CG-Gw2-T1中隔開兩個CpG的dT核苷酸被「C18」六乙二醇連接子，或「C3」丙二醇連接子所取代(表38)。如實例3中所述在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞中測試這些ODN刺激TLR21的能力。
雖然由六乙二醇所形成之C18間隔子當被插入CG-Gw2的CpG要素之間(表36，圖43)時產生TLR21-無活性ODN(表39，圖44A)，但使用C3間隔子(1,3-丙二醇，CG-Gw2X2，表38，圖43)的相同修飾不僅維持，甚至就EC50來說還略微增進親本CG-Gw2-T1的效力(表39，圖44B)。有鑑於C3間隔子結構相較於核苷酸的簡單性(圖43)，這是最為值得注意的結果。考量無鹼基位點(像是C3間隔子)在兩個磷酸二酯鍵之間包含三個連結的碳原子，C3可能是高活性無鹼基位點結構的一個簡化形式(參見圖43)，也有效率地支持了TLR21活化。
探究經G-線與TGGGGT(SEQ ID NO：265)-活化C3間隔子連結之CpG結構的TLR21刺激活性
在這個研究中，GGGGTTGGGG(SEQ ID NO：257)G-wire(CG-Gw2X2-1)或TGGGGT(SEQ ID NO：265)要素(CG-G4T16X2-1)被連結至TTTTTTTTCG-X2-CGTTT(SEQ ID NO：271)(表40)，並且評估TLR21刺激效力。然後，ODN均藉由連續添加連結至CpG模體的C3-間隔子進行進一步修飾，產生帶有三個、四個與五個CpG模體的ODN，各自被C3分隔開(表40)。也如實例3中所解釋於HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞中評估其對TLR21的活化效力(表41，圖45與46)。
在G-線活化中，帶有兩個被C3分隔開之CpG模體的第一個ODN已顯示皮莫耳活性(EC50=312pM)，雖然在三位數範圍內。第三個被C3分隔開的CpG得到EC50為78.5pM，其與第二個(被分開合成的批次)所測定的96.5pM相當(參見表39)。添加第四個被C3分隔開的CpG模體又再產生效力10倍增加(EC50=7.4pM)。添加第五個與第六個被C3分隔開的CpG模體維持高效力且甚至有略為增進。這些單位數皮莫耳效力是目前對TL21來說最高的活性，對於像是經丙二醇磷酸酯分隔開之CpG模體般簡單的結構要素 來說是一個引人注意且出乎預期的成績(表41，圖44A與44B)。在X2-1至X2-5系列中GTTTTG要素取代G-線要素已知會引起平行分子間G-四聯體結構(表40)，產生具有類似效力，一部分甚至效力更優越的ODN(表41，圖46A與46B)。
探究間隔子長度與精細化學結構對於經G-線活化C3間隔子連結之CpG模體之TLR21刺激活性的影響
在這個研究中，GGGGTTGGGG(SEQ ID NO：257)G-線被連結至TTTTTTTTCG-X-CGXCGTTT(SEQ ID NO：260)(表42)，並且評估TLR21刺激效力。X是一系列用來分隔CpG模體的烷基二醇-磷酸酯(表42，圖47)，其ODN-X3是CG-Gw2X2(參見表38)和CG-Gw2X2-2(參見表40)的重複合成。此外，如實例3中所述在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞中針對TLR21刺激分析包含無鹼基間隔子(表42，圖49；參見CG-Gw2-abase(表36中的SEQ ID NO：221))還有三乙二醇衍生物間隔子(一種「C8」連接子，圖49)的寡核苷酸。
在結構上，CG-Gw2-T1中的一個CpG要素的3’-磷酸根與下一個CpG要素的5’-磷酸根之間的間隔是經由三個連結碳原子，由5’C至4’C至3’C(圖49)。當使用無鹼基位點時，維持相同距離，因為缺少鹼基並不會改變去氧核醣部分。在ODN-X3中維持非常相同的排列，其中三個亞甲基(-CH2-)基團在3’-與5’-磷酸根基團之間形成間隔子(圖47)。有趣的是，如透過EC50所測定，它們對TLR21的效力高度相近(分別為133pM、127pM以及149pM，表43)，暗示著物理距離比精細的化學結構(例如存在鹼基、去氧核醣部分的完整性)更為重要，因為最容易想到的部分維持去氧核醣幾何學的連接子1,3-丙二醇似乎並非一個不利條件(表43，圖49A與49B)。
依據研究結果，作為一個間隔子來說，1,3-丙二醇相當於去氧胸嘧啶(dT)或無鹼基位點的間隔子(表43)，其也已經由較早實驗(表36-39)所暗示過，吾人探究間隔子長度對於TLR21活性的影響。
較短的衍生物乙二醇(ODN-X2，表42，圖47)相比於1,3-丙二醇衍生物ODN-X3(表42，圖47)在TLR21刺激活性方面更弱，係數超過二(表43，圖50A與50B)。相反，1,4-丁二醇衍生物ODN-X4(表42，圖47)中的間隔子給予略高的活性(表43，圖50A與50B)，而進一步延長兩個額外亞甲基基團(1,6-己二醇，ODN-X6)或5個額外亞甲基基團(1,9-壬二醇，ODN-X9)(表42，圖47)大幅削弱TLR21刺激效力，係數分別為89與138(表43，圖50A和 50B)。具有12個亞甲基基團的間隔子(1,12十二烷二醇，ODN-X12)(表42，圖47)在所考量的濃度範圍內完全無活性(表43，圖50A與50B)。還探究了三乙二醇(TEG)連接子(ODN-XtrEG，表42，圖48)。這個衍生物在空間上對應於C8連接子。因此，引人注意的是其TLR21 EC50比1,9-壬二醇衍生物ODN-X9明顯更低，且同樣低於1,6-己二醇衍生物ODN-X6的EC50(參見表43，圖51)。
C3間隔子原理也對含CpG之四核苷酸結構發揮作用嗎？
檢驗含C3間隔子(1,3-丙二醇)之TLR21-活性ODN(具有含CpG四核苷酸結構)。為此，在第一個實驗中，合成含有5’-G-線序列的ACGC-Gw2X1、ACGC-Gw2X2、CCGC-Gw2X1以及CCGC-Gw2X2，且如實例3中所述於HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞中測試其刺激TLR21的能力(表44)。之後合成含有5’-G4T16的ACGC-G4T16X2以及CCGC-G4T16X2並且進行TLR21測試(表44)。
CpG四核苷酸序列的C3間隔明確能夠刺激TLR21。ACGC-Gw2X2以及CCGC-Gw2X2(表44)在先前觀察CG-Gw2X2/ODN-X3的範圍內(比較表39與43)展現出TLR21 EC50(表45，圖52A以及52B)。如先前CG-Gw2X1所觀察到(表39)，還有透過結構-活性相關性所預測，六乙二醇(HEG，「C18」)衍生物ACGC-Gw2X1以及CCGC-Gw2X1分別為無活性，或者非常微弱(表45，圖52A與52B)。5’-G-線序列受到其他吾人先前鑑定之具優勢5’-結構(TGGGGT(SEQ ID NO：265)，G4T16)取代產生了兩個衍生物，ACGC-G4T16-X2與CCGC-G4T16-X2，具有更為增進的EC50(表45，圖53A與53B)。
C3與C18連接子在TLR21-活化ODN之5’-富含G序列處/中的影響
探究當被置放在CpG模體與G-四聯體序列之間時或當被置放在G-四聯體序列內時，C3間隔子(1,3-丙二醇)或C18間隔子(六乙二醇，HEG)能否增進TLR21活性含5’-G-四聯體ODN的活性。基於2006-PDE5dG4合成兩個ODN。一者在dG4序列下游3’帶有C18連接子(2006-PDE5dG4-X1)，而一者在相同位置處帶有C3連接子(2006-PDE5dG4-X2)(表46)。此外，透過將GGGGTTGGGG(SEQ ID NO：257)序列中的T取代為C18連接子(2006-5dG4-X3)或C3連接子(2006-5dG4-X4)來修飾2006-G-wire1。如實例3中所述在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞中測試所有這些衍生物刺激TLR21的能力。
在2006-PDE5dG4，在dG4與2006-PDE之間添加C18間隔子增進TLR21活性，如透過EC50量測超過6倍(表47，圖54A)。在相同位置處的C3間隔子增進TLR21刺激，係數為2(表47，圖54A)。在2006-PDE-G-wire1中，G-線序列中的兩個T被C18間隔子取代會增進TLR21活性，如透過EC50量測約5倍(表47，圖54B)。在相同位置處的C3間隔子增進TLR21刺激，係數為4(表47，圖54B)。總而言之，數據暗示TLR21活化性質不會因為C18或C3連接子的存在而蒙受減損，而且它們產生甚至更為增進的活性。
實例9：ODN的5’-膽固醇修飾，而非3’-膽固醇修飾造成TLR21刺激活性強烈增加
檢驗典型3’-膽固醇修飾以及較為罕用的5’-膽固醇修飾對中等活性與高活性ODN類型之TLR21刺激效力的影響。
3’-膽固醇修飾
一般施用之3’膽固醇修飾(圖55)被施用至兩個高TLR21活性ODN，2006-Gwire2以及2006-T4-5dTG4T(表48)。更具體來說，包含3’膽固醇部分的ODN是購自Eurofins。膽固醇部分的結構是依據www_linktech_co_uk/products/modifiers/hydrophobic_group_cholesterol_palmitate_modification/969_3-cholesterol-synbase-cpg-1000-110中所示的3’Cholesterol SynBaseTM。如實例3中所解釋進行TLR21刺激測試。
結果暗示，ODN的TLR21刺激活性在3’-膽固醇修飾之後均未增進(表49，圖56A、56B、57A、57B)。經3’-膽固醇修飾之ODN的EC50甚至增加(表49)，暗示著小幅喪失TLR21刺激活性。
包含一個3’膽固醇部分的ODN是購自Eurofins。膽固醇部分的結構是依據www_linktech_co_uk/products/modifiers/hydrophobic_group_cholesterol_palmitate_modification/969_3-cholesterol-synbase-cpg-1000-110中所示的3’Cholesterol SynBaseTM。
5’-膽固醇修飾(I)
將更罕施用之5’膽固醇修飾(圖58A與58B)合成至在吾人研究過程中鑑別之高TLR21活性ODN(GCGT3-TG4T)上(表50)。更具體來說，包含5’膽固醇部分的ODN是訂購自Genelink，且這些ODN的脂質部分的結構是依據在www_genelink_com/newsite/products/MODPDFFILES/26-6602.pdf處所示的結構。包含5’膽固醇部分的其他ODN是訂自Sigma Aldrich。這些ODN的脂質部分的結構是根據在www_sigmaaldrich_com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/General_Information/1/custom-oligonucleotide-modifications-guide.pdf，第85/86頁處所示的結構。其他包含5’膽固醇部分的ODN是訂購自IBA Lifesciences，並且具有基於在www_iba-lifesciences_com/Services_custom_oligos_custom_DNa_Non-fluorescent_5-modifications.html處所示的結構。如實例3中所述在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞中進行TLR21刺激測試。
兩個獨立測量的結果暗示，GCGT3-TG4T的TLR21刺激活性因為5'-膽固醇修飾而大幅增進(表51，圖59A、59B)。相較於其未經修飾的變體，於兩個分析中EC50均降低超過兩個量級(係數分別為147與152，表51)。5’-經膽固醇基修飾GCGT3-TG4T是迄今鑑定最具TLR21刺激活性的ODN。
包含一個5’膽固醇部分的ODN是訂購自Genelink，且這些ODN之脂質部分的結構是基於在www_genelink_com/newsite/products/MODPDFFILES/26-6602.pdf處所示的結構。其他包含5’膽固醇部分的ODN是訂購自Sigma Aldrich。這些ODN之脂質部分的結構是基於在www_sigmaaldrich_com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/General_Information/1/custom-oligonucleotide-modifications-guide.pdf，第85/86頁處所示的結構。其他包含5’膽固醇基部分的ODN是訂購自IBA Lifesciences，且具有基於在www_iba-lifesciences_com/Services_custom_oligos_custom_DNa_Non-fluorescent_5-modifications.html處所示之結構。
5’-膽固醇基修飾(I)
將5’膽固醇修飾(圖58A與58B)合成至在吾人研究過程中鑑別之高TLR21活性ODN(GCGT-3-TG4T以及GCGT-3-Gw2)上(表52)。如實例3中所述在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞中進行TLR21刺激測試。
兩個獨立測量的結果暗示，GCGT-3-TG4T以及GCGT-3-Gw2的TLR21刺激活性均因為5’-膽固醇修飾而大幅增進(表53，圖60A、60B、61A、61B)。相較於其未經修飾變體，於兩個分析中EC50均降低達約1個量級(GCGT-3-TG4T-5Chol的係數分別為10與13，而GCGT-3-Gw2-5Chol的係數分別為30與24)(表51)。5’-經膽固醇基修飾的ODN(GCGT-3-TG4T以及GCGT-3-Gw2是迄今鑑定最具TLR21刺激活性的ODN，展現出飛莫耳EC50值。
5’-膽固醇修飾(II)
將5’膽固醇修飾(圖58A與58B)合成至在吾人研究過程中鑑 別之兩個高TLR21活性ODN(GCGT-3-TG4T以及GCGT-3-Gw2)上(表54)，並且如實例3中所述在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞中進行TLR21刺激測試。
兩個獨立測量的結果暗示，GCGT-3-TG4T以及GCGT-3-Gw2的TLR21刺激活性均因為5’-膽固醇修飾而增進(表55，圖62A、62B、63A、63B)。相較於其未經修飾的變體，在兩個分析中EC50均降低約5至10倍(GCGT3-TG4T-5Chol的係數約5，而GCGT3-Gw2-5Chol的係數約10(表55))。在這個研究中也顯示，5’-dG序列對於5’-膽固醇的活性提高效用不是必須的，因為GCGT3-5Chol相較於其未修飾同源物的活性多出約17倍(表55，圖64)。
5’-膽固醇修飾(III)
將5’膽固醇修飾(圖58A與58B)合成至另一個供應商的GCGT3-TG4T上(表56)，並且如實例3中所述在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞中進行TLR21刺激測試。
GCGT3-TG4T的5’-經膽固醇基修飾形式顯示高效TLR21刺激活性，具有單位數pM EC50數值(表57，圖65A與65B)。相反，沒有5’-膽固醇基的GCGT3-TG4T形式就EC50來說效力少幾乎1500倍，證實5’脂質修飾的重要性(表57，圖65A與65B)。
5’-膽固醇修飾(IV)
將5’膽固醇修飾(圖58A與58B)合成至在吾人研究過程中鑑別之另一個帶有不同CpG-四核苷酸核心的高TLR21活性ODN(CCGC3-Gw2)上(表58)，並且如實例3中所述在HEK293-NFκB-bsd-cTLR21細胞中進行TLR21刺激測試。
兩個獨立測量的結果暗示，CCGC3-Gw2的TLR21刺激活性因為5’-膽固醇修飾而增進(表59，圖66A、66B)。相較於未經修飾的變體，在兩個分析中EC50均降低約3至5倍(表59)。在這個研究中也顯示，5’-dG序列對於5’-膽固醇的活性提高效用不是必須的：CCGC3-5Chol相較於其未修飾同源物的活性多出約33倍(表59，圖67)。
歸納來說，咸信是第一個關於ODN對TLR21之固有活性增加是因為5’-膽固醇基修飾的報導。這已經由在三個不同批次中由三個不同供應商合成之GCGT3-TG4T(在這個研究系列中新鑑定出的ODN)所證實。TLR21活性提高效用除了因為5’-G-四聯體形成序列的活化(諸如Gwire2或TG4T)以外，並不需要它們(參見GCGT3)。TLR21活性提高效用也因為另一個在這個研究系列中所鑑定出之CpG-ODN而獲得證實：CCGC3-Gwire2以及CCGC3。3’-膽固醇基修飾不具TLR21活性提高效用。5’膽固醇基衍生化似乎可能也具有穩定效用來對抗核酸酶降解。推測膽固醇基微胞組裝貢獻了多牙TLR21配位體形成。相對於3’位置，5’位置可能是CpG模體的正確位向所需。此外，5’膽固醇基衍生化可能在活體內生物可利用性具有修飾效用。
那些習於技藝者將能理解到，可對本發明的較佳具體例進行許多變化以及修飾，且此等變化以及修飾可在不偏離本發明精神的情況下進行。因此，只要落入本發明的真正精神與範疇內，期望隨附申請專利範圍含括所有這些等效變化。
本篇文件中所引用或所述的各專利案、專利申請案以及公開案的揭示內容以其整體併入本文做為參考資料。
實例10：免疫刺激劑在雞隻的新城病(Newcastle disease)免疫接種模型中的活體內效力研究
為了確定ODN1、ODN2與ODN3作為免疫刺激劑的合適性以及效力，以三種不同濃度測試每一者。
探究以下免疫刺激劑：ODN1：[CholTEG]-TGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT(「GCGT3-TG4T-5Chol」)(SEQ ID NO：252)([CholTEG]=5’- 三乙二醇連結的膽固醇基修飾)，ODN2：TGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT(「GCGT3-TG4T」)(SEQ ID NO：252)，ODN3：tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt(「2006-PTO」)(SEQ ID NO：3)。
依據表61，將各免疫刺激劑添加至油乳液中，該油乳液含有次優濃度的不活化新城病病毒(NDV)。關於製備次優NDV疫苗，將NDV抗原批次在NDV陰性尿囊液(AF)中稀釋50倍。在SPF層雞(Leghorn)中測試ODN1、ODN2以及ODN3組合次優劑量的新城病疫苗的效力。測量血清反應並且與沒有免疫刺激劑的相似次優NDV疫苗進行比較。在免疫接種之後於不同時間點測定抗體力價，以探究添加免疫刺激劑是否會導致較早的免疫反應。為測定三種ODN的最優劑量，各者以三個不同劑量(100ng、1000ng與5000ng)補充至次優NDV疫苗，產生九個免疫刺激劑組。除了這九個免疫刺激劑組以外，在本研究中併入五個對照組，其由下列組成：不具有免疫刺激劑的次優NDV疫苗組、未稀釋NDV疫苗組、陰性對照組(免疫刺激劑組合佐劑)以及兩個具有呈不同濃度之聚肌苷酸：聚胞苷酸(聚I：C)的陽性對照組(表60)。
測試下列參數：雞隻的健康狀態(數據未示出)以及依據血球凝集抑制(HI)分析的血清學。
依據研究設計，參與治療組T01-T14的雞隻接受測試物或對照物。在T13與T14組中，因為在研究開始之前損失兩隻動物，每組為九隻而不是十隻雞進行免疫接種。
分配至治療組T01、T02、T03、T04、T05、T06、T07、T08以及T09的雞隻以含有3種不同免疫刺激劑(ODN)中之一者的次優NDV懸浮液進行免疫接種，每一種ODN呈三種不同濃度(100、1000、5000ng/劑量)。關於油包水乳液的製備，將NDV抗原懸浮液與免疫刺激劑(水相)和佐劑Stimune(油相)以4：5的比率一起調配(表61)。
分配至對照組T10的雞隻用次優NDV懸浮液(沒有免疫刺激劑)於佐劑(Stimune)中以4：5的比率進行免疫接種。
分配至對照組T11的雞隻用未稀釋NDV懸浮液(沒有免疫刺激劑)於佐劑(Stimune)中以4：5的比率進行免疫接種。
分配至T12組的雞隻以免疫刺激劑1(3隻雞)、免疫刺激劑2(3隻雞)或免疫刺激劑3(3隻雞)於佐劑(Stimune)中以4：5的比率進行免疫接種。一隻雞用稀釋緩衝液於佐劑(Stimune)中進行免疫接種。
分配至對照組T13的雞隻(n=9)以及分配至對照組T14的雞隻(n=9)用次優NDV懸浮液組合兩種濃度(10,000ng和100μg)的聚I：C在佐劑(Stimune)中以4：5的比率進行免疫接種。
測試物或對照物投與
將儲存在-70℃下的不活化NDV病毒株Ulster懸浮液解凍且在陰性尿囊液中稀釋50倍以產生次優疫苗劑量。依據研究設計添加免疫刺激劑。所得水相與Stimune以4：5的比率依據表61中所示免疫接種製備方案進行混合。製備期間，除了Stimune佐劑以外，所有疫苗成分均放置在融冰上。在製備之後直接注射已調配好的疫苗(0.5ml，肌肉內)。
自抵達當日至研究結束，透過有經驗的生物技術人員每天監控一般健康狀態。
血清血液採樣
在研究第0天(免疫接種之前)、第7天、第14天以及第21天從所有雞隻收集用於血清學的血液樣品。血液樣品標示研究號碼、專屬樣品鑑別碼以及收集日期。取決於抽取血液體積之量，將血清分成兩個約0.5ml的等份試樣並儲存於-20±5℃下。
血球凝集抑制(HI)分析
簡言之，將連續稀釋的血清與8 HAU(血球凝集單位)的NDV病毒株Ulster在室溫下一起培育歷時60分鐘。在每一次分析之前對HAU進行滴定。之後，添加雞紅血球並且在4℃下培育歷時45分鐘之後對凝集進行評分。於每個分析中納入陰性對照血清以及三個陽性對照血清(低、中與高抗體力價)。
HI力價結果表示為完全抑制凝集之最高血清稀釋度的倒數，其在對數上被轉換成最終Log2力價。
統計學
依據動物歸納經對數轉換的HI結果(參見表62-65)。根據治療組別來計算抗體力價的平均值以及標準差。利用非參數曼-惠二式t-檢定來進行統計分析。
結果
在所有組別中觀察到沒有與免疫接種相關的臨床症狀或不良事件，在整個研究期期間所有雞隻看起來都健康。
但是，有兩隻雞在研究開始之前6天起因為啄鬥行為(pecking behaviour)被評為有小傷。在免疫接種當天，這些雞隻被分派至聚I：C組T13(#11658)以及T14(#11676)。在免疫接種之後一週內恢復。
ODN1，GCGT3-TG4T-5Chol
表示為100ng、1000ng以及5000ng ODN1劑量組的Log2力價的個別HI結果顯示於表62中。與經稀釋NDV疫苗組的平均力價相比，這些組別的平均HI力價以及標準差顯示於圖70(免疫接種之後(pv)第14與21天)以及圖71(所有數據)中。
相較於經稀釋NDV疫苗，GCGT3-TG4T-5Chol組顯示HI力價明顯較高(平均HI力價：4.8 Log2/SD 1.0)。在pv第14天，全部三個劑量的實際情況為：100ng：平均HI力價6.2 Log2/SD 1.4(p=0.0214)；1000ng：平均HI力價6.9 Log2/SD 1.1(p=0.0003)以及5000ng：平均HI 5.9 Log2/SD 0.7(p=0.0243)。
然而在pv第21天，當與NDV疫苗相比(HI力價6.2 Log2/ SD1.0)，所有濃度均觀察到沒有明顯差異；100ng：平均HI力價6.9 Log2/SD 0.8(p=0.1995)；1000ng：平均HI力價7.3 Log2/SD 0.9(p=0.0527)；以及5000ng：平均HI 6.7 Log2/SD 0.9(p=0.4523)(圖70)，儘管1000ng濃度非常接近顯著性。
ODN2，GCGT3-TG4T
表示為100ng、1000ng以及5000ng ODN1劑量組的Log2力價的個別HI結果顯示於表63中。與經稀釋NDV疫苗組的平均力價相比，這些組別的平均HI力價以及標準差顯示於圖72(pv第14與21天)以及圖73(所有數據)中。
相較於經稀釋NDV疫苗，ODN2，GCGT3-TG4T組顯示HI力價明顯較高(平均HI力價：4.8 Log2/SD 1.0)。在免疫接種之後第14天，全部三種劑量的實際情況為：100ng：平均HI力價7.1 Log2/SD 1.2(p=0.0003)， 1000ng：平均H1力價6.4 Log2/SD 0.7(p=0.0027)以及5000ng：平均HI力價6.1Log2/SD 1.1(p=0.0236)。在第21天，當與NDV疫苗相比較時(HI力價6.2Log2/SD 1.0)，僅於100ng劑量觀察到顯著差異，其中平均HI力價為7.6 Log2/SD 0.8(p=0.0083)。1000ng與5000ng的平均HI力價分別為7.1 Log2/0.6(p=0.0696)與7.2 Log2/SD 1.0(p=0.0956)(圖72)。
ODN3，2006-PTO
表示為100ng、1000ng以及5000ng ODN1劑量組的測量Log2力價的個別HI結果顯示於表64中。在三重複HI分析進行期間，動物11570於第21天觀察到異常結果，這非常有可能是由於抽吸誤差所致(未添加足夠的AF)，因而最終分析刪去這個結果(表64中被強調)。故，就這隻動物還有日期來說，平均HI力價是基於二重複測量結果。
與經稀釋NDV疫苗組的平均力價相比，這些組別的平均HI力價以及標準差顯示於圖74(pv第14與21天)以及圖75(所有數據)中。
相較於經稀釋NDV疫苗，ODN3，2006-PTO組顯示HI力價明顯較高(平均HI力價：4.8 Log2/SD 1.0)。在免疫接種之後第14天，兩個劑量的實際情況為：1000ng：平均HI力價：6.3 Log2/SD 1.2(p=0.0081)以及5000ng：平均HI力價：6.2 Log2/SD 0.8(p=0.0059)。100ng劑量的平均HI力價為5.3 Log2/SD 0.5(p=0.2090)。在pv第21天，僅在5000ng測量到顯著差異：平均HI力價7.3 Log2/SD 0.6(p=0.0296)。當與NDV疫苗(HI力價6.2 Log2/SD 1.0)相比較時，在100ng與1000ng劑量下觀察到沒有顯著差異，其中平均HI力價分別為6.6 Log2/SD 0.5(p=0.7183)以及6.8 Log2/SD 1.1(p=0.1685)(圖74)。
對照組
表示為10μg以及100μg聚I：C劑量組、經稀釋與未稀釋NDV疫苗以及陰性對照組的Log2力價的個別HI結果顯示於表65中。與經稀釋 NDV疫苗組的平均力價相比，這些組別的平均HI力價以及標準差顯示於圖76(pv第14與21天)以及圖77(所有數據)中。
關於聚I：C陽性對照組，當與NDV疫苗(6.2 Log2/SD 1.0)相比時，僅於第21天在100μg劑量下觀察到HI力價明顯較高(HI力價7.5 Log2/SD 0.4)。10μg與100μg劑量組在pv第14天的平均HI力價分別為5.8 Log2/SD 1.3(p=0.1859)與5.5 Log2/SD 0.8(p=0.1609)。10μg劑量組在pv第21天的平均HI力價為6.4 Log2/SD 1.3(p=0.7273)。相較於在免疫接種之後第14與21天的經稀釋NDV組(分別為4.8/SD 1.0與6.2 Log2/SD 1.0)，未稀釋NDV疫苗(8.3/SD 0.5以及8.5 Log2/SD 0.7)與陰性對照組之間觀察到顯著差異(p<0.0001)(圖76)。
結論
目標是要研究三種不同免疫刺激劑的佐劑活性。這是透過在用含有次優濃度不活化NDV與不同濃度之三種免疫刺激劑之一者的油乳液疫苗來免疫接種之後測量血清學反應進行測試。
探究以下免疫刺激劑；ODN1：CholTEG]-TGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT(「GCGT3-TG4T-5Chol」)(SEQ ID NO：252)([CholTEG]=5’-三乙二醇連結的膽固醇基修飾)，ODN2：TGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT(「GCGT3-TG4T」)(SEQ ID NO：252)，ODN3：tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt(「2006-PTO」)(SEQ ID NO：3)。
ODN1以及ODN2免疫的骨架是磷酸二酯連結，而ODN3的骨架是硫代磷酸酯連結。各個ODN的效力是在三種不同濃度下進行測定：100ng、1000ng與5000ng，它們被補充至次優NDV疫苗中。
在第0天(免疫接種之前)、免疫接種後第7天、第14天及第21天測量血清學反應，以探究添加這些免疫刺激劑是否也會引起較早的免疫反應。在第0天以及免疫接種後(pv)第7天，偵測到沒有對抗NDV的抗體含量，除了在第7天於未稀釋NDV疫苗組中的一隻動物(#11618)以外。
以Log2 HI力價表示的血清學反應顯示，未稀釋與次優NDV疫苗之間在pv第14與21天有顯著差異(p<0.0001)，表示50倍的稀釋係數就足以產生次優疫苗劑量。
陰性對照組在整個研究期間維持陰性，表示免疫刺激劑在沒有NDV疫苗的情況下不會造成非特異性免疫反應。
相較於原生NDV疫苗，陽性對照聚I：C 100μg劑量組在第21天顯示HI力價明顯較高(p=0.0053)，表示這個劑量組可用作為有效的陽性對照組。
當相較於經稀釋NDV疫苗時，GCGT3-TG4T-5Chol(ODN1)組在pv第14天時就所有三個劑量均顯示HI力價明顯較高：100ng (p=0.0214)、1000ng(p=0.0003)以及5000ng(p=0.0243)。然而在pv第21天，觀察到沒有顯著差異。
當相較於經稀釋NDV疫苗時，GCGT3-TG4T(ODN2)組在pv第14天時就所有三個劑量均顯示HI力價明顯較高：100ng(p=0.0003)、1000ng(p=0.0027)以及5000ng(p=0.0236)。在第21天，僅於100ng劑量組測量到顯著差異(p=0.0083)。
相較於經稀釋NDV疫苗，2006-PTO(ODN3)組在pv第14天時就兩個劑量顯示HI力價明顯較高：1000ng(p=0.0081)以及5000ng(p=0.0059)。在pv第21天，僅於5000ng劑量組測量到顯著差異(p=0.0296)。
總結，當分別與原生NDV疫苗在pv第14天與第21天的2.3 Log2與1.4 Log2相比較時，在100ng GCGT3-TG4T(ODN2)劑量組觀察到最高的平均HI力價7.1 Log2(pv第14天)以及7.6 Log2(pv第21天)，指出力價增加。
1000ng GCGT3-TG4T-5Chol(ODN1)劑量組在pv第14天與第21天的力價分別為6.9 Log2與7.3 Log2，與ODN2組幾乎相似。在pv第14天，ODN1與ODN2組之間觀察到沒有顯著差異(p=0.7513)。
5000ng 2006-PTO(ODN3)劑量組在pv第14天與第21天的力價分別為6.2 Log2與7.3 Log2。在pv第14天，ODN3組明顯(p=0.0300)不同於ODN1與ODN2組(圖78及圖79)。
在pv第21天，所有ODN組之間顯示沒有顯著差異。
因此，這些結果指明：所有ODN都能夠明顯增加血清學反應，特別在是免疫接種之後第14天，也指明免疫較早發生。
具體例
關於更多說明，在下面提供本揭示內容的額外非限制性具體例。
例如，具體例1是一種免疫刺激性寡核苷酸，包含至少一個CpG模體，以及一個始於寡核苷酸5’端處或寡核苷酸5’端的四個核苷酸內之富含鳥嘌呤核苷酸的序列。
具體例2是具體例1之寡核苷酸，其中該富含鳥嘌呤核苷酸的序列包含第一複數個鳥嘌呤核苷酸。
具體例3是具體例2之寡核苷酸，其中該第一複數個鳥嘌呤核苷酸包含三至八個鳥嘌呤核苷酸。
具體例4是具體例3之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含SEQ ID NO：16、17、18、19、20、21、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、77、78、81、82、85、86、89、90、92、93、96、97、100、102、104、106、108、143或252。
具體例5是具體例1至3中任一項之寡核苷酸，其中該富含鳥嘌呤核苷酸的序列包含TTAGGG、TTAGGGTTAGGG(SEQ ID NO：261)、TTTTGGGG、GGGGTTTT、GGGGTTTTGGGG(SEQ ID NO：262)、TTAGGG、TTAGGGTTAGGGTTTT(SEQ ID NO：263)、TGTGGGTGTGTGTGGG(SEQ ID NO：268)、GGAGG、TGGAGGC、TGGAGGCTGGAGGC(SEQ ID NO：264)或TGGGGT(SEQ ID NO：265)。
具體例6是具體例1至3中任一項之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含SEQ ID NO：110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、124、125、126、127、129、130、131、134、136、137或138。
具體例7是前面具體例1-6中任一項之寡核苷酸，其在第一複數個鳥嘌呤核苷酸與該至少一個CpG模體之間進一步包含第二複數個鳥嘌呤核苷酸。
具體例8是具體例2至7中任一項之寡核苷酸，其中該第一複數個鳥嘌呤核苷酸、第二複數個鳥嘌呤核苷酸或兩者包含一個G-四聯體序列。
具體例9是具體例8之寡核苷酸，其中該G-四聯體序列是其他G-四聯體序列的交互作用位點。
具體例10是具體例9之寡核苷酸，其中該G-四聯體序列包含TGGGGT(SEQ ID NO：265)。
具體例11是具體例7之寡核苷酸，其中第一與第二複數個鳥嘌呤核苷酸包含G-線序列。
具體例12是具體例11之寡核苷酸，該G-線序列是其他G-線序列的交互作用位點。
具體例13是具體例10或11之寡核苷酸，其中該G-線序列包含SEQ ID NO：257或258。
具體例14是具體例11或12之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含SEQ ID NO：141、142、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、252或GCGT-Gwire3。
具體例15是具體例7至14中任一項之寡核苷酸，其中該第一複數個鳥嘌呤核苷酸與第二複數個鳥嘌呤核苷酸被至少一個核苷酸分隔開。
具體例16是具體例1至3中任一項之寡核苷酸，在第一複數個鳥嘌呤核苷酸與該至少一個CpG模體之間進一步包含一個連接子。
具體例17是具體例16之寡核苷酸，其中該連接子包含至少三個核苷酸。
具體例18是具體例16或17之寡核苷酸，其中該連接子包含六乙二醇、三乙二醇、丙二醇或其衍生物。
具體例19是具體例16至18中任一項之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含2006-PDE5dG4-X1或2006-PDE5dG4-X3。
具體例20是前面具體例1至19中任一項之寡核苷酸，其中該至少一個CpG模體為複數個CpG模體。
具體例21是具體例20之寡核苷酸，其中該複數個CpG模體包含兩個、三個、四個或五個CpG模體。
具體例22是具體例20或21之寡核苷酸，其中各個CpG模體與其他CpG模體被至少一個核苷酸或核苷酸類似物分隔開。
具體例23是具體例22之寡核苷酸，其中該至少一個核苷酸為一至四個胸嘧啶核苷酸。
具體例24是具體例22或23之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含SEQ ID NO：217、218、219或220。
具體例25是具體例20之寡核苷酸，其中該等CpG模體中的每一個與其他CpG模體被一個間隔子分隔開。
具體例26是具體例25之寡核苷酸，其中該間隔子是去氧核醣磷酸酯橋接。
具體例27是具體例26之寡核苷酸，其中該去氧核醣磷酸酯橋接為無鹼基。
具體例28是具體例27之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含SEQ ID NO：221。
具體例29是具體例25之寡核苷酸，其中該間隔子包含一個碳鏈。
具體例30是具體例29之寡核苷酸，其中該碳鏈包含兩個碳原子。
具體例31是具體例30之寡核苷酸，其中該碳鏈是衍生自乙二醇。
具體例32是具體例31之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含ODN-X2，其中X2為乙二醇。
具體例33是具體例29之寡核苷酸，其中該碳鏈包含三個碳原子。
具體例34是具體例33之寡核苷酸，其中該碳鏈是衍生自1,3-丙二醇。
具體例35是具體例33或34之寡核苷酸，其中該核苷酸包含CG-Gw2X2、Gw2X2-2或ODN-X3、CG-Gw2X2-1、CG-Gw2X2-3、CG-Gw2X2-4、CG-Gw2X2-5、CG-G4T16X2-1、CG-G4T16X2-2、CG-G4T16X2-3、CG-G4T16X2-4，或CG-G4T16X2-5，其中X2為一個三碳鏈；2006-PDE5dG4-X2，其中X2是一個衍生自丙二醇的三碳鏈；或2006-PDE5dG4-X4，其中X4是一個衍生自丙二醇的三碳鏈。
具體例36是具體例29之寡核苷酸核苷酸，其中該碳鏈包含四個碳原子。
具體例37是具體例36之寡核苷酸，其中該碳鏈是衍生自1,4-丁二醇。
具體例38是具體例36或37之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含ODN-X4，其中X4是一個衍生自1,4-丁二醇的四碳鏈。
具體例39是具體例25之寡核苷酸，其中該間隔子包含重複化學單元。
具體例40是具體例39之寡核苷酸，其中該重複化學單元為一個乙二醇。
具體例41是具體例39或40之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含CCGC-Gw2X1，其中X1是一個衍生自六乙二醇的間隔子。
具體例42是前面具體例1-41中任一項之寡核苷酸，進一步包含至少一個核苷酸類似物。
具體例43是前面具體例1-42中任一項之寡核苷酸，進一步包含一個磷酸二酯骨架。
具體例44是前面具體例1-43中任一項之寡核苷酸，進一步包含一個硫代磷酸酯骨架。
具體例45是前面具體例1至44中任一項之寡核苷酸，進一步包含一個脂質部分。
具體例46是具體例45之寡核苷酸，其中該脂質部分為膽固醇。
具體例47是具體例45或46之寡核苷酸，其中該脂質部分是在寡核苷酸的5’端處或鄰近寡核苷酸的5’端。
具體例48是前面具體例1-47中任一項之寡核苷酸，其中該CpG模體包含具有至少四個核苷酸的CpG序列要素。
具體例49是具體例48之寡核苷酸，包含至少兩個CpG序列要素。
具體例50是具體例48或49之寡核苷酸，包含至少三個CpG序列要素。
具體例51是具體例48至50中任一項之寡核苷酸，其中該等CpG序列要素為GCGA、GCGG、ACGC、CCGC、GCGT、TCGC或其任何組合。
具體例52是前面具體例1-51中任一項之寡核苷酸，進一步包含一個三胸嘧啶核苷酸3’末端。
具體例53是具體例55之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含SEQ ID NO：204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214或215。
具體例54是一種用於預防或治療傳染病的疫苗，包含前面具體例1-53中任一項之寡核苷酸。
具體例55是一種載體，包含前面具體例1-54中任一項之寡核苷酸。
具體例56是一種免疫刺激性組成物，包含前面具體例1-55中任一項之寡核苷酸。
具體例57是具體例56之免疫刺激性組成物，進一步包含醫藥上可接受載劑。
具體例58是具體例57之免疫刺激性組成物，其中該寡核苷酸與該載劑連結。
具體例59是具體例56之免疫刺激性組成物，進一步包含一個半抗原。
具體例60是具體例57之免疫刺激性組成物，其中該寡核苷酸與該半抗原連結。
具體例61是一種刺激類鐸受體21(TLR21)的方法，包含：向有需要的個體投與一個免疫刺激性寡核苷酸，該免疫刺激性寡核苷酸具有至少一個CpG模體以及一個始於該寡核苷酸5’端處或在該寡核苷酸5’端的四個核苷酸內的富含鳥嘌呤核苷酸的序列，該富含鳥嘌呤核苷酸的序列包含第一複數個鳥嘌呤核苷酸。
具體例62是具體例61之方法，其中該寡核苷酸的濃度少於20nM。
具體例63是具體例61或62之方法，其中該寡核苷酸進一步包含醫藥上可接受載劑。
具體例64是具體例61至63中任一項之方法，其中該免疫刺激性組成物進一步包含一個半抗原。
具體例65是具體例61至64中任一項之方法，其中該寡核苷酸的半最大濃度(EC50)少於100pM。
具體例66是具體例61至65中任一項之方法，其中該富含鳥嘌呤核苷酸的序列包含TTAGGG、TTAGGGTTAGGG(SEQ ID NO：261)、TTTTGGGG、GGGGTTTT、GGGGTTTTGGGG(SEQ ID NO：262)、TTAGGG、TTAGGGTTAGGGTTTT(SEQ ID NO：263)、TGTGGGTGTGTGTGGG(SEQ ID NO：268)、GGAGG、TGGAGGC或TGGAGGCTGGAGGC(SEQ ID NO：264)。
具體例67是具體例61至66中任一項之方法，其中該寡核苷酸包含SEQ ID NO：110、111、112、113、114、115、116、117118、119、120、124、125、126、127、129、130、131、134、136、137或138。
具體例68是具體例61至67中任一項之方法，其中該寡核苷酸進一步包含一個G-線序列。
具體例69是具體例68之方法，其中該G-線序列包含SEQ ID NO：257或258。
具體例70是具體例68之方法，其中該寡核苷酸包含SEQ ID NO：141、142、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、252或GCGT-Gwire3。
具體例71是具體例61至70中任一項之方法，包含第二複數個鳥嘌呤核苷酸，其中第一複數個鳥嘌呤核苷酸與第二複數個鳥嘌呤核苷酸被至少一個核苷酸分隔開。
具體例72是具體例61至71中任一項之方法，其中該寡核苷酸 在第一複數個鳥嘌呤核苷酸與該至少一CpG模體之間進一步包含一個連接子。
具體例73是具體例72之方法，其中該連接子包含至少三個核苷酸。
具體例74是具體例72之方法，其中該連接子包含六乙二醇、三乙二醇、丙二醇或其衍生物。
具體例75是具體例72至74之方法，其中該寡核苷酸包含2006-PDE5dG4-X1或2006-PDE5dG4-X3。
具體例76是具體例72至75之方法，其中該至少一個CpG模體為複數個CpG模體。
具體例77是具體例76之方法，其中該複數個CpG模體包含兩個、三個、四個或五個CpG模體。
具體例78是具體例76或77之方法，其中各個CpG模體與其他CpG模體被至少一個核苷酸或核苷酸類似物分隔開。
具體例79是具體例78之方法，其中該至少一個核苷酸為一至四個胸嘧啶核苷酸。
具體例80是具體例78或79之方法，其中該寡核苷酸包含SEQ ID NO：217、218、219或220。
具體例81是具體例76或77之方法，其中該等CpG模體中的每一個與其他CpG模體被一個間隔子分隔開。
具體例82是具體例81之方法，其中該間隔子是去氧核醣磷酸酯橋接。
具體例83是具體例82之方法，其中該去氧核醣磷酸酯橋接為無鹼基。
具體例84是具體例82或83之方法，其中該寡核苷酸包含SEQ ID NO：221。
具體例85是具體例81之方法，其中該間隔子包含一個碳鏈。
具體例86是具體例85之方法，其中該碳鏈包含兩個碳原子。
具體例87是具體例86之方法，其中該碳鏈是衍生自乙二醇。
具體例88是具體例86或87之方法，其中該寡核苷酸包含ODN-X2，其中X2為乙二醇。
具體例89是具體例85之方法，其中該碳鏈包含三個碳原子。
具體例90是具體例89之方法，其中該碳鏈是衍生自1,3-丙二醇。
具體例91是具體例89或90之方法，其中該核苷酸包含CG-Gw2X2、Gw2X2-2或ODN-X3、CG-Gw2X2-1、CG-Gw2X2-3、CG-Gw2X2-4、CG-Gw2X2-5、CG-G4T16X2-1、CG-G4T16X2-2、CG-G4T16X2-3、CG-G4T16X2-4，或CG-G4T16X2-5，其中X2為一個三碳鏈；2006-PDE5dG4-X2，其中X2是一個衍生自丙二醇的三碳鏈；或2006-PDE5dG4-X4，其中X4是一個衍生自丙二醇的三碳鏈。
具體例92是具體例85之方法，其中該碳鏈包含四個碳原子。
具體例93是具體例92之方法，其中該碳鏈是衍生自1,4-丁二醇。
具體例94是具體例92或93之方法，其中該寡核苷酸包含ODN-X4，其中X4是一個衍生自1,4-丁二醇的四碳鏈。
具體例95是具體例81之方法，其中該間隔子包含重複化學單元。
具體例96是具體例95之方法，其中該重複化學單元為一個乙二醇。
具體例97是具體例95或96之方法，其中該寡核苷酸包含CCGC-Gw2X1，其中X1是一個衍生自六乙二醇的間隔子。
具體例98是前面具體例61-97中任一項之方法，進一步包含至少一個核苷酸類似物。
具體例99是前面具體例61-98中任一項之方法，進一步包含一個脂質部分。
具體例100是具體例99之方法，其中該脂質部分為膽固醇。
具體例101是具體例99或100之方法，其中該脂質部分是在寡核苷酸的5’端處或鄰近寡核苷酸的5’端。
具體例102是具體例61至101中任一項之方法，其中該CpG模體包含具有至少四個核苷酸的CpG序列要素。
具體例103是具體例102之方法，其中該寡核苷酸包含至少兩個CpG序列要素。
具體例104是具體例102或103之方法，其中該寡核苷酸包含至少三個CpG序列要素。
具體例105是具體例101至104中任一項之方法，其中該等CpG序列要素為GCGA、GCGG、ACGC、CCGC、GCGT、TCGC或其任何組合。
具體例106是具體例61之方法，進一步包含一個三胸嘧啶核苷酸3’末端。
具體例107是具體例106之方法，其中該寡核苷酸包含SEQ ID NO：204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214或215。
具體例108是具體例61至107中任一項之方法，其中該免疫刺激性組成物包含用於預防或治療傳染病的疫苗。
具體例109是具體例61至107中任一項之方法，其中該免疫刺激性組成物包含一個載體。
具體例110是具體例61至109中任一項之方法，其中該免疫刺激性組成物進一步包含醫藥上可接受載劑。
具體例111是具體例110之方法，其中該寡核苷酸與該載劑連結。
具體例112是具體例61至111中任一項之方法，其中該免疫刺激性組成物進一步包含一個半抗原。
具體例113是具體例112中任一項之方法，其中該寡核苷酸與該半抗原連結。
具體例114是具體例61至113中任一項之方法，其中投與是靜脈內、肌肉內、乳房內、皮內、腹膜內、皮下、藉由噴霧、藉由氣溶膠、卵內、黏膜、穿皮、藉由浸入、經口、眼內、氣管內或鼻內進行。
具體例115是具體例61至114中任一項之方法，其中該個體為動物。
具體例116是具體例61至115中任一項之方法，其中該個體為禽類物種的一個成員。
具體例117是一種用於增加一個具有至少一個CpG模體的寡核苷酸之TLR21刺激活性的方法，包含將該寡核苷酸的5’端融合至一個富含鳥嘌呤核苷酸的序列。
具體例118是具體例117之方法，其中該富含鳥嘌呤核苷酸的序列是G-四聯體序列。
具體例119是具體例118之方法，其中該G-四聯體序列包含第一複數個鳥嘌呤核苷酸。
具體例120是具體例119之方法，其中該第一複數個鳥嘌呤核苷酸包含三至八個鳥嘌呤核苷酸。
具體例121是具體例119或120之方法，其中該G-四聯體序列包含TTAGGG、TTAGGGTTAGGG(SEQ ID NO：261)、TTTTGGGG、GGGGTTTT、GGGGTTTTGGGG(SEQ ID NO：262)、TTAGGG、TTAGGGTTAGGGTTTT(SEQ ID NO：263)、TGTGGGTGTGTGTGGG(SEQ ID NO：268)、GGAGG、TGGAGGC或TGGAGGCTGGAGGC(SEQ ID NO：264)。
具體例122是具體例117至121中任一項之方法，其中該寡核苷酸包含第二複數個鳥嘌呤核苷酸。
具體例123是具體例117至122中任一項之方法，其中該富含鳥嘌呤核苷酸的序列包含一個G-線序列。
具體例124是具體例123之方法，其中該G-線序列包含SEQ ID NO：257或258。
具體例125是具體例119至124中任一項之方法，其中該第一複數個鳥嘌呤核苷酸以及第二複數個鳥嘌呤核苷酸被至少一個核苷酸分隔開。
具體例126是具體例117之方法，進一步包含在第一複數個鳥嘌呤核苷酸與該至少一CpG模體之間插入一個連接子。
具體例127是具體例126之方法，其中該連接子包含至少三個核苷酸。
具體例128是具體例126或127之方法，其中該連接子包含六乙二醇、三乙二醇、丙二醇或其衍生物。
具體例129是具體例126至128中任一項之方法，其中該寡核苷酸包含2006-PDE5dG4-X1或2006-PDE5dG4-X3。
具體例130是具體例117之方法，其中該至少一個CpG模體是複數個CpG模體。
具體例131是具體例130之方法，其中該複數個CpG模體包含兩個、三個、四個或五個CpG模體。
具體例132是具體例130或131之方法，進一步包含在CpG模體之間插入至少一個核苷酸或核苷酸類似物。
具體例133是具體例132之方法，其中該至少一個核苷酸為一至四個胸嘧啶核苷酸。
具體例134是具體例117之方法，進一步包含在CpG模體的每一者之間插入一個間隔子。
具體例135是具體例134之方法，其中該間隔子是去氧核醣磷酸酯橋接。
具體例136是具體例135之方法，其中該去氧核醣磷酸酯橋接為無鹼基。
具體例137是具體例134之方法，其中該間隔子包含一個碳鏈。
具體例138是具體例137之方法，其中該碳鏈包含兩個碳原子。
具體例139是具體例137或138之方法，其中該碳鏈是衍生自乙二醇。
具體例140是具體例137之方法，其中該碳鏈包含三個碳原子。
具體例141是具體例137或140之方法，其中該碳鏈是衍生自1,3-丙二醇。
具體例142是具體例137之方法，其中該碳鏈包含四個碳原子。
具體例143是具體例137或142之方法，其中該碳鏈是衍生自1,4-丁二醇。
具體例144是具體例137之方法，其中該間隔子包含重複化學單元。
具體例145是具體例137或144之方法，其中該重複化學單元是一個乙二醇。
具體例146是具體例137、144或145中任一項之方法，其中該間隔子是衍生自六乙二醇。
具體例147是具體例117至146中任一項之方法，進一包含插入至少一個核苷酸類似物。
具體例148是具體例117至147中任一項之方法，進一步包含插入一個脂質部分。
具體例149是具體例148之方法，其中該脂質部分是一個膽固醇。
具體例150是具體例148或149之方法，其中該脂質部分在該寡核苷酸的5’端處或鄰近該寡核苷酸的5’端。
具體例151是具體例117至150中任一項之方法，進一步包含修飾鄰接該CpG模體的核苷酸。
具體例152是一種在個體體內引起免疫反應的方法，包含：向有需要的個體投與包含一寡核苷酸的免疫刺激性組成物，該寡核苷酸具有至少一個CpG二核苷酸模體以及一個始於該寡核苷酸5’端處或在寡核苷酸5’端的四個核苷酸內之富含鳥嘌呤核苷酸的序列。
具體例153是具體例152之方法，其中該寡核苷酸的濃度少於20nM。
具體例154是具體例152或153之方法，其中該免疫刺激性組成物進一步包含醫藥上可接受載劑。
具體例155是具體例152至154中任一項之方法，其中該免疫刺激性組成物進一步包含一個半抗原。
具體例156是具體例152至155中任一項之方法，其中該免疫刺激性組成物的半最大濃度(EC50)少於100pM。
具體例157是具體例152之方法，其中該富含鳥嘌呤核苷酸的序列包含一個G-四聯體序列。
具體例158是具體例152至156中任一項之方法，其中該G-四聯體序列包含TTAGGG、TTAGGGTTAGGG(SEQ ID NO：261)、TTTTGGGG、GGGGTTTT、GGGGTTTTGGGG(SEQ ID NO：262)、TTAGGG、TTAGGGTTAGGGTTTT(SEQ ID NO：263)、TGTGGGTGTGTGTGGG(SEQ ID NO：268)、GGAGG、TGGAGGC、TGGAGGCTGGAGGC(SEQ ID NO：264)或TGGGGT(SEQ ID NO：265)。
具體例159是具體例152至157中任一項之方法，其中該寡核苷酸包含SEQ ID NO：110、111、112、113、114、115、116、117118、119、120、124、125、126、127、129、130、131、134、136、137或138。
具體例160是具體例152之方法，其中該富含鳥嘌呤核苷酸的序列包含一個G-線序列。
具體例161是具體例160之方法，其中該G-線序列包含SEQ ID NO：257或258。
具體例162是具體例160之方法，其中該寡核苷酸包含SEQ ID NO：141、142、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、252或GCGT-Gwire3。
具體例163是具體例152之方法，其中該富含鳥嘌呤核苷酸的序列包含被至少一個核苷酸分隔開的第一複數個鳥嘌呤核苷酸以及第二複數個鳥嘌呤核苷酸。
具體例164是具體例152之方法，其中該寡核苷酸在該富含鳥嘌呤核苷酸的序列與該至少一個CpG模體之間進一步包含一個連接子。
具體例165是具體例164之方法，其中該連接子包含至少三個核苷酸。
具體例166是具體例164之方法，其中該連接子包含一個六乙二醇、三乙二醇、丙二醇或其衍生物。
具體例167是具體例164至166中任一項之方法，其中該寡核苷酸包含2006-PDE5dG4-X1或2006-PDE5dG4-X3。
具體例168是具體例152之方法，其中該至少一個CpG模體是複數個CpG模體。
具體例169是具體例168之方法，其中該複數個CpG模體包含兩個、三個、四個或五個CpG模體。
具體例170是具體例168或169之方法，其中各個CpG模體與其他CpG模體是被至少一個核苷酸或核苷酸類似物分隔開。
具體例171是具體例170之方法，其中該至少一個核苷酸類似物是一至四個胸嘧啶核苷酸。
具體例172是具體例170或171之方法，其中該寡核苷酸包含SEQ ID NO：217、218、219或220。
具體例173是具體例168或169之方法，其中該等CpG模體的每一者與其他CpG模體被一個間隔子分隔開。
具體例174是具體例173之方法，其中該間隔子是一個去氧核醣磷酸酯橋接。
具體例175是具體例174之方法，其中該去氧核醣磷酸酯橋接為無鹼基。
具體例176是具體例174或175之方法，其中該寡核苷酸包含SEQ ID NO：221。
具體例177是具體例173之方法，其中該間隔子包含一個碳鏈。
具體例178是具體例177之方法，其中該碳鏈包含兩個碳原子。
具體例179是具體例177或178之方法，其中該碳鏈是衍生自乙二醇。
具體例180是具體例177至179中任一項之方法，其中該寡核苷酸包含ODN-X2，其中X2為乙二醇。
具體例181是具體例177之方法，其中該碳鏈包含三個碳原子。
具體例182是具體例177或181之方法，其中該碳鏈是衍生自1,3-丙二醇。
具體例183是具體例177、181或182中任一項之方法，其中該核苷酸包含CG-Gw2X2、Gw2X2-2或ODN-X3、CG-Gw2X2-1、CG-Gw2X2-3、CG-Gw2X2-4、CG-Gw2X2-5、CG-G4T16X2-1、CG-G4T16X2-2、CG-G4T16X2-3、CG-G4T16X2-4或CG-G4T16X2-5，其中X2是一個三碳鏈；2006-PDE5dG4-X2，其中X2是一個衍生自丙二醇的三碳鏈；或2006-PDE5dG4-X4，其中X4是一個衍生自丙二醇的三碳鏈。
具體例184是具體例177之方法，其中該碳鏈包含四個碳原子。
具體例185是具體例177或184之方法，其中該碳鏈是衍生自1,4-丁二醇。
具體例186是具體例177、184或185中任一項之方法，其中該寡核苷酸包含ODN-X4，其中X4是一個衍生自1,4-丁二醇的四碳鏈。
具體例187是具體例173之方法，其中該間隔子包含重複化學單元。
具體例188是具體例187之方法，其中該重複化學單元是一個乙二醇。
具體例189是具體例187或188之方法，其中該寡核苷酸包含CCGC-Gw2X1，且其中X1是一個衍生自六乙二醇的間隔子。
具體例190是具體例152至189中任一項之方法，進一步包含至少一個核苷酸類似物。
具體例191是具體例152至190之方法，進一步包含將一個脂質部分附接至該寡核苷酸。
具體例192是具體例191之方法，其中該脂質部分是膽固醇。
具體例193是具體例191或192之方法，其中該脂質部分是在該寡核苷酸的5’端處或鄰近該寡核苷酸的5’端。
具體例194是具體例152之方法，其中該CpG模體包含一個具有至少四個核苷酸的CpG序列要素。
具體例195是具體例194之方法，包含至少兩個CpG序列要素。
具體例196是具體例194或195之方法，包含至少三個CpG序列要素。
具體例197是具體例194至196中任一項之方法，其中該等CpG序列要素為GCGA、GCGG、ACGC、CCGC、GCGT、TCGC或其組合。
具體例198是具體例152之方法，進一步包含將一個三胸嘧啶核苷酸連串序列插入到該寡核苷酸的3’端。
具體例199是具體例198之方法，其中該寡核苷酸包含SEQ ID NO：204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214或215。
具體例200是一種包含SEQ ID NO：252的免疫刺激性寡核苷酸。
具體例201是具體例200之寡核苷酸，進一步包含一個5’膽固醇基修飾。
具體例202是具體例201之寡核苷酸，其中該5’膽固醇基修飾包含一個三乙二醇連接子。
當介紹本揭示內容之要素或其較佳具體例(等)時，冠詞「一(a、an、the)」與「該(said)」意欲表示有一或多個該要素。術語「包含」、「包 括」以及「具有」意欲為含括性且表示除了所列出的要素以外可能有其他要素。
關於上文，應理解達到揭示內容的數個目標以及獲得其他有利結果。
因為可在不偏離揭示內容的範疇的情況下對上文的產物以及方法做出各種變化，期望上面說明含括的所有一切應了解為說明性而不具有限制性涵義。
【序列表】
本申請案含有序列表，序列表已呈ASCII格式電子呈交並且以其全文引用的方式併入。在2018年11月30日產生的該份ASCII抄本被命名為BHC_168028_SL.txt且大小為78,795位元組。
<110> 德商拜耳動物保健有限公司
<120> 免疫刺激性寡核苷酸
<130> BHC 168028
<140>
<141>
<150> EP 17207750.5
<151> 2017-12-15
<150> EP 17207746.3
<151> 2017-12-15
<150> EP 17207740.6
<151> 2017-12-15
<160> 273
<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
<221> 來源
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<211> 35
<212> DNA
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<220>
<221> 來源
<223> 註解="人工序列的說明：合成寡核苷酸"
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<211> 42
<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<221> 來源
<223> /註解="人工序列的說明：合成寡核苷酸"
<400> 209
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的說明：合成寡核苷酸"
<400> 210
<210> 211
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的說明：合成寡核苷酸"
<400> 211
<210> 212
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的說明：合成寡核苷酸"
<400> 212
<210> 213
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的說明：合成寡核苷酸"
<400> 213
<210> 214
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的說明：合成寡核苷酸"
<400> 214
<210> 215
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的說明：合成寡核苷酸"
<400> 215
<210> 216
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的說明：合成寡核苷酸"
<400> 216
<210> 217
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的說明：合成寡核苷酸"
<400> 217
<210> 218
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 註解="人工序列的說明：合成寡核苷酸"
<400> 218
<210> 219
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的說明：合成寡核苷酸"
<400> 219
<210> 220
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的說明：合成寡核苷酸"
<400> 220
<210> 221
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的說明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 經修飾_鹼基
<220>
<221> 經修飾_鹼基
<222> (24)..(24)
<223> 無鹼基位點
<400> 221
<210> 222
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的說明：合成寡核苷酸"
<400> 222
<210> 223
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的說明：合成寡核苷酸"
<400> 223
<210> 224
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的說明：合成寡核苷酸"
<400> 224
<210> 225
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的說明：合成寡核苷酸"
<400> 225
<210> 226
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<212> DNA
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<211> 14
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<223> a、c、t、g、未知或其他
<220>
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<211> 12
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<220>
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<220>
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<211> 14
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<220>
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<211> 6
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<220>
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<220>
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<211> 30
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<223> /註解="人工序列的說明：合成寡核苷酸"
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<211> 18
<212> DNA
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<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的說明：合成寡核苷酸"
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<211> 12
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<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的說明：合成寡核苷酸"
<400> 270
<210> 271
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的說明：合成寡核苷酸"
<400> 271
<210> 272
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的說明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 經修飾_鹼基
<222> (1)..(6)
<223> a,c,t,or g
<220>
<221> 來源
<223> /註解="關於置換的詳細說明以及較佳具體例參見所提申的說明書"
<400> 272
<210> 273
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的說明：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 經修飾_鹼基
<222> (1)..(4)
<223> a、c、t域g
<400> 273

Claims (20)

  1. 一種免疫刺激性寡核苷酸，包含至少一個CpG模體，以及一個始於該寡核苷酸5’端處或在該寡核苷酸5’端的四個核苷酸內的富含鳥嘌呤核苷酸的序列。
  2. 如請求項1之寡核苷酸，其中該富含鳥嘌呤核苷酸的序列包含第一複數個鳥嘌呤核苷酸。
  3. 如請求項2之寡核苷酸，其中該第一複數個鳥嘌呤核苷酸包含三至八個鳥嘌呤核苷酸。
  4. 如請求項3之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含SEQ ID NO：16、17、18、19、20、21、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、77、78、81、82、85、86、89、90、92、93、96、97、100、102、104、106、108、143或252。
  5. 如請求項1至3中任一項之寡核苷酸，其中該富含鳥嘌呤核苷酸的序列包含TTAGGG、TTAGGGTTAGGG(SEQ ID NO：261)、TTTTGGGG、GGGGTTTT、GGGGTTTTGGGG(SEQ ID NO：262)、TTAGGG、TTAGGGTTAGGGTTTT(SEQ ID NO：263)、TGTGGGTGTGTGTGGG(SEQ ID NO：268)、GGAGG、TGGAGGC、TGGAGGCTGGAGGC(SEQ ID NO：264)或TGGGGT(SEQ ID NO：265)。
  6. 如請求項1至3中任一項之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含SEQ ID NO：110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、124、125、126、127、129、130、131、134、136、137或138。
  7. 如前面請求項中任一項之寡核苷酸，在該第一複數個鳥嘌呤核苷酸與該至少一個CpG模體之間進一步包含第二複數個鳥嘌呤核苷酸。
  8. 如請求項2至7中任一項之寡核苷酸，其中該第一複數個寡核苷酸、第二複數個寡核苷酸或兩者包含一個G-四聯體序列。
  9. 如請求項7之寡核苷酸，其中該第一與第二複數個鳥嘌呤核苷酸包含一個G-線序列。
  10. 一種用於預防或治療傳染病的疫苗，包含如前面請求項中任一項之寡核苷酸。
  11. 一種載體，包含如前面請求項中任一項之寡核苷酸。
  12. 一種免疫刺激性組成物，包含如前面請求項中任一項之寡核苷酸。
  13. 如請求項12之免疫刺激性組成物，進一步包含醫藥上可接受載劑。
  14. 如請求項13之免疫刺激性組成物，其中該寡核苷酸與該載劑連結。
  15. 一種如請求項1之免疫刺激性組成物的用途，其用於製備用以刺激類鐸受體21(TLR21)的藥劑，包含：a.向有需要的個體投與免疫刺激性寡核苷酸，該免疫刺激性寡核苷酸具有至少一個CpG模體，以及一個始於該寡核苷酸5’端處或在該寡核苷酸5’端的四個核苷酸內的富含鳥嘌呤核苷酸的序列，該富含鳥嘌呤核苷酸的序列包含第一複數個鳥嘌呤核苷酸。
  16. 如請求項15之用途，其中該寡核苷酸包含SEQ ID NO：110、111、112、113、114、115、116、117118、119、120、124、125、126、127、129、130、131、134、136、137或138。
  17. 如請求項16之用途，其中該寡核苷酸進一步包含一個G-線序列。
  18. 如請求項17之用途，其中該寡核苷酸包含SEQ ID NO：141、142、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、252或GCGT-Gwire3。
  19. 一種如請求項1之免疫刺激性組成物的用途，其用於製備用以增加TLR21刺激活性的藥劑，其中該免疫刺激性組成物包含一個寡核苷酸，該寡核苷酸具有至少一個CpG模體，包含將寡核苷酸的5’端融合至該富含鳥嘌呤核苷酸的序列。
  20. 一種如請求項1之免疫刺激性組成物的用途，用於製備用以在個體體內引起免疫反應的藥劑，包含：a.向有需要的個體投與包含一寡核苷酸的免疫刺激性組成物，該寡核苷酸具有至少一個CpG二核苷酸模體，以及一個始於該寡核苷酸5’端處或在該寡核苷酸5’端的四個核苷酸內的富含鳥嘌呤核苷酸的序列。
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