TW201718013A - 用於治療癌症的聯合療法 - Google Patents

Abstract

本發明涉及聯合療法，所述聯合療法包括將特異性結合人B7-H3的第一分子和特異性結合人PD-1的第二分子施用至受試者，以治療癌症和/或炎症。本發明也涉及藥物組合物，其包括特異性結合人B7-H3的第一分子和特異性結合人PD-1的第二分子，所述藥物組合物能夠介導，更優選地能夠增強，針對與任何各種人癌症相關的癌細胞的免疫系統的啟動。本發明也涉及這類藥物組合物治療接受受試者中癌症和其他疾病的用途。

Description

用於治療癌症的聯合療法

[相關申請的交叉引用] 本申請要求美國專利申請系列號62/239,020 (2015年10月8日提交；待決)的優先權，該申請通過引用以其整體併入本文。

[参考序列表] 根據37 C.F.R. 1.821以及下面的條款，本申請包括一個或多個序列表，其以電腦-可讀介質公開(檔案名：1301_129PCT_ST25.txt，2016年9月24日創建，並且大小為89,867位元組)，該檔通過引用以其整體併入本文。

本發明涉及聯合療法，所述聯合療法包括向受試者施用特異性結合人B7-H3的第一分子和特異性結合人PD-1的第二分子，用於治療癌症和/或炎症。本發明也涉及藥物組合物，其包括特異性結合人B7-H3的第一分子和特異性結合人PD-1的第二分子，所述藥物組合物能夠介導，更優選地能夠增強，針對與任何各種人癌症相關的癌細胞的免疫系統的啟動。本發明也涉及這類藥物組合物治療接受受試者中癌症和其他疾病的用途。

腫瘤的生長和轉移很大程度上取決於它們逃避宿主免疫監視和戰勝宿主防禦的能力。大部分腫瘤表達可被宿主免疫系統不同程度識別的抗原，但是在許多情況下，由於效應T細胞的無效啟動而引起不充分的免疫應答(Khawli, L.A.等 (2008) “Cytokine ,Chemokine ,and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of Solid Tumors ,” Exper. Pharmacol. 181:291-328)。

A. B7 超家族和 B7-H3

B7家族成員是具有免疫球蛋白-V樣和免疫球蛋白-C樣結構域(例如，IgV-IgC)的免疫球蛋白超家族成員(Sharpe, A.H.等 (2002) “The B7-CD28 Superfamily ,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126)。B7-家族成員的IgV和IgC結構域各自由單外顯子編碼，另外的外顯子編碼前導序列、跨膜和細胞質結構域。細胞質結構域較短，長度範圍是19至62個氨基酸殘基並且可由多個外顯子編碼(Collins, M.等 (2005) “The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands ,” Genome Biol. 6:223.1-223.7)。預測B7家族的成員在細胞表面形成連續的(back-to-back)、非共價同源二聚體，並且就B7-1 (CD80)和B7-2 (CD86)而言，已經發現了這類二聚體。B7-1 (CD80)和B7-2 (CD86)展示對於刺激性CD28受體和抑制性CTLA-4 (CD152)受體的雙特異性(Sharpe, A.H.等 (2002) “The B7-CD28 Superfamily ,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126)。

B7-H3是獨特的，因為主要的人形式包含兩個細胞外串聯IgV-IgC結構域(即，IgV-IgC-IgV-IgC) (Collins, M.等 (2005) “The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands ,” Genome Biol. 6:223.1-223.7)。儘管起初認為僅僅包括2個Ig結構域(IgV-IgC) (Chapoval, A.等 (2001) “B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production ,” Nature Immunol. 2:269–274；Sun, M.等 (2002) “Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes ,” J. Immunol. 168:6294-6297)，但是已經鑒定了四免疫球蛋白細胞外結構域變體(“4Ig-B7-H3”)，並且發現其是更常見的人形式的蛋白質(Sharpe, A.H.等 (2002) “The B7-CD28 Superfamily ,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126)。但是，天然鼠科形式(2Ig)和人4Ig形式展示類似的功能(Hofmeyer, K.等 (2008) “The Contrasting Role Of B7-H3 ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278)。4Ig-B7-H3分子抑制天然殺傷細胞介導的癌細胞的裂解(Castriconi, R.等 “Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34): 12640-12645)。已經發現人B7-H3 (2Ig形式)通過結合啟動T細胞上的假定受體而促進T-細胞啟動和IFN-γ產生(Chapoval, A.等 (2001) “B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production ,” Nature Immunol. 2:269–274；Xu, H.等 (2009) “MicroRNA miR-29 Modulates Expression of Immunoinhibitory Molecule B7-H3: Potential Implications for Immune Based Therapy of Human Solid Tumors ,” Cancer Res. 69(15):5275-6281)。當在腫瘤細胞上表達時，B7-H4和B7-H1都是免疫功能有效的抑制劑(Flies, D.B.等 (2007) “The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity ,” J. Immunother. 30(3):251-260)。

B7-H3的作用模式的複雜的，因為蛋白質介導T細胞共刺激和共抑制二者(Hofmeyer, K.等 (2008) “The Contrasting Role Of B7-H3 ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278；Martin-Orozco, N.等 (2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity ,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298；Subudhi, S.K.等 (2005) “The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition ,” J. Mol. Med. 83:193-202)。B7-H3結合(TREM)樣轉錄體2 (TLT-2)和共刺激T細胞啟動，而且也結合仍未確定的受體(一種或多種)，以介導T細胞的共抑制。另外，通過與未知受體(一種或多種)的相互作用，B7-H3是天然殺傷細胞和成骨細胞的抑制劑(Hofmeyer, K.等 (2008) “The Contrasting Role Of B7-H3 ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278)。可通過與主要信號傳導途徑的成員的相互作用進行抑制，通過所述傳導途徑，T細胞受體(TCR)調節基因轉錄(例如，NFTA、NF-κB或AP-1因數)。

B7-H3共刺激CD4+和CD8+ T-細胞增殖。B7-H3也刺激IFN-γ產生以及CD8+裂解活性(Chapoval, A.等 (2001) “B7-H3:A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production ,” Nature Immunol. 2:269–274；Sharpe, A.H.等 (2002) “The B7-CD28 Superfamily ,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126)。但是，蛋白質也可能通過NFAT (啟動T細胞的核因數)、NF-κB (核因數κ B)以及AP-1 (活化因數蛋白-1)因數起作用，以抑制T-細胞啟動(Yi. K.H.等 (2009) “FineTuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4 ,” Immunol. Rev. 229:145-151)。也認為B7-H3體內抑制Th1、Th2或Th17 (Prasad, D.V.等 (2004) “Murine B7–H3 Is A Negative Regulator Of T Cells ,” J. Immunol. 173:2500-2506；Fukushima, A.等 (2007) “B7–H3 Regulates The Development Of Experimental Allergic Conjunctivitis In Mice ,” Immunol. Lett. 113:52-57；Yi. K.H.等 (2009) “FineTuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4 ,” Immunol. Rev. 229:145-151)。若干獨立的研究已經顯示，人惡性腫瘤細胞展示顯著增加的B7-H3蛋白質的表達，並且該增加的表達與增加的疾病嚴重程度相關(Zang, X.等 (2007) “The B7 Family And Cancer Therapy: Costimulation And Coinhibition ,” Clin. Cancer Res. 13:5271-5279)，提示B7-H3被腫瘤用作免疫逃避途徑(Hofmeyer, K.等 (2008) “The Contrasting Role Of B7-H3 ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278)。

阻斷B7分子結合T-細胞受體(例如，CD28)的能力的分子抑制免疫系統，並且已經被建議作為自身免疫性疾病的療法(Linsley, P.S.等 (2009) “The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Co-Stimulation ,” Immunolog. Rev. 229:307-321)。用抗4Ig-B7-H3抗體治療的表達4Ig-B7-H3的成神經細胞瘤細胞對NK細胞更敏感。但是，不清楚該活性是否可僅僅歸因於針對4Ig-B7-H3形式的抗體，因為所有報導的針對4Ig-B7-H3而產生的抗體也結合兩個Ig樣形式的B7-H3 (Steinberger, P.等 (2004) “Molecular Characterization of Human 4Ig-B7-H3 ,a Member of the B7 Family with Four Ig-Like Domains ,” J. Immunol. 172(4): 2352-2359和Castriconi等 (2004) “Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34):12640-12645)。

B7-H3不在靜息B或T細胞、單核細胞或樹突細胞上表達，但是其在樹突細胞上通過IFN-γ被誘導和在單核細胞上通過GM-CSF被誘導(Sharpe, A.H.等 (2002) “The B7-CD28 Superfamily ,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126)。還未充分表徵結合B7-H3的受體(一種或多種)。早期的工作提示，一種這樣的受體需要在啟動之後在T細胞上被快速和暫態上調(Loke, P.等 (2004) “Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulatory T Cells .” Arthritis Res. Ther. 6:208-214)。最近，在髓樣細胞上表達的(TREM)樣轉錄體2 (TLT-2或TREML2)受體(King, R.G.等 (2006) “Trem-Like Transcript 2 Is Expressed On Cells Of The Myeloid/Granuloid And B Lymphoid Lineage And Is Up-Regulated In Response To Inflammation ,” J. Immunol. 176:6012-6021；Klesney-Tait, J.等 (2006) “The TREM Receptor Family And Signal Integration ,” Nat. Immunol. 7:1266–1273；Yi. K.H.等 (2009) “FineTuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4 ,” Immunol. Rev. 229:145-151) 已經被證明能夠結合B7-H3，從而尤其能夠共刺激CD8+ T細胞的啟動(Zang, X.等 (2003) “B7x: A Widely Expressed B7 Family Member That Inhibits T Cell Activation ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 100:10388–10392；Hashiguchi, M.等 (2008) “Triggering Receptor Expressed On Myeloid Cell-Like Transcript 2 (TLT-2) Is A Counter-Receptor For B7–H3 And Enhances T Cell Responses ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10495-10500；Hofmeyer, K.等 (2008) “The Contrasting Role Of B7-H3 ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278)。

除了其在成神經細胞瘤細胞上的表達，人B7-H3在寬範圍的癌症和培養的癌症類幹細胞中過表達。尤其地，B7-H3在許多惡性贅生物上廣泛地過表達，所述惡性贅生物包括：SCCHN，其中水準與遠端轉移的發展和降低的生存率呈正相關(Katayama, A.等 (2011) “Expression of B7-H3 in hypopharyngeal squamous cell carcinoma as a predictive indicator for tumor metastasis and prognosis ,” Int J Oncol 38:1219-26)；膀胱癌(Boorjian, S.A. ,等 (2008) “T Cell Coregulatory Molecule Expression in Urothelial Cell Carcinoma: Clinicopathologic Correlations and Association with Survival ,” Clin Cancer Res 14:4800-7)；前列腺癌，其中B7-H3的表達與轉移行為和差的結果相關(Chavin, G.等 (2009) “Expression of immunosuppresive B7-H3 ligand by hormone-treated prostate cancer tumors and metastases’ ,” Clin Cancer Res 15:2174-80；Zang, X. 等 (2007) “B7-H3 and B7x are highly expressed in human prostate cancer and associated with disease spread and poor outcome ,” Proc Natl Acad Sci U S A 104:19458-63)；腎細胞癌，其中B7-H3在腫瘤脈管系統中廣泛地表達(Crispen, P.L.等 (2008) “Tumor cell and tumor vasculature expression of B7-H3 predict survival in clear cell renal cell Carcinoma ,” Clin Cancer Res 14:5150-7)；卵巢癌(Zang, X.等 (2010) “Tumor associated endothelial expression of B7-H3 predicts survival in ovarian carcinomas ,” Mod Pathol 2010 May 21)；結直腸癌(Sun, J.等 (2010) “Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H3 in human colorectal carcinoma ,” Cancer Immunol Immunother, 3月24)；胃癌(Wu, C.P.等 (2006) “Relationship between costimulatory molecule B7-H3 expression and gastric carcinoma histology and prognosis ,” World J Gastroenterol 12:457-9)；非小細胞肺癌，其中原發性腫瘤上的較高水準與較高可能性的轉移疾病相關(Sun, Y.等 (2006) “B7-H3 and B7-H4 expression in non-small-cell lung cancer ,” Lung Cancer 53:143-51)；惡性膠質瘤(Modak, S.等(2001) “Monoclonal antibody 8H9 targets a novel cell surface antigen expressed by a wide spectrum of human solid tumors ,” Cancer Res 61:4048-54)；黑素瘤，其中較高的水準與較高的腫瘤階段和更短的生存期相關(Tekle, C.等 (2012) “B7-H3 contributes to the metastatic capacity of melanoma cells by modulation of known metastasis-associated genes ,” Int J Cancer 130:2282-90；Wang, L.等(2013) “B7-H3 mediated tumor immunology: Friend or foe? ,” Int J Cancer Sep 7)；和兒童的某些小圓藍細胞瘤（small round blue cell tumor），包括成神經細胞瘤和橫紋肌肉瘤(Gregorio, A.等 (2008) “Small round blue cell tumours ： diagnostic and prognostic usefulness of the expression of B7-H3 surface molecule ,” Histopathology 53:73-80)。

B. PD-1

程式性死亡-1 (“PD-1”) 是廣泛地負調節免疫應答的T-細胞調節劑的擴展的CD28/CTLA-4家族的約31 kD I型膜蛋白成員(Ishida, Y.等 (1992) “Induced Expression Of PD-1 ,A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily ,Upon ProgrammedCell Death ,” EMBO J. 11:3887-3895；美國專利申請公開號2007/0202100、2008/0311117、2009/00110667；美國專利號6,808,710、7,101,550、7,488,802、7,635,757、7,722,868；PCT公開號WO 01/14557)。

PD-1在啟動的T-細胞、B-細胞和單核細胞上表達(Agata, Y.等 (1996) “Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes ,” Int. Immunol. 8(5):765-772；Yamazaki, T.等 (2002) “Expression Of Programmed Death 1 Ligands By Murine T-Cells And APC ,” J. Immunol. 169:5538-5545)，並且以低水準在天然殺傷細胞(NK) T-細胞中表達(Nishimura, H.等 (2000) “Facilitation Of Beta Selection And Modification Of Positive Selection In The Thymus Of PD-1-Deficient Mice ,” J. Exp. Med. 191:891-898；Martin-Orozco, N.等 (2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity ,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298)。

PD-1的細胞外區域由單免疫球蛋白(Ig)V結構域組成，所述單免疫球蛋白(Ig)V結構域與CTLA4中等同的結構域具有23%的同一性(Martin-Orozco, N.等 (2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity, ” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298)。細胞外IgV結構域之後是跨膜區和細胞內尾區。細胞內尾區包含位於基於免疫受體酪氨酸的抑制基序和基於免疫受體酪氨酸的轉換基序中的兩個磷酸化位點，這表明PD-1負調節TCR信號(Ishida, Y.等 (1992) “Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily ,Upon Programmed Cell Death ,” EMBO J. 11:3887-3895；Blank, C.等 (2006) “Contribution Of The PD-L1/PD-1 Pathway To T-Cell Exhaustion: An Update On Implications For Chronic Infections And Tumor Evasion Cancer ,” Immunol. Immunother. 56(5):739-745)。

通過結合PD-L1和PD-L2，PD-1介導其對免疫系統的抑制(Flies, D.B.等 (2007) “The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity ,” J. Immunother. 30(3):251-260；美國專利號6,803,192、7,794,710；美國專利申請公開號2005/0059051、2009/0055944、2009/0274666、2009/0313687；PCT公開號WO 01/39722、WO 02/086083)。

PD-L1和PD-L2在人和鼠科動物組織，比如心臟、胎盤、肌肉、胎肝、脾、淋巴結和胸腺以及鼠科動物肝、肺、腎、胰腺的胰島細胞和小腸的表面上廣泛表達(Martin-Orozco, N.等 (2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity ,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298)。在人中，已經在人內皮細胞(Chen, Y.等 (2005) “Expression of B7-H1 in Inflammatory Renal Tubular Epithelial Cells ,” Nephron. Exp. Nephrol. 102:e81-e92；de Haij, S.等 (2005) “Renal Tubular Epithelial Cells Modulate T-Cell Responses Via ICOS-L And B7-H1 ” Kidney Int. 68:2091-2102；Mazanet, M.M.等 (2002) “B7-H1 Is Expressed By Human Endothelial Cells And Suppresses T-Cell Cytokine Synthesis ,” J. Immunol. 169:3581-3588)、心肌(Brown, J.A.等 (2003) “Blockade Of Programmed Death-1 Ligands On Dendritic Cells Enhances T-Cell Activation And Cytokine Production ,” J. Immunol. 170:1257-1266)、合胞滋養層(syncyciotrophoblasts) (Petroff, M.G.等 (2002) “B7 Family Molecules: Novel Immunomodulators At The Maternal-Fetal Interface ,” Placenta 23:S95-S101)中發現了PD-L1蛋白質表達。該分子也由一些組織的駐留型巨噬細胞、已經經干擾素(IFN)-γ或腫瘤壞死因數(TNF)-α啟動的巨噬細胞表達(Latchman, Y.等 (2001) “PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation ,” Nat. Immunol 2:261-268)，並且在腫瘤中被表達(Dong, H. (2003) “B7-H1 Pathway And Its Role In The Evasion Of Tumor Immunity, ” J. Mol. Med. 81:281-287)。

已經發現PD-L1和PD-1之間的相互作用為T-和B-細胞提供了重要的負共刺激信號(Martin-Orozco, N.等 (2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity ,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298)，並且用作細胞死亡誘導者(Ishida, Y.等 (1992) “Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death ,” EMBO J. 11:3887-3895；Subudhi, S.K.等 (2005) “The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition ,” J. Molec. Med. 83:193-202)。更具體而言，已經發現低濃度的PD-1受體和PD-L1配體之間的相互作用導致強烈抑制抗原特異性CD8+ T-細胞增殖的抑制信號的傳輸；在較高濃度，與PD-1的相互作用不抑制T-細胞增殖，但是顯著減少多種細胞因數的產生(Sharpe, A.H.等 (2002) “The B7-CD28 Superfamily ,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126)。已經發現，可溶性PD-L1-Fc融合蛋白抑制通過靜息和先前啟動的CD4和CD8 T-細胞以及甚至來自臍帶血液的幼稚T-細胞的T-細胞增殖和細胞因數產生(Freeman, G.J.等 (2000) “Engagement Of The PD-1 Immunoinhibitory Receptor By A Novel B7 Family Member Leads To Negative Regulation Of Lymphocyte Activation ,” J. Exp. Med. 192:1-9；Latchman, Y.等 (2001) “PD-L2 Is ASecond Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation ,” Nature Immunol. 2:261-268；Carter, L.等 (2002) “PD-1:PD-L Inhibitory Pathway Affects Both CD4(+) and CD8(+) T-cells And Is Overcome By IL-2 ,” Eur. J. Immunol. 32(3):634-643；Sharpe, A.H.等 (2002) “The B7-CD28 Superfamily ,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126)。

PD-L1和PD-1在抑制T-細胞啟動和增殖中的作用提示這些生物分子可用作治療性靶標，用於治療炎症和癌症。因此，已經建議了抗PD-1抗體治療感染和腫瘤以及上調適應性免疫應答的用途(見，美國專利申請公開號2010/0040614、2010/0028330、2004/0241745、2008/0311117、2009/0217401；美國專利號7,521,051、7,563,869、7,595,048；PCT公開號WO 2004/056875、WO 2008/083174)。Agata, T.等 (1996) “Expression Of The PD-1Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes ,” Int. Immunol. 8(5):765-772；和Berger, R.等 (2008) “Phase I Safety And Pharmacokinetic Study Of CT-011 ， A Humanized Antibody InteractingWith PD-1 ， In Patients With Advanced Hematologic Malignancies ,” Clin. Cancer Res. 14(10):3044-3051已經報導了能夠特異性結合PD-1的抗體(也見，美國專利號8,008,449和8,552,154；美國專利公開號2007/0166281、2012/0114648、2012/0114649、2013/0017199、2013/0230514和2014/0044738；和PCT專利公開號WO 2003/099196、WO 2004/004771、WO 2004/056875、WO 2004/072286、WO 2006/121168、WO 2007/005874、WO 2008/083174、WO 2009/014708、WO 2009/073533、WO 2012/135408、WO 2012/145549和WO 2013/014668)。

C. 表達 B7-H3 的癌症

B7-H3的過表達發生於大範圍的癌症和培養的癌症類幹細胞中。如上所述，B7-H3的過表達與增加的疾病復發和差的預後強烈相關。但是，B7-H3是抗B7-H3藥物的潛在的靶標，包括靶向受體的細胞外結構域的單克隆抗體。已經描述了特異性結合B7-H3的抗體和其他分子(見，美國專利號8,802,091、7,527,969、7,368,554、7,358,354和7,279,567；美國專利申請公開號US 20090087416、US 20090022747、US 20090018315、US2008116219、US20080081346、US 20050202536、US20030103963、US20020168762；PCT公開號WO 2011/109400、WO 2008/116219、WO 2006/016276、WO 2004/093894、WO 04/001381、WO 2002/32375、WO 2002/10187和WO 2001/094413；EP 1292619B；Modak, S.等(March 1999)“Disialoganglioside GD2 And Antigen 8H9: Potential Targets For Antibody-Based Immunotherapy Against Desmoplastic Small Round Cell Tumor (DSRCT) And Rhabdomyosarcoma (RMS) ,” Proceedings Of The American Association For Cancer Research Annual Meeting (美國癌症研究協會年會論文集), Vol. 40:474 (9^0th Annual Meeting Of The American Association For Cancer Research (第九十屆美國癌症研究協會年會)；Philadelphia, Pennsylvania, US；4月10-14, 1999；Modak, S.等 (March 2000)“Radioimmunotargeting To Human Rhabdomyosarcoma Using Monoclonal Antibody 8H9 ,” Proc. Am. Assoc. Cancer Res.41:724；Modak, S.等 (2001)“Monoclonal Antibody 8H9 Targets A Novel Cell Surface Antigen Expressed By A Wide Spectrum Of Human Solid Tumors ,” Cancer Res. 61(10):4048-4054；Steinberger, P.等(2004)“Molecular Characterization of Human 4Ig-B7-H3 ， a Member of the B7 Family with Four Ig-Like Domains ,” J. Immunol. 172(4):2352-2359；Xu, H.等(2009)“MicroRNA miR-29 Modulates Expression of Immunoinhibitory Molecule B7-H3: Potential Implications for Immune Based Therapy of Human Solid Tumors ,” Cancer Res. 69(15):5275-6281)。

儘管這些進展，但是仍需要改善的療法，用於治療表達B7-H3的癌症並且利於或介導針對這類癌症的免疫應答。儘管適應性免疫系統可能是抵抗癌症和疾病的有效防禦機制，但其通常受到腫瘤微環境中免疫抑制機制，比如共抑制分子的表達的阻礙。此外，在腫瘤環境(milieu)中由腫瘤細胞、免疫細胞和基質細胞表達的共抑制分子可明顯減弱針對癌細胞的T-細胞應答。因此，進一步地需要新的聯合和治療方案，其特異性識別癌細胞表面上的靶標，並且可從而介導T-細胞啟動、免疫應答的刺激和表達B7-H3的癌細胞的殺傷。本發明的目標是鑒定這類組合物和治療方案。

本發明涉及包括向受試者施用特異性結合人B7-H3的第一分子(即，B7-H3-結合分子)和特異性結合人PD-1的第二分子(即，PD-1-結合分子)的聯合療法，用於治療癌症和炎症。本發明也涉及藥物組合物，其包括特異性結合人B7-H3的第一分子和特異性結合人PD-1的第二分子，所述藥物組合物能夠介導，更優選地能夠增強，針對與各種人癌症相關的癌細胞的免疫系統的啟動。本發明也涉及這類藥物組合物治療癌症和其他疾病的用途。

詳細地，本發明提供了治療癌症的方法，其包括向需要其的受試者施用特異性結合B7-H3的分子和特異性結合PD-1的分子。

本發明尤其涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合B7-H3的分子是抗B7-H3抗體或其抗原-結合片段，並且特異性結合PD-1的分子是抗PD-1抗體或其抗原-結合片段。

本發明尤其涉及這類方法的實施方式，其中抗B7-H3抗體或其抗原-結合片段： (a)與BRCA84D、BRCA69D、PRCA157或與選自表5的抗B7-H3抗體競爭B7-H3結合；或 (b)具有BRCA84D、hBRCA84D (1.1)、hBRCA84D (2.2)、hBRCA84D-2、hBRCA69D (1.1)、hBRCA (2.2)的三個重鏈CDR和三個輕鏈CDR，或具有選自表 5 的抗B7-H3的三個重鏈CDR和三個輕鏈CDR；或 (c)具有BRCA84D、hBRCA84D (1.1)、hBRCA84D (2.2)、hBRCA84D-2、hBRCA69D (1.1)、hBRCA (2.2)的重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，或具有選自表 5 的抗B7-H3的重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域。

本發明尤其涉及這類方法的實施方式，其中抗PD-1抗體或其抗原-結合片段： (a)與尼伏魯單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、匹地利珠單抗(pidilizumab)、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb7、PD-1 mAb 8，或與選自表6的抗PD-1抗體競爭PD-1結合；或 (b)具有尼伏魯單抗、派姆單抗、匹地利珠單抗、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb7、PD-1 mAb 8的三個重鏈CDR和三個輕鏈CDR，或具有選自表6的抗PD-1抗體的三個重鏈CDR和三個輕鏈CDR；或 (c)具有尼伏魯單抗、派姆單抗、匹地利珠單抗、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb7、PD-1 mAb 8的重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，或具有選自表6的抗PD-1抗體的重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域。

本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中抗B7-H3抗體或其抗原-結合片段包括Fc結構域，和/或抗PD-1抗體或其抗原-結合片段包括Fc結構域。本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中抗B7-H3抗體或其抗原-結合片段包括變異的Fc結構域，其在Fc結構域具有一個、兩個、三個、四個、五個或更多個增強ADCC的修飾。本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中增強ADCC的Fc結構域修飾包括L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L中的任何一個、任何兩個、任何三個、任何四個或所有五個取代。本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中抗PD-1抗體或其抗原-結合片段包括：(a)變異的Fc結構域，其在Fc結構域具有降低或消除ADCC活性的至少一個修飾；或(b)IgG4 Fc結構域。本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中降低或消除ADCC的Fc結構域修飾包括優選地IgG1 Fc結構域的L234A；L235A；或L234A和L235A的取代。

本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中抗B7-H3抗體是hBRCA84D-2並且抗PD-1抗體是尼伏魯單抗、派姆單抗、匹地利珠單抗或PD-1 mAb 6-ISQ。本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中抗B7-H3抗體是hBRCA84D-2並且抗PD-1抗體或其抗原-結合片段包括尼伏魯單抗、派姆單抗、匹地利珠單抗、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7，PD-1 mAb 8或選自表6的抗PD-1抗體的VH和VL。

本發明另外涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合B7-H3的分子(尤其是抗B7-H3抗體)以每週1-15 mg/kg體重的劑量被施用和特異性結合PD-1的分子(尤其是抗PD-1抗體)以每三周200 mg的固定劑量被施用。本發明也涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合B7-H3的分子(尤其是抗B7-H3抗體)以每週1-15 mg/kg體重的劑量被施用，並且特異性結合PD-1的分子(尤其是抗PD-1抗體)以每兩周或三周1-10 mg/kg體重的劑量被施用。本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合B7-H3的分子(尤其是抗B7-H3抗體)以選自每週1 mg/kg、3 mg/kg、10 mg/kg和15 mg/kg體重的劑量被施用，並且特異性結合PD-1的分子(尤其是抗PD-1抗體)以每三周200 mg的固定劑量被施用。本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合B7-H3的分子(尤其是抗B7-H3抗體)以選自每週1 mg/kg、3 mg/kg、10 mg/kg和15 mg/kg體重的劑量被施用，並且特異性結合PD-1的分子(尤其是抗PD-1抗體)以選自每兩周或三周1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg和10 mg/kg體重的劑量被施用。本發明尤其是涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合B7-H3的分子(尤其是抗B7-H3抗體)以選自每週3 mg/kg、10 mg/kg和15 mg/kg體重的劑量被施用，並且特異性結合PD-1的分子(尤其是抗PD-1抗體)以每三周2 mg/kg體重的劑量被施用。本發明尤其是涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合B7-H3的分子(尤其是抗B7-H3抗體)以選自每週3 mg/kg、10 mg/kg和15 mg/kg體重的劑量被施用，並且特異性結合PD-1的分子(尤其是抗PD-1抗體)以每兩周3 mg/kg體重的劑量被施用。本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中特異性結合B7-H3的分子(尤其是抗B7-H3抗體)和特異性結合PD-1的分子(尤其是抗PD-1抗體)通過IV輸注而被施用。本發明也涉及這類方法的實施方式，其中每兩周或三周在48-小時的時間內施用特異性結合B7-H3的分子(尤其是抗B7-H3抗體)和特異性結合PD-1的分子(尤其是抗PD-1抗體)。

本發明尤其涉及這類方法的實施方式，其中癌症是其中表達B7-H3的癌症。本發明進一步涉及這類方法的實施方式，其中癌症是表達B7-H3的頭頸部的鱗狀細胞癌(SCCHN)、膀胱癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、惡性膠質瘤、腎癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、腎細胞癌、小圓藍細胞瘤、成神經細胞瘤或橫紋肌肉瘤。

本發明另外涉及這類方法的實施方式，其進一步包括施用第三治療劑的步驟，尤其其中第三治療劑是抗血管生成劑、抗腫瘤劑、化療劑，或細胞毒性劑。

本發明涉及包括向受試者施用特異性結合人B7-H3的第一分子和特異性結合人PD-1的第二分子的聯合療法，用於治療癌症和/或炎症。本發明也涉及藥物組合物，其包括特異性結合人B7-H3的第一分子和特異性結合人PD-1的第二分子，所述藥物組合物能夠介導，更優選地能夠增強，針對與任何各種人癌症相關的癌細胞的免疫系統的啟動。本發明也涉及這類藥物組合物治療接受受試者中癌症和其他疾病的用途。

A. 抗體

1. 抗體

“抗體 ”是能夠通過位於免疫球蛋白分子的可變結構域中的至少一個表位識別位點免疫特異性結合靶標，比如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等(“抗原”)的免疫球蛋白分子。因此，當靶分子是“抗原”時，被抗體識別並且與抗體結合的抗原部分是“表位元”。如本文所使用，術語“抗體”不僅僅包括完整的多克隆或單克隆抗體、駱駝源化(camelized)抗體、單鏈抗體和抗特應(抗Id)抗體(包括，例如，抗Id和針對本發明抗體的抗抗Id抗體)，而且也包括其突變體，天然產生的變體，包括具有必要的免疫特異性的表位結合位點的融合蛋白、人源化抗體和嵌合抗體，以及包括具有必要的免疫特異性的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他修飾構造。如本文所使用，抗體的“抗原-結合片段”是其氨基酸序列包括對該抗原特異性的抗體的至少一個表位-結合位點的免疫球蛋白。如本文所使用，術語包括片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')₂ Fv)、二硫化物連接的雙特異性Fvs (sdFv)、胞內抗體和單鏈分子(例如，scFv)。尤其地，抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，包含表位-結合位點的分子。免疫球蛋白分子可以屬於任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類。

天然抗體(比如IgG抗體)包括與兩條重鏈 複合的兩條輕鏈 。每條輕鏈包含輕鏈可變(VL )結構域和恒定輕鏈(CL )結構域。每條重鏈包含重鏈可變(VH )結構域，三個重鏈恒定結構域(CH1 、CH2 和CH3 )和鉸鏈結構域，其位於CH1 和CH2 結構域之間。因此，天然存在的免疫球蛋白(例如，IgG)的基本結構單元是具有兩條輕鏈和兩條重鏈的四聚體，其通常作為約150,000 Da的糖蛋白表達。每條多肽鏈的氨基末端部分包括其可變(“V ”)結構域，其具有約100至110或更多個氨基酸，並且主要負責抗原識別。每條多肽鏈的羧基末端部分限定鏈的恒定(“C ”)結構域。因此，IgG分子的輕鏈的結構(在N-末端至C-末端方向上)是：VL-CL ，並且IgG重鏈的結構(在N-末端至C-末端方向上)是：VH-CH1- 鉸鏈 -CH2-CH3 。

完整的、未修飾的抗體(例如，IgG抗體)結合抗原的表位的能力取決於免疫球蛋白輕鏈和重鏈上可變結構域(即，分別為VL結構域和VH結構域)的存在。抗體輕鏈和抗體重鏈的相互作用，尤其地，其VL和VH結構域的相互作用形成抗體的表位-結合位點之一。IgG分子的可變結構域由以下組成：包含與表位接觸的殘基的互補決定區(CDR )和稱為框架區段(FR )的非CDR區段，所述非CDR區段通常維持結構和確定CDR環的定位，以便允許這類接觸(但是某些框架殘基也可接觸抗原)。因此，VL結構域具有如下結構(在N-末端至C-末端方向上)：FR_L 1-CDR_L 1-FR_L 2-CDR_L 2-FR_L 3-CDR_L 3-FR_L 4 ，並且VH結構域具有如下結構(在N-末端至C-末端方向上)：FR_H 1-CDR_H 1-FR_H 2-CDR_H 2-FR_H 3-CDR_H 3-FR_H 4 。作為(或可用作)抗體輕鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分別命名為CDR_L 1 結構域 、CDR_L 2 結構域 和CDR_L 3 結構域 。類似地，作為(或可用作)抗體重鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分別命名為CDR_H 1 結構域 、CDR_H 2 結構域 和CDR_H 3 結構域 。因此，術語CDR_L 1結構域、CDR_L 2結構域、CDR_L 3結構域、CDR_H 1結構域、CDR_H 2結構域和CDR_H 3結構域涉及這樣的多肽：所述多肽在併入到蛋白質中時使得蛋白質能夠結合特定表位，無論這類蛋白質是否是具有輕鏈和重鏈的抗體或單鏈結合分子(例如，scFv、BiTe等)，或是另一類型的蛋白質。與這類抗體相對，scFv構建體包括包含在單多肽鏈中的抗體的VL和VH結構域，其中結構域被足夠長度的柔性連接體分開，以使得兩個結構域自組裝成功能性表位-結合位點。在由於連接體長度不足(小於約12個氨基酸殘基)而使得VL和VH結構域的自組裝不可能時，兩個scFv結構可彼此相互作用而形成二價分子，其中一條鏈的VL與另一條鏈的VH締合(在下文中綜述：Marvin等 (2005)“Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658)。

除了它們在診斷中的已知用途，抗體已經被證明可用作治療劑。最近幾十年已經看到對抗體的治療潛能的興趣的復興，並且抗體已經成為一種主要類型的生物技術衍生的藥物(Chan, C.E.等 (2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases ,” Singapore Med. J. 50(7):663-666)。將近200種基於抗體的藥物已經被批准或正在開發中。

術語“單克隆抗體”指同質型(homogeneous)抗體群體，其中單克隆抗體包括參與抗原的選擇性結合的氨基酸(天然產生的和非天然產生的)。單克隆抗體是高度特異性的，直接針對單個表位(或抗原位點)。術語“單克隆抗體”不僅僅包括完整的單克隆抗體和全長單克隆抗體，而且也包括其片段(比如Fab、Fab'、F(ab')2 Fv)、單鏈(scFv)、其突變體、包括抗體部分的融合蛋白、人源化的單克隆抗體、嵌合單克隆抗體和包括具有結合表位的必要的免疫特異性和能力的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他修飾構造。就抗體的來源或製備其的方式(例如，通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、轉基因動物等)而言，不旨在是限制性的。術語包括完整的免疫球蛋白以及上面根據“抗體”的定義描述的片段等。製備單克隆抗體的方法是本領域已知的。可採用的一種方法是Kohler, G.等(1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,” Nature 256:495-497的方法或其改良。典型地，單克隆抗體在小鼠、大鼠或兔子中開發。通過用免疫原性量的細胞、細胞提取物或包含期望的表位的蛋白質製品免疫動物而產生抗體。免疫原可以是但不限於原代細胞、培養d 細胞系、癌細胞、蛋白質、肽、核酸或組織。用於免疫的細胞可被培養一段時間(例如，至少24小時)，然後將它們用作免疫原。細胞它們本身或聯合非變性佐劑，比如Ribi，可用作免疫原 (見，例如，Jennings, V.M. (1995) “Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production ,” ILAR J. 37(3):119-125)。

一般而言，在用作免疫原時，細胞應保持完整並且優選地有活性。相比於破裂的細胞，完整的細胞可允許抗原被免疫的動物更好地檢測。變性或烈性佐劑，例如，弗氏佐劑的使用，可使細胞破裂，因此，其應用受阻。免疫原可以週期性間隔被多次施用，諸如兩週一次或一週一次，或者可以以維持在動物(例如，在組織重組體中)中的生存力這樣的方式被施用。可選地，對於期望的致病表位是免疫特異性的現有單克隆抗體和任意其他等價抗體可被測序，並通過本領域中已知的任意手段重組產生。在一個實施方式中，對這樣的抗體測序，然後將多核苷酸序列克隆至載體中，用於表達或增殖。編碼感興趣的抗體的序列可在宿主細胞中保持在載體中，並且，可然後擴展和冷凍宿主細胞，用於將來的使用。這樣的抗體的多核苷酸序列可用於遺傳操作，以產生嵌合抗體、人源化抗體或犬源化(caninized)抗體，或以改善抗體的親和力或其他特徵。術語“人源化的 ”抗體指一般使用重組技術製備的嵌合分子，其具有源自來源於非人物種的免疫球蛋白的抗原-結合位點並且保留了基於人免疫球蛋白結構和/或序列的分子的免疫球蛋白結構。這類抗體的可變結構域的多核苷酸序列可用於遺傳操作，以產生這類衍生物和改善這類抗體的親和性或其他特徵。人源化抗體的一般原則涉及保留抗體的抗原-結合部分的基本序列，同時用人抗體序列交換抗體的非人剩餘部分。人源化單克隆抗體有四個一般步驟。這些是：(1)確定開始抗體輕鏈和重鏈可變結構域的核苷酸和預測的氨基酸序列；(2)設計人源化抗體或犬源化抗體，即，決定在人源化或犬源化過程中使用哪種抗體框架區域；(3)實際人源化或犬源化方法/技術；和(4)人源化抗體的轉染和表達。見，例如，美國專利號4,816,567、5,807,715、5,866,692和6,331,415。

這類抗體的表位-結合位點可包括融合至恒定結構域的完整可變結構域或僅僅包括移植在可變結構域中適當的框架區上的互補決定區(CDR)。抗原-結合位點可以是野生型的或通過一個或多個氨基酸取代而被修飾。這消除了人個體中作為免疫原的恒定區，但是保留了對外源可變區的免疫應答的可能性(LoBuglio, A.F.等 (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224)。另一方法不僅僅關注提供源自人的恒定區，而且也修飾可變區，以便重塑它們而盡可能地接近人形式。已知重鏈和輕鏈二者的可變區都包含三個互補決定區(CDR)，其回應討論的抗原而變化並且決定結合能力，其側翼是四個框架區(FR)，所述框架區在給定的物種中是相對保守的並且推測為CDR提供支架。當針對特定的抗原製備非人抗體時，可通過在待修飾的人抗體中存在的FR上移植源自非人抗體的CDR而“重塑”或“人源化”可變區。下面的文章已經報導了該方法用於各種抗體：Sato, K.等 (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann；L.等 (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy ,” Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.等 (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity ,” Science 239:1534-1536；Kettleborough, C. A.等 (1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation ,” Protein Engineering 4:773-3783；Maeda, H.等 (1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity ,” Human Antibodies Hybridoma 2:124-134；Gorman, S. D.等 (1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185；Tempest, P.R.等 (1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo ,” Bio/Technology 9:266-271；Co, M. S.等 (1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873；Carter, P.等 (1992) “Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289；和Co, M.S.等 (1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen ,” J. Immunol. 148:1149-1154。在一些實施方式中，人源化抗體保留所有的CDR序列(例如，包含所有六個來自小鼠抗體的CDR的人源化小鼠抗體)。在其他實施方式中，人源化抗體具有序列相對於初始抗體不同的一個或多個CDR (一個、兩個、三個、四個、五個或六個)。

已經描述了包括源自非人免疫球蛋白的抗原-結合位點的許多“人源化”抗體分子，包括具有齧齒動物或修飾的齧齒動物V區域和它們與人恒定結構域融合的締合的互補決定區(CDR)的嵌合抗體(見，例如，Winter等 (1991) “Man-made Antibodies ,” Nature 349:293-299；Lobuglio等 (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989)；Shaw等 (1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen ,” J. Immunol. 138:4534-4538；和Brown等 (1987) “Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody ,” Cancer Res. 47:3577-3583)。其他參考文獻描述了移植至人支架框架區(FR)上然後與適當的人抗體恒定結構域融合的齧齒動物CDR (見，例如，Riechmann, L.等 (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy ,” Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.等 (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity ,” Science 239:1534-1536；和Jones等 (1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse ,” Nature 321:522-525)。另一參考文獻描述了由重組修飾(veneered)的齧齒動物框架區支撐的齧齒動物CDR。見，例如，歐洲專利公開號519,596。這些“人源化”分子被設計，以使對齧齒動物抗人抗體分子的不利免疫應答最小化，所述不利免疫應答限制了這些部分在人接受者中治療應用的持續時間和效力。也可使用人源化抗體的其他方法，其公開在以下文獻中：：Daugherty等 (1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins ,” Nucl. Acids Res. 19:2471-2476和美國專利號6,180,377、6,054,297、5,997,867和5,866,692。

2. 雙特異性抗體

天然抗體僅僅能夠結合一個表位種類(即，它們是“單特異性的”)，但是它們可能結合該種類的多個拷貝(即，它們可展示二價或多價)。可通過產生可同時結合兩個分開的和不同的抗原(或相同抗原的不同表位)的基於多特異性抗體的分子和/或通過產生對於相同的表位和/或抗原具有更高價(即，大於兩個結合位點)的基於抗體的分子而增強抗體的功能。

已經開發了各種重組雙特異性和三特異性抗體形式(見，例如，美國專利號8,277,806、6,994,853、6,551,592和6,171,586；美國專利公開號2010-0291112和2008-0057054；和PCT公開號WO 2013/070565、WO 2012/156430、WO 2012/009544、WO 2009/132876、WO 2009/018386、WO 2008/003116、WO 2008/003103、WO 2007/146968、WO 2006/072152、WO 2002/020039、WO 2000/018806、WO 1999/042597、WO 1998/006749和WO 1998/003670)，其大部分使用連接體肽，以使抗體核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)與另外的表位-結合位點(例如，scFv、VL、VH等)融合，或在抗體核心中融合，或使多個表位-結合位點(例如兩個Fab片段或scFv)彼此融合。可選形式使用連接體肽，以將表位-結合位點(例如，scFv、VL、VH等)融合至二聚化結構域，比如CH2-CH3結構域或可選的多肽(WO 2005/070966、WO 2006/107786A WO 2006/107617A、WO 2007/046893)。PCT公開號WO 2013/174873、WO 2011/133886和WO 2010/136172教導了三特異性抗體，其中CL和CH1結構域從它們各自的天然位置被轉換，並且VL和VH結構域已經被多樣化(WO 2008/027236、WO 2010/108127)，以允許它們結合大於一種抗原。PCT公開號WO 2013/163427和WO 2013/119903公開了修飾CH2結構域，以包含包括結合結構域的融合蛋白加合物。PCT公開號WO 2010/028797、WO2010028796和WO 2010/028795公開了重組抗體，其Fc結構域已經被另外的VL和VH結構域取代，以便形成三價結合分子。PCT公開號WO 2013/006544公開了多價Fab分子，其作為單多肽鏈被合成，並且然後進行蛋白水解，而產生異源二聚化結構。PCT公開號WO 2014/022540、WO 2013/003652、WO 2012/162583、WO 2012/156430、WO 2011/086091、WO 2007/075270、WO 1998/002463、WO 1992/022583和WO 1991/003493公開了添加另外的結合結構域或官能團至抗體或抗體部分(例如，添加另外的VL和VH結構域至抗體的輕鏈和重鏈，或添加異源融合蛋白或使多個Fab結構域彼此連結)。美國專利號7,695,936和專利公開2007/ 0196363涉及由兩個抗體的重鏈形成的雙特異性抗體，一個抗體具有被工程化至其重鏈的凸起和第二個抗體具有被工程化至其重鏈的互補的腔。相對於包含相同抗體的兩條重鏈的單特異性的同種抗體，這類互補的“杵(knob)”和“臼(hole)”的存在被教導優選形成雙特異性異種抗體(其具有每個這類抗體的一個重鏈)，。

3. 優選的 Fc 結構域

兩條重鏈的CH2和CH3結構域相互作用而形成Fc 結構域 ，其是被細胞Fc 受體 (FcγR) 識別的結構域。如本文所使用，術語“Fc 結構域 ”用於限定IgG重鏈的C-末端區域。示例性人IgG1的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:1 )： 231　　　 　240　　　　　　　 　250　　　　　　　 　　260　　　　　　 　　　270　　　　 　　　　280 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 290　　　　　　　 300　　　　　　 　　　310　　　　 　　　　　320　　　　　 　　　330 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 340　　　　　　　 350　　　　　 　　　　360　　　　　　 　　　370　　　　　 　　　380 PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390　　　　　　　 400　　　　　　 　　　410　　　　　　 　　　420　　　　　　 　　430 WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 440　　 　　　447 ALHNHYTQKS LSLSPG X 根據如Kabat中闡釋的EU索引編號，其中X是賴氨酸(K)或不存在。

示例性人IgG2的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:2 )： 231　　 　　240　　　　　 　　　250　　　 　　　　　　260　　　　　 　　　270　　　　　　　 　　280 APPVA-GPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD 290　　　　　 　　　300　　　 　　　　　　310　　　　　 　　　　320　　　　　 　　　330 GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA 340　　　　　　　 　350　　　　　　　 　　360　　　　　 　　　　370　　　　 　　　　380 PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE 390　　　　　　 　　400　　　　　　　 　　410　　　　　　 　　　420　　　　　　　 　430 WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 440　　　　 　447 ALHNHYTQKS LSLSPG X 根據如Kabat中闡釋的EU索引編號，其中，X 是賴氨酸(K)或不存在。

示例性人IgG3的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:3 )： 231　　 　　240　　　　 　　　　　250　　　　 　　　　260　　　　　 　　　270　　　　　 　　　　280 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD 290　　　　　　 　　　300　　　　　　 　　310　　　　　　 　　　320　　　　　　 　　330 GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA　　 340　　　　　 　　　　350　　　　　 　　　360　　　　　 　　　　370　　　　　 　　　380 PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE　　 390　　　　　 　　　　400　　　　　 　　　410　　　 　　　　　　420　　　　　 　　　430 WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE　　 440　　　　 447 ALHNRFTQKS LSLSPG X 根據如Kabat中闡釋的EU索引編號，其中，X 是賴氨酸(K)或不存在。

示例性人IgG4的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:4 )： 231　　 　　240　　　　　 　　　　250　　　　 　　　　260　　　　　 　　　270　　　　　　 　　　280 APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD 290　　　　　　 　　　300　　　　 　　　　310　　　　　 　　　　320　　　　　　 　　330 GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS 340　　　　　 　　　　350　　　　　 　　　360　　　　　　 　　　370　　　　　 　　　380 SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390　　　　　　　 　　400　　　　　　 　　410　　　　　　 　　　420　　　　　　 　　430 WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE 440　　　　 447 ALHNHYTQKS LSLSLG X 根據如Kabat中闡釋的EU索引編號，其中，X 是賴氨酸(K)或不存在。

遍及本說明書，IgG重鏈的恒定區中殘基的編號是如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版, Public Health Service, NH1, MD (1991)中EU索引的編號，其通過引用明確併入本文。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗體的編號。來自免疫球蛋白的成熟的重鏈和輕鏈的可變區的氨基酸根據鏈中氨基酸的位置被命名。Kabat描述了抗體的許多氨基酸序列，鑒定了每個亞組的氨基酸共有序列，並且為每個氨基酸賦予了殘基編號。通過參考保守氨基酸比對所討論的抗體與Kabat中的共有序列之一，Kabat的編號方案可擴展至未包括在其綱要中的抗體。用於賦予殘基編號的該方法已經成為本領域的標準並且容易鑒定在不同抗體，包括嵌合或人源化的變體中等同位置處的氨基酸。例如，在人抗體輕鏈50位的氨基酸佔據與在小鼠抗體輕鏈的50位氨基酸等同的位置。

儘管邊界可能稍微不同，根據Kabat的EU編號系統，人IgG Fc結構域的CH2結構域通常從人IgG的氨基酸231延伸至氨基酸341。根據Kabat的EU編號系統，人IgG的CH3結構域通常從氨基酸342延伸至447。“鉸鏈區”或“鉸鏈結構域”通常定義為從人IgG1的Glu216延伸至Pro230。

在抗體恒定區內的許多不同位置(例如，Fc位置，包括但不限於270、272、312、315、356和358位，如在Kabat闡釋的EU索引編號)已經觀察到了多態性，並且因此在呈現的序列和現有技術的序列之間可存在稍微不同。已經表徵了多態形式的人免疫球蛋白。目前，18種 Gm同種異型(allotype)是已知的：G1m (1、2、3、17)或G1m (a、x、f、z)、G2m (23)或G2m (n)、G3m (5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m (b1、c3、b3、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5) (Lefranc, 等, The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990)；Lefranc, G.等, 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211)。特別考慮用於本發明方法的抗體可併入任何免疫球蛋白基因的任何同種異型、異同種異型(isoallotype)或單倍型(haplotype)，並且不限於本文提供的序列的同種異型、異同種異型或單倍型。此外，在一些表達體系中，CH3結構域的C-末端氨基酸殘基(上面粗體顯示的)可在翻譯後去除。因此，CH3結構域的C-末端殘基是本發明提供的B7-H3結合分子和PD-1結合分子中的任選的氨基酸殘基。本發明具體考慮缺少CH3結構域的C-末端殘基的這類結合分子。本發明也具體考慮包括CH3結構域的C-末端賴氨酸殘基的這類結合分子。

當存在時，CH1結構域和/或鉸鏈區可以是任何同種型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)，但是優選地是與期望的Fc結構域相同的同種型。

示例性人IgG1 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:8 )： ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV

示例性人IgG2 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:60 )： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV

示例性人IgG4 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:61)： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV

IgG4 CH1結構域和穩定化的鉸鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO:16)顯示在下方。 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP

示例性人IgG1鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:10)： 　　EPKSCDKTHTCPPCP

示例性人IgG2鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:62)： ERKCCVECPPERKCCVECPPCP

示例性人IgG4鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:11)：ESKYGPPCPSCP

在它們與Fc結構域連接之後，通過Fcγ受體(FcγRs)轉導啟動和抑制信號。這些完全相反的功能源自不同受體同等型(isoform)之間的結構差異。受體的胞質信號傳導結構域中的兩個不同的結構域——稱為基於免疫受體酪氨酸的啟動基序(ITAMs)或基於免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIMS)——是造成不同應答的原因。募集不同胞質酶到這些結構中控制了FcγR-介導的細胞應答的結果。含有ITAM的FcγR複合物包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA，然而，含ITIM的複合物僅包括FcγRIIB。人嗜中性粒細胞表達FcγRIIA基因。通過免疫複合物或特異性抗體交聯的FcγRIIA聚類用於使ITAM與促進ITAM磷酸化的受體相關的激酶聚集。ITAM磷酸化充當Syk激酶的停泊位點，Syk激酶的啟動導致下游底物(例如，PI3K)的啟動。細胞啟動導致促炎性介質的釋放。FcγRIIB基因在B淋巴細胞上表達；其細胞外結構域與FcγRIIA是96%一致的，並且以不能區分的方式結合IgG複合物。ITIM在FcγRIIB的胞質結構域中的存在限定了FcγR的這種抑制性亞類。最近，確定了這種抑制的分子基礎。當與啟動FcγR共連接時，FcγRIIB中的ITIM變成磷酸化的，並且吸引肌醇聚磷酸鹽5’-磷酸酶(SHIP)的SH2結構域，肌醇聚磷酸鹽5’-磷酸酶(SHIP)水解由於含ITAM的FcγR介導的酪氨酸激酶啟動而釋放的磷酸肌醇信使，從而防止細胞內Ca++的流入。因此，FcγRIIB的交聯抑制對FcγR連接的啟動應答並抑制細胞應答。B-細胞啟動、B-細胞增殖和抗體分泌因此被中止。另外，與新生Fc受體(FcRn)的相互作用介導了IgG分子從內體至細胞表面的再迴圈並且釋放至血液中。

Fc結構域的修飾通常導致改變的表型，例如改變的血清半衰期、改變的穩定性、改變的對細胞酶的敏感性或改變的效應子功能。針對效應子功能，可期望修飾用於本發明方法的B7-H3-結合分子和/或PD-1-結合分子(例如，抗B7-H3和抗PD-1抗體)的Fc結構域，以便增強抗體治療例如癌症的效力。在某些情況下，例如在抗體的作用機制涉及阻斷或對抗，但是不殺死攜帶靶抗原的細胞的情況下，期望減少或消除效應子功能。當被引導至非期望的細胞，比如其中FcγRs以低水準表達的腫瘤和外源細胞時，，例如，具有低水準FcγRIIB的腫瘤特異性B細胞(例如，非霍奇金淋巴瘤、CLL和伯基特淋巴瘤) ，通常期望增加效應子功能。

用於本發明方法的B7-H3-結合分子和/或PD-1-結合分子(例如，抗B7-H3和抗PD-1抗體)的Fc結構域可以是完整的Fc結構域(例如，完整的IgG Fc結構域)或僅僅是完整Fc結構域的片段。因此，用於本發明方法的、包含這類結構域的分子的Fc結構域可包括完整的Fc結構域的一些或所有的CH2結構域和/或一些或所有的CH3結構域，或可包括變異的CH2和/或變異的CH3序列(其可包括，例如，相對於完整的Fc結構域的CH2或CH3結構域的一個或多個插入和/或一個或多個缺失)。這類Fc結構域可包括非Fc多肽部分，或可包括非天然產生的完整的Fc結構域的部分，或可包括非天然產生的取向的CH2和/或CH3結構域(比如，例如，兩個CH2結構域或兩個CH3結構域，或在N-末端至C-末端方向上，與CH2結構域連接的CH3結構域等)。儘管B7-H3-結合分子和/或PD-1-結合分子的Fc結構域可具有結合一個或多個Fc受體(例如，FcγR(一個或多個))的能力，更優選地，這類Fc結構域將將導致與FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)改變的結合(相對於野生型Fc結構域展示的結合)或基本上消除這類Fc結構域與一個或多個FcγR (例如，抑制性受體)結合的能力。

在某些實施方式中，用於本發明方法的分子可包括變異的Fc結構域，其具有對於啟動性和/或抑制性Fcγ受體改變的親和力。在一個實施方式中，分子包括變異的Fc結構域，相對於具有野生型Fc結構域的可比較分子，其具有對於FcγRIIB增加的親和力和對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA降低的親和力。在另一實施方式中，用於本發明方法的分子包括變異的Fc結構域，其相對於具有野生型Fc結構域的比較分子具有對於FcγRIIB降低的親和性和對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA增加的親和性。在仍另一實施方式中，用於本發明方法的分子包括變異的Fc結構域，其相對於具有野生型Fc結構域的可比較分子具有對於FcγRIIB降低的親和力和對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA降低的親和力。在仍另一實施方式中，用於本發明方法的分子包括變異的Fc結構域，其相對於具有野生型Fc結構域的可比較分子具有對於FcγRIIB不變的親和力和對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA降低的(或增加的)親和力。

在某些實施方式中，用於本發明方法的分子包括變異的Fc結構域，其具有對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA改變的親和力，以便免疫球蛋白具有增強的效應子功能。效應細胞功能的非限制性例子包括抗體依賴性細胞介導的細胞毒性、抗體依賴性吞噬、吞噬、調理作用、調理吞噬、細胞結合、玫瑰花結(rosetting)、C1q結合和補體依賴性細胞介導的細胞毒性。

變異的Fc結構域是本領域熟知的，並且任何已知的變異的Fc結構域可用于本發明，以賦予或修飾包括Fc結構域(或其部分)的分子展示的效應子功能，如在例如NK依賴性或巨噬細胞依賴性試驗中功能測試的。例如，鑒定為改變效應子功能的Fc結構域變體公開在PCT公開號WO 04/063351、WO 06/088494、WO 07/024249、WO 06/113665、WO 07/021841、WO 07/106707；和WO 2008/140603中，並且其中公開的任何適當的變體可用在本發明的分子中。

表 4 列舉了示例性單、雙、三、四和五Fc結構域突變。

尤其優選的變體包括一個或多個修飾，所送修改選自組A-AI：

仍更尤其優選的變體包括選自組1-105中的一個或多個修飾：

在尤其優選的實施方式中，本發明包括B7-H3-結合分子，其包括變異的Fc結構域，其中變體賦予或具有增加的ADCC活性和/或的與FcγRIIIA (CD16A)增加的結合，並且也可具有與FcγRIIB (CD32B)降低的結合。具有與CD16A增加的結合並且可另外具有與CD32B降低的結合的人IgG1 Fc結構域的示例性變體包含L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I或P296L取代。優選的B7-H3-結合分子包括變異的IgG1 Fc結構域，其包括下述任何1、2、3、4、5或6個取代：L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L。這些氨基酸取代可以以任何組合出現在人IgG1 Fc結構域中。

在一個實施方式中，B7-H3-結合分子將包括在Fc結構域中具有至少一個修飾的變異的Fc結構域。在某些實施方式中，變異的Fc結構域包括選自下述的至少一個取代：L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L。

在具體的實施方式中，變異的Fc結構域包括： (A)至少一個取代選自F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L； (B)至少兩個取代選自： F243L和P396L； F243L和R292P；和 R292P和V305I； (C)至少三取代選自： F243L、R292P和Y300L； F243L、R292P和V305I； F243L、R292P和P396L；和 R292P、V305I和P396L； (D)至少四取代選自： F243L、R292P、Y300L和P396L；和 F243L、R292P、V305I和P396L；或 (E)至少五個取代選自： F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L；和 L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L。

在另一具體的實施方式中，變異的Fc結構域包括下述取代： (A)F243L、R292P和Y300L； (B)L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L；或 (C)F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L。

在某些實施方式中，PD-1-結合分子包括變異的Fc結構域，其中相對於野生型Fc結構域(SEQ ID NO:1 ))展示的結合，變體賦予或具有降低的(或基本上沒有)對FcγRIIIA (CD16a)的結合。

具有降低的對FcγRs的結合的人IgG1 Fc結構域的示例性變體包含L234A、L235A、D265A、N297A或N297Q取代。優選的PD-1-結合分子包括變異的IgG1 Fc結構域，其包括任何1、2、3、4或所有5個下述取代：L234A、L235A、D265A、N297A和N297Q。這些氨基酸取代可以以任何組合中出現在人IgG1 Fc結構域中。

在一個實施方式中，PD-1-結合分子將包括變異的Fc結構域，其在Fc結構域中具有至少一個修飾。在某些實施方式中，變異的Fc結構域包括選自下述的至少一個取代：L234A、L235A、D265A和N297Q。因為L234A、L235A、D265A、N297A和N297Q取代消除效應子功能，所以在期望效應子功能的情況下，優選地不採用這些取代。

在具體的實施方式中，變異的Fc結構域包括下述取代： L234A、L235A； D265A； N297A；或 N297Q。

用於本發明方法的PD-1結合分子的CH2和CH3結構域的優選IgG1序列具有L234A/L235A取代(SEQ ID NO:5 )： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中，X 是賴氨酸(K)或不存在。

在尤其優選的實施方式中，用於本發明方法的包含Fc結構域的PD-1結合分子的CH2-CH3結構域可以是固有地展示對FcγRIIIA (CD16a)降低的(或基本上沒有)結合和/或降低的效應子功能(相對於野生型IgG1 Fc結構域(SEQ ID NO:1 )展示的結合)的CH2-CH3結構域。例如，用於本發明方法的包含Fc結構域的PD-1-結合分子的CH2-CH3結構域可以是IgG2 Fc結構域或IgG4 Fc結構域。

在優選的實施方式中，用於本發明方法的PD-1-結合分子包括IgG4 Fc結構域。在使用IgG4 Fc結構域的情況下，本發明也包括引入穩定化的鉸鏈突變，比如S228P (例如，ESKYGPPCP P CP (SEQ ID NO:12 ))，如在Kabat中闡釋的EU索引編號(Lu等, (2008) “The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored By Analytical Ultracentrifugation ,” J. Pharm. Sci. 97:960-969)，以降低鏈交換的發生率。本領域已知的其他穩定化突變可被引入到IgG4 Fc結構域中(Peters, P等, (2012) “Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability ,” J. Biol. Chem., 287:24525-24533;PCT專利公開號WO 2008/145142)。另外，如上所述，當存在時，CH1結構域和/或鉸鏈優選地與期望的Fc結構域屬於相同的同種型。因此，在這樣的實施方式中，PD-1-結合分子(例如抗體)包括IgG4 CH1 (見，例如，SEQ ID NO:9 )、穩定化的IgG4鉸鏈(見，例如，SEQ ID NO:12 )和IgG4 CH2-CH3結構域(見，例如，SEQ ID NO:4 )。

可通過增加Fc結構域對FcRn的結合親和力而延長包括Fc結構域的蛋白質的血清半衰期。如本文使用的術語“半衰期”意思是分子的藥物代謝動力學性質，是對在其施用之後分子的平均生存時間的衡量。半衰期可表示為從受試者的身體(例如，人患者或其他哺乳動物)或其特定區室消除百分之五十(50%)的已知量的分子需要的時間，例如，如在血清中測量的，即，迴圈半衰期，或在其他組織中測量的。一般而言，施用的分子的半衰期的增加導致分子在迴圈中的平均停留時間(MRT)的增加。

在一些實施方式中，用於本發明方法的B7-H3-結合分子和/或PD-1-結合分子包括變異的Fc結構域，其中變異的Fc結構域相對於野生型Fc結構域包括至少一個氨基酸修飾，使得分子具有延長的半衰期(相對於野生型Fc結構域的半衰期而言)。

在一些實施方式中，用於本發明方法的B7-H3-結合分子和/或PD-1-結合分子包括變異的Fc結構域，其中變異的Fc結構域在選自下述的一個或多個位置處包括延長半衰期的氨基酸取代：238、250、252、254、256、257、256、265、272、286、288、303、305、307、308、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428、433、434、435和436。能夠延長包含Fc結構域的分子的半衰期的許多具體突變是本領域已知的，其包括，例如M252Y、S254T、T256E和其組合。例如，見下述文獻中描述的突變：美國專利號6,277,375、7,083,784、7,217,797、8,088,376；美國公開號2002/0147311、2007/0148164；和國際公開號WO 98/23289、WO 2009/058492；和WO 2010/033279，其通過引用以它們的整體併入本文。具有延長半衰期的包含Fc結構域的分子也包括在兩個或更多個Fc結構域殘基處具有取代的那些：250、252、254、256、257、288、307、308、309、311、378、428、433、434、435和436。尤其地，兩個或更多個取代選自：T250Q、M252Y、S254T、T256E、K288D、T307Q、V308P、A378V、M428L、N434A、H435K、Y436I。

在具體的實施方式中，變異的Fc結構域包括下述取代： M252Y、S254T和T256E； M252Y和S254T； M252Y和T256E； T250Q和M428L； T307Q和N434A； A378V和N434A； N434A和Y436I； V308P和N434A；或 K288D和H435K。

本發明進一步包括的變異的Fc結構域，其包括： (A)改變效應子功能和/或FcγR的一個或多個突變；和 (B)延長血清半衰期的一個或多個突變。

用於本發明方法的B7-H3-結合分子和/或PD-1-結合分子的兩條包含Fc結構域的相互作用的多肽鏈的CH2-CH3結構域的兩個CH2和/或兩個CH3結構域不需要序列一致，並且有利地被修飾而有助於兩條多肽鏈之間的複合(見，例如：WO 98/50431、WO2007/110205、WO2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/06867)。例如，氨基酸取代(優選以包括形成“杵”的大側基的氨基酸例如色氨酸取代)可被引入CH2或CH3結構域中，以便空間干擾將防止與類似的突變結構域的相互作用並將迫使突變的結構域與其中互補或適應性突變已經被工程化的結構域——即“臼”(例如，用甘氨酸取代)——配對。這樣的突變組可被工程化至本發明包含Fc結構域的B7-H3-結合分子和/或PD-1-結合分子的任何多肽中。蛋白質工程化以相對于同源二聚化利於異源二聚化的方法是本領域熟知的，尤其對於免疫球蛋白樣分子的工程化而言，其包括在本文中(見例如，Ridgway等 (1996)“‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621；Atwell等 (1997)“Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26-35；和Xie等 (2005)“A New Format Of Bi-specific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101；其每一篇通過引用以其整體併入本文)。優選地“杵”被工程化至一條多肽鏈的CH2-CH3結構域中，並且“臼”被工程化至另一包含CH2-CH3的多肽鏈的CH2-CH3結構域中。因此，“杵”有助於防止第一多肽鏈經其CH2和/或CH3結構域而同源二聚化。CH2-CH3 “具有臼的”多肽鏈將與CH2-CH3“具有杵的”多肽鏈異源二聚化，並且也與其本身同源二聚化。通過修飾天然IgG Fc結構域而包含修飾T366W產生優選的杵。通過修飾天然IgG Fc結構域而包含修飾T366S、L368A和Y407V產生優選的臼。為了有助於從優選的異源二聚體分子純化“具有臼的”多肽鏈同源二聚體，“具有臼的”Fc結構域的CH2和CH3結構域的蛋白質A結合位點優選地通過在435位的氨基酸取代(H435R)而被突變。因此，“具有臼的”Fc結構域同源二聚體不結合蛋白質A，而用於本發明方法的包含Fc結構域的B7-H3-結合分子和/或PD-1-結合分子將保持其經第一多肽鏈上的蛋白質A結合位點而結合蛋白質A的能力。

包含Fc結構域的B7-H3-結合分子和/或PD-1結合分子的優選的“具有杵的 ”序列具有序列(SEQ ID NO:6 )： APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL W C L VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN H YTQKS LSLSPG X 其中，X 是賴氨酸(K)或不存在。

用於包含Fc結構域的B7-H3-結合分子和/或PD-1結合分子的優選的“具有臼的 ”序列具有序列(SEQ ID NO:7) ： APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL S C A VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V SKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN R YTQKS LSLSPG X 其中，X 是賴氨酸(K)或不存在。

本發明也包括這類CH2-CH3結構域，其包括另外的取代，其修飾如上面提供的Fc結構域的效應子功能和/或FγR結合活性。本發明也包括這類CH2-CH3結構域，其進一步包括一個或多個延長半衰期的氨基酸取代。尤其地，本發明包括這類具有臼的和這類具有杵的CH2-CH3結構域，其進一步包括M252Y/S254T/T256E取代。

B. B7-H3- 結合分子

本發明包括的特異性結合B7-H3的分子包括抗B7-H3抗體，其能夠結合人B7-H3的連續的或不連續的(例如，構象)部分(表位元)，以及包括這類抗體的表位-結合位點的分子。在本發明的方法和組合物中使用的B7-H3-結合分子優選地也展示結合一個或多個非人物種，尤其是鼠科動物、齧齒動物、犬科動物和靈長類物種的B7-H3分子的能力。對於B7-H3特異性的抗體是已知的(見，例如，美國專利號7,527,969、7,666,424、7,718,774、7,737,258、7,740,845、8,148,154、8,216,570、8,414,892、8,501,471、8,779,098、8,802,091、9,062,110；美國專利公開號2013/0078234、2010/0143245；和PCT專利公開WO 2004/001381、WO 2008/066691、WO 2008/116219、WO 2011/109400、WO 2012/147713，和表 5 )。另外期望的抗體可通過分離使用表達B7-H3的細胞；B7-H3或其肽片段引起的分泌抗體的雜交瘤而被製備。

人B7-H3以“2Ig”形式和“4Ig”形式存在。人B7-H3的“2Ig”形式的氨基酸序列(包括29個氨基酸殘基信號序列，加底線顯示)是(SEQ ID NO:17 )： MLRRRGSPGM GVHVGAALGA LWFCLTGAL E VQVPEDPVVA LVGTDATLCC SFSPEPGFSL AQLNLIWQLT DTKQLVHSFA EGQDQGSAYA NRTALFPDLL AQGNASLRLQ RVRVADEGSF TCFVSIRDFG SAAVSLQVAA PYSKPSMTLE PNKDLRPGDT VTITCSSYRG YPEAEVFWQD GQGVPLTGNV TTSQMANEQG LFDVHSVLRV VLGANGTYSC LVRNPVLQQD AHGSVTITGQ PMTFPPEALW VTVGLSVCLI ALLVALAFVC WRKIKQSCEE ENAGAEDQDG EGEGSKTALQ PLKHSDSKED DGQEIA

人B7-H3的“2Ig”形式的氨基酸序列(SEQ ID NO:17 )完全包括在人B7-H3的“4Ig”形式中(SEQ ID NO:18 ，29個氨基酸殘基信號序列，加底線顯示)： MLRRRGSPGM GVHVGAALGA LWFCLTGAL E VQVPEDPVVA LVGTDATLCC SFSPEPGFSL AQLNLIWQLT DTKQLVHSFA EGQDQGSAYA NRTALFPDLL AQGNASLRLQ RVRVADEGSF TCFVSIRDFG SAAVSLQVAA PYSKPSMTLE PNKDLRPGDT VTITCSSYQG YPEAEVFWQD GQGVPLTGNV TTSQMANEQG LFDVHSILRV VLGANGTYSC LVRNPVLQQD AHSSVTITPQ RSPTGAVEVQ VPEDPVVALV GTDATLRCSF SPEPGFSLAQ LNLIWQLTDT KQLVHSFTEG RDQGSAYANR TALFPDLLAQ GNASLRLQRV RVADEGSFTC FVSIRDFGSA AVSLQVAAPY SKPSMTLEPN KDLRPGDTVT ITCSSYRGYP EAEVFWQDGQ GVPLTGNVTT SQMANEQGLF DVHSVLRVVL GANGTYSCLV RNPVLQQDAH GSVTITGQPM TFPPEALWVT VGLSVCLIAL LVALAFVCWR KIKQSCEEEN AGAEDQDGEG EGSKTALQPL KHSDSKEDDG QEIA

優選的抗B7-H3-結合分子具有抗人B7-H3單克隆抗體“BRCA84D ”、“BRCA69D ”、“PRCA1 ”或表 5 中提供的任何抗B7-H3抗體的VL和/或VH結構域；並且更優選地具有這類抗B7-H3單克隆抗體的VL區域的1、2或所有3個CDR_L 和/或VH結構域的1、2或所有3個CDR_H 。尤其優選的是B7-H3-結合分子，其具有人源化的VH和/或VL結構域。這類優選的B7-H3-結合分子包括具有變異的Fc結構域的抗體、雙特異性(或多特異性)抗體、嵌合抗體或人源化抗體等

1. BRCA84D

BRCA84D的VL結構域的氨基酸序列(SEQID NO:19 )顯示在下方(CDR_L 殘基加底線顯示)。 DIAMTQSQKF MSTSVGDRVS VTC KASQNVD TNVA WYQQKP GQSPKALIY S ASYRYS GVPD RFTGSGSGTD FTLTINNVQS EDLAEYFC QQ YNNYPFT FGS GTKLEIK

BRCA84D的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:20 )顯示在下方(CDR_H 殘基加底線顯示)。 DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFTFS SFGMH WVRQA PEKGLEWVA Y ISSDSSAIYY ADTVKG RFTI SRDNPKNTLF LQMTSLRSED TAMYYCGR GR ENIYYGSRLD Y WGQGTTLTV SS

a. hBRCA84D

下面提供了本文命名為“hBRCA84D VL1 ”、“ hBRCA84D VL2 ”、“hBRCA84D VL3 ”、“hBRCA84D VL4 ”、“hBRCA84D VL5 ”、“hBRCA84D VL6 ” 的BRCA84D的六個示例性人源化VL結構域，和本文命名為“hBRCA84D VH1 ”、“hBRCA84D VH2 ”、“hBRCA84D VH3 ”和“hBRCA84D VH4 ” 的BRCA84D的四個示例性人源化的VH結構域。任何人源化VL結構域可與任何人源化的VH結構域配對，以產生B7-H3結合結構域。因此，包括與人源化的VH結構域配對的人源化VL結構域之一的任何抗體通常稱為“hBRCA84D ”，並且人源化VH/VL結構域的具體組合通過參考具體的VH/VL結構域而被提及，例如包括hBRCA84D VH1和hBRCA84D VL2的人源化抗體具體稱為“hBRCA84D (1.2) ”。

hBRCA84D VL1的VL結構域的氨基酸序列(SEQID NO:21 )顯示在下方(CDR_L 殘基加底線顯示)。 DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC KASQNVD TNVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASYRYS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YNNYPFT FGQ GTKLEIK

hBRCA84D VL2的VL結構域的氨基酸序列(SEQID NO:22 )顯示在下方(CDR_L 殘基加底線顯示)。 DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC KASQNVD TNVA WYQQKP GKAPKALIY S ASYRYS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YNNYPFT FGQ GTKLEIK

hBRCA84D VL3的VL結構域的氨基酸序列(SEQID NO:23 )顯示在下方(CDR_L 殘基加底線顯示)。 DIQLTQSPSF LSASVGDRVS VTC KASQNVD TNVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASYRYS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YNNYPFT FGQ GTKLEIK

hBRCA84D VL4的VL結構域的氨基酸序列(SEQID NO:24 )顯示在下方(CDR_L 殘基加底線顯示)。 DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC KASQNVD TNVA WYQQKP GQAPKLLIY S ASYRYS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YNNYPFT FGQ GTKLEIK

hBRCA84D VL5的VL結構域的氨基酸序列(SEQID NO:25 )顯示在下方(CDR_L 殘基加底線顯示)。 DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC KASQNVD TNVA WYQQKP GQAPKALIY S ASYRYS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YNNYPFT FGQ GTKLEIK

hBRCA84D VL6的VL結構域的氨基酸序列(SEQID NO:26 )顯示在下方(CDR_L 殘基加底線顯示)。 DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC KASQNVD TNVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASYRYS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFAEYYC QQ YNNYPFT FGQ GTKLEIK

hBRCA84D VH1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:27 )顯示在下方(CDR_H 殘基加底線顯示)。 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMH WVRQA PGKGLEWVA Y ISSDSSAIYY ADTVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCAR GR ENIYYGSRLD Y WGQGTTVTV SS

hBRCA84D VH2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:28 )顯示在下方(CDR_H 殘基加底線顯示)。 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMH WVRQA PGKGLEWVA Y ISSDSSAIYY ADTVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCGR GR ENIYYGSRLD Y WGQGTTVTV SS

hBRCA84D VH3的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:29 )顯示在下方(CDR_H 殘基加底線顯示)。 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMH WVRQA PGKGLEWVA Y ISSDSSAIYY ADTVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAMYYCGR GR ENIYYGSRLD Y WGQGTTVTV SS

hBRCA84D VH4的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:30 )顯示在下方(CDR_H 殘基加底線顯示)。 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMH WVRQA PGKGLEWVA Y ISSDSSAIYY ADTVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRSED TAVYYCAR GR ENIYYGSRLD Y WGQGTTVTV SS

2. BRCA69D

BRCA69D的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:31 )顯示在下方(CDR_L 殘基加底線顯示)。 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISC RASQDIS NYLN WYQQKP DGTVKLLIY Y TSRLHS GVPS RFSGSGSGTD YSLTIDNLEQ EDIATYFC QQ GNTLPPT FGG GTKLEIK

BRCA69D的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:32 )顯示在下方(CDR_H 殘基加底線顯示)。 QVQLQQSGAE LARPGASVKL SCKASGYTFT SYWMQ WVKQR PGQGLEWIG T IYPGDGDTRY TQKFKG KATL TADKSSSTAY MQLSSLASED SAVYYCAR RG IPRLWYFDV W GAGTTVTVSS

a. hBRCA69D

下面提供了本文命名為“hBRCA69D VL1 ” 和“hBRCA69D VL2 ”的BRCA69D的兩個示例性人源化VL結構域以及本文命名為“hBRCA69D VH1 ”和“hBRCA69D VH2 ”的BRCA69D的兩個示例性人源化的VH結構域。注意，hBRCA69D VL2包括CDR_L 1和CDR_L 2中的氨基酸取代，並且hBRCA69D VH2包括CDR_L 2中的氨基酸取代。任何人源化VL結構域可與任何人源化的VH結構域配對，以產生B7-H3結合結構域。因此，包括與人源化VH結構域配對的人源化VL結構域之一的任何抗體通常稱為“hBRCA69D ”並且人源化VH/VL結構域的特定組合通過參考特定VH/VL結構域而被提及，例如包括hBRCA69D VH1和hBRCA69D VL2的人源化抗體具體稱為“hBRCA69D (1.2) ”。

hBRCA69D VL1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:33 )顯示在下方(CDR_L 殘基加底線顯示)。 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDISNYLN WYQQKP GKAPKLLIY Y TSRLHS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYC QQ GNTLPPT FGG GTKLEIK

hBRCA69D VL2的VL結構域的氨基酸序列(SEQID NO:34 )顯示在下方(CDR_L 殘基加底線顯示)。 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQSIS SYLN WYQQKP GKAPKLLIY Y TSRLQS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYC QQ GNTLPPT FGG GTKLEIK

hBRCA69D VH1的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:35 ) (CDR_H 殘基加底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQ WVRQA PGQGLEWMG T IYPGDGDTRY TQKFKG RVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR RG IPRLWYFDV W GQGTTVTVSS

hBRCA69D VH2的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:36 ) (CDR_H 殘基加底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQ WVRQA PGQGLEWMG T IYPGGGDTRY TQKFQG RVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR RG IPRLWYFDV W GQGTTVTVSS

3. PRCA157

PRCA157的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:37 )顯示在下方(CDR_H 殘基加底線顯示)。 DIQMTQSPAS LSVSVGETVT ITC RASESIY SYLA WYQQKQ GKSPQLLVY N TKTLPE GVPS RFSGSGSGTQ FSLKINSLQP EDFGRYYC QH HYGTPPWT FG GGTNLEIK

PRCA157的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:38 )顯示在下方(CDR_H 殘基加底線顯示)。 EVQQVESGGD LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYGMS WVRQT PDKRLEW VAT INSGGSNTYY PDSLKG RFTI SRDNAKNTLY LQMRSLKSED TAMYYCAR HD GGAMDY WGQG TSVTVSS

4. 另外的抗 B7-H3 抗體

可用于本發明的方法和組合物的另外的抗B7-H3抗體提供在表 5 中。

5. 示例性抗 B7-H3 抗體

在某些實施方式中，用於本發明的方法和組合物的B7-H3抗體包括上面提供的任何抗體的VL和VH結構域(例如，hBRCA84D、hBRCA69D、PRCA157或表 5 中任何抗B7-H3抗體的VL和VH結構域)、κ CL結構域，以及(相對於野生型Fc結構域)具有增強的ADCC的變異的IgG1 Fc結構域。在一個實施方式中，CH2-CH3結構域包括L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L取代(其中編號是根據如Kabat中的EU索引)。這類抗體將優選包括IgG1 CH1結構域和鉸鏈結構域。

κ CL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:13 )顯示在下方。 RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC

IgG1 CH1結構域和鉸鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO:14 )顯示在下方。 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCP

包括L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L取代的IgG1 CH2-CH3結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:15 )顯示在下方。 APELVGGPSV FLLPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PPEEQYNSTL RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPLVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK

命名為“hBRCA84D-2 ”的示例性抗B7-H3抗體包括：具有BRCA84D VL2的VL結構域(SEQ ID NO:22 )和κ CL (SEQ ID NO:13 )的輕鏈和具有BRCA84D VH2的VH結構域(SEQ ID NO:28 )、IgG1 CH1結構域和鉸鏈(SEQ ID NO:14 )的重鏈、和包括L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L取代(SEQ ID NO:15 )的變異的IgG CH2-CH3結構域。

hBRCA84D-2的完整輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO:39 )顯示在下方。 DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC

hBRCA84D-2的完整重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO:40 )顯示在下方。 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCGRGR ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKRV EPKSCDKTHT CPPCPAPELV GGPSVFLLPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPPEEQ YNSTLRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP LVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK

C. PD-1- 結合分子

本發明包括的特異性結合PD-1的分子包括能夠結合人PD-1的連續的或不連續的(例如，構象)部分(表位)的抗PD-1抗體，和包括這類抗體的表位-結合位點的分子。本發明的方法和組合物中使用的PD-1-結合分子(例如，抗體)將優選地也展示結合一個或多個非人物種，尤其是鼠科動物、齧齒動物、犬科動物和靈長類物種的PD-1分子的能力。特異性針對PD-1的抗體是已知的(見，例如，美國專利專利申請號62/198,867；美國專利號5,952,136、7,488,802、7,521,051、8,008,449、8,088,905、8,354,509、8,552,154、8,779,105、8,900,587、9,084,776；PCT專利公開WO 2004/056875、WO 2006/121168、WO 2008/156712、WO 2012/135408、WO 2012/145493、WO 2013/014668、WO 2014/179664、WO 2014/194302和WO 2015/112800；和表 6 )。可通過分離使用PD-1或其肽片段引起的分泌抗體的雜交瘤而製備另外期望的抗體。

人PD-1 (包括20個氨基酸殘基信號序列(加底線顯示)和268個氨基酸殘基的成熟蛋白質)具有氨基酸序列(SEQ ID NO:41 )： MQIPQAPWPV VWAVLQLGWR PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGVVGGLLGS LVLLVWVLAV ICSRAARGTI GARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW REKTPEPPVP CVPEQTEYAT IVFPSGMGTS SPARRGSADG PRSAQPLRPE DGHCSWPL

用於本發明的方法和組合物的優選的抗PD-1-結合分子(例如，抗體)具有下述抗體的VL和/或VH結構域：抗人PD-1單克隆抗體“PD-1 mAb 1 ” (尼伏魯單抗，CAS登記號:946414-94-4，也稱為5C4、BMS-936558、ONO-4538、MDX-1106，並且作為OPDIVO®由Bristol-Myers Squibb售賣)；“PD-1 mAb 2 ”(派姆單抗，(之前稱為蘭羅利珠單抗(lambrolizumab))，CAS登記號:1374853-91-4，也稱為MK-3475、SCH-900475並且作為KEYTRUDA®由Merck售賣)；“PD-1 mAb 3 ”(EH12.2H7；Dana Farber)，“ PD-1 mAb 4 ”(匹地利珠單抗，CAS登記號：1036730-42-3也稱為CT-011，CureTech)，或表 6 中的任何抗PD-1抗體；並且更優選地具有這類抗PD-1單克隆抗體的VL區域的1、2或所有3個CDR_L 和/或VH結構域的1、2或所有3個CDR_H 。最近已經鑒定了可用于本發明的方法和組合物的、具有獨特的結合特徵的另外的抗PD-1抗體(見，美國專利專利申請號62/198,867)。尤其地，優選的是PD-1-結合分子，其具有下述抗體的人源化的VH和/或VL結構域：抗PD-1抗體“ PD-1 mAb 5 ”(hPD-1 mAb 2，MacroGenics)；“ PD-1 mAb 6 ”(hPD-1 mAb 7，MacroGenics)；“ PD-1 mAb 7 ”(hPD-1 mAb 9，MacroGenics)；或“PD-1 mAb 8 ” (hPD-1 mAb 15，MacroGenics)；和更優選地具有這類人源化的抗PD-1單克隆抗體的VL區域的1、2或所有3個CDR_L 和/或VH結構域的1、2或所有3個CDR_H 。這類優選的抗PD-1-結合分子包括具有變異的Fc結構域的抗體、雙特異性(或多特異性)抗體、嵌合抗體或人源化抗體等

1. PD-1 mAb 1

PD-1 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:42 )顯示在下方(CDR_H 殘基加底線顯示)。 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL DCKASGITFS NSGMH WVRQA PGKGLEWVA V IWYDGSKRYY ADSVKG RFTI SRDNSKNTLF LQMNSLRAED TAVYYCAT ND DY WGQGTLVT VSS

PD-1 mAb 1的VL結構域的氨基酸序列(SEQID NO:43 )顯示在下方(CDR_L 殘基加底線顯示)。 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVSSYLA WYQQKP GQAPRLLIY D ASNRAT GIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYC QQ SSNWPRT FGQ GTKVEIK

2. PD-1 mAb 2

PD-1 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:44 )顯示在下方(CDR_H 殘基加底線顯示)。 QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMY WVRQA PGQGLEWMG G INPSNGGTNF NEKFKN RVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCAR RD YRFDMGFDY W GQGTTVTVSS

PD-1 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQID NO:45 )顯示在下方(CDR_L 殘基加底線顯示)。 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASKGVS TSGYSYLH WY QQKPGQAPRL LIY LASYLES GVPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YC QHSRDLPL T FGGGTKVEI K

3. PD-1 mAb 3

PD-1 mAb 3的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:46 )顯示在下方(CDR_H 殘基加底線顯示)。 QVQLQQSGAE LAKPGASVQM SCKASGYSFT SSWIH WVKQR PGQGLEWIG Y IYPSTGFTEY NQKFKD KATL TADKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCA RWR DSSGYHAMDY WGQGTSVTVSS

PD-1 mAb 3的VL結構域的氨基酸序列(SEQID NO:47 )顯示在下方(CDR_L 殘基加底線顯示)。 DIVLTQSPAS LTVSLGQRAT ISC RASQSVS TSGYSYMH WY QQKPGQPPKL LIK FGSNLES GIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YC QHSWEIPY T FGGGTKLEI K

4. PD-1 mAb 4

PD-1 mAb 4的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:48 )顯示在下方(CDR_H 殘基加底線顯示)。 QVQLVQSGSE LKKPGASVKI SCKASGYTFT NYGMN WVRQA PGQGLQWMG W INTDSGESTY AEEFKG RFVF SLDTSVNTAY LQITSLTAED TGMYFCVR VG YDALDY WGQG TLVTVSS

PD-1 mAb 4的VL結構域的氨基酸序列(SEQID NO:49 )顯示在下方(CDR_L 殘基加底線顯示)。 EIVLTQSPSS LSASVGDRVT ITC SARSSVS YMH WFQQKPG KAPKLWIY RT SNLAS GVPSR FSGSGSGTSY CLTINSLQPE DFATYYC QQR SSFPLT FGGG TKLEIK

5. PD-1 mAb5

PD-1 mAb 5的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:50 )顯示在下方(CDR_H 殘基加底線顯示)。 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFVFS SFGMH WVRQA PGKGLEWVA Y ISSGSMSISY ADTVKG RFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRTED TALYYCAS LS DYFDY WGQGT TVTVSS

PD-1 mAb 5的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:51 )顯示在下方(CDR_L 殘基加底線顯示)。 DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISC RSSQSLV HSTGNTYLH W YLQKPGQSPQ LLIY RVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYC SQTTHVP WT FGQGTKLE IK

6. PD-1 mAb 6

PD-1 mAb 6的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:52 )顯示在下方(CDR_H 殘基加底線顯示)。 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMN WVRQA PGQGLEWXG V IHPSDSETWL DQKFKD RVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR EH YGTSPFAY WG QGTLVTVSS 其中X是I或A。

PD-1 mAb 6的VL結構域的氨基酸序列(SEQID NO:53 )顯示在下方(CDR_L 殘基加底線顯示)。 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RAX₁ ESVD NYGMSFMN WF QQKPGQPPKL LIH AASNX₂ GS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FC QQSKEVPY T FGGGTKVEI K 其中：X₁ 是N或S和X₂ 是Q或R；或X₁ 是N和X₂ 是Q；或X₁ 是S和X₂ 是Q；或X₁ 是S和X₂ 是R。

在具體的實施方式中，PD-1mAb 6包括： (a)SEQ ID NO:52 ，其中X是I；和SEQ ID NO:53 ，其中X₁ 是N和X₂ 是Q；或 (b)SEQ ID NO:52 ，其中X是I；和SEQ ID NO:53 ，其中X₁ 是S和X₂ 是Q。

7. PD-1 mAb 7

PD-1 mAb 7的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:54 )顯示在下方(CDR_H 殘基加底線顯示)。 EVQLVESGGG LX₁ RPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVX₂ WVRQA PGKGLEWX₃ A T ISGGGGNTYY SDSVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSX₄ RAED TATYYCAR YG FDGAWFAY WG QGTLVTVSS 其中X₁ 是V或A；X₂ 是S或G；X₃ 是V或T；X₄ 是L或A；X₁ 是V，X₂ 是S，X₃ 是V，和X₄ 是L；或X₁ 是A，X₂ 是G，X₃ 是T，和X₄ 是A。

PD-1 mAb 7的VL結構域的氨基酸序列(SEQID NO:55 )顯示在下方(CDR_L 殘基加底線顯示)。 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASENIY X₁ YLA WYQQKP GKAPKLLIY X₂ AKTLAA GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QH HYAVPWT FGQ GTKLEIK 其中：X₁ 是S或N和X₂ 是N或D；或X₁ 是S和X₂ 是N；或 X₁ 是N和X₂ 是D。

在具體的實施方式中，PD-1mAb 7包括： (a)SEQ ID NO:54 ，其中X₁ 是V，X₂ 是S，X₃ 是V，和X₄ 是L；和SEQ ID NO:55 ，其中X₁ 是S和X₂ 是N；或 (b)SEQ ID NO:54 ，其中X₁ 是A，X₂ 是G，X₃ 是T，和X₄ 是A；和SEQ ID NO:55 ，其中X₁ 是N和X₂ 是D。

8. PD-1 mAb 8

PD-1 mAb 8的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:56 )顯示在下方(CDR_H 殘基加底線顯示)。 EVQLVESGGG LVRPGGSLRL SCAASGFTFS SYLIS WVRQA PGKGLEWVA A ISGGGADTYY ADSVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TATYYCAR RG TYAMDY WGQG TLVTVSS

PD-1 mAb 8的VL結構域的氨基酸序列(SEQID NO:57 )顯示在下方(CDR_L 殘基加底線顯示)。 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASENIY NYLA WYQQKP GKAPKLLIY D AKTLAA GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QH HYAVPWT FGQ GTKLEIK

9. 另外 的 抗 PD-1 抗體

可在本發明的方法和組合物中使用的另外的抗PD-1抗體提供在表 6 中。

10. 示例性 PD-1 抗體

在某些實施方式中，可用于本發明的方法和組合物的PD-1抗體包括上面提供的任何抗體(例如，PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8或表 6 中的任何抗PD-1抗體)的VL和VH結 構域、κ CL結構域和IgG4 Fc結構域，任選地缺少C-末端賴氨酸殘基。這類抗體將優選地包括IgG4 CH1結構域和鉸鏈結構域，並且更優選地包括穩定化的IgG4鉸鏈，其包括S228P取代(其中編號是根據Kabat中的EU索引)。

κ CL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:13 )已經提供在上方。

IgG4 CH1結構域和穩定化的鉸鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO:16 )已經提供在上方。

IgG4 CH2-CH3結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:4 )已經提供在上方。

命名為“PD-1 mAb 6-ISQ ”的示例性抗PD-1抗體包括：具有PD-1 mAb 6的VL結構域(SEQ ID NO:53 )，其中X₁ 是S和X₂ 是Q，和κ CL (SEQ ID NO:13 )的輕鏈；和重鏈，其具有PD-1 mAb 6的VH結構域(SEQ ID NO:52 )，其中X₁ 是I、IgG4 CH1結構域、穩定化的IgG 4鉸鏈(SEQ ID NO:16 )和IgG4 CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:4 )。

PD-1 mAb 6-ISQ的完整輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO:58 )顯示在下方。 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC

PD-1 mAb 6-ISQ的完整重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO:59 )顯示在下方。 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APCSRSTSES TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTKTY TCNVDHKPSN TKVDKRVESK YGPPCPPCPA PEFLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSQEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPSS IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSQEEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSRLT VDKSRWQEGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSLG

另一示例性抗PD-1抗體是PD-1 mAb 1 (尼伏魯單抗)，其是人抗體，包括：具有VL結構域(SEQ ID NO:43 )和κ CL結構域(見例如，SEQ ID NO:13 )的輕鏈；和具有VH結構域(SEQ ID NO:42 )、IgG4 CH1結構域(見例如，SEQ ID NO:9 )、穩定化的IgG4鉸鏈(見例如，SEQ ID NO:12 )和IgG4 CH2-CH3結構域(見例如，SEQ ID NO:4 )的重鏈。

另一示例性抗PD-1抗體是PD-1 mAb 2 (派姆單抗)，其是人源化抗體，包括：具有VL結構域(SEQ ID NO:45 )和κ CL結構域(見例如，SEQ ID NO:13 )的輕鏈；和具有VH結構域(SEQ ID NO:44 )、IgG4 CH1結構域(見例如，SEQ ID NO:9 )、穩定化的IgG4鉸鏈(見例如，SEQ ID NO:12 )和IgG4 CH2-CH3結構域(見例如，SEQ ID NO:4 )的重鏈。

D. 產生 方法

本發明包括的B7-H3-結合分子和PD-1-結合分子可通過本領域已知的方法產生，例如，經合成或重組產生(見，例如，Kelley, R. F.等 (1990), 在以下中: Genetic Engineering Principles and Methods, Setlow, J.K. Ed., Plenum Press, N.Y., vol. 12, pp 1-19；Stewart, J.M等 (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL；也見美國專利號4,105,603、3,972,859、3,842,067和3,862,925；Merrifield, B. (1986) “Solid Phase Synthesis ,” Science 232(4748):341-347；Houghten, R.A. (1985) “General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135；Ganesan, A. (2006) “Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century ,” Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10)。

可選地，可通過使用商業上可得的小鼠獲得具有期望的抗B7-H3抗體和/或抗PD-1抗體的一個或多個CDR的適當的B7-H3-結合分子和/或PD-1-結合分子，所述小鼠已經被工程化以表達特定的人免疫球蛋白蛋白質。被設計以產生更期望的(例如，全人抗體)或更有力的免疫應答的轉基因動物也可用於產生人源化的或人抗體。這類技術的例子是XENOMOUSE™ (Abgenix, Inc. , Fremont, CA)和HuMAb-MOUSE®和TC MOUSE™ (都來自Medarex, Inc. , Princeton, NJ)。

在進一步可選的方法中，這類結合分子可經重組製備並使用本領域已知的任何方法被表達。可通過如下方法經重組製備抗體：首先分離從宿主動物製備的抗體、獲得基因序列和使用基因序列在宿主細胞(例如，CHO細胞)中重組表達抗體。可採用的另一方法是在植物(例如，煙草)或轉基因奶中表達抗體序列。已經公開了用於在植物或奶中重組表達抗體的合適的方法(見，例如，Peeters等 (2001) “Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants ,” Vaccine 19:2756；Lonberg, N.等 (1995) “Human Antibodies From Transgenic Mice ,” Int. Rev. Immunol 13:65-93；和Pollock等(1999) “Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies ,” J. Immunol Methods 231:147-157)。用於製備抗體衍生物，例如，人源化抗體、雙特異性抗體、單鏈等的適當的方法是本領域已知的。在另一可選方案中，可通過噬菌體展示技術重組製備抗體(見，例如，美國專利號5,565,332、5,580,717、5,733,743、6,265,150；和Winter, G.等 (1994) “Making Antibodies By Phage Display Technology ,” Annu. Rev. Immunol. 12.433-455)。

可將包含編碼感興趣多肽的多核苷酸的載體通過任何許多適當的方式引入到宿主細胞中，所述適當的方式包括電穿孔；採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質的轉染；微彈轟擊(microprojectile bombardment)；脂轉染；和感染(例如，在載體是感染劑諸如牛痘病毒的情況下)。引入載體或多核苷酸的選擇通常取決於宿主細胞的特徵。

能夠過表達異源DNA的任何宿主細胞均可被使用，用於分離編碼感興趣的抗體、多肽或蛋白質的基因的目的。合適的哺乳動物宿主細胞的非的限制性實例包括但不限於COS、HeLa和CHO細胞。優選地，相比於宿主細胞中相應的感興趣的內源抗體或蛋白質（如果存在），宿主細胞以約5-倍，更優選10-倍，甚至更優選20-倍的水準表達cDNA。針對免疫特異性結合cDNA表達的靶(例如，B7-H3或PD-1) 篩選宿主細胞，可使用免疫試驗或FACS實現。可鑒定過表達感興趣的抗體或蛋白質的細胞。

本發明包括這樣的多肽，所述多肽包括本文提供的抗B7-H3抗體和/或抗PD-1-抗體的氨基酸序列(優選地表位元結合結構域)。可通過本領域已知的程式製備本發明的多肽。可通過抗體的蛋白水解或其他降解、如上述的重組方法(即，單個或融合多肽)或化學合成來產生多肽。抗體的多肽，尤其地，上至約50個氨基酸的較短的多肽，通過化學合成被常規製備。

本發明包括任何這類B7-H3-結合分子和/或PD-1-結合分子的多肽的修飾，所述修飾不明顯影響這類分子以及具有增強的或降低活性的變體的特性。多肽的修飾在本領域中是常規操作，因而不需要在本文詳細描述。修飾的多肽的實例包括這樣的多肽：其具有氨基酸殘基的保守取代、未明顯有害改變功能活性的氨基酸的一個或多個缺失或添加，或使用化學類似物。可彼此保守取代的氨基酸殘基包括但不限於：甘氨酸/丙氨酸；絲氨酸/蘇氨酸；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸；天冬醯胺/穀氨醯胺；天冬氨酸/谷氨酸；賴氨酸/精氨酸；和苯基丙氨酸/酪氨酸。這些多肽還包括糖基化和非糖基化多肽以及具有其它翻譯後修飾的多肽，所述其它翻譯後修飾，諸如例如，用不同糖進行糖基化、乙醯化和磷酸化。優選地，氨基酸取代應該是保守的，即，取代的氨基酸會具有與原始氨基酸類似的化學性質。這樣的保守取代在本領域中是已知的，並且已經在上文提供實例。氨基酸修飾範圍可從改變或修飾一個或多個氨基酸到區域諸如可變結構域的完全重新設計(redesign)。可變結構域中的變化可改變結合親和力和/或免疫特異性。修飾的其它方法包括利用本領域中已知的偶合技術，包括但不限於酶促手段、氧化取代和螯合。修飾可用於例如，連接標籤用於免疫分析，諸如連接放射性部分用於放射免疫分析。修飾的多肽利用本領域中確定的方法製備，並且可利用本領域中已知的標準測定來篩選。

本發明包括這樣的融合蛋白，所述融合蛋白包括本發明的一種或多種抗體。在一個實施方式中，提供融合多肽，其包括輕鏈、重鏈或輕鏈以及重鏈二者。在另一實施方式中，融合多肽包含異源免疫球蛋白恒定區。在另一實施方式中，融合多肽包含本文提供的或由公開保藏的雜交瘤產生的抗體的VL結構域和VH結構域。為了本發明的目的，抗體融合蛋白包含免疫特異性結合B7-H3和/或PD-1的一個或多個表位-結合位點，和免疫特異性結合在天然分子中其未連接的另外的氨基酸序列的一個或多個多肽結構域，所述另外的氨基酸序列，例如，異源序列或來自另一區域的同源序列。

E. 藥物組合物

本發明包括組合物，其包括B7-H3-結合分子、PD-1-結合分子或這類分子的組合。本發明的組合物包括原料藥組合物(bulk drug composition)，其可用於製備藥學組合物(例如，不純或非無菌組合物)和可用於製備單位劑型的藥學組合物(即，適於施用給受試者或患者的組合物)。這類組合物包括B7-H3-結合分子、PD-1-結合分子或這類分子的組合以及藥學上可接受的載體。優選地，本發明的組合物包括B7-H3-結合分子、PD-1-結合分子或這類分子的組合、以及藥學上可接受的載體。在優選的方面中，這類組合物基本上是純化的(即，基本上不含限制其作用或產生非期望的副作用的物質)。

在施用大於一種治療劑時，所述劑可以一起被配製在相同的製劑中或被可配製成單獨的組合物。因此，在一些實施方式中，B7-H3-結合分子和PD-1-結合分子在相同的藥物組合物中被配製在一起。在可選的實施方式中，分子被配製在分開的藥物組合物中。

B7-H3-結合分子、PD-1-結合分子或這類分子的組合的各種製劑可用於施用。除了藥理學活性劑(一種或多種)，本發明的組合物可包含適當的藥學上可接受的載體，其包括賦形劑和助劑，所述藥學上可接受的載體是本領域熟知的並且是相對惰性物質，有利於施用藥理學上有效的物質或利於將活性化合物加工成可在藥學上用於遞送至作用位點的製劑。例如，賦形劑可賦予形狀或稠度，或用作稀釋劑。適當的賦形劑包括但不限於穩定劑、濕潤劑和乳化劑、用於改變滲透性的鹽、封裝劑、緩衝液和皮膚滲透增強劑。

在具體的實施方式中，術語“藥學上可接受的 ”表示獲得聯邦政府或州政府管理機構的許可或列於美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或其他通常獲得認可的藥典中，供用於動物，特別是用於人類。術語“載體 ”指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全)、賦形劑或媒介。這類藥學載體可以是無菌液體，如水和油，包括石油、動物油、植物油或合成來源的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內施用藥物組合物時，優選水性載體，比如生理鹽水溶液、水性右旋糖和甘油溶液。合適的藥用賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉(dried skim milk)、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。若需要，組合物也可以含有小量濕潤劑或乳化劑或pH緩衝劑。這些組合物可以採用溶液、懸液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、緩釋製劑等形式。

一般而言，本發明組合物的成分被單獨提供或以單位劑型混合在一起，例如作為標明活性劑的量的密封容器中的凍乾粉或無水濃縮物，所述密封容器如安瓿或小袋(sachette)。當通過輸注施用組合物時，其可以用含有無菌的藥學級水或鹽水的輸注瓶分配。如果通過注射施用所述組合物，則可以提供一安瓿注射用無菌水或鹽水，以便可以在施用前混合所述成分。

可以將本發明的組合物配製為中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括但不限於用陰離子形成的鹽以及用陽離子形成的鹽，所述陰離子例如來源於鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的陰離子，並且所述陽離子例如來自氫氧化納、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的陽離子。

優選地，治療劑(即，B7-H3-結合分子、PD-1-結合分子或這類分子的組合)在指示分子的量的密封容器，比如安瓿或袋中作為乾燥無菌冷凍粉末被提供。在一個實施方式中，治療劑作為凍幹無菌粉或無水濃縮物提供於密封容器中，並且可以用例如水或鹽水重構至適當濃度，用於施用於受試者。在可選的實施方式中，治療劑在指示治療劑的量和濃度的密封容器中以液體形式被提供。

冷凍乾燥治療劑(即，B7-H3-結合分子、PD-1-結合分子或這類分子的組合)應在初始容器中儲存在2°C和8°C之間並且劑應在重構之後12小時內、優選地6小時內、5小時內、3小時內或1小時內被施用。在可選的實施方式中，治療劑在指示分子(一種或多種)、融合蛋白或綴合分子的量和濃度的密封容器中以液體形式被提供。優選地，這類治療劑當以液體形式時提供時，被提供在密封容器中。

本發明也提供了包括一個或多個容器的藥學包裝或試劑盒，所述容器包含B7-H3-結合分子、PD-1-結合分子或這類分子的組合，單獨地或與其他試劑一起，優選地與藥學上可接受的載體一起。另外，用於治療疾病的一種或多種其他預防劑或治療劑也可包括在藥物包裝或試劑盒中。本發明也提供了這樣的藥物包裝或試劑盒，其包括一個或多個容器，所述容器填充本發明藥物組合物的一種或多種成分。任選地與這類容器(一個或多個)關聯的可以是管理藥物或生物產品的製造、使用或銷售的政府機構規定的形式的佈告(notice)，所述佈告反映了管理機構許可用於人類施用的製造、使用或銷售。

試劑盒可包括B7-H3-結合分子、PD-1-結合分子或這類分子的組合。試劑盒可在一個或多個容器中進一步包括可用於治療癌症的一種或多種其他預防劑和/或治療劑；和/或試劑盒可進一步包括結合一種或多種癌症抗原的一種或多種細胞毒性抗體。在某些實施方式中，其他預防劑或治療劑是化療劑。在其他實施方式中，預防劑或治療劑是生物或激素治療劑。

F. 使用方法

如上所討論，特異性結合B7-H3的分子和特異性結合PD-1的分子在患有癌症或其他疾病的受試者中可用於治療性目的。所以，本發明提供了治療癌症的方法，包括向需要其的受試者施用B7-H3-結合分子和PD-1-結合分子。尤其地，本發明包括這樣的方法，其中B7-H3-結合分子包括本文的提供的抗B7-H3抗體的表位-結合位點，並且其中PD-1-結合分子包括本文提供的抗PD-1抗體的表位-結合位點。在一個實施方式中，B7-H3-結合分子是抗體。在一個實施方式中，PD-1-結合分子是抗體。在進一步的實施方式中，B7-H3-結合分子和PD-1-結合分子是抗體。

在一個實施方式中，同時施用B7-H3-結合分子和PD-1-結合分子。如本文所使用，這類“同時”施用旨在表示： (A) 施用包含B7-H3-結合分子和PD-1-結合分子的單藥物組合物。這類分子可以是相同的分子(例如，雙特異性抗體)，或可以是不同的(例如，抗B7-H3抗體或其抗原-結合片段，和抗PD-1-抗體或其抗原-結合片段)；或 (B) 分開施用兩種或更多種藥物組合物，其中一種組合物包含特異性結合B7-H3的分子和另一種組合物包含特異性結合PD-1的分子，其中組合物在48-小時時間內施用。

在第二個實施方式中，採用兩種不同的分子，並且“按順序”施用分子(例如，施用抗B7-H3抗體，然後稍後提供抗PD-1抗體，或反之亦然)。在這樣的順序施用中，在施用第一施用的組合物之後至少48小時或更長時間施用第二施用的組合物。

提供療法或“治療 ”指有益的或期望的結果的任何指標：包括但不限於臨床結果，比如腫瘤尺寸的縮小(在癌症背景下，例如，乳腺、胃癌或前列腺癌的腫瘤)、癌細胞生長的遲緩、轉移發展的延遲、由於疾病導致的症狀的減少、遭受疾病的患者的生活品質的提高、治療疾病需要的其他藥物治療的劑量的減少、另一藥物的效果的提高，比如經靶向和/或內化、疾病的進展的延遲和/或個體的生存的延長。

治療的受試者包括動物，最優選哺乳動物物種，比如非靈長類動物(例如，牛、馬、貓科動物、犬科動物、齧齒動物等)或靈長類(例如，猴子，比如，食蟹猴、人等)。在優選的實施方式中，受試者是人。

可通過本發明的各種實施方式治療的示例性疾病包括但不限於增殖性疾病、細胞增殖性疾病和癌症(尤其是表達B7-H3的癌症)。在各種實施方式中，本發明包括用於治療、預防或管理受試者中疾病或病症的方法和組合物，包括向受試者施用治療有效量的特異性結合B7-H3的分子和特異性結合PD-1的分子。例如，B7-H3-結合分子和PD-1-結合分子尤其可用于預防、抑制、減緩原發性腫瘤的生長或復原(regression)，和癌細胞的轉移。儘管不意圖受具體作用機制的限制，但是這類結合分子可介導針對癌細胞的效應子功能、促進免疫系統針對癌細胞的啟動、交聯細胞表面抗原和/或癌細胞上的受體和增強細胞凋亡或負生長調節信號傳導，或其組合，導致腫瘤清除和/或腫瘤減小。

如本文所使用，在一個實施方式中，藥物組合物的“有效量 ”是足以實現有益的或期望的結果的量，包括，但不限於，臨床結果比如減輕由於疾病導致的症狀，減弱感染的症狀 (例如，病毒量、發熱、疼痛、膿毒症等)或癌症的症狀(例如，癌細胞的增殖、腫瘤存在、腫瘤轉移等)，從而提高遭受疾病的患者的生活品質、減少治療疾病需要的其他藥物治療的劑量、提高另一藥物的效果，比如經靶向和/或內化、延遲疾病的進展和/或延長個體的生存。當應用于單獨施用的單活性成分時，術語指單獨該成分。當應用于組合時，術語指產生療效的活性成分的組合的量，無論是否是組合施用、連續施用或同時施用。下面討論具體的劑量。

在一個實施方式中，B7-H3-結合分子(例如，抗體)和PD-1-結合分子(例如，抗體)可用於治療與B7-H3的表達相關的任何疾病或病況或特徵在於B7-H3的表達的任何疾病或病況。因此，不受限制地，本發明的方法和組合物可用於針對癌症的免疫療法，所述癌症包括特徵在於癌細胞的存在的癌症，所述癌細胞包括但不限於下述的細胞：急性髓細胞樣白血病、腎上腺腫瘤、AIDS相關的癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌症、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、促結締組織增生小圓細胞瘤、室管膜細胞瘤、尤文氏瘤、骨外粘液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、骨的纖維發育異常、膽囊癌或膽管癌、胃癌、妊娠滋養層疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、惡性膠質瘤、胰島細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性的脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、惡性間皮瘤、多發性內分泌瘤、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、鼻咽癌、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀旁腺瘤、兒科癌症、周圍神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、前列腺癌、眼色素層後黑素瘤、罕見血液學疾病、腎細胞癌、腎轉移性癌症、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌症、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌症和子宮癌。這類免疫療法可，例如，足夠減少癌細胞中的細胞分裂、延遲轉移的發展(例如，發作和程度)和/或促進免疫系統對癌細胞的活性。

尤其地，B7-H3-結合分子和PD-1-結合分子的組合尤其可用於治療頭頸的磷狀細胞癌(SCCHN)、膀胱癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、惡性膠質瘤、腎癌、肺癌，包括非小細胞肺癌(NSCLC)、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、腎細胞癌和兒童的小圓藍細胞腫瘤，包括成神經細胞瘤和橫紋肌肉瘤，其每種高度表達B7-H3。

應理解，以在生理學(例如，體內)條件下促進結合的濃度施用B7-H3-結合分子和PD-1-結合分子。可與增強或引導個體的自身免疫應答的另外的劑，比如增強ADCC或刺激T-細胞的劑，一起施用B7-H3-結合分子和PD-1-結合分子(例如，抗B7-H3和抗PD-1抗體)。

在仍另一實施方式中，B7-H3-結合分子和/或PD-1-結合分子可與放射性分子、毒素(例如，加利車黴素)、化療分子、脂質體或包含化療化合物的其他小泡綴合或結合，並且被施用至需要這種治療的個體，以使這些化合物靶向包含被B7-H3-結合分子識別的抗原的癌症細胞，因此消除癌症或患病的細胞。不限於任何具體的理論，B7-H3-結合分子(例如，抗B7-H3抗體)通過在其表面攜帶B7-H3的細胞被內化，因此將綴合部分遞送至細胞，以誘導治療作用，並且PD-1-結合分子促進免疫系統的啟動。

在仍另一實施方式中，B7-H3-結合分子和PD-1-結合分子(例如，抗B7-H3和抗PD-1抗體)可在外科去除腫瘤時用作輔助療法，以便延遲、抑制或預防轉移的發展。也可在外科手術之前施用分子(新輔助療法)，以便減小腫瘤的尺寸，因此確保外科手術能夠進行或簡化外科手術、在外科手術期間節約組織和/或減少任何產生的缺陷。

具有對FcγRIIIA和/或FcγRIIA增加的親和力，和任選地對FcγRIIB降低的親和力的Fc結構域的分子可在FcγR結合時導致增強的啟動應答，因此對於治療和/或預防癌症具有增強的治療效力。因此，包括變異的Fc結構域的B7-H3-結合分子尤其可用于治療和/或預防其中期望FcγR介導的效應細胞功能(例如，ADCC)的疾病或病症(例如，癌症)。例如，具有增強的FcγRIII結合的B7-H3-結合分子可結合細胞-表面抗原和免疫效應細胞(例如，NK細胞)上的FcγRIIIA，刺激針對細胞的效應子功能(例如，ADCC、CDC、吞噬、調理作用等)。在一些實施方式中，本文提供的B7-H3-結合分子尤其適於治療癌症。標準單克隆抗體療法的效力取決於受試者的FcgR多態性。Cartron, G.等 (2002) “Therapeutic Activity Of Humanized Anti ‐ CD20 Monoclonal Antibody And Polymorphism In IgG Fc Receptor FcgammaRIIIa Gene ,” Blood 99:754-758；Weng, W.K.等 (2003) “Two Immunoglobulin G Fragment C Receptor Polymorphisms Independently Predict Response To Rituximab In Patients With Follicular Lymphoma ,” J Clin Oncol. 21(21):3940-3947。這些受體表達在效應細胞的表面上，並且介導ADCC。高親和力等位基因改善了效應細胞介導ADCC的能力。尤其地，本文提供的B7-H3-結合分子包括展示對於效應細胞上的FcgRIIIA增強的親和力(相對於野生型Fc結構域)的變異的Fc結構域，該B7-H3-結合分子是用於患者的更好的免疫療法試劑，無論它們的FcγR多態性如何。

G. 施用和劑量

通過向受試者施用有效量的B7-H3-結合分子和PD-1-結合分子的組合或包括其的藥物組合物，這類組合可被提供用於治療、預防和改善與癌症或其他疾病或病症相關的一個或多個症狀。在下面的任何實施方式中，癌症優選地是表達B7-H3的癌症。

如本文所使用，術語“組合(聯合，combination)”指使用大於一種治療劑(例如，B7-H3-結合分子和PD-1-結合分子)。術語“組合”的使用不限制將治療劑施用至患疾病的受試者的順序，也不意味著在精確的同一時間施用劑，而是其意思是按順序和在一定的時間隔內向受試者施用劑，以便劑可用於提供比它們以其他方式施用時增加的益處。例如，每種治療劑(例如，(即， B7-H3-結合分子和PD-1-結合分子)可同時或以任何順序相繼施用和/或在不同的時間點施用，以便提供期望的治療效果或預防效果。此外，每種試劑不需要在整個治療療程中施用。例如，兩種劑可都被施用一段時間，之後中止一種劑。可分別施用每種治療劑，以任何適當的形式和通過任何適當的途徑，例如，一種通過口服途徑和一種通過腸胃外被施用。

用於提供B7-H3-結合分子和PD-1-結合分子的組合的各種遞送系統和施用路徑是可用的。可用於施用B7-H3-結合分子和PD-1-結合分子的遞送系統包括但不限於封裝在脂質體中、微粒、微膠囊、能夠表達抗體或融合蛋白的重組細胞、受體-介導內吞作用(見，例如，Wu等 (1987)“Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System,” J. Biol. Chem. 262:4429-4432)，構建核酸作為逆轉錄病毒或其他載體的一部分等。施用B7-H3-結合分子和PD-1-結合分子的方法包括但不限於腸胃外施用(例如皮內、肌肉、腹腔內、靜脈內以及皮下)、硬膜外以及粘膜(例如鼻內和口腔途徑)。在具體實施方式中，分子經肌肉、靜脈內或皮下施用。組合物可以通過任何方便途徑施用，例如通過輸注或彈丸注射、通過上皮或黏膜皮膚被覆(lining) (例如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收，並且可以與其他生物活性劑一起施用。給藥可以是全身的或局部的。另外，也可以應用肺給藥，例如通過使用吸入器或噴霧器，並且與霧化劑一起配製。見，例如，美國專利號6,019,968、5,985，320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；和PCT公開號WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346；和WO 99/66903，其每一篇通過引用以其整體併入本文。

用治療或預防有效量的B7-H3-結合分子和/或PD-1-結合分子治療受試者可包括單治療或，優選地，可包括一系列治療。例如，受試者可用B7-H3-結合分子和/或PD-1-結合分子治療，每週一次、每週兩次、每兩週一次、每三週一次、每四周一次、每六週一次、每兩個月一次，持續約2至約52周。應該理解，在具體治療的期間，用於治療的分子的有效劑量可增加或減少。如本文提供，B7-H3-結合分子和PD-1-結合分子不需要同時施用或以相同的間隔施用或持續相同的治療次數。

優選地，使用包括一個或多個劑量的治療方案施用B7-H3-結合分子和PD-1-結合分子，其中在1周、2周、3周、4周、6周、8周或大於8周內施用治療方案。在某些實施方式中，治療方案包括間歇地施用有效量的這類分子的劑量(例如，在第一周和第四周施用分子的劑量並且在第二周或第三周不施用分子的劑量)。典型地，有1、2、3、4、5或大於5個治療療程。每個療程可以是相同的方案或不同的方案。

施用至患者的B7-H3-結合分子、PD-1-結合分子或這類分子的組合的劑量通常是至少約1.0 mg/kg體重、至少約3 mg/kg體重、至少約5 mg/kg體重、至少約10 mg/kg體重、至少約15 mg/kg體重或至少約20 mg/kg。對於本發明包括的抗體，施用至患者的劑量通常是1.0 mg/kg至20 mg/kg患者的體重。優選地，施用至患者的劑量在1.0 mg/kg和20 mg/kg、1.0 mg/kg和10 mg/kg、1.0 mg/kg和5 mg/kg、2.0 mg/kg和20 mg/kg或5 mg/kg和20 mg/kg患者的體重之間。在一個實施方式中，施用至患者的劑量在1 mg/kg和15 mg/kg體重之間。在另一實施方式中，施用至患者的劑量是1 mg/kg、2mg/kg、3 mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10 mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg或15 mg/kg、16 mg/kg、17 mg/kg、18 mg/kg、19 mg/kg或20 mg/kg體重。在基線處，基於患者的體重施用計算的劑量。體重由基線或確定的穩定狀態( plateau)重量的顯著(≥ 10%)改變將提示重新計算施用的劑量。

可選地，將固定劑量的B7-H3-結合分子、PD-1-結合分子或這類分子的組合施用至患者，無論體重如何。對於本發明包括的抗體，施用至患者的固定劑量通常在50 mg至500 mg之間。優選地，施用至患者的固定劑量在50 mg和300 mg、100 mg和300 mg或100 mg和200 mg之間。在一個實施方式中，施用至患者的固定劑量是100 mg、200 mg或300 mg。

在各種實施方式中，可在施用第二(或隨後)治療劑(例如，抗B7-H3抗體或抗PD-1抗體)至患疾病的受試者之前(例如，5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、同時或之後(例如，5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之後)施用第一治療劑(例如，抗B7-H3抗體或抗PD-1抗體)。在優選的實施方式中，在相同患者隨訪期間施用兩種或更多種劑。

如本文提供的，可以不同的劑量、不同的濃度、不同時間和/或以不同的方案施用B7-H3-結合分子和PD-1-結合分子。

如上所討論，儘管可採用各種給藥方案和施用路徑，以便向需要其的接受受試者提供特異性結合B7-H3的分子和特異性結合PD-1的分子的組合。根據本發明，某些組合、給藥方案和施用路徑對於這類治療是尤其優選的。在這類給藥和施用中，抗B7-H3抗體(例如，hBRCA84D-2)，單獨地和與抗PD-1抗體(例如，派姆單抗)組合，是尤其優選的。

在某些實施方式中，每週施用抗B7-H3抗體的劑量，其聯合每兩周或三周施用的抗PD-1抗體的劑量(其中這類聯合治療方案的每個施用在本文稱為“迴圈”)。在一個實施方式中，每週施用1至15 mg/kg患者體重，優選地1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15 mg/kg體重的抗B7-H3抗體。在一個實施方式中，每兩周或三週一次施用1至10 mg/kg患者體重，優選地1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 mg/kg體重的抗PD-1抗體，或100、200或300 mg固定劑量的抗PD-1抗體，直到觀察到疾病或難處理毒性的緩解。

在尤其優選的實施方式中，每週通過IV輸注將抗B7-H3抗體施用至受試者並且每兩周或三周通過IV輸注將抗PD-1抗體施用至受試者，持續至少1個月或更長時間、至少3個月或更長時間或至少6個月或更長時間或至少12個月或更長時間。尤其優選治療持續時間是至少6個月或更長時間，或至少12個月或更長時間，或直到觀察到疾病或難處理毒性的緩解。在這類每兩周或三週一次的IV施用中，抗B7-H3抗體和抗PD-1抗體可一起施用或順序施用。在尤其優選的實施方式中，以不大於48小時間隔，通過IV輸注將抗B7-H3抗體和抗PD-1抗體順序施用至受試者。在這類順序施用中，抗B7-H3抗體可在施用抗PD-1抗體之前或之後施用。

尤其優選地，為受試者提供多個劑量的抗B7-H3抗體和抗PD-1抗體的聯合治療。治療方案可因此包括1個迴圈、至少2個迴圈或大於2個迴圈、至少3個迴圈或大於3個迴圈、至少4個迴圈或大於4個迴圈、至少5個迴圈或大於5個迴圈或至少6個迴圈或大於6個迴圈。每個這樣的迴圈中的每種抗體的劑量可以相同或可與之前施用的劑量不同。在每種這樣的迴圈中，每種抗體的劑量可以相同或可與之前的施用劑量不同。

優選地，不以IV推注或IV團注施用抗體，但是這樣的施用通過IV輸注實現。因此，抗體優選地被稀釋至包括適當的稀釋劑，例如，0.9%氯化鈉的輸注袋中。因為可能發生輸注或過敏反應，所以推薦用於預防這類輸注反應的術前用藥並且應在抗體施用期間觀察防範過敏。尤其優選地，在30分鐘和24小時之間的時期內向受試者施用IV輸注。在某些實施方式中，如果受試者不展示不利的輸注反應的徵兆或症狀，IV輸注優選地在30-180分鐘或30-120分鐘或30-90分鐘內或60分鐘或更短的時間段內遞送。

因此，提供了優選的治療癌症的方法，該方法包括向需要其的受試者施用抗B7-H3抗體和抗PD-1抗體的組合，其中抗B7-H3抗體以每週1至15 mg/kg體重的劑量被施用並且抗PD-1抗體以每三周200 mg的固定劑量被施用。在一個實施方式中，抗B7-H3抗體以1、3、10或15 mg/kg體重的劑量被施用。在進一步的實施方式中，抗B7-H3抗體以每週1 mg/kg的劑量被施用和抗PD-1抗體以每三周200 mg的固定劑量被施用。在進一步的實施方式中，抗B7-H3抗體以每週3 mg/kg體重的劑量被施用和抗PD-1抗體以每三周200 mg的固定劑量被施用。在進一步的實施方式中，抗B7-H3抗體以每週10 mg/kg體重的劑量被施用和抗PD-1抗體以每三周200 mg的固定劑量被施用。在進一步的實施方式中，抗B7-H3抗體以每週15 mg/kg體重的劑量被施用和抗PD-1抗體以每三周200 mg的固定劑量被施用。在任何上述實施方式中，通過IV輸注施用抗B7-H3抗體和抗PD-1抗體，並且當在同一周施用時，二者可在48小時內，優選地24小時內施用。

提供了治療癌症的另一優選的方法，該方法包括向需要其的受試者施用抗B7-H3抗體和抗PD-1抗體的組合，其中抗B7-H3抗體的劑量是每週1至15 mg/kg體重，並且抗PD-1抗體的劑量是每兩周或三周1至10 mg/kg體重。在一個實施方式中，抗B7-H3抗體的劑量是1、3、10或15 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，抗PD-1抗體的劑量是1、2、3或10 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，抗B7-H3抗體的劑量是1 mg/kg體重並且抗PD-1抗體的劑量是1 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，抗B7-H3抗體的劑量是1 mg/kg並且抗PD-1抗體的劑量是2 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，抗B7-H3抗體的劑量是1 mg/kg體重並且抗PD-1抗體的劑量是3 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，抗B7-H3抗體的劑量是1 mg/kg並且抗PD-1抗體的劑量是10 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，抗B7-H3抗體的劑量是3 mg/kg體重並且抗PD-1抗體的劑量是1 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，抗B7-H3抗體的劑量是3 mg/kg體重並且抗PD-1抗體的劑量是2 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，抗B7-H3抗體的劑量是3 mg/kg體重並且抗PD-1抗體的劑量是3 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，抗B7-H3抗體的劑量是3 mg/kg體重並且抗PD-1抗體的劑量是10 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，抗B7-H3抗體的劑量是10 mg/kg體重並且抗PD-1抗體的劑量是1 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，抗B7-H3抗體的劑量是10 mg/kg體重並且抗PD-1抗體的劑量是2 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，抗B7-H3抗體的劑量是10 mg/kg體重並且抗PD-1抗體的劑量是3 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，抗B7-H3抗體的劑量是10 mg/kg體重並且抗PD-1抗體的劑量是10 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，抗B7-H3抗體的劑量是15 mg/kg體重並且抗PD-1抗體的劑量是1 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，抗B7-H3抗體的劑量是15 mg/kg體重並且抗PD-1抗體的劑量是2 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，抗B7-H3抗體的劑量是15 mg/kg體重並且抗PD-1抗體的劑量是3 mg/kg體重。在進一步的實施方式中，抗B7-H3抗體的劑量是15 mg/kg體重並且抗PD-1抗體的劑量是10 mg/kg體重。在任何上述實施方式中，通過IV輸注施用抗B7-H3抗體和抗PD-1抗體，並且每兩周或三週一次，可在48小時、優選地24小時時間內施用。

在任何上述實施方式中，抗B7-H3抗體包括hBRCA84D、hBRCA69D、PRCA157的CDR_L 1、CDR_L 2、CDR_L 3、CDR_H 1、CDR_H 2和CDR_H 3結構域或表 5 中提供的任何抗B7-H3抗體的CDR_L 1、CDR_L 2、CDR_L 3、CDR_H 1、CDR_H 2和CDR_H 3結構域，並且抗PD-1抗體包括PD-1 mAb 1、PD-1 mAb 2、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 4、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb 7、PD-1 mAb 8的CDR_L 1、CDR_L 2、CDR_L 3、CDR_H 1、CDR_H 2和CDR_H 3結構域，或表 6 中提供的任何抗PD-1抗體的CDR_L 1、CDR_L 2、CDR_L 3、CDR_H 1、CDR_H 2和CDR_H 3結構域。在任何上述實施方式中，抗B7-H3抗體是hBRCA84D-2並且抗PD-1抗體選自表 6 中提供的抗體。在優選的實施方式中，抗B7-H3抗體是hBRCA84D-2並且抗PD-1抗體是派姆單抗。在另一優選的實施方式中，抗B7-H3抗體是hBRCA84D-2並且抗PD-1抗體是尼伏魯單抗。在另一優選的實施方式中，抗B7-H3抗體是hBRCA84D-2並且抗PD-1抗體是匹地利珠單抗。在另一優選的實施方式中，抗B7-H3抗體是hBRCA84D-2並且抗PD-1抗體是PD-1 mAb 6-ISQ。

在任何上述實施方式中，將治療劑優選地迴圈施用至受試者。迴圈療法可減少發展對一種或多種療法的抗性，避免或減少一種療法的副作用，和/或改善治療的效力。示例性迴圈是約每週一次，約每10天一次，約每兩週一次，和約每三週一次。每個迴圈可包括至少1周的休息、至少2周的休息、至少3周的休息等。施用的迴圈的數量是約1至約12個迴圈，更通常約2至約10個迴圈，和更通常約2至約8個迴圈。

如在上面任何實施方式中提供的用於治療劑施用的優選的劑量方案，包括在初始迴圈和一個或多個隨後的迴圈中，向接受受試者施用抗B7-H3抗體和抗PD-1抗體的這類組合。在上面提供的任何實施方式中，在同一迴圈方案中施用抗B7-H3抗體和抗PD-1抗體。在這類實施方式中，每個迴圈包括兩周或三周，其中以每週施用向受試者提供抗B7-H3抗體，並且在每個2周或3周週期的第一周向受試者提供抗PD-1抗體。可選地，以不同的迴圈方案施用抗B7-H3抗體和抗PD-1抗體。在這類實施方式中，用於抗PD-1抗體的每個迴圈包括兩周或三周，其中在每個2周或3周週期的第一周向受試者提供抗PD-1抗體。在這類實施方式中，用於抗B7-H3抗體的初始迴圈優選地包括8周，其中，在這樣的8周初始週期的前四周，以每週施用向受試者提供抗B7-H3抗體，隨後在這樣的8周初始週期的5-8周的時間，不向受試者施用。每個隨後迴圈優選地包括4周時間段，其中在這樣的4周隨後週期的前三周，以每週施用向受試者提供抗B7-H3抗體，隨後在這樣的4周隨後週期的第4周時間段，不向受試者施用。因此，例如，在1、2、3、4、9、10、11、13、14、15周等等中，受試者每週將接收B7-H3抗體，其中第1-8周是初始劑量方案迴圈，第9-12周是第一隨後的迴圈，第13-16周是第二隨後的迴圈等。

聯合療法

本發明進一步包括向受試者施用特異性結合B7-H3的分子和特異性結合PD-1的分子的組合，其進一步與本領域技術人員已知的用於治療或預防癌症、自身免疫性疾病、炎症或感染疾病的其他療法組合，所述其他療法包括但不限於當前的標準和實驗化學療法、激素療法、生物療法、免疫療法、放射療法或外科手術。在一些實施方式中，B7-H3-結合分子和PD-1-結合分子(例如，抗B7-H3抗體和抗PD-1抗體)的組合聯合治療或預防有效量的一種或多種另外的治療劑被施用，本領域技術人員已知所述另外的治療劑用於治療和/或預防癌症(尤其是表達B7-H3的癌症)。

在用於治療細胞增殖性疾病的實施方式中，B7-H3-結合分子和/或PD-1-結合分子(例如，抗B7-H3抗體、抗PD-1抗體)與另一治療劑綴合，或進一步聯合另一治療劑施用，所述另一治療劑比如，但不限於烷基化劑(例如，氮芥或順鉑)、血管生成抑制劑、蒽環類抗生素(例如，柔紅黴素/道諾黴素或多柔比星)、抗生素(例如，放線菌素D、博來黴素或安麯黴素)、抗體(例如，抗VEGF抗體比如貝伐單抗(由Genentech, Inc.以AVASTIN®出售)、抗EGFR抗體比如帕尼單抗(由Amgen, Inc.以VECTIBIX^TM 出售)或抗整聯蛋白抗體，比如那他珠單抗(由 Biogen Idec and Elan Pharmaceuticals, Inc.以TYSABRI®出售))、抗代謝物(例如，氨甲喋呤或5-氟尿嘧啶)、抗有絲分裂劑(例如，長春新堿或紫杉醇)、細胞毒素(例如，細胞抑制劑或殺細胞劑)、激素治療劑(例如，選擇性雌激素受體調節劑(例如，他莫昔芬或雷洛昔芬)、芳香酶抑制劑、促黃體激素-釋放激素類似物、促孕劑、腎上腺皮質固醇、雌激素、雄激素、抗雌激素試劑、雄激素受體阻斷劑、5-α還原酶抑制劑、腎上腺產生抑制劑等)、基質金屬蛋白酶抑制劑、放射性元素(例如，α-發射體、γ-發射體等)或任何其他化療劑。

適當的血管生成抑制劑的非限制性例子包括ABT-627、血管生長抑制素(血纖維蛋白溶酶原片段)；抗血管生成RNA構成酶(angiozyme）；抗血管生成抗凝血酶III；Bay 12-9566；氟草胺；貝伐單抗；BMS-275291；雙膦酸鹽；軟骨衍生的抑制劑(CDI)；CAI；CD59補體片段；CEP-7055；Col 3；考布他汀A-4；內皮抑制素(膠原蛋白XVIII片段)；法呢基轉移酶抑制劑(FTI)；纖連蛋白片段；gro-β；鹵夫酮；肝素酶；肝素多聚己糖片段；HMV833；人絨膜促性腺素(hCG)；IM-862；干擾素α/β/γ；干擾素可誘導的蛋白質(IP-10)；白介素-12；絞鏈區5 (kringle 5) (血纖維蛋白溶酶原片段)；馬立馬司他；金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)；2-甲氧雌二醇；MMI 270 (CGS 27023A)；MoAb IMC-1C11；新伐司他；NM-3；panzem；PI-88；胎盤核糖核酸酶抑制劑；血纖維蛋白溶酶原啟動抑制劑；血小板因數-4 (PF4)；普馬司他；催乳素16kDa片段；增殖蛋白相關的蛋白質(PRP)；PTK 787/ZK 222594；類視黃醇；索利司他；角鯊胺；SS 3304；SU 5416；SU6668；SU11248；四氫皮質醇-S；四硫鉬酸鹽；沙利度胺；血小板反應蛋白-1 (TSP-1)；TNP-470；轉化生長因數β (TGF-b)；血管抑制素(vasculostatin)；血管形成抑制素(鈣網蛋白片段)；ZD6126和ZD 6474。

用於治療細胞增生性病症的另外的抗體的非限制性例子包括針對下述的抗體：17-1A、αvβ₃ 、AFP、CD3、CD18、CD20、CD22、CD33、CD44、CD52、CEA、CTLA-4、DNA相關的蛋白質、EGF受體、Ep-CAM、GD2-神經節苷脂、gp IIIb/IIIa、gp72、HLA-DR 10β、HLA-DR抗原、IgE、神經節苷脂GD3、MUC-1、nuC242、PEM抗原、SK-1抗原、腫瘤抗原CA125、腫瘤抗原MUC1、VEGF和VEGF-受體。

實施例

現在已經大體上描述了本發明，通過參考下述實施例，本發明將被更容易理解，通過示例的方式提供實施例而不旨在限制本發明，除非另外指出。

實施例 1

抗 B7-H3 抗體和抗 PD-1 抗體的組合的劑量遞增研究

儘管下面的劑量遞增研究方案詳細描述了示例性抗B7-H3抗體“hBRCA84D-2”聯合抗PD-1抗體“派姆單抗”的使用，但是應理解，鑒於本文的教導，可使用本文提供的任何抗B7-H3抗體和抗PD-1抗體設計類似的組合方案。

進行劑量遞增研究，以確定每週施用的遞增劑量的hBRCA84D-2聯合每三周施用的2 mg/kg劑量的派姆單抗的最大耐受劑量(MTD)或最大施用劑量(MAD) (如果沒有定義MTD)。這隨後可以是組擴展階段(cohort expansion phase)，以進一步定義與在劑量遞增研究中確定的hBRCA84D-2劑量的組合的安全性和初始效力。每週施用hBRCA84D-2，並且每3週一次施用派姆單抗。每3週一次，在同一天施用劑，其中先施用派姆單抗，隨後施用hBRCA84D-2。但是，在組合劑量超過2,500 mg的情況下，應在連續的天數施用抗體。當在連續的天數施用抗體時，可在第一天施用派姆單抗，並且可在接下來的日曆日施用hBRCA84D-2。療法的每個迴圈限定為3周，其中在第1、8和15天給予hBRCA84D-2，並且在第1天給予派姆單抗。可在研究期間進行腫瘤評估，優選地，在前兩個迴圈結束時，並且在治療的每個隨後三個迴圈結束時(即，在6周之後[迴圈2結束時]和在15周、24周、33周等之後[迴圈5、8、11結束時等])。

可以在組患者中，以三個相繼遞增的劑量，3 mg/kg體重、10 mg/kg和15 mg/kg體重，聯合2 mg/kg派姆單抗評估hBRCA84D-2。如果確定在第一劑量組中超過了MTD，則可聯合2 mg/kg派姆單抗使用劑量遞減組來評估較低劑量的hBRCA84D-2 (1 mg/kg)。

對於組擴展階段，招募另外的患者，其將以從研究的劑量遞增階段確定的MTD (或MAD)接收hBRCA84D-2聯合2 mg/kg的派姆單抗。

在前兩個3-周迴圈結束時，仍是臨床上穩定化的並且不經歷迫使永遠終止研究藥物的不可接受的毒性的患者將有資格接收通過hBRCA84D-2和派姆單抗的另外的治療。仍是臨床上穩定的、保持對穩定疾病的應答狀態或更好並且不經歷迫使永遠終止研究藥物的不可接受的毒性的患者，患者可接收hBRAC84D-2和派姆單抗的另外的治療迴圈。這類另外的治療可持續約一年，以便患者可接收51個劑量的hBRCA84D-2和17個劑量的派姆單抗。

本說明書提到的所有出版物和專利通過參考併入本文，達到如同具體和單獨指出每個單個出版物或專利申請通過參考以其整體併入的相同程度。儘管已經結合其具體實施方式描述了本發明，但是應當理解，其能夠被進一步修改，並且本申請旨在覆蓋大體上根據本發明原理並且包括與本公開的偏離的本發明的任何變型、用途或改變，只要在本發明所屬領域的已知或習慣實踐內並且如可應用至本文之前所闡釋的本質特徵。

無

無

Claims (33)

1. 一種治療癌症的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用： (a)              特異性結合B7-H3的分子，和 (b)              特異性結合PD-1的分子。
2. 如請求項1所述的方法，其中所述特異性結合B7-H3的分子是抗B7-H3抗體或其抗原-結合片段，並且所述特異性結合PD-1的分子是抗PD-1抗體或其抗原-結合片段。
3. 如請求項2所述的方法，其中所述抗B7-H3抗體或其抗原-結合片段： (a)   與BRCA84D、BRCA69D、PRCA157競爭B7-H3結合或與選自表5的抗B7-H3抗體競爭B7-H3結合；或 (b)  具有BRCA84D、hBRCA84D (1.1)、hBRCA84D (2.2)、hBRCA84D-2、hBRCA69D (1.1)、hBRCA (2.2)的三個重鏈CDR和三個輕鏈CDR，或具有選自表5的抗B7-H3抗體的三個重鏈CDR和三個輕鏈CDR；或 (c)   具有BRCA84D、hBRCA84D (1.1)、hBRCA84D (2.2)、hBRCA84D-2、hBRCA69D (1.1)、hBRCA (2.2)的重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，或具有選自表5的抗B7-H3抗體的重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域。
4. 如請求項2至3中任一項所述的方法，其中所述抗PD-1抗體或其抗原-結合片段： (a)   與尼伏魯單抗、派姆單抗、匹地利珠單抗、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb7、PD-1 mAb 8競爭PD-1結合，或與選自表6的抗PD-1抗體競爭PD-1結合；或 (b)  具有尼伏魯單抗、派姆單抗、匹地利珠單抗、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb7、PD-1 mAb 8的三個重鏈CDR和三個輕鏈CDR，或具有選自表6的抗PD-1抗體的三個重鏈CDR和三個輕鏈CDR；或 (c)   具有尼伏魯單抗、派姆單抗、匹地利珠單抗、PD-1 mAb 3、PD-1 mAb 5、PD-1 mAb 6、PD-1 mAb7、PD-1 mAb 8的重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，或具有選自表6的抗PD-1抗體的重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域。
5. 如請求項2至4中任一項所述的方法，其中所述抗B7-H3抗體或其抗原-結合片段包括Fc結構域，並且所述抗PD-1抗體或其抗原-結合片段包括Fc結構域。
6. 如請求項5所述的方法，其中所述抗B7-H3抗體或其抗原-結合片段包括在Fc結構域具有增強ADCC的至少一個修飾的變異的Fc結構域。
7. 如請求項5或6所述的方法，其中所述抗PD-1抗體或其抗原-結合片段包括： (a)   變異的Fc結構域，其在所述Fc結構域中具有降低或消除ADCC活性的至少一個修飾；或 (b)  IgG4 Fc結構域。
8. 如請求項2至7中任一項所述的方法，其中所述抗B7-H3抗體是hBRCA84D-2並且所述抗PD-1抗體是尼伏魯單抗、派姆單抗、匹地利珠單抗或PD-1 mAb 6-ISQ。
9. 如請求項2至8中任一項所述的方法，其中所述抗B7-H3抗體以每週1-15 mg/kg體重的劑量被施用，並且所述抗PD-1抗體以每兩周或三周200 mg的固定劑量或以1-10 mg/kg體重的劑量被施用。
10. 如請求項9所述的方法，其中所述抗B7-H3抗體以每週1 mg/kg體重、3 mg/kg體重、10 mg/kg體重或15 mg/kg體重的劑量被施用。
11. 如請求項9或10所述的方法，其中所述抗B7-H3抗體以每週1 mg/kg體重、3 mg/kg體重、10 mg/kg體重或15 mg/kg體重的劑量被施用，並且所述抗PD-1抗體以每兩周或三周1 mg/kg體重、2 mg/kg體重、3 mg/kg體重或10 mg/kg體重的劑量被施用。
12. 如請求項10或11所述的方法，其中所述抗B7-H3抗體以每週3 mg/kg體重、10 mg/kg體重或15 mg/kg體重的劑量被施用，並且所述抗PD-1抗體以每三周2 mg/kg體重的劑量被施用。
13. 如請求項10或11所述的方法，其中所述抗B7-H3抗體以每週3 mg/kg體重、10 mg/kg體重或15 mg/kg體重的劑量被施用，並且所述抗PD-1抗體以每兩周3 mg/kg體重的劑量被施用。
14. 如請求項10或11所述的方法，其中所述抗B7-H3抗體以每週3 mg/kg體重、10 mg/kg體重或15 mg/kg體重的劑量被施用，並且所述抗PD-1抗體以每兩周10 mg/kg體重的劑量被施用。
15. 如請求項1至11中任一項所述的方法，其中每兩周施用所述抗PD-1抗體。
16. 如請求項1至11中任一項所述的方法，其中每三周施用所述抗PD-1抗體。
17. 如請求項2至16中任一項所述的方法，其中所述抗B7-H3抗體和所述抗PD-1抗體通過IV輸注被施用。
18. 如請求項1至12、16和17中任一項所述的方法，其中每三周在48小時時期內施用所述抗B7-H3抗體和所述抗PD-1抗體。
19. 如請求項2至11、13至15或17中任一項所述的方法，其中每兩周在48小時時期內施用所述抗B7-H3抗體和所述抗PD-1抗體。
20. 如請求項1至19中任一項所述的方法，其中所述癌症是表達B7-H3的癌症。
21. 如請求項20所述的方法，其中所述表達B7-H3的癌症是其中表達B7-H3的頭頸部的鱗狀細胞癌(SCCHN)、膀胱癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、惡性膠質瘤、腎癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、腎細胞癌、小圓藍細胞瘤、成神經細胞瘤或橫紋肌肉瘤。
22. 如請求項1至21中任一項所述的方法，其中所述治療進一步包括施用第三治療劑的步驟，其中所述第三治療劑選自抗血管生成劑、抗腫瘤劑、化療劑和細胞毒性劑。
23. 如請求項2至22中任一項所述的方法，其中所述抗B7-H3抗體是hBRCA84D-2。
24. 如請求項2至23中任一項所述的方法，其中所述抗PD-1抗體是派姆單抗。
25. 如請求項2至23中任一項所述的方法，其中所述抗PD-1抗體是尼伏魯單抗。
26. 如請求項2至23中任一項所述的方法，其中所述抗PD-1抗體是匹地利珠單抗。
27. 如請求項2至23中任一項所述的方法，其中所述抗PD-1抗體包括PD-1 mAb 3的VH結構域和VL結構域。
28. 如請求項2至23中任一項所述的方法，其中所述抗PD-1抗體包括PD-1 mAb 5的VH結構域和VL結構域。
29. 如請求項2至23中任一項所述的方法，其中所述抗PD-1抗體包括PD-1 mAb 6的VH結構域和VL結構域。
30. 如請求項29所述的方法，其中所述抗PD-1抗體是mAb 6 ISQ。
31. 如請求項2至23中任一項所述的方法，其中所述抗PD-1抗體包括PD-1 mAb 7的VH和VL。
32. 如請求項2至23中任一項所述的方法，其中所述抗PD-1抗體包括PD-1 mAb 8的VH結構域和VL結構域。
33. 如請求項2至23中任一項所述的方法，其中所述抗PD-1抗體選自表6。