定義 除非以其他方式定義，否則本文所使用之技術及科學術語具有與本發明所屬領域中通常所使用相同之含義。出於解釋本說明書之目的，將應用以下定義且只要合適，以單數形式使用之術語亦將包括複數且反之亦然。 如本文所用，術語「抗原結合分子
」在其最廣泛的意義上係指特異性結合抗原決定子之分子。抗原結合分子之實例係抗體、抗體片段及骨架抗原結合蛋白。 如本文所用，術語「能夠特異性結合於 PD1 之 部分
」或「能夠特異性結合於PD1之抗原結合結構域」係指特異性結合於PD1之多肽分子。在一個態樣中，抗原結合部分能夠經由PD1活化信號傳導。在一特定態樣中，抗原結合部分能夠將其所連接之實體(例如TNF家族配位三聚體)導引至目標部位，例如達至特定類型之帶有PD1之腫瘤細胞中或帶有PD1之T細胞上。能夠特異性結合於PD1之部分包括如本文所進一步定義之抗體及其片段。另外，能夠特異性結合於靶細胞抗原之部分包括如本文中所進一步定義之骨架抗原結合蛋白，例如結合域，其係基於經設計之重複蛋白質或經設計之重複域(參見例如WO 2002/020565)。 關於抗體或其片段，術語「能夠特異性結合於靶細胞抗原之部分」係指分子之一部分，其包含特異性結合於一部分或所有抗原且與其互補之區域。可例如藉由一或多個抗體可變域(亦稱為抗體可變區)提供能夠進行特異性抗原結合之部分。特定言之，能夠進行特異性抗原結合之部分包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)。 術語「抗體
」在本文中以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、單特異性及多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其呈現所需抗原結合活性即可。 如本文所用，術語「單株抗體
」係指自實質上均質抗體之群體獲得之抗體，亦即除可能變異抗體(例如含有天然產生之突變或在製造單株抗體製劑期間出現之變異抗體，此類變異體通常以較小量存在)以外，構成該群體之個別抗體相同及/或結合相同抗原決定基。相比於通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑，單株抗體製劑中之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。 如本文所用，術語「單特異性
」抗體表示具有一或多個結合位點之抗體，該一或多個結合位點各結合於相同抗原之相同抗原決定基。術語「雙特異性
」意謂抗原結合分子能夠特異性結合至至少兩個不同的抗原決定子。通常，雙特異性抗原結合分子包含兩個抗原結合位點，其各對不同抗原性決定子具有特異性。在某些實施例中，雙特異性抗原結合分子能夠同時結合兩個抗原性決定子，詳言之，兩個不同細胞上所表現之兩個抗原性決定子。 如本申請案中所使用，術語「價
」表示抗原結合分子中存在指定數目之結合位點。同樣，術語「二價」、「四價」及「六價」分別表示抗原結合分子中存在兩個結合位點、四個結合位點及六個結合位點。 術語「全長抗體」、「完整抗體」及「完全抗體」在本文中可互換使用，其係指具有與原生抗體結構實質上類似之結構的抗體。「原生抗體
」係指具有不同結構之天然產生之免疫球蛋白分子。舉例而言，原生IgG類抗體為約150,000道爾頓(dalton)之雜四聚體糖蛋白，其由雙硫鍵鍵結之兩個輕鏈及兩個重鏈構成。自N端至C端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變域，之後係三個恆定域(CH1、CH2及CH3)，亦稱為重鏈恆定區。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變域，之後係輕鏈恆定域(CL)，亦稱為輕鏈恆定區。抗體之重鏈歸屬於五種類型中之一者，該五種類型稱為α (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE)、γ (IgG)或μ (IgM)，其中一些可進一步分成亞型，例如γ1 (IgG1)、γ2 (IgG2)、γ3 (IgG3)、γ4 (IgG4)、α1 (IgA1)及α2 (IgA2)。抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸屬於兩種類型中之一者，稱為(κ)及(λ)。 「抗體片段
」係指不同於完整抗體，包含完整抗體之一部分，結合完整抗體所結合之抗原的分子。抗體片段之實例包括(但不限於) Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2
；雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、交叉Fab片段；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及單域抗體。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人, Nat Med 9, 129-134 (2003)。關於scFv片段之綜述，參見例如Plückthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 第113卷, Rosenburg及Moore編, Springer-Verlag, NewYork, 第269-315頁 (1994)；亦參見WO93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含救助受體結合抗原決定基殘基及具有延長之活體內半衰期之Fab及F(ab')2
片段的論述，參見美國專利第5,869,046號。雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點之抗體片段，其可為二價或雙特異性的，參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人, Nat Med 9, 129-134 (2003)；及Hollinger等人, Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人, Nat Med 9, 129-134 (2003)中。單域抗體為包含抗體之重鏈可變域全部或一部分或輕鏈可變域全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA；參見例如美國專利第6,248,516B1號)。抗體片段可藉由各種技術製得，包括(但不限於)蛋白水解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E. coli)或噬菌體)產生，如本文所述。 完整抗體之番木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其各含有重鏈及輕鏈可變域以及輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(CH1)。如本文所用，因此，術語「Fab 片段
」係指包含有包含輕鏈之VL結構域及恆定域(CL)之輕鏈片段，及重鏈之VH結構域及第一恆定域(CH1)的抗體片段。Fab'片段與Fab片段之不同之處在於，在包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸之重鏈CH1結構域的羧基端處添加幾個殘基。Fab'-SH為其中恆定域之半胱胺酸殘基帶有游離硫醇基之Fab'片段。胃蛋白酶處理產生F(ab')2片段，其具有兩個抗原結合位點(兩個Fab片段)及Fc區之一部分。 術語「交叉 Fab 片段
」或「xFab片段」或「交換型Fab片段」係指其中重鏈及輕鏈之可變區或恆定區互換之Fab片段。交換型Fab分子之兩種不同鏈組成係可能的且包含於本發明之雙特異性抗體中：一方面，Fab重鏈及輕鏈之可變區經互換，即交換型Fab分子包含由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)構成之肽鏈以及由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)構成之肽鏈。此交換型Fab分子亦稱為CrossFab(VLVH)
。另一方面，當Fab重鏈及輕鏈之恆定區互換時，交換型Fab分子包含由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)組成之肽鏈，及由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)組成之肽鏈。此交換型Fab分子亦稱為CrossFab(CLCH1)
。 「單鏈Fab片段」或「scFab
」係由抗體重鏈可變域(VH)、抗體恆定域1 (CH1)、抗體輕鏈可變域(VL)、抗體輕鏈恆定域(CL)及連接子組成之多肽，其中該抗體域及該連接子按N端至C端方向之次序具有以下中之一者：a) VH-CH1-連接子-VL-CL，b) VL-CL-連接子-VH-CH1，c) VH-CL-連接子-VL-CH1或d) VL-CH1-連接子-VH-CL；且其中該連接子為至少30個胺基酸，較佳32與50個胺基酸之間的多肽。該單鏈Fab片段經由CL結構域與CH1結構域之間的天然雙硫鍵穩定化。另外，此等單鏈Fab分子可經由插入半胱胺酸殘基(例如可變重鏈中之位置44及可變輕鏈中之位置100，根據Kabat編號)而產生鏈間雙硫鍵來進一步穩定化。 「交換型單鏈Fab片段」或「x-scFab
」為由抗體重鏈可變域(VH)、抗體恆定域1 (CH1)、抗體輕鏈可變域(VL)、抗體輕鏈恆定域(CL)及連接子組成之多肽，其中該等抗體域及該連接子按N端至C端方向之次序具有以下中之一者：a) VH-CL-連接子-VL-CH1及b) VL-CH1-連接子-VH-CL；其中VH及VL共同形成抗原結合位點，其特異性結合於抗原且其中該連接子為至少30個胺基酸之多肽。另外，此等x-scFab分子可經由插入半胱胺酸殘基(例如可變重鏈中之位置44及可變輕鏈中之位置100，根據Kabat編號)而產生鏈間雙硫鍵來進一步穩定化。 「單鏈可變片段 (scFv)
」為抗體之重鏈(VH
)及輕鏈(VL
)之可變區之融合蛋白，其與十至約25個胺基酸之短連接子肽連接。連接子通常富含甘胺酸以具有可撓性，以及絲胺酸或蘇胺酸以具有可溶性，且可使VH
之N端與VL
之C端連接，或反之亦然。儘管移除恆定區且引入連接子，但此蛋白質保留初始抗體之特異性。scFv抗體例如描述於Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96)中。另外，抗體片段包含單鏈多肽，其具有VH結構域(亦即能夠與VL結構域一起組裝成功能性抗原結合位點)或VL結構域(亦即能夠與VH結構域一起組裝成功能性抗原結合位點)之特徵，且由此提供全長抗體之抗原結合特性。 「骨架抗原結合蛋白
」在此項技術中已知，例如纖維結合蛋白及經設計錨蛋白重複蛋白質(DARPins)已用作抗原結合域之替代骨架，參見例如Gebauer及Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009)及Stumpp等人, Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008)。在本發明之一個態樣中，骨架抗原結合蛋白係選自由以下組成之群：CTLA-4 (艾維伯迪(Evibody))；脂質運載蛋白(抗運載蛋白)；蛋白質A衍生之分子，諸如蛋白質A之Z結構域(親和抗體)；A結構域(高親和性多聚體/最大抗體)；血清運鐵蛋白(反式體)；經設計之錨蛋白重複蛋白(DARPin)；抗體輕鏈或重鏈之可變域(單域抗體，sdAb)；抗體重鏈之可變域(奈米抗體，aVH)；VNAR
片段；纖維結合蛋白(纖連蛋白(AdNectin))；C型凝集素域(四連接素)；新型抗原受體β-內醯胺酶之可變域(VNAR
片段)；人類γ-晶狀體球蛋白或泛素(阿菲林(Affilin)分子)；人類蛋白酶抑制劑之kunitz型域，微體，諸如來自knottin家族之蛋白質、肽適體及纖維結合蛋白(纖連蛋白)。 CTLA-4 (細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4)為表現於大部分CD4+ T細胞上之CD28家族受體。其細胞外域具有可變域類Ig摺疊。對應於抗體之CDR之環可經異源序列取代以賦予不同結合特性。經工程改造以具有不同結合特異性之CTLA-4分子亦稱為艾維伯迪(Evibodies)(例如US7166697B1)。艾維伯迪與抗體(例如域抗體)之經分離之可變區之尺寸大致相同。關於其他細節，參見Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)。 脂質運載蛋白為細胞外蛋白質之家族，其傳遞小型疏水性分子，諸如類固醇、後色膽素、類視黃素及脂質。其具有剛性β-片狀第二結構，其在圓錐結構之開放端具有許多環，其可經工程改造以結合於不同靶抗原。抗運載蛋白之尺寸在160-180個胺基酸之間，且來源於脂質運載蛋白。關於其他細節，參見Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)、US7250297B1及US20070224633。 親和抗體為來源於金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)之蛋白質A之骨架，其可經工程改造以結合於抗原。結構域由具有約58個胺基酸之三螺旋束組成。已藉由表面殘基之隨機化產生文庫。關於其他細節，參見Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004)及EP 1641818A1。 高親和性多聚體為來源於A結構域骨架家族之多域蛋白質。約35個胺基酸之原生域採用既定雙硫鍵鍵結之結構。藉由改組由A結構域之家族呈現之天然變化來產生多樣性。關於其他細節，參見Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005)及Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (2007年6月)。 運鐵蛋白係單體血清傳遞糖蛋白。運鐵蛋白可藉由在允許的表面環中插入肽序列而經工程改造以結合不同靶抗原。經工程改造之運鐵蛋白骨架之實例包括反式體。關於其他細節，參見J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)。 經設計之錨蛋白重複蛋白質(DARPins)來源於錨蛋白，其為介導整合膜蛋白與細胞骨架之連接的蛋白質之家族。單一錨蛋白重複蛋白為由兩個α螺旋及β回旋(beta-turn)組成之33殘基主結構。其可藉由隨機化各重複蛋白之第一個α螺旋及β回旋中之殘基而經工程改造以結合不同靶抗原。可藉由增加模組數目來增加其結合界面(親和力成熟方法)。關於其他細節，參見J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)及J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)及US20040132028A1。 單域抗體係由單一單體可變抗體域組成之抗體片段。第一個單域來源於來自駱駝之抗體重鏈之可變域(奈米抗體或VH
H片段)。此外，術語單域抗體包括自主人類重鏈可變域(aVH)或來源於鯊魚之VNAR
片段。 纖維結合蛋白為可經工程改造以結合於抗原之骨架。纖連蛋白由III型人類纖維結合蛋白(FN3)之15個重複單元之第10個結構域之天然胺基酸序列之主鏈組成。β-夾層結構之一端處的三個環可經工程改造以使纖連蛋白能夠特異性識別相關治療標靶。關於其他細節，參見Protein Eng. Des. Sel. 18, 435- 444 (2005)，US20080139791，WO2005056764及US6818418B1。 肽適體為組合性識別分子，其由恆定骨架蛋白(通常係硫氧還蛋白(TrxA))組成，該恆定骨架蛋白質含有在活性位點處插入之限制性可變肽環。關於其他細節，參見Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)。 微體來源於天然產生之長度為25-50個胺基酸之微型蛋白質，其含有3-4個半胱胺酸橋，微型蛋白質之實例包括KalataBI及芋螺毒素(conotoxin)及打結素。微型蛋白質具有環，其可經工程改造以包括至多25個胺基酸而不影響微型蛋白質之整體摺疊。關於經工程改造之打結素域之其他細節，參見WO2008098796。 與參考分子「結合於相同抗原決定基之抗原結合分子
」係指一種抗原結合分子，其在競爭分析中阻斷參考分子與其抗原之結合達50%或更高，且相反，參考分子在競爭分析中阻斷抗原結合分子與其抗原之結合達50%或更高。 術語「抗原結合域
」係指抗原結合分子之一部分，其包含特異性結合於一部分或全部抗原且與其互補之區域。當抗原較大時，抗原結合分子可僅結合於抗原之特定一部分，該部分稱為抗原決定基。抗原結合域可由例如一或多個可變域(亦稱為可變區)提供。較佳地，抗原結合域包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)。 如本文所用，術語「抗原決定子
」與「抗原」及「抗原決定基」同義且係指多肽大分子上與抗原結合部分結合，形成抗原結合部分-抗原複合物的位點(例如鄰近胺基酸區段或由非鄰近胺基酸之不同區域組成的構形組態)。適用的抗原決定子可見於例如腫瘤細胞表面上、病毒所感染細胞之表面上、其他病變細胞表面上、免疫細胞表面上、游離於血清中及/或細胞外基質(ECM)中。除非另外指明，否則本文中適用作抗原之蛋白質可為來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之蛋白質的任何原生形式。在一特定實施例中，抗原係人類蛋白質。在本文中提及特定蛋白質之情況下，該術語涵蓋「全長」的未經處理之蛋白質，以及由細胞中之處理所產生之任何形式的蛋白質。該術語亦涵蓋天然產生之蛋白質變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。 術語「能夠特異性結合於 PD1
」係指能夠以足以使抗原結合分子適用作靶向PD1中之診斷劑及/或治療劑之親和力結合PD1之抗原結合分子。抗原結合分子包括(但不限於)抗體、Fab分子、交換型Fab分子、單鏈Fab分子、Fv分子、scFv分子、單域抗體以及VH及骨架抗原結合蛋白。在一個態樣中，抗PD1抗原結合分子與不相關非PD1蛋白質之結合程度低於抗原結合分子與PD1之結合的約10%，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測。詳言之，能夠特異性結合於PD1之抗原結合分子之解離常數(Kd
) ≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如10- 8
M或更小，例如10- 8
M至10- 13
M，例如10- 9
M至10- 13
M)。在某些實施例中，抗PD1抗原結合分子結合於來自不同物種之PD1。詳言之，抗PD1抗原結合分子結合於人類及食蟹獼猴PD1。 「特異性結合
」意謂結合對於抗原而言具選擇性且可與非所需或非特異性相互作用區分。抗原結合分子結合於特異性抗原之能力可經由酶聯結免疫吸附分析(ELISA)或熟習此項技術者熟悉之其他技術(例如表面電漿子共振(SPR)技術(在BIAcore儀器上分析)(Liljeblad等人, Glyco J 17, 323-329 (2000))及傳統結合分析(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))量測。在一個實施例中，抗原結合分子與不相關蛋白質之結合程度低於抗原結合分子與抗原之結合的約10%，如例如藉由SPR所量測。在某些實施例中，結合於抗原之分子之解離常數(Kd) ≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如10- 8
M或更小，例如10- 8
M至10- 13
M，例如10- 9
M至10- 13
M)。 「親和力
」或「結合親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之總和的強度。除非另外指明，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間的1:1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y的親和力一般可由解離常數(Kd)表示，解離常數係解離速率常數與締合速率常數(分別係koff
及kon
)之比率。因此，等效親和力可包含不同速率常數，只要速率常數之比率保持相同即可。可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所述之該等方法)來量測親和力。一種用於量測親和力之具體方法係表面電漿子共振(SPR)。 如本文所用，「靶細胞抗原
」係指靶細胞(例如T細胞或B細胞，一種腫瘤細胞，諸如癌細胞或腫瘤基質細胞)表面上所呈遞的抗原決定子。在某些實施例中，靶細胞抗原係T細胞之表面上的抗原。在一個實施例中，靶細胞抗原係PD1。 術語「PD1
」，亦稱為漸進式細胞死亡蛋白1，係具有288個胺基酸之I型膜蛋白，其首先描述於1992 (Ishida等人, EMBO J., 11 (1992), 3887-3895)中。PD1係T細胞調節因子之擴展CD28/CTLA-4家族之成員且具有兩個配位體PD-L1 (B7-H1，CD274)及PD-L2 (B7-DC，CD273)。蛋白結構包括細胞外IgV結構域，之後為跨膜區及細胞內尾。細胞內尾含有位於基於免疫受體酪胺酸之抑制性基元及基於免疫受體酪胺酸之切換基元中之兩個磷酸化部位，由此表明PD1負調節TCR信號。此情況與SHP-1及SHP-2磷酸酶與配位體結合時PD1之細胞質尾之結合一致。儘管PD1不表現於未處理T細胞上，但其在T細胞受體(TCR)介導之活化之後得以上調且在活化與耗竭之T細胞上皆觀察到(Agata等人, Int. Immunology 8 (1996), 765-772)。此等耗竭之T細胞具有功能異常表型且不能適當地進行反應。儘管PD1具有相對較寬的表現模式，但其最重要的作用可能係作為T細胞上之共抑制受體(Chinai等人, Trends in Pharmacological Sciences 36 (2015), 587-595)。因此，目前治療方法集中於阻斷PD1與其配位體之相互作用以增強T細胞反應。術語「漸進式死亡1」、「漸進式細胞死亡1」、「蛋白質PD-1」、「PD-1」、「PD1」、「PDCD1」、「hPD-1」及「hPD-I」可互換使用且包括人類PD1之變異體、同功異型物、物種同源物及具有至少一個與PD1共同之抗原決定基的類似物。人類PD1之胺基酸序列展示於UniProt (www.uniprot.org)寄存編號Q15116 (SEQIDNO:94)中。 術語「可變區
」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中涉及抗原結合分子與抗原之結合的結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈(分別係VH及VL)可變域一般具有類似的結構，其中各結構域均包含四個保守性構架區(FR)及三個高變區(HVR)。參見例如Kindt等人, Kuby Immunology, 第6版, W.H. Freeman and Co., 第91頁 (2007)。單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。 如本文所用，術語「高變區
」或「HVR」係指抗體可變域中在序列上具有高變性及/或形成結構上定義之環(「高變環」)的各區域。一般而言，原生四鏈抗體包含六個HVR；三個位於VH中(H1、H2、H3)，且三個位於VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含來自高變環及/或來自「互補決定區」(CDR)之胺基酸殘基，後者具有最高的序列可變性及/或與抗原識別相關。例示性高變環出現在胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)處。(Chothia及Lesk,J. Mol. Biol.
196:901-917 (1987))。例示性CDR (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)出現在L1之胺基酸殘基24-34、L2之胺基酸殘基50-56、L3之胺基酸殘基89-97、H1之胺基酸殘基31-35B、H2之胺基酸殘基50-65及H3之胺基酸殘基95-102處。(Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest
, 第5版 美國公共衛生署(Public Health Service), 美國國家衛生研究院(National Institutes of Health), Bethesda, MD (1991)。) 高變區(HVR)亦稱為互補決定區(CDR)，且此等術語在本文中、在提及形成抗原結合區之可變區之一部分時可互換使用。此特定區域已由Kabat等人, 美國衛生與人群服務部(U.S. Dept. of Health and Human Services), 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」 (1983)及Chothia等人,J . Mol . Biol
. 196:901-917 (1987)描述，其中定義包括對照彼此比較時胺基酸殘基之交疊部分或子集。然而，涉及抗體或其變異體之CDR之任何定義的應用意欲處於如本文中所定義及所用之術語的範疇內。涵蓋如上文所引用之參考文獻中之每一者所定義之CDR的適當胺基酸殘基闡述於下表A中作為比較。涵蓋特定CDR之確切殘基數目將視CDR序列及大小而變。在抗體之可變區胺基酸序列指定的情況下，熟習此項技術者可以常規方式確定哪個殘基包含特定CDR。 表A. CDR定義1 1
表A中之所有CDR定義之編號皆依據Kabat等人所闡述之編號約定(參見下文)。2
如表A中所用之含有小寫字母「b」的「AbM」係指如藉由Oxford Molecular之「AbM」抗體模型化軟體所定義的CDR。 Kabat等人亦定義適用於任何抗體的可變區序列編號系統。一般熟習此項技術者可將此「Kabat編號」系統明確地分配給任何可變區序列，而不依賴於超過序列本身的任何實驗數據。如本文所用，「Kabat編號」係指由Kabat等人, 美國衛生與人群服務部, 「Sequence of Proteins of Immunological Interest」 (1983)所闡述之編號系統。除非另外說明，否則提及抗體可變區中之特異性胺基酸殘基位置的編號係根據Kabat編號系統。 除VH中之CDR1以外，CDR一般包含形成高變環之胺基酸殘基。CDR亦包含「特異性決定殘基」或「SDR」，其為接觸抗原之殘基。SDR含於簡稱為-CDR或a-CDR之CDR區域內。例示性CDR (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)出現在L1之胺基酸殘基31-34、L2之胺基酸殘基50-55、L3之胺基酸殘基89-96、H1之胺基酸殘基31-35B、H2之胺基酸殘基50-58及H3之胺基酸殘基95-102處。(參見Almagro及Fransson,Front. Biosci.
13:1619-1633 (2008)。) 除非另外指明，否則在本文中，根據Kabat等人, 同上對可變域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)進行編號。 如本文所使用，在抗原結合分子(例如抗體)之情形下，術語「親和力成熟
」係指來源於參考抗原結合分子(例如藉由突變)之抗原結合分子，其結合於與參考抗體相同的抗原，較佳結合於相同的抗原決定基；且與參考抗原結合分子相比對抗原具有較高親和力。親和力成熟一般涉及抗原結合分子之一或多個CDR中一或多個胺基酸殘基之修飾。通常，親和力成熟抗原結合分子結合於與初始參考抗原結合分子相同的抗原決定基。 「構架
」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基以外的可變域殘基。可變域之FR一般由四個FR結構域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，在VH (或VL)中，HVR及FR序列一般依以下序列呈現：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。 出於本文之目的，「接受體人類構架
」係包含來源於如以下所定義之人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之輕鏈可變域(VL)構架或重鏈可變域(VH)構架之胺基酸序列的構架。「來源於」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之接受體人類構架可包含人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數目為10個或更少、9個或更少、8個或更少、7個或更少、6個或更少、5個或更少、4個或更少、3個或更少或2個或更少。在一些實施例中，VL接受體人類構架之序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架序列一致。 術語「嵌合
」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分源自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分源自不同來源或物種之抗體。 抗體之「類別
」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區的類型。存在五種主要類別之抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干者可進一步分成子類(同型)，例如IgG1
、IgG2
、IgG3
、IgG4
、IgA1
及IgA2
。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。 「人類化
」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含至少一個且典型地兩個可變域之實質上所有者，其中所有或實質上所有HVR (例如CDR)皆對應於非人類抗體之HVR，且所有或實質上所有FR皆對應於人類抗體之FR。人類化抗體視情況可包含源自人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式
」係指已經歷人類化之抗體。本發明涵蓋之「人類化抗體」之其他形成為其中恆定區已經額外修飾或自原始抗體發生變化以產生根據本發明之特性，尤其在C1q結合及/或Fc受體(FcR)結合方面。 「人類
」抗體為胺基酸序列對應於由人類或人類細胞產生或來源於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體之胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義特定排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。 術語「Fc結構域」或「Fc 區
」在本文中用於定義抗體重鏈中含有恆定區之至少一部分的C端區域。該術語包括原生序列Fc區及變異型Fc區。IgG Fc區包含IgG CH2及IgG CH3結構域。人類IgG Fc區之「CH2結構域」通常自約位置231處之胺基酸殘基延伸至約位置340處之胺基酸殘基。在一個實施例中，碳水化合物鏈連接至CH2結構域。本文中，CH2結構域可為原生序列CH2結構域或變異型CH2結構域。「CH3結構域」包含Fc區中C端殘基延伸至CH2結構域(亦即自IgG之約位置341之胺基酸殘基至約位置447處之胺基酸殘基)。本文中，CH3區可為原生序列CH3結構域或變異型CH3結構域(例如在其一個鏈中具有引入之「隆凸」(「杵」)且在其另一個鏈中具有相應的引入之「凹穴」(「臼」)的CH3結構域；參見美國專利第5,821,333號，其以引用之方式明確併入本文中)。此類變異型CH3結構域可用於促進如本文中所述之兩個非一致抗體重鏈之雜二聚化。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。除非另外說明，否則Fc區或恆定區胺基酸殘基之編號係依據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. 美國公共衛生署, 美國國家衛生研究院, Bethesda, Md., 1991中所述。 「杵-臼」技術描述於例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人, Prot Eng 9, 617-621 (1996)及Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)中。一般而言，方法包括在第一多肽之界面處引入隆凸(「杵」)及在第二多肽之界面處引入相應凹穴(「臼」)，使得隆凸可定位於凹穴中以便促進雜二聚體形成且阻礙均二聚體形成。隆凸藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換第一多肽界面中之小胺基酸側鏈來構築。大小與隆凸相同或相似的補償性凹穴藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換交大胺基酸側鏈而形成於第二多肽之界面中。隆凸及凹穴可藉由改變編碼多肽之核酸，例如藉由定點突變誘發或藉由肽合成產生。在一特定實施例中，杵修飾包含Fc結構域之兩個子單元中之一者中之胺基酸取代T366W，且臼修飾包含Fc結構域之兩個子單元中之另一者中的胺基酸取代T366S、L368A及Y407V。在另一特定實施例中，包含杵修飾之Fc結構域之子單元另外包含胺基酸取代S354C，且包含臼修飾之Fc結構域之子單元另外包含胺基酸取代Y349C。引入此等兩個半胱胺酸殘基使得Fc區之兩個子單元之間形成雙硫橋鍵，由此進一步穩定二聚體(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。編號係根據Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. 美國公共衛生署, 美國國家衛生研究院, Bethesda, MD, 1991之EU索引。 「與免疫球蛋白之Fc區等效之區域」意欲包括免疫球蛋白之Fc區之天然產生之對偶基因變異體以及具有變化之變異體，該等變化產生取代、添加或缺失，但不實質上降低免疫球蛋白介導效應功能(諸如抗體依賴性細胞毒性)之能力。舉例而言，免疫球蛋白之Fc區之N端或C端可缺失一或多個胺基酸而不實質性損失生物功能。此類變異體可根據此項技術中已知之通用規則選擇以對活性具有最小影響(參見例如Bowie, J. U等人, Science 247:1306-10 (1990))。 術語「效應功能
」係指可歸因於抗體之Fc區之彼等生物活性，其因抗體同型而異。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、細胞激素分泌、免疫複合物介導之抗原呈遞細胞攝入抗原、細胞表面受體(例如B細胞受體)下調及B細胞活化。 「活化 Fc 受體
」係一種Fc受體，其與抗體之Fc區接合之後，引發信號傳導事件，刺激攜帶受體之細胞執行效應功能。活化Fc受體包括FcγRIIIa (CD16a)、FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32)及FcαRI (CD89)。特定活化Fc受體為人類FcγRIIIa (參見UniProt寄存編號P08637，版本141)。 術語「TNF 配位體家族成員
」或「TNF家族配位體」係指促炎性細胞激素。細胞激素通常(且特定言之TNF配位體家族之成員)在免疫系統之刺激及配位中起重要作用。當前，基於序列、功能性及結構類似性，已發現十九種細胞激素為TNF (腫瘤壞死因子)配位體超家族之成員。所有此等配位體皆為具有C端細胞外域(胞外域)、N端細胞胞內域及單一跨膜域之II型跨膜蛋白。C端細胞外域(稱為TNF同源性域(THD))在超家族成員之間具有20-30%胺基酸一致性且負責結合於受體。TNF胞外域亦負責TNF配位體以形成三聚複合物，其由其特異性受體而被識別。 TNF配位體家族之成員係選自由以下組成之群：淋巴毒素α (亦稱為LTA或TNFSF1)、TNF (亦稱為TNFSF2)、LTβ (亦稱為TNFSF3)、OX40L (亦稱為TNFSF4)、CD40L (亦稱為CD154或TNFSF5)、FasL (亦稱為CD95L、CD178或TNFSF6)、CD27L (亦稱為CD70或TNFSF7)、CD30L (亦稱為CD153或TNFSF8)、4-1BBL (亦稱為TNFSF9)、TRAIL (亦稱為APO2L、CD253或TNFSF10)、RANKL (亦稱為CD254或TNFSF11)、TWEAK (亦稱為TNFSF12)、APRIL (亦稱為CD256或TNFSF13)、BAFF (亦稱為CD257或TNFSF13B)、LIGHT (亦稱為CD258或TNFSF14)、TL1A (亦稱為VEGI或TNFSF15)、GITRL (亦稱為TNFSF18)、EDA-A1 (亦稱為外異蛋白A1)及EDA-A2 (亦稱為外異蛋白A2)。除非另外指明，否則該術語係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生TNF家族配位體。在本發明之特定實施例中，TNF配位體家族成員係選自由以下組成之群：OX40L、FasL、CD27L、TRAIL、4-1BBL、CD40L及GITRL。在一特定實施例中，TNF配位體家族成員係選自4-1BBL及OX40L。 TNF配位體家族成員之其他資訊(特定言之，序列)可自公開可用資料庫(諸如Uniprot (www.uniprot.org))獲得。舉例而言，人類TNF配位體具有以下胺基酸序列：人類淋巴毒素α (UniProt寄存編號P01374，SEQ ID NO:95)、人類TNF (UniProt寄存編號P01375，SEQ ID NO:96)、人類淋巴毒素β (UniProt寄存編號Q06643，SEQ ID NO:97)、人類OX40L (UniProt寄存編號P23510，SEQ ID NO:98)、人類CD40L (UniProt寄存編號P29965，SEQ ID NO:99)、人類FasL (UniProt寄存編號P48023，SEQ ID NO:100)、人類CD27L (UniProt寄存編號P32970，SEQ ID NO:101)、人類CD30L (UniProt寄存編號P32971，SEQ ID NO:102)、4-1BBL (UniProt寄存編號P41273，SEQ ID NO:103)、TRAIL (UniProt寄存編號P50591，SEQ ID NO:104)、RANKL (UniProt寄存編號O14788，SEQ ID NO:105)、TWEAK (UniProt寄存編號O43508，SEQ ID NO:106)、APRIL (UniProt寄存編號O75888，SEQ ID NO:107)、BAFF (UniProt寄存編號Q9Y275，SEQ ID NO:108)、LIGHT (UniProt寄存編號O43557，SEQ ID NO:109)、TL1A(UniProt寄存編號O95150，SEQ ID NO:110)、GITRL (UniProt寄存編號Q9UNG2，SEQ ID NO:111)及外異蛋白A(UniProt寄存編號Q92838，SEQ ID NO:112)。 「胞外域」為膜蛋白中延伸至細胞外空間(亦即目標細胞外之空間)的結構域。胞外域通常為蛋白質中起始與表面之接觸(其引起信號轉導)之部分。因此，如本文所定義之TNF配位體家族成員之胞外域係指TNF配位體蛋白質中延伸至細胞外空間(細胞外域)之部分，但亦包括負責三聚作用及結合於相應TNF受體之更短部分或其片段。因此，術語「TNF配位體家族成員之胞外域或其片段」係指TNF配位體家族成員之細胞外域，其形成仍能夠結合於受體(受體結合域)之細胞外域或其部分。 術語「共刺激性 TNF 配位體家族成員
」或「共刺激性TNF家族配位體」係指TNF配位體家族成員之子群，其能夠共刺激T細胞之增殖及細胞激素產生。此等TNF家族配位體可在與其相應TNF受體相互相用時共刺激TCR信號且與其受體之相互相用可引起TNFR相關因子(TRAF)之募集，其起始可引起T細胞活化之信號級聯。共刺激性TNF家族配位體係選自由以下組成之群：4-1BBL、OX40L、GITRL、CD70、CD30L及LIGHT，更特定言之，共刺激性TNF配位體家族成員係選自4-1BBL及OX40L。 如上文中所述，4-1BBL為II型跨膜蛋白及TNF配位體家族中之一個成員。已描述具有SEQ ID NO:103之胺基酸序列的完全或全長4-1BBL可形成細胞表面上之三聚體。藉由4-1BBL之胞外域之特異性移動實現三聚體之形成。該等動機在本文中稱為「三聚區域」。人類4-1BBL序列(SEQ ID NO:113)之胺基酸50-254形成4-1BBL之細胞外域，但即使其片段亦能夠形成三聚體。在本發明之特定實施例中，術語「4-1BBL之胞外域或其片段」係指具有選自以下之胺基酸序列的多肽：SEQ ID NO:4 (人類4-1BBL之胺基酸52-254)、SEQ ID NO:1 (人類4-1BBL之胺基酸71-254)、SEQ ID NO:3 (人類4-1BBL之胺基酸80-254)及SEQ ID NO:2 (人類4-1BBL之胺基酸85-254)；或具有選自以下之胺基酸序列的多肽：SEQ ID NO:5 (人類4-1BBL之胺基酸71-248)、SEQ ID NO:8 (人類4-1BBL之胺基酸52-248)、SEQ ID NO:7 (人類4-1BBL之胺基酸80-248)及SEQ ID NO:6 (人類4-1BBL之85-248 of)，而且本文中亦包括能夠進行三聚作用之胞外域之其他片段。 如上文中所描述，OX40L係另一種II型跨膜蛋白及TNF配位體家族中之另一成員。完全或全長人類OX40L具有SEQ ID NO:98之胺基酸序列。人類OX40L序列(SEQ ID NO:114)之胺基酸51-183形成OX40L之細胞外域，但即使其片段亦能夠形成三聚體。在本發明之特定實施例中，術語「OX40L之胞外域或其片段」係指具有選自SEQ ID NO:114 (人類OX40L之胺基酸51-183)或SEQ ID NO:115 (人類OX40L之胺基酸52-183)之胺基酸序列的多肽，但本文中亦包括其他能夠進行三聚之胞外域之片段。 術語「肽連接子
」係指包含一或多個胺基酸(通常約2至20個胺基酸)的肽。肽連接子在此項技術中已知或描述於本文中。適合的非免疫原性連接肽係例如(G4
S)n
、(SG4
)n
或G4
(SG4
)n
肽連接子，其中「n」一般係1與10之間，通常1與4之間的數值，詳言之係2，亦即選自由以下組成之群的肽：GGGGS (SEQ ID NO:116)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:117)、SGGGGSGGGG (SEQ ID NO:118)、(G4
S)3
或GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:119)、GGGGSGGGGSGGGG或G4(SG4)2
(SEQ ID NO:120)及(G4
S)4
或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:121)，而且包括序列GSPGSSSSGS (SEQ ID NO:122)、GSGSGSGS (SEQ ID NO:123)、GSGSGNGS (SEQ ID NO:124)、GGSGSGSG (SEQ ID NO:125)、GGSGSG (SEQ ID NO:126)、GGSG (SEQ ID NO:127)、GGSGNGSG (SEQ ID NO:128)、GGNGSGSG (SEQ ID NO:129)及GGNGSG (SEQ ID NO:130)。尤其關注之肽連接子係(G4S)1
或GGGGS (SEQ ID NO:86)、(G4
S)2
或GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:117)及GSPGSSSSGS (SEQ ID NO:122)，更特定言之(G4
S)2
或GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:117)。 如本申請案內所用，術語「胺基酸
」表示天然產生之羧基α-胺基酸之群，其包含丙胺酸(三字母代碼：ala，一字母代碼：A)、精胺酸(arg，R)、天冬醯胺(asn，N)、天冬胺酸(asp，D)、半胱胺酸(cys，C)、麩醯胺酸(gln，Q)、麩胺酸(glu，E)、甘胺酸(gly，G)、組胺酸(his，H)、異白胺酸(ile，I)、白胺酸(leu，L)、離胺酸(lys，K)、甲硫胺酸(met，M)、苯丙胺酸(phe，F)、脯胺酸(pro，P)、絲胺酸(ser，S)、蘇胺酸(thr，T)、色胺酸(trp，W)、酪胺酸(tyr，Y)及纈胺酸(val，V)。 如本文所用，「融合多肽
」或「單一融合多肽」係指由該TNF配位體家族成員之與抗原結合部分之一部分或Fc部分融合的一或兩個胞外域構成之單鏈多肽。融合可藉由將抗原結合部分之N端或C端胺基酸經由肽連接子直接連接至該TNF配位體家族成員之胞外域之C端或N端胺基酸來進行。 「融合」或「連接」意謂組分(例如多肽及該TNF配位體家族成員之胞外域)由肽鍵(直接或經由一或多個肽連接子)連接。 相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比 (%)
」定義為在比對參考多肽序列與候選序列且必要時引入間隙以達成最大序列一致性百分比之後，且在不將保守性取代視為序列一致性之一部分之情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以此項技術內之各種方式實現，例如使用公開可用之電腦軟體，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於比對序列之適當參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何算法。然而，出於本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生胺基酸序列一致性%值。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech, Inc.設計，且原始程式碼已在美國著作權局(U.S. Copyright Office), Washington D.C., 20559申請用戶文檔，其在此註冊在美國版權註冊第TXU510087號下。ALIGN-2程式可公開購自Genentech, Inc., South San Francisco, California或可自原始程式碼編譯。ALIGN-2程序經編寫可用於UNIX操作系統，包括數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數由ALIGN-2程序設定且不變化。在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，既定胺基酸序列A與既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性% (或者，其可表述為與既定胺基酸序列B具有或包含一定胺基酸序列一致性%的既定胺基酸序列A)如下計算： 100乘以分率X/Y 其中X係在A與B之比對程式中藉由序列比對程式ALIGN-2評為一致匹配之胺基酸殘基之數目，且其中Y係B中之胺基酸殘基之總數目。應瞭解，在胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不相等之情況下，A相對於B之胺基酸序列一致性%與B相對於A之胺基酸序列一致性%將不相等。除非另外特定規定，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%值係如前述段落中剛剛所述使用ALIGN-2電腦程式獲得。 在某些實施例中，涵蓋本文中提供之含有TNF配位三聚體之抗原結合分子的胺基酸序列變異體
。舉例而言，可能需要改良含TNF配位三聚體之抗原結合分子之結合親和力及/或其他生物特性。含TNF配位三聚體之抗原結合分子之胺基酸序列變異體可藉由將適合的修飾引入編碼核苷酸序列之分子或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如在抗體之胺基酸序列內的殘基之缺失及/或插入及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件係最終構築體具有所需特徵，例如抗原結合。用於取代性突變誘發之相關位點包括HVR及構架(FR)。保守性取代以標題「較佳取代」提供於表B中且在下文中參考胺基酸側鏈分類(1)至(6)進一步描述。可將胺基酸取代引入相關分子且針對所需活性篩檢產物，例如保持/改良之抗原結合、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC。 表B
胺基酸可根據共有側鏈特性進行分組： (1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3)酸性：Asp、Glu； (4)鹼性：His、Lys、Arg； (5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro； (6)芳族：Trp、Tyr、Phe。 非保守取代將必然伴有將此等類別中之一者之成員換成另一個類別。 術語「胺基酸序列變異體
」包括實質性變異體，其中在親本抗原結合分子(例如人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基中存在胺基酸取代。一般而言，所選擇之用於進一步研究之所得變異體與親本抗原結合分子相比將具有某些生物特性之修飾(例如改良)(例如提高之親和力、降低之免疫原性)及/或將實質上保持親本抗原結合分子之某些生物特性。例示性取代型變異體係親和力成熟抗體，其可例如宜使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文所述之技術)產生。簡言之，一或多個HVR殘基發生突變且變異型抗原結合分子呈現於噬菌體上且針對特定生物活性(例如結合親和力)進行篩檢。在某些實施例中，一或多個HVR內可存在取代、插入或缺失，只要此類變化不實質上降低抗原結合分子結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行不實質上降低結合親和力之保守改變(例如如本文所提供之保守取代)。一種適用於鑑別突變誘發可靶向之抗體殘基或區域的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如Cunningham及Wells (1989) Science, 244:1081-1085所述。在此方法中，鑑別殘基或一組靶殘基(例如帶電殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)且經中性或帶負電胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換以判定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。或者或另外，抗原-抗原結合分子之晶體結構複合以鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及鄰近殘基可作為取代候選物之標靶或排除在取代候選物之外。可篩檢變異體以判定其是否含有所需特性。 胺基酸序列插入包括在一個殘基至含有一百個或更多殘基之多肽長度範圍內的胺基及/或羧基端融合物，以及具有單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子。分子之其他插入型變異體包括與多肽之N或C端融合，其增加含TNF配位三聚體之抗原結合分子之血清半衰期。 在某些實施例中，本文中提供之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子經改變以增加或降低抗體之糖基化程度。可藉由改變胺基酸序列使得創造或移除之一或多個糖基化位點宜獲得分子之糖基化變異體。當含TNF配位三聚體之抗原結合分子包含Fc區時，可改變與其連接之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含分支鏈雙觸角寡醣，其一般藉由N鍵連接至Fc區之CH2結構域的Asn297。參見例如Wright等人TIBTECH
15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接至雙觸寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc的海藻糖。在一些實施例中，可進行含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子中寡糖之修飾以產生具有某些改良之特性的變異體。在一個態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子的變異體，其具有不含與Fc區連接(直接或間接)之海藻糖的碳水化合物結構。此類海藻糖基化變異體可具有改良之ADCC功能，參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta, L.)或US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之其他變異體包括具有平分寡糖之變異體，例如其中連接至Fc區之雙觸角寡糖由GlcNAc平分。此類變異體可具有降低之海藻糖基化及/或改良之ADCC功能，參見例如WO 2003/011878 (Jean-Mairet等人)；美國專利第6,602,684號(Umana等人)；及US 2005/0123546 (Umana等人)。亦提供寡糖中之至少一個半乳糖殘基與Fc區連接之變異體。此類抗體變異體可具有改良之CDC功能且描述於例如WO 1997/30087 (Patel等人)；WO 1998/58964 (Raju, S.)；及WO 1999/22764 (Raju, S.)中。 在某些實施例中，可能需要產生本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子的經半胱胺酸工程改造之變異體，例如「thioMAbs」，其中分子之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代之殘基存在於分子之可達位點處。藉由用半胱胺酸取代此等殘基，藉此將反應性硫醇基安置於抗體之可達位點且可用於使抗體與其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)結合以產生免疫結合物。在某些實施例中，以下殘基中之任一或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205 (Kabat編號)；重鏈之A118 (Eu編號)；及重鏈Fc區之S400 (Eu編號)。經半胱胺酸工程改造之抗原結合分子可如例如美國專利第7,521,541號中所述產生。 在某些態樣中，本文中提供之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子可經進一步修飾以含有此項技術中已知且可容易地獲得之其他非蛋白質部分。適用於抗體衍生作用之部分包括(但不限於)水可溶聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如丙三醇)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其於水中之穩定性而可在製造中具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為分支鏈或未分支的。連接至抗體之聚合物的數目可變化，且若連接多於一個聚合物，則聚合物可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生作用之聚合物之數目及/或類型可基於包括(但不限於)待改良抗體之特定特性或功能、雙特異性抗體衍生物是否將用於限定條件下之療法等考慮因素來確定。在另一態樣中，提供抗體與可藉由暴露於輻射來選擇性地加熱之非蛋白質部分之結合物。在一個實施例中，非蛋白質部分係碳奈米管(Kam, N.W.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605)。輻射可具有任何波長，且包括(但不限於)不損害普通細胞但將非蛋白質部分加熱至殺死抗體-非蛋白質部分近側之細胞之溫度的波長。 在另一態樣中，可獲得本文中提供之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子的免疫結合物。「免疫結合物
」係結合於一或多個異源分子(包括(但不限於)細胞毒性劑)之抗體。 術語「聚核苷酸
」係指分離之核酸分子或構築體，例如信使RNA (mRNA)、病毒源性RNA或質體DNA (pDNA)。聚核苷酸可包含習知磷酸二酯鍵或非習知鍵(例如醯胺鍵，諸如肽核酸(PNA)中所見)。術語「核酸分子」係指聚核苷酸中存在之任一或多個核酸區段，例如DNA或RNA片段。 「分離之
」核酸分子或聚核苷酸意欲係已自原生環境中移除之核酸分子、DNA或RNA。舉例而言，出於本發明之目的，編碼載體中所含之多肽的重組性聚核苷酸視為分離。分離之聚核苷酸之其他實例包括異源宿主細胞中所維持之重組聚核苷酸或溶液中純化(部分或實質上)之聚核苷酸。分離之聚核苷酸包括通常含有聚核苷酸分子之細胞中所含的聚核苷酸分子，但聚核苷酸分子存在於染色體外或不同於其天然染色體位置之染色體位置。分離之RNA分子包括本發明之活體內或活體外RNA轉錄物，以及正股及負股形式，及雙股形式。本發明之分離之聚核苷酸或核酸進一步包括以合成方式製造之此類分子。另外，聚核苷酸或核酸可為或可包括調節元件，諸如啟動子、核糖體結合位點或轉錄終止子。 一種核酸或聚核苷酸之核苷酸序列與本發明之參考核苷酸序列至少例如95%「一致」意指該聚核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致，但該聚核苷酸序列相對於參考核苷酸序列可每100個核苷酸中包括至多五個點突變。換言之，為獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%一致之聚核苷酸，參考序列中至多5%的核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代，或參考序列中可插入佔參考序列核苷酸總數至多5%的多個核苷酸。參考序列之此等改變可發生於參考核苷酸序列之5'或3'端位置或彼等末端位置之間的任何位置，此等位置個別地穿插於參考序列殘基中或參考序列內的一或多個鄰近基團中。實際來看，任何特定聚核苷酸序列是否與本發明之核苷酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致可習知地使用已知電腦程式確定，諸如上文關於多肽所論述的電腦程式(例如ALIGN-2)。 術語「表現卡匣
」係指以重組或合成方式產生之聚核苷酸，其具有允許靶細胞中之特定核酸發生轉錄的一系列特定核酸要素。重組表現卡匣可併入質體、染色體、粒線體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。通常，表現載體之重組表現卡匣部分包括待轉錄之核酸序列及啟動子，以及其他序列。在某些實施例中，本發明之表現卡匣包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段之聚核苷酸序列。 術語「載體
」或「表現載體」與「表現構築體」同義且係指用於引入特定基因且引導該基因表現之DNA分子，該DNA分子與該基因在靶細胞中可操作地締合。該術語包括呈自我複製核酸結構之載體以及併入已引入其之宿主細胞之基因組中的載體。本發明之表現載體包含表現卡匣。表現載體允許大量穩定mRNA發生轉錄。一旦表現載體進入靶細胞內，則藉由細胞轉錄及/或轉譯機構製造由該基因編碼的核糖核酸分子或蛋白質。在一個實施例中，本發明之表現載體包含表現卡匣，該表現卡匣包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段的聚核苷酸序列。 術語「宿主細胞
」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入外源核酸之細胞，包括此類細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括初級轉型細胞及自其衍生之子代(不考慮繼代次數)。子代之核酸含量與親代細胞可能不完全相同，而是可能含有突變。本文包括針對原始轉型細胞篩檢或選擇之具有相同功能或生物活性之突變型子代。宿主細胞係可用於產生本發明之雙特異性抗原結合分子的任何類型之細胞系統。宿主細胞包括培養細胞，例如哺乳動物培養細胞，諸如CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及植物細胞(僅舉數例)，而且包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或培養植物或動物組織內所含的細胞。 藥劑之「有效量
」係指在所投與之細胞或組織中產生生理變化所需的量。 例如醫藥組合物之藥劑的「治療有效量
」係指在所需劑量及時段下有效獲得所需治療或預防結果之量。舉例而言，治療有效量之藥劑消除、減少、延遲、最小化或預防疾病副作用。 「個體
(individual)」或「個體(subject)」係哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。特定言之，個體係人類。 術語「醫藥組合物
」係指所呈形式允許其中所含活性成分之生物活性有效發揮的製劑，且其不含對調配物將投與之個體具有不可接受毒性之其他組分。 「醫藥學上可接受之賦形劑
」係指醫藥組合物中除活性成分以外之對個體無毒的成分。醫藥學上可接受之賦形劑包含(但不限於)緩衝劑、穩定劑或防腐劑。 術語「藥品說明書
」用於指通常包括於治療性產品之商業包裝中之說明書，其含有關於與使用此類治療性產品有關之適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、禁忌症及/或警告的資訊。 如本文所用，「治療
(treatment)」(及其語法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指臨床介入以試圖改變所治療個體之自然病程，且可以為實現預防或在臨床病理學病程中進行。所需治療作用包括(但不限於)預防疾病發生或復發、緩解症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理性後果、預防癌轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病病況及緩解或改善預後。在一些實施例中，本發明之分子用於延遲疾病發展或減慢疾病之進程。 如本文所使用，術語「癌症
」係指增生性疾病，諸如淋巴瘤、癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤、白血病、淋巴球性白血病、肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、細支氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、結腸直腸癌(CRC)、胰臟癌、乳癌、三陰性乳癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌症、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎臟或尿管之癌症、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽癌、中樞神經系統(CNS)之贅瘤、脊柱軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、脊膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤及尤文氏肉瘤(Ewings sarcoma)、黑素瘤、多發性骨髓瘤、B細胞癌(淋巴瘤)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、毛細胞白血病、慢性骨髓母細胞白血病，包括以上癌症中之任一者之頑抗性版本，或以上癌症中之一或多者之組合。 本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子 本發明提供新穎的含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其具有尤其有利特性，諸如可生產性、穩定性、結合親和力、生物活性、靶向功效及降低之毒性。 在第一態樣中，本發明提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a)至少一個部分，其能夠特異性結合於PD1，及 (b)第一及第二多肽，其藉由雙硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於該第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其片段，該兩個胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接，且該第二多肽包含該TNF配位體家族成員之僅一個胞外域或其片段。 在一特定態樣中，本發明提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a)至少一個部分，其能夠特異性結合於PD1， (b)第一及第二多肽，其藉由雙硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於該第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其片段，該兩個胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接，且該第二多肽包含該TNF配位體家族成員之僅一個胞外域或其片段，及 (c) Fc結構域，其由能夠穩定締合之第一及第二子單元構成。 在一特定態樣中，含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含(a)至少一個部分，其能夠特異性結合於PD1及 (b)第一及第二多肽，其藉由雙硫鍵彼此連接， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其兩個片段，該兩個胞外域或其兩個片段藉由肽連接子彼此連接，且其特徵在於第二多肽包含該TNF配位體家族成員之僅一個胞外域或其片段，其中該TNF配位體家族成員共刺激人類T細胞活化。 在另一特定態樣中，含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含(a)至少一個部分，其能夠特異性結合於PD1及 (b)第一及第二多肽，其藉由雙硫鍵彼此連接， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其兩個片段，該兩個胞外域或其兩個片段藉由肽連接子彼此連接，且其特徵在於第二多肽包含該TNF配位體家族成員之僅一個胞外域或其片段，其中在所有情況下該TNF配位體家族成員之胞外域相同。 在另一態樣中，提供一種如上文所定義之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a)至少一個部分，其能夠特異性結合於PD1，及 (b)第一及第二多肽，其藉由雙硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於 (i)分別地，該第一多肽含有CH1或CL結構域且該第二多肽含有CL或CH1結構域，其中該第二多肽藉由該CH1與CL結構域之間的雙硫鍵連接至該第一多肽，且其中該第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其兩個片段，該兩個胞外域或其兩個片段藉由肽連接子彼此連接且連接至該CH1或CL結構域，且其中該第二多肽包含該TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子連接至該多肽之CL或CH1結構域，或 (ii)分別地，該第一多肽含有CH3結構域且該第二多肽含有CH3結構域，且其中該第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其兩個片段，該兩個胞外域或其兩個片段藉由肽連接子彼此連接且連接至該CH3結構域之C端，且其中該第二多肽包含該TNF配位體家族成員之僅一個胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子連接至該多肽之CH3結構域之C端，或 (iii)分別地，該第一多肽含有VH-CL或VL-CH1結構域且該第二多肽含有VL-CH1結構域或VH-CL結構域，其中該第二多肽藉由該CH1與CL結構域之間的雙硫鍵連接至該第一多肽，且其中該第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其片段，該兩個胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且連接至VH或VL，且其中該第二多肽包含該TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子連接至該多肽之VL或VH。 在另一態樣中，提供一種如上文所定義之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a)至少一個部分，其能夠特異性結合於PD1，及 (b)第一及第二多肽，其藉由雙硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於 (i)分別地，該第一多肽含有CH1或CL結構域且該第二多肽含有CL或CH1結構域，其中該第二多肽藉由該CH1與CL結構域之間的雙硫鍵連接至該第一多肽，且其中該第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其兩個片段，該兩個胞外域或其兩個片段藉由肽連接子彼此連接且連接至該CH1或CL結構域，且其中該第二多肽包含該TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子連接至該多肽之CL或CH1結構域，或 (ii)分別地，該第一多肽含有CH3結構域且該第二多肽含有CH3結構域，且其中該第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其兩個片段，該兩個胞外域或其兩個片段藉由肽連接子彼此連接且連接至該CH3結構域之C端，且其中該第二多肽包含該TNF配位體家族成員之僅一個胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子連接至該多肽之CH3結構域之C端。 在一個態樣中，含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含選自4-1BBL及OX40L之共刺激人類T細胞活化之TNF配位體家族成員。更特定言之，TNF配位體家族成員為4-1BBL。 在另一態樣中，TNF配位體家族成員之胞外域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8，尤其SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5之胺基酸序列。更特定言之，TNF配位體家族成員之胞外域包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列。 在另一態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a)至少一個部分，其能夠特異性結合於PD1，及 (b)第一及第二多肽，其藉由雙硫鍵彼此連接， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:10，且其特徵在於第二多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5。 在一個態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a)至少一個部分，其能夠特異性結合於PD1，及 (b)第一及第二多肽，其藉由雙硫鍵彼此連接， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列且其特徵在於第二多肽包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列。 在另一態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a)至少一個部分，其能夠特異性結合於PD1，及 (b)第一及第二多肽，其藉由雙硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列且其特徵在於第二多肽包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列。 在另一態樣中，TNF配位體家族成員係OX40L。在一特定態樣中，提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中TNF配位體家族成員之胞外域包含SEQ ID NO:114或SEQ ID NO:115之胺基酸序列，尤其SEQ ID NO:114之胺基酸序列。 在另一態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a)至少一個部分，其能夠特異性結合於PD1， (b)分別地，含有CH1或CL結構域之第一多肽及含有CL或CH1結構域之第二多肽，其中第二多肽藉由CH1與CL結構域之間的雙硫鍵連接至第一多肽， 且其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其兩個片段，該兩個胞外域或其兩個片段藉由肽連接子彼此連接且連接至CH1或CL結構域，且第二多肽包含該TNF配位體家族成員之僅一個胞外域或其片段，該胞外域或其片段藉由肽連接子連接至該多肽之CL或CH1結構域。 在一個態樣中，提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a)至少一個部分，其能夠特異性結合於PD1， (b)含有CH1結構域之第一多肽及含有CL結構域之第二多肽，其中第二多肽藉由CH1與CL結構域之間的雙硫鍵連接至第一多肽， 且其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其兩個片段，該兩個胞外域或其兩個片段藉由肽連接子彼此連接且連接至CH1結構域，且其特徵在於第二多肽包含該TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子連接至該多肽之CL結構域。 在另一態樣中，提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a)至少一個部分，其能夠特異性結合於PD1， (b)含有CL結構域之第一多肽及含有CH1結構域之第二多肽，其中第二多肽藉由CH1與CL結構域之間的雙硫鍵連接至第一多肽， 且其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其兩個片段，該兩個胞外域或其兩個片段藉由肽連接子彼此連接且連接至CL結構域，且其特徵在於第二多肽包含該TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子連接至該多肽之CH1結構域。 在另一態樣中，本發明提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a)一個部分，其能夠特異性結合於PD1，及 (b)第一及第二多肽，其藉由雙硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於該第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其兩個片段，該兩個胞外域或其兩個片段藉由肽連接子彼此連接，且其特徵在於該第二多肽包含該TNF配位體家族成員之僅一個胞外域或其片段。 在又一態樣中，本發明提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a)多於一個部分，其能夠特異性結合於PD1，及 (b)第一及第二多肽，其藉由雙硫鍵彼此連接， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其兩個片段，該兩個胞外域或其兩個片段藉由肽連接子彼此連接，且其特徵在於第二多肽包含該TNF配位體家族成員之僅一個胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子連接至該多肽。 在一個態樣中，本發明提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a)兩個部分，其能夠特異性結合於PD1，及 (b)第一及第二多肽，其藉由雙硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於該第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其兩個片段，該兩個胞外域或其兩個片段藉由肽連接子彼此連接，且其特徵在於該第二多肽包含該TNF配位體家族成員之僅一個胞外域或其片段。 在一特定態樣中，提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a)至少一個部分，其能夠特異性結合於PD1，及 (b)第一及第二多肽，其藉由雙硫鍵彼此連接， 其中抗原結合分子之特徵在於分別地第一多肽含有CH3結構域且第二多肽含有CH3結構域，且其中該第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其片段，該兩個胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且連接至CH3結構域之C端，且其中該第二多肽包含該TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子連接至該多肽之CH3結構域之C端。特定言之，此類含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含兩個能夠特異性結合於靶細胞抗原之部分。 在一個態樣中，本發明提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a)兩個部分，其能夠特異性結合於PD1，及 (b)第一及第二多肽，其藉由雙硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於該第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其兩個片段，該兩個胞外域或其兩個片段藉由肽連接子彼此連接，且其特徵在於該第二多肽包含該TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段， 其中該兩個能夠特異性結合於靶細胞抗原之部分結合於兩個不同的靶細胞抗原。 在另一態樣中，本發明提供一種如上文所定義之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於靶細胞抗原之部分係選自由以下組成之群：抗體、抗體片段及骨架抗原結合蛋白。 在一個態樣中，提供一種如上文所述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於PD1之部分係選自由以下組成之群：抗體片段、Fab分子、交換型Fab分子、單鏈Fab分子、Fv分子、scFv分子、單域抗體、aVH及骨架抗原結合蛋白。在一個態樣中，能夠特異性結合於PD1之部分係aVH或骨架抗原結合蛋白。在一個態樣中，能夠特異性結合於靶細胞抗原之部分係能夠特異性結合於靶細胞抗原之骨架抗原結合蛋白。 詳言之，含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含一或兩個能夠特異性結合於PD1之部分。 在一特定態樣中，提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於PD1之部分係能夠特異性結合於PD1之Fab分子或交換型Fab分子。詳言之，能夠特異性結合於靶細胞抗原之部分係能夠特異性結合於PD1之Fab。 在另一態樣中，提供一種根據本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中包含TNF配位體家族成員之藉由第一肽連接子彼此連接之兩個胞外域或其片段的肽在其C端藉由第二肽連接子與重鏈之CH1結構域融合，且其中該TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段在其C端藉由第三肽連接子與輕鏈上之CL結構域融合。 在另一態樣中，提供一種根據本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中包含TNF配位體家族成員之藉由第一肽連接子彼此連接之兩個胞外域或其片段的肽在其C端藉由第二肽連接子與重鏈之CL結構域融合，且其中該TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段在其C端藉由第三肽連接子與輕鏈上之CH1結構域融合。 在另一態樣中，本發明涉及一種根據本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中包含TNF配位體家族成員之藉由第一肽連接子彼此連接之兩個胞外域或其片段的肽在其C端藉由第二肽連接子與輕鏈之CL結構域融合，且其中該TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段在其C端藉由第三肽連接子與重鏈之CH1結構域融合。 在一特定態樣中，本發明係關於一種如上文所定義之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中肽連接子係(G4S)2
。在一個態樣中，第一肽連接子係(G4S)2
(SEQ ID NO:117)，第二肽連接子係GSPGSSSSGS (SEQ ID NO:122)且第三肽連接子係(G4S)2
(SEQ ID NO:117)。詳言之，本發明係關於一種如上文所定義之含TNF配位三聚體之抗原結合分子，其中第一肽連接子係(G4S)2
(SEQ ID NO:117)，第二肽連接子係(G4S)2
(SEQ ID NO:117)且第三肽連接子為(G4S)2
(SEQ ID NO:117)。 在另一態樣中，如上文所定義之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含由能夠穩定締合之第一及第二子單元組成之Fc結構域。 詳言之，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含(a)能夠特異性結合於PD1之Fab分子，其中Fab重鏈在C端與Fc結構域中CH2結構域之N端融合，及(c)由能夠穩定締合之第一及第二子單元構成之Fc結構域。 在另一態樣中，Fc結構域係IgG，尤其IgG1 Fc結構域或IgG4 Fc結構域。更特定言之，Fc結構域係IgG1 Fc結構域。在一特定態樣中，Fc結構域包含促進Fc結構域之第一及第二子單元之締合的修飾。 降低Fc受體結合及/或效應功能之Fc結構域修飾 本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之Fc結構域由包含免疫球蛋白分子之重鏈域的一對多肽鏈組成。舉例而言，免疫球蛋白G (IgG)分子之Fc結構域係二聚體，其中各子單元包含CH2及CH3 IgG重鏈恆定域。Fc結構域之兩個子單元能夠彼此穩定締合。 Fc結構域賦予本發明之抗原結合分子有利的藥物動力學特性，包括長血清半衰期，其促進目標組織中之良好聚集及有利的組織-血液分佈率。然而，其同時可引起本發明之雙特異性抗體不合需要地靶向表現Fc受體之細胞並非較佳的攜有抗原之細胞。因此，在特定態樣中，與原生IgG1 Fc結構域相比，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子的Fc結構域呈現降低之針對Fc受體之結合親和力及/或降低之效應功能。在一個態樣中，Fc不實質上結合於Fc受體及/或不誘導效應功能。在一特定態樣中，Fc受體係Fcγ受體。在一個態樣中，Fc受體係人類Fc受體。在一特定態樣中，Fc受體係活化人類Fcγ受體，更特定言之，係人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特定言之，係人類FcγRIIIa。在一個態樣中，Fc結構域不誘導效應功能。降低之效應功能可包括(但不限於)以下中之一或多者：降低之補體依賴性細胞毒性(CDC)、降低之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、降低之抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、降低之細胞激素分泌、降低之免疫複合物介導之抗原呈現細胞之抗原捕捉、降低之與NK細胞之結合、降低之與巨噬細胞之結合、降低之與單核細胞之結合、降低之與多形核細胞之結合、降低之誘導細胞凋亡之直接信號傳導、降低之樹突狀細胞成熟或降低之T細胞激活。 在某些態樣中，可將一或多個胺基酸修飾引入至本文中提供之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之Fc區中，由此產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如取代)之人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。 在一特定態樣中，本發明提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a)至少一個部分，其能夠特異性結合於PD1， (b)第一及第二多肽，其藉由雙硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於該第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其兩個片段，該兩個胞外域或其兩個片段藉由肽連接子彼此連接，且其特徵在於該第二多肽包含該TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段，及 (c) Fc結構域，其由能夠穩定締合之第一及第二子單元構成，其中Fc結構域包含一或多個胺基酸取代，其使與Fc受體，尤其與Fcγ受體之結合減少。 在一個態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子的Fc結構域包含一或多個胺基酸突變，其降低Fc結構域對Fc受體及/或效應子功能之結合親和力。典型地，Fc結構域之兩個子單元中之每一者中存在相同的一或多個胺基酸突變。詳言之，Fc結構域在位置E233、L234、L235、N297、P331及P329 (EU編號)處包含胺基酸取代。詳言之，Fc結構域包含IgG重鏈之位置234及235 (EU編號)及/或329 (EU編號)處的胺基酸取代。更特定言之，提供根據本發明之含三聚TNF家族配位體之抗原結合分子，其包含具有IgG重鏈中之胺基酸取代L234A、L235A及P329G (「P329G LALA」，EU編號)之Fc結構域。胺基酸取代L234A及L235A係指所謂的LALA突變。胺基酸取代之「P329G LALA」組合幾乎完全消除人類IgG1 Fc結構域之Fcγ受體結合且描述於國際專利申請公開案第WO 2012/130831 A1號中，其亦描述製備此類突變型Fc結構域之方法及測定其特性(諸如Fc受體結合或效應功能)之方法。「EU編號」係指根據Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 美國公共衛生署, 美國國家衛生研究院, Bethesda, MD, 1991之EU索引之編號。 具有降低之Fc受體結合及/或效應功能之Fc結構域亦包括具有Fc結構域殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者之取代的結構域(美國專利第6,737,056號)。此類Fc突變體包括具有胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者之取代的Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸的所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。 在另一態樣中，Fc結構域係IgG4 Fc結構域。相較於IgG1抗體，IgG4抗體展現減小之與Fc受體之結合親和力及減少之效應功能。在一更特定態樣中，Fc結構域係包含位置S228 (Kabat編號)之胺基酸取代(特定言之，胺基酸取代S228P)的IgG4 Fc結構域。在一更特定態樣中，Fc結構域係IgG4 Fc結構域，其包含胺基酸取代L235E及S228P及P329G (EU編號)。此類IgG4 Fc結構域突變體及其Fcγ受體結合特性亦描述於WO 2012/130831中。 突變型Fc結構域可使用此項技術中熟知之遺傳學或化學方法、藉由胺基酸缺失、取代、插入或修飾來製備。遺傳學方法可包括DNA編碼序列之位點特異性突變誘發、PCR、基因合成及類似方法。恰當的核苷酸變化可藉由例如定序來檢驗。 與Fc受體之結合可容易例如藉由ELISA，或藉由表面電漿子共振(SPR)，使用標準儀器，諸如BIAcore儀器(GE Healthcare)測定，且可藉由重組表現來獲得諸如Fc受體。適合的此類結合分析描述於本文中。或者，Fc結構域或包含Fc結構域之細胞活化雙特異性抗原結合分子對Fc受體之結合親和力可使用已知表現特定Fc受體的細胞株(諸如表現FcγIIIa受體的人類NK細胞)評價。 Fc結構域或包含Fc結構域之本發明之雙特異性抗體之效應功能可藉由此項技術中已知之方法量測。適用於量測ADCC之分析描述於本文中。用於評定相關分子之ADCC活性的活體外分析之其他實例描述於美國專利第5,500,362號；Hellstrom等人 Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及Hellstrom等人, Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；美國專利第5,821,337號；Bruggemann等人, J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)中。或者，可採用非放射性分析方法(參見例如流動式細胞測量術用的ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；及CytoTox 96®
非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI))。適用於此類分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可例如在動物模型中，諸如Clynes等人, Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)中所揭示之動物模型中活體內評定相關分子之ADCC活性。 在一些實施例中，Fc結構域相對於補體組分(特定言之，C1q)的結合減少。因此，在其中Fc結構域經工程改造而具有減少之效應功能的一些實施例中，該減少之效應功能包括降低之CDC。可進行C1q結合分析以測定本發明之雙特異性抗體是否能夠結合C1q且因此具有CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評定補體活化，可執行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人, J Immunol Methods 202, 163 (1996)；Cragg等人, Blood 101, 1045-1052 (2003)；及Cragg及Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004))。 在一特定態樣中，Fc結構域包含促進Fc結構域之第一及第二子單元之締合的修飾。 促進雜二聚化之Fc結構域修飾 在一個態樣中，含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含(a)至少一個部分，其能夠特異性結合於PD1， (b)第一及第二多肽，其藉由雙硫鍵彼此連接， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其兩個片段，該兩個胞外域或其兩個片段藉由肽連接子彼此連接，且其特徵在於第二多肽包含該TNF配位體家族成員之僅一個胞外域或其片段，及(c) Fc結構域，其由能夠穩定締合之第一及第二子單元構成，其中Fc結構域包含一或多個胺基酸取代，其使與Fc受體，尤其與Fcγ受體之結合減少。因此，其包含不同部分，與兩個不相同的多肽鏈(「重鏈」)中通常所包含之Fc結構域之兩個子單元中之一者或另一者融合。此等多肽之重組共表現及隨後二聚化引起兩種多肽出現若干種可能的組合。為改良重組製造中含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之產率及純度，因此宜在本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之Fc結構域中引入促進所需多肽之締合的修飾。 因此，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之Fc結構域包含促進Fc結構域之第一及第二子單元之締合的修飾。人類IgG Fc結構域中之兩個子單元之間最廣泛蛋白質-蛋白質相互作用的位點存在於Fc結構域之CH3結構域中。因此，該修飾尤其存在於Fc結構域之CH3結構域中。 在一特定態樣中，該修飾係所謂的「杵臼」修飾，其包含Fc結構域之兩個子單元中之一者中的「杵」修飾及Fc結構域之兩個子單元之另一者中的「臼」修飾。因此，在一特定態樣中，本發明係關於如上文中所述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含IgG分子，其中第一重鏈之Fc部分包含第一二聚模組且第二重鏈之Fc部分包含第二二聚模組，從而實現IgG分子之兩個重鏈之雜二聚化，且根據杵臼技術，第一二聚模組包含杵且第二二聚模組包含臼。 杵臼技術描述於例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人, Prot Eng 9, 617-621 (1996)及Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)中。一般而言，方法包括在第一多肽之界面處引入隆凸(「杵」)及在第二多肽之界面處引入相應凹穴(「臼」)，使得隆凸可定位於凹穴中以便促進雜二聚體形成且阻礙均二聚體形成。隆凸藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換第一多肽界面中之小胺基酸側鏈來構築。大小與隆凸相同或相似的補償性凹穴藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換交大胺基酸側鏈而形成於第二多肽之界面中。 因此，在一特定態樣中，在本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之Fc結構域之第一子單元之CH3結構域中，胺基酸殘基經具有較大側鏈體積的胺基酸殘基置換，由此在第一子單元之CH3結構域內產生可定位於第二子單元之CH3結構域內之凹穴中的隆凸，且在Fc結構域之第二子單元之CH3結構域中，胺基酸殘基經具有較小側鏈體積的胺基酸殘基置換，由此在第二子單元之CH3結構域內產生供第一子單元之CH3結構域內之隆凸可定位於其中的凹穴。 隆凸及凹穴可藉由改變編碼多肽之核酸，例如藉由定點突變誘發或藉由肽合成產生。 在一特定態樣中，在Fc結構域之第一子單元之CH3結構域中，位置366處之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基(T366W)置換，且在Fc結構域之第二子單元之CH3結構域中，位置407處之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基(Y407V)置換。更特定言之，另外在Fc結構域之第二子單元中，位置366處之蘇胺酸殘基經絲胺酸殘基(T366S)置換且位置368處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基(L368A)置換。更特定言之，另外在Fc結構域之第一子單元中，位置354處之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基(S354C)置換，且另外在Fc結構域之第二子單元中，位置349處之酪胺酸殘基經半胱胺酸殘基(Y349C)置換。引入此等兩個半胱胺酸殘基可引起在Fc結構域之兩個子單元之間形成雙硫橋鍵。雙硫橋鍵進一步使二聚體穩定(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。 在一替代態樣中，促進Fc結構域之第一及第二次單元之締合的修飾包含調節靜電導引作用之修飾，例如PCT公開案WO 2009/089004中所描述。一般而言，此方法涉及用帶電胺基酸殘基置換兩個Fc結構域子單元之界面處之一或多個胺基酸殘基，使得均二聚體形成變成在靜電上不利的，但雜二聚在靜電上為有利的。CH1/CL 結構域中之修飾
為了進一步改良正確配對，含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子可含有不同的帶電胺基酸取代(所謂的「帶電殘基」)。將此等修飾引入交叉或非交叉CH1及CL結構域中。在一特定態樣中，本發明係關於一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中在一個CL結構域中，位置123 (EU編號)處之胺基酸經精胺酸(R)置換且位置124 (EU編號)處之胺基酸經離胺酸(K)取代，且其中在一個CH1結構域中，位置147 (EU編號)及位置213 (EU編號)處之胺基酸經麩胺酸(E)取代。 更特定言之，本發明係關於一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中在與TNF配位體家族成員相鄰之CL結構域中，位置123 (EU編號)處之胺基酸由精胺酸(R)置換且位置124 (EU編號)處之胺基酸經離胺酸(K)取代，且其中在與TNF配位體家族成員相鄰之CH1結構域中，位置147 (EU編號)及位置213 (EU編號)處之胺基酸經麩胺酸(E)取代。 因此，在一特定態樣中，提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a)至少一個部分，其能夠特異性結合於PD1， (b)包含胺基酸突變E123R及Q124K之含有CL結構域之第一多肽及包含胺基酸突變K147E及K213E之含有CH1結構域第二多肽，其中第二多肽藉由CH1與CL結構域之間的雙硫鍵連接至第一多肽， 且其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其兩個片段，該兩個胞外域或其兩個片段藉由肽連接子彼此連接且連接至CL結構域，且其特徵在於第二多肽包含該TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子連接至該多肽之CH1結構域。 特定的含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子 在另一態樣中，本發明提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中分別地，抗原結合分子包含 第一重鏈及第一輕鏈，其皆包含能夠特異性結合於PD1之Fab分子， 第一肽，其包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其片段，該兩個胞外域或其片段藉由第一肽連接子彼此連接，該第一肽在其C端藉由第二肽連接子與第二重鏈或輕鏈融合， 及第二肽，其包含該TNF配位體家族成員之一個胞外域，該第二肽在其C端藉由第三肽連接子與第二輕鏈或重鏈融合。 在另一態樣中，提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中第一肽在其C端藉由第二肽連接子與作為重鏈之一部分的CH1結構域融合，該第一肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其片段，該兩個胞外域或其片段藉由第一肽連接子彼此連接，且第二肽在其C端藉由第三肽連接子與作為輕鏈之一部分的CL結構域融合，該第二肽包含該TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段。 在又一態樣中，提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中第一肽在其C端藉由第二肽連接子與作為重鏈之一部分的CL結構域融合，該第一肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其片段，該兩個胞外域或其片段藉由第一肽連接子彼此連接， 及該第二肽在其C端藉由第三肽連接子與作為輕鏈之一部分的CH1結構域融合，該第二肽包含該TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段。 在一個態樣中，本發明提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中在與TNF配位體家族成員相鄰之CL結構域中，位置123 (EU編號)處之胺基酸已經精胺酸(R)置換且位置124 (EU編號)處之胺基酸已經離胺酸(K)取代，且其中在與TNF配位體家族成員相鄰之CH1結構域中，位置147 (EU編號)及位置213 (EU編號)處之胺基酸已經麩胺酸(E)取代。此等修飾產生具有有利特性之所謂的帶電殘基，其避免不合需要的作用，例如錯配。 詳言之，CL結構域包含胺基酸突變E123R及Q124K且CH1結構域包含胺基酸突變K147E及K213E。 在一個態樣中，本發明提供一種如上文所定義之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於PD1之部分為骨架抗原結合蛋白。 在一特定態樣中，本發明係關於一種如上文所定義之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於PD1之部分為能夠特異性結合於靶細胞抗原之Fab分子。 本發明提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含至少一個能夠特異性結合於PD1之部分。在一特定態樣中，含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含一個能夠特異性結合於PD1之部分，意謂含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子係單價的。在另一態樣中，本發明提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含兩個能夠特異性結合於PD1之部分，意謂含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子係二價的。 在一個態樣中，本發明提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該能夠特異性結合於PD1之部分包含 (a) VH結構域，其包含(i)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列的HVR-H3；及VL結構域，其包含(iv)包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列的HVR-L3， (b) VH結構域，其包含(i)包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列的HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列的HVR-H3；及VL結構域，其包含(iv)包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列的HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列的HVR-L3， (c) VH結構域，其包含(i)包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列的HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列的HVR-H3；及VL結構域，其包含(iv)包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列的HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:39之胺基酸序列的HVR-L3， (d) VH結構域，其包含(i)包含SEQ ID NO:42之胺基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列的HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:44之胺基酸序列的HVR-H3；及VL結構域，其包含(iv)包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:46之胺基酸序列的HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列的HVR-L3， (e) VH結構域，其包含(i)包含SEQ ID NO:50之胺基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:51之胺基酸序列的HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:52之胺基酸序列的HVR-H3；及VL結構域，其包含(iv)包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列的HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列的HVR-L3， (f) VH結構域，其包含(i)包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列的HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列的HVR-H3；及VL結構域，其包含(iv)包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:62之胺基酸序列的HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:63之胺基酸序列的HVR-L3，或 (g) VH結構域，其包含(i)包含SEQ ID NO:66之胺基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:68之胺基酸序列的HVR-H3；及VL結構域，其包含(iv)包含SEQ ID NO:69之胺基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:70之胺基酸序列的HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:71之胺基酸序列的HVR-L3。 在另一態樣中，本發明提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該能夠特異性結合於PD1之部分包含 (a)包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列的VL結構域， (b)包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列的VL結構域， (c)包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列的VL結構域， (d)包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列的VL結構域， (e)包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列的VL結構域， (f)包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列的VL結構域， (g)包含SEQ ID NO:40之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列的VL結構域， (h)包含SEQ ID NO:48之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:49之胺基酸序列的VL結構域， (i)包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列的VL結構域， (k)包含SEQ ID NO:64之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:65之胺基酸序列的VL結構域，或 (l)包含SEQ ID NO:72之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:73之胺基酸序列的VL結構域。 在一個態樣中，本發明提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該能夠特異性結合於PD1之部分包含 (a) VH結構域，其包含(i)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列的HVR-H3；及VL結構域，其包含(iv)包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列的HVR-L3。 在一特定態樣中，本發明提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該能夠特異性結合於PD1之部分包含 (a)包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列的VL結構域， (b)包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列的VL結構域， (c)包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列的VL結構域， (d)包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列的VL結構域，或 (e)包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列的VL結構域。 在另一態樣中能夠特異性結合於PD1之部分包含重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:21之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%、100%一致之胺基酸序列，及輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:22之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。 在另一態樣中，能夠特異性結合於PD1之部分包含重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:21之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列，及輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:24之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。 在一個態樣中，提供一種如上文所定義之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中能夠特異性結合於PD1之部分包含有包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列的可變輕鏈，或其中能夠特異性結合於FAP之部分包含有包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列的可變輕鏈。 在一特定態樣中，能夠特異性結合於PD1之部分包含有包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列的輕鏈可變區。在另一特定態樣中，能夠特異性結合於PD1之部分包含有包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一特定態樣中，能夠特異性結合於PD1之部分包含由SEQ ID NO:21之胺基酸序列組成之VH結構域及由SEQ ID NO: 22之胺基酸序列組成之VL結構域或由SEQ ID NO:21之胺基酸序列組成之VH結構域及由SEQ ID NO:24之胺基酸序列組成之VL結構域。 在另一態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a)至少一個能夠特異性結合於PD1之部分，其包含有包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列的輕鏈可變區或包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列的輕鏈可變區，及 (b)第二重鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:10，及 第二輕鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5。 在一特定態樣中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含 (a)至少一個能夠特異性結合於PD1之部分，其包含有包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列的輕鏈可變區或包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列的輕鏈可變區，及 (b)第一及第二多肽，其藉由雙硫鍵彼此連接， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列且第二多肽包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列。 在另一態樣中，提供一種如上文中所述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含 (a)第一重鏈及第一輕鏈，其皆包含能夠特異性結合於PD1之Fab分子， (b)第二重鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:10，及 第二輕鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5。 在一個態樣中，本發明提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含 (a)能夠特異性結合於PD1之Fab分子，其包含有包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列的輕鏈可變區或包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列的輕鏈可變區，及 (b)第二重鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:10，及 第二輕鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5。 在一個態樣中，本發明提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含 (a)(i)第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列的VL結構域，或 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之VL結構域：SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:25，及 (b)第二重鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:10，及 第二輕鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5。 在一特定態樣中，提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含 (i)第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列的VL結構域，或 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之VL結構域：SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:25， (ii)第二重鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:80，及 (iii)第二輕鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79及SEQ ID NO:81。 在另一態樣中，本發明提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含 (a)包含SEQ ID NO:82之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:83之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:74之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:75之胺基酸序列的第二輕鏈， (b)包含SEQ ID NO:82之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:83之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:76之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:77之胺基酸序列的第二輕鏈， (c)包含SEQ ID NO:82之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:83之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:78之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:79之胺基酸序列的第二輕鏈，或 (d)包含SEQ ID NO:82之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:83之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:80之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:81之胺基酸序列的第二輕鏈。 在另一態樣中，本發明提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含 (a)包含SEQ ID NO:82之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:171之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:74之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:75之胺基酸序列的第二輕鏈， (b)包含SEQ ID NO:82之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:171之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:76之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:77之胺基酸序列的第二輕鏈， (c)包含SEQ ID NO:82之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:171之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:78之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:79之胺基酸序列的第二輕鏈，或 (d)包含SEQ ID NO:82之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:171之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:80之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:81之胺基酸序列的第二輕鏈。 詳言之，提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含有包含SEQ ID NO:82之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:83之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:78之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:79之胺基酸序列的第二輕鏈。 在另一特定態樣中，提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含有包含SEQ ID NO:82之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:171之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:78之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:79之胺基酸序列的第二輕鏈。 在又一態樣中，本發明提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a)至少一個部分，其能夠特異性結合於PD1，及 (b)第一及第二多肽，其藉由雙硫鍵彼此連接， 其中抗原結合分子之特徵在於分別地第一多肽含有CH3結構域且第二多肽含有CH3結構域，且其中該第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其片段，該兩個胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且連接至CH3結構域之C端，且其中該第二多肽包含該TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子連接至該多肽之CH3結構域之C端。 詳言之，此類含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含兩個能夠特異性結合於PD1之Fab結構域。 詳言之，提供一種如上文中所述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a)包含SEQ ID NO:84之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:85之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:83之胺基酸序列的兩個輕鏈，或 (b)包含SEQ ID NO:86之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:87之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:83之胺基酸序列的兩個輕鏈。 在另一態樣中，提供一種如上文所述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a)包含SEQ ID NO:84之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:85之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:171之胺基酸序列的兩個輕鏈，或 (b)包含SEQ ID NO:86之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:87之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:171之胺基酸序列的兩個輕鏈。 在另一特定態樣中，本發明提供一種如上文所述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子包含一個能夠特異性結合於PD1之Fab結構域。 在此類態樣中，提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含 (i)融合多肽，其包含Fc結構域之第一子單元及TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其片段，該兩個胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且連接至CH3結構域之C端，(ii)重鏈，其包含能夠特異性結合於PD1之Fab結構域之VH結構域、Fc結構域之第二子單元及該TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子連接至CH3結構域之C端，及(iii)輕鏈，其包含能夠特異性結合於PD1之Fab結構域的VL結構域，或 (i)融合多肽，其包含Fc結構域之第一子單元及TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段，該胞外域或其片段藉由肽連接子連接至CH3結構域之C端，(ii)重鏈，其包含能夠特異性結合於PD1之Fab結構域的VH結構域、Fc結構域之第二子單元及該TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其片段，該兩個胞外域或其片段經由肽連接子彼此連接且連接至CH3結構域之C端，及(iii)輕鏈，其包含能夠特異性結合於PD1之Fab結構域的VL結構域。 在一特定態樣中，提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含 (a)包含SEQ ID NO:88之胺基酸序列的融合多肽、包含SEQ ID NO:87之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO:83之胺基酸序列的輕鏈， (b)包含SEQ ID NO:89之胺基酸序列的融合多肽、包含SEQ ID NO:90之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO:83之胺基酸序列的輕鏈， (c)包含SEQ ID NO:91之胺基酸序列的融合多肽、包含SEQ ID NO:86之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO:83之胺基酸序列的輕鏈，或 (d)包含SEQ ID NO:93之胺基酸序列的融合多肽、包含SEQ ID NO:92之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO:83之胺基酸序列的輕鏈。 在另一特定態樣中，提供一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中抗原結合分子包含 (a)包含SEQ ID NO:88之胺基酸序列的融合多肽、包含SEQ ID NO:87之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO:171之胺基酸序列的輕鏈， (b)包含SEQ ID NO:89之胺基酸序列的融合多肽、包含SEQ ID NO:90之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO:171之胺基酸序列的輕鏈， (c)包含SEQ ID NO:91之胺基酸序列的融合多肽、包含SEQ ID NO:86之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO:171之胺基酸序列的輕鏈，或 (d)包含SEQ ID NO:93之胺基酸序列的融合多肽、包含SEQ ID NO:92之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO:171之胺基酸序列的輕鏈。 聚核苷酸 本發明進一步提供編碼如本文中所述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子的分離之聚核苷酸或其片段。 編碼本發明之含有TNF配位三聚體之抗原結合分子的分離之聚核苷酸可表現為編碼整個抗原結合分子之單一聚核苷酸或表現為共表現之多個(例如兩個或更多個)聚核苷酸。由共表現之聚核苷酸編碼之多肽可經由例如雙硫鍵或其他手段締合，以形成功能性抗原結合分子。舉例而言，免疫球蛋白之輕鏈部分可由來自免疫球蛋白之重鏈部分的單獨聚核苷酸編碼。當共表現時，重鏈多肽與輕鏈多肽締合以形成免疫球蛋白。 在一些態樣中，分離之聚核苷酸編碼如本文中所述之根據本發明之整個含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子。詳言之，分離之聚核苷酸編碼如本文中所述之根據本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子中所包含之多肽。 在一個態樣中，本發明係針對編碼含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之分離之聚核苷酸，其中聚核苷酸包含(a)編碼能夠特異性結合於PD1之部分的序列，(b)編碼包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其兩個片段之多肽的序列，該兩個胞外域或其兩個片段藉由肽連接子彼此連接，及(c)編碼包含該TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段之多肽的序列。 在另一態樣中，提供一種編碼含有4-1BB配位三聚體之抗原結合分子的分離之聚核苷酸，其中聚核苷酸包含(a)編碼能夠特異性結合於PD1之部分的序列，(b)編碼包含4-1BBL之兩個胞外域或其兩個片段之多肽的序列，該兩個胞外域或其兩個片段藉由肽連接子彼此連接，及(c)編碼包含4-1BBL之一個胞外域或其片段之多肽的序列。 在另一態樣中，本發明係針對一種分離之聚核苷酸，其包含編碼包含兩個4-1BBL片段之多肽的序列，該兩個4-1BBL片段包含與以SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示之胺基酸序列至少約90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列，且係針對一種聚核苷酸，其包含編碼包含一個4-1BBL片段之多肽的序列，該一個4-1BBL片段包含與以SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示之胺基酸序列至少約90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。 此外，提供一種編碼含有OX40配位三聚體之抗原結合分子的分離之聚核苷酸，其中聚核苷酸包含(a)編碼能夠特異性結合於PD1之部分的序列，(b)編碼包含OX40L之兩個胞外域或其兩個片段之多肽的序列，該兩個胞外域或其兩個片段藉由肽連接子彼此連接，及(c)編碼包含OX40L之一個胞外域或其片段之多肽的序列。 在其他態樣中，本發明係關於包含與本文中所揭示之特異性cDNA序列至少約90%、95%、98%或100%一致的序列之聚核苷酸。在一特定態樣中，本發明係關於包含與本文中所揭示之特異性cDNA序列中之一者一致的序列之聚核苷酸。 在其他態樣中，核酸分子包含或由編碼如以下中之任一者所闡述之胺基酸序列的核苷酸序列組成：SEQ ID NO:19、20、21、22、23、24、25、32、33、40、41、48、49、56、57、64、65、72或73。在另一態樣中核酸分子包含或由編碼如以下中之任一者所闡述之胺基酸序列的核苷酸序列組成：SEQ ID NO:9、10、11或12。 在其他態樣中，核酸分子包含或由選自由以下組成之群的核苷酸序列組成：SEQ ID NO: 131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150。 在某些態樣中，聚核苷酸或核酸係DNA。在其他實施例中，本發明之聚核苷酸係RNA，例如呈信使RNA (mRNA)形式。本發明之RNA可為單股或雙股RNA。 重組方法 本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子可例如藉由固態肽合成(例如梅里菲爾德固相合成(Merrifield solid phase synthesis))或重組製造來獲得。關於重組製造，分離一或多個編碼含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之聚核苷酸或其多肽片段(例如上文所述)且插入一或多個載體中以用於宿主細胞中之進一步選殖及/或表現。此類聚核苷酸可使用習知程序容易地分離及定序。在本發明之一個態樣中，提供包含本發明之聚核苷酸中之一或多者的載體，較佳係表現載體。可使用熟習此項技術者熟知的方法構築表現載體，該等表現載體具有含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之編碼序列(片段)以及適合的轉錄/轉譯控制信號。此等方法包括活體外重組DNA技術、合成技術及活體內重組/基因重組。參見例如Maniatis等人, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及Ausubel等人, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)中所述之技術。表現載體可為質體、病毒之一部分，或可為核酸片段。表現載體包括其中編碼含有腫瘤壞死因子家族配位三聚體之抗原結合分子之聚核苷酸或其多肽片段(亦即編碼區)以與啟動子及/或其他轉錄或轉譯對照要素可操作地締合之方式選殖的表現卡匣。如本文所用，「編碼區」為由轉譯成胺基酸之密碼子組成的核酸之一部分。「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)雖然未轉譯成胺基酸，但其可視為編碼區(若存在)之一部分，但任何側接序列(例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子、5'及3'未轉譯區及類似序列)並非編碼區之一部分。兩個或更多個編碼區可存在於單一聚核苷酸構築體中，例如單一載體上，或存在於各別聚核苷酸構築體中，例如各別(不同)載體上。此外，任何載體可含有單一編碼區，或可包含兩個或更多個編碼區，例如本發明之載體可編碼一或多個多肽，其經由蛋白水解分裂而轉譯後或共轉譯分離成最終蛋白質。此外，本發明之載體、聚核苷酸或核酸可編碼異源編碼區(與或未與編碼本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子的聚核苷酸或其多肽片段融合)，或其變異體或衍生物。異源編碼區包括(不限於)專門化要素或基元，諸如分泌性信號肽或異源功能域。可操作地締合為基因產物(例如多肽)之編碼區與一或多個調節序列以使基因產物之表現受到調節序列之影響或控制的方式締合。若誘導啟動子功能導致編碼所需基因產物之mRNA轉錄且若兩個DNA片段之間連接的性質不干擾表現調節序列導引基因產物表現的能力或不干擾DNA模板轉錄的能力，則兩個DNA片段(諸如多肽編碼區及與其締合的啟動子)為「可操作地締合」。因此，若啟動子能夠實現編碼多肽之核酸的轉錄，則啟動子區域將與該核酸可操作地締合。啟動子可為僅導引預定細胞中之DNA實質性轉錄之細胞特異性啟動子。除啟動子外之其他轉錄控制要素(例如增強子、操縱子、抑制子及轉錄終止信號)與引導細胞特異性轉錄之聚核苷酸可操作地締合。 適合啟動子及其他轉錄控制區揭示於本文中。多種轉錄控制區已為熟習此項技術者所知。此等區域包括(但不限於)在脊椎動物細胞中起作用的轉錄控制區，諸如(但不限於)啟動子及增強子區段，其來自巨細胞病毒(例如即刻早期啟動子，連同內含子-A)、猴病毒40 (例如早期啟動子)及反轉錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))。其他轉錄控制區包括來源於脊椎動物基因(諸如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔α-血球蛋白)之區域，以及能夠控制真核細胞中之基因表現的其他序列。其他適合的轉錄控制區包括組織特異性啟動子及增強子以及誘導性啟動子(例如啟動子誘導性四環素(tetracyclin))。類似地，多種轉譯控制要素已為一般技術者所知。此等要素包括(但不限於)核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子，以及來源於病毒系統的要素(特定言之，內部核糖體入口位點或IRES，亦稱為CITE序列)。表現卡匣亦可包括其他特徵，諸如複製起點，及/或染色體整合元件，諸如反轉錄病毒長末端重複序列(LTR)，或腺相關病毒(AAV)反向末端重複序列(ITR)。 本發明之聚核苷酸及核酸編碼區可與編碼分泌肽或信號肽的其他編碼區締合，從而引導由本發明之聚核苷酸編碼的多肽的分泌。舉例而言，若需要分泌含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子或其多肽片段，則可將編碼信號序列之DNA置放於編碼本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子或其多肽片段之核酸的上游。根據信號假設，哺乳動物細胞所分泌的蛋白質具有自成熟蛋白質裂解(一旦生長蛋白質鏈跨越粗糙內質網輸出已起始)的信號肽或分泌性前導序列。一般熟習此項技術者認識到，脊椎動物細胞分泌的多肽通常具有與多肽之N端融合的信號肽，該信號肽自所轉譯之多肽裂解而產生呈分泌或「成熟」形式的多肽。在某些實施例中，使用原生信號肽(例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽)，或該序列之功能衍生物，該功能衍生物保留引導與其可操作地締合之多肽之分泌的能力。或者，可使用異源哺乳動物信號肽或其功能衍生物。舉例而言，野生型前導序列可經人類組織纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸酶之前導序列取代。 編碼可用於促進較晚純化(例如組胺酸標籤)或有助於標記融合蛋白之短蛋白質序列之DNA可包括於編碼本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子或其多肽片段之聚核苷酸內或位於其末端。 在本發明之另一態樣中，提供包含一或多種本發明之聚核苷酸的宿主細胞。在某些實施例中，提供包含一或多種本發明載體之宿主細胞。聚核苷酸及載體可合併本文分別關於聚核苷酸及載體所述之任一特徵(單個或組合)。在一個態樣中，宿主細胞包含載體(例如已經其轉型或轉染)，該載體包含編碼本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子(之一部分)的聚核苷酸。如本文中所用，術語「宿主細胞」係指任何類型之可經工程改造以產生本發明之融合蛋白或其片段的細胞系統。適用於複製及支持抗原結合分子之表現的宿主細胞為此項技術中熟知。此類細胞可視需要經特定表現載體轉染或轉導，且可生長含有大量載體之細胞以用於接種大型醱酵槽，以獲得足量抗原結合分子以用於臨床應用。適合的宿主細胞包括原核微生物，諸如大腸桿菌，或各種真核生物細胞，諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、昆蟲細胞或其類似物。舉例而言，可利用細菌產生多肽，特別是在不需要糖基化時。在表現之後，可自可溶性部分之細菌細胞糊狀物分離出多肽且可將該多肽進一步純化。除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為適用於編碼多肽之載體的選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」，從而產生具有部分或完全人類糖基化型態之多肽的真菌及酵母菌株。參見Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)，及Li等人, Nat Biotech 24, 210-215 (2006)。 適用於表現(糖基化)多肽之宿主細胞亦來源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出眾多可與昆蟲細胞結合使用，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞之桿狀病毒株。植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述在轉殖基因植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM
技術)。脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例係經SV40轉型之猴腎CV1細胞株(COS-7)；人類胎腎細胞株(293或293T細胞，如例如Graham等人, J Gen Virol 36, 59 (1977)中所述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cell) (TM4細胞，如例如Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)中所述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；水牛鼠肝細胞(buffalo rat liver cell) (BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤細胞(MMT 060562)；TRI細胞(如例如Mather等人, Annals N. Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)中所述)；MRC 5細胞及FS4細胞。其他適用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括dhfr-CHO細胞(Urlaub等人, Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如YO、NS0、P3X63及Sp2/0。關於適用於蛋白質產生之某些哺乳動物宿主細胞株之綜述，參見例如Yazaki及Wu, Methods in Molecular Biology, 第248卷 (B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ), 第255-268頁(2003)。宿主細胞包括經培養細胞，例如經培養之哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、細菌細胞及植物細胞(僅舉數例)，而且包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或經培養之植物或動物組織中所包含的細胞。在一個實施例中，宿主細胞為真核生物細胞，較佳為哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人類胚腎(HEK)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。此項技術中已知在此等系統中表現外源基因的標準技術。表現包含免疫球蛋白之重鏈或輕鏈之多肽的細胞可經工程改造以亦表現免疫球蛋白鏈中之另一者，使得所表現產物為具有重鏈及輕鏈的免疫球蛋白。 在一個態樣中，提供製造本發明之含有腫瘤壞死因子家族配位三聚體之抗原結合分子或其多肽片段之方法，其中該方法包含在適用於表現本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子或其多肽片段之條件下培養包含聚核苷酸之宿主細胞，該等聚核苷酸編碼如本文中提供之本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子或其多肽片段，及自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子或其多肽片段。 在本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子中，該等組分(至少一個能夠特異性結合於靶細胞抗原之部分、一個包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其片段的多肽及一個包含該TNF家族配位體家族成員之一個胞外域或其片段的多肽)不以遺傳學方式彼此融合。多肽經設計使得其組分(TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其片段及其他組分，諸如CH或CL)直接或經由連接子序列彼此融合。連接子之組成及長度可根據此項技術中熟知之方法確定且可測試其功效。本發明之抗原結合分子之不同組分之間的連接子序列之實例見於本文中提供之序列中。亦可包括合併裂解位點的其他序列以在必要時將融合蛋白中之個別組分分離，例如內肽酶識別序列。 在某些實施例中，形成抗原結合分子之一部分的能夠特異性結合於靶細胞抗原(例如Fab片段)之部分包含至少一個能夠結合於抗原之免疫球蛋白可變區。可變區可形成天然或非天然產生之抗體及其片段之一部分且來源於天然或非天然產生之抗體及其片段。製造多株抗體及單株抗體之方法為此項技術中熟知(參見例如Harlow及Lane, 「Antibodies, a laboratory manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。非天然產生之抗體可使用固相肽合成法構築，可以重組方式製造(例如如美國專利第4,186,567號中所述)或可藉由例如篩檢包含可變重鏈及可變輕鏈之組合文庫來獲得(參見例如McCafferty之美國專利第5,969,108號)。 本發明中可使用任何動物物種之免疫球蛋白。適用於本發明之非限制性免疫球蛋白可為鼠、靈長類動物或人類來源。若融合蛋白意欲用於人類用途，則可使用其中免疫球蛋白之恆定區來自人類之免疫球蛋白之嵌合形式。亦可根據此項技術中熟知之方法製備免疫球蛋白之人類化或完全人類形式(參見例如Winter之美國專利第5,565,332號)。人類化可藉由各種方法達成，包括(但不限於) (a)將非人類(例如供者抗體)CDR移植至人類(例如接受者抗體)構架區及恆定區上，保留或不保留關鍵構架殘基(例如對於保留良好抗原結合親和力或抗體功能而言具有重要作用的該等殘基)；(b)僅將非人類特異性決定區(SDR或a-CDR；對於抗體-抗原相互作用而言具有關鍵作用的殘基)移植至人類構架區及恆定區上；或(c)移植整個非人類可變域，但藉由表面殘基置換而用人類類似區段對其進行「遮掩」。人類化抗體及其製造方法綜述於例如Almagro及Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)中，且進一步描述於例如Riechmann等人, Nature 332, 323-329 (1988)；Queen等人, Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Jones等人, Nature 321, 522-525 (1986)；Morrison等人, Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984)；Morrison及Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988)；Verhoeyen等人, Science 239, 1534-1536 (1988)；Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994)；Kashmiri等人, Methods 36, 25-34 (2005) (描述SDR (a-CDR)移植)；Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (描述「表面重修」)；Dall'Acqua等人, Methods 36, 43-60 (2005) (描述「FR改組」)；及Osbourn等人, Methods 36, 61-68 (2005)及Klimka等人, Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (描述FR改組的「導向選擇」方法)中。根據本發明之特定免疫球蛋白係人類免疫球蛋白。人類抗體及人類可變區可使用此項技術中已知之各種技術製造。人類抗體大體上描述於van Dijk及van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001)及Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)中。人類可變區可形成藉由融合瘤方法製得之人類單株抗體的一部分且可來源於藉由融合瘤方法製得的人類單株抗體(參見例如Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 第51-63頁 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。人類抗體及人類可變區亦可藉由如下製備：向已經修飾之轉殖基因動物投與免疫原，從而響應於抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體(參見例如Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)。人類抗體及人類可變區亦可藉由分隔選自人類衍生之噬菌體呈現文庫的Fv純系可變區序列來產生(參見例如Hoogenboom等人, Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien等人編, Human Press, Totowa, NJ, 2001)；及McCafferty等人, Nature 348, 552-554；Clackson等人, Nature 352, 624-628 (1991))。噬菌體通常以單鏈Fv (scFv)片段或Fab片段形式呈現抗體片段。 在某些態樣中，本發明之抗原結合分子中所包含之能夠特異性結合於靶細胞抗原之部分(例如Fab片段)根據例如PCT公開案WO 2012/020006 (參見與親和力成熟相關之實例)或美國專利申請公開案第2004/0132066號中所揭示之方法經工程改造以具有增強之結合親和力。本發明之抗原結合分子結合於特異性抗原決定子之能力可經由酶聯結免疫吸附分析(ELISA)或熟習此項技術者熟悉之其他技術(例如表面電漿子共振(SPR)技術(Liljeblad等人, Glyco J 17, 323-329 (2000))及傳統結合分析(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))量測。可使用競爭分析鑑別與參考抗體競爭結合於特定抗原之抗原結合分子。在某些實施例中，此類競爭抗原結合分子結合於與由參考抗原結合分子所結合相同的抗原決定基(例如直鏈或構形抗原決定基)。抗原結合分子所結合之抗原決定基之定位的詳細例示性方法提供於Morris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」, Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press, Totowa, NJ)中。在例示性競爭分析中，在包含結合於抗原之第一標記抗原結合分子及測試與第一抗原結合分子競爭結合於抗原之能力的第二未標記抗原結合分子之溶液中培育固定抗原。第二抗原結合分子可存在於融合瘤上清液中。作為對照，在包含第一標記抗原結合分子但不包含第二未標記抗原結合分子之溶液中培育固定抗原。在允許第一抗體結合至抗原之條件下培育之後，移除過量的未結合抗體，且量測與所固定抗原締合之標記的量。若與對照樣品相比，測試樣品中與固定抗原締合之標記之量實質上降低，則表明第二抗原結合分子與第一抗原結合分子競爭結合於抗原。參見Harlow及Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual 第14章 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。 如本文中所描述製備之本發明之含有TNF配位三聚體之抗原結合分子可藉由此項技術中已知的技術純化，諸如高效液相層析、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析、尺寸排阻層析及其類似方法。用於純化特定蛋白質之實際條件部分地視諸如淨電荷、疏水性、親水性等因素而定，且對於熟習此項技術者而言為顯而易見的。關於親和層析純化，可使用與含有TNF配位三聚體之抗原結合分子結合之抗體、配位體、受體或抗原。舉例而言，關於本發明之融合蛋白之親和層析純化，可使用具有蛋白質A或蛋白質G之基質。可使用序列蛋白質A或G親和層析及尺寸排阻層析來分離實質上如實例中所描述之抗原結合分子。可藉由多種熟知分析方法(包括凝膠電泳、高壓液相層析及其類似方法)中之任一種測定含有TNF配位三聚體之抗原結合分子或其片段的純度。舉例而言，證實如實例中所描述來表現之含有TNF配位三聚體之抗原結合分子為完整的且經適當組裝，如由還原及非還原性SDS-PAGE證明。 分析 可藉由此項技術中已知之各種分析對本文中提供之抗原結合分子針對其物理/化學特性及/或生物活性進行鑑別、篩檢或表徵。生物活性可包括(例如)增強活化及/或增生不同免疫細胞，尤其T細胞之能力。舉例而言，其增強免疫調節細胞介素(例如干擾素-γ (IFN-γ)及/或腫瘤壞死因子α (TNF α))之分泌。增強或可增強之其他免疫調節細胞介素係例如 IL12、粒酶B等。生物活性亦可包括食蟹獼猴結合交叉反應性以及結合於不同細胞類型。亦提供在活體內及/或活體外具有此類生物活性之抗原結合分子。 1.親和力分析 可使用標準測試設備(諸如BIAcore儀器(GE Healthcare))及諸如可藉由重組表現獲得之受體或靶蛋白質，根據實例中所闡述之方法藉由表面電漿子共振(SPR)測定本文中提供之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子對相應TNF受體之親和力。亦可使用標準測試設備(諸如BIAcore儀器(GE Healthcare))及諸如可藉由重組表現獲得之受體或靶蛋白質，藉由表面電漿子共振(SPR)測定含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子對PD1之親和力。用於量測結合親和力之特定說明性及例示性實施例描述於實例4中。根據一個態樣，藉由表面電漿子共振，使用BIACORE® T100機器(GE Healthcare)在25℃下量測KD
。 2. 結合分析及其他分析 本文中提供之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子與表現相應受體之細胞的結合可使用表現特定受體或靶抗原之細胞株藉由例如流動式細胞測量術(FACS)來評估。在一個態樣中，結合分析中使用表現TNF受體之新鮮的周邊血液單核細胞(PBMC)。此等細胞在分離後(未處理PMBC)或在刺激後(經活化之PMBC)直接使用。在另一態樣中，使用經活化之小鼠脾細胞(表現TNF受體分子)表明本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子與表現相應TNF受體之細胞的結合。 在另一態樣中，使用表現PD1之細胞株表明抗原結合分子與此靶細胞抗原之結合。 在另一態樣中，可使用競爭分析來鑑別分別與特定抗體或抗原結合分子競爭結合於目標或TNF受體之抗原結合分子。在某些實施例中，此類競爭性抗原結合分子結合於與由特異性抗靶抗體或特異性抗TNF受體抗體所結合相同的抗原決定基(例如直鏈或構形抗原決定基)。抗體所結合之抗原決定基之定位的詳細例示性方法提供於Morris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」,Methods in Molecular Biology
第66卷(Humana Press, Totowa, NJ)中。 3. 活性分析 在一個態樣中，提供用於鑑別結合於具有生物活性之特異性靶細胞抗原及特異性TNF受體之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子的分析。生物活性可包括例如經細胞上表現靶細胞抗原之TNF受體進行之促效性信號傳導。亦提供由分析鑑別為具有此類活體外生物活性之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子。 在某些態樣中，針對此類生物活性測試本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子。用於偵測本發明之分子之生物活性的分析係實例5及6中所描述之該等分析。此外，用於偵測細胞溶解(例如藉由量測LDH釋放)、誘導之細胞凋亡動力學(例如藉由量測卡斯蛋白酶3/7活性)或細胞凋亡(例如使用TUNEL分析)之分析為此項技術中熟知的。此外，此類複合物之生物活性可藉由評估其對多種淋巴細胞子集，諸如NK細胞、NKT細胞或γδ T細胞之存活、增生及淋巴激素分泌之作用或評估其調節抗原呈現細胞，諸如樹突狀細胞、單核細胞/巨噬細胞或B細胞之表現型及功能的能力來評估。 醫藥組合物、調配物及投藥途徑 在另一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含本文中提供之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子中之任一者，例如以用於以下治療方法中之任一者。在一個實施例中，醫藥組合物包含本文中提供之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子中之任一者及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。在另一實施例中，醫藥組合物包含本文提供之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子中之任一者及至少一種其他治療劑，例如如下所述。 本發明之醫藥組合物包含治療有效量之一或多種溶解或分散於醫藥學上可接受之賦形劑中之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子。片語「醫藥學上或藥理學上可接受」係指分子實體及組合物在所用劑量及濃度下對於接受者而言一般為無毒性的，亦即當適當時投與至動物(諸如人類)時，不會產生有害的過敏反應或其他不良反應。含有至少一個含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子及視情況存在之其他活性成分之醫藥組合物之製備根據本發明將為熟習此項技術者所已知，如藉由Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版 Mack Printing Company, 1990所例示，其以引用的方式併入本文中。詳言之，組合物係凍乾調配物或水溶液。如本文所用，「醫藥學上可接受之賦形劑」包括任何及所有溶劑、緩衝劑、分散介質、塗料、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗菌劑、抗真菌劑)、等張劑、鹽、穩定劑及其組合，如一般熟習此項技術者所已知。 非經腸組合物包括為藉由注射(例如皮下、皮內、病灶內、靜脈內、動脈內、肌肉內、鞘內或腹膜內注射)投藥所設計的該等組合物。關於注射，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子可於水溶液中調配，較佳於生理上相容的緩衝劑，諸如漢克氏溶液(Hanks' solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理鹽水緩衝劑中調配。溶液可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。或者，融合蛋白可呈粉末形式以用於在使用之前用適合的媒劑(例如無菌無熱原質水)復原。藉由將所需量之本發明之融合蛋白併入視需要具有多種下文列舉之其他成分之適當溶劑中來製備無菌可注射溶液。無菌性可容易藉由例如經由無菌過濾膜過濾來實現。一般而言，分散液係藉由將各種經滅菌之活性成分併入含有基本分散介質及/或其他成分之無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情況下，較佳製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥技術，其利用預先無菌過濾之液體介質產生活性成分與任何其他所需成分之粉末。必要時，液體介質宜經緩衝，且在用足量生理食鹽水或葡萄糖注射之前，首先使液體稀釋劑呈等張性。該組合物在製造及儲存條件下必須為穩定的，且必須避免諸如細菌及真菌之微生物的污染作用。應瞭解，內毒素污染應最低限度地保持在安全水準，例如低於0.5 ng/mg蛋白質。適合的醫藥學上可接受之賦形劑包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子性界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之化合物，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、聚葡萄糖或其類似物。視情況，懸浮液亦可含有適合穩定劑或增加化合物溶解性之試劑以允許製備高度濃縮之溶液。此外，活性化合物之懸浮液可製備成適當的油性注射懸浮液。適合親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，諸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂質體。 活性成分可截留於微膠囊中，例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合作用所製備之微膠囊，例如分別為羥基甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊；截留於膠態藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或巨乳液中。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences (第18版, Mack Printing Company, 1990)中。可製備持續釋放製劑。持續釋放型製劑之適合實例包括含有多肽之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質呈成形物品形式，例如薄膜或微膠囊。在特定實施例中，可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中使用延遲吸收劑(諸如單硬脂酸鋁、明膠或其組合)來達成。 本文中之例示性醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶糖蛋白，諸如rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)。某些示例性sHASEGP (包括rHuPH20)及使用方法描述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，sHASEGP與一或多種其他葡糖胺聚糖酶(諸如軟骨素酶)組合。 例示性凍乾抗體調配物描述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括美國專利第6,171,586號及WO2006/044908中所述之該等調配物，後者調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。 除先前描述之組合物以外，融合蛋白亦可調配成儲存製劑。此類長效調配物可藉由植入(例如皮下或肌肉內植入)或藉由肌肉內注射來投與。因此，舉例而言，融合蛋白可用適合的聚合或疏水性材料(例如呈可接受之油中的乳液形式)或離子交換樹脂調配，或調配成微溶性衍生物，例如微溶性鹽。 包含本發明之融合蛋白之醫藥組合物可借助於習知混合、溶解、乳化、包裹、包覆或凍乾方法製造。醫藥組合物可使用一或多種有利於將蛋白質處理成可在醫藥學上使用之製劑的生理學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑以習知方式調配。適當調配物視所選投藥途徑而定。 含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子可調配成游離酸或游離鹼、中性或鹽形式之組合物。醫藥學上可接受之鹽為實質上保留游離酸或鹼之生物活性的鹽。此等鹽包括酸加成鹽，例如與蛋白質組合物之游離胺基形成的鹽，或與無機酸(諸如鹽酸或磷酸)或有機酸(諸如乙酸、乙二酸、酒石酸或杏仁酸)形成的鹽。與游離羧基形成的鹽亦可衍生自無機鹼，諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；或有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因(procaine)。相較於相應游離鹼形式，醫藥鹽傾向於更溶於水性及其他質子溶劑中。 本文中之組合物亦可含有多於一種為所治療之特定適應症所必需之活性成分，較佳為具有不會對彼此產生不利影響之互補活性的活性成分。此類活性成分適合地以對預期目的有效之量組合存在。 用於活體內投與之調配物通常係無菌的。無菌性可容易藉由例如經由無菌過濾膜過濾來實現。 治療方法及組合物 任一種本文中提供之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子均可用於治療方法中。 對於用於治療方法中，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子可以符合良好醫學實踐之方式調配、給藥及投與。在此情形中考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症起因、藥劑遞送部位、投藥方法、投藥時程及醫學從業者已知的其他因素。 在一個態樣中，提供用作藥劑之本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子。在其他態樣中，提供本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其係用於治療疾病，尤其用於治療癌症。在某些態樣中，提供本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其係用於治療方法。在一個態樣中，本發明提供如本文中所描述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其係用於治療有需要之個體中之疾病。在某些態樣中，本發明提供含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其係用於治療患有疾病之個體之方法，該方法包含向個體投與治療有效量之融合蛋白。在某些態樣中，待治療之疾病係癌症。癌症之實例包括實體腫瘤、膀胱癌、腎細胞癌、腦癌、頭頸癌、胰臟癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前列腺癌、血液癌症、皮膚癌、鱗狀細胞癌、骨癌及腎癌、黑素瘤、B細胞淋巴瘤、B細胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤及急性淋巴母細胞白血病。因此，提供如本文中所述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其係用於治療癌症。需要治療之個體、患者或「個體」通常係哺乳動物，更特定言之係人類。 在另一態樣中，提供如本文中所述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其係用於治療感染性疾病，尤其用於治療病毒感染。在另一態樣中，提供如本文中所述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其係用於治療自體免疫疾病，諸如狼瘡疾病。 在另一態樣中，本發明係關於含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之用途，其係用於製造或製備用以治療有需要之個體中之疾病的藥劑。在一個態樣中，藥劑用於治療疾病之方法中，其包含向患有疾病之個體投與治療有效量之藥劑。在某些實施例中，待治療之疾病係增生性病症，特定言之係癌症。因此，在一個態樣中，本發明係關於本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之用途，其係用於製造或製備用以治療癌症之藥劑。癌症之實例包括實體腫瘤、膀胱癌、腎細胞癌、腦癌、頭頸癌、胰臟癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前列腺癌、血液癌症、皮膚癌、鱗狀細胞癌、骨癌及腎癌、黑素瘤、B細胞淋巴瘤、B細胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤及急性淋巴母細胞白血病。其他可使用本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子治療的細胞增生病症包括(但不限於)位於以下部位之贅瘤：腹部、骨骼、乳房、消化系統、肝、胰腺、腹膜、內分泌腺(腎上腺、副甲狀腺、垂體、睾丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼、頭部及頸部、神經系統(中樞及周邊)、淋巴系統、骨盆、皮膚、軟組織、脾、胸區及泌尿生殖系統。亦包括癌前病狀或病變及癌轉移。在某些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：腎細胞癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、腦癌、頭頸癌。熟習此項技術者可認識到，在一些情況下，含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子可能不提供治癒，而僅可提供部分益處。在一些實施例中，具有一些益處之生理學變化亦視為治療上有利的。因此，在一些態樣中，提供生理學變化之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之量視為「有效量」或「治療有效量」。 在另一態樣中，本發明係關於如本文中所述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之用途，其係用於製造或製備用以治療感染性疾病，尤其用於治療病毒感染或用於治療自體免疫疾病(例如狼瘡疾病)之藥劑。 在另一態樣中，本發明提供用於治療個體中之疾病的方法，其包含向該個體投與治療有效量之本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子。在一個態樣中，向該個體投與組合物，其包含醫藥學上可接受之形式的本發明之融合蛋白。在某些態樣中，待治療之疾病係增生性病症。在一特定態樣中，疾病係癌症。在另一態樣中，疾病係感染性疾病或自體免疫疾病。在某些態樣中，若待治療之疾病係癌症，則該方法進一步包含向個體投與治療有效量之至少一種其他治療劑，例如抗癌劑。根據任一上述實施例之「個體」可為哺乳動物，較佳人類。 對於預防或治療疾病，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之適合劑量(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將取決於待治療之疾病類型、投藥途徑、患者之體重、融合蛋白之類型、疾病之嚴重度及病程、融合蛋白是否投與用於預防性或治療性目的、先前或並行治療干預、患者臨床病史及對融合蛋白之反應以及主治醫師之判斷。負責投藥之從業者將在任何情況下確定組合物中活性成分之濃度及適用於單獨個體的劑量。本文中涵蓋各種給藥時程，包括(但不限於)單次投與或經各個時間點多次投與、快速投與及脈衝式輸注。 含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子宜一次性或經一系列治療來投與患者。視疾病之類型及嚴重度而定，約1 µg/kg至15 mg/kg (例如0.1 mg/kg-10 mg/kg)之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子可為投與患者之初始候選劑量，無論例如藉由一或多次單獨投藥或藉由連續輸注。視上文所提及之因素而定，一種典型日劑量可在約1 μg/kg至100 mg/kg或更高之範圍內。對於歷經數日或更長時間之重複投與，治療一般將視病狀而定持續至發生疾病症狀之所需抑制為止。融合蛋白之一種例示性劑量將在約0.005 mg/kg至約10 mg/kg範圍內。在其他實例中，劑量亦可包含每次投藥約1 μg/kg體重、約5 μg/kg體重、約10 μg/kg體重、約50 μg/kg體重、約100 μg/kg體重、約200 μg/kg體重、約350 μg/kg體重、約500 μg/kg體重、約1 mg/kg體重、約5 mg/kg體重、約10 mg/kg體重、約50 mg/kg體重、約100 mg/kg體重、約200 mg/kg體重、約350 mg/kg體重、約500 mg/kg體重至約1000 mg/kg體重或更高，及其中可衍生之任何範圍。在來自本文中列舉之數值之可衍生範圍之實例中，基於上述數值，可投與約5 mg/kg體重至約100 mg/kg體重、約5 μg/kg體重至約500 mg/kg體重等之範圍。因此，可向患者投與約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、5.0 mg/kg或10 mg/kg (或其任何組合)之一或多種劑量。此類劑量可間歇地投與，例如每週或每三週(例如以使得患者接收約二至約二十，或例如約六個劑量之融合蛋白)。可投與較高初始起始劑量，隨後可投與一或多個較低劑量。然而，其他給藥方案可為適用的。此療法之進展易於藉由習知技術及分析監測。 本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子通常以可有效實現所欲目的之量使用。對於用於治療或預防疾病病狀，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子或其醫藥組合物以治療有效量投與或施用。治療有效量之確定完全屬於熟習此項技術者之能力範圍內，尤其根據本文所提供之詳細揭示內容。 關於全身性投藥，可首先自活體外分析(諸如細胞培養分析)估算治療有效劑量。接著可在動物模型中調配劑量以實現循環濃度範圍，包括如在細胞培養物中測定的IC50
。此類資訊可用於更準確地確適用於人類之劑量。 初始劑量亦可自活體內數據(例如動物模型)、使用此項技術中熟知的技術估算。一般熟習此項技術者容易基於動物數據使人類投藥達最佳。 可個別地調節劑量及區間以提供足以維持治療作用之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子的血漿含量。常見的患者注射投藥劑量範圍係約0.1至50毫克/公斤/天，通常係約0.5至1毫克/公斤/天。治療有效的血漿含量可藉由每日投與多次劑量來達成。血漿含量可藉由例如HPLC量測。 在局部投藥或選擇性捕捉之情況下，含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之有效局部濃度可能與血漿濃度無關。熟習此項技術者能夠不經不當實驗使治療有效局部劑量達最佳。 本文中所述之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之治療有效劑量通常將提供治療效益而不引起實質性毒性。可在細胞培養物或實驗動物中藉由標準醫藥學程序測定融合蛋白之毒性及治療功效。可使用細胞培養分析及動物研究來確定LD50
(50%群體致死劑量)及ED50
(50%群體治療有效劑量)。毒性作用與治療作用之間的劑量比係治療指數，其可表示為比率LD50
/ED50
。呈現較大治療指數之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子係較佳的。在一個實施例中，根據本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子呈現高治療指數。自細胞培養分析及動物研究獲得之數據可用於調配適用於人類的劑量範圍。該劑量較佳在循環濃度範圍內，包括毒性極小或無毒性的ED50
。該劑量可視各種因素而定在此範圍內變化，該等因素係例如所採用之劑型、所採用之投藥途徑、個體之病狀及其類似因素。準確調配物、投藥途徑及劑量可由個別醫師鑒於患者之病狀加以選擇(參見例如Fingl等人, 1975, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第1章第1頁，其以全文引用之方式併入本文中)。 用本發明之融合蛋白質治療之患者之主治醫師將知曉如何及何時由於毒性、器官功能不全及其類似原因而終止、中斷或調節投藥。相反，主治醫師亦知曉若臨床反應不充足(排除毒性)，則將治療調節至較高水準。管理所關注病症時所投與劑量之量值將因待治療之病狀的嚴重度及投藥途徑及其類似因素而變化。病狀之嚴重程度可例如部分地藉由標準預後評估方法來評估。另外，劑量及可能的給藥頻率亦將根據個別患者之年齡、體重及反應而變化。 其他藥劑及治療 本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子可與療法中之一或多種其他藥劑組合投與。舉例而言，本發明之融合蛋白可與至少一種其他治療劑共同投與。術語「治療劑」涵蓋可投與用於治療需要此類治療之個體中之症狀或疾病的任何藥劑。此類其他治療劑可包含適於治療特定適應症的任何活性成分，較佳係具有互補活性、彼此間無不利影響的該等活性成分。在某些實施例中，其他治療劑係另一種抗癌劑。 此類其他藥劑宜以可有效達成預定目的之量組合存在。此類其他藥劑之有效量視所使用之融合蛋白之量、病症或治療之類型及如上文所述之其他因素而定。含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子一般以相同劑量及藉由如本文所述之投藥途徑使用，或本文所述之劑量之約1%至99%，或以任何劑量及藉由憑經驗/臨床上確定合適之任何途徑。 上文指出的此類組合療法涵蓋組合投與(其中在相同或各別組合物中包括兩種或更多種治療劑)及各別投與，在此情況下，本發明之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之投與可在其他治療劑及/或佐劑之投與之前、同時及/或之後進行。 製品 在本發明之另一態樣中，提供含有適用於治療、預防及/或診斷上文所述之病症的製品。製品包含容器及容器上或容器隨附之標記或藥品說明書。適合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由各種材料形成，諸如玻璃或塑膠。容器容納單獨或與有效治療、預防及/或診斷病狀之另一組合物組合之組合物，且可具有無菌接取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之含有TNF配位三聚體之抗原結合分子。 標記或藥品說明書指示組合物用於治療所選病狀。此外，製品可包含(a)其中含有組合物的第一容器，其中組合物包含本發明之含有TNF配位三聚體之抗原結合分子；及(b)其中含有組合物的第二容器，其中組合物包含另一種細胞毒性劑或其他治療劑。本發明之此實施例中之製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病狀之藥品說明書。 或者或另外，製品可進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝劑，諸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。 表C(序列)：
關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列之一般資訊提供於Kabat, E.A.等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 美國公共衛生署, 美國國家衛生研究院, Bethesda, MD (1991)中。根據如上文所定義之根據Kabat (Kabat, E.A.等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 美國公共衛生署, 美國國家衛生研究院, Bethesda, MD (1991))之EU編號系統編號及參考抗體鏈之胺基酸。 以下經編碼之段落係本發明之態樣： 1. 一種含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a)至少一個部分，其能夠特異性結合於PD1，及 (b)第一及第二多肽，其藉由雙硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於該第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其片段，該兩個胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接，且該第二多肽包含該TNF配位體家族成員之僅一個胞外域或其片段。 2. 如段落1之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其進一步包含 (c) Fc結構域，其由能夠穩定締合之第一及第二子單元構成。 3. 如段落1或2之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a)至少一個部分，其能夠特異性結合於PD1，及 (b)第一及第二多肽，其藉由雙硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於 a. 分別地，該第一多肽含有CH1或CL結構域且該第二多肽含有CL或CH1結構域，其中該第二多肽藉由該CH1與CL結構域之間的雙硫鍵連接至該第一多肽，且其中該第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其片段，該兩個胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且連接至該CH1或CL結構域，且其中該第二多肽包含該TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子連接至該多肽之該CL或CH1結構域。 b. 分別地，該第一多肽含有CH3結構域且該第二多肽含有CH3結構域，且其中該第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其片段，該兩個胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且連接至該CH3結構域之C端，且其中該第二多肽包含該TNF配位體家族成員之僅一個胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子連接至該多肽之該CH3結構域之C端，或 c. 分別地，該第一多肽含有VH-CL或VL-CH1結構域且該第二多肽含有VL-CH1結構域或VH-CL結構域，其中該第二多肽藉由該CH1與CL結構域之間的雙硫鍵連接至該第一多肽，且其中該第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其片段，該兩個胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且連接至VH或VL，且其中該第二多肽包含該TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子連接至該多肽之VL或VH。 4. 如段落1至3中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該TNF配位體家族成員共刺激人類T細胞活化。 5. 如段落1至4中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該TNF配位體家族成員係選自4-1BBL及OX40L。 6. 如段落1至5中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該TNF配位體家族成員係4-1BBL。 7. 如段落1至6中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中TNF配位體家族成員之該胞外域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7及、SEQ ID NO:8，尤其SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5之胺基酸序列。 8. 如段落1至7中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中TNF配位體家族成員之該胞外域包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列。 9. 如段落1至8中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a)至少一個部分，其能夠特異性結合於PD1，及 (b)第一及第二多肽，其藉由雙硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於該第一多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:10，且其特徵在於該第二多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5。 10. 如段落1至9中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a)至少一個部分，其能夠特異性結合於PD1，及 (b)分別地，含有CH1或CL結構域之第一多肽及含有CL或CH1結構域之第二多肽，其中該第二多肽藉由該CH1與CL結構域之間的雙硫鍵連接至該第一多肽， 且其中該抗原結合分子之特徵在於該第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其兩個片段，該兩個胞外域或其兩個片段藉由肽連接子彼此連接且連接至該CH1或CL結構域，且其特徵在於該第二多肽包含該TNF配位體家族成員之僅一個胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子連接至該多肽之該CL或CH1結構域。 11. 如段落1至10中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該能夠特異性結合於PD1之部分係選自由以下組成之群：抗體片段、Fab分子、交換型Fab分子、單鏈Fab分子、Fv分子、scFv分子、單域抗體、aVH及骨架抗原結合蛋白。 12. 如段落1至11中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該分子包含一個能夠特異性結合於PD1之部分。 13. 如段落1至12中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該能夠特異性結合於PD1之部分係能夠特異性結合於PD1之Fab分子。 14. 如段落1至13中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該能夠特異性結合於PD1之部分包含 (a) VH結構域，其包含(i)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列的HVR-H3；及VL結構域，其包含(iv)包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列的HVR-L3， (b) VH結構域，其包含(i)包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列的HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列的HVR-H3；及VL結構域，其包含(iv)包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列的HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列的HVR-L3， (c) VH結構域，其包含(i)包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列的HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列的HVR-H3；及VL結構域，其包含(iv)包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列的HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:39之胺基酸序列的HVR-L3， (d) VH結構域，其包含(i)包含SEQ ID NO:42之胺基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列的HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:44之胺基酸序列的HVR-H3；及VL結構域，其包含(iv)包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:46之胺基酸序列的HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列的HVR-L3， (e) VH結構域，其包含(i)包含SEQ ID NO:50之胺基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:51之胺基酸序列的HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:52之胺基酸序列的HVR-H3；及VL結構域，其包含(iv)包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列的HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列的HVR-L3， (f) VH結構域，其包含(i)包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列的HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列的HVR-H3；及VL結構域，其包含(iv)包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:62之胺基酸序列的HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:63之胺基酸序列的HVR-L3，或 (g) VH結構域，其包含(i)包含SEQ ID NO:66之胺基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列的HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:68之胺基酸序列的HVR-H3；及VL結構域，其包含(iv)包含SEQ ID NO:69之胺基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:70之胺基酸序列的HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:71之胺基酸序列的HVR-L3。 15. 如段落1至14中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該能夠特異性結合於PD1之部分包含 (a)包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列的VL結構域， (b)包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列的VL結構域， (c)包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列的VL結構域， (d)包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列的VL結構域， (e)包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列的VL結構域， (f)包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列的VL結構域， (g)包含SEQ ID NO:40之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列的VL結構域， (h)包含SEQ ID NO:48之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:49之胺基酸序列的VL結構域， (i)包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列的VL結構域， (k)包含SEQ ID NO:64之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:65之胺基酸序列的VL結構域，或 (l)包含SEQ ID NO:72之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:73之胺基酸序列的VL結構域。 16. 如段落1至14中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該能夠特異性結合於PD1之部分包含 (a) VH結構域，其包含(i)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列的HVR-H3；及VL結構域，其包含(iv)包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列的HVR-L3。 17. 如段落1至16中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該能夠特異性結合於PD1之部分包含 (a)包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列的VL結構域， (b)包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列的VL結構域， (c)包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列的VL結構域， (d)包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列的VL結構域，或 (e)包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列的VL結構域。 18. 如段落2至17中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該Fc結構域係IgG，尤其係IgG1 Fc結構域或IgG4 Fc結構域 19. 如段落2至18中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該Fc結構域係IgG1 Fc結構域，其包含位置234及235 (EU編號)及/或329 (EU編號)處的胺基酸取代。 20. 如段落1至19中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該Fc結構域之第一子單元包含胺基酸取代S354C及T366W (根據Kabat EU索引編號)且該Fc結構域之第二子單元包含胺基酸取代Y349C、T366S、L368A及Y407V (根據Kabat EU索引編號)。 21. 如段落1至20中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中分別地，該抗原結合分子包含 第一重鏈及第一輕鏈，其皆包含能夠特異性結合於PD1之Fab分子， 第一肽，其包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其片段，該兩個胞外域或其片段藉由第一肽連接子彼此連接，該第一肽在其C端藉由第二肽連接子與第二重鏈或輕鏈融合， 及第二肽，其包含該TNF配位體家族成員之一個胞外域，該第二肽在其C端藉由第三肽連接子與第二輕鏈或重鏈融合。 22. 如段落1至20中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該第一肽在其C端藉由第二肽連接子與作為重鏈之一部分的CH1結構域融合，該第一肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其片段，該兩個胞外域或其片段藉由第一肽連接子彼此連接， 且該第二肽在其C端藉由第三肽連接子與作為輕鏈之一部分的CL結構域融合，該第二肽包含該TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段。 23. 如段落1至20中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該第一肽在其C端藉由第二肽連接子與作為重鏈之一部分的CL結構域融合，該第一肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其片段，該兩個胞外域或其片段藉由第一肽連接子彼此連接， 且該第二肽在其C端藉由第三肽連接子與作為輕鏈之一部分的CH1結構域融合，該第二肽包含該TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段。 24. 如段落1至20中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該第一肽在其C端藉由第二肽連接子與作為重鏈之一部分的VH結構域融合，該第一肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其片段，該兩個胞外域或其片段藉由第一肽連接子彼此連接， 且該第二肽在其C端藉由第三肽連接子與作為輕鏈之一部分的VL結構域融合，該第二肽包含該TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段。 25. 如段落21至23中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中在與該TNF配位體家族成員相鄰之該CL結構域中，位置123 (EU編號)處之胺基酸已經精胺酸(R)置換且位置124 (EU編號)處之胺基酸已經離胺酸(K)取代，且其中在與該TNF配位體家族成員相鄰之該CH1結構域中，位置147 (EU編號)及位置213 (EU編號)處之胺基酸已經麩胺酸(E)取代。 26. 如段落1至20中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含 (a)第一重鏈及第一輕鏈，其皆包含能夠特異性結合於PD1之Fab分子， (b)第二重鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:10，及 第二輕鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5。 27. 如段落1至20或26中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含 (i)第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列的該VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列的該VL結構域，或 第一重鏈，其包含有包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的該VH結構域，及第一輕鏈，其包含有包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之該VL結構域：SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:25， (ii)第二重鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:80，及 (iii)第二輕鏈，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79及SEQ ID NO:81。 28. 如段落1至21中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含 (a)包含SEQ ID NO:82之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:83之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:74之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:75之胺基酸序列的第二輕鏈， (b)包含SEQ ID NO:82之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:83之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:76之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:77之胺基酸序列的第二輕鏈， (c)包含SEQ ID NO:82之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:83之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:78之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:79之胺基酸序列的第二輕鏈，或 (d)包含SEQ ID NO:82之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:83之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO:80之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:81之胺基酸序列的第二輕鏈。 29. 如段落1至20中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含 (a)至少一個Fab結構域，其能夠特異性結合於PD1，及 (b)第一及第二多肽，其藉由雙硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於分別地該第一多肽含有CH3結構域且該第二多肽含有CH3結構域，且其中該第一多肽包含TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其片段，該兩個胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且連接至該CH3結構域之C端，且其中該第二多肽包含該TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子連接至該多肽之該CH3結構域之C端。 30. 如段落29之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含兩個能夠特異性結合於PD1之Fab結構域。 31. 如段落29之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含 (a)包含SEQ ID NO:84之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:85之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:83之胺基酸序列的兩個輕鏈，或 (b)包含SEQ ID NO:86之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO:87之胺基酸序列的第二重鏈及包含SEQ ID NO:83之胺基酸序列的兩個輕鏈。 32. 如段落29之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其包含一個能夠特異性結合於PD1之Fab結構域。 33. 如段落29或32之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含 (i)融合多肽，其包含Fc結構域之第一子單元及TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其片段，該兩個胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且連接至該CH3結構域之C端，(ii)重鏈，其包含該能夠特異性結合於PD1之Fab結構域之VH結構域、該Fc結構域之第二子單元及該TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子連接至該CH3結構域之C端，及(iii)輕鏈，其包含該能夠特異性結合於PD1之Fab結構域的VL結構域，或 (i)融合多肽，其包含Fc結構域之第一子單元及TNF配位體家族成員之一個胞外域或其片段，該胞外域或其片段藉由肽連接子連接至該CH3結構域之C端，(ii)重鏈，其包含該能夠特異性結合於PD1之Fab結構域的VH結構域、該Fc結構域之第二子單元及該TNF配位體家族成員之兩個胞外域或其片段，該兩個胞外域或其片段經由肽連接子彼此連接且連接至該CH3結構域之C端，及(iii)輕鏈，其包含該能夠特異性結合於PD1之Fab結構域的VL結構域。 34. 如段落31之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含 (a)包含SEQ ID NO:88之胺基酸序列的融合多肽、包含SEQ ID NO:87之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO:83之胺基酸序列的輕鏈， (b)包含SEQ ID NO:89之胺基酸序列的融合多肽、包含SEQ ID NO:90之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO:83之胺基酸序列的輕鏈， (c)包含SEQ ID NO:91之胺基酸序列的融合多肽、包含SEQ ID NO:86之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO:83之胺基酸序列的輕鏈， (b)包含SEQ ID NO:93之胺基酸序列的融合多肽、包含SEQ ID NO:92之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO:83之胺基酸序列的輕鏈。 35. 一種分離之聚核苷酸，其編碼如段落1至34中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子。 36. 一種載體，特定言之一種表現載體，其包含如段落35之分離之聚核苷酸。 37. 一種宿主細胞，其包含如段落35之分離之聚核苷酸或如段落36之載體。 38. 一種製造如段落1至34中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之方法，其包含以下步驟 (i)在適於表現該抗原結合分子之條件下培養如段落37之宿主細胞，及 (ii)回收該抗原結合分子。 39. 一種醫藥組合物，其包含如段落1至34中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。 40. 如段落1至34中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子或如段落39之醫藥組合物，其係用作藥劑。 41. 如段落1至34中任一項之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子或如段落39之醫藥組合物，其係用於治療癌症。 42. 如段落1至34中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子，其係用於製造用以治療癌症之藥劑。 43. 一種治療個體之疾病之方法，其包含向該個體投與治療有效量之呈醫藥學上可接受之形式的包含如段落1至34中任一者之含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子之組合物。 44. 如段落43之方法，其中該疾病係癌症。 實例 以下為本發明之方法及組合物之實例。應理解，考慮到上文所提供之通用說明，可實施各種其他實施例。 重組型DNA技術 使用標準方法操縱DNA，如Sambrook等人, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989中所述。根據製造商說明書，使用分子生物學試劑。關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列之通用資訊提供於Kabat, E.A.等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, NIH公開案第91-3242號中。 DNA定序 藉由雙股定序法測定DNA序列。 基因合成 所需基因區段係使用適當模板藉由PCR製造，或藉由自動化基因合成法，藉由Geneart AG (Regensburg, Germany)自合成寡核苷酸及PCR產物合成。在確切基因序列無法獲得的情況下，根據來自最近同源物的序列來設計寡核苷酸引子且藉由RT-PCR自來源於適當組織之RNA分離基因。將側接有單數個限制性核酸內切酶裂解位點的基因區段選殖至標準選殖/定序載體中。自經轉型之細菌純化質體DNA且藉由UV光譜學來測定濃度。經次選殖之基因片段之DNA序列藉由DNA定序來證實。基因區段經設計具有允許次選殖入各別表現載體中的適合限制位點。所有構築體經設計具有5'端DNA序列，該序列編碼靶向真核細胞中分泌之蛋白質的前導肽。細胞培養技術
如Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J.及Yamada, K.M. (編), John Wiley & Sons, Inc.中之現有方案中所描述使用標準細胞培養技術。蛋白質純化
參考標準方案，自經過濾之細胞培養物上清液純化蛋白質。簡言之，將抗體施用於蛋白質A瓊脂糖凝膠管柱(GE Healthcare)且用PBS洗滌。在pH 2.8下實現抗體之溶離，接著立即中和樣品。在PBS或20 mm組胺酸、150 mM NaCl pH 6.0中藉由尺寸排阻層析(Superdex 200，GE Healthcare)自單體抗體分離聚集之蛋白質。單體抗體溶離份經合併、使用例如MILLIPORE Amicon Ultra (30MWCO)離心濃縮器濃縮(必要時)、凍結且儲存於-20℃或-80℃下。提供部分樣品用於例如藉由SDS-PAGE、尺寸排阻層析(SEC)或質譜進行後續蛋白質分析及分析型表徵。SDS-PAGE
根據製造商說明書使用NuPAGE® Pre-Cast凝膠系統(Invitrogen)。詳言之，使用10%或4%至12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast凝膠(pH 6.4)及NuPAGE® MES (還原性凝膠，具有NuPAGE® Antioxidant操作緩衝劑添加劑)或MOPS (非還原性凝膠)操作緩衝劑。分析型尺寸排阻層析
藉由HPLC層析進行用於測定抗體之聚集及寡聚狀態之尺寸排阻層析(SEC)。簡言之，將蛋白質A純化抗體施用於Agilent HPLC 1100系統上之Tosoh TSKgel G3000SW管柱用300 mM NaCl、50 mM KH2
PO4
/K2
HPO4
(pH 7.5)進行或Dionex HPLC系統上之Superdex 200管柱(GE Healthcare)用2×PBS進行。藉由UV吸光度及峰值面積之積分來定量溶離之蛋白質。BioRad Gel過濾標準151-1901用作標準。質譜分析
此章節描述具有VH/VL交換(VH/VL CrossMabs)之多特異性抗體之表徵，其中強調其正確組裝。藉由去糖基化完整CrossMabs及去糖基化/纖維蛋白溶酶消化或以其他方式去糖基化/受限LysC消化CrossMabs之電噴霧電離質譜(ESI-MS)來分析預期主要結構。 在1 mg/ml之蛋白質濃度下，VH/VL CrossMab在磷酸鹽或Tris緩衝劑中，在37℃下用N-糖苷酶F去糖基化17小時。纖維蛋白溶酶或受限LysC (Roche)消化用100 µg去糖基化VH/VL CrossMab分別在Tris緩衝劑(pH 8)中，在室溫下進行120小時及在37℃下進行40分鐘。在質譜分析之前，在Sephadex G25管柱(GE Healthcare)上經由HPLC將樣品去鹽。在配備有TriVersa NanoMate來源(Advion)之maXis 4G UHR-QTOF MS系統(Bruker Daltonik)上經由ESI-MS測定總質量。使用表面電漿子共振 ( SPR )( BIACORE ) 測定多特異性抗體與各別抗原之結合及結合親和力
使用BIACORE儀器(GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Sweden)藉由表面電漿子共振研究所產生之抗體與各別抗原之結合。簡言之，對於親和力量測，Goat-Anti-Human IgG、JIR 109-005-098抗體經由胺偶合固定在CM5晶片上以用於針對各別抗原之抗體之呈現。在HBS緩衝劑(HBS-P)(10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.005% Tween 20，pH 7.4)中，在25℃下(或在37℃下)量測結合。在溶液中以多種濃度添加抗原(R&D Systems或內部純化)。藉由80秒至3分鐘之抗原注射來量測締合；藉由用HBS緩衝劑洗滌晶片表面3-10分鐘來量測解離且使用1:1朗格繆爾結合模型(Langmuir binding model)來評估KD值。自樣品曲線減去陰性對照數據(例如緩衝劑曲線)以用於系統內源性基線偏移之校正及雜訊信號降低。使用各別Biacore Evaluation軟體進行感測器圖譜之分析及親和力數據之計算。 實例1 1.1抗PD1抗體之產生 小鼠免疫接種 NMRI小鼠使用編碼全長人類PD1之質體表現載體，藉由皮內施用100 μg載體DNA (質體15300_hPD1-fl)，隨後電穿孔(2個1000 V/cm之方形脈衝，持續時間0.1 ms，時間間隔0.125 s；隨後4個287.5 V/cm之方形脈衝，持續時間10 ms，時間間隔0.125 s)進行基因免疫接種。小鼠在第0、14、28、42、56、70及84天接受6次連續免疫。在第36、78及92天獲取血液且製備血清，其用於藉由ELISA進行滴定測定(參見下文)。選擇具有最高效價之動物在第96天藉由靜脈內注射50 μg重組人類PD1人類Fc嵌合體來增強免疫，且藉由融合瘤技術藉由在增強免疫之後3天使脾細胞與骨髓瘤細胞株融合來分離單株抗體。測定血清效價 (ELISA)
將人類重組PD1人類Fc嵌合體於PBS中以0.3 μg/ml、100微升/孔固定於96孔NUNC Maxisorp盤上，隨後：用200微升/孔含2% Crotein C之PBS阻斷該盤；施用抗血清之連續稀釋液，一式兩份，在含0.5% Crotein C之PBS中，100微升/孔；用結合HRP之山羊抗小鼠抗體(Jackson Immunoresearch/Dianova 115-036-071；1/16000)偵測。對於所有步驟，將盤在37℃下培育1小時。在所有步驟之間，用含0.05% Tween 20之PBS洗滌盤3次。藉由以100微升/孔添加BM Blue POD可溶性底物(Roche)顯現信號；且藉由添加1 M HCl，100微升/孔停止。在450 nm下，對照690 nm作為參考，讀出吸光度。將效價定義為產生半最大信號的抗血清之稀釋度。 1.2表徵抗PD1抗體/抗PD1抗體與人類PD1之結合用於 hu PD1 之 Elisa
用25微升/孔經生物素標記之PD1-ECD-AviHis來塗佈經Nunc maxisorp抗生蛋白鏈菌素塗佈之培養盤(MicroCoat編號11974998001)且在4℃下培育隔夜。在洗滌(用PBST緩衝劑，3×90微升/孔)之後，添加25 µl抗PD1樣品或參考抗體(人類抗PD1；Roche/小鼠抗PD1；Biolegend；目錄號：329912)且在室溫下培育1小時。在沖洗(用3×90微升/孔的PBST緩衝劑)之後，以1:2000/1:1000之稀釋度添加25微升/孔的山羊抗人類H+L-POD (JIR，JIR109-036-088)/綿羊抗小鼠-POD (GE Healthcare; NA9310)並在室溫下在振盪器上培育1小時。在洗滌(用PBST緩衝劑，3×90微升/孔)之後，添加25微升/孔之TMB受質(Roche目錄號11835033001)且培育直至OD 2-3。量測在370/492 nm下進行。 ELISA結果以EC50
值[ng/ml]列於以下概述性表1及表2中。 用於PD1之細胞ELISA 以0.01×10E6個細胞/孔之濃度將用編碼全長人類PD1之質體15311_hPD1-fl_pUC_Neo來穩定轉染且用G418 (質體上之新黴素抗性標記)選擇之黏附CHO-K1細胞株接種至384孔平底培養盤中且生長隔夜。 次日，添加25微升/孔PD1樣品或人類抗PD1 (Roche)/小鼠抗PD1 (Biolegend；目錄號：329912)參考抗體且在4℃下培育2小時(以避免內化)。在小心地洗滌(1×90微升/孔PBST)之後，藉由添加於1x PBS緩衝劑中稀釋之30微升/孔0.05%戊二醛(Sigma，目錄號G5882，25%)來固定細胞且在室溫下培育10分鐘。在沖洗(3×90微升/孔PBST)之後，添加25微升/孔的二次抗體用於檢測：山羊抗人類H+L-POD (JIR，109-036-088)/綿羊抗小鼠-POD (GE NA9310)，之後在室溫下在振盪器上培育1小時。在洗滌(3×90微升/孔PBST)之後，添加25微升/孔之TMB受質溶液(Roche 11835033001)且培育直至OD 1.0-2.0。在370 nm/492 nm下量測培養盤。 細胞ELISA結果以「EC50
CHO-PD1」值[ng/ml]列於以下概述性表表2中。 用於食蟹獼猴PD1之ELISA 用25微升/孔經生物素標記之食蟹獼猴PD1-ECD-Biotin來塗佈經Nunc maxisorp抗生蛋白鏈菌素塗佈之培養盤(MicroCoat編號11974998001)且在4℃下培育隔夜。在沖洗(3×90微升/孔之PBST-緩衝劑)之後，添加25微升抗PD1樣品或參考抗體(人類抗PD1；羅氏)且在室溫下在振盪器上培育1小時。在沖洗(3×90微升/孔的PBST緩衝劑)之後，以1:1000之稀釋度添加25微升/孔的山羊抗人類H+L-POD (JIR，109-036-088)且在室溫下在振盪器上培育1小時。在洗滌(3×90微升/孔之PBST緩衝劑)之後，添加25微升/孔之TMB受質(Roche，11835033001)且培育直至OD 2-3。量測在370/492 nm下進行。 ELISA結果以EC50
值[ng/ml]列於以下概述性表1及表2中。 PD配位體1替換分析 用25微升/孔經生物素標記之PD1-ECD-AviHis來塗佈經Nunc maxisorp抗生蛋白鏈菌素塗佈之培養盤(MicroCoat編號11974998001)且在4℃下培育隔夜。在洗滌(3×90微升/孔之PBST緩衝劑)之後，添加25 µl抗PD1樣品或參考抗體(小鼠抗PD1；Biolegend；目錄號：329912)且在室溫下在振盪器上培育1小時。在洗滌(3×90微升/孔之PBST緩衝劑)之後，添加25微升/孔PD-L1 (重組人類B7-H1/PD-L1 Fc嵌合體；156-B7，R&D)且在室溫下在振盪器上培育1小時。在沖洗(3×90微升/孔之PBST緩衝劑)之後，以1:1000之稀釋度添加25微升/孔的山羊抗人類H+L-POD (JIR，109-036-088)且在室溫下在振盪器上培育1小時。在洗滌(3×90微升/孔之PBST緩衝劑)之後，添加25微升/孔之TMB受質(Roche，11835033001)且培育直至OD 2-3。量測在370/492 nm下進行。 ELISA結果以IC50
值[ng/ml]列於以下概述性表1中。PD 配位體 2 替換分析
用25微升/孔經生物素標記之PD1-ECD-AviHis來塗佈經Nunc maxisorp抗生蛋白鏈菌素塗佈之培養盤(MicroCoat編號11974998001)且在4℃下培育隔夜。在洗滌(3×90微升/孔之PBST-緩衝劑)之後，添加25微升抗PD1樣品或參考抗體(小鼠抗huPD1；羅氏)且在室溫下在振盪器上培育1小時。在洗滌(3×90微升/孔之PBST緩衝劑)之後，添加25微升/孔PD-L2 (重組人類B7-DC/PD-L2 Fc嵌合體；1224-PL-100，R&D)且在室溫下在振盪器上培育1小時。在洗滌(3×90微升/孔之PBST緩衝劑)之後，以1:2000之稀釋度添加25微升/孔的山羊抗人類H+L-POD (JIR，109-036-088)且在室溫下在振盪器上培育1小時。在洗滌(3×90微升/孔之PBST緩衝劑)之後，添加25微升/孔之TMB受質(Roche，11835033001)且培育直至OD 2-3。量測在370/492 nm下進行。 ELISA結果以IC50
值[ng/ml]列於以下概述性表1中。抗原決定基定位 ELISA / 結合競爭分析
用25微升/孔捕捉抗體(山羊抗小鼠IgG；JIR；115-006-071)塗佈Nunc maxisorp培養盤(Nunc編號464718)且在室溫下在震盪器上培育1小時。在洗滌(3×90微升/孔之PBST-緩衝劑)之後，用含有2% BSA之PBS緩衝劑在室溫下在震盪器上阻斷培養盤1小時。在洗滌(3×90微升/孔之PBST緩衝劑)之後，添加25微升小鼠抗PD1樣品且在室溫下在振盪器上培育1小時。在洗滌(3×90微升/孔之PBST-緩衝劑)之後，藉由30微升/孔小鼠IgG (JIR；015-000-003)在室溫下在振盪器上阻斷捕捉抗體1小時。同時，用第二樣品抗體在室溫下在震盪器上預培育經生物素標記之PD1-ECD-AviHis 1小時。在洗滌分析培養盤(3×90微升/孔之PBST-緩衝劑)之後，將PD1抗體混合物轉移至分析培養盤且在室溫下在振盪器上培育1小時。在洗滌(3×90微升/孔之PBST-緩衝劑)之後，以1:4000之稀釋度添加25微升/孔抗生蛋白鏈菌素POD (Roche，編號11089153001)且在室溫下在震盪器上培育1小時。在洗滌(3×90微升/孔之PBST緩衝劑)之後，添加25微升/孔TMB受質(Roche編號11089153001)且培育直至OD 1.5-2.5。量測在370/492 nm下進行。抗原決定基群由針對參考抗體之層級聚類定義。表 1 ： 例示性 PD1 抗體之結合、 PD - L1 抑制及抗原決定基區群組 ( ELISA ) 表 2 ： 來源於親本小鼠抗體 PD1 - 0103 之 人類化 PD1 抗體之生物化學及細胞結合 ( ELISA ) 人類化抗 PD - 1 抗體之 Biacore 表徵
已使用基於表面電漿子共振(SPR)之分析以確定若干鼠類PD1黏合劑與市售人類PD1結合參考物之間的結合動力學參數。因此，抗人類IgG藉由偶合至(Biacore) CM5感測器晶片表面之胺來固定。接著捕捉樣品且使hu PD1-ECD與其結合。在各分析週期之後更新感測器晶片表面。最終藉由將數據擬合至1:1朗格繆爾相互作用模型獲得平衡常數及動力學速率常數。 藉由使用GE Healthcare供應之胺類偶合套組在pH 5.0下將約2000個反應單位(RU)之20 µg/ml的抗人類IgG (GE Healthcare編號BR-1008-39)偶合至Biacore T200中之CM5感測器晶片之流通槽1及2 (或者：3及4)上。 該樣品及操作緩衝劑係HBS-EP+ (0.01 M HEPES、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.05% v/v界面活性劑P20，pH 7.4)。流通槽溫度設定為25℃且樣品腔室溫度設定為12℃。系統用操作緩衝劑預致敏。 注射濃度係10 nM之樣品20秒且與第二流通槽結合。接著，在各樣品上注射一整組人類PD1-ECD濃度(144 nM、48 nM、16 nM、5.33 nM、1.78 nM、0.59 nM、0.20 nM及0 nM) 120秒，之後係30/300秒之解離時間及兩個用3 M MgCl2
溶液進行之20秒再生步驟，其中最後一個含有用操作緩衝劑進行「注射後額外洗滌」。 最終，用Biacore T200評估軟體將雙重參考數據擬合至1:1朗格繆爾相互作用模型。所得K D
、k a
及k d
值示於表3中。表 3 ： 藉由 Biacore 測定之嵌合 PD1 - 0103 及人類化 PD1 - Ab 之動力學速率常數及平衡常數
如表3中所示，嵌合PD1-0103 (產生參見實例1.3)之全部人類化形式呈現與親本抗體(嵌合PD1-0103)相似之動力學特性。動力學
根據製造商說明書，將CM5感測器系列S安裝於Biacore 4000系統中且以水動力方式解決偵測點。 在流通槽1、2、3及4中以10000個Ru將多株兔IgG抗體＜IgGFCγM＞R (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)固定在檢測點1及5上。根據製造商之說明書經由EDC/NHS化學法完成偶合。流通槽中之剩餘點充當參考。樣品緩衝劑係補充有1 mg/ml羧甲基葡聚糖之系統緩衝劑。 在一個實施例中，在25℃下驅動該分析。在另一實施例中，在37℃下驅動該分析。藉由以10 µl/min注射1 min在感測器表面上捕捉50 nM之各鼠類單株抗體。隨後以100 nM、2×33 nM、11 nM、4 nM、1 nM及系統緩衝劑0 nM之一系列濃度，以30 µl/min注射各別抗原，歷時4分鐘締合相時間。再監測解離4 min。以30 µl/min注射10 mM甘胺酸(pH 1.5) 3分鐘使捕捉系統再生。根據製造商說明書使用Biacore評估軟體計算相關動力學數據。抗原決定基定位
將Biacore 4000儀器安裝Biacore CAP感測器且其如製造商所建議來製備。儀器緩衝劑係HBS-ET (10 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.005% w/v Tween 20)。在25℃下操作儀器。 將全部樣本稀釋於系統緩衝劑中。藉由在流通槽1、2、3及4中在點1及5中以30 µl/min注射1分鐘來在200個RU下在CAP感測器表面上捕捉35kDa經生物素標記之抗原PD1-ECD-AviHis。點2、3及4充當參考。在另一實施例中，以同樣的方式在200 RU下在CAP感測器上捕捉35 kDa經生物素標記之抗原PD1-ECD-AviHis。 隨後以30 µl/min注射100 nM初級抗體3分鐘，接著以30 µl/min注射100 nM二級抗體3分鐘。注射初級抗體直至呈現抗原之表面充分飽和。在初級及二級抗體注射相結束時，設定報告點「結合後期」(BL)以監測各別抗體之結合反應。計算二級抗體結合反應「BL2」與初級抗體反應「BL1」之間的商(莫耳比)。當已藉由初級抗體來複合抗原時，將莫耳比用作二級抗體之抗原可接近性之指標。 如製造商所建議，藉由以30 µl/min注射2 M鹽酸胍250 mM NaOH再生緩衝劑2分鐘，接著以30 µl/min注射系統緩衝劑1分鐘，自感測器表面完全移除複合物。 1.3混合淋巴細胞反應(MLR)中不同抗PD-1抗體對細胞激素產生之作用3A)
混合淋巴細胞反應(MLR)係量測一個個體(供者X)之淋巴細胞面對另一個體(供者Y)之淋巴細胞進行之活化的免疫細胞分析。混合淋巴細胞反應用以表明阻斷PD1至淋巴細胞效應細胞之路徑的效應。在存在或不存在抗PD1 mAb之情況下測試分析中之T細胞之活化及其IFN-γ分泌。 為進行同種異體MLR，藉由密度梯度離心，使用Leukosep (Greiner Bio One, 227 288)來分離來自未知HLA類型之至少四個健康供者的末梢血液單核細胞(PBMC)。簡言之，用三倍體積之PBS稀釋肝素化血液樣品且稀釋之血液的25 ml等分試樣以層狀放置於50 ml Leukosep管中。在室溫下在800 x g下離心15分鐘(有或無破裂)之後，收集含有淋巴細胞之部分，在PBS中洗滌且直接用於功能性分析中或以1.0E+07個細胞/毫升再懸浮於冷凍培養基(10% DMSO、90% FCS)中，且儲存於液氮中。藉由以1:1刺激/反應細胞比率混合來自兩種不同供者之PBMC來建立個別雙向MLR反應，且在有或無不同濃度範圍之經純化抗PD1單株抗體PD1-0050、PD1-0069、PD1-0073、PD1-0078、PD1-0098、PD1-0102、PD1-0103之情況下，在37℃、5% CO2
下至少一式兩份地在平底96孔盤中共培養6天。作為參考抗PD1抗體，用人類IgG1之主鏈(具有突變L234A、L235A及P329G (Kabat之EU索引))來合成及選殖包含納武單抗(nivolumab) (亦稱為MDX-5C4或MDX-1106)或派立珠單抗(pembrolizumab) (亦稱為MK-3475或Org 1.09A)之VH及VL結構域之抗體。不將抗體或同型對照抗體用作陰性對照且將rec hu IL-2 (20 EU/ml)用作陽性對照。在第6天之後，自用於細胞激素量測之各培養物取出100 µl培養基。使用OptEIA ELISA套組(BD Biosciences)量測IFN-γ之含量。 結果示於表4中(IFN-γ分泌/釋放)。抗PD1單株抗體以濃度依賴性方式促進T細胞活化及IFN-γ分泌。參考添加/不添加任何阻斷mAb (誘導如E-c之IFNg值的基本同種異體刺激)之MLR及添加20 EU/ml rec hu IL-2 (陽性對照=100%之如E+c的IFNg值)之MLR的IFN-γ產生來計算IFNg分泌之增加%之值且根據下式計算：Rel. 刺激 [%] = ((實例- E-c)/(E+c - E-c)*100)。表 4 ： 相較於作為陽性對照之重組人類 IL - 2 治療 ( 20 EU / ml ) (= 100 % 增加 ) 之作用 ， 在同種異體刺激及用抗 PD1 抗體治療之後的 IFN γ 分泌之百分比
若干PD1阻斷抗體PD1-0050、PD1-0069、PD1-0073、PD1-0078、PD1-0098、PD1-0102、PD1-0103藉由增強干擾素γ (IFN-γ)之分泌來表明強烈的免疫調節活性(數據未展示全部抗體)。3B)
在另一實驗中，評價嵌合PD1-0103 (具有突變L234A、L235A及P329G (Kabat之EU索引)之人類IgG1同型)。用嵌合PD1-0103阻斷PD1強烈增強同種刺激之初級人類T細胞分泌IFN-γ。嵌合PD1-0103比參考抗PD1抗體更強效(參見圖 1
)。 為進行比較，使用用人類IgG1之主鏈(具有突變L234A、L235A及P329G (Kabat之EU索引))合成及選殖之包含納武單抗(nivolumab) (亦稱為MDX-5C4或MDX-1106)或派立珠單抗(pembrolizumab) (亦稱為MK-3475或Org 1.09A)之VH及VL結構域的參考抗PD1抗體。3C)
在其他實驗中，如上文所述在MLR中評價抗PD1抗體PD1-0103(人類化抗體PD1-0103-0312、PD1-0103-0314，在圖2及3中)之人類化變異體之免疫調節活性，亦即a)IFNγ釋放(分泌)、b)TNF-α釋放(分泌)。將嵌合PD1-0103抗體及其人類化形式之作用與具有人類IgG1之主鏈(具有突變體L234A、L235A及P329G (Kabat之EU索引))之包含納武單抗(亦稱為MDX5C4或MDX-1106)及派立珠單抗(亦稱為MK-3475或Org 1.09A)之VH及VL結構域的參考抗PD1抗體作比較。在6天MLR培養之後，獲取50 µl上清液且使用Bio-Plex Pro™人類細胞介素Th1/Th2分析 (Bio-Rad Laboratories Inc.)在單一培養中量測多種細胞介素。(數據未展示全部細胞介素)。 在增強T細胞活化及IFN-γ分泌方面嵌合PD1-0103抗體及其人類化形式(PD1-0103_0312及PD1-0103_0314)比參考抗PD1抗體更強效(參見圖 2
)。 此外，嵌合PD1-0103抗體及其人類化變異體藉由抗原呈現細胞增加腫瘤壞死因子α (TNF α) (參見圖 3
)及IL-12 (數據未展示)分泌且增強單核細胞/巨噬細胞或抗原呈現細胞刺激T細胞之能力。1 . 4 藉由與同種異體成熟樹突狀細胞共培養之人類 CD4 T 細胞得到 抗 PD - 1 阻斷對 細胞毒性粒酶 B 釋放及 IFN - γ 分泌之作用
為進一步在同種異體環境下研究抗PD-1治療之效果，吾等研發一種分析，其中在衍生出單核細胞之同種異體成熟樹突狀細胞(mDC)的存在下共培養新近純化之CD4 T細胞5天。提前一週經由塑性黏附自新鮮PBMC分離單核細胞，之後移除非黏附細胞。吾等接著藉由在含有GM-CSF (50 ng/ml)及IL-4 (100 ng/ml)之培養基中培養其5天來自單核細胞產生未成熟DC。為誘導iDC成熟，添加TNF-α、IL-1β及IL-6 (各50 ng/ml)至培養基，再持續2天。吾等接著藉由經由流動式細胞量測術(LSRFortessa，BD Biosciences)量測主要組織相容性複合物II類(MHCII)、CD80、CD83及CD86之表面表現來評定DC成熟。 在最小混合淋巴細胞反應(mMLR)當天，經由微珠套組(Miltenyi Biotec)自獲自不相關供者之108
個PBMC富集CD4 T細胞。培養之前，用5 µM之羧基螢光素丁二醯亞胺酯(CFSE)標記CD4 T細胞。接著在存在或不存在阻斷抗PD1抗體(PD1-0103，嵌合PD1-0103或人類化抗體PD1-0103-0312、PD1-0103-0313、PD1-0103-0314、PD1-0103-0315，在圖 4A
及4B
中縮寫為0312、0313、0314、0315)之情況下，以10 µg/ml之濃度(若圖式中未另外指定)將105
個CD4 T細胞連同成熟同種異體DC (5:1)一起塗覆於96孔盤中。 五天後，收集細胞培養上清液，稍後用以藉由ELISA (R&D systems)來量測IFN-γ含量，且在存在Golgi Plug (布雷菲爾德菌素A(Brefeldin A))及Golgi Stop (莫能菌素(Monensin))之情況下在37℃下再靜置細胞5小時。隨後在具有抗人類CD4抗體及存活/死亡可固定染料Aqua (Invitrogen)之表面上洗滌、染色細胞，之後用固定/滲透緩衝劑(BD Bioscience)將其固定/滲透。進行顆粒酶B (BD Bioscience)、IFN-γ及IL-2 (兩者來自eBioscience)之胞內染色。 亦測試不同濃度之人類化變異體PD1-0103 (人類化抗體PD1-0103-0312、PD1-0103-0313、PD1-0103-0314、PD1-0103-0315，在圖式中縮寫為0312、0313、0314、0315，亦參見下文之實例1.6)且發現其在增強顆粒酶B及干擾素γ方面應同樣良好。DP47係在Fc部分中具有LALA突變之非結合人類IgG以避免經FcγR識別且用作陰性對照。結果示於圖 4A
及4B
中。1 . 5 嵌合抗體衍生物
藉由經由PCR擴增抗PD1小鼠抗體PD1-0098、PD1-0103之重鏈及輕鏈可變區來生成嵌合PD1抗體並將其選殖至作為具有有消除效應功能之突變L234A、L235A及P329G (Kabat之EU索引)) (白胺酸234至丙胺酸、白胺酸235至丙胺酸、脯胺酸329至甘胺酸)之人類IgG1主鏈/人類CH1-鉸鏈-CH2-CH3之融合蛋白的重鏈表現載體及作為人類C-κ之融合蛋白的輕鏈表現載體中。接著將LC及HC質體共轉染至HEK293中且在7天之後藉由抗體純化之標準方法自上清液純化。將嵌合PD1抗體重新命名為嵌合chiPD1-0098 (chiPD1-0098)及嵌合PD1-0103 (chiPD1-0103)。為進行比較，使用用人類IgG1之主鏈(具有突變L234A、L235A及P329G (Kabat之EU索引))合成及選殖之包含納武單抗(亦稱為MDX-5C4或MDX-1106)或派立珠單抗(亦稱為MK-3475或Org 1.09A)之VH及VL結構域的參考抗PD1抗體。1 . 6 抗 PD1 抗體 PD - 0103 ( huMab PD - 0103 ) 之人類化變異體之產生、表現及純化以及表徵 鼠類抗 PD1 抗體 0103 之 VH 及 VL 結構 域之人類化
基於鼠類抗PD1抗體PD1-0103之鼠類VH及VL結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO:43及SEQ ID NO:44)產生人類化抗PD1抗體變異體。 人類化VH-變異體係基於人類生殖系IMGT_hVH_3_23與具有若干突變之人類J-要素生殖系IGHJ5-01組合。(產生SEQ ID NO:45)。 VL之人類化變異體係基於人類生殖系IMGT_hVK_4_1、IMGT_hVK_2_30、IMGT_hVK_3_11及IMGT_hVK_1_39與人類J-要素生殖系IGKJ1-01組合。不同突變得到SEQ ID NO:46至SEQ ID NO:49之人類化變異體。 將PD1-0103之重鏈及輕鏈可變區之人類化胺基酸序列回譯至DNA中且合成所得cNDA (GenArt)且接著選殖至作為具有有消除效應功能之LALA及PG突變(白胺酸234至丙胺酸、白胺酸235至丙胺酸、脯胺酸329至甘胺酸)之人類IgG1主鏈/人類CH1-鉸鏈-CH2-CH3之融合蛋白的重鏈表現載體及作為人類C-κ之融合蛋白的輕鏈表現載體中。接著將LC及HC質體共轉染至HEK293中且在7天之後藉由抗體純化之標準方法自上清液純化。所得人類化PD1抗體命名如下：表 5 ： PD1 - 0103 之人類化變異抗體之 VH 及 VL 序列 表 6 ： PD1 - 0103 之人類化變異抗體之 HVR 序列
如上所述表徵人類化PD1-0103抗體變異體及親本嵌合PD1-0103。結果示於表7中。表 7 ： 人類化 PD1 - 0103 抗體變異體及親本嵌合 PD1 - 0103 之結果的概述 1 . 7 中和 PD - 1 抗體之效能
為測試內部產生之PD1抗體模擬重建活體外遏制T細胞反應之中和效能，使用市售PD1/PD-L1報導子分析(Promega)。此系統由PD1+ NFAT Jurkat細胞及PD-L1+ CHO對應體構成，其亦給予活化信號。大體上，該報導子系統係基於三個步驟：(1)TCR介導之NFAT活化、(2)在活化時即藉由PD-1/PD-L1軸抑制NFAT信號及(3)藉由PD1阻斷抗體回收NFAT信號。 材料及方法： • PD-L1培養基：PAN Biotech (編號P04-03609)；FBS (10%)及L-Gln (4 mM) • 分析培養基：RPMI 1640 (編號31870; Invitrogen)，25 mM HEPES，2 mM L-Gln，FBS (2%) • 用於此分析之細胞(細胞類型均購自Promega)： PD-L1+CHO細胞(批號第139147號)：2至3×104
個細胞/96孔 PD1+NFAT Jurkat細胞(批號第133024號)：3.5×104
個細胞/孔 第1天，將PD-L1+細胞解凍，在以上所提及之培養基中以指定細胞濃度接種且在37℃及5% CO2
下培養隔夜。第二天，移除培養基且PD-L1+細胞以指定濃度與製備之抗體一起培育(在分析培養基中)。同時，解凍PD1+NFAT Jurkat細胞且將上文所提及之細胞成員轉移至PD-L1+細胞並與PD-L1+細胞一起共培養。在37℃及5% CO2
下培育6小時之後，將Bio-Glo基底升溫至室溫(添加之前1至2小時)。根據套組製造商之建議，在每孔添加80 µl Bio-Glo溶液之前，自培育箱移除細胞培養盤且調整至室溫(10分鐘)，在以Tecan無限讀取器量測螢光之前培育5至10分鐘。結果可見於圖5A及圖5B中，其中展示在TCR刺激時不同PD-1抗體復原PD-1/PD-L1介導之NFAT信號遏制：圖 5A
：當與參考抗體比較時，嵌合PD1_0103展示可再現之優良作用。作為參考，用人類IgG1之主鏈(具有突變L234A、L235A及P329G (Kabat之EU索引))合成且選殖包含納武單抗(亦稱為MDX-5C4或MDX-1106)之VH及VL結構域的抗PD1抗體。圖 5B
：PD1_0103之四個人類化變異體表明與先導抗體相似之活體外效能且亦略微優於參考抗體。 實例2 靶向PD1之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合物抗原結合分子之製備 根據Uniprot資料庫之P41273序列(SEQ ID NO:103)合成編碼人類4-1BB配位體之胞外域之一部分(胺基酸71-254及71-248)的DNA序列之不同片段。 2.1具有交叉CH1-CL結構域及帶電殘基之單價的靶向PD1 (0314)之含有4-1BB配位(71-254)三聚體之Fc(kih)融合物抗原結合分子(構築體7.1)之製備 如圖 6A
中所描繪選殖含有4-1BB配位體(71-254)之兩個胞外域(由(G4S)2連接子分離且與人類IgG1-CL結構域融合)之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2連接子、人類CL。 如圖 6B
中所描述選殖含有4-1BB配位體(71-254)之一個胞外域且與人類IgG1-CH1結構域融合之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2
連接子、人類CH。 為改良正確配對，在交叉CH-CL中引入以下突變。在與人類CL融合之二聚4-1BB配位體中，引入突變E123R及Q124K。在與人類CH1融合之單體4-1BB配位體中，將突變K147E及K213E選殖至人類CH1結構域中，如國際專利申請公開案第WO 2015/150447號中所述。 在具有臼之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖編碼對PD1，純系0314 (或0103-0314)具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列的可變區。PD1結合子之產生及製備描述於實例1中。 根據國際專利申請公開案第WO 2012/130831號中描述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入杵及臼重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。 對於所有構築體，在杵鏈中之S354C/T366W突變及相應的臼鏈中之Y349C/T366S/L368A/Y407V突變情況下使用杵臼雜二聚化技術。 含有S354C/T366W突變之二聚配位體-Fc杵鏈、單體CH1融合物、靶向之含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗PD1-Fc臼鏈及抗PD1輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及PD1結合Fab(圖7，構築體7.1)。 表8展示含有CH1-CL交換型物及帶電殘基之單價的PD1(0314)-人類4-1BB配位體(71-254) Fc (kih)融合物抗原結合分子(構築體7.1)之cDNA及胺基酸序列。 表8：單價的靶向PD1(0314)之含有人類4-1BB配位體(71-254)之Fc (kih)融合物分子構築體7.1之序列
2.2具有交叉CH1-CL結構域但無帶電殘基之單價的靶向PD1(0314)之含有4-1BB配位體(71-254)之Fc(kih)融合物抗原結合分子(構築體7.2)之製備 如圖 6C
中所描繪選殖含有4-1BB配位體(71-254)之兩個胞外域(由(G4S)2連接子分離且與人類IgG1-CL結構域融合)之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2連接子、人類CL。 如圖 6D
中所描述選殖含有4-1BB配位體(71-254)之一個胞外域且與人類IgG1-CH1結構域融合之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2連接子、人類CH1。 在具有臼之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖編碼對PD1，純系0103-0314具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列的可變區。 將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入杵及臼重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合(WO 2012/130831)。 含有S354C/T366W突變之二聚配位體-Fc結鏈、單體CH1融合物、靶向之含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗FAP-Fc臼鏈及抗FAP輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及FAP結合Fab (圖 7
，構築體7.2)。 表9展示含有CH1-CL交叉型物但無帶電殘基之單價的抗PD1(0314)人類4-1BB配位體(71-254)Fc (kih)融合物抗原結合分子(構築體7.2)之cDNA及胺基酸序列。 表9：單價的靶向PD1(0314)之含有人類4-1BB配位體(71-254)之Fc (kih)融合物分子構築體7.2之序列
2.3具有在各重鏈之C端融合之二聚及單體4-1BB配位體之二價的靶向PD1(0314)之含有4-1BB配位(71-254)三聚體之Fc (kih)融合物抗原結合分子(構築體7.3)之製備 含有由(G4S)2連接子分離之4-1BB配位體(71-254)之兩個胞外域之多肽與人類IgG1 Fc臼鏈之C端融合，如圖 6E
中所描繪：人類IgG1 Fc臼、(G4S)2連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2連接子、人類4-1BB配位體。含有4-1BB配位體(71-254)之一個胞外域之多肽與人類IgG1 Fc杵鏈之C端融合，如圖 6F
中所描述：人類IgG1 Fc杵、(G4S)2連接子、人類4-1BB配位體。 在具有臼、杵之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖編碼對PD1，純系0103-0314具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列的可變區。 根據WO 2012/130831中所述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入杵及臼重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。 含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗FAP huIgG1臼二聚配位體鏈、含有S354C/T366W突變之抗FAP huIgG1杵單體配位體鏈及抗FAP輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及兩個PD1結合Fab (圖 7
，構築體7.3)。 表10展示含有二價的靶向PD1(0314)之4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合物分子構築體7.3 (具有2個抗PD1 Fab、分別在各重鏈之C端融合之二聚及單體4-1BB配位體之PD1裂解型三聚體)之cDNA及胺基酸序列。 表10：二價的靶向PD1(0314)之含有人類4-1BB配位體(71-254)之Fc (kih)融合物分子構築體7.3之序列
2.4具有交叉CH1-CL結構域及帶電殘基之單價的靶向PD1(0314)之含有4-1BB配位(71-248)三聚體之Fc(kih)融合物抗原結合分子(構築體7.4)之製備 如圖 8A
中所描繪選殖含有4-1BB配位體(71-248)之兩個胞外域(由(G4S)2連接子分離且與人類IgG1-CL結構域融合)之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2連接子、人類CL。如圖 8B
中所描述選殖含有4-1BB配位體(71-248)之一個胞外域且與人類IgG1-CH結構域融合之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2連接子、人類CH1。 為改良正確配對，在交叉CH-CL中引入以下突變。在與人類CL融合之二聚4-1BB配位體中，引入突變E123R及Q124K。如國際專利申請公開案第WO 2015/150447號中所述，在與人類CH1融合之單體4-1BB配位體中，將突變K147E及K213E選殖至人類CH1結構域中。 在具有臼之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖編碼對PD1，純系0103-0314具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列的可變區。 根據WO 2012/130831中所述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入杵及臼重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。 含有S354C/T366W突變之二聚配位體-Fc杵鏈、單體CH1融合物、靶向之含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗PD1(0314)-Fc臼鏈及抗PD1(0314)輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及FAP結合Fab (圖 7
，構築體7.4)。表 11
個展示含有CH1-CL交換型物及帶電殘基之單價的PD1(0314)-人類4-1BB配位體(71-248) Fc (kih)融合物抗原結合分子(構築體7.4)之cDNA及胺基酸序列。 表11：單價的靶向PD1(0314)之含有人類4-1BB配位體(71-248)之Fc (kih)融合物分子構築體7.4之序列
2.5具有交叉CH1-CL結構域但無帶電殘基之單價的靶向PD1(0314)之含有4-1BB配位(71-248)三聚體之Fc(kih)融合物抗原結合分子(構築體7.5)之製備 如圖 8C
中所描繪選殖含有4-1BB配位體(71-248)之兩個胞外域(由(G4S)2連接子分離且與人類IgG1-CL結構域融合)之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2連接子、人類CL。如圖 8D
中所描述選殖含有4-1BB配位體(71-248)之一個胞外域且與人類IgG1-CH結構域融合之多肽：人類4-1BB配位體、(G4S)2連接子、人類CH。 在具有臼之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖編碼對PD1，純系0103-0314具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列的可變區。 根據WO 2012/130831中所述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入杵及臼重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。 含有S354C/T366W突變之二聚配位體-Fc杵鏈、單體CH1融合物、靶向之含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗PD1臼鏈及抗PD1輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及FAP結合Fab (圖 7
，構築體7.5)。 表12展示含有CH1-CL交換型物但無帶電殘基之單價的抗PD1(0314)人類4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合物抗原結合分子(構築體7.5)之cDNA及胺基酸序列。 表12：單價的靶向PD1(0314)之含有人類4-1BB配位體(71-248)之Fc (kih)融合物分子構築體7.5之序列
2.6具有在各重鏈之C端融合之二聚及單體4-1BB配位體之二價的靶向PD1(0314)之含有4-1BB配位(71-248)三聚體之Fc (kih)融合物抗原結合分子(構築體7.6)之製備 含有由(G4S)2連接子分離之4-1BB配位體(71-248)之兩個胞外域之多肽與人類IgG1 Fc臼鏈之C端融合，如圖 8E
中所描繪：人類IgG1 Fc臼、(G4S)2連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2連接子、人類4-1BB配位體。含有4-1BB配位體(71-248)之一個胞外域之多肽與人類IgG1 Fc杵鏈之C端融合，如圖8F
中所描述：人類IgG1 Fc杵、(G4S)2連接子、人類4-1BB配位體。 在具有臼、杵之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖編碼對PD1，純系0103-0314具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列的可變區。 根據WO 2012/130831中所述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入杵及臼重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。 含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗PD1 huIgG1臼二聚配位體鏈、含有S354C/T366W突變之抗PD1 huIgG1杵單體配位體鏈及抗PD1輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及兩個PD1結合Fab (圖 7
，構築體7.6) 表13展示含有靶向二價PD1(0314)之4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合物分子構築體7.6 (具有2個抗PD1 Fab、分別在各重鏈之C端融合之二聚及單體4-1BB配位體之PD1裂解型三聚體)之cDNA及胺基酸序列。 表13：二價的靶向PD1(0314)之含有人類4-1BB配位體(71-248)之Fc (kih)融合物分子(構築體7.6)之序列
2.7具有在各重鏈之C端融合之二聚及單體4-1BB配位體之單價的靶向PD1(0314)之含有4-1BB配位(71-248)三聚體之Fc(kih)融合物抗原結合分子(杵鏈上之抗PD1，構築體7.11及7.12)之製備 將含有由(G4S)2連接子分離之4-1BB配位體之兩個胞外域之多肽在框架中次選殖至人類IgG1 Fc臼或杵鏈之C端，如圖 9A
中所描繪：人類IgG1 Fc、(G4S)2連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2連接子、人類4-1BB配位體。將含有4-1BB配位體之一個胞外域之多肽在框架中次選殖至人類IgG1 Fc杵或臼鏈之C端，如圖 9B
中所描述：人類IgG1 Fc、(G4S)2連接子、人類4-1BB配位體。 在具有杵之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖編碼對PD1，純系0314具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列的可變區。 根據WO 2012/130831中所述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入杵及臼重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。 含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之huIgG1臼鏈、含有S354C/T366W突變之抗PD1 huIgG1杵鏈及抗PD1輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及一個PD1結合Fab (圖 9C 及 D
，構築體7.11及7.12)。 表14展示單價的靶向PD1(0314)之含有4-1BB配位三聚體之Fc(kih)融合物分子構築體7.11 (具有一個抗PD1 Fab、在Fc臼鏈之C端融合之二聚4-1BB配位體及在Fc杵鏈之C端融合之單體4-1BB配位體之PD1裂解型三聚體)之cDNA及胺基酸序列。 表14：單價的靶向PD1(0314)之含有人類4-1BB配位體(71-248)之Fc (kih)融合物分子(構築體7.11)之序列
表15展示單價的靶向PD1(0314)之含有4-1BB配位三聚體之Fc(kih)融合物分子構築體7.12 (具有一個抗PD1 Fab、在Fc臼鏈之C端融合之二聚4-1BB配位體及在Fc杵鏈之C端融合之單體4-1BB配位體之PD1裂解型三聚體)之cDNA及胺基酸序列。 表15：單價的靶向PD1(0314)之含有人類4-1BB配位體(71-248)之Fc (kih)融合物分子(構築體7.12)之序列
2.8具有在各重鏈之C端融合之二聚及單體4-1BB配位體之單價的靶向PD1(0314)之含有4-1BB配位(71-248)三聚體之Fc(kih)融合物抗原結合分子(杵鏈上之抗PD1，構築體7.13及7.14)之製備 將含有由(G4S)2連接子分離之4-1BB配位體之兩個胞外域之多肽在框架中次選殖至人類IgG1 Fc臼或杵鏈之C端，如圖 9A
中所描繪：人類IgG1 Fc、(G4S)2連接子、人類4-1BB配位體、(G4S)2連接子、人類4-1BB配位體。將含有4-1BB配位體之一個胞外域之多肽在框架中次選殖至人類IgG1 Fc杵或臼鏈之C端，如圖 9B
中所描述：人類IgG1 Fc、(G4S)2連接子、人類4-1BB配位體。 在具有臼之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中次選殖編碼對PD1，純系0314具有特異性之結合子之重鏈及輕鏈DNA序列的可變區。 根據WO 2012/130831中所述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入杵及臼重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。 含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗PD1 huIgG1臼鏈、含有S354C/T366W突變之huIgG1杵鏈及抗PD1輕鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括組裝之三聚4-1BB配位體及一個PD1結合Fab (圖 10A
及B
，構築體7.13及7.14)。 表16展示單價的靶向PD1(0314)之含有4-1BB配位三聚體之Fc(kih)融合物分子構築體7.13 (具有一個抗PD1 Fab、在Fc臼鏈之C端融合之二聚4-1BB配位體及在Fc杵鏈之C端融合之單體4-1BB配位體之PD1裂解型三聚體)之cDNA及胺基酸序列。 表16：單價的靶向PD1(0314)之含有人類4-1BB配位體(71-248)之Fc (kih)融合物分子(構築體7.13)之序列
表17展示單價的靶向PD1(0314)之含有4-1BB配位三聚體之Fc(kih)融合物分子構築體7.14 (具有一個抗PD1 Fab、在Fc臼鏈之C端融合之二聚4-1BB配位體及在Fc杵鏈之C端融合之單體4-1BB配位體之PD1裂解型三聚體)之cDNA及胺基酸序列。 表17：單價的靶向PD1(0314)之含有人類4-1BB配位體(71-248)之Fc (kih)融合物分子(構築體7.14)之序列
2.9未經靶向之含有人類4-1BB配位三聚體之Fc融合物抗原結合分子(對照分子)之製備 如上文關於靶向PD1之抗原結合分子所描述製備對照分子，唯一不同之處在於經不結合於抗原之稱為DP47之生殖系對照置換抗PD1結合子(VH及VL)。 對照B係含有CH-CL交換型物及帶電殘基之未經靶向單價的裂解型三聚人類4-1BB配位體(71-254) Fc(kih)抗原結合分子(圖 11A
)。然而，與構築體7.1相對應，PD1結合子之重鏈及輕鏈DNA序列之可變區經生殖系對照(DP47)之該等重鏈及輕鏈DNA序列之可變區置換且在框架中用臼之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈次選殖。 二價變異體對照C (圖 11B
)與二價構築體7.3及7.6類似來製備且單價變異體對照D (圖 11C
)與構築體7.3 (含有4-1BB配位(71-248)三聚體)類似來製備，唯一不同之處在於經生不結合於抗原之稱為DP47之殖系對照置換抗PD1結合子(VH及VL)。 表18展示在含有4-1BB配位體之臂中具有CH1-CL交換型物及帶電殘基之未靶向DP47之含有4-1BB配位(71-254)三聚體之Fc (kih)融合物抗原結合分子(對照B)之cDNA及胺基酸序列。 表18：未靶向DP47之含有4-1BB配位(71-254)三聚體之Fc (kih)融合物抗原結合分子(DP47裂解型4-1BBL三聚體)對照B之序列
表19展示二價的未靶向DP47之裂解型三聚4-1BB配位體(71-254) Fc (kih)融合物分子對照C之cDNA及胺基酸序列。 表19：二價的未靶向DP47之含有人類4-1BB配位體(71-254)之Fc (kih)融合物分子對照C之序列
表20分別展示含有CH-CL交叉物及帶電殘基之單價未靶向DP47之裂解型三聚4-1BB配位體(71-248) Fc (kih)融合物、對照D之cDNA及胺基酸序列。 表20：具有CH-CL交叉物及帶電殘基之單價的未靶向DP47之裂解型三聚人類4-1BB配位體(71-248)Fc (kih)融合物(對照D)之cDNA及胺基酸序列。*帶電殘基
2.10製備作為對照之人類IgG1抗原結合分子 用於分析之另一對照分子(對照F)係未經靶向之DP47、生殖系對照、人類IgG1，其含有Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變以消除與Fcγ受體之結合，根據國際專利申請公開案第WO 2012/130831號中描述之方法。 表21展示未經靶向之DP47 huIgG1 PGLALA (對照F)之cDNA及胺基酸序列。 表21：未經靶向之DP47 huIgG1 (對照F)之序列表 22
展示抗PD1 huIgG1 PGLALA (純系0314)，亦即對照M之cDNA及胺基酸序列。 表22：抗PD1 (0314)huIgG1 PGLALA (對照M)之cDNA及胺基酸序列
實例3 單價及二價的靶向抗PD1之裂解型三聚4-1BB配位體Fc融合物抗原結合分子及對照分子之製造及純化 將經靶向及未經靶向之裂解型三聚4-1BB配位體Fc (kih)融合物分子編碼序列選殖至質體載體中，該質體載體驅動插入物自MPSV啟動子之表現且含有位於在CDS之3'端處的合成polyA序列。另外，載體含有用於質體之游離型維護之EBV OriP序列。 藉由使用聚乙烯亞胺共轉染HEK293-EBNA細胞及哺乳動物表現載體來製造裂解型三聚4-1BB配位體Fc(kih)融合物分子。用相應表現載體轉染細胞。對於構築體7.1、7.2、7.4、7.6及相應對照分子對照B及D，係在1:1:1:1之比率下(「載體Fc臼鏈」:「載體PD1輕鏈」:「載體Fc杵鏈」:「載體4-1BBL輕鏈」)。對於構築體7.3、7.6、7.11、7.12、7.13、7.14及對照C，係在1:1:1之比率下(「載體Fc臼鏈」:「載體Fc杵鏈」:「載體抗PD1輕鏈」)。對於雙特異性構築體製造在分析中用作對照之人類IgG (僅對於轉染，使用1:1比率之用於輕鏈之載體及用於重鏈之載體)。 關於在500 mL搖瓶中製造，在轉染之前24小時接種3億個HEK293 EBNA細胞。對於轉染，細胞在210 x g下離心10分鐘，且用20 mL預溫熱CD CHO培養基置換上清液。在20 mL CD CHO培養基中混合表現載體(200 μg完全DNA)。在添加540 μL PEI之後，使溶液渦動15秒且在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至500mL搖瓶中且在具有5% CO2
氛圍的培育箱中在37℃下培育3小時。在培育之後，添加補充有6 mM L-麩醯胺酸、5 g/L PEPSOY及1.2 mM丙戊酸之160 mL Excell培養基且培養細胞24小時。在轉染之後一天，添加12% Feed 7及葡萄糖(最終濃度3 g/L)。在培養7天之後，藉由在至少400 x g下離心30-40分鐘來收集上清液。將溶液無菌過濾(0.22 μm過濾器)，補充疊氮化鈉至最終濃度係0.01% (w/v)，且保持在4℃下。 藉由親和層析，使用蛋白A，隨後尺寸排阻層析，自細胞培養物上清液純化所分泌之蛋白質。對於親和層析，將上清液裝載於MabSelect Sure管柱(CV = 5 - 15 mL，來自GE Healthcare之樹脂)上，用磷酸鈉(20 mM)、檸檬酸鈉(20 mM)緩衝劑(pH 7.5)平衡。藉由用至少6倍管柱體積之相同緩衝劑洗滌來移除未結合之蛋白質。用20 mM檸檬酸鈉、100 mM氯化鈉、100 mM甘胺酸緩衝劑(pH 2.5)，使用線性梯度(20 CV)或分步溶離(8 CV)來溶離結合之蛋白質。對於線性梯度，應用額外的4倍管柱體積分步溶離。 藉由添加1/10 (v/v) 0.5 M磷酸鈉，pH 8.0來調節所收集之溶離份之pH值。在裝載於用20 mM組胺酸、140 mM氯化鈉、0.01% (v/v)Tween20溶液(pH 6.0)平衡之HiLoad Superdex 200管柱(GE Healthcare)之前濃縮蛋白質。 藉由量測280 nm下之光學密度(OD)，使用基於胺基酸序列計算之莫耳消光係數來測定蛋白質濃度。藉由在存在及不存在還原劑(5 mM 1,4-二硫蘇糖醇)之情況下進行SDS-PAGE且用Coomassie SimpleBlue™ SafeStain (Invitrogen USA)染色或使用Caliper LabChip GXII (Perkin Elmer)進行CE-SDS來分析經靶向之三聚4-1BB配位體Fc (kih)融合物之純度及分子量。在25℃下，使用在25 mM K2
HPO4
、125 mM NaCl、200 mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02% (w/v)NaN3
，pH 6.7操作緩衝劑中平衡之TSKgel G3000 SW XL分析型尺寸排阻管柱(Tosoh)分析樣品之聚集物含量。 表23概述靶向及未靶向FAP(4B9)之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合物抗原結合分子及對照分子之產量及最終單體含量。 表23 靶向及未靶向PD1之含有4-1BB配位三聚體Fc (kih)融合物抗原結合分子及對照分子之生物化學分析
實例4藉由表面電漿子共振進行靶向 PD1 之 4 - 1BB 裂解型 三聚配位體 Fc 融合物抗原結合分子之同時結合
4.1用於表面電漿子共振之抗原的製備、純化及表徵製備 4 - 1BB Fc ( kih ) 融合物分子
在具有杵上之人類IgG1重鏈CH2及CH3結構域的框架中次選殖編碼人類4-1BB之胞外域的DNA序列(根據Q07011之人類4-1BB之胺基酸24至186，SEQ ID NO:163)。在抗原胞外域與人類IgG1之Fc之間引入AcTEV蛋白酶裂解位點。在抗原-Fc杵之C端引入用於引導生物素標記之Avi標籤。含有S354C/T366W突變之抗原-Fc杵鏈與含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之Fc臼鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括含有4-1BB胞外域之鏈之單一複本，因此產生Fc連接之抗原之單體形式。表24展示抗原Fc-融合物構築體之cDNA及胺基酸序列。 表24：單體抗原Fc (kih)融合分子之cDNA及胺基酸序列
將所有4-1BB-Fc-融合物分子編碼序列選殖至質體載體，其驅動插入物自MPSV啟動子之表現且含有位於CDS之3'端處的合成polyA信號序列。另外，載體含有用於質體之游離型維護之EBV OriP序列。 關於經生物素標記之單體抗原/Fc融合分子之製備，用三個編碼融合蛋白之兩個組分(杵及臼鏈)的載體以及BirA (生物素標記反應所需之酶)共轉染以指數方式生長之懸浮液HEK293 EBNA細胞。以2:1:0.05之比率(「抗原ECD-AcTEV-Fc杵」:「Fc臼」:「BirA」)使用相應載體。 關於在500 mL搖瓶中製造蛋白質，在轉染之前24小時接種4億個HEK293 EBNA細胞。關於轉染，使細胞在210 g下離心5分鐘，且用預溫熱之CD CHO培養基置換上清液。使表現載體再懸浮於20 mL含有200 μg載體DNA之CD CHO培養基中。在添加540 μL聚乙烯亞胺(PEI)之後，使溶液渦動15秒且在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至500 mL搖瓶中且在具有5% CO2
氛圍的培育箱中在37℃下培育3小時。在培育之後，添加160 mL F17培養基且培養細胞24小時。在轉染之後一天，將1 mM丙戊酸及7% Feed 1與補充劑一起添加至培養物中。培養7天之後，藉由使細胞在210 g下短暫離心15分鐘收集細胞上清液。將溶液無菌過濾(0.22 μm過濾器)，補充疊氮化鈉至最終濃度係0.01% (w/v)，且保持在4℃下。 藉由親和層析，使用蛋白A，隨後尺寸排阻層析，自細胞培養物上清液純化所分泌之蛋白質。對於親和層析，將上清液裝載於經40 mL 20 mM磷酸鈉、20 mM檸檬酸鈉(pH 7.5)平衡之HiTrap ProteinA HP管柱(CV = 5 mL，GE Healthcare)上。藉由用至少10倍管柱體積之含有20 mM磷酸鈉、20 mM檸檬酸鈉、0.5 M氯化鈉之緩衝劑(pH 7.5)洗滌來移除未結合之蛋白質。使用經20倍管柱體積之20 mM檸檬酸鈉、0.01% (v/v)Tween-20 (pH 3.0)產生之氯化鈉之線性pH梯度(0至500 mM)來溶離結合之蛋白質。接著用10倍管柱體積之20 mM檸檬酸鈉、500 mM氯化鈉、0.01% (v/v) Tween-20 (pH 3.0)洗滌管柱。 藉由添加1/40 (v/v) 2 M Tris (pH 8.0)來調節所收集之溶離份之pH值。在裝載於用2 mM MOPS、150 mM氯化鈉、0.02% (w/v)疊氮化鈉溶液(pH 7.4)平衡之HiLoad Superdex 200管柱(GE Healthcare)之前濃縮蛋白質。 關於人類受體之親和力測定，亦在具有avi (GLNDIFEAQKIEWHE，SEQ ID NO:168)及六組胺酸標籤之框架中次選殖人類4-1BB之胞外域。 如上文針對Fc融合蛋白所述進行蛋白質製造。藉由螯合層析，隨後尺寸排阻層析自細胞培養物清液層純化所分泌之蛋白質。在用20 mM磷酸鈉、500 nM氯化鈉(pH 7.4)平衡之NiNTA Superflow濾筒(5 ml，Qiagen)上進行第一層析步驟。藉由經12倍管柱體積施用5%至45%溶離緩衝劑(20 mM磷酸鈉、500 nM氯化鈉、500 mM咪唑，pH 7.4)之梯度來進行溶離。在裝載於用2 mM MOPS、150 mM氯化鈉、0.02% (w/v)疊氮化鈉溶液(pH 7.4)平衡之HiLoad Superdex 75管柱(GE Healthcare)之前濃縮蛋白質且過濾(表25)。 表25：單體人類4-1BB His分子之序列
人類PD1 Fc融合抗原購自R&D systems (目錄號1086-PD-050)。 4.2藉由表面電漿子共振測定經靶向C端4-1BB裂解型三聚配位體Fc融合物抗原結合分子之同時結合 藉由表面電漿子共振(SPR)評定同時結合人類4-1BBFc (kih)及人類PD1之能力。所有SPR實驗均在Biacore T200上在25℃下以HBS-EP作為操作緩衝劑(0.01 M HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.005%界面活性劑P20, Biacore, Freiburg/Germany)來進行。 經生物素標記之人類4-1BB Fc (kih)與抗生蛋白鏈菌素(SA)感測器晶片之流通槽直接偶合。使用至多200個共振單位(RU)之固定程度。使200 nM之濃度範圍之經靶向三聚C端4-1BB配位體Fc(kih)融合物分子以30 μL/分鐘之流量流經流通槽90秒，且將解離設定為零秒。濃度500 nM之人類PD1-Fc (R&D systems)作為第二分析物以30 μL/分鐘之流量注射穿過流通槽90秒(圖 12A
)。監測解離120秒。藉由減去在參考流通槽(其中未固定蛋白質)中獲得之反應來校正整體折射率差異。全部雙特異性構築體均可同時結合於人類4-1BB及人類PD1 (圖 12B 、 12C 、 12D 及 12E
)。 實例5靶向 PD1 之含有 4 - 1BB 配位三聚體之 Fc 融合物抗原結合分子之功能性表徵
5.1. 靶向PD1之含有4-1BB配位三聚體之Fc (kih)融合物抗原結合分子之新鮮且經活化之人類PMBC上之結合 自Zürich血液供給中心獲得白血球層。為分離新鮮的周邊血液單核細胞(PBMC)，用相同體積之DPBS (Gibco，Life Technologies，目錄號14190 326)稀釋白血球層。提供50 mL聚丙烯離心管(TPP，目錄號91050)及15 mL Histopaque 1077 (SIGMA Life Science，目錄號10771，聚蔗糖及泛影酸鈉，調節至1.077 g/mL之密度)且經稀釋之白血球層內含物在Histopaque 1077上分層。使管在450 x g下離心30分鐘。接著，自界面收集PBMC，用DPBS洗滌三次且再懸浮於由以下組成之T細胞培養基中：具有10% (v/v)胎牛血清(FBS，US-origin，PAN biotech，P30-2009，批號P150307GI，γ照射、無黴漿菌，在56℃下熱不活化35分鐘)、1% (v/v) GlutaMAXI (GIBCO，Life Technologies，目錄號35050038)、1 mM丙酮酸鈉(SIGMA，目錄號S8636)、1% (v/v)MEM非必需胺基酸(SIGMA，目錄號M7145)及50 µM β-巰基乙醇(SIGMA，M3148)之RPMI1640培養基(Gibco，Life Technology，目錄號42401-042)。 在分離之後直接使用PBMC(結合於新鮮人類PBMC上)或刺激其以誘導T細胞之細胞表面上之4-1BB表現(結合於經活化之人類PBMC上)。為誘導人類T細胞上之4-1BB上調，在具有10%胎牛血清(FBS，US-origin，PAN biotech，P30-2009，批號P150307GI，γ照射、無黴漿菌，在56℃下熱不活化35分鐘)、1% GlutaMAX-I (GIBCO，life technologies，目錄號35050-038)、200 U/mL Proleukin (Novartis Pharma Schweiz AG，CHCLB-P-476-700-10340，批號AA4493BAL)及2 µg/mL PHA-L (SIGMA，目錄號L2769)之RPMI 1640 (GIBCO，life technologies，目錄號42401-042)中以1×106
個細胞/毫升之濃度培養PBMC 3天。在三天之後，收集預活化之人類PBMC，再懸浮於具有10 % FBS、1 mM丙酮酸鈉(SIGMA，目錄號S8636)、1% Gluta-MAX-I、1% MEM-非必需胺基酸溶液(SIGMA，目錄號M7145)及50 μM β-巰基乙醇(Sigma M3148)之RPMI 1640中至最終濃度係1×106
個細胞/毫升。之後，將細胞接種於6孔組織培養盤(TTP，目錄號92006)中，該培養盤已在4℃下用10 μg/mL抗人類CD3 (純系OKT3，小鼠IgG2a，BioLegend，目錄號317315)及2 μg/mL抗人類CD28(純系CD28.2，小鼠IgG1，BioLegend，目錄號302923)塗佈隔夜。將細胞在37℃及5% CO2
下再培育2天。 對於結合分析，將0.1×106
個新鮮或經活化之PBMC添加至圓底懸浮細胞96孔盤(greiner bio-one，cellstar，目錄號650185)之各孔中。培養盤用350 x g且在4℃下離心5分鐘，且丟棄上清液。之後，在4℃下在黑暗中用100微升/孔含有1:5000稀釋之可固定存活力染料eF660 (eBioscience，目錄號65-0864-18)之DPBS染色細胞30分鐘。細胞用200 µL冰冷DPBS緩衝劑洗滌一次。接下來，添加50微升/孔之含有滴定濃度之構築體7.1、構築體7.3、構築體7.5及構築體7.6及作為對照之對照B、對照C、對照D、對照M及對照F的4℃冷FACS緩衝劑(具有2% FBS、5 mM EDTA pH8 (Amresco，目錄號E177)及7.5 mM疊氮化鈉(Sigma-Aldrich，目錄號S2002)之DPBS)，且在4℃下培育細胞60分鐘，用200微升/孔4℃ FACS緩衝劑洗滌三次。將細胞進一步再懸浮於50微升/孔之含有0.67 μg/ml抗人類CD45-AF488 (純系HI30，小鼠igG1k，BioLegend，目錄號304019)、0.33 μg/mL抗人類CD8a-BV510 (純系SK1，小鼠IgG1k，BioLegend，目錄號344732)、0.23 μg/mL抗人類CD4-BV421 (純系OKT4，小鼠IgG2bκ，BioLegend，目錄號317434)、0.67 μg/mL抗人類CD3-PerCP-Cy5.5 (純系UCHT1，小鼠IgG1k，BioLegend，目錄號300430)、0.67 μg/mL抗人類CD19-PE/Cy7 (純系HIB19，小鼠IgG1k，BioLegend，目錄號302216)、5 µg/mL PE結合之親和純化抗人類IgG F(ab`)2-片段特異性山羊F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch，目錄號109 116 098)之4℃冷FACS緩衝劑中，且在4℃下培育30分鐘。細胞用200微升/孔4℃ FACS緩衝劑洗滌兩次，且接著用具有1%甲醛(Sigma, HT501320-9.5L)之DPBS固定。使細胞再懸浮於100微升/孔之FACS緩衝劑中且使用MACS Quant分析儀10 (Miltenyi Biotech)獲取。使用FlowJo V10 (FlowJo, LLC)及GraphPad Prism 6.04 (GraphPad Software, Inc)分析數據。 將閘極設置於活的CD45+
CD3+
CD19陰性
CD8陰性
CD4+
T細胞、CD45+
CD3+
CD19陰性
CD4陰性
CD8+
T細胞、CD45+
CD3+
CD4陰性
CD8陰性
γδ T細胞及CD45+
CD3陰性
CD19+
B細胞上且針對滴定濃縮之靶向PD1或未靶向DP47之4-1BB裂解型三聚配位體Fc融合物抗原結合分子印跡結合PE之親和純化抗人類IgG IgGFcγ片段特異性山羊F(ab`)2片段之螢光強度之幾何平均值。如圖13A - H
中所示，關於來自健康供者之靜止之新鮮的分離之人類PBMC，僅靶向PD1之4-1BB裂解型三聚配位體Fc融合物抗原結合分子(構築體7.1、構築體7.3、構築體7.5及構築體7.6)及靶向PD1之人類IgG對照M結合於CD3+
CD4+
、CD3+
CD8+
及CD3+
CD4陰性
CD8陰性
γδ T細胞。然而未靶向DP47之4-1BB裂解型三聚配位體Fc融合物抗原結合分子(對照B、C及D)不結合於任何新近分離之PBMC。因此，關於新近分離之人類PBMC，大多數細胞並不表現4-1BB，然而T細胞群體表現可偵測量之PD1。在表26中，概述新近分離之人類PBMC之結合曲線之EC50
值。 表26：新近分離之靜止人類PBMC之結合曲線之EC50
值
如圖14A - H
中所示，在活化之後，活的CD45+
CD3+
CD19陰性
CD8陰性
CD4+
T細胞、CD45+
CD3+
CD19陰性
CD4陰性
CD8+
T細胞、CD45+
CD3+
CD4陰性
CD8陰性
γδ T細胞及CD45+
CD3陰性
CD19+
B細胞表現人類4-1BB及人類PD1。由此僅PD1結合分子(對照M)或僅人類4-1BB結合分子(對照B、對照C及對照D)證明在活化之CD4+
T細胞、CD8+
T細胞、γδ T細胞及B細胞上PD1高度上調，然而在CD8+
T細胞、γδ T細胞及B細胞上4-1BB主要上調且在CD4+
T細胞上較小程度上調。靶向PD1之4-1BB裂解型三聚配位體Fc融合物抗原結合分子(構築體7.1、構築體7.3、構築體7.5及構築體7.6)結合於PD1及人類4-1BB，且此由高於配合對照之螢光強度之幾何平均值反映。在表27中，概述活化之人類PBMC之結合曲線之EC50
值。 表27：活化之人類PBMC之結合曲線的EC50
值
5.2人類PD1及人類4-1BB轉染之腫瘤細胞之結合 對於表現PD1及4-1BB之腫瘤細胞之結合分析，使用兩個經遺傳修飾之腫瘤細胞。人類表現HeLa-hu4-1BB-NFκB-luc純系26細胞之產生將描述於實例5.3.1中。對於表現人類PD1之腫瘤細胞株，如下用人類PD1轉染CHO-k1細胞：用編碼全長人類PD1之質體15311_hPD1-fl_pUC_Neo穩定轉染親本黏附CHO-K1細胞株(ATCC CCL-61)且用G418(質體上之新黴素耐受性標記)選擇。 將再懸浮於DPBS (Gibco，Life Technologies，目錄號14190 326)中之0.1×106
個腫瘤細胞添加至圓底懸浮細胞96孔盤(greiner bio-one，cellstar，目錄號650185)之各孔中。細胞用200 µL DPBS洗滌一次。細胞再懸浮於100微升/孔之含有1:5000稀釋之可固定存活力染料eFluor 660 (eBioscience，目錄號65-0864-18)的4℃冷DPBS緩衝劑中且在4℃下培育培養盤30分鐘。細胞用200微升/孔 4℃冷DPBS緩衝劑洗滌一次且再懸浮於50微升/孔之一系列濃度之含有靶向PD1之4-1BB裂解型三聚配位體Fc融合物抗原結合分子之4℃冷FACS緩衝劑(具有2% FBS、5 mM EDTA pH8 (Amresco，目錄號E177)及7.5 mM疊氮化鈉(Sigma-Aldrich S2002)之DPBS)中，之後在4℃下培育1小時。在充分洗滌之後，在4℃下進一步用50微升/孔之含有5 µg/mL結合PE之親和純化抗人類IgG F(ab`)2-片段特異性山羊F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch，目錄號109 116 098)之4℃冷FACS緩衝劑染色細胞30分鐘。細胞用200微升/孔4℃ FACS緩衝劑洗滌兩次且將細胞固定於50微升/孔之含有1%甲醛(Sigma，HT501320-9.5L)之DPBS中。使細胞再懸浮於100微升/孔之FACS緩衝劑中且使用MACS Quant分析儀10 (Miltenyi Biotech)獲取。使用FlowJo V10 (FlowJo, LLC)及GraphPad Prism 6.04 (GraphPad Software, Inc)分析數據。 將閘極設置於活的腫瘤細胞上且針對滴定濃縮之靶向PD1之4-1BB裂解型三聚配位體Fc融合物抗原結合分子或其對照印跡結合PE之親和純化抗人類IgG IgGFcγ片段特異性山羊F(ab`)2片段之螢光強度之幾何平均值。如圖15A
及15B
中所示，僅靶向PD1將裂解型三聚4-1BB配位體融合物分子構築體7.1、構築體7.3、構築體7.5及構築體7.6及對照M結合於表現PD1之CHO-k1-huPD1純系5，然而未靶向PD1之對照分子，對照B、對照C、對照D及對照F不結合於腫瘤細胞。在圖 16A
及16B
中，僅含有裂解型三聚4-1BB配位體之融合物分子構築體7.1、構築體7.3、構築體7.5及構築體7.6及對照B、對照C、及對照D結合於表現人類4-1BB之HeLa-hu4-1BB-NFkB-luc純系26，然而不含融合之裂解型三聚4-1BB配位體之對照(對照F及對照M)不結合於表現人類4-1BB之腫瘤細胞。在表28中列舉曲線之EC50
值。 表28：表現人類PD1或人類4-1BB之腫瘤細胞之結合曲線的EC50
值
實例6靶向 PD1 之含有 4 - 1BB 配位三聚體之 Fc 融合物抗原結合分子之生物活性
表現人類4-1BB之HeLa報導子細胞株之NF-κB活化 6.1表現人類4-1BB及NF-κB螢光素酶之HeLa細胞之產生 人類乳頭瘤病毒18誘導性子宮頸癌細胞株HeLa (ATCC CCL-2)在CMV-啟動子及嘌呤黴素耐受性基因控制下用基於表現載體pETR10829之質體轉導，該質體含有人類4-1BB之序列(Uniprot寄存號Q07011)。細胞在具有10%胎牛血清(FBS，GIBCO，Life Technologies，目錄號16000-044，批號941273，γ照射，無黴漿菌，在56℃下熱不活化35分鐘)、1% GlutaMAX-I (GIBCO，Life Technologies，目錄號35050-038)及3 μg/mL嘌呤黴素(InvivoGen，目錄號ant-pr-1)之DMEM培養基(Gibco，Life Technologies，目錄號42430-025)中培養。 藉由流式細胞測量術測試4-1BB轉導之HeLa細胞之4-1BB表現：使0.2×106
個活細胞再懸浮於100 μL含有0.1 µg PerCP/Cy5.5結合之抗人類4-1BB小鼠IgG1κ純系4B4-1 (BioLegend目錄號309814)或其同型對照(PerCP/Cy5.5結合之小鼠IgG1κ同型對照抗體純系MOPC 21，BioLegend，目錄號400150)之FACS緩衝劑(具有2% FBS、5 mM EDTA pH 8 (Amresco，目錄號E177)及7.5 mM疊氮化鈉(Sigma-Aldrich，目錄號S2002)之DPBS)中且在4℃下培育30分鐘。細胞用FACS緩衝劑洗滌兩次，再懸浮於含有0.06 μg DAPI (Santa Cruz Biotec，目錄號Sc-3598)之300 μL FACS緩衝液中且使用5-雷射LSR-Fortessa (BD Bioscience, DIVA software)獲取。如下執行有限稀釋以產生單一純系：使人類-4-1BB轉導之HeLa細胞再懸浮於培養基中至10、5及2.5個細胞/毫升之濃度，且將200 μL細胞懸浮液轉移至圓底之經組織培養物處理之96孔盤(6個盤/細胞濃度，TPP目錄號92697)中。收集單一純系，擴增且如上文所述測試4-1BB表現。選擇具有最高4-1BB表現之純系(純系5)用於隨後用NFκB螢光素酶表現載體5495p Tranlucent HygB進行之轉染。載體賦予經轉染細胞對潮黴素B之耐藥性及在NF-kB反應元素(Panomics, 目錄號LR0051)之控制下表現螢光素酶之能力。培養人類4-1BB HeLa純系5細胞至70%匯合。50 μg (40 μL)線性化(限制酶AseI及SalI) 5495p Tranlucent HygB表現載體添加至無菌0.4 cm Gene Pulser/MicroPulser光析管(Biorad，目錄號165-2081)中。添加含2.5×106
個人類4-1BB HeLa純系5細胞之400 μl不含DMEM培養基之補充劑且與質體溶液小心混合。使用Gene Pulser Xcell完全系統(Biorad，目錄號1652660)在以下設定下進行細胞之轉染：指數脈衝，電容500 μF，電壓160 V，電阻∞。緊接在脈衝之後，將轉染之細胞轉移至有具有10% FBS及1% GlutaMAX I (GIBCO，Life Technologies，目錄號35050 038)之15 mL 37℃溫熱DMEM培養基(Gibco，Life Technologies，目錄號42430-025)的組織培養燒瓶75 cm2
(TPP，目錄號90075)中。第二天，添加含有3 μg/mL嘌呤黴素培養基(InvivoGen，目錄號ant-pr-1)及200 μg/mL潮黴素B (Roche，目錄號10843555001)。擴增活細胞且如上文所述進行有限稀釋以產生單一純系。如上文所述測試純系之4-1BB表現且如下測試NF-κB螢光素酶活性：在選擇培養基中收集純系且使用Cell Counter Vi-細胞 xr 2.03 (Beckman Coulter，目錄號731050)計數。細胞設定為0.33×106
個細胞/毫升之細胞密度且將150 μL此細胞懸浮液轉移至具有蓋子之無菌白色96孔平底組織培養盤(greiner bio one，目錄號655083)之各孔中，且作為對照物轉移至正常96孔平底組織培養盤(TPP目錄號92096)中以在第二天測試存活率及細胞密度。細胞在37℃及5% CO2
下培育隔夜。第二天，將50 μL含有不同濃度之重組人類腫瘤壞死因子α (rhTNFα，PeproTech，目錄號30001A)之培養基添加至96孔盤之各孔中達到100、50、25、12.5、6.25及0奈克/孔之rhTNFα之最終濃度。細胞在37℃及5% CO2
下培育6小時且接著用200微升/孔DPBS洗滌三次。將報導子溶解緩衝液(Promega，目錄號：E3971)添加至各孔(30 μl)中且將培養盤儲存在-20℃下隔夜。第二天，將冷凍細胞培養盤及偵測緩衝劑(Luciferase 1000分析系統，Promega，目錄號E4550)解凍至室溫。將100 μL偵測緩衝液添加至各孔中且使用SpectraMax M5/M5e微定量盤式讀取器及SoftMax Pro軟體(Molecular Devices)儘可能快地量測培養盤。將高於對照(不添加rhTNF α)之量測之URL視為螢光素酶活性。選擇NFκB-luc-4-1BB-HeLa純系26用於進一步使用，呈現最高螢光素酶活性及可觀4-1BB表現量。 6.2與表現PD1之CHO-k1-huPD1純系5細胞共培養之表現人類4-1BB之HeLa細胞之NFκB活化 NFκB-luc-4-1BB-海拉純系26細胞用DPBS (Gibco，Life Technologies，目錄號14190 326)洗滌且在37℃下用0.05%胰蛋白酶EDTA(Gibco，Life Technologies，目錄號25300 054)處理5分鐘。收集細胞且再懸浮於具有10%胎牛血清(FBS，US-origin，PAN biotech，P30-2009，批號P150307GI，γ照射，無黴漿菌，在56℃下熱不活化35分鐘)及1%GlutaMAX-I (GIBCO Life Technologies，目錄號35050 038)之DMEM培養基(Gibco，Life Technologies，目錄號42430 025)中。使用細胞計數器Vi-cell xr 2.03 (Beckman Coulter，目錄號731050)計數細胞且設定為細胞密度係0.2×106
個細胞/毫升。將100 μL(2×104
個細胞)之此細胞懸浮液轉移至具有蓋子之無菌白色96孔平底組織培養盤(greiner bio one，目錄號655083)之各孔中且在37℃及5% CO2
下培育培養盤隔夜。第二天，加入50 μL含有不同滴定濃度之含有融合物分子構築體7.1、構築體7.3、構築體7.5及構築體7.6或配合對照(對照B、對照C、對照D、對照F及對照M)之裂解型三聚4-1BB配位體的培養基。對於PD1結合介導之交聯，使用表現PD1之CHO-k1-huPD1純系5細胞。 黏附CHO-k1-huPD1純系5細胞用DPBS(Gibco，Life Technologies，目錄號14190 326)洗滌且在37℃下用無酶之基於PBS之細胞解離緩衝液(Gibco，Life Technologies，目錄號13151-014)處理10分鐘。之後收集細胞且使用細胞計數器Vi-cell xr 2.03計數。使細胞再懸浮於具有10% FBS及1% L-GlutaMAX -I之DEM中至2×106
個細胞/毫升且每孔添加50 µL。在添加交聯表現PD1之CHO-k1-huPD1純系5細胞之後，在37℃及5% CO2
下培育培養盤6小時。白色平底96孔盤用200微升/孔DPBS洗滌三次。將40 µl新近製備之報導子溶解緩衝劑(Promega，目錄號：E3971)添加至各孔中且將培養盤儲存於-20℃下隔夜。第二天，將冷凍培養盤及偵測緩衝劑(Luciferase 1000分析系統，Promega，目錄號E4550)解凍至室溫。將100 μL偵測緩衝劑添加至各孔中且儘快使用SpectraMax M5/M5e微定量盤式讀取器及具有以下設定之SoftMax Pro軟體(Molecular Devices)量測培養盤：對於螢光素酶(RLU)，500 ms整合時間，無過濾器，收集所有波長及上部讀數。 含有靶向PD1之4-1BB配位三聚體之Fc融合物抗原結合分子(PD1裂解型4-1BBL三聚體)在報導子細胞株中在存在表現PD1之腫瘤細胞下觸發NFκB信號傳導路徑之活化。相比之下，相同分子之未經靶向之變異體在任一測試濃度下皆未觸發此作用(圖 18C
及18D
)。當甚至在存在靶向PD1之含有4-1BB配位三聚體之Fc融合物抗原結合分子下用PD1陰性腫瘤細胞培養NF-kB報導子細胞株時仍不能偵測到NF-kB活化時，經靶向4-1BBL之此活性嚴格取決於腫瘤細胞之細胞表面處PD1之表現(圖 18A
及18B
)。展示如針對構築體7.1、7.3、7.5及7.6所量測之活性。以下表29中給出如在表現PD1之腫瘤細胞存在下所量測之EC50
值。 表29：NFκB活化誘導之螢光素酶活性曲線之EC50
值
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