TW201813509A - 二元殺蟲ｃｒｙ毒素 - Google Patents

Abstract

本發明涉及新類別的殺蟲活性蛋白以及編碼這些蛋白的聚核苷酸序列。更具體而言，約12-24kDa及約12-14kDa的殺蟲蛋白係使用來防治玉米根蟲。本發明包含用於防治西方玉米根蟲與其他鞘翅目昆蟲之方法及基因轉殖植物。

Description

二元殺蟲CRY毒素 相關申請案之交叉引用

本申請案主張於2016年9月30日提出申請之美國第62/402,316號臨時申請案之優先權與權益。所述申請案的整個內容係以引用方式特此併入此申請案中。

序列鑑定列表的併入

序列表之正式文本係以2017年8月30日所建立之檔案名稱為「77990-US-NP_20170920_20170920Seq_ST25.txt」且大小為83.8千位元組之ASCII格式序列表形式、以電子方式經由電子申請系統(EFS-Web)提交，且其係與本說明書同時提出。該ASCII格式文件中所包含的序列表係為本說明書的一部分，且以全文引用的方式併入本文中。

本發明大體上係有關應用於農業科學的分子生物學領域。更特定言之，某些實施例係涉及使用DNA節段做為用於生產蛋白質的診斷探針與模板之方法，以及用於昆蟲防治及各種免疫與診斷應用中之蛋白質、融合蛋白載體與肽的用途。本發明亦揭示製造及使用核酸節段於研發含有本文所揭示之DNA節段之基因轉殖植物細胞中的植物嵌入型保護劑之方法。

每年有數十億美元花費在防治造成農業麻煩的害蟲之上。這些害蟲造成的損害每年另外損失數十億。合成的有機化學殺蟲劑已經成為用於防治害蟲的主要工具，但是生物殺蟲劑(諸如衍生自蘇雲金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis(B.t.)的殺蟲蛋白)已經在一些地區扮演重要作用。藉由用B.t.殺蟲蛋白基因對植物細胞進行基因轉形來產生昆蟲抗性植物的能力 係已改革了現代農業，並且提高了殺蟲蛋白及其基因的重要性與價值。

B.t.是一種革蘭氏陽性細菌，其產生被稱為結晶蛋白(經常被稱為Cry蛋白或Cry毒素)的內毒素，其選擇性地對某些昆蟲目、昆蟲屬與昆蟲種具有毒性。許多種不同菌株的B.t.已展現出能產生殺蟲Cry蛋白。包含有能產生殺蟲Cry蛋白的B.t.菌株組合物已可以購得，並且已用作環境可接受的殺蟲劑。

多數殺蟲的B.t.菌株具有抗鱗翅目昆蟲(即毛蟲)的活性。另一些B.t.菌株具有抗雙翅目昆蟲(即蠅和蚊)的殺蟲活性，或者具有抗鱗翅類和雙翅類二種昆蟲的活性。最近幾年，還報導了幾種B.t.菌株能產生對鞘翅目昆蟲(即甲蟲，諸如玉米根蟲)有毒的結晶蛋白。這類當前利用的毒性蛋白包括Cry3Bb1(一種經修飾的Cry3A)、eCry3.1Ab和二元毒素Cry34Ab1/Cry35Ab1(需要針對毒性活性的兩種不同的蛋白質)。這些蛋白質有效用於控制侵害玉米根的葉甲(Diabrotica)屬，不論是單一利用還是呈不同組合以降低發展抗性的可能性。雖然這些蛋白質已成功地在基因轉殖作物中被利用為昆蟲控制劑，但是可能發展出對其作用的抗性。

先前這些Cry蛋白的分類係基於其標的昆蟲的類型。目前使用的命名法是基於胺基酸序列同源性而系統地分類Cry基因，而非基於昆蟲特異性(Crickmore,N.et al.Microbiol.and Mol.Bio.Rev.(1998)Vol.62：807-813；http：//www.btnomenclature.info/)。

對於鞘翅目與雙翅目昆蟲具有活性之30-kDa毒素蛋白之基因的選殖及表徵係已經被描述(Intl.Pat.Appl.Pub.No.WO 95/02693,1995)。這個分離自B.t.PS201T6的基因係編碼一個29,906Da的蛋白質，其展現出與蘇雲金芽孢桿菌亞種伊氏拉林斯(B.t.var.israelensis)之CytA毒素有64%的序列一致性。

許多B.t.蛋白已被使用為併入植物的保護劑以產生具昆蟲抗性的基因轉殖植物，所述植物迄今係已成功註冊、撤銷管制與商業化。殺蟲蛋 白系統係已在B.t.中發現到，並揭露於WO 97/40162專利案中。此系統包括兩種蛋白，其中一種蛋白約為14-15kDa，而另一種蛋白約為44-45kDa。參見美國專利案第6,083,499及6,127,180號。這些蛋白分別被分配為Cry34及Cry35的Cry名稱。其它相關的二元蛋白毒素系統係已被揭露。參見美國專利案第6,372,480號；WO 01/14417專利案；及WO 00/66742專利案。編碼這類蛋白的植物最佳化基因(其中所述基因係經工程化以使用在植物中有最佳表現的密碼子)亦已被揭露。參見美國專利案第6,218,188號。

在美國每年有超過1千萬英畝的玉米被感染玉米根蟲種群。所述玉米根蟲種群包含北方玉米根蟲(Diabrotica barberi)、南方玉米根蟲(D.undecimpunctata howardi)及西方玉米根蟲(D.virgifera virgifera)。其它物種包含Diabrotica virgifera zeae(墨西哥玉米根蟲)、Diabrotica balteata(巴西玉米根蟲)。巴西玉米根蟲種群包含Diabrotica viridula及Diabrotica speciosa。

西方玉米根蟲(WCR,Diabrotica virgifera virgifera LeConte)在整個美國玉米地帶是一個主要的玉米蟲害。由於對化學農藥與表現B.t.Cry毒素之基因轉殖植物的抗性產生，WCR的防治已成為一個重大的挑戰。WCR已對Cry3Aa及Cry3Bb產生顯著的抗性，但對於市場中出色的二元蛋白質對Cry34/35則無。然而，由於WCR Cry3抗性族群的出現，Cry34/35性狀的選擇壓力不斷增長。

對所利用的毒素(無論是化學品還是蛋白質)的抗性更可能在增強抗性發展的多種情況下產生。一般來說，抗性的產生直接依賴於毒素被利用至環境中的時間長度。抗性產生還更可能在毒素的劑量不足以確保消耗含有所述毒素的組織的單次叮咬的害蟲的死亡率的情況下增加。因此，關鍵的是在每次叮咬遞送致死劑量的毒素；否則，更可能發展出對特定毒素的抗性。在共同地理區域內或在對共同地理區域內的相同或類似害蟲敏感的多種植物物種之上或之中重複使用同一毒素更可能引起對所述毒 素的抗性的快速發展，特別是在在單個生長季節之內有多個世代的特定目標害蟲的氣候中。出於所有的上述原因，對有限數目的毒性蛋白或毒性化學品的依賴可導致發展出對這些害蟲控制劑的抗性。

本領域中所揭露之聲稱對玉米根蟲有毒性作用之其他蛋白質包含patatin、TIC100/101二元毒素、ET33/34二元毒素、TIC863、ET80/76二元毒素、ET70、Cry3Bb(美國專利第6,501,009號)、CrylC變體、Cry3A變體、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、Axmil84、Axmi205、AxmiRl、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC3131、DIG-10、eHIPs(美國專利申請案公開第2010/0017914號)、及ω-Hex atoxin-Hv la(美國專利申請案公開第US2014-0366227 A1號)。這些蛋白在後續商業實施例中係可單獨提供或與其它毒劑一起提供，以確保根蟲產品的耐久性，並減少抗性產生的可能性。

儘管發現許多來自B.t.的選擇性蛋白毒素，但仍有迫切的需求去發現新的且有效的害蟲防治劑，以為農夫提供經濟上的利益，能夠緩發或預防具抗性的昆蟲產生，並為環境可接受的。特別需要針對用來防治廣泛範圍的經濟重要蟲害的試劑以有效防治會對(或可能會對)現有昆蟲防治劑產生抗性的昆蟲族群，以及那些與當前利用的殺蟲蛋白毒素相比具有相同或更高效力的試劑。

本發明係部分涉及用於防治鞘翅目害蟲之材料及方法。在具體實施例中，本文所述之材料及方法係用於防治玉米根蟲種。能產生這些蛋白毒素的植物係包含在本發明的範圍內。

本發明係提供新穎的B.t.殺蟲蛋白二元毒素，其於結合施予鞘翅目害蟲時係致命的或阻礙發育的。這些二元毒素係由一增效蛋白及一毒素蛋白所組成。如於(78559 US Prov Appl 62/319428,filed Apr 7,2016)中所述，某些毒素蛋白於單獨施用時係具有致命或半致死特性。然而，以二元 形式(例如與增效蛋白結合)施用時，本文中所述的全部毒素蛋白實質上更有毒性。

本發明包含這些二元毒素的同源物、N-端缺失體與延伸體、衍生物、類似物及突變體形式，編碼所請求保護之二元毒素的植物密碼子最佳化核酸序列，以及用於製造與使用所述二元毒素及選擇性地結合所述二元毒素的抗體之方法。

本發明包含了編碼所述殺蟲毒素中之任一者的聚核苷酸、編碼該毒素全長之於結合使用時係帶有殺蟲活性之部分或片段的聚核苷酸、以及編碼這兩種類型毒素的聚核苷酸序列。這些二元毒素針對鞘翅目害蟲(諸如玉米根蟲，特別是WCR)是有活性的。

在特定的實施例中，本發明係涉及分離的DNA節段以及併入了編碼所請求保護之二元毒素的重組載體。更特定言之，所述DNA節段係包括一個編碼包含了序列辨識編號(SEQ ID NO)：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、63、66、68、71、74、76、78、80、82、84、86、88、91、93、95、97、99、101、103及105的胺基酸序列內的至少十個連續胺基酸序列之蛋白或肽種類的核酸序列。

同樣地，包括有經分離或純化的蛋白編碼基因之DNA節段係指DNA節段可在編碼肽的序列之外，包含某些其他元件，諸如調節序列、基本上分離自其他天然發生的基因或蛋白編碼序列。在這方面，術語「基因」係為了簡單起見而用以提及一功能性蛋白-多肽-或肽-編碼單元。如該項技藝者將能理解的，此功能性術語不僅包含基因組序列(包含染色體外的DNA序列)，也包含操作子序列或表現(或經調適而表現)蛋白、多肽或肽之工程化基因節段。

於一較佳實施例中，本發明係涉及以本發明之至少一聚核苷酸序列轉形的植物細胞，使得經轉形的植物細胞在所述目標害蟲所吃的組織中表現殺蟲毒素。

替代性地，本發明之B.t.分離株，或本文中所述之表現毒素的重組微生物，係可用來防治害蟲。在這點上，本發明包含實質上完整的B.t.細胞的處理，或含有本發明所表現之毒素的重組細胞，其係經處理以於所述實質上完整的細胞施用於具有目標害蟲的環境時能延長其殺蟲活性。經處理過的細胞係做為所述殺蟲毒素的保護性塗蓋。

本發明之毒素係為口服毒物，其於目標昆蟲攝入後影響昆蟲中腸細胞的正常功能。暴露於這些二元毒素、施用這些二元毒素或以這些二元毒素處理昆蟲係表示所述二元毒素最常藉由吃下含有這類二元毒素的食物而進入昆蟲的消化系統。因此，藉由吃入所述二元毒素(呈任何形式或較佳地呈現為表現有這些毒素之重組植物細胞者)，所述目標昆蟲係暴露於或接觸本發明之蛋白毒素。這樣接觸二元毒素或暴露於二元毒素導致了目標昆蟲死亡、發育阻礙或嚴重傷害。

本發明亦涉及一種防治鞘翅目害蟲的方法，其包括使所述鞘翅目害蟲的腸道暴露於一增效蛋白與毒素蛋白之有效組合。本發明亦涉及一種用於表現二元毒素之核酸構築體，所述二元毒素包括有一個非蘇雲金芽孢桿菌所原有的基因調節結構以及一或多種編碼二元毒素的DNA節段。本發明進一步請求保護包括有一編碼二元毒素之核酸序列的基因轉殖植物、植物部分或種子，以及包括有經調配之二元毒素的組成物。所請求保護的尚有一種用於產生具鞘翅目耐受性的植物之方法，其包括將一非基因轉殖植物與一包括有外來DNA構築體之基因轉殖植物進行育種，所述外來DNA構築體能夠表現二元毒素，穩定併入到所述鞘翅目耐受性的植物之基因組中，並藉由分析來自該基因轉殖植物之外來DNA構築體的至少一部分來篩選子代。

圖1：用於在B.t.中共同表現之IRDIG27501與IRDIG27642的連接與方向。

序列簡述

SEQ ID NO：1為編碼IRDIG27501增效蛋白的B.t.DNA序列；357 nt。

SEQ ID NO：2為所述B.t.IRDIG27501蛋白序列，118 aa。

SEQ ID NO：3為編碼IRDIG27642的B.t.DNA序列；555 nt。

SEQ ID NO：4為所述IRDIG27642的B.t.蛋白序列；184 aa。

SEQ ID NO：5為編碼IRDIG28672的B.t.DNA序列；555 nt。

SEQ ID NO：6為所述IRDIG28672的B.t.蛋白序列；184 aa。

SEQ ID NO：7為編碼IRDIG28674的B.t.DNA序列；555 nt。

SEQ ID NO：8為所述IRDIG28674的B.t.蛋白序列；184 aa。

SEQ ID NO：9為編碼IRDIG28676的B.t.DNA序列；624 nt。

SEQ ID NO：10為所述IRDIG28676的B.t.蛋白序列；207 aa。

SEQ ID NO：11為編碼IRDIG28680的B.t.DNA序列；333 nt。

SEQ ID NO：12為所述IRDIG28680的B.t.蛋白序列；110 aa。

SEQ ID NO：13為編碼IRDIG28682的B.t.DNA序列；564 nt。

SEQ ID NO：14為所述IRDIG28682的B.t.蛋白序列；187 aa。

SEQ ID NO：15為編碼IRDIG28684的B.t.DNA序列；564 nt。

SEQ ID NO：16為所述IRDIG28684的B.t.蛋白序列；187 aa。

SEQ ID NO：17為編碼IRDIG28686的B.t.DNA序列；564 nt。

SEQ ID NO：18為所述IRDIG28686的B.t.蛋白序列；187 aa。

SEQ ID NO：19為編碼IRDIG28688的B.t.DNA序列；570 nt。

SEQ ID NO：20為所述IRDIG28688的B.t.蛋白序列；189 aa。

SEQ ID NO：21為編碼IRDIG28690的B.t.DNA序列；570 nt。

SEQ ID NO：22為所述IRDIG28690的B.t.蛋白序列；189 aa。

SEQ ID NO：23為編碼IRDIG28692的B.t.DNA序列；579 nt。

SEQ ID NO：24為所述IRDIG28692的B.t.蛋白序列；192 aa。

SEQ ID NO：25為編碼IRDIG28694的B.t.DNA序列；366 nt。

SEQ ID NO：26為所述IRDIG28694的B.t.蛋白序列；121 aa。

SEQ ID NO：27至60為用以擴增上列部分的殺蟲蛋白的引子。

SEQ ID NO：61為使用玉米高GC(ZmHGC)策略進行最佳化之IRDIG27501 DNA密碼子；357 nt。

SEQ ID NO：62為使用玉米最高GC(ZmHGC)策略進行最佳化之IRDIG27501 DNA密碼子；357 nt。

SEQ ID NO：63IRDIG27501蛋白；其係來自使用所述玉米高GC(ZmHGC)策略(SEQ ID NO：61-62之蛋白)之密碼子最佳化的DNA序列；118 aa。

SEQ ID NO：64為融合至IRDIG27501 Zm最高GC的TraP4；570 nt。

SEQ ID NO：65為融合至IRDIG27501 ZmHGC的TraP4；570 nt。

SEQ ID NO：66為融合至IRDIG27501 Zm最高GC蛋白(SEQ ID NO：64-65之蛋白)的TraP4；189 aa。

SEQ ID NO：67為IRDIG27501 ZmHGC之TraP8；555 nt。

SEQ ID NO：68為IRDIG27501 ZmHGC蛋白之TraP8；184 aa。

SEQ ID NO：69為使用ZmHGC策略進行最佳化之IRDIG27642 DNA密碼子；555 nt。

SEQ ID NO：70為使用Zm最高GC策略進行最佳化之IRDIG27642 DNA密碼子；555 nt。

SEQ ID NO：71為來自IRDIG27642的蛋白序列；(SEQ ID NO：69-70之蛋白)；184 aa。

SEQ ID NO：72為融合至IRDIG27642 Zm最高GC之DNA密碼子最佳化的TraP8；753 nt。

SEQ ID NO：73為融合至IRDIG27642 Zm高GC之DNA密碼子最佳化的TraP8；753 nt。

SEQ ID NO：74為融合至IRDIG27642(SEQ ID NO：72-73之蛋白)之來自TraP8的蛋白序列；250 aa。

SEQ ID NO：75為融合至IRDIG27642 ZmHGC之DNA密碼子最佳化的TraP4；768 nt。

SEQ ID NO：76為融合至IRDIG27642之來自TraP4的蛋白序列；255 aa。

SEQ ID NO：77為與一個2A序列融合之IRDIG27501.2與IRDIG27642.2；981 nt。

SEQ ID NO：78為所述與一個2A序列融合之IRDIG27501.2與IRDIG27642.2的蛋白序列；326 aa。

SEQ ID NO：79為與一個2A序列融合之IRDIG27642.2與IRDIG27501.2；981 nt。

SEQ ID NO：80為所述與一個2A序列融合之IRDIG27642.2與IRDIG27501.2的蛋白序列；326 aa。

SEQ ID NO：81為IRDIG27642.1的一個截斷的B.t.DNA；324 nt。

SEQ ID NO：82為IRDIG27642.1的一個截斷的B.t.蛋白；107 aa。

SEQ ID NO：83為來自IRDIG27501的一個截斷的B.t.DNA序列；297 nt。

SEQ ID NO：84為來自IRDIG27501的一個截斷的B.t.蛋白序列；98 aa。

SEQ ID NO：85為來自IRDIG28674的一個截斷的B.t.DNA序列；324 nt。

SEQ ID NO：86為來自IRDIG28674的一個截斷的B.t.蛋白序列；107 aa。

SEQ ID NO：87為來自IRDIG28680的一個截斷的B.t.DNA序 列；327 nt。

SEQ ID NO：88為來自IRDIG28680的一個截斷的B.t.蛋白序列。

SEQ ID NO：89為來自IRDIG28682的一個截斷的B.t.DNA序列；333 nt。

SEQ ID NO：90為來自IRDIG28688的一個截斷的B.t.DNA序列；333 nt。

SEQ ID NO：91為來自IRDIG28682與IRDIG28688的一個截斷的B.t.蛋白序列；110 aa。

SEQ ID NO：92為來自IRDIG28684的一個截斷的B.t.DNA序列；333 nt。

SEQ ID NO：93為來自IRDIG28684的一個截斷的B.t.蛋白序列；110 aa。

SEQ ID NO：94為來自IRDIG28686的一個截斷的B.t.DNA序列；333 nt。

SEQ ID NO：95為來自IRDIG28686的一個截斷的B.t.蛋白序列；110 aa。

SEQ ID NO：96為來自IRDIG28672的一個截斷的B.t.DNA序列；324 nt。

SEQ ID NO：97為來自IRDIG28672的一個截斷的B.t.蛋白序列；108 aa。

SEQ ID NO：98為來自IRDIG28676的一個截斷的B.t.DNA序列；342 nt。

SEQ ID NO：99為來自IRDIG28676的一個截斷的B.t.蛋白序列；113 aa。

SEQ ID NO：100為來自IRDIG28690的一個截斷的B.t.DNA序列；333 nt。

SEQ ID NO：101為來自IRDIG28690的一個截斷的B.t.蛋白序列；110 aa。

SEQ ID NO：102為來自IRDIG28692的一個截斷的B.t.DNA序列；348 nt。

SEQ ID NO：103為來自IRDIG28692的一個截斷的B.t.蛋白序列；115 aa。

SEQ ID NO：104為來自IRDIG28694的一個截斷的B.t.DNA序列；273 nt。

SEQ ID NO：105為來自IRDIG28694的一個截斷的B.t.蛋白序列；90 aa。

以下的詞語及片語係具有如下列舉的意義。除非特別指示，否則如本文所用之術語「一(a)」、「一個(an)」及「該」係表示「至少一個/種」。

「殺蟲蛋白」(亦可稱做為「毒素蛋白」)係如SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、63、66、68、71、74、76、78、80、82、84、86、88、91、93、95、97、99、101、103、105所定義，且蛋白毒素係具有至少70%的序列相同於前述包含衍生物、類似物與突變體形式中之任一者。更佳的殺蟲蛋白群組為由SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、63、66、68、71、74、76、78、80、82、84、86、88、91、93、95、97、99、101、103、105所組成，且蛋白毒素具有至少80%的序列相同於前述序列中之任一者。另一個較佳的殺蟲蛋白群組為由SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、63、66、68、71、74、76、78、80、82、84、86、88、91、93、95、97、99、101、103、105所組成，且蛋白毒素具有至少90%的序列相同於前述序列中之任一者。另一個較佳的殺蟲蛋白群組為由SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、63、66、68、71、74、76、78、80、82、84、86、88、91、93、95、97、99、101、103、105所組成，且蛋白毒素具有至少95%的序列相同於前述序列中之任一者。另一個較佳的殺蟲蛋白群組為由SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、63、66、68、71、74、76、78、80、82、84、86、88、91、93、95、97、99、101、103、105所組成，且蛋白毒素具有至少99%的序列相同於前述序列中之任一者。最佳的殺蟲蛋白群組為由SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、63、66、68、71、74、76、78、80、82、84、86、88、91、93、95、97、99、101、103、105所組成。

「增效蛋白」係如SEQ ID NO：2或任何包括有SEQ ID NO：2之功能性胺基酸序列所定義。「增效蛋白」更包含任何具有至少70%的序列相同於SEQ ID NO：2之功能性胺基酸序列。更佳的增效蛋白群組係由任何具有至少80%的序列相同於SEQ ID NO：2之功能性胺基酸序列所組成。另一較佳的增效蛋白群組係由任何具有至少90%的序列相同於SEQ ID NO：2之功能性胺基酸序列所組成。另一較佳的增效蛋白群組係由任何具有至少95%的序列相同於SEQ ID NO：2之功能性胺基酸序列所組成。另一較佳的增效蛋白群組係由任何具有至少99%的序列相同於SEQ ID NO：2之功能性胺基酸序列所組成。最佳的增效蛋白為SEQ ID NO：2。

「DNA節段」係指經分離之不含特定物種的全基因組DNA之DNA分子。因此，編碼蛋白或肽的DNA區段係指，含有已從獲得該DNA區段的物種的全基因組DNA中分離出或純化出之蛋白編碼序列的DNA區段，在本發明的情況下，其為革蘭氏陽性菌屬之芽孢桿菌屬(特別是被稱為B.t.的物種)之基因組。包括在術語「DNA區段」中的有DNA區段和這種區段的小片段，還有重組載體，包含(例如)質體、黏質體、噬菌粒、噬菌體、病毒等。

「實質上與其它編碼序列分離」意指所研究的基因構成了該DNA區段編碼區的重要部分，在此，該基因係為編碼細菌殺蟲蛋白的基因，此術語還意指該DNA區段不包含大部分天然存在的編碼DNA，諸如大染色體片段或者其它的功能性基因或操縱子編碼區。當然，這指的是原本已被分離的DNA區段，且不排除通過人工後來加入此區段的基因、重組基因、合成連接子或編碼區。

「表現」的定義為細胞內過程的組合，包含藉由一個編碼DNA分子(諸如結構基因)以產生多肽所經歷的轉錄和翻譯過程。

藉由術語「遺傳物質」的使用，其意指包含所有的基因、核酸、DNA及RNA。術語「dsRNA」係指雙股RNA。對於聚核苷酸、DNA、RNA、寡核苷酸及引子之核苷酸殘基的名稱及對於蛋白質之胺基酸殘基的名稱，在本文中通篇採用標準IUPAC縮寫。核酸序列係以標準的5'至3'方向呈現，且蛋白質序列係以標準的胺基(N)端至羧基(C)端方向呈現。

啟動子：DNA序列或DNA序列組上的一種識別位置，其對結構基因提供了一個表現控制元件，且RNA聚合酶係特異性地與其結合，而啟動該基因的RNA合成(轉錄)。

再生：從植物細胞(例如，植物原生質體或外植體)培植一可孕性植物的過程。

結構基因：一種經表現而產生多肽的基因。

轉形：將外源性DNA序列(例如載體、重組DNA分子)導入細胞或原生質體的過程，在此過程中，外源性DNA係併入染色體內，或者能夠自主複製。

轉形細胞：一種已藉由導入外源性DNA分子至細胞內而使其基因組改變的細胞。

基因轉殖細胞：由轉形細胞衍生或再生、或者是衍生自轉形細 胞之任何一種細胞。例示性基因轉殖細胞包含衍生自轉形植物細胞的植物愈合組織，以及從基因轉殖植物獲得的特定細胞，諸如葉、根、莖(例如，體細胞)、或生殖細胞等。

基因轉殖植物：衍生自轉形植物細胞或原生質體之植物或其後代，在該植物的DNA中係含有於天然的且非基因轉殖之相同植株中原來不存在的被導入的外源性DNA分子。術語「基因轉殖植物」及「轉形植物」在本領域中有時被當成同義詞使用，以定義其DNA中含有外源性DNA分子的植物。然而，更科學地修正應將從轉形植物細胞或原生質體獲得的再生植物或愈合組織稱作為基因轉殖植物，此後將照此使用。

載體：能夠在宿主細胞中複製之DNA分子，且/或另一DNA區段可與其有效地連接，以致使被連接的區段能夠複製。質體為一種例示性的載體。

亦應理解到，胺基酸或核酸序列可包含附加的殘基，諸如附加的N-端或C-端胺基酸，或者5'或3'序列，但基本上仍如本文中所揭示的序列之一，只要該序列滿足上面列舉的標準，包含在涉及蛋白質表現時，保持蛋白質的生物活性。附加末端序列的情況特別適合於核酸序列，例如其可包含在編碼區的5'或3'部分側翼的各種非編碼序列，或可包含已知存在於基因中的各種內部序列(即內含子)。

不論編碼序列本身的長度，本發明的核酸節段係可與其它DNA序列組合(諸如啟動子、聚腺苷酸化信息、額外的限制性酶切位、多重選殖位點、其它的編碼節段等)，使得其總長度可以顯著改變。因此可設想到，幾乎任何長度的核酸片段都可使用，且其總長度最好限制在易於在預期的重組DNA實驗方案中製備與使用之範圍內。例如，可製備包含了一段短而緊連的核酸片段，而此片段係編碼SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、63、66、68、71、74、76、78、80、82、84、86、88、91、93、95、97、99、101、103、105中所揭露的整個或部 分的肽序列，或者與編碼SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、63、66、68、71、74、76、78、80、82、84、86、88、91、93、95、97、99、101、103、105中所揭露的肽之DNA序列相同或互補，尤其是揭露於SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、61、62、64、65、67、69、70、72、73、75、77、79、81、83、85、87、89、90、92、94、96、98、100、102及104中的DNA節段。例如，還可設想到如下各種長度的DNA序列都是有用的，諸如：約14個核苷酸的DNA序列，以及多達約10,000、約5,000、約3,000、約2,000、約1,000、約500、約200、約100、約50與約14個鹼基對長度(包括全部中等長度)的DNA序列。

應該容易理解的是，「中等長度」就此而言係意指所標示範圍之間的任何長度，諸如14、15、16、17、18、19、20等等；21、22、23等等，30、31、32等等，50、51、52、53等等，100、101、102、103等等，150、151、152、153等等，包含從200-500，500-1,000，1,000-2,000，2,000-3,000，3,000-5,000的全部整數，以及多達並包含約10,000個核苷酸的序列等等。

還應理解到，本發明並不侷限於編碼本發明的肽之特定核酸序列，或者是編碼SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、63、66、68、71、74、76、78、80、82、84、86、88、91、93、95、97、99、101、103、105胺基酸序列的特定核酸序列，包含在SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、61、62、64、65、67、69、70、72、73、75、77、79、81、83、85、87、89、90、92、94、96、98、100、102及104中特別揭露的DNA序列。重組載體及經分離的DNA節可因此廣泛地包含該等編碼肽的區域本身，在基礎編碼區域內帶有經選擇的改變或修飾之編碼區域，或者其雖然包括這些編碼肽的區域但還可編碼較大的多肽，或者可編碼具有變異胺基酸序列之生物功能等效的 蛋白質或肽。

所述編碼殺蟲蛋白的基因係編碼具有如表1所示胺基酸序列與大小之殺蟲蛋白。

本發明的DNA節段涵蓋生物功能性等效的肽。這類序列可能由於密碼子冗餘及功能等效性的結果而產生，已知在核酸序列及這樣編碼的蛋白質中天然存在這種特性。另一方面，功能等效的蛋白質或肽可經由應用重組DNA技術而建立，其中，基於被交換的胺基酸特性的考量，可設計改變蛋白質的結構。可通過應用定點誘變技術導入人工設計的改變，例如，以改進蛋白質的抗原性或檢測突變體，以便在分子層級檢驗活性。帶有所例示殺蟲活性的片段與等效物係落入本發明的範圍內。在本領域中受 過訓練的人員的技能中，產生這些編碼相同或大致相同之毒素的替代DNA序列是綽綽有餘的。這些變異的DNA序列係落入本發明的範圍內。如本文所用，提及之「大致相同」的序列係指具有胺基酸取代、缺失、增加或插入之序列，其實質上不影響殺蟲活性。帶有殺蟲活性之片段係亦包含於此一定義內。

重組載體構成本發明的其他態樣。預期特別有用的載體為，那些在其中不論是編碼全長蛋白質或者是較小的肽之DNA節段編碼部分係處於啟動子的控制之下的載體。這種啟動子係可為與編碼本發明的肽之基因自然結合的形式，因為其可藉由分離位於編碼節段或外顯子上游的5'非編碼序列而獲得，例如使用與本文所揭露組成物有關之重組選殖技術及/或PCR技術。

除了引導本發明之殺蟲蛋白或肽的表現之用途以外，本文中所設想的核酸序列亦具有多種其它用處。例如，其在核酸雜交實施例中還可以用作探針或引子。由此可設想到，包括由至少14個核苷酸長的連續序列所組成序列區域之核酸節段將會有特別的用途，其中的連續序列係與SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、61、62、64、65、67、69、70、72、73、75、77、79、81、83、85、87、89、90、92、94、96、98、100、102及104中的一個14個核苷酸長的連續DNA節段有相同的序列或與其互補。更長之連續且相同或互補的序列，例如，約20、30、40、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000等的序列(包含所有居間長度並且達到和包含全長序列的那些序列)也將會在某些實施例中是有用的。

這類核酸探針與編碼蛋白的序列之特異性雜交的能力將使其能夠使用於檢測一給定樣本中之互補序列的存在。然而，還可設想到其它的用途，包含將該序列資訊使用於製備突變種的引子，或用於製備其它遺傳構築體的引子。

具有由與SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、61、62、64、65、67、69、70、72、73、75、77、79、81、83、85、87、89、90、92、94、96、98、100、102或104之DNA序列相同或互補之約10-14、15-20、30、50、或甚至100-200個核苷酸之連續核苷酸片段所組成之序列區域的核酸分子係被特別設想為使用在(例如)南方或北方點墨法中的雜交探針。一般係發現將較小的片段用在雜交實施例中，其中該連續互補區域的長度可以改變，諸如在約10-14到約100或200個核苷酸之間，但依據所要檢測的互補序列長度也可以使用較長的連續互補片段。

使用長度約14個核苷酸的雜交探針係使得可形成既穩定又具選擇性的雙螺旋分子。但是，為了增加雜交的穩定性和選擇性，並因此改進所得的特異性雜交分子的品質和數量，通常最好是具有長度多於14個鹼基之較長一段緊連互補序列的分子。一般係偏好設計具有一段15至20個相連核苷酸之基因互補序列的核酸分子，或者需要時甚至可以更長些。

當然，還可以通過其它技術獲得這些片段，諸如(例如)通過機械剪切或限制性酶裂解。小核酸節段或片段係易於製備，可借助於(例如)用化學方法直接合成此片段，通常是用自動化的寡核苷酸合成儀來實現。還可以通過如下手段獲得這些片段：通過應用諸如美國專利第4,683,195及4,683,202號之PCR^TM技術(其每一者係以引用方式併入本文中)，通過將選擇的序列導入重組載體來重組產生，以及通過分子生物學領域的技術人員通常熟知的其它重組DNA技術。

因此，本發明之核苷酸序列可因其能與DNA片段的互補片段選擇性地形成雙螺旋分子之能力而被使用。本發明之毒素與基因係可藉由使用寡核苷酸探針而鑑別與取得，例如，這些探針為可偵測得到的核苷酸序列。所述探針(及本發明之聚核苷酸)係可為DNA、RNA或PNA(肽核酸)。這些序列可藉由一適當標記或可使其自帶螢光而偵測到，如國際專 利申請案第WO93/16094號所述。取決於預期的應用，將期望能採用不同的雜交條件來達到探針對目標序列不同程度的選擇性。一般而言，嚴格條件應為在pH 7.0至pH 8.3下之小於約1.5M鈉離子的鹽濃度，通常約0.01至1.0M鈉離子濃度(或其他鹽)、且對於短探針(例如10至50個核苷酸)之溫度至少約30℃，對於長探針(例如大於50個核苷酸)之溫度至少約60℃。嚴格條件亦可藉由添加去穩定化劑(諸如甲醯胺)來實現。例示性的低嚴格性條件包含在37℃下以含有30%至35%甲醯胺、1M NaCl、1% SDS(十二烷基硫酸鈉)之緩衝溶液雜交，並在50℃至55℃下以1X至2X SSC(20X SSC=3.0M NaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中洗滌。例示性的中度嚴格性條件包含於37℃在40%至45%甲醯胺、1.0M NaCl、1% SDS中雜交，並於55℃至60℃在0.5X至1X SSC中洗滌。例示性的高嚴格性條件包含於37℃在50%甲醯胺、1M NaCl、1% SDS中雜交，並於60℃至65℃在0.1X SSC中洗滌。視情況，洗滌緩衝液可包括約0.1%至約1%的SDS。雜交持續時間一般小於約24小時，通常約4至約12小時。這類選擇性條件只允許在探針與模板或目標單鏈之間有很少的錯配，並且特別適合用於分離編碼結晶蛋白的DNA序列。經由雜交檢測DNA節段是本領域技術人員熟知的，而美國專利第4,965,188及5,176,995號的教示係為雜交分析的例示性方法。

特異性通常與雜交後的洗滌相關，關鍵因素為最終洗滌溶液之離子強度及溫度。對於DNA/DNA雜交，熱熔點(T_m)為50%之互補目標序列與完全匹配之探針雜交的溫度(在經定義的離子強度及pH下)。每1%錯配，T_m減小約1℃；因此，可調整T_m、雜交條件，及/或洗滌條件以促進具有所需一致性之序列黏接。例如，若尋求具有>90%一致性之序列，則T_m可降低10℃。一般而言，在經定義的離子強度及pH下會選擇低於特定序列及其互補物的T_m約5℃的嚴格條件。然而，高度嚴格條件可採用在比T_m低1℃、2℃、3℃或4℃下雜交及/或洗滌；中度嚴格條件可採用在比T_m低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃下雜交及/或洗滌，且低嚴格條件可採用在比 T_m低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃下雜交及/或洗滌。

T_m(℃計)可以實驗方式確定或可藉由計算估計。對於DNA-DNA雜交，T_m可由下式估計：T_m(℃)=81.5℃+16.6(log M)+0.41(%GC)-0.61(%甲醯胺)-500/L；其中M為單價陽離子莫耳濃度，%GC為DNA中之鳥嘌呤及胞嘧啶核苷酸之百分比，%甲醯胺為雜交溶液中甲醯胺之百分比(w/v)，而L為鹼基對雜交長度。

或者，T_m係藉由下式描述(Beltz等人，1983)。

T_m(℃)=81.5℃+16.6(log[Na+])+0.41(%GC)-0.61(%甲醯胺)-600/L其中[Na+]為鈉離子莫耳濃度，%GC為DNA中之鳥嘌呤及胞嘧啶核苷酸之百分比，%甲醯胺為雜交溶液中甲醯胺之百分比(w：v)，而為鹼基對雜交長度。

使用等式、雜交及洗滌組成物以及所需T_m，具有通常知識者將理解原有描述之雜交嚴格性及/或洗滌溶液之變化。若所需程度的錯配導致T_m小於45℃(水溶液)或32℃(甲醯胺溶液)，最好增加SSC濃度以便可使用較高溫度。對於核酸雜交之詳盡指導見於Tijssen(1993)。亦參見Sambrook等人(1989)。

當然，對於有些應用，例如當希望利用雜交到潛在模板上的突變引子鏈來製備突變體或尋求從相關種類、功能等效物等等之中分離出編碼蛋白的序列時，為了形成非互補雙螺旋一般將需要較不嚴格的雜交條件。在這些情況中，人們可能希望利用諸如約0.15M到0.9M的鹽、約20℃到約55℃之溫度範圍的條件。因此，相對於對照雜交，交叉雜交的種類可容易地鑒定為陽性雜交信號。無論如何，一般係明白這些條件可通過添加逐漸增加量的甲醛而變得更為嚴格，其中的甲醛係用於隨著溫度的增加而 以相同的方式使雜交雙鏈變得不穩定。因此，雜交條件可以容易地進行操作，並因此一般將根據所需的結果成為最佳方法。

在某些實施例中，聯合使用本發明之核酸序列與適當的方法，諸如用於判定雜交的標記物將會是有利的。在本領域中已知有廣泛多種適當的指示劑手段，包含螢光指示劑、放射性指示劑、酶指示劑或其它配體指示劑，諸如抗生物素蛋白/生物素，其能夠給出可檢測的訊號。較佳實施例中，人們將很可能希望利用螢光標記或酶標記，諸如尿素酶、鹼性磷酸酶或過氧化物酶來取代放射性或其它對環境不利的試劑。在酶標記的情況下，已知比色指示基質可用於提供人眼可見的手段或分光光度的手段來鑒定出與含有互補核酸樣本之間的特異性雜交。

一般而言，可預想到本文中所述的雜交探針既可做為在雜交溶液中的試劑使用，又可在採用固相的實施例中使用。在涉及固相的實施例中，待測DNA(或RNA)是被吸附在或以其他方式被固定在所選用的基質或表面上。然後在要求的條件下使這種被固定的單鏈核酸與選用的探針進行特異性雜交。所選擇的條件將取決於基於所要求的特定標準之特定環境(取決於(例如)G+C含量、目標核酸的類型、核酸的來源、雜交探針的大小等)。於清洗經雜交的表面以除去非特異性結合的探針分子之後，藉由標記手段對特異性雜交進行檢測，或甚至測定數量。

於較佳實施例中，所述殺蟲蛋白係一起使用，且所述蛋白合併時係具殺蟲性。因此，本發明之這兩類蛋白質可稱做為「二元毒素」。如本文中所用，術語「毒素」係包含所述殺蟲蛋白質中之其中一個類別。本發明涉及了編碼其中任一種殺蟲毒素之聚核苷酸、編碼該毒素全長之於結合使用時係帶有殺蟲活性之部分或片段的聚核苷酸、以及編碼這兩種類型毒素的聚核苷酸序列。於一較佳實施例中，這些毒素針對鞘翅目害蟲(更佳地為玉米根蟲，且最佳地為西方玉米根蟲)是有活性的。

在本文中例示了某些特異性毒素。對於具有已知胺基酸序列的 毒素，其分子量亦為已知的。熟習此項技術者將瞭解，由凝膠電泳所判定之蛋白質表觀分子量有時會與真實分子量不同。因此，本文中提及之(例如)21kDa的蛋白或12kDa的蛋白可理解為其係指約為該大小之蛋白質，即使其真實分子量有些不同。

本發明涉及的不僅僅是編碼這些毒素類別之聚核苷酸序列，也涉及使用這些聚核苷酸序列來產生可表現這些毒素的重組宿主。於進一步的態樣中，本發明係涉及將本發明的一個殺蟲毒素與本發明的另一個殺蟲毒素一起合併使用，以達到對害蟲(包含鞘翅目，諸如玉米根蟲)的高效防治。

因此，使用本發明之分離株、毒素及基因之鞘翅目(包含玉米根蟲)防治係可藉由熟習此項技術者所知道的各種方法來達成。這些方法包含(例如)：對害蟲(或其所在地)施用B.t.分離株、對害蟲(或其所在地)施用重組的微生物、以及利用編碼本發明之殺蟲毒素的基因來轉形植物。

重組的微生物係可為(例如)B.t.、E.coli、或假單胞菌。熟習此項技術者可使用標準的技術來進行轉形。這些轉形所需的材料係已於本文中揭示，或者是本領域技術人員可容易獲得的。

本文中所提供之新類別的毒素及聚核苷酸序列係根據若干參數所定義。本文中所述毒素的一個關鍵特徵是殺蟲活性。於一具體實施例中，這些毒素針對鞘翅目害蟲係具有活性。本發明之毒素及基因係可進一步藉由其胺基酸與核苷酸序列而定義。各個新類別內的分子序列係可根據對於某些例示序列的同源性、以及根據與某些探針與引子雜交或被其擴增之能力而定義。本文中所提供的毒素類別亦可基於其與某些抗體的免疫反應性、以及基於其與通式的一致性進行鑑定。

對於熟習此項技術者而言，通過多種方式來鑑定與取得編碼所述根據本發明之二元毒素的基因係為顯而易見的。本發明之這些基因及毒 素係可以合成方式建構。

利用本文中所提供的教示，熟習此項技術者可容易產生及使用本文所述之新穎類別的各種毒素與聚核苷酸序列。

亦可根據毒素內含物的形狀與位置而對本發明之其他分離株進行定性。

在一較佳實施例中，本發明之毒素係具有下列特徵中之至少一者：(a)所述毒素係由一個在嚴格條件下與一選自下列組成之群組的核苷酸序列進行雜交的核苷酸序列編碼：編碼SEQ ID NO：4的DNA、編碼SEQ ID NO：6的DNA、編碼SEQ ID NO：8的DNA、編碼SEQ ID NO：10的DNA、編碼SEQ ID NO：12的DNA、編碼SEQ ID NO：14的DNA、編碼SEQ ID NO：16的DNA、編碼SEQ ID NO：18的DNA、編碼SEQ ID NO：20的DNA、編碼SEQ ID NO：22的DNA、編碼SEQ ID NO：24的DNA、編碼SEQ ID NO：26的DNA、編碼SEQ ID NO：71的DNA、編碼SEQ ID NO：74的DNA、編碼SEQ ID NO：76的DNA、編碼SEQ ID NO：78的DNA、編碼SEQ ID NO：80的DNA、編碼SEQ ID NO：82的DNA、編碼SEQ ID NO：84的DNA、編碼SEQ ID NO：86的DNA、編碼SEQ ID NO：88的DNA、編碼SEQ ID NO：91的DNA、編碼SEQ ID NO：93的DNA、編碼SEQ ID NO：95的DNA、編碼SEQ ID NO：97的DNA、編碼SEQ ID NO：99的DNA、編碼SEQ ID NO：101的DNA、編碼SEQ ID NO：103的DNA、及編碼SEQ ID NO：105的DNA；(b)所述毒素係由一核苷酸序列編碼，其中所述核苷酸序列的一部分係可藉由PCR及使用一選自表4所列引子組成之群組的引子對而擴增；(c)所述毒素包括下列所示胺基酸序列的殺蟲部分：SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、71、74、76、78、80、82、84、86、88、91、93、95、97、99、101、103或105； (d)所述毒素包括一個與一選自下列組成之群組的胺基酸序列的殺蟲部分有至少約60%的同源性之胺基酸序列：SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、71、74、76、78、80、82、84、86、88、91、93、95、97、99、101、103、105；(e)所述毒素係由一個在嚴格條件下與一選自下列組成之群組的核苷酸序列進行雜交的核苷酸序列編碼：編碼SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、71、74、76、78、80、82、84、86、88、91、93、95、97、99、101、103、105的DNA；(f)所述毒素係由一核甘酸序列編碼，其中所述核苷酸序列的一部分係可藉由PCR及使用表4所列之所述引子對而擴增；以及(h)所述毒素包括一個與一選自下列組成之群組的胺基酸序列有至少約60%的同源性之胺基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：66及SEQ ID NO：68。

基因與毒素的修飾。根據本發明之所述有用的基因與毒素不僅包含所述具體例示的全長序列，也包含這些序列、變異體、突變體、嵌合體及融合蛋白(包含具有經取代的胺基酸的蛋白)的部分(包含內部的缺失(與全長的蛋白相比))及片段(包含端部的缺失(與全長的蛋白相比))，其保留本文中具體例示的蛋白質特徵殺蟲活性。如本文中所用，術語基因之「變異體」或「變異」係指編碼相同毒素或編碼具殺蟲活性之等效毒素的核苷酸序列。如本文中所用，術語「等效毒素」係指針對所述目標害蟲具有與所主張保護之毒素相同或大致相同生物活性之毒素。

使用用於(例如)製造點突變之標準技術可容易建構基因之變異。此外，(例如)美國專利案第5,605,793號描述了在隨機斷裂之後使用DNA重組以產生額外的分子多樣性之方法。全長基因的片段係可用市售核酸外切酶或核酸內切酶而根據標準程序製造。例如，可用諸如Bal31之酶或定點突變以系統性地從這些基因的末端切除核苷酸。編碼活性片段之基 因亦可使用多種限制酶而獲得。可用蛋白酶以直接獲得這些毒素之活性片段。

等效毒素及/或編碼這些等效毒素的基因係可使用本文中所提供的教示而衍生自B.t.分離株及/或DNA資料庫。有許多方法可用於獲得本發明之殺蟲毒素。例如，本文中所揭示及請求保護脂抗體係可用於從蛋白混合物中鑑定且分離其他毒素。具體而言，抗體可出現在所述毒素最不變且與其他B.t.毒素最不同的部分。這些抗體可接著用以藉免疫沉澱法、酵素結合免疫吸附測定(ELISA)或西方墨點法而特異性地鑑別具有所述特徵活性的等效毒素。本文所揭示之抗毒素、抗等效毒素、或抗這些這些毒素之片段的抗體係可使用本領域中的標準程序而容易製備。編碼這些毒素的這些基因可接著獲自所述微生物。

在功能上與本發明之毒素等效的合成基因亦可用以轉形宿主。產生合成基因的方法係可在(例如)美國專利案第5,380,831號中找到。

本發明還揭露並請求保護一種包含有殺蟲蛋白之組成物。此組成物可包括表現有殺蟲蛋白於可溶片段中之細菌宿主細胞、含有該殺蟲蛋白的包含體或結晶、培養物上清液、破碎的細胞、細胞萃取液、溶胞產物及均質物等等。此組成物係可呈液態形式，或者呈乾燥、半濕或其它類似的形式(諸如細胞漿、細胞沉澱物)，或者以冷凍乾燥、製成粉末、真空冷凍乾燥、蒸發或其它類似的方法製成乾燥形式。這類製備殺蟲蛋白的方法係為細菌蛋白分離與純化之技術領域中的技術人員所熟知的。在某些實施例中，該等蛋白係可經純化、濃縮、與其它試劑混合、或者被加工成所需要的最終形式。較佳地，該組成物將包括為以重量計之約1%至約90%的蛋白，更佳地為以重量計之5%至約50%的蛋白。

在一較佳實施例中，本發明之蛋白組成物可按如下方法製備，其步驟包括：在能夠有效地產生這類蛋白的條件下培養可表現殺蟲蛋白的蘇雲金芽孢桿菌細胞，接著從此細胞中獲得蛋白。為了獲得這類蛋白，可 進一步包含純化、濃縮、加工、或者將此蛋白與一或多種試劑混合的步驟。較佳地，此殺蟲蛋白毒素之獲得量為以重量計自約1%至約90%之間，更佳地為以重量計自約5%至約50%。

本發明還涉及製備殺蟲蛋白組成物的方法。這類方法通常包含在能有效地產生此蛋白的條件下培養可表現殺蟲蛋白毒素的蘇雲金芽孢桿菌細胞，接著獲得如此產生的蛋白之步驟。在一較佳實施例中，蘇雲金芽孢桿菌細胞為含有殺蟲蛋白基因節段的任何蘇雲金芽孢桿菌細胞。或者，可使用本發明的重組質體載體使其它適合的細菌或真核細胞轉形以產生本發明的蛋白。包含有革蘭氏陰性細胞(諸如大腸桿菌、螢光假單孢菌及相關的腸桿菌科)，或者革蘭氏陽性細胞(諸如芽抱桿菌屬(包含巨大芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌和B.t.等等)的原核宿主細胞都被設想到有用於本發明之殺蟲蛋白的製備之中。特別偏好常用的大腸桿菌表現菌株。

在這類實施例中，可預期通過將DNA編碼節段安置於重組、或異源啟動子的控制之下將會獲得一些優勢。如本文中所使用，重組或異源啟動子意指通常在自然環境中不與編碼蛋白或肽的DNA節段相連接之啟動子。這類啟動子可包含通常與其它基因相連接之啟動子，及/或分離自任何細菌、病毒、真核或植物細胞的啟動子。當然，利用在選定用於表現的細胞類型、有機體或甚至是動物中有效引導DNA節段表現的啟動子將會是重要的。啟動子和用於蛋白表現的細胞類型組合之使用對於分子生物學領域中的技術人員一般是已知的，例如，參見Sambrook等人，1989。所利用的啟動子可以是組成性的或可誘導的，並且可在適當的條件下使用以引導高程度的DNA節段表現，這在大規模製備重組蛋白或肽中是有利的。預期用於高程度表現的合適啟動子系統包含(但不限於)畢赤酵母表現載體系統(Pharmacia LKB Biotechnology公司)。

在有關為了製備重組蛋白及肽的表現實施例中，預期將最常使用較長的DNA節段，其中編碼完整肽序列的DNA節段是最好的。然而，應 瞭解到使用較短的DNA節段來引導肽或表位核心區域的表現係可用於產生抗蛋白抗體，其亦落入本發明範圍之內。編碼自約8至約50個胺基酸長度、或更佳地自約8至約30個胺基酸長度、或甚至更佳地自約8至約20個胺基酸長度的肽抗原之DNA節段係預期會特別有用。這類的肽表位係可為包括有來自SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、63、66、68、71、74、76、78、80、82、84、86、88、91、93、95、97、99、101、103或105之相連胺基酸序列的胺基酸序列。

在另一個態樣中，本發明提供了用於產生基因轉殖細胞的方法，特別是表現編碼本發明之新穎殺蟲蛋白的核酸節段之植物或動物細胞。產生基因轉殖細胞的方法是本領域中眾所周知的。一般而言，此方法包括以一含有一個可操作地連接到編碼殺蟲蛋白毒素之編碼區域的啟動子之DNA節段，來轉形適當的宿主細胞。這類編碼區通常係可操作地連接到轉錄終止區域，從而使此啟動子能夠在細胞中驅動該編碼區域的轉錄，並因此賦予細胞在體內產生重組蛋白質的能力。或者，當需要控制、調節或減少特定基因轉殖細胞中所表現的特定重組蛋白數量時，本發明也提供了用於蛋白表現的反義mRNA。使用反義mRNA做為細胞中控制或減少一給定的待研究蛋白數量的手段在本領域中是眾所周知的。

在一較佳實施例中，本發明涵蓋了一種已用本發明的核酸節段轉形的植物細胞，且此植物細胞係表現出編碼本文中所揭露之一或多種新穎多肽組成物的基因或基因節段。如本文中所使用，術語「基因轉殖植物細胞」意指一種已併入某種DNA序列的植物細胞，所述DNA序列包含(但不限於)或許是正常不存在的基因、正常不被轉錄成RNA或轉譯成蛋白質(「表現」)的DNA序列，或者是希望導入非轉形植物之其它任何基因或DNA序列，諸如係可正常存在於非轉形植物、但期望已經過基因工程處理或已改變了表現的基因。

預期在某些情況下，通過穩定地導入表現殺蟲蛋白毒素的轉殖 基因，本發明之基因轉殖植物的基因組將被擴增。在某些情況下，將一個以上的轉殖基因併入被轉形的宿主植物細胞的基因組。將一個以上之編碼蛋白的DNA節段併入這類植物基因組時的情形就是這樣。在某些情況下，理想的可能是有一個、二個、三個、四個，或者甚至更多的B.t.結晶蛋白(天然的或經重組工程改造的中之任一種)被併入經轉形的基因轉殖植物中並穩定表現。在較佳實施例中，轉殖基因導入植物細胞的基因組係導致穩定的整合作用，使這些植物後代的基因組中也含有轉殖基因的複本。最初已導入此基因的植物子代，對這種遺傳成分的遺傳性正是本發明的優勢所在。

可導入的較佳基因包含(例如)來自一細菌來源之編碼蛋白質的DNA序列，尤其是本文中所述獲自芽孢桿菌屬之序列中的一或多者。優先考慮的核酸序列為獲自B.t.的序列，或是那些經過基因工程改造以在這樣的經轉形宿主細胞中減少或增加所述蛋白之殺蟲活性的序列中之任一者。

轉形植物細胞及製備基因轉殖細胞株的手段是本領域中眾所周知的(如在美國專利第5,550,318；5,508,468；5,482,852；5,384,253；5,276,269及5,225,341號中已有例證性說明，其係特別以引用方式併入本文中)，且在本文中僅作簡單論述。當然，用於轉形這類細胞的載體、質體、黏質體、YAC(酵母人工染色體)及DNA節段，通常都包括有本發明之操縱子、基因或基因衍生序列(天然的或人工合成的衍生序列)，特別是編碼所揭露的蛋白之序列。這些DNA構築體可進一步包含調節結構，諸如啟動子、增強子、多連接子，或者甚至是對所需待研究的特定基因具有正向或負向調節活性的基因序列。此DNA區段或基因可編碼天然的或經修飾的蛋白，其將在所形成的重組細胞中表現，及/或將對再生的植物賦予改良的表現型。

通過將編碼對昆蟲有毒性的殺蟲蛋白之基因轉殖DNA節段併入植物而增加單子葉或雙子葉植物之殺蟲抗性的這類基因轉殖植物是被期望 的。特別偏好的植物包含玉米、小麥、大豆、草皮草、觀賞植物、果樹、灌木、蔬菜、穀物、豆科植物等等，或是期望有可將殺蟲蛋白轉殖基因導入的任何一種植物。

在一相關的態樣中，本發明亦涵蓋了一種由轉形植物產生的種子、從這種種子產生的後代、以及由根據上述方法產生的原代基因轉殖植物之後代所產生的種子。這些後代及種子將具有被穩定併入其基因組之蛋白質編碼轉殖基因，且這些後代植物將按孟德爾方式遺傳由導入穩定的轉殖基因所賦予的性狀。所有這些已將編碼殺蟲蛋白毒素之基因轉殖DNA節段併入其基因組的基因轉殖植物皆為本發明的態樣。

本發明之編碼毒素的基因可被導入各種各樣的微生物宿主或植物宿主。該毒素基因的表現係直接或間接地致使該殺蟲蛋白在細胞內製造並維持。因此，目標害蟲可藉由攝入含有所述對害蟲有毒的殺蟲蛋白之植物組織而接觸到殺蟲蛋白。其結果為對該害蟲的防治。或者，可將適宜的微生物宿主(例如假單孢菌)施用到該害蟲的位置，其中有一些微生物宿主可於該處增殖，並被該目標害蟲攝入。留有毒素基因之微生物係可在延長該毒素之活性與穩定該細胞之條件下進行處理。帶有所述毒性活性之處理過的細胞可接著被施用至該目標害蟲的環境。

當該B.t.毒素基因經由一合適之載體而導入一微生物宿主，且該宿主以活的狀態被施用至該環境，應該要使用某些宿主微生物。選擇已知會佔領一或多個感興趣作物之「植物圈」(葉面、葉片、根圈及/或根面)的微生物做為微生物宿主。選擇這些微生物以便能夠在特定環境中(作物及其他昆蟲棲所)成功與野生型微生物競爭、提供表現該多胜肽殺蟲劑之基因穩定維持與表現、並期望提供改善殺蟲劑之保護使環境免於劣化與去活性化。

已知很多微生物棲息在種類多樣的重要作物的葉面(植物葉子之表面)及/或根圈(植物跟不周圍之土壤)上。這些微生物包括細菌、藻 類與真菌。特別感興趣的是諸如細菌之微生物，例如假單胞菌屬Pseudomonas、歐文氏菌屬Erwinia、沙雷氏菌屬Serratia、克雷伯氏菌屬Klebsiella、黃單胞菌屬Xanthomonas、鏈黴菌屬Streptomyces、根瘤菌屬Rhizobium、紅假單胞菌屬Rhodopseudomonas、嗜甲基菌屬Methylophilius、土壤桿菌屬Agrobactenum、醋酸桿菌屬Acetobacter、乳酸菌屬Lactobacillus、關節桿菌屬Arthrobacter、固氮菌Azotobacter、白念珠菌屬Leuconostoc以及產鹼桿菌屬Alcaligenes；真菌，特別是酵母菌，例如酵母屬Saccharomyces、芽生菌屬Cryptococcus、克魯維酵母屬Kluyveromyces、擲孢酵母屬Sporobolomyces、紅酵母屬Rhodotorula以及短梗黴菌屬Aureobasidium。特別有興趣之此類植物圈細菌物種諸如丁香假單胞菌Pseudomonas syringae、螢光假單胞菌Pseudomonas fluorescens、黏質沙雷氏菌Serratia marcescens、木醋酸桿菌Acetobacter xylinum、根癌土壤桿菌Agrobactenium tumefaciens、隱球紅假單胞菌Rhodopseudomonas spheroides、野油菜黃單胞菌Xanthomonas campesiris、目蓿根瘤菌Rhizobium melioti、真氧產鹼桿菌Alcaligenes entrophus以及涅藍德固氮菌Azotobacter vinlandii；以及植物圈酵母物種諸如深紅酵母Rhodotorula rubra、黏紅酵母R.glutinis、海洋紅酵母R.marina、授紅酵母R.aurantiaca、白色隱球菌酵母孢菌Cryptococcus albidus、流散隱球菌C.diffluens、羅倫特隱球菌C.laurentii、羅斯酵母Saccharomyces rosei、有孢酵母S.pretoriensis、釀酒酵母S.cerevisiae、拋孢酵母菌Sporobolomyces roseus、香味擲孢酵母S.odorus、維羅那克魯維酵母Kluyveromyces veronae以及出芽短梗黴Auseobasidium pollulans。特別感興趣的是有色的微生物。

B.t.或表現B.t.毒素之重組細胞可經由處理以延長其有毒活性並穩定該細胞。所形成之殺蟲微囊係包括在細胞結構中的B.t.毒素，該細胞結構係已穩定且當該微囊被施用至該目標害蟲之環境時將保護該毒素。合適之宿主細胞可包括原核生物或真核生物，通常限制在不會產生對高等生物 (諸如哺乳類)有毒之物質的那些細胞。然而，當該有毒物質不穩定或施用程度低到可避免任何對哺乳類宿主有毒性的機會，可使用會產生對高等生物有毒之物質的有機體。特別感興趣的將是以原核生物或低等真核生物(諸如真菌)做為宿主。

處理時，該細胞通常是完整的且基本上係呈增殖形式而非呈孢子形式，儘管在一些例子中可使用孢子形式。

可用化學性或物理性方式，或一化學性及/或物理性方式的組合來處理該微生物細胞，例如一含有該B.t.毒素基因之微生物，只要該技術不對該毒素性質有不好影響或不減少該細胞保護該毒素的能力。化學試劑之實例為鹵化劑，特別是原子序17-80的鹵素。更具體而言，可在溫和條件下使用碘以及足夠時間以達到預期的結果。其他適合的技術包括以下列溶液處理：諸如戊二醛之醛類；諸如殺藻胺氯化物及氯化十六烷基吡啶之抗感染劑；諸如異丙醇及乙醇之醇類；各種組織固定劑，諸如盧戈氏碘液(Lugo iodine)、布恩氏固定劑(Boulin's fixative)和海利氏固定劑(Helly's fixative)(參見Humason,Gretchen L.，動物組織技術Animal Tissue Techniques,W.H.Freeman and Company,1967)；或一物理性(加熱)和化學試劑的組合，當該細胞被施用到該宿主環境時，保持並延長在該細胞中所產生之毒素的活性。物理性方式的實例為諸如伽馬輻射線和X-輻射線、冷凍、紫外光照射、冷凍乾燥等之短波輻射。用於處理微生物細胞的方法係揭露於美國專利第4,695,455及4,695,462號中，其通過引用方式併入本文。

該等細胞通常有增強的結構穩定性且其將增強對環境條件的抗性。當該殺蟲劑呈現為前體形式(proform)時，應選擇細胞處理法不會被該目標害蟲病原體抑制處理該殺蟲劑之前體形式至成熟形式的過程。例如，甲醛會交聯蛋白質並可抑制處理一多胜肽殺蟲劑之前體形式的過程。該處理方法應至少保留該毒素大部分的生物可利用性與生物活性。

選擇用於製造目的之宿主細胞時，特別感興趣的特性包含易於將該B.t.基因導入宿主、表現系統的可利用性、表現的效力、殺蟲劑於宿主中的穩定性以及存有輔助遺傳的能力。用作殺蟲劑微囊之感興趣的特性係包含對殺蟲劑的保護特質，諸如厚細胞壁、色素形成及細胞內包裝或形成包含體；存活於水性環境；不具哺乳動物毒性；對害蟲有攝入吸引力、易於致命與固定而不損壞該毒素。其他考量包括易於配製和處理、經濟性、儲存穩定性等等。

細胞生長。含有B.t.殺蟲基因的細胞宿主可在任何方便的營養培養基中生長，其中DNA構築體提供一選擇性優勢，提供一選擇性培養基使得基本上全部或全部的細胞帶有B.t.基因。然後根據常規方式收集這些細胞。替代性地，可在收集之前處理這些細胞。

本發明之B.t.細胞可使用標準技術培養基和發酵技術來培養。當發酵循環完成時，可以使用本領域所熟知之方法先從發酵培養液中將B.t.孢子與結晶分離出而收集該細菌。

在另一個重要的實施例中，該生物殺蟲劑組成物係包括可潤濕的粉末、粉劑、片狀沉澱物、粒劑、膠態濃縮物或其他製劑。此粉末係包括表現出本文所揭露之新穎蛋白的細菌細胞。較佳的細菌細胞為B.t.細胞，然而，以本文中所揭露之DNA節段轉形並表現出該蛋白的細菌也被預期是有用的，諸如巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌或假單胞菌屬細胞。這類乾燥形式的殺蟲組成物可被配置成在增濕時立即溶解，或替代性地以控釋、緩釋或其它時間依存性的方式溶解。

在另一個重要的實施例中，所述生物殺蟲劑組成物係包括諸如上述表現出所述蛋白之細菌細胞的水性懸浮液。這類水性懸浮液係可提供為濃縮儲備液而在施用前稀釋，或替代性地提供為即用的稀釋液。該等製劑可包含了表面活性劑、分散劑、惰性載體及其他組分的添加，以便用於特定目標害蟲的處理和應用。這些製劑與施用程序為本領域中所熟知的。 當所述殺蟲組成物包括有表現出所感興趣蛋白之完整B.t.細胞時，可以多種方法製備這類細菌。

可將含有引誘劑及B.t.分離物之孢子與結晶之所配製的誘餌粒劑，或者包括有可取自本文所揭露之B.t.分離株之基因的重組微生物施用至土壤。配製的產品也能夠在作物週期的晚期做為種子包被或根處理或全植物處理來施加。藉由與多種惰性材料混合，諸如無機礦物質(頁矽酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等)或植物材料(粉末狀玉米穗軸、稻穀、胡桃殼等)，含有B.t.細胞的植物與土壤處理可做為可潤濕的粉末、粒劑或粉劑來使用。這些製劑可包含分散-黏著佐劑、穩定劑、其它殺蟲添加劑或表面活性劑。液態劑型可為水性或非水性的，並做為泡沫、凝膠、懸浮液、乳劑等來使用。這些成分可包含流變劑、表面活性劑、乳化劑、分散劑或聚合物。

在另一重要的實施例中，該生物殺蟲劑組成物係包括可在水中分散的粒劑。此粒劑係包括表現有本文中所揭露之新穎蛋白的細菌細胞。較佳的細菌細胞為B.t.細胞，然而，以本文中所揭露之DNA節段轉形並表現出該蛋白的細菌也被預期是有用的，諸如巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌或假單胞菌屬細胞。

發明人考慮到本文中所揭露的蛋白組成物做為局部性及/或系統性施用至田間作物、草、果樹及蔬菜以及觀賞植物的殺蟲劑將會有特別的用途。在一較佳實施例中，所述生物殺蟲劑組成物係包括表現了本文所揭露之新穎蛋白質的油性可流動細菌細胞懸液。這些細胞較佳地為B.t.細胞，然而，可預期到表現出本文所揭露之新穎核酸節段並產生蛋白的任何這類細菌宿主細胞都是有用的，包含(但不限於)巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌或假單胞菌屬。

所述新穎殺蟲蛋白或殺蟲蛋白衍生的毒素係可藉由天然的或重組的細菌表現系統在體外來製備並分離以隨後供田間施用。這類蛋白係可 存在於粗製細胞裂解液、懸浮液、膠體等之中，或替代性地可在配製成具活性的生物殺蟲製劑之前被純化、精煉、緩衝及/或進一步加工。同樣的，在某些情況下，可能會期望從表現所述蛋白之細菌培養物中分離出結晶及/或孢子，並將這類結晶及/或孢子之溶液、懸浮液或膠體製品應用為具活性的生物殺蟲劑組成物。

無論應用方法如何，以殺蟲有效的量施用該活性組成物，這個量將取決於例如待防治的特定昆蟲、待處理的特定植物或作物、環境條件及施用該有殺蟲活性的組成物之方法、速度和數量等這類因素。

所述殺蟲劑組成物可通過配製該細菌細胞、結晶及/或孢子懸浮液、或分離的蛋白組分與所需之農業上可接受的載體而完成。該組成物可在施用之前以適當手段配製，諸如冷凍乾燥、冰凍乾燥、脫水或置於水性載體、介質或合適的稀釋劑，諸如鹽液或其它緩衝液。所配製的組成物係可呈粉劑或微粒物質形式、或油(蔬菜或礦物油)中的懸浮液形式、或者水或油/水乳劑形式、或者為可潤濕的粉末形式、或者與任何其它適於農業施用的載體材料聯合使用的形式。合適的農業載體可以為固態或液態且在本技術領域中是眾所周知的。術語「農業上可接受的載體」包括所有的佐劑，例如通常用於殺蟲劑製備技術中的惰性成分、分散劑、表面活性劑、增黏劑、黏合劑等；這些對於殺蟲劑製備的技術人員來說是眾所周知的。該製劑可與一或多種固態或液態佐劑混合，並使用常規的製備技術通過各種方法，例如均勻混合、混摻及/或研磨該殺蟲組成物與合適的佐劑而加以製備。

本發明之殺蟲劑組成物係施用至含有目標昆蟲的環境中，一般通過習用方法(較佳地藉由噴灑方式)施用到要保護的植物或作物的葉群及/或根群區(植物根部周圍的土壤)上。殺蟲劑施用的強度和時間將依據待處理的特定害蟲、作物的具體狀況和特定的環境條件來確定。活性成分對載體的比例將自然取決於該殺蟲組成物的化學性質、可溶性及穩定性以 及所預想的特定配方。

在某些情況下，諸如(例如)導致根部或莖部感染的昆蟲或者是施用至纖弱的植物或觀賞植物，其它的施用技術(例如噴粉、噴灑、浸泡、土壤注射、種子塗覆、幼苗塗覆、噴灑、通氣、噴霧、霧化等)也是可行的並且可能是必要的。這些施用方法對於本領域中的技術人員也是眾所周知的。

本發明之殺蟲組成物可以僅僅用於本發明方法中或者與其它化合物(包含(但不限於)其它殺蟲劑)結合使用。本發明方法也可與諸如表面活性劑、清潔劑、聚合物或時間釋放型製劑之其它處理方案結合使用。本發明的殺蟲組成物可以配製成系統或局部使用。

使用於環境、系統、或土壤應用的殺蟲組成物濃度將依據特定製劑、施用方式、環境條件及生物殺蟲活性的程度而廣泛變化。一般而言，所述生物殺蟲劑組成物將在以重量計為至少約1%的濃度下存在於施用的製劑中，且以重量計可高達並包含約99%。所述組成物的乾燥製劑以組成物重量計係可為自約1%至約99%，同時液體製劑以重量計一般係可包括自約1%至約99%或更多的活性成分。

該殺蟲劑製劑根據需要可以一次或更多次施用至特定的植物或目標區域，每公頃的典型田間施用量在自約50g至約500g活性成分範圍，或者自約500g至約1000g、或者自約1000g至約5000g或更多的活性成分範圍。

在特定的實施例中，本案發明人預想到了抗體的使用，即能與本文中所揭露的蛋白結合之單株抗體或多株抗體。製備及定性抗體的手段在本技術領域中是眾所周知的。

本發明亦提供了用於篩選懷疑含有殺蟲蛋白毒素或編碼這類毒素之基因的樣本之組成物、方法及試劑組。可以對如下各種樣本進行篩選：轉形宿主細胞、基因轉殖植物及其後代或種子、或者是懷疑含有或產 生這類多肽或核酸節段之實驗室樣本。試劑組可含有本發明之新穎核酸節段或抗體。該試劑組可含有用於檢測樣本與本發明之核酸或抗體相互作用的試劑。所提供的試劑可以是放射性標記的、螢光標記的、或酶標記的。該試劑組可含有一個能與本發明之核酸或抗體結合或相互作用之已知放射性標記的試劑。

該試劑組的試劑係可用附著到固體支持物上的液體溶液或乾粉形式提供。較佳地，當該試劑以液體溶液形式提供時，該液體溶液為水溶液。較佳地，當所提供的試劑附著到固體支持物上時，該固體支持物可以是層析介質、多孔測試盤或顯微鏡載玻片。當所提供的試劑為乾粉時，可通過加入(所提供的)適宜溶劑而重新調製此粉末。

在另一些實施例中，本發明係涉及免疫檢測法及相關的試劑組。建議可將本發明之蛋白質或肽利用在檢測與其有反應性的抗體，或者，替代性地，可將據本發明製備的抗體利用在檢測蛋白質或含有蛋白相關抗原表位的肽。一般而言，這些方法將包含首先獲得之懷疑含有這種蛋白、肽或抗體的樣本，再視情況於能有效形成免疫複合物的條件下，使該樣本與根據本發明之抗體或肽接觸，並接著檢測此免疫複合物的存在。

一般而言，檢測免疫複合物的形成在本技術領域中是相當熟悉的，可通過應用多種方法來達到目的。例如，本發明設想到應用ELISA、RIA、免疫點墨跡法(例如斑點點墨法)、和間接免疫螢光技術等。一般情況下，可通過使用標記物來檢測免疫複合物的形成，所述標記物例如為放射性標記或酶標記(諸如鹼性磷酸酶、辣根過氧化酶等)。當然，如本技術領域中所知的，可通過使用二級結合配體(諸如二級抗體或生物素/抗生物素蛋白配體)的結合配置而發現到其他益處。

為了分析的目的，已提出實際上可以利用根據實際情況待測之懷疑包括有蛋白或肽或者與蛋白質相關的肽或抗體之任何樣本。預期到這類實施例可能在篩選融合瘤細胞等的抗原或抗體樣本滴定中有所應用。在 相關的實施例中，本發明設想到可利用在檢測樣本中之蛋白或相關的肽及/或抗體的存在。所述樣本可包含懷疑含有蛋白或肽之細胞、細胞上清液、細胞懸浮液、細胞萃取物、酶的片段、蛋白萃取物或其它不含細胞的組成物。一般來說，根據本發明之試劑組將包括適宜的蛋白、肽或抗該蛋白或肽的抗體，以及免疫測定試劑及用於容納所述抗體或抗原與試劑的手段。免疫測定試劑一般將包括與所述抗體或抗原有關、或與二級結合配體有關之標記物。例示性的配體可包含抗一級抗體、或具有連接標記物之抗原或生物素或抗生物素蛋白(或鏈霉抗生物素蛋白)的二級抗體。當然，如上所述，許多例示性標記在本領域中是已知的並且這類標記可與本發明結合使用。

容器將一般包含其中可放置抗體、抗原或檢測試劑、且最好適合分裝的小瓶。本發明之試劑組通常也將包含為了商業銷售而在密閉條件下容納所述抗體、抗原和試劑容器的手段。這類容器可包含放置有所需小瓶於其中之注射或吹製塑膠容器。

ELISAs與免疫沉澱法

ELISA可與本發明聯合使用。在ELISA分析中，將摻入蛋白抗原序列的蛋白或肽固定於選定的表面上，最好是一個會展現出蛋白親和力的表面，諸如聚苯乙烯微滴定盤的小孔。在清洗去除未完全吸附的物質後，最好用一個非特異性蛋白結合或塗覆該測定盤的小孔，且所述非特異性蛋白已知在抗原性上對於該試驗抗血清(諸如牛血清蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液)是中性的。這樣便阻斷了該固定表面上的非特異性吸附位點，且因此減少因非特異性的抗血清結合到該表面上所造成的背景。

在抗原物質結合到小孔上以後，以非反應性物質塗覆以降低背景，並且清洗以去除未結合的物質，以有利於免疫複合物(抗原/抗體)形成的方式將固定的表面與待測抗血清或臨床或生物學萃取物接觸。這類條件最好包含以諸如BSA、牛γ球蛋白(BGG)及磷酸鹽緩衝液(PBS)/TWEEN^® 表面活性試劑(ICI Americas,Inc.,Wilmington,Del.)之稀釋劑來稀釋該抗血清。這些加入的試劑也傾向於協助降低非特異性的背景。接著使分層的抗血清按約25℃至約27℃的較佳溫度順序下培養約2至約4小時。培養之後，清洗該抗血清接觸的表面以去除非免疫複合的物質。較佳的清洗方法包含以諸如PBS/TWEEN^®表面活性試劑溶液或硼酸緩衝液清洗。

所述檢測樣本與結合的抗原之間形成特異性免疫複合物並隨後清洗之後，通過使一個對該一級抗體有特異性之二級抗體經受同樣處理可測定免疫複合物的出現且甚至其數量。為提供檢測手段，該二級抗體最好具有一個將會在與適當的顯色基質一起培養時產生顏色顯影之相連接的酶。因此，例如需要使抗血清結合表面與脲酶或過氧化酶偶聯的抗人IgG接觸並培養一段時間，並且在有利於發生免疫複合物形成的條件下進行(例如，於室溫下在諸如PBS/TWEEN^®之含PBS溶液中培養2小時)。

與二級酶標記抗體培養並且隨後清洗去除未結合的物質之後，通過在做為酶標記的過氧化物酶存在下與顯色基質一起培養而對標記數量進行定量，所述顯色基質諸如為尿素及溴甲酚紫或2,2'-連氮-雙-(3-乙基-苯噻唑啉)-6-磺酸(ABTS)及H₂O₂。然後通過(例如)用可見光譜分光光度計測定生色的程度而完成定量。

本發明之抗蛋白的抗體對於通過免疫沉澱分離其它的蛋白抗原是特別有用的。免疫沉澱包括從複合混合物中分離目標抗原成分，並且用於區分或分離微量的蛋白。對於膜蛋白的分離，必須將細胞溶解成清潔劑微胞。非離子鹽是較佳的，因為其它試劑(諸如膽鹽)在酸性pH或在二價陽離子存在下會沉澱。

在一替代性實施例中，本發明之抗體對於緊密並聯二種抗原是有用的。這對於增加特定位置抗原的濃度(例如酶-基質對)是特別有用的。

本發明之組成物在免疫點墨法或西方點墨法分析方面是十分有 用的。可將所述抗肽的抗體做為高親和力的一級試劑，用於鑒定固定在諸如硝酸纖維素、尼龍或其組合物之固態支持基質上的蛋白。在免疫沉澱之後，接著進行凝膠電泳，可將其使用為用於檢測抗原的單一步驟試劑，其中之用於檢測抗原的二級試劑會導致負背景。當所研究的抗原是免疫球蛋白時，這樣做是特別有用的(排除了免疫球蛋白結合細菌細胞壁成分的使用)，所研究的抗原能與所述檢測試劑交叉反應，或者其能以與交叉反應信號相同的相對分子量遷移。

用於與西方點墨法結合使用之基於免疫學的檢測方法係包含針對在這方面被認為有特殊用途之抗毒素部分的酶標記的、放射標記的或螢光標記的二級抗體。

本發明也涉及不含完整細胞與其它肽的蛋白或肽組成物，其包括併入在免疫學上與一或多種抗蛋白抗體交叉反應之表位的純化蛋白或肽。尤其，本發明涉及衍生自殺蟲蛋白或肽的表位核心序列。

如本文中所使用，術語「併入在免疫學上與一或多種抗蛋白抗體交叉反應之表位」意指一個包含與位於蛋白或多肽內的表位類似的一級、二級或三級結構之肽或蛋白抗原。類似的程度所將達到的程度一般為，抗蛋白或多肽的單株或多株抗體將同時與交叉反應肽或蛋白抗原結合，與其反應或以其他方式對其進行識別。可利用各種免疫分析方法來與這類抗體結合使用，諸如(例如)西方點墨法、ELISA、RIA等，這些方法對於本領域中的技術人員皆為已知的。

Cry免疫顯性表位及/或其適合用於疫苗之功能等效物的鑑定是相對簡單的事情。例如，可利用美國專利4,554,101號(以引用方式併入本文中)所述，其中講述了根據胺基酸的親水性鑒定和製備表位。在幾篇其它論文中所述的方法以及基於這些方法的軟體程式也可用於鑒定表位核心序列(參見(例如)美國專利第4,554,101號)。接著可通過用肽合成或重組技術容易地將這些「表位核心序列」的胺基酸序列併入到肽中。

根據本發明優選使用的肽將一般在約8至約20個胺基酸長度，且更佳地為約8至約15個胺基酸長度。已提出較短的抗原蛋白衍生的肽將在某些情況(例如)於免疫學檢測試驗的製備中具有優勢。例示性的優勢包含製備和純化的簡單易行、相對較低的成本及提高的生產重複性，以及有利的生物分佈。

已提出本發明的特定優勢可通過製備合成肽而加以實現，該合成肽包含經修飾及/或延伸的表位/免疫原性核心序列，其導致針對蛋白(且特別是殺蟲及與殺蟲有關的序列)的「通用」表位肽。這些表位核心序列在本文的特定態樣中被鑒定為特定多肽抗原的親水區域。已提出這些區域代表最有可能促進T-細胞或B-細胞的刺激，並且因此引發特異性抗體產生的那些區域。

如本文中所使用，表位核心序列是相對短的胺基酸片段，其與本文中所揭露之針對蛋白的抗體上的抗原結合位點「互補」且因此將與其結合。此外或替代性地，表位核心序列為將會引發與針對本發明肽組成物抗體起交叉反應之抗體的序列。應該明白在本文的上下文中，術語「互補」意指相互間顯示出吸引力的胺基酸或肽。因此，可根據與相應之抗蛋白的抗血清之間競爭結合所需蛋白抗原或者是代替它們之間的結合之能力而可操作地界定本發明的一些表位核心序列。

一般來說，只要其至少足夠大以帶有鑒定出的核心序列或多個序列，那麼該多肽抗原的大小不認為是特別重要的。本發明所預期之最小的有用核心序列一般將為大約8個胺基酸的長度，其中10到20個胺基酸長度的序列是優選的。因此，其大小將一般相應於根據本發明所製備之最小的肽抗原。然而，只要其含有基本的表位核心序列，那麼該抗原的大小在需要時可以更大些。

表位核心序列的鑒定對於本領域的技術人員是已知的，例如美國專利第4,554,101號(以引用方式併入本文中)所述，其中講述了根據 胺基酸的親水性鑒定和製備表位。再者，眾多的電腦程式可用於預測蛋白質的抗原部分。電腦化的肽序列分析程式(例如，DNAStarr^®軟體，DNAStar,Inc.,Madison,Wis.)也可用於設計根據本發明的合成肽。

在其序列內部包含抗原表位之表位序列或肽的合成係可用常規的合成技術而容易地完成，諸如固相方法(例如，通過使用市售的肽合成儀，諸如Applied Biosystems Model 430A型肽合成儀)。然後將以此方式合成的肽抗原分裝成預定的量並以常規方法儲存，諸如水溶液或甚至更佳地為以粉末或冷凍乾燥狀態儲存備用。

一般來說，由於肽的相對穩定性，它們可容易以水溶液形式儲存相當長的時間，若需要的話在實際上儲存於任何水溶液中例如達6個月或更長時間而沒有可覺察到的降解或抗原活性的喪失。然而，當期望長時間含水儲存時，一般將需要包括含有諸如Tris或磷酸鹽緩衝液之緩衝液的試劑以將pH維持在約7.0至約7.5。此外，可能需要包括抑制微生物生長的試劑，諸如疊氮鈉或硫柳汞。為在液態下長時間儲存，將需要將該溶液儲存在約4℃下，或更佳的進行冷凍。當然，在冷凍或粉末狀態下儲存所述肽時，其實際上可(例如)以固定的等份無限期儲存，在使用前以預定量的水(最好是蒸餾過的)或緩衝液使其再水合。

本發明之某些毒素係已具體例示於本文中。因為這些毒素僅為本發明之毒素的示例，顯而易見，本發明包括具有與該示例性毒素相同或相似殺蟲活性的變異體或等效毒素(以及編碼等效毒素之核苷酸序列)。等效毒素將與一示例之毒素具有胺基酸同源性。其胺基酸一致性將通常大於60%，較佳地大於75%，更加地大於80%，更佳地大於90%，且可大於95%。在該毒素之關鍵區的胺基酸同源性將會最高，其負責生物活性或參與三維構形之決定，該三維構形最終為該生物活性負責。在這方面，某些胺基酸取代為可接受的且可被預期，若這些取代不在對活性關鍵的區域或者為不影響該分子三維構形之保守胺基酸取代。可在本發明該等毒素的初 級結構進行修飾及改變，以產生編碼它們並仍留有功能性殺蟲分子之衍生物、類似物及突變體以及DNA節段，且所述分子係編碼具有所需特徵的蛋白或肽。在本發明的特定實施例中，已考量到突變的蛋白係有益於增強該蛋白的殺蟲活性，且因而增強該重組的轉殖基因在植物細胞中的殺蟲活性及/或表現。胺基酸的改變可根據表2中列出的密碼子而改變DNA序列的密碼子來實現。

例如，在蛋白結構中有些胺基酸可以用其它胺基酸代替而沒有可覺察到之與諸如(例如)抗體之抗原結合區域或作用物分子上之結合位點的結構相互結合的能力喪失。由於正是蛋白的這種相互作用能力及性質定義該蛋白的生物學功能活性，故可以在蛋白序列，和，當然其潛在的DNA編碼序列中造成一些胺基酸序列替代，但是可得到具有同樣特性的蛋白。因此，發明人預想到可在所揭露的組成物肽序列中，或在編碼所述肽的相應DNA序列中，做出各種變化而其生物學用途或活性沒有可覺察到的喪失。

在做出這樣的變化時，可考量胺基酸的親水性指數。親水性胺基酸指數在賦予蛋白相互間生物功能中的重要性在本領域中已得到一致認同。現已接受胺基酸的相對親水特性係促成所產生蛋白的二級結構，其反過來又定義了該蛋白與其它分子之間的相互作用，例如酶、作用物、受體、DNA、抗體、抗原等。

根據其疏水性和電荷特徵，每種胺基酸已被指定一個親水指數，其為：異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；苯丙胺酸(+2.8)；半胱胺酸/胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；息寧胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸(-3.5)；麩醯胺酸(-3.5)；天冬胺酸(-3.5)；天冬醯胺酸(-3.5)；賴胺酸(-3.9)；與精胺酸(-4.5)。

在本領域中已知有些胺基酸可由具有類似親水指數或評分的其它胺基酸所代替並且仍可得到具有類似生物學活性的蛋白，即，仍然獲得生物功能等效的蛋白。在做出這樣的改變時，替代其親水指數在±2以內的胺基酸是較好的，替代其親水指數在±1以內的胺基酸是特別較好的，並且替代那些親水指數在±0.5以內的胺基酸甚至是更為特別較好的。

也應明白在本領域中替代類似的胺基酸可根據疏水性而有效地 完成。以引用方式併入本文中之美國專利第4,554,101號敘述了由其鄰近胺基酸親水性所支配的蛋白最大局部平均親水性係與該蛋白的生物學特性相關。

如在美國專利如在美國專利第4,554,101號中所詳述，下面的疏水值已指定給每個胺基酸殘基：精胺酸(+3.0)；賴胺酸(+3.0)；天冬胺酸(+3.0±1)；麩胺酸(+3.0±1)；絲胺酸(+0.3)；天冬醯胺酸(+0.2)；麩醯胺酸(+0.2)；甘胺酸(0)；息寧胺酸(-0.4)；脯胺酸(-5+1)；丙胺酸(-0.5)；組胺酸(-0.5)；半胱胺酸(-1.0)；甲硫胺酸(-1.3)；纈胺酸(-1.5)；白胺酸(-1.8)；異白胺酸(-1.8)；酪胺酸(-2.3)；苯丙胺酸(-2.5)；色胺酸(-3.4)。

應該明白胺基酸可由具有類似疏水值的其它胺基酸所代替並且仍然獲得生物學上等效的，且特別是免疫學上等效的蛋白。在這些改變中，替代其疏水值在±2以內的胺基酸是較好的，替代其疏水值在±1以內的胺基酸是特別較好的，並且替代其疏水值在+0.5以內的胺基酸是甚至更為特別較好的。

如上面所總結的，因此胺基酸替代一般是根據胺基酸側-鏈取代基的相對類似性，例如其疏水性、親水性、電荷、大小等。將前述特性都納入考慮的替換實例是本領域技術人員眾所周知的，且包含：精胺酸與賴胺酸；麩胺酸與天冬胺酸；絲胺酸與息寧胺酸；麩醯胺酸與天冬醯胺酸；以及纈胺酸、白胺酸與異白胺酸。

在另一態樣中，由本發明提供的DNA序列資訊允許製備具有與本文中所揭露之篩選出的聚核苷酸基因序列特異性雜交的能力之相對較短的DNA(或RNA)序列。在這些態樣中，係根據篩選出的蛋白基因序列(例如，諸如在SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、61、62、64、65、67、69、70、72、73、75、77、79、81、83、85、87、89、90、92、94、96、98、100、102及104中所顯示的序列)的 考量來製備適當長度的核酸探針。這類核酸探針與編碼蛋白的基因序列之特異性雜交的能力賦予其在多種實施例中的特定用途。更為重要的是，這些探針可使用於多種用以在一給定樣本中測定互補序列的存在之試驗中。

在某些實施例中，使用寡核苷酸引子是有利的。使用本發明之聚核苷酸來設計這類引子序列，供使用在利用PCR^TM技術測定、擴增或使一來自B.t.的蛋白基因的經定義節段突變。來自其它品系之相關蛋白基因節段也可使用這類引子通過PCR^TM而擴增。

本發明設想到一種包括有本發明之聚核苷酸的表現載體。因此，在一實施例中，表現載體為包括有可操作地連接到編碼本發明之多肽編碼區上的啟動子之經分離純化的DNA分子，其編碼區係可操作地連接到一轉錄終止區域，藉以使該啟動子驅動此編碼區域的轉錄。

如本文中所使用，術語「可操作地連接」意指啟動子以編碼區域被該啟動子控制與調節的方式而連接到該編碼區域。用於可操作地連接啟動子至編碼區域上的手段在本領域中是眾所周知的。

在一較佳實施例中，編碼本發明蛋白質之DNA的重組表現較佳地是在芽孢桿菌宿主細胞中。較佳的宿主細胞包含B.t.、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌及相關的芽孢桿菌，而B.t.宿主細胞是特別較佳的。在細菌中作用的啟動子在本領域中是眾所周知的。芽孢桿菌結晶蛋白的一個例示性及較佳的啟動子包含任何已知結晶蛋白基因啟動子中之任一者，包含殺蟲蛋白基因啟動子，以及對B.t.sigma因子(諸如σ^E及σ^K)具特異性的啟動子。或者，經誘變或重組之編碼結晶蛋白的基因之啟動子係可通過人工基因工程化，並用於促進本文中所揭露之新穎基因節段的表現。

在一替代實施例中，編碼本發明蛋白質之DNA重組表現係使用一種經轉形的革蘭氏陰性細菌(諸如大腸桿菌或假單孢菌屬宿主細胞)來進行。在大腸桿菌及其他革蘭氏陰性宿主細胞中以高度表現方式作用之啟 動子也是本領域中眾所周知的。

本發明之表達載體被使用於轉形植物時，選擇在植株中有驅動表現能力的啟動子。在植株中作用的啟動子也是本領域中眾所周知的。有用於在植株中表現所述多肽之啟動子為可誘導的、病毒的、合成的、組成型的啟動子，以及時間調節的、空間調節的、時空調節的啟動子。

還篩選了啟動子將轉形植物細胞的或基因轉殖植物的轉錄能力引向編碼區域的能力。結構基因可通過植物組織中的各種啟動子來驅動。啟動子可能是接近組成型的(諸如CaMV 35S啟動子)，或影響雙子葉或單子葉植物的組織特異性或發育特異性啟動子。

不論轉形技術，優選將基因併入到一個通過在載體中包含植物啟動子而適於在植物細胞中表現B.t.殺蟲毒素基因及變異體的基因轉移載體中。在植物啟動子之外，可以在植物細胞中有效使用來自多種來源的啟動子來表現外來基因。例如，可使用細菌來源之啟動子，諸如章魚鹼合成酶啟動子、胭脂鹼合成酶啟動子、甘露鹼合成酶啟動子；病毒來源之啟動子，諸如花椰菜嵌紋病毒(CaMV)之35S及19S啟動子及其類似物。植物來源之啟動子包含(但不限於)核酮糖-1,6-二磷酸鹽(RUBP)羧基酶小次單位(ssu)、β-大豆球蛋白啟動子、菜豆蛋白啟動子、ADH(醇脫氫酶)啟動子、熱休克啟動子、ADF(肌動蛋白解聚合因子)啟動子及組織特異性啟動子。啟動子亦可含有某些可改良轉錄效率之增強子序列元件。典型的增強子包含(但不限於)ADH1-內含子1及ADH1-內含子6。可使用組成性啟動子。組成性啟動子在幾乎所有細胞類型中及在幾乎所有時間引導連續基因表現(例如，肌動蛋白、泛蛋白、CaMV 35S)。組織特異性啟動子係負責在特定細胞或組織類型中之基因表現，諸如種子(例如，玉米蛋白、油質蛋白、凝集素、芸苔素、ACP(醯基載體蛋白質))，且亦可使用此等啟動子。亦可使用在植物發育之某一階段期間具有活性以及在特定植物 組織及器官中具有活性之啟動子。此類啟動子之實例包含(但不限於)根特異性、花粉特異性、胚特異性、玉米穗黃特異性、棉花纖維特異性、種子內胚乳特異性、韌皮部特異性的啟動子及其類似物。

例示性的組織特異性啟動子為玉米蔗糖合成酶1、玉米乙醇脫氫酶1、玉米集光複合體、玉米熱休克蛋白、豌豆小次單位RuBP羧基酶、Ti質體甘露聚醣合酶、Ti質體胭脂鹼合酶、矮牽牛查耳酮異構酶、大豆甘胺酸富含蛋白1、CaMV 35S轉錄體及馬鈴薯蛋白(patatin)的啟動子。優選的啟動子為花椰菜嵌紋病毒(CaMV 35S)啟動子及S-E9小次單位RuBP羧基酶啟動子。

在某些情況下，可能需要使用誘導性啟動子。誘導性啟動子負責回應於以下特定信號之基因表現，諸如：物理刺激(例如熱休克基因)；光(例如RUBP羧基酶)；激素(例如糖皮質激素)；抗生素(例如四環素)；代謝物；及壓力(例如乾旱)。可使用在植物中起作用之其他所需轉錄及轉譯元件，諸如5'未轉譯前導序列、RNA轉錄終止序列及聚腺苷酸添加信號序列。許多植物特異性基因轉移載體為本技術領域中已知的。

將含有編碼感興趣之多肽的編碼區域的表現載體基因工程化，從而使其在凝集素啟動子的控制下，並且用(例如)原生質體轉形方法將該載體導入植物中。該多肽的表現具體與該基因轉殖植物的種子有關。

從以組織特異性啟動子轉形的植物細胞所產生之本發明的基因轉殖植物係可與從以不同組織特異性啟動子轉形的植物細胞形成的第二種基因轉殖植物雜交，以產生一種顯示出不止一種特異性組織中轉形效應的雜交基因轉殖植物。

表現載體及最終多肽編碼區域與哪一個啟動子可操作地連接的選擇係直接取決於所需的功能特性，例如蛋白表現的位置和時間選擇，以 及待轉形的宿主細胞。這些是在構築重組DNA分子領域中眾所周知的固有限制。然而，有用於實施本發明之載體係能夠引導與該載體可操作地連接之多肽編碼區域的表現。

用於高等植物中之基因表現的典型載體在本領域中是眾所周知的，且包含源自於根癌農桿菌誘導-腫瘤(Ti)質粒的載體。然而，已知數種其它植物整合載體系統在植物中起作用，包括pCaMVCN轉移控制載體。pCaMVCN(可獲自Pharmacia公司，Piscataway,N.J.)包含花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動子。

在較佳實施例中，用於表現該多肽的載體係包含一個在植物細胞中有效的選擇標記，優選為藥物抗性選擇標記一較佳的藥物抗性標記為其表達導致卡那黴素抗性的基因，即含有胭脂鹼合酶啟動子、Tn 5新黴素磷酸轉移酶II(npt II)與胭脂鹼合酶3'非轉譯區的嵌合基因。

RNA聚合酶經過一個聚腺苷酸化出現的位點來轉錄編碼DNA序列。一般而言，位於聚腺苷酸化下游數百個鹼基對處的DNA序列係用於終止轉錄。這些DNA序列在本文中係稱為轉錄終止區域。這些區域對於經轉錄的信使RNA(mRNA)的有效聚腺苷酸化是必需的。

用於製備表現載體的手段在本領域中是眾所周知的。用於轉形植物的表現(轉形載體)以及製備這些載體的方法係描述於美國專利第4,971,908、4,940,835、4,769,061及4,757,011中，其內容係以引用方式併入本文中。這些載體係經修飾而包含根據本發明之編碼序列。

已開發出多種通過互補黏性末端或鈍端而可操作地將DNA連接到載體上的方法。例如，將互補的同聚物特徵添加到待插入的DNA節段上和載體DNA上。然後通過互補同聚物尾部之間的氫鍵連接載體與DNA節段以形成重組DNA分子。

編碼具有賦予細胞殺蟲活性之多肽的編碼區域優選為編碼殺蟲 蛋白毒素的基因。

也預想到了以本發明的表現載體轉形之細菌、酵母細胞、植物細胞或植物。也預想到了衍生自該類轉形或基因轉殖細胞的基因轉殖細菌、酵母細胞、植物細胞或植物。用於轉形細菌和酵母細胞的手段在本領域中是眾所周知的。一般而言，轉形的手段係與那些熟知用於轉形其它細菌或酵母(諸如大腸桿菌或啤酒酵母)的手段類似。

用於植物細胞DNA轉形的方法包含農桿菌介導的植物轉形、原生質體轉形、基因轉移入花粉、注射至生殖器官中、注射至未成熟胚胎及粒子轟擊。這些方法中之每一者係具有不同的優點和缺點。因此，一種將基因導入特定植物品系中的特定方法可能不一定對於另一種植物品系是最為有效的，但該方法對於特定植物品系是有用的是眾所周知的。

有許多種將轉形DNA節段導入細胞中的方法，但並不是所有方法均適用於將DNA運載至植物細胞中。認為適宜的方法包含實際上可將DNA導入細胞中的任何方法，諸如農桿菌感染、DNA的直接轉運，例如，通過PEG-介導的原生質體轉形、乾燥/抑制-介導的DNA攝入、電穿孔、碳化矽纖維的攪拌、加速覆有DNA的粒子等。在有些實施例中，加速方法是優選的並且包含(例如)微粒轟擊等。

用於導入DNA至細胞中的技術對於本領域中的技術人員是眾所周知的。已描述過四種將基因導入細胞中的常用方法：(1)化學方法；(2)物理方法，諸如顯微注射、電穿孔和基因槍；(3)病毒載體；及(4)受體介導的機制。

更為優選的是基因轉殖植物對於添加的結構基因是同型接合的；即含有2個添加基因的基因轉殖植物，在一染色體對的每條染色體相同位點各具一個基因。同型接合的基因轉殖植物可通過以下方法而獲得：性交配(自交)一種含有單一個添加基因之獨立分離的基因轉殖植物、萌 發一些產生的種子並且分析所產生的植物較對照(天然、非基因轉殖)或獨立分離基因轉殖植物增強的羧基酶活性。

應當明白也可交配兩種不同的基因轉殖植物以製備含有二種獨立分離之添加外源基因的後代。適當後代的自交可以產生對編碼感興趣的多肽的2個添加外源基因均為純合的植物。也預想到了與母代植物的回交及與非基因轉殖植物的異型雜交。

植物原生質體的轉形可根據下面的方法完成：磷酸鈣沉澱、聚乙二醇沉澱、電穿孔、和這些處理的組合。

不同植物品系中這些系統的施用係取決於從原生質體中再生此特定植物的能力。已描述過從原生質體中再生禾穀類的說明性方法(WO 1997/013843)。

為了轉形不能從原生質體中成功再生的植物品系，可以利用其它將DNA導入完整細胞或組織中的方法。例如，可從未成熟胚胎或外植體中再生出禾穀類。此外，可以利用「粒子槍」或高速微粒技術。

用此後者技術，將DNA經細胞壁帶入小金屬顆粒上的原生質體中。該金屬粒子穿透數層細胞且因而允許對組織外植體內部細胞的轉形。

通過以一含有重組殺蟲蛋白基因的區段來轉形適當的宿主細胞(諸如植物細胞)，被編碼的蛋白(即具有抗鞘翅目殺蟲活性的細菌蛋白或多肽)之表現係可導致具昆蟲抗性的植物形成。

藉由實例方式，使用諸如粒子轟擊的方法可利用含有B.t.蛋白編碼區域與一適當的選擇標記之表現載體來轉形胚胎植物細胞(諸如小麥或玉米細胞)的懸浮液，以傳遞包被在微彈上的DNA進入所述受體細胞。然後從被轉形之表現殺蟲蛋白的胚胎癒合組織來再生基因轉殖植物。

用本領域所知的其他細胞轉形法(諸如農桿菌介導的DNA轉移)也可完成基因轉殖植物的形成。或者，通過直接將DNA轉移進入花 粉，通過將DNA注射進入植物生殖器，或通過直接注射DNA基因進入未成熟胚隨後通過脫水乾燥胚胎的再水化，而可將DNA引入植物。

從單個植物原生質體轉形株或從各種轉形的外植塊再生，發育和培養植物是本領域中眾所周知的。此再生及生長過程一般包含篩選轉形細胞的步驟、培養那些個體化細胞通過通常的胚胎發育階段到生根的幼小植物階段。基因轉植胚胎和種子同樣被再生。此後，所產生的基因轉殖生根的苗被栽種在適當的植物生長培養基中，諸如土壤。

從葉的外植塊發育或再生含編碼由農桿菌導入的所感興趣多肽之外來外源基因的植物可通過本領域中眾所周知的方法來完成。在此方法中，轉形株被培養在有選擇試劑存在並在誘導該植物品系中苗的再生之培養基中。

這種方法一般在兩到四個月內產生苗，然後那些苗被轉移到含選擇性試劑和抗生素的適當誘導根培養基以防止細菌生長。然後將在選擇性試劑存在下生根以形成幼小植物的苗轉移到土壤或使產生根的其他培養基。這些方法依據所用的具體植物而有不同，這些不同是本領域眾所周知的。

所述再生的植物優選是自花受粉的以提供純合基因轉殖植物(如前所述)。此外，使從所述再生植物獲得的花粉與農業上重要的種子生長植物(優選近交系)雜交。相反，來自那些重要品系植物的花粉被用於再生植物的授粉。使用本領域技術人員所熟知的方法栽培含所需要多肽的本發明基因轉殖植物。

因此，本發明基因轉殖植物具有被增加了數量的編碼區(例如IRDIG基因)，所述編碼區係編碼感興趣的多肽。一種優選的基因轉殖植物是獨立分離子並能將該基因及其活性遺傳給其後代。更優選的基因轉殖植物是所述基因是純合的，並將該基因傳遞給其有性交配的所有子代。基 因轉殖植物來源的種子可被種植在田間或溫室，並且所生成的性別成熟的基因轉殖植物自花受粉以產生真正的育種植株。從這些植株而來的後代成為真正的育種品系，作為實施例，在環境條件範圍(優選在田間)這些品系被評估增加的抗鞘翅目昆蟲的殺蟲能力。發明人期望本發明在創建商業目的的基因轉殖植物，包括玉米及各種覆蓋草、小麥、玉米、水稻、大麥、燕麥、各種觀賞植物和蔬菜以及許多堅果和水果樹或植物方面找到具體應用。

本文中提及或列舉之全部專利、專利申請案、臨時申請案及公開案以全文引用之方式併入，至其不與本說明書之明確教示內容不一致之程度。

應瞭解，本文所述之實例及實施例僅出於說明之目的，且根據其之各種修改或變化將由熟習此項技術者提出且包括在本申請案之精神及範圍內及隨附申請專利範圍之範疇內。此等實例不應視為限制。

除非另外指出，否則所有百分比均以重量計且所有溶劑混合物比例均以體積計。所有溫度均以攝氏度為單位。

實例1 本發明之 B.t.分離株的培養

B.t.分離株或其突變體的繼代培養物係可用於接種以下的培養基、蛋白腖、葡萄糖及鹽培養基。

將鹽溶液及CaCl₂溶液過濾除菌，並在接種時添加到經高溫滅菌的培養液中。燒瓶係於30℃在一個旋轉搖動器上以200rpm培養24-48小時。

以上步驟可容易通過本領域中眾所周知的步驟而將規模放大到大型發酵槽。

可通過通過本領域中眾所周知的步驟而分離出上述發酵中得到 的B.t.芽孢及/或晶體。常使用的步驟為對收集到的發酵液進行分離技術，例如離心。

實例2 編碼所述殺蟲蛋白之基因的分離

基因體學與蛋白質體學的研究顯示，7個WCR活性B.t.及蘇雲金芽孢桿菌以色列亞種(B.t.i.)菌株中的6個被鑑定出具有一或多種可能促成在篩選生物活性測定中觀察到的WCR活性之已知WCR活性基因，但有一個菌株DBt12172通過蛋白質體學方法被發現到其具有兩種被稱為IRDIG27501與IRDIG27642之假想蛋白質，以及一個B.t.S-層蛋白(IRDIG27674)。

這三個基因係經選殖以用於蛋白質表現與生物測定。使用標準分子生物學的步驟，利用E.coli-B.t.穿梭載體pDAB101622以及靶向這些基因的PCR產物，來構築表現載體pDAB122756、pDAB122768及pDAB122774。具有IRDIG27501、IRDIG27642及IRDIG27674之5’與3’非轉譯區域(UTRs)的開放讀取框架係使用DBt12172的基因體DNA做為模板及使用設計給各基因(表4)的引子，通過PCR而擴增。得自New England Biolabs(NEB)公司之Phusion高保真性DNA聚合酶係依循以下程式而使用於PCR中：98℃ 3分鐘，隨後98℃ 50秒、51℃ 30秒及72℃ 1分鐘(重複5個循環)，接著98℃ 30秒、58℃ 30秒及72℃ 1分鐘(重複35個循環)，最後步驟為72℃ 5分鐘並保持在4℃中。對於IRDIG27501及IRDIG27642，所得到的PCR產物係分別次選殖至pCR-Blunt II-TOPO(Invitrogen)內供定序確認，接著選殖至pDAB101622內的BamHI/KpnI位置，因而產生用於分別在無毒素(無質體)的B.t.菌株4Q7中表現IRDIG27501及IRDIG27642之表現載體pDAB122756及pDAB122774。對於IRDIG27674，Clontech的融合策略係用來將其分別選殖到已藉SmaI酶切反應線性化的pDAB101622及 pDAB112695內。所得到的表現載體係稱為pDAB122768及pDAB122773。載體pDAB101622並不具有調節目標基因表現的啟動子與終止子。選殖至pDAB101622內的這些基因表現皆受到其自已的天然啟動子與終止子的控制。然而，pDAB112695含有一個來自於另一個B.t.菌株的Cry1Ac啟動子與終止子。因此，在pDAB122773中的B.t.S層蛋白質表現係受到Cry1Ac啟動子與終止子的調控。

已完成用於共同表現IRDIG27501與IRDIG27642這兩個新穎基因的選殖，以測試二元活性。使用引子12172-00709-F1BamHI & 12172-00709-R1SacII、及12172-00733-F1SacII & 12172-00733-R1KpnI來分別產生IRDIG27501與IRDIG27642的兩個PCR產物，接著以圖1所示的方向同時在BamHI、SacII及KpnI的位置選殖至pDAB101622內，其中在SacII的位置IRDIG27501與IRDIG27642係彼此連接。

IRDIG27501與IRDIG27642的核酸序列係通過BLAST、針對陶氏農業科學公司的內部B.t.基因體序列資料庫進行檢索。IRDIG27501的檢索並未回報任何顯著的結果，最近的鄰近序列只有32%的胺基酸序列一致性。然而，IRDIG27642的檢索回報了許多顯著結果，與廣泛範圍的胺基酸序列有100%至40%的一致性。這些結果係稱為IRDIG27642的同源物。

編碼這些同源殺蟲蛋白的核酸係從不同的B.t.菌株分離。聚合酶鏈反應(PCR)之正向及反向引子係經設計且用於擴增編碼全長殺蟲蛋白之核苷酸序列(表4)。擴增的片段係經再選殖到蛋白表現載體骨架之中。針對NCBI、Pfam及GenomeQuest資料庫進行這些基因序列的BLAST研究並未回報出任何有重大意義的結果。這些序列檢索結果表明這些基因在所有已知的蛋白序列中是新穎的。

使用標準選殖方法構築經基因工程改造以產生由天然或植物最佳化編碼區域編碼之全長殺蟲蛋白毒素的螢光假單胞菌(Pf)表現質體。限 制性內切核酸酶自New England BioLabs(NEB；Ipswich,MA)獲得，而T4 DNA接合酶(NEB；Ipswich,MA)係用於DNA接合。在瓊脂糖Tris-乙酸鹽凝膠電泳之後，使用QIAquick^®凝膠萃取試劑組(Qiagen公司，Venio,Limburg)純化DNA片段。使用NucleoSpin®質體製備試劑組(Macherey-Nagel公司，Bethlehem,PA)，按照供應商對於低度複製質體純化的說明書進行質體製備，或使用Qiagen Plasmid Plus Midi試劑組^®(Qiagen公司，Hilden,Germany)製備。

全部的殺蟲蛋白係經系統發育分析，並選擇非冗餘的代表性蛋白進行WCR活性效驗。獨特的代表性殺蟲蛋白之開放讀取框架(ORF)係經鑑別。這些ORF係使用分離自含有目標殺蟲蛋白之野生型B.t.菌株之基因組DNA做為模板，並使用列於表4中的引子而通過PCR擴增。

所得到的IRDIG27501與IRDIG27642 PCR產物並不具有自己的啟動子及終止子，但在ATG起始密碼子之前係具有其天然的核糖體結合位點(RBS)序列AGGAGA(對於IRDIG27501)與AGGAGT(對於IRDIG27642)。該等PCR產物係分別被選殖到pDAB116687及pDAB116693內的SpeI/XhoI位置，因而產生pDAB121089及pDAB121093。跟隨標準的實驗方案對該接合反應物進行轉形。將此DNA/細胞混合物轉移到一個冷卻在冰上之預標記的Bio-rad 0.2cM電穿孔透光管。乾燥該透光管並以Bio-Rad Gene Pulser Xcell電穿孔儀並使用預設的綠膿桿菌設定而施以脈衝(2.25kV/cm,25μF及200Ω)。將該透光管放回冰上，轉移到層流櫃內，以SOC培養液稀釋，並剔除在一個補充有20μg/ml四環素的LB平盤上。將該平盤放置在28℃下過夜。挑選單個的菌落以通過限制酶酶切反應及定序來進行每個Mini Prep、插入檢查及構築體驗證的試驗。

將兩個在2.5-L超高產量燒瓶中的500mL生成培養物培養液用來進行蛋白質的表現。將兩個1-mL的DPf45284或DPf45134甘油儲備液添加到每一個含有培養液之經高溫滅菌的燒瓶內，且該等燒瓶係在30℃下以300rpm搖動24小時進行培養。在生長24小時之後，取0.5mL的樣本讀取OD₆₀₀值並預誘導培養樣本。添加一滴消泡劑204(Sigma,A8311-50ML)至每個燒瓶，並以IPTG誘導蛋白質的表現。將培養物放回振盪器再搖動48 小時。每24小時從每個燒瓶抽出半毫升的樣本以再進行蛋白質表現分析並讀取OD₆₀₀值。

這些樣本及預誘導的樣本係重新懸浮於具有0.1mm玻璃珠的500μL BugBuster^® Master Mix內。該等懸浮物係在室溫下搖動30分鐘進行培養，接著使用Geno/Grinder 2010以1750rpm溶解細胞3分鐘。該等樣本係經離心，並分離可溶與不可溶的部分。藉由添加0.5mL的萃取緩衝液(8M urea,0.5M NaCl,25mM NaPO₄,pH 10.4)來溶解不可溶的部分。該等部分係皆經由SDS-PAGE，使用NuPAGE^® Novex^® Tris-Glycine 4-20% Midi膠體在1X Tris-Glycine SDS running buffer(Invitrogen)中跑膠而進行蛋白質表現的分析。將該等樣本與25μL的6X Tris-Glycine SDS樣本緩衝液(Invitrogen)及1μL的1M DTT混合。以200V跑膠60分鐘，並接著以SimplyBlue^TM SafeStain(Life Technologies,LC6060)進行染色。在染色之後，將該膠體置入水中。為了評估表現的程度，使用GE Image Scanner III(GE Healthcare公司)來執行光密度測定分析。標準曲線係藉由在每個泳道裝填0.2、0.5、1.5、3.0及6.0μg的牛血清蛋白(BSA)而產生。使用ImageQuant TL software(GE Healthcare公司)偵測蛋白質條帶並定量。

實例3 植物密碼子最佳化的殺蟲毒素基因之設計

熟習植物分子生物學之技術者應理解，多個DNA序列可經設計以編碼單個胺基酸序列。增加所關注蛋白質之編碼區表現的常見手段為以一定方式定製編碼區使其密碼子組成類似於預定表現基因之宿主的整體密碼子組成。關於合成基因設計及產生之指導可見於例如WO1997013402、美國專利第6166302號及美國專利第5380831號中。

設計且合成具有玉米密碼子傾向之DNA序列以在基因轉殖單子葉植物中產生殺蟲蛋白。玉米(Zea mays L.)之密碼子使用表由自GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov)中寄存之序列獲得的數百種蛋白質編碼序列計算得到。在省略使用少於該胺基酸所用總密碼子之約10%的任何同義密碼子之後，計算重新調整之玉米密碼子集合。

對序列進行進一步改進以消除不當限制酶識別位點、可能存在的植物內含子剪接位點、A/T或C/G殘基之長期使用及可能干擾植物細胞編碼區之mRNA穩定性、轉錄或轉譯的其他基元。進行其他變化以引入所需限制酶識別位點且消除長的內部開放閱讀框架(除+1以外的框架)。此等變化全部在保留玉米偏向之重新調整的密碼子組成的限制內進行。編碼殺蟲毒素之玉米最佳化DNA序列係揭示為SEQ ID NO：61、62、64、65、67、69、70、72、73及75。

上文提供了若干根據本發明之經分離聚核苷酸的實施例，包含密碼子最佳化的聚核苷酸供表現本發明之殺蟲毒素多肽。

實例4 在細菌宿主中之編碼殺蟲蛋白毒素的表現質體之構築

使用標準選殖方法構築經基因工程改造以產生由天然或玉米最佳化的編碼序列所編碼之殺蟲毒素蛋白的螢光假單胞菌(Pf)表現質體。限制性內切核酸酶自New England BioLabs(NEB；Ipswich,MA)獲得，而T4 DNA接合酶(Invitrogen)用於DNA接合。使用NucleoSpin^®質體試劑組(Macherey-Nagel Inc,Bethlehem,PA)，按照供應商說明書進行質體製備。在瓊脂糖Tris-乙酸鹽凝膠電泳之後，使用QIAQUICK凝膠萃取試劑組(Qiagen)純化DNA片段。線性化載體係以南極磷酸酶(NEB)進行處理以增強重組分子之形成。

所產生之缺少天然調節元件序列的PCR產物係經分別選殖到pDAB122775(用以於B.t.宿主4Q7中表現)及pDOW1169(用以於Pf宿主中表現)內。使用於B.t.及Pf系統的選殖位點為XbaI/XhoI或SpeI/XhoI。 B.t.表現載體pDAB122775係包含一個Cry1Ac結晶蛋白基因起動子(在B.t.細胞孢子形成期間表現)、核糖體結合位點(RBS)及Cry1Ac終止子，而在pDOW1169中這些目標基因的表現係由Ptac啟動子及IPTG的誘導所驅動。pDOW1169係為一種低度複製質體，其具有RSF1010複製起點、pyrF基因、及在該限制酵素酶識別位點前的核糖體結合位點，其中含有蛋白編碼區域之DNA片段可能引入至該限制酶識別位點內(美國專利第7618799號)。若未在B.t.或Pf中表現，其係被選殖到E.coli表現載體內，諸如在SpeI/XhoI位點的pET280(Kan)。構築體係使用本領域中眾所周知的標準分子選殖程序而產生。

表現質體(pDAB121093、127479、127480、127481、127482、127484、127485、127486、127487、127488、127489、127490、127491)係藉由電穿孔而轉形至DC454(具有△pyrF及lsc：：lacIQI突變之近似野生型螢光假單胞菌菌株)或其衍生物中，在SOC-大豆水解產物培養基中回復，且塗覆在選擇性培養基(缺少尿嘧啶的M9葡萄糖瓊脂，Sambrook等人，見上文)上。

這些殺蟲蛋白的蛋白表現實驗係先在4Q7 B.t.宿主中執行，接著在DPf10 Pf宿主中執行。簡言之，重組B.t.培養物係於250-ml三角燒瓶中在28℃/180-200rpm下，生長在50ml之陶氏農業科學公司專有的培養液中歷時24-32小時。結晶與內孢子的混合物係在4℃下以6,000g離心15分鐘而收集，隨後以10ml的1M NaCl與0.1% Triton X-100溶液清洗，接著以35ml的去離子水清洗。將最終的沉澱物再懸浮於2ml的去離子水以用於WCR攝食試驗。以空載體pDAB122775轉形的B.t.4Q7係被包含在內以做為陰性對造組。

轉形及選擇的方法一般可由美國專利申請案第20060008877號、美國專利第7681799號及美國專利申請案第20080058262號中所描述者 而獲得，其係引用的方式併入本文中。重組菌落係藉由小量製備質體DNA之限制酶分解來鑑別。

實例5 殺蟲蛋白樣本的製備

用於表徵及昆蟲生物試驗之殺蟲蛋白的生產係藉由搖瓶生長之含有表現構築體菌株DPf46314、48284、48285、48286、48287、48289、48290、48291、48292、48293、48294、48295、48296之螢光假單胞菌菌株來完成。經儲存的菌株甘油儲液係用來接種成分確定之具有9.5%甘油(Teknova Catalog No.3D7426,Hollister,CA)的培養基。於30℃震盪下開始培養24小時之後，藉由添加異丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)來誘導殺蟲基因的表現。在誘導時及在誘導後之多個時間對培養物進行取樣。藉由在600nm之光密度(OD₆₀₀)來量測細胞密度。亦可利用適用於螢光假單胞菌生長之其他培養基，例如，如美國專利申請案第20060008877號所述。誘導前及誘導後的樣本係經分析其於BugBuster^®裂解及萃取步驟之後，在細胞可溶片段及不可溶片段中的目標蛋白表現。為了評估表現的程度，使用GE Image Scanner III(GE Healthcare公司)來執行光密度測定分析。使用ImageQuant TL software(GE Healthcare公司)並以BSA做為標準曲線來偵測並定量蛋白質條帶。殺蟲蛋白係累積於經裂解細胞之不可溶片段中而當做為包含體(IB)。細胞被瞬間凍結在液態氮中並儲存於-80℃。

製備殺蟲蛋白的包含體(IB)。 表現全長殺蟲蛋白之Pf衍生細胞糊狀物係從-80℃儲存環境轉移至室溫。取出每一者約10g並於冷的裂解緩衝液(40mL之50mM Tris、200mM NaCl、10%甘油、0.5% Triton X-100、20mM EDTA、1mM DTT，pH 7.5)中再懸浮至20% w/v。經再懸浮的沉澱物係於室溫下培養，同時與0.4mg/ml的溶菌酶振動20分鐘。之後加入0.1mg/mL的DNA水解酶與0.1M的MgCl₂，並進一步於30℃下培養在水 浴槽中20分鐘。該等樣本係使用Branson超音波儀進行超音波處理1分鐘(工作循環-60、輸出控制4)，隨後於JA-17轉子中以16,000rpm離心30分鐘。於具有金屬珠之20% w/v冷的溶胞緩衝液中使沉澱物額外再懸浮兩次。最後的兩次清洗係使用不含triton-x-100的裂解緩衝液實施，其上清液為無色且IB沉澱物變得結實且呈灰白色。將包含體再懸浮於含有10mM EDTA之pH 8.0的無菌過濾蒸餾水，等分為1.5mL並於需要時冷凍於-80℃。

包含體溶解。包含體係在室溫下於水浴中解凍。包含體被導入10mL的0.1M CAPS(pH 11)中，隨後以輸出控制4、工作循環40%進行超音波處理1分鐘。溶解的蛋白係於JA-17轉子中以16,000rpm離心20分鐘。樣本係以15mL的Amicon 3K MWCO濃縮以得到約2mL的最終體積，並藉由添加18mL的10mM CAPS(pH 11)進行緩衝液交換並將其濃縮至2mL。其次是在PD10管柱(已先使用10mM CAPS(pH 11)平衡過)除去鹽分。

自IB製備所純化的殺蟲蛋白係藉由SDS-PAGE分析。分子量係由胺基酸序列所判定。於如所期待的~21.1kDa位置測到一個條帶，且經MALDI及N端定序鑑定為IRDIG27642。藉由將條帶的光密度值與在同一凝膠上移動而產生標準曲線之牛血清白蛋白(BSA)樣本進行比較而完成目標條帶的定量。

上文提供了經分離的聚核苷酸，包含根據本發明之核酸構築體與經分離的殺蟲多肽。

IRDIG27642及其同源物的純化。包含體的製備與溶解係如先前對於其同源物所述般進行。以1mL/min的速度將上清液裝填至一個以緩衝液A(50mM CAPS,pH 11)預平衡的5mL HiTrap Q HP管柱上。藉由從0至100%增加緩衝液B(50mM CAPS,pH 11,1M NaCl)的濃度而以一個梯度將該蛋白質溶析出超過200mL。該等流份的SDS-PAGE分析係於一個4-20% Tris-glycine膠體上執行，在1x Tris/Glycine/SDS緩衝液中跑膠，且以GelCode Blue染色試劑對該膠體進行染色，並以水使膠體脫色。全部含有目標物的流份係藉SDS-PAGE分析來鑑定並經濃縮。使用Bradford試劑來判定全部的蛋白質，且使用光密度測定法來判定目標蛋白的濃度。

IRDIG27501的純化。IRDIG27501並未形成包含體並純化自可溶蛋白質。取出約50g的pf細胞漿並重新懸浮於20% w/v(50mM Tris,0.2M NaCl,10% glycerol,20mM ETDA,4mM Benzamidine,1mM DTT,0.2% CHAPS,pH 7.5)且具有0.25mg/mL溶菌酶之冷的溶胞緩衝液。經重新懸浮的沉澱物係培養在室溫下同時震動20分鐘。隨後加入0.1mg/mL的DNA水解酶與0.1M的MgCl₂，並進一步於30℃下在水浴槽中培養20分鐘。該樣本係使用Branson超音波儀進行超音波震盪兩次每次2分鐘(30%工作循環、輸出控制-4)，隨後於JA-17轉子中以31,000g離心30分鐘。保存上清液以在丟棄前通過SDS-PAGE進行目標蛋白分析。於具有金屬珠之20% w/v冷的溶胞緩衝液中使沉澱物額外再懸浮兩次。將沉澱物溶解於4℃的0.1M CAPS緩衝液(pH 11)中且攪拌一小時，隨後以31,000g離心30分鐘。

以1mL/min的速度將上清液裝填至一個以緩衝液A(50mM CAPS,pH 11)預平衡的5mL HiTrap Q HP管柱上。藉由從0至100%增加緩衝液B(50mM CAPS,pH 11,1M NaCl)的濃度而以一個梯度將該蛋白質溶析出超過200mL。該等流份的SDS-PAGE分析係於一個4-20% Tris-glycine膠體上執行，在1x Tris/Glycine/SDS緩衝液中跑膠，且以GelCode Blue染色試劑對該膠體進行染色，並以水使膠體脫色。全部含有目標物的流份係藉由添加固態的硫酸銨以得到30%的最終濃度，隨後在4℃下培養30分鐘，並在JA-17轉子中以31,000g離心30分鐘。

來自於硫酸銨沉澱之在10mM CAPS緩衝液(pH 11)中重新懸浮的上清液係以Amicon旋轉濃縮器(3kDa MWCO)濃縮至~25ml，接著以1ml/min的速度注入Superdex 75管柱(XK26/100,~450ml柱床體積)。全部含 有該目標蛋白的流份係藉SDS-PAGE分析來鑑定並經濃縮。使用Bradford試劑來判定全部的蛋白質，且使用光密度測定法來判定目標蛋白的濃度。

實例6 蛋白的殺蟲活性

殺蟲蛋白係經測試且被發現對鞘翅目昆蟲西方玉米根蟲(西方玉米根螢葉甲)的幼蟲具有殺蟲活性。

實驗昆蟲為西方玉米根蟲(WCR)一齡蟲(孵化後不到24小時)，西方玉米根螢葉甲。非滯育的西方玉米根螢葉甲蟲卵(Crop Characteristics公司，Farmington,MN)係於28℃及60% RH下培養10天。依據Pleau等人(2002)的方法以10%福馬林對黑頭蟲卵進行表面消毒。鱗翅目實驗昆蟲包括秋天行軍蟲(FAW)、草地貪夜蛾(J.E.Smith)、玉米穗蟲(CEW)、玉米夜蛾(Boddie)、歐洲玉米螟(ECB)、玉米螟(Hübner)、大豆夜蛾(SBL)、黃豆銀紋夜蛾(Chrysodeixis includens)。IRDIG27501結合IRDIG27642並未對這些鱗翅目害蟲造成顯著的實際死亡或生長抑制。

使用48孔的WCR生物試驗形式進行蛋白生物試驗。在48孔滴定盤進行覆蓋食物生物試驗，每個孔係含有0.75ml的人造陶氏農業科學公司專有的WCR食物。每一個試驗等分試樣係以每孔40μL抽吸到8孔的食物表面上(0.95cm²)，並在室溫下於層流通風櫥內乾燥。以兩隻玉米根螢葉甲剛孵化幼蟲(24-48小時大)侵擾每孔中經處理過的食物表面，以用於微滴定盤(USA Scientific公司，Orlando,FL)的Breathe Easy^®透氣密封膜將試驗昆蟲封閉在生物試驗場所。陰性對照組為20mM檸檬酸鈉緩衝液，pH 3.5；10mM CAPS緩衝液，pH 11；陽性對照組為100μg/cm² Cry34/35Ab1檸檬酸鈉緩衝液。

將生物試驗托盤保持在受控制的環境條件(28℃、60%相對溼度、16：8小時光照/黑暗)下5天。記錄全部的昆蟲試驗中之暴露於每種蛋白質樣本的昆蟲總數、死亡昆蟲數目、及存活昆蟲的重量。經秤重為0.1 mg或更輕的幼蟲係被視為瀕死的昆蟲且包含在實際死亡百分比的計算之中。生長抑制作用係如下計算：GI=[1-(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]其中，TWIT為處理中的昆蟲總重量，TNIT為處理中的昆蟲總數目，TWIBC為背景檢核(緩衝液對照組)中的昆蟲總重量，而TNIBC為背景檢核(緩衝液對照組)中的昆蟲總數目。生物試驗係以每次重複16隻玉米根螢葉甲幼蟲、在隨機完全區組設計與重複至少四次的情況下進行。以ANOVA及使用Tukey HSD的平均值分離分析數據(P>0.05)。執行劑量反應分析。使用非線性邏輯三種參數模式判定生長抑制濃度-回應曲線，並評估造成50%生長抑制(GI₅₀)的所需有效濃度。這些分析係使用JMP Pro 9.0.3版的軟體(SAS Institute Inc.,Cary,NC)執行。使用POLO-PC(LeOra軟體)來進行併合的實際死亡率數據的Probit分析，以估計濃度-回應曲線的50%致死濃度(LC₅₀)。

兩種由DBt12172結晶製品(結晶與孢子混合物)鑑定之候選殺蟲蛋白IRDIG27501與IRDIG27642係單獨於一個B.t.主中表現，且也結合於其中表現。此外，IRDIG27501也在一個Pf宿主中有表現。來自於B.t.宿主表現系統的結晶製品以及有IRDIG27501表現之重組Pf的溶胞產物係經單獨地及結合地測試WCR活性，如表5所示。表5顯示IRDIG27501與IRDIG27642的結晶製品在單獨測定時並未展現出明顯的WCR活性；然而，IRDIG27501與IRDIG27642的結合在手動混合的樣本或在共同表現的樣本中係顯示出明顯的WCR活性。

衍生自野生型DBt12172以及表現有由此B.t.菌株所鑑定出的候選蛋白IRDIG27501與27642之重組B.t.培養物的結晶製品WCR達成率係顯示於Table 5中。達成係以視覺評分並定義為死亡的昆蟲或者是與陰性對照組相比具有等於或大於50%之生長抑制的存活昆蟲。達成率係基於總達成量除以全部昆蟲測試數量來計算。

IRDIG27642同源蛋白的WCR殺蟲活性係使用表現在Pf或E.coli中的經純化蛋白樣本，而進一步單獨地測試及與IRDIG27501結合測試。該生物測定數據顯示，大多數的IRDIG27642同源物在實際死亡或生長抑制方面(表6)係單獨顯示出顯著WCR活性(表6)，且其WCR活性於與IRDIG27501混合時係明顯增加(表7)。IRDIG27501與IRDIG28686、IRDIG28682、IRDIG28688、IRDIG28684、IRDIG28674、IRDIG28692、IRDIG28672及IRDIG28680之混合物的功效及生長抑制情形係與陽性控制組Cry34/35Ab1相當(表7)。全部的同源物與IRDIG27501混合物係判定出顯著的生長抑制情形。表8及9提供了添加IRDIG27501至IRDIG27642同源物會分別顯著增加實際死亡百分比及生長抑制百分比1.3-17.3倍及1.2-4.9倍的證據。

IRDIG27642及IRDIG28686係於一系列自2.6至168μg/cm²的濃度範圍中進行試驗，且由此產生的WCR活性提供了足夠的數據供劑量反應分析(表10及11)。在21、42、84及168μg/cm²的劑量下，IRDIG28686的實際死亡百分比相對於陰性對照組係有顯著的不同。在10.5、42、84及168μg/cm²劑量下的IRDIG27642，以及在21、42、84及168μg/cm²劑量下的IRDIG28686，係確定有顯著的生長抑制。

IRDIG27642與IRDIG28686係分別在一系列自2.625至168μg/cm²的濃度範圍中與IRDIG27501進行試驗。在這些組合中，每個濃度的雙蛋白係與126μg/cm²的IRDIG27501混合，且因而產生的WCR活性提供了足夠的數據供劑量反應分析(表12、13及14)。在10.5、21、42、84及168μg/cm²的劑量下，IRDIG28686的實際死亡百分比係有顯著的不同。在所有2.625、5.25、10.5、42、84及168μg/cm²的劑量下係確定IRDIG27642與IRDIG28686有顯著的生長抑制。

表12、13及14係顯示在48孔生物試驗形式中殺蟲蛋白對於WCR的劑量反應。

當與表11中這些單獨測試的蛋白的LC₅₀及GI₅₀相比時，添加126μg/cm²的IRDIG27501與IRDIG28686及IRDIG27642結合係分別提供了IRDIG28686或IRDIG276429倍或18倍的效力增加。

實例7 對於具抗性的WCR之蛋白殺蟲活性

殺蟲蛋白係以產自一個經Cry3Bb篩選的WCR品系及一個未經Cry3Bb篩選的WCR品系之幼蟲，以及一個非滯育的WCR控制品系，一起進行生物試驗。非滯育的WCR控制蟲卵(Crop Characteristics公司，Farmington,MN)、經Cry3Bb篩選的WCR蟲卵(Meihls等人，2008及2012)及未經Cry3Bb篩選的WCR蟲卵係以與上述製備48孔生物試驗形式的近似方式處理。未經Cry3Bb篩選的蟲卵係為一個源自Brookings(South Dakota)之未曝光的實驗室種群。

該等處理包含了223個(總計量)皆含有181μg/cm² IRDIG27501.1與42μg/cm² IRDIG27642.1之DBt12172_00709 B.t.培養物的結晶/孢子混合物。一個B.t.宿主4Q7係包含在內以做為DBt12172_00709的陰性對照組。陽性及陰性對照組分別為100μg/cm² Cry34/35Ab1及20mM檸檬酸鈉(pH3.5)緩衝液。300μg/cm²的經截斷Cry3Aa蛋白係包含在內以提供經Cry3Bb篩選及未經Cry3Bb篩選之WCR的抗性程度示度。10mM CAPS(pH 10.5)緩衝液係包含在內以做為經截斷Cry3Aa蛋白的緩衝液陰性對照組。

該等結果(表15)表明了該等二元IRDIG27501/27642蛋白對於經Cry3Bb篩選的WCR剛孵化幼蟲提供了33.1%的實際死亡及71.8%的生長抑制。與經Cry3Bb篩選的及未經Cry3Bb篩選的品系相比以及與非滯育的WCR對照品系相比(死亡百分比及生長的抑制分別在9-33%及66-72%)，WCR幼蟲對於此二原蛋白的感受性並未有顯著的不同。這些數據暗示了該二元蛋白IRDIG27501/27642與Cry3Bb蛋白相比係具有不同的作用模式。未經Cry3Bb篩選的品系對於mCry3Aa有點不太敏感，且此觀察與Zukoff等人(2015)呈現的結果一致。

計算實際死亡(死亡的加上垂死的昆蟲)及生長抑制百分比。控制死亡率不應超過20%。在完全隨機的設計下以每次重複16隻玉米根螢葉甲幼蟲進行生物試驗並重複3-4次。實際死亡及生長抑制百分比係藉由使用Tukey-Kramer HSD檢定而以單因子變異數分析(ANOVA)及平均值分離進行分析(P>0.05)。

實例8 WCR中腸流體玉米根汁之蛋白質處理

中腸流體的收集。約150隻西方玉米根蟲(WCR)三齡幼蟲係購自Crop Characteristics公司。該等昆蟲係與玉米根一起運送。在光學顯微鏡下使用解剖刀移除幼蟲的後端及前端。使用鑷子拉出腸管並存放於緩衝液(含有8.5%的蔗糖之0.15M NaCl過濾無菌緩衝液)內並保持在冰上。

藉由WCR中腸流體分解蛋白質的步驟。西方玉米根蟲 (WCR)之活性蛋白穩定性是在有12μg的WCR腸汁的存在下進行分析，以判定可能的裂解(活化或非活化)位點。由假單胞菌表現及純化後的蛋白係與WCR腸汁(或萃取物)於30℃下一起培養20小時。依據蛋白酶活性測試而選出WCR的濃度與7.5的pH值(由10X儲液稀釋成最終濃度50mM Tris pH 7.5,0.15M KCl,0.015M CaCl₂)。

添加蛋白酶抑制劑以停止反應。接著將30μl的反應溶液與10μl的LDS緩衝液(10mM TCEP)混合，並使用MES電泳緩衝液裝填到4-12% PAGE凝膠上。結果表明憑藉WCR及玉米根萃取物(MRE)係有顯著量的WCR活性進行。轉印相同的凝膠以藉由Edman N端定序法及完整的MS分析來識別裂解基序。核心蛋白係接著表現在E.coli中以進行WCR活性測試及其它的定性。

藉由玉米根汁分解蛋白質的步驟

由重組E.coli表現與純化之100ug/cm²的殺蟲IRDIG27642核心蛋白係依據實例5所述48孔形式的生物試驗方法，經單獨測試以及與IRDIG27501結合測試其對於WCR的結果。

實例9 農桿菌轉形

使用標準選殖方法構築二元植物轉形及表現質體。自NEB獲得限制性內切核酸酶及T4 DNA接合酶。使用NucleoSpin^®質體製備試劑組或NucleoBond^®AX Xtra Midi試劑組(均來自Macherey-Nagel)，按照製造商說明書進行質體製備。在凝膠分離之後，使用QIAquick PCR純化試劑組或QIAEX II凝膠萃取試劑組(均來自Qiagen)純化DNA片段。

包括有編碼殺蟲蛋白之核苷酸序列的DNA係由供應商(例如DNA2.0,Menlo Park,CA)合成且做為選殖片段供應在質體載體中。編碼其他殺蟲蛋白之其他DNA序列係藉由含有適當核苷酸序列之構築體的標準分子生物學操作而獲得。

將殺蟲蛋白之全長或經修飾編碼序列(CDS)在適當位點處再選 殖至植物表現質體中。利用(例如)Gateway^®技術或標準限制酶片段選殖程序，將在植物表現元件(例如，植物可表現啟動子、3'端轉錄終止及聚腺苷酸添加決定子及其類似物)的控制下之含有適當編碼區域的所得植物表現卡匣再選殖至二元載體質體中。例如，若採用Gateway^®技術，則LR Clonase^TM(Invitrogen)可使用於將全長及經修飾基因植物表現卡匣重組到二元植物轉形質體中。當質體存在於大腸桿菌及農桿菌細胞中時，二元植物轉形載體包含了一個賦予對抗生素觀黴素的抗性之細菌可選標記基因。二元載體質體亦包含在所需宿主植物中起作用之植物可表現與可選擇的標記基因，亦即編碼對抗生素卡那黴素、新黴素及G418有抗性的轉位子Tn5之胺基配醣體磷酸轉移酶基因(aphII)。

製備根癌農桿菌菌株Z707S(Z707之鏈黴素抗性衍生物)之電勝任細胞並使用電穿孔轉形(Weigel及Glazebrook,2002)。在電穿孔之後，將1mL的YEP培養液(gm/L：酵母萃取物，10；蛋白腖，10；NaCl,5)添加至光析管中，並將細胞-YEP懸浮液轉移至15mL培養管，在28℃下於水浴中恆定攪拌培養4小時。將細胞塗覆在具有觀黴素(200μg/mL)及鏈黴素(250μg/mL)之YEP+瓊脂(25gm/L)上，且將培養盤在28℃下培養2-4天。選擇完全分離之單個菌落，於具有觀黴素及鏈黴素之新鮮YEP+瓊脂培養盤上劃線，並在28℃下培養1-3天。

藉由使用載體特異性引子與由經選擇之農桿菌菌落製備之模板質體DNA的PCR分析證實了二元植物轉形載體中存在有殺蟲毒素基因插入物。使用Qiagen Spin Mini Preps按照製造商說明書自如前所述在具有觀黴素及鏈黴素之YEP中生長之15mL隔夜培養物的4mL等分試樣萃取細胞沉澱物。來自用於農桿菌電穿孔轉形之二元載體的質體DNA係包含在內以作為對照組。使用來自Invitrogen之Taq DNA聚合酶，按照製造商說明書在0.5X濃度下完成PCR反應。PCR反應係於經以下列條件程式化之MJ Research Peltier熱循環儀中進行：步驟1)94℃，3分鐘；步驟2)94℃，45秒；步驟3)55℃，30秒；步驟4)72℃，每kb預期產物長度設為1分鐘；步 驟5)返回步驟2，29次；步驟6)72℃，10分鐘。反應在循環之後係維持在4℃下。擴增產物係藉由瓊脂糖凝膠電泳(例如，0.7%至1%瓊脂糖，w/v)分析並藉由溴化乙菲錠染色而目測。選擇PCR產物與質體對照組一致的菌落。

另一個含有殺蟲毒素基因插入物的二元植物轉形載體係根據熟習農桿菌操作領域中之技術者熟知的標準分子生物學方法，藉由對從候選農桿菌分離株所製備的質體DNA進行限制性消化物指紋圖譜定位而執行。

上文揭露了包括有編碼根據本發明之殺蟲毒素多肽的聚核苷酸之核酸構築體。

實例10 在雙子葉植物中產生殺蟲毒素

阿拉伯芥的轉形。阿拉伯芥Col-01係使用浸花法轉形(Weigel及Glazebrook,2002)。使用經選擇之農桿菌菌落接種1mL至15mL含有用於選擇之適當抗生素之YEP培養液的培養物。培養物係於28℃在220rpm恆定攪拌下培養隔夜。使用每一培養物接種兩份500mL含有用於選擇之適當抗生素之YEP培養液的培養物，且新培養物於28℃在恆定攪拌下培養隔夜。細胞在室溫下以大約8700 x g集結10分鐘，且棄去所得到的上清液。將細胞沉澱物溫和地再懸浮於500mL滲透培養基中，所述培養基含有：1/2x Murashige及Skoog鹽(Sigma-Aldrich)/Gamborg's B5維生素(Gold BioTechnology,St.Louis,MO),10%(w/v)蔗糖，0.044μM苯甲基胺基嘌呤(10μL/公升之在DMSO中的1mg/mL儲液)以及300μL/公升之Silwet L-77。將大致1月齡之植物浸入培養基中15秒，小心確保淹沒最新的花序。接著，將植物側放且覆蓋(透明或不透明)24小時，用水洗滌並豎放。植物於22℃下在16小時光照/8小時黑暗之光週期下生長。在浸漬大約4週後收成種子。

阿拉伯芥的生長及選擇。使新鮮採收之T1種子在乾燥劑存在下於室溫乾燥至少7天。將種子懸浮於0.1%瓊脂/水(Sigma-Aldrich)溶液中 且隨後在4℃下分層2天。為準備種植，將10.5吋x 21吋發芽托盤(T.O.Plastics公司，Clearwater,MN)中之Sunshine Mix LP5(Sun Gro Horticulture公司，Bellevue,WA)以細蛭石覆蓋，用霍格蘭(Hoagland)氏溶液分灌直至濕潤為止，接著允許排水24小時。將分層種子播種於蛭石上且用濕蓋(KORD Products,Bramalea,Ontario,Canada)覆蓋7天。在120-150μmol/m²sec的光強度之長日照條件(16小時光照/8小時黑暗)以及恆定溫度(22℃)與濕度(40-50%)下，於Conviron^TM生長箱(型號CMP4030或CMP3244；Controlled Environments Limited,Winnipeg,Manitoba,Canada)中讓種子發芽與植物生長。植物起初係以霍格蘭氏溶液澆水且隨後以去離子水澆水，以保持土壤濕潤但不潮濕。

播種後5-6天移除蓋子且向植物噴灑化學選擇劑，以殺死由未轉形種子發芽之植物。例如，若由二元植物轉形載體提供之植物可表現與可選標記的基因為bar基因，則經轉形植物可藉由噴灑Finale(5.78%草銨膦銨，Farnam Companies公司，Phoenix,AZ.)之1000X溶液來篩選。間隔5-7天進行兩次後續噴灑。在最終噴灑之後的7-10天鑑別存活植物(活躍生長的植物)且移栽至以Sunshine Mix LP5製備的盆中。經移栽的植物係以濕蓋覆蓋3-4天，並置於上述生長條件下之Conviron^TM生長箱中。

熟習雙子葉植物轉形之技術者應理解，當使用其他植物可表現與可選標記的基因(例如，耐除草劑基因)時，可用其他篩選轉形植物的方法。

基因轉殖之阿拉伯芥的昆蟲生物分析。表現殺蟲毒素蛋白之基因轉殖阿拉伯芥植株在人工食物覆蓋試驗中係展現出針對敏感昆蟲物種之活性。自基因轉殖及非基因轉殖阿拉伯芥植株萃取之蛋白質係藉由適當方法定量且調節樣本體積以使蛋白質濃度歸一化。在如上述之人工食物上進行生物試驗。非基因轉殖阿拉伯芥及/或緩衝液及水係被包含在試驗中以做為背景檢查處理。

上文提供了製造及使用包括有根據本發明之殺蟲毒素多肽的基 因轉殖植物之方法。

實例11 在單子葉植物中產生殺蟲毒素

農桿菌介導之玉米轉形。於農桿菌介導的轉形之後，透過穩定整合至植物基因組的嵌合基因之表現，產生出會產生一或多種殺蟲蛋白之基因轉殖玉米細胞、組織及植物。採用二元轉形載體之玉米轉形方法在本技術領域中係為已知的，例如美國專利第8,304,604號中所描述者，其全文細以引用方式併入本文中。轉形組織係藉由其在含有合氯氟(Haloxyfop)的培養基上生長的能力來選擇，且適當地針對蛋白質的產生來進行篩選。可將一部分這樣的轉形組織培養物提供給昆蟲幼蟲以用於生物試驗，基本上如實例5中所述。

農桿菌培養的起始。含有項目載體的農桿菌宿主菌株DAt13192(缺少RecA的三元菌株)之甘油儲液係獲自DAS重組培養物保存中心(RCC)。將農桿菌培養物由甘油儲液劃線接種到AB基本培養基上，並在黑暗中於20℃下培養3天。接著將農桿菌培養物劃線接種於YEP培養基平盤上並在黑暗中於20℃下培養1天。

在實驗當天，將接種培養基及乙醯丁香酮的混合物製備成適合實驗中的構築體數量的體積。將接種培養基吸移至無菌的拋棄式250mL燒瓶內。將適當體積之配在100%二甲亞碸中的1M乙醯丁香酮儲液添加至含有接種培養基的燒瓶內，使最終的乙醯丁香酮濃度為200μM。

對於每個構築建體，將YEP平盤之1-2個接種環的農桿菌懸浮於無菌拋棄式50mL離心管內之15mL接種培養基/乙醯丁香酮混合物中，並於分光光度計中測量該溶液於600nm的光密度(O.D.₆₀₀)。接著以額外的接種培養基/乙醯丁香酮混合物將懸浮液稀釋至0.25-0.35 O.D.₆₀₀。接著將農桿菌懸浮液的管子水平地放置在設置為約75rpm的平台搖動器上，在室溫下歷時1至4小時後使用。

穗滅菌及胚芽分離。來自玉蜀黍栽培品種B104的穗係於授粉後10-12天採收。採收的穗係經去除外皮並藉由浸入市售漂白劑(Ultra Clorox® Germicidal Bleach公司，6.15%次氯酸鈉)加上兩滴肥皂水的20%溶液中表面滅菌20分鐘，然後在層流通風櫥內以無菌的去離子水清洗三次。將未成熟的合子胚(1.8-2.2mm長)從每個穗上無菌地切下，分裝到一或多個裝有2.0mL的農桿菌懸浮液的微型離心管中，且已添加2μl的10% Break-Thru® S233界面活性劑於其內。

農桿菌共培養。

胚芽分離活動一旦完成，即將含胚芽的管子蓋上並放置在振動平台上5分鐘。接著將管子內容物倒在共培養培養基平盤上，以一無菌的拋棄式吸移管去除液體農桿菌懸浮物，並使用顯微鏡將胚芽的子葉盤面向上而定位。接著蓋上平盤並以3M Micropore膠帶密封，放置在25℃、24小時/天光照、約60μmol m^-2 s^-1的光合作用有效輻射(PAR)之培養箱中。

基因轉殖事例之癒合組織選擇與再生。

在共培養期間之後，將胚芽轉移至休眠培養基。不超過36個胚胎被轉移到各個平盤。將平盤於27℃、24小時/天光照、約50μmol m^-2 s^-1的PAR下培養7-10天。接著將癒合的胚芽轉移至選擇培養基I。不超過18個癒合的胚芽被轉移到各個選擇培養基I平盤。將平盤於27℃、24小時/天光照、約50μmol m^-2 s^-1的PAR下培養7天。接著將癒合的胚芽轉移至選擇培養基II。不超過12個癒合的胚芽被轉移到各個選擇培養基II平盤。將平盤於27℃、24小時/天光照、約50μmol m^-2 s^-1的PAR下培養14天。

在此階段，將具抗性的愈合組織移到預再生培養基。不超過9個愈合組織被移到各個預再生培養基平盤。將平盤保存在27℃、24小時/天光照、約50μmol m^-2 s^-1的PAR下持續7天。再生的愈合組織接著被轉移到Phytatrays^TM(Sigma-Aldrich)之再生培養基，並在28℃、每天16小時亮/8小時暗、約150μmol m^-2 s^-1的PAR下培養7-14天或直到長出芽。每個Phytatray^TM培養基最多放置5個愈合組織。接著將具有初生根的小芽分離並轉移到芽/根培養基。將6公分或更高的生根小植株移植到土壤中，並 移出到生長室中以進行健化。

將藉由其等在含有合氯氟的培養基上生長的能力而選擇之轉形植物芽係由Phytatrays^TM移植至填充有生長培養基(ProMix BX；Premier Tech Horticulture公司)之小盆，以杯子或HUMI-DOMES(Arco Plastics公司)覆蓋，接著在Conviron生長室中進行健化(白天27℃/夜間24℃、16小時光照期、50-70% RH、200μmol m^-2s^-1 PAR)。於一些例子中，推定的基因轉殖小植株係藉由即時定量PCR分析、使用設計用來偵測整合至玉米基因組之除草劑耐受基因的引子、而針對轉殖基因相對複本數進行分析。再者，使用RNA qPCR測定法以偵測推定的轉形體所表現的dsRNAs中之連接子序列的存在。選出的轉形小植株接著被移至溫室內供進一步生長與測試。

在溫室中轉移並建立T ₀ 植物供生物試驗與種子生產。將植物從Phytatrays^TM移植到裝有生長培養基(Premier Tech Horticulture公司，ProMix BX,0581 P)的小盆(T.O.Plastics公司，3.5”SVD,700022C)，並用Humidome覆蓋以使植物適應環境。將植物置於Conviron生長室(28℃/24℃、16小時光照期、50-70% RH、200μmol m^-2 s^-1 PAR)內直到其達到V3-V4期。這可幫助植物適應土壤和更嚴酷的溫度。然後將植物移到溫室(光暴露型：光合或同化；強光限制：1200μmol m^-2 s^-1 PAR；16小時晝長；27℃白天/24℃夜間)，並於昆蟲生物試驗之前從小盆移植到TINUS^TM 350-4 Rootrainers^®(Spencer-Lemaire Industries公司，Acheson,Alberta,Canada)，每個Rootrainer^®中移植每個事例的一株植物。每個構築體的約30個事例係經測試。移植到Rootrainer^®約四天後，所述V3-V4期的植物係被侵擾以進行生物試驗，每株植物係隨時準備孵化150顆西方玉米根蟲卵(Crop Characteristics LLC公司，Farmington,MN)。此生物試驗係於溫室中進行兩周，並接著按照Oleson等人(2005)所推薦且經修改後的方法對每個事例進行分級。

根部損傷評級(修改自Oleson等人，2005)

0.00 無損傷

0.01 只有一些輕微的攝食

0.02 攝食痕跡明顯-非常輕的掘進或溝道&根部沒有被吃掉至莖的4公分內(根部被吃掉至莖的4cm內係被認為是經修剪的根部)

0.05 嚴重的結疤或者當只有整個根部系統的若干根部尖端受傷時

0.10 一個根被修剪

0.25 2-3個根被修剪或¼的根部被修剪

0.50 4-5個根被修剪，在根部系統的外側部分上有相當多的攝食損傷；½的根節被修剪

0.75 6個以上的根被修剪，但在根部系統的外側部分上有廣泛的攝食；¾的根節被修剪

1.00 根部的至少一個完整根節被修剪

近親交配種B104及7SH382的陰性對照組始終給予0.5至1.0的根部評級(高度損傷)。給予0.5或更低單位之根部評級的T₀事例係經儲存並移植到5加侖的盆子內供產生種子。

T₁世代之植物係藉由用從非基因轉殖近親交配品系B104植物或其他適當的花粉供體所收集的花粉與T₀基因轉殖植物的穗絲進行授粉，並種植所得到的種子而獲得。在可能時實施正逆配種。選擇性的T₁事例係依據使用於T₀事例昆蟲生物試驗中的程序來測試其抵抗西方玉米根蟲的根部保護作用。

上文提供了根據本發明之用以製造及再生包括有殺蟲毒素多肽之基因轉殖植物的方法。

葉子採樣以用於西方點墨分析。

萃取方法。植物係於V-3至V-5期進行採樣。將兩份6mm直徑的葉子樣本在96孔簇管架中儲存-80℃直到分析當日。將兩個Daisy^TM鋼質BB以及300μl萃取緩衝液(含有0.05%的Tween 20與5ul/ml的Sigma蛋白酶抑制劑之PBS溶液，產品目錄編號9599)添加至每個管子。將樣本在 Kelco珠研磨機中以最大設置碾磨3分鐘。將樣本以3,000 x g離心5分鐘，且將100μl的上清液轉移至空的樣本管。再添加100μl的萃取緩衝液至植物樣本，再用珠碾磨3分鐘，進行離心且將100μl的此萃取物與第一次的100μl結合。將結合後的上清液混合，並在萃取同一天進行分析。

西方點墨法(定性方法)：利用Invitrogen^TM的裝置與基本試劑來使用習用電泳與轉印方法。陶氏農業科學的抗IRDIG27642兔子抗體為用來偵測葉子組織中的IRDIG27642之一級抗體。全部的蛋白質係以CY-3螢光偵測系統進行偵測。

實例12 基因轉植玉米之生物試驗

自植物細胞產生的殺蟲毒素生物活性係藉由習用生物測定方法(見(例如)Huanget al.，2006)來展現。在功效測定中，在一受控制的飼養環境下將源自產生殺蟲毒素的植物之各種植物組織或植物切片餵食給目標昆蟲。在另一生物活性試驗中，從源自產生殺蟲毒素的植物之各種植物組織製備蛋白質萃取物，且萃取出的蛋白質係併入人工食物生物試驗之中。每個餵食試驗的結果係與以相似方式進行的生物試驗進行比較，所述相似的生物試驗係運用取自不產生殺蟲毒素的宿主植物之合適對照組織或其他對照樣本。

實例13 包括有殺蟲蛋白之基因轉殖大豆(Glycine max)

10至20株懷有包括了殺蟲蛋白的核酸之表現載體之基因轉殖T₀大豆(Glycine max)植物，係藉由農桿菌介導的轉形作用而產生。成熟的大豆(大豆(Glycine max))種子係以氯氣隔夜滅菌十六小時。在氯氣滅菌之後，將種子放置於Laminar^TM層流通風櫥內的開放容器中以驅散氯氣。接著，經滅菌的種子係在24℃下使用黑箱子於黑暗中予以吸收無菌H₂O歷時十六小時。

製備種子裂開的大豆。包括有一部分胚軸之裂開的大豆種子的實驗方案，係需要縱向切開的大豆種子材料，其使用固定在解剖刀的10號刀片沿著種子的臍縱切以分離並去除種皮，並將種子分裂成兩個子葉部 分。小心部分地移除胚軸，其中約1/2-1/3的胚軸仍保持附著於子葉的節端。

接種。接著將包括有一部分胚軸之裂開的大豆種子浸漬在農桿菌(例如，菌株EHA 101或EHA 105)溶液中約30分鐘，且該溶液係含有包括了殺蟲蛋白的二元質體。於浸入包括有胚軸之子葉之前，該農桿菌溶液係經稀釋至λ=0.6 OD₆₅₀的最終濃度。

共培養。在接種之後，使裂開的大豆種子與農桿菌菌株於覆蓋一張濾紙之培養皿中的共培養培養基(Wang,Kan.Agrobacterium Protocols.2.1.New Jersey：Humana Press,2006.Print.)上共培養5天。

芽誘導。在共培養5天之後，將裂開的大豆種子在含有B5鹽類、B5維生素、28mg/L鐵、38mg/L Na₂EDTA、30g/L蔗糖、0.6g/L MES、1.11mg/L BAP、100mg/L TIMENTIN^TM、200mg/L頭孢泰新(cefotaxime)與50mg/L萬古黴素之液體芽誘導(SI)培養基(pH 5.7)中清洗。裂開的大豆種子係接著在含有B5鹽類、B5維生素、7g/L Noble瓊脂、28mg/L鐵、38mg/L Na₂EDTA、30g/L蔗糖、0.6g/L MES、1.11mg/L BAP、50mg/L TIMENTIN^TM、200mg/L頭孢泰新與50mg/L萬古黴素之芽誘導I(SI I)培養基(pH 5.7)上培養，並將子葉的平坦側面向上且子葉的節端埋入培養基內。在培養2週之後，將來自經轉形之裂開的大豆種子的外植體轉移至芽誘導II(SI II)培養基，且所述培養基含有補充了6mg/L草銨膦(Liberty^®)之SI I培養基。

芽伸長。在SI II培養基上培養2週之後，將子葉從外植體移除，並藉由在子葉的基部切一刀而切下含有胚軸之齊平芽墊。將分離自子葉的芽墊轉移到芽伸長(SE)培養基上。該SE培養基係含有MS鹽類、28mg/L鐵、38mg/L Na₂EDTA、30g/L蔗糖與0.6g/L MES、50mg/L天冬醯胺酸、100mg/L L-焦麩胺酸、0.1mg/L IAA、0.5mg/L GA3、1mg/L玉米素核苷)、50mg/L TIMENTIN^TM、200mg/L頭孢泰新、50mg/L萬古黴素、6mg/L草銨膦、7g/L Noble瓊脂，(pH 5.7)。每2週將培養物轉移至新鮮的SE培養基上。培養物係以18小時光照期及在80-90μmol/m²sec的光強度下於24℃的Conviron^TM生長室中生長。

發根。從子葉芽墊發育的伸長芽體係藉由在子葉芽墊的基部處切割該伸長芽體而分離，並將伸長芽體浸入1mg/L IBA(吲哚-3-丁酸)1-3分鐘以促進發根。接著，將伸長芽體轉移至phyta托盤內的發根培養基(MS鹽類、B5維生素、28mg/L鐵、38mg/L Na₂EDTA、20g/L蔗糖及0.59g/L MES、50mg/L天冬醯胺酸、100mg/L L-焦麩胺酸、7g/L Noble瓊脂，pH 5.6)。

培養。在18小時光照期、24℃的Conviron^TM生長室中培養1-2週後，將已經生根的芽轉移至有蓋的聖代杯內的土壤混合物中，並放置到Conviron^TM生長室(型號CMP4030及CMP3244,Controlled Environments Limited公司，Winnipeg,Manitoba,Canada)中、在長日照條件(16小時亮/8小時暗)下以120-150μmol/m²sec的光強度、於恆溫(22℃)與恆濕(40-50%)下使小植株適應環境。生根的小植株在轉移到溫室之前係於聖代杯中適應環境數週，以進一步適應環境並建立強健的基因轉殖大豆植物。

基因轉殖品系的發育與形態特徵係與非轉形植物進行比較。比較植物的根、芽、葉群及生殖特徵。在基因轉殖及非轉形植物之根長度與生長模式中並沒有可觀察到的差異。諸如高度、葉片數及大小，開花時間，花的大小及外觀之植物的芽特徵都是類似的。一般而言，當在活體外及在溫室土壤中培養時，在基因轉殖品系與那些沒有表現IRDIG蛋白者之間並沒有可觀察到的形態差異。

上文提供了根據本發明之用以製造及選擇包括有殺蟲毒素多肽之基因轉殖雙子葉植物(大豆)的方法。

實例14 額外作物品種的轉形

棉花係以殺蟲蛋白轉形(具有或沒有葉綠體轉運肽)，以藉由利用熟習該項技藝者知悉的方法而提供昆蟲的防治，例如，基本上與先前於美國專利案第7,838,733號的實例14、或PCT國際專利公開案第WO 2007/053482號的實例12中所述的相同技術。

文獻目錄

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<120> 殺蟲CRY毒素

<130> 77990

<160> 105

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 357

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 1

<210> 2

<211> 118

<212> PRT

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 2

<210> 3

<211> 555

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 3

<210> 4

<211> 184

<212> PRT

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 4

<210> 5

<211> 555

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 5

<210> 6

<211> 184

<212> PRT

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 6

<210> 7

<211> 555

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 7

<210> 8

<211> 184

<212> PRT

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 8

<210> 9

<211> 624

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 9

<210> 10

<211> 207

<212> PRT

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 10

<210> 11

<211> 333

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 11

<210> 12

<211> 110

<212> PRT

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 12

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<211> 564

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 13

<210> 14

<211> 187

<212> PRT

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 14

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<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

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<213> 蘇雲金芽孢桿菌

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<211> 564

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

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<210> 18

<211> 187

<212> PRT

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 18

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<211> 570

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 19

<210> 20

<211> 189

<212> PRT

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 20

<210> 21

<211> 570

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 21

<210> 22

<211> 189

<212> PRT

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 22

<210> 23

<211> 579

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 23

<210> 24

<211> 192

<212> PRT

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 24

<210> 25

<211> 366

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 25

<210> 26

<211> 121

<212> PRT

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 26

<210> 27

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 27

<210> 28

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 28

<210> 29

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 29

<210> 30

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 30

<210> 31

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 31

<210> 32

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 32

<210> 33

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 33

<210> 34

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 34

<210> 35

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 35

<210> 36

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 36

<210> 37

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 37

<210> 38

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 38

<210> 39

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 39

<210> 40

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 40

<210> 41

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 41

<210> 42

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 42

<210> 43

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 43

<210> 44

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 44

<210> 45

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 45

<210> 46

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 46

<210> 47

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 47

<210> 48

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 48

<210> 49

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 49

<210> 50

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 50

<210> 51

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 51

<210> 52

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 52

<210> 53

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 53

<210> 54

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 54

<210> 55

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 55

<210> 56

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 56

<210> 57

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 57

<210> 58

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 58

<210> 59

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 59

<210> 60

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引子寡核苷酸

<400> 60

<210> 61

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經最佳化的玉米

<400> 61

<210> 62

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經最佳化的玉米

<400> 62

<210> 63

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 自合成的玉米最佳化編碼區域轉譯

<400> 63

<210> 64

<211> 570

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經最佳化的玉米

<400> 64

<210> 65

<211> 570

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經最佳化的玉米

<400> 65

<210> 66

<211> 189

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 自合成的玉米最佳化編碼區域轉譯

<400> 66

<210> 67

<211> 555

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經最佳化的玉米

<400> 67

<210> 68

<211> 184

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 自合成的玉米最佳化編碼區域轉譯

<400> 68

<210> 69

<211> 555

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經最佳化的玉米

<400> 69

<210> 70

<211> 555

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經最佳化的玉米

<400> 70

<210> 71

<211> 184

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 自合成的玉米最佳化編碼區域轉譯

<400> 71

<210> 72

<211> 753

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經最佳化的玉米

<400> 72

<210> 73

<211> 753

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經最佳化的玉米

<400> 73

<210> 74

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 自合成的玉米最佳化編碼區域轉譯

<400> 74

<210> 75

<211> 768

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經最佳化的玉米

<400> 75

<210> 76

<211> 255

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 自合成的玉米最佳化編碼區域轉譯

<400> 76

<210> 77

<211> 981

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合有2A序列的IRDIG27501.2與IRDIG27642.2

<400> 77

<210> 78

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 自合成的融合編碼區域轉譯

<400> 78

<210> 79

<211> 981

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合有2A序列的IRDIG27642.2與IRDIG27501.2

<400> 79

<210> 80

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 自合成的融合編碼區域轉譯

<400> 80

<210> 81

<211> 324

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 81

<210> 82

<211> 107

<212> PRT

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 82

<210> 83

<211> 297

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 83

<210> 84

<211> 98

<212> PRT

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 84

<210> 85

<211> 324

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 85

<210> 86

<211> 107

<212> PRT

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 86

<210> 87

<211> 327

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 87

<210> 88

<211> 108

<212> PRT

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 88

<210> 89

<211> 333

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 89

<210> 90

<211> 333

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 90

<210> 91

<211> 110

<212> PRT

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 91

<210> 92

<211> 333

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 92

<210> 93

<211> 110

<212> PRT

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 93

<210> 94

<211> 333

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 94

<210> 95

<211> 110

<212> PRT

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 95

<210> 96

<211> 324

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 96

<210> 97

<211> 108

<212> PRT

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 97

<210> 98

<211> 342

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 98

<210> 99

<211> 113

<212> PRT

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 99

<210> 100

<211> 333

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 100

<210> 101

<211> 110

<212> PRT

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 101

<210> 102

<211> 348

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 102

<210> 103

<211> 115

<212> PRT

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 103

<210> 104

<211> 273

<212> DNA

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 104

<210> 105

<211> 90

<212> PRT

<213> 蘇雲金芽孢桿菌

<400> 105

Claims (18)

1. 一種防治鞘翅目害蟲之方法，其包括使該鞘翅目害蟲的腸道暴露於一增效蛋白與一毒素蛋白之有效組合。
2. 如請求項1所述之方法，其中該增效蛋白係包括一包括有SEQ ID NO：2之功能性胺基酸序列，且其中該毒素蛋白包括選自由下列所組成之群組之毒素蛋白中的任一者：SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、71、74、76、82、86、88、91、93、95、97、99、101、103及105。
3. 如請求項1所述之方法，其中該增效蛋白為SEQ ID NO：2，且其中該毒素蛋白係選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、71、74、76、82、86、88、91、93、95、97、99、101、103及105。
4. 如請求項1所述之方法，其中該鞘翅目害蟲為西方玉米根蟲(WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte)。
5. 如請求項2所述之方法，其中該鞘翅目害蟲為西方玉米根蟲(WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte)。
6. 如請求項3所述之方法，其中該鞘翅目害蟲為西方玉米根蟲(WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte)。
7. 一種用於表現二元蛋白之核酸構築體，其包括一個非蘇雲金芽孢桿菌所原有的基因調節結構以及一或多個編碼二元毒素的DNA節段。
8. 如請求項7所述之核酸構築體，其中該編碼二元毒素的DNA節段係包括編碼SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、71、74、76、82、86、88、91、93、95、97、99、101、103及105之一或多個DNA序列。
9. 如請求項7所述之核酸構築體，其中該編碼二元毒素的DNA節段係包括選自由下列所組成之群組之一或多個DNA序列：SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13,15、17、19、21、23、25、27、29、61、62、64、65、67、69、70、72、73、75、77及79。
10. 一種基因轉殖植物或植物部分，其包括一編碼一個如請求項7之二元毒素的核酸序列。
11. 一種基因轉殖植物或植物部分，其包括一編碼一個如請求項8之二元毒素的核酸序列。
12. 一種基因轉殖植物或植物部分，其包括一編碼一個如請求項9之二元毒素的核酸序列。
13. 如請求項10所述之植物部分，其中該植物部分為種子。
14. 如請求項11所述之植物部分，其中該植物部分為種子。
15. 如請求項12所述之植物部分，其中該植物部分為種子。
16. 一種用於產生用於產生具鞘翅目耐受性的植物之方法，其包括將一非基因轉殖植物與一包括有外來DNA構築體之基因轉殖植物進行育種，所述外來DNA構築體能夠表現二元毒素，穩定併入到所述鞘翅目耐受性的植物之基因組中，並藉由分析來自該基因轉殖植物之外來DNA構築體的至少一部分來篩選子代。
17. 一種組成物，其包括一經調配之二元毒素，該二元毒素係選自由下列所組成之群組：a. 具有至少70%的序列相同於SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、71、74、76、82、86、88、91、93、95、97、99、101、103及105中之任一者的蛋白毒素； b. 具有至少80%的序列相同於SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、71、74、76、82、86、88、91、93、95、97、99、101、103及105中之任一者的蛋白毒素；c. 具有至少90%的序列相同於SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、71、74、76、82、86、88、91、93、95、97、99、101、103及105中之任一者的蛋白毒素；d. 具有至少95%的序列相同於SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、71、74、76、82、86、88、91、93、95、97、99、101、103及105中之任一者的蛋白毒素；e. 具有至少99%的序列相同於SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、71、74、76、82、86、88、91、93、95、97、99、101、103及105中之任一者的蛋白毒素；以及f. SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、71、74、76、82、86、88、91、93、95、97、99、101、103及105中之毒素蛋白。
18. 如請求項17所述之組成物，其進一步包括一選自由下列所組成之群組的增效蛋白：a. 具有至少70%的序列相同於SEQ ID NO：2的增效蛋白；b. 具有至少80%的序列相同於SEQ ID NO：2的增效蛋白；c. 具有至少90%的序列相同於SEQ ID NO：2的增效蛋白；d. 具有至少95%的序列相同於SEQ ID NO：2的增效蛋白；e. 具有至少99%的序列相同於SEQ ID NO：2的增效蛋白；以及f. 由SEQ ID NO：2所組成的增效蛋白。