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TW201938192A - 雙特異性ｃｄ１６-結合分子及其在疾病治療中的用途 - Google Patents

雙特異性ｃｄ１６-結合分子及其在疾病治療中的用途 Download PDF

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TW201938192A
TW201938192A TW107144245A TW107144245A TW201938192A TW 201938192 A TW201938192 A TW 201938192A TW 107144245 A TW107144245 A TW 107144245A TW 107144245 A TW107144245 A TW 107144245A TW 201938192 A TW201938192 A TW 201938192A
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Abstract

本發明涉及能夠結合人CD16的表位的分子(例如，抗體、雙抗體、scFv、抗體、TandAb等) (“CD16結合分子”)。本發明進一步涉及能夠結合人CD16的表位和疾病抗原(“DA”) 的一個或多個表位的CD16結合分子(例如，“CD16 x DA結合分子”)。本發明特別地涉及這樣的CD16 x DA結合分子，其是抗體，或者包含其表位元結合結構域，或者是雙抗體(包括DART®雙抗體)、雙特異性抗體、TandAbs、其它多特異性結合分子(例如，三價TRIDENT™分子)等。本發明特別地涉及除了能夠結合CD16外還能夠結合疾病抗原即癌抗原或病原體相關抗原的CD16 x DA結合分子。本發明特別地涉及這種CD16和CD16 x DA結合分子在治療癌症和病原體相關疾病中的用途。本發明也涉及包括這種分子的藥物組合物。

Description

雙特異性CD16-結合分子及其在疾病治療中的用途
[相關申請的交叉引用]
本申請案主張美國專利申請序號62/597,800(在2017年12月12日提交；申請中)的優先權，該申請通過引用以其全部併入本文。
[序列表的引用]
本申請案按照37 C.F.R. 1.821以及以下各條包括一個或多個序列表，其在電腦可讀介質上公開(檔案名：1301_0153PCT_Sequence_Listing_ST25.txt，創建於2018年12月4日，具有276,384個位元組的大小)，其檔案通過引用以其全部併入本文。
本發明涉及能夠結合人CD16的表位的分子(例如，抗體、雙抗體、scFv、抗體、TandAb等)(“CD16結合分子”)。本發明進一步涉及能夠結合人CD16的表位和疾病抗原(“DA”)的一個或多個表位的CD16結合分子(例如，“CD16 x DA結合分子”)。本發明特別地涉及這樣的CD16 x DA結合分子，其為抗體或者包括其表位元結合結構域，或者為雙抗體(包括DART®雙抗體)、雙特異性抗體、TandAb、其它多特異性結合分子(例如，三價TRIDENT™分子)等。本發明特別地涉及CD16 x DA結合分子，所述CD16 x DA結合分子除了能夠結合CD16外還能夠結合疾病抗原，所述疾病抗原是癌抗原或病原體相關抗原。本發明特別地涉及這種CD16和CD16 x DA結合分子在治療癌症和病原體相關疾病中的用途。本發明也涉及包括這類分子的藥物組合物。
哺乳動物免疫系統充當抵禦各種病況、包括例如損傷、感染和瘤形成的防衛。人和其它哺乳動物形成對病原體、外來物質和癌抗原的免疫學應答的效率取決於兩種特徵：對抗原識別的免疫應答的高度特異性以及在用相同抗原重新啟動後允許更快且更強的應答的免疫學記憶(Portolés, P.等(2009) “The TCR/CD3 Complex: Opening the Gate to Successful Vaccination,” Current Pharmaceutical Design 15:3290-3300；Guy, C.S.等(2009) “Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex,” Immunol Rev. 232(1):7-21；Topalian, S.L.等(2015) “Immune Checkpoint Blockade: A Common Denominator Approach to Cancer Therapy,” Cancer Cell 27:450-461)。
在健康個體中，免疫系統處於靜息狀態，受到許多不同抑制性受體和受體配體的抑制。一旦識別到癌抗原、微生物病原體或過敏原，一系列啟動受體和受體配體被觸發以誘導免疫系統的啟動。這種啟動導致巨噬細胞、自然殺傷(NK)細胞和抗原特異性的、細胞毒性的T-細胞的啟動，並且促進各種細胞因數的釋放，其全部具有對抗所察覺到的對受試者健康的威脅的作用(Dong, C.等(2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules ,” Immunolog. Res. 28(1):39-48；Viglietta, V.等(2007) “Modulating Co-Stimulation ,” Neurotherapeutics 4:666-675；Korman, A.J.等(2007) “Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy ,” Adv. Immunol. 90:297-339)。當抗衡抑制性免疫信號勝過啟動免疫信號時，免疫系統能夠返回到其正常靜息狀態。
因此，癌症的疾病狀態(以及實際上傳染病的疾病狀態)可被認為反映出未能充分啟動受試者的免疫系統。這種故障可反映啟動免疫信號的呈現不足，或者它可反映減弱受試者中的抑制性免疫信號的能力不足。在一些情況下，研究者已經確定癌症細胞可以拉攏免疫系統以避免被免疫系統檢測到(Topalian, S.L.等(2015) “Immune Checkpoint Blockade: A Common Denominator Approach to Cancer Therapy ,” Cancer Cell 27:450-461)。
涉及免疫系統啟動的受體有Fc受體：CD16、CD32和CD64。這些Fc受體見於多種類型的免疫系統細胞(例如，B淋巴細胞、濾泡樹突細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞和肥大細胞)的表面上。這種受體具有“胞外 ”部分(其因此能夠連接到Fc區)、“跨膜 ”部分(其延伸通過細胞膜)、和“細胞質 ”部分(位於細胞內部)。已經鑒定了多種類型的FcγR：CD16A (FcγRIIIA )、CD16B (FcγRIIIB )、CD32A (FcγRIIA )、CD32B (FcγRIIB )、和CD64 (FcγRI )。這些受體結合IgG抗體的Fc部分，由此觸發啟動或抑制性信號轉導至免疫系統。
CD16 是啟動Fc受體FcγRIIIA (CD16A )和FcγRIIIB (CD16B )的總稱。這些受體結合IgG抗體的Fc部分，由此觸發細胞因數的釋放。如果這種抗體被結合至在細胞(例如，癌症細胞、病原體感染的細胞等)表面上表達的疾病抗原，那麼這種釋放介導殺死靶細胞。
CD16A 由結合聚集的而非單體的人IgG的自然殺傷(NK)細胞和組織巨噬細胞表達(Selvaraj, P.等(2004) “Functional Regulation Of Human Neutrophil Fc Gamma Receptors ,” Immunol Res. 29(1-3):219-230；Peltz, G.A.等(1989) “Human Fc Gamma RIII: Cloning, Expression, And Identification Of The Chromosomal Locus Of Two Fc Receptors For IgG ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86(3):1013-1017；Bachanova, V.等(2014) “NK Cells In Therapy Of Cancer ,” Crit. Rev. Oncog. 19(1-2):133-141；Miller, J.S. (2013) “Therapeutic Applications: Natural Killer Cells In The Clinic ,” Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2013:247-253；Youinou, P.等(2002) “Pathogenic Effects Of Anti-Fc Gamma Receptor IIIB (CD16) On Polymorphonuclear Neutrophils In Non-Organ-Specific Autoimmune Diseases ,” Autoimmun Rev. 1(1-2):13-19；Peipp, M.等(2002) “Bispecific Antibodies Targeting Cancer Cells ,” Biochem. Soc. Trans. 30(4):507-511；Unkeless, J.C.等(1995) “Function Of Human Fc Gamma RIIA And Fc Gamma RIIIB ,” Semin. Immunol. 7(1):37-44)。
由自然殺傷(NK)細胞表達CD16A尤其與本發明相關，因為這種細胞當它們的CD16分子結合至抗體的Fc區時釋放細胞因數。因此，當天然抗體結合至靶細胞的疾病抗原時，其Fc區可被自然殺傷細胞的CD16分子識別，其然後介導靶細胞的殺傷。因為這種殺傷是抗體依賴性的，所以它被稱為抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC) 。ADCC因此依賴於之前的抗體應答，並且如所述，要求表達FcγR的效應細胞(典型地自然殺傷(NK)細胞，以及巨噬細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞)的存在和參與。CD16A通過與NK細胞的CD ξ蛋白相互作用發送ADCC信號，並且通過與巨噬細胞FcγR鏈相互作用發送巨噬細胞介導的殺傷的信號。
CD16A具有兩種主要的多態形式F158 和V158 ，其區別在於在殘基158處具有苯丙氨酸或纈氨酸(如CD16A的胞外結構域的殘基160所示(圖 7 )，其對應於全長蛋白的殘基176 (Wu, J.等(1997) “A Novel Polymorphism of FcγRIIIa (CD16) Alters Receptor Function and Predisposes to Autoimmune Disease ,” J. Clin.Invest. 100(5):1059-1070；Ravetch, J. V.等(1989) “Alternative Membrane Forms Of FcγRIII(CD16) On Human Natural Killer Cells And Neutrophils ,” J. Exper. Med. 170:481-497；Koene, H.R.等(1997) “FcγRIIIa-158V/F Polymorphism Influences the Binding of IgG by Natural Killer Cell FcγRIIIa, Independently of the FcγRIIIa-48L/R/H Phenotype ,” Blood, 90(3):1109-1114；van Sorge, N.M. (2003) “FcgammaR Polymorphisms: Implications For Function, Disease Susceptibility And Immunotherapy ,” Tissue Antigens 61(3):189-202；Fijen, C.A. (2000) “The Role Of Fcgamma Receptor Polymorphisms And C3 In The Immune Defence Against Neisseria Meningitidis In Complement-Deficient Individuals ,” Clin. Exp. Immunol. 120(2):338-345)。50%的高加索人對於苯丙氨酸多態性是純合的(F158/F158)，而39%高加索人對於這種多態性是雜合的(F158/V158)以及11%的高加索人對於纈氨酸多態性是純合的(V158/V158)。
CD16B 在中性粒細胞上表達，並且錨定到糖基磷脂醯肌醇 (“GPI- 錨定的 ”) (Meknache, N.等(2009) “Human Basophils Express The Glycosylphosphatidylinositol-Anchored Low-Affinity IgG Receptor FcgammaRIIIB (CD16B) ,” J. Immunol. 182(4):2542-2550；Fernandes, M.J.等(2006) “CD16b Associates With High-Density, Detergent-Resistant Membranes In Human Neutrophils ,” Biochem. J. 393(Pt 1):351-359；Selvaraj, P.等(2004) “Functional Regulation Of Human Neutrophil Fc Gamma Receptors ,” Immunol Res. 29(1-3):219-230；Unkeless, J.C.等(1995) “Function Of Human Fc Gamma RIIA And Fc Gamma RIIIB ,” Semin. Immunol. 7(1):37-44)。儘管被認為是誘餌受體，但是它也可傳遞信號(Fernandes, M.J. (2005) “Signaling Through CD16b In Human Neutrophils Involves The Tec Family Of Tyrosine Kinases ,” J. Leukoc. Biol. 78(2):524-532)，並且在細胞啟動後通過ADAM17下調/切割(Wang, Y.等(2013) “ADAM17 Cleaves CD16b (FcγRIIIb) In Human Neutrophils ,” Biochim. Biophys. Acta 1833(3):680-685；Guo, S.等(2012) “Role of ADAM10 and ADAM17 in CD16b Shedding Mediated By Different Stimulators ,” Chin. Med. Sci. J. 27(2):73-79)。
CD16B具有兩種主要的多態形式NA1 和NA2 ，其對於IgG1和IgG3亞類呈現不同的結合親和力(Bournazos, S.等(2010) “Fcγ Receptor IIIb (CD16b) Polymorphisms Are Associated With Susceptibility To Idiopathic Pulmonary Fibrosis ,” Lung 188(6):475-481；van Sorge, N.M. (2003) “FcgammaR Polymorphisms: Implications For Function, Disease Susceptibility And Immunotherapy ,” Tissue Antigens 61(3):189-202)。13%的高加索人和16%的印度人對於NA1多態性是純合的(NA1/NA1)，而55%的高加索人和28%的印度人對於這種多態性是雜合的(NA1/NA2)以及32%的高加索人和55%的印度人對於NA2多態性是純合的(NA2/NA2)。人CD16A和CD16B同種異型的比對顯示在圖7 中。
CD32A (FcγRIIA ) (Brandsma, A.M. (2015) “Fc Receptor Inside-Out Signaling And Possible Impact On Antibody Therapy ,” Immunol Rev. 268(1):74-87；van Sorge, N.M.等(2003) “FcgammaR Polymorphisms: Implications For Function, Disease Susceptibility And Immunotherapy ,” Tissue Antigens 61(3):189-202；Selvaraj, P.等(2004) “Functional Regulation Of Human Neutrophil Fc Gamma Receptors ,” Immunol. Res. 29(1-3):219-230)和CD64 (FcγRI ) (Lu, S.等(2015) “Structural Mechanism Of High Affinity FcγRI recognition Of Immunoglobulin G ,” Immunol. Rev. 268(1):192-200；Swisher, J.F.等(2015) “The Many Faces Of FcγRI: Implications For Therapeutic Antibody Function ,” Immunol. Rev. 268(1):160-174；Thepen, T.等(2009) “Fcgamma Receptor 1 (CD64), A Target Beyond Cancer ,” Curr. Pharm. Des. 15(23):2712-2718；Rouard, H.等(1997) “Fc Receptors As Targets For Immunotherapy ,” Int. Rev. Immunol. 16(1-2):147-185)是在巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和樹突細胞上(對於CD32A ，也在血小板和朗格罕細胞上)表達的啟動型Fc受體。相反，CD32B (FcγRIIB )是在B淋巴細胞(巨噬細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞)上表達的抑制型Fc受體(Stopforth, R.J.等(2016) “Regulation of Monoclonal Antibody Immunotherapy by FcγRIIB ,” J. Clin. Immunol. [2016 Feb 27 Epub], pp. 1-7；Bruhns, P.等(2009) “Specificity And Affinity Of Human Fcgamma Receptors And Their Polymorphic Variants For Human IgG Subclasses ,” Blood. 113(16):3716-3725；White, A.L.等(2014) “FcγRIIBAs A Key Determinant Of Agonistic Antibody Efficacy ,” Curr. Top. Microbiol. Immunol. 382:355-372；Selvaraj, P.等(2004) “Functional Regulation Of Human Neutrophil Fc Gamma Receptors ,” Immunol. Res. 29(1-3):219-230)。
不同FcγRs介導截然相反的功能的能力反映了它們的結構不同，尤其是FcγR是否具有免疫受體酪氨酸啟動基序(“ITAM ”)或免疫受體酪氨酸抑制基序(“ITIM ”)。不同細胞質酶募集到這些結構指示FcγR-介導的細胞應答的結果。含ITAM的FcγR包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA，並且當結合至Fc區時啟動免疫系統(例如，存在於免疫複合物中的聚集Fc區)。FcγRIIB是目前已知的唯一天然含ITIM的FcγR；它當結合至聚集的Fc區時起到減弱或抑制免疫系統的作用。
儘管針對特定疾病抗原表位的天然IgG抗體具有可與CD16相互作用以啟動受試者的免疫應答的Fc區，但在許多疾病和許多受試者的情況下，這種免疫系統啟動不足以提供對該疾病的有效治療。因此，儘管之前在鑒定涉及哺乳動物免疫應答的分子方面已經有所進步，但是仍然需要用於治療癌症和傳染病的改進療法。本發明的CD16-結合分子以及具體地本發明的CD16 x DA 結合分子 (其包括CD16結合結構域和對在靶細胞上表達的疾病抗原特異性的結合結構域)，能夠將CD16-表達細胞共定位到表達疾病抗原的細胞位點。這種共定位通過增加針對疾病抗原表位元的抗體的Fc部分將結合表達CD16的效應細胞的可能性而提高了ADCC-介導的目標細胞的殺傷，並且通過這種Fc-CD16相互作用，觸發免疫系統啟動以及針對靶細胞的細胞因數的釋放。因此，本發明涉及提高受試者對疾病抗原和其他目標的免疫應答的啟動。
本發明涉及能夠結合人CD16的表位的分子(例如，抗體、雙抗體、scFv、抗體、TandAb等) (“CD16 結合分子 ”)。本發明進一步涉及能夠結合人CD16的表位和疾病抗原(“DA ”)的一個或多個表位的CD16結合分子(例如，“CD16 x DA 結合分子 ”)。本發明特別地涉及這樣的CD16 x DA 結合分子，其為抗體、或者包括抗體的表位元結合結構域、或者是雙抗體(包括DART®雙抗體)、雙特異性抗體、TandAb、其它多特異性結合分子(例如，三價TRIDENT™分子)等。本發明特別地涉及CD16 x DA 結合分子，其除了能夠結合CD16之外還能夠結合疾病抗原，所述疾病抗原是癌抗原或病原體相關抗原。本發明特別地涉及這種CD16 和 CD16 x DA 結合分子在治療癌症和病原體相關疾病中的用途。本發明也涉及包括這種分子的藥物組合物。
詳細地，本發明提供CD16 x 疾病抗原 (CD16 x DA )結合分子，其包括能夠結合CD16的表位元的CD16結合結構域以及能夠結合疾病抗原的表位的疾病抗原-結合結構域，其中所述CD16結合結構域包括下列中的一種或多種： (I) (A) 包含SEQ ID NO:66 的氨基酸序列的CDRH 1結構域； (B) 包含SEQ ID NO:67 的氨基酸序列的CDRH 2結構域； (C) 包含SEQ ID NO:68 或 SEQ ID NO:60 的氨基酸序列的CDRH 3結構域； (D) 包含SEQ ID NO:69 或 SEQ ID NO:74 的氨基酸序列的CDRL 1結構域； (E) 包含SEQ ID NO:70 的氨基酸序列的CDRL 2結構域；和 (F) 包含SEQ ID NO:71 或 SEQ ID NO:61 的氨基酸序列的CDRL 3結構域； (II) (A) 包含SEQ ID NO:77 的氨基酸序列的CDRH 1結構域； (B) 包含SEQ ID NO:78 的氨基酸序列的CDRH 2結構域； (C) 包含SEQ ID NO:79 的氨基酸序列的CDRH 3結構域； (D) 包含SEQ ID NO:80 的氨基酸序列的CDRL 1結構域； (E) 包含SEQ ID NO:81 的氨基酸序列的CDRL 2結構域；和 (F) 包含SEQ ID NO:82 的氨基酸序列的CDRL 3結構域； (III) 包含SEQ ID NO:72 、 SEQ ID NO:83 、 SEQ ID NO:84 、或 SEQ ID NO:58 的氨基酸序列的VH結構域； (IV) 包含SEQ ID NO:73 、 SEQ ID NO:85 或 SEQ ID NO:59 的氨基酸序列的VL結構域； (V) 包含SEQ ID NO:72 的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:73 的氨基酸序列的VL結構域；和 (VI) 包含SEQ ID NO:83 或 SEQ ID NO:84 的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:85 的氨基酸序列的VL結構域； (VII) 包含SEQ ID NO:58 的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:73 的氨基酸序列的VL結構域； (VIII) 包含SEQ ID NO:72 的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:59 的氨基酸序列的VL結構域；和 (IX) 包含SEQ ID NO:58 的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:59 的氨基酸序列的VL結構域。
本發明另外涉及這種CD16 x 疾病抗原結合分子的實施方式，其中所述分子是雙特異性抗體、雙特異性雙抗體、雙特異性TandAb、雙特異性三價分子或雙特異性CAR。
本發明另外涉及這種CD16 x 疾病抗原結合分子的實施方式，其中所述分子能夠結合多於一個的疾病抗原和/或多於一個的CD16的表位。
本發明另外涉及這種CD16 x 疾病抗原結合分子的實施方式，其中所述CD16結合結構域包括： (A) 包含SEQ ID NO:66 的氨基酸序列的CDRH 1結構域； (B) 包含SEQ ID NO:67 的氨基酸序列的CDRH 2結構域； (C) 包含SEQ ID NO:68 或SEQ ID NO:60 的氨基酸序列的CDRH 3結構域； (D) 包含SEQ ID NO:69 或SEQ ID NO:74 的氨基酸序列的CDRL 1結構域； (E) 包含SEQ ID NO:70 的氨基酸序列的CDRL 2結構域；和 (F) 包含SEQ ID NO:71 或SEQ ID NO:61 的氨基酸序列的CDRL 3結構域。
本發明另外涉及這種CD16 x 疾病抗原 結合分子的實施方式，其中所述CD16結合結構域包括： (A) 包含SEQ ID NO:72 或SEQ ID NO:58 的氨基酸序列的VH結構域； (B) 包含SEQ ID NO:73 或SEQ ID NO:59 的氨基酸序列的VL結構域；或 (C) 包含SEQ ID NO:72 的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:73 的氨基酸序列的VL結構域； (D) 包含SEQ ID NO:58 的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:73 的氨基酸序列的VL結構域； (E) 包含SEQ ID NO:72 的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:59 的氨基酸序列的VL結構域；或 (F) 包含SEQ ID NO:58 的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:59 的氨基酸序列的VL結構域。
本發明另外涉及這種CD16 x 疾病抗原 結合分子的實施方式，其中所述CD16結合結構域包括： (A) 包含SEQ ID NO:77 的氨基酸序列的CDRH 1結構域； (B) 包含SEQ ID NO:78 的氨基酸序列的CDRH 2結構域； (C) 包含SEQ ID NO:79 的氨基酸序列的CDRH 3結構域； (D) 包含SEQ ID NO:80 的氨基酸序列的CDRL 1結構域； (E) 包含SEQ ID NO:81 的氨基酸序列的CDRL 2結構域；和 (F) 包含SEQ ID NO:82 的氨基酸序列的CDRL 3結構域。
本發明另外涉及這種CD16 x 疾病抗原 結合分子的實施方式，其中所述CD16結合結構域包括： (A) 包含SEQ ID NO:83 或SEQ ID NO:84 的氨基酸序列的VH結構域； (B) 包含SEQ ID NO:85 的氨基酸序列的VL結構域；或 (C) 包含SEQ ID NO:83 或SEQ ID NO:84 的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:85 的氨基酸序列的VL結構域。
本發明另外涉及這種CD16 x 疾病抗原 結合分子的實施方式，其中所述疾病抗原是癌抗原並且所述疾病是癌症。
本發明另外涉及這種CD16 x 疾病抗原 結合分子的實施方式，其中所述癌症選自由下列組成的組：腎上腺癌、膀胱癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、成膠質細胞瘤、腎癌、非小細胞肺癌、急性淋巴細胞性白血病、急性髓細胞樣白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓細胞樣白血病、毛細胞白血病、伯基特淋巴瘤(Burkett's lymphoma)、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、小淋巴細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮膚癌、腎細胞癌、睾丸癌和子宮癌。
本發明另外涉及這種CD16 x 疾病抗原 結合分子的實施方式，其中所述癌抗原選自由下列癌抗原組成的組：19.9、4.2、A33、ADAM-9、AH6、ALCAM、B1、B7-H3、BAGE、β-聯蛋白、血型ALeb /Ley 、伯基特淋巴瘤抗原-38.13、C14、CA125、羧肽酶M、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD33、CD36、CD40/CD154、CD45、CD56、CD46、CD52、CD56、CD79a/CD79b、CD103、CD123、CD317、CDK4、CEA、CEACAM5/CEACAM6、CO17-1A、CO-43、CO-514、CTA-1、CTLA-4、細胞角蛋白8、D1.1、D1 56-22、DR5、E1 系列、EGFR、肝配蛋白受體、EphA2、Erb、GAGE、GD2/GD3/GM2神經節苷脂、GICA 19-9、gp100、Gp37、gp75、gpA33、HER2/neu、HMFG、人乳頭瘤病毒-E6/人乳頭瘤病毒-E7、HMW-MAA、I抗原、IL13Rα2、整聯蛋白β6、JAM-3、KID3、KID31、KS 1/4 泛癌抗原、L6、L20、LEA、LUCA-2、M1:22:25:8、M18、M39、MAGE、MART、間皮素、MUC-1、MUM-1、Myl、N-乙醯葡糖胺基轉移酶、擬糖蛋白、NS-10、OFA-1、OFA-2、制瘤素M、p15、p97、PEM、PEMA、PIPA、PSA、PSMA、前列腺酸磷酸鹽、R24 、ROR1、鞘脂、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、sTn、T細胞受體衍生肽、T5 A7 、TAG-72、TL5、TNF-受體、TNF-γ受體、TRA-1-85、轉鐵蛋白受體、5T4、TSTA、VEGF、VEGF受體、VEP8、VEP9、VIM-D5、和Y半抗原、Ley 。
本發明另外涉及這種CD16 x 疾病抗原 結合分子的實施方式，其中所述疾病抗原是5T4、B7-H3、CEACAM5/CEACAM6、CD19、CD123、EGRF、EphA2、HER2/neu、IL13Rα2或VEGF。
本發明另外涉及這種CD16 x 疾病抗原 結合分子的實施方式，其中所述疾病抗原是病原體相關抗原。
本發明另外涉及這種CD16 x 疾病抗原 結合分子的實施方式，其中所述病原體相關抗原選自由下列病原體相關抗原組成的組：單純皰疹病毒感染的細胞蛋白(ICP)47、單純皰疹病毒gD、愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr Virus)LMP-1、愛潑斯坦-巴爾病毒LMP-2A、愛潑斯坦-巴爾病毒LMP-2B、人類免疫缺陷病毒gp160、人類免疫缺陷病毒gp120、人類免疫缺陷病毒gp41等、人乳頭瘤病毒E6、人乳頭瘤病毒E7、人T細胞白血病病毒gp64、人T細胞白血病病毒gp46和人T細胞白血病病毒gp21。
本發明另外涉及這種CD16 x 疾病抗原 結合分子的實施方式，其中所述疾病抗原是HIV env抗原。
本發明另外涉及這種CD16 x 疾病抗原 結合分子的實施方式，其中所述分子是： (A) 雙抗體，所述雙抗體是包含兩條、或三條、四條或五條多肽鏈的共價結合的複合物；或 (B) 三價結合分子，所述三價結合分子是包含三條、四條或五條多肽鏈的共價結合的複合物；或 (C) 雙特異性抗體。
本發明另外涉及這種CD16 x 疾病抗原 結合分子的實施方式，其中所述分子包含Fc區。
本發明另外涉及這種CD16 x 疾病抗原 結合分子的實施方式，其中所述Fc區具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型。
本發明另外涉及這種CD16 x 疾病抗原結合分子的實施方式，其中所述Fc區是變體Fc區，包含： (A) 一個或多個氨基酸修飾，其減少所述變體Fc區對於FcγR的親和力；和/或 (B) 一個或多個氨基酸修飾，其增加所述變體Fc區的血清半衰期。
本發明另外涉及這種CD16 x 疾病抗原 結合分子的實施方式： (A) 減少所述變體Fc區對於FcγR的親和力的所述修飾包括L234A；L235A；或L234A和L235A的置換；和 (B) 增加所述變體Fc區的血清半衰期的所述修飾包括M252Y；M252Y和S254T；M252Y和T256E；M252Y、S254T和T256E；或K288D和H435K的置換， 其中所述編號是如Kabat中EU索引的編號。
本發明另外涉及CD16結合分子，其包含： (A) 包含SEQ ID NO:66 的氨基酸序列的CDRH 1結構域； (B) 包含SEQ ID NO:67 的氨基酸序列的CDRH 2結構域； (C) 包含SEQ ID NO:68 或SEQ ID NO:60 的氨基酸序列的CDRH 3結構域； (D) 包含SEQ ID NO:69 或SEQ ID NO:74 的氨基酸序列的CDRL 1結構域； (E) 包含SEQ ID NO:70 的氨基酸序列的CDRL 2結構域；和 (F) 包含SEQ ID NO:71 或SEQ ID NO:61 的氨基酸序列的CDRL 3結構域。
本發明另外涉及這種CD16結合分子的實施方式，其中所述分子包含： (A) 包含SEQ ID NO:72 或SEQ ID NO:58 的氨基酸序列的VH結構域； (B) 包含SEQ ID NO:73 或SEQ ID NO:59 的氨基酸序列的VL結構域； (C) 包含SEQ ID NO:72 的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:73 的氨基酸序列的VL結構域；或 (D) 包含SEQ ID NO:58 的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:73 的氨基酸序列的VL結構域； (E) 包含SEQ ID NO:72 的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:59 的氨基酸序列的VL結構域；或 (F) 包含SEQ ID NO:58 的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:59 的氨基酸序列的VL結構域。
本發明另外涉及CD16結合分子，其包含： (A) 包含SEQ ID NO:77 的氨基酸序列的CDRH 1結構域； (B) 包含SEQ ID NO:78 的氨基酸序列的CDRH 2結構域； (C) 包含SEQ ID NO:79 的氨基酸序列的CDRH 3結構域； (D) 包含SEQ ID NO:80 的氨基酸序列的CDRL 1結構域； (E) 包含SEQ ID NO:81 的氨基酸序列的CDRL 2結構域；和 (F) 包含SEQ ID NO:82 的氨基酸序列的CDRL 3結構域。
本發明另外涉及這種CD16結合分子的實施方式，其中所述分子包含： (A) 包含SEQ ID NO:83 或SEQ ID NO:84 的氨基酸序列的VH結構域； (B) 包含SEQ ID NO:85 的氨基酸序列的VL結構域；或 (C) 包含SEQ ID NO:83 或SEQ ID NO:84 的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:85 的氨基酸序列的VL結構域。
本發明另外涉及這種CD16 結合分子的實施方式，其中所述分子選自由下列組成的組：抗體、多特異性抗體、Fab'片段、F(ab')2 片段、(Fv)片段、單鏈(scFv)、單鏈抗體、二硫化物連接的雙特異性Fv (sdFv)、雙抗體、三價結合分子和CAR-T分子。
本發明另外涉及藥物組合物，其包括上述CD16 x 疾病抗原 結合分子中的任一種或CD16結合分子、和藥學上可接受的載體。
本發明另外涉及上述藥物組合物在治療特徵在於疾病抗原的表達的疾病中的用途。
本發明另外涉及用於治療特徵在於疾病抗原的表達的疾病的方法，包括向需要其的受試者施用治療有效量的上述藥物組合物。
本發明另外涉及這種用途或方法的實施方式，其中所述CD16 x 疾病抗原 結合分子能夠結合多於一個的疾病抗原和/或多於一個的CD16的表位。
本發明另外涉及這種用途或方法，其中所述CD16 x 疾病抗原 結合分子的所述疾病抗原是癌抗原，並且所述疾病是癌症。
本發明另外涉及這種用途或方法，其中所述癌症選自由下列組成的組：腎上腺癌、膀胱癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、成膠質細胞瘤、腎癌、非小細胞肺癌、急性淋巴細胞性白血病、急性髓細胞樣白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓細胞樣白血病、毛細胞白血病、伯基特淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、小淋巴細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮膚癌、腎細胞癌、睾丸癌和子宮癌。
本發明另外涉及這種用途或方法，其中所述癌抗原選自由下列癌抗原組成的組：19.9、4.2、A33、ADAM-9、AH6、ALCAM、B1、B7-H3、BAGE、β-聯蛋白、血型ALeb /Ley 、伯基特淋巴瘤抗原-38.13、C14、CA125、羧肽酶M、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD33、CD36、CD40/CD154、CD45、CD56、CD46、CD52、CD56、CD79a/CD79b、CD103、CD123、CD317、CDK4、CEA、CEACAM5/CEACAM6、CO17-1A、CO-43、CO-514、CTA-1、CTLA-4、細胞角蛋白8、D1.1、D1 56-22、DR5、E1 系列、EGFR、肝配蛋白受體、EphA2、Erb、GAGE、GD2/GD3/GM2神經節苷脂、GICA 19-9、gp100、Gp37、gp75、gpA33、HER2/neu、HMFG、人乳頭瘤病毒-E6/人乳頭瘤病毒-E7、HMW-MAA、I抗原、IL13Rα2、整聯蛋白β6、JAM-3、KID3、KID31、KS 1/4 泛癌抗原、L6、L20、LEA、LUCA-2、M1:22:25:8、M18、M39、MAGE、MART、間皮素、MUC-1、MUM-1、Myl、N-乙醯葡糖胺基轉移酶、擬糖蛋白、NS-10、OFA-1、OFA-2、制瘤素M、p15、p97、PEM、PEMA、PIPA、PSA、PSMA、前列腺酸磷酸鹽、R24 、ROR1、鞘脂、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、sTn、T細胞受體衍生肽、T5 A7 、TAG-72、TL5、TNF-受體、TNF-γ受體、TRA-1-85、轉鐵蛋白受體、5T4、TSTA、VEGF、VEGF受體、VEP8、VEP9、VIM-D5、和Y半抗原、Ley 。
本發明另外涉及這種用途或方法，其中所述疾病抗原是5T4、B7-H3、CEACAM5/CEACAM6、CD19、CD123、EGRF、EphA2、HER2/neu、IL13Rα2或VEGF。
本發明另外涉及這種用途或方法，其中所述CD16 x 疾病抗原結合分子的所述疾病抗原是病原體相關抗原。
本發明另外涉及這種用途或方法，其中所述病原體相關抗原選自由下列病原體相關抗原組成的組：單純皰疹病毒感染的細胞蛋白(ICP)47、單純皰疹病毒gD、愛潑斯坦-巴爾病毒LMP-1、愛潑斯坦-巴爾病毒LMP-2A、愛潑斯坦-巴爾病毒LMP-2B、人類免疫缺陷病毒gp160、人類免疫缺陷病毒gp120、人類免疫缺陷病毒gp41等、人乳頭瘤病毒E6、人乳頭瘤病毒E7、人T細胞白血病病毒gp64、人T細胞白血病病毒gp46和人T細胞白血病病毒gp21。
本發明另外涉及這種用途或方法，其中所述疾病抗原是HIV env抗原。
本發明涉及能夠結合人CD16的表位的分子(例如， 抗體、雙抗體、scFv、抗體、TandAb等) (“CD16 結合分子 ”)。本發明進一步涉及能夠結合人CD16的表位和疾病抗原(“DA ”)的一個或多個表位的CD16 結合分子(例如，“CD16 x DA 結合分子 ”)。本發明特別地涉及這樣的CD16 x DA 結合分子，其是抗體、或者包含抗體的表位元結合結構域、或者是雙抗體 (包括DART®雙抗體)、雙特異性抗體、TandAb、其它多特異性結合分子(例如，三價TRIDENT™分子)等。本發明特別地涉及CD16 x DA 結合分子，其除了能夠結合CD16外還能夠結合疾病抗原，所述疾病抗原是癌抗原或病原體相關抗原。本發明特別地涉及這種CD16 和CD16 x DA 結合分子在治療癌症和病原體相關疾病中的用途。本發明也涉及包括這種分子(一種或多種)的藥物組合物。I. 抗體和其它結合分子 A. 抗體
本發明的CD16 x DA 結合分子可以是抗體，或可衍生自抗體(例如，通過抗體多肽的斷裂、切割等，或者來自抗體分子的氨基酸序列或者編碼這種氨基酸序列的多核苷酸(或其序列)等的應用)。
抗體是能特異性結合分子，諸如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等的特定結構域或部分(moiety)或構造(“表位 ”)的免疫球蛋白分子。含表位的分子可具有免疫原性活性，使得其引起動物中的抗體產生應答；這樣的分子被稱為“抗原 ”。如本文所用，術語“抗體 (antibody) ”和“抗體 (antibodies) ”是指單克隆抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、合成抗體、嵌合抗體、多克隆抗體、駱駝化抗體(camelized antibody)、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)片段、二硫鍵連接的雙特異性Fvs(sdFv)、胞內抗體和任意上的表位元結合結構域。這種免疫球蛋白分子可以是任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類別(例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 和IgA2 )或亞類。
術語“單克隆抗體 ”是指同源性抗體群，其中單克隆抗體包括涉及抗原的選擇性結合的氨基酸(天然產生的或非天然產生的)。單克隆抗體是高度特異性的，針對單個表位(或抗原位點)。術語“單克隆抗體”不僅僅涵蓋完整的單克隆抗體和全長單克隆抗體，而且也涵蓋其片段(比如Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv)、單鏈(scFv)、其突變體、包括抗體部分的融合蛋白、人源化的單克隆抗體、嵌合單克隆抗體和包括具有結合抗原的必要特異性和能力的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其它修飾構型。就抗體的來源或其製備的方式(例如，通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、轉基因動物等)而言，其不旨在是限制性的。術語包括完整的免疫球蛋白以及上面根據“抗體”的定義描述的片段等。製備單克隆抗體的方法是本領域已知的。可採用的一種方法是Kohler, G.等(1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity ,” Nature 256:495-497的方法或其改良。典型地，單克隆抗體在小鼠、大鼠或兔子中開發。通過用免疫原性量的細胞、細胞提取物或包含期望表位的蛋白質製品免疫動物而產生抗體。免疫原可以是但不限於原代細胞、培養細胞系、癌細胞、蛋白質、肽、核酸或組織。在其用作免疫原之前，用於免疫的細胞可被培養一段時間(例如，至少24小時)。細胞可本身或聯合非變性佐劑(比如Ribi)用作免疫原(參見，例如Jennings, V.M. (1995) “Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production ,” ILAR J. 37(3):119-125)。一般而言，在用作免疫原時，細胞應保持完整並且優選地是活的。相比於破裂的細胞，完整的細胞可允許抗原被免疫的動物更好地檢測到。變性佐劑或烈性佐劑(harsh adjuvants)，例如弗氏佐劑的使用，可使細胞破裂並且因此受阻。免疫原可以週期性間隔被多次施用，諸如兩週一次或一週一次，或者可以以維持在動物(例如，在組織重組體中)中的生存力這樣的方式被施用。可替選地，對於期望的致病表位是免疫特異性的現有的單克隆抗體和任意其它等效抗體可被測序，並通過本領域中已知的任意手段重組產生。在一個實施方式中，對這樣的抗體測序，然後將多核苷酸序列克隆到載體中用於表達或增殖。編碼感興趣的抗體的序列可在宿主細胞內保持在載體中，然後可擴增和冷凍宿主細胞，用於將來的使用。這樣的抗體的多核苷酸序列可用於基因操作，以生成本發明的單特異性或多特異性(例如，雙特異性、三特異性和四特異性)分子以及親和力優化的嵌合抗體、人源化抗體和/或犬源化(caninized)抗體，以改善抗體的親和力或其它特徵，如下所詳述。
本發明的抗體和結合分子以“免疫特異性 ”方式經由它們的結合結構域結合表位元。如本文所用，如果一個分子相對於可替選的表位與另一分子的一個表位更頻繁、更迅速、以更長的持續時間和/或以更大的親和力結合或締合，則認為該分子以“免疫特異性 ”方式(或免疫特異性地 )結合所述另一分子的所述表位。例如，免疫特異性地結合病毒表位元的抗體是相比於免疫特異性地結合其它病毒表位元或非病毒表位元以更大的親和力、親合力、更容易地和/或以更大的持續時間結合該病毒表位元的抗體。通過閱讀該定義同樣理解，例如，免疫特異性地結合第一靶標的抗體(或部分或表位元)可以特異性地或優先地結合至第二靶標或者可以不特異性地或不優先地結合第二靶標。照此，“免疫特異性結合 ”並不一定要求(儘管其可包括)排他性結合。一般地，但不一定，提及“結合”意味著“免疫特異性”結合。天然抗體能夠結合僅一個表位種類(即，它們是“單特異性的 ”)，雖然它們可免疫特異性地結合那個種類的多個拷貝(即，呈現出“二價 ”或“多價 ”)。如果結合呈現出受體結合其各自的配體的特異性的話，則兩個分子被認為能夠以“生理特異性”方式相互結合。
過去幾十年已經看出對抗體的治療潛力的關注的復蘇，並且抗體已經變成生物技術衍生的藥物的主導類別之一(Chan, C.E.等 (2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases ,” Singapore Med. J. 50(7):663-666)。超過200種的基於抗體的藥物已經批准使用或在開發中。 1. 抗體的一般結構特徵
天然產生的免疫球蛋白(例如IgG)的基本結構單元是四聚體，其由與兩條較長的“重鏈 ”複合的兩條較短的“輕鏈 ”構成；並且通常被表達為約150,000 Da的糖蛋白。每條鏈由含“可變結構域 ”的氨基-末端(“N- 末端 ”)部分和含至少一個“恆定結構域 ”的羧基-末端(“C- 末端 ”)部分構成。IgG輕鏈由單“輕鏈可變結構域 ”(“VL ”)和單“輕鏈恆定結構域 ”(“CL ”)構成。因此，IgG分子的輕鏈的結構是n-VL-CL-c (其中n和c分別代表多肽的N-末端和C-末端)。IgG重鏈由單“重鏈可變結構域 ” (“VH ”)、三個“重鏈恆定結構域 ” (“CH1 ”、“CH2 ”和“CH3 ”)和位於CH1 和CH2 結構域之間的“鉸鏈”區(“H ”)構成。因此，IgG重鏈的結構是n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (其中n和c分別代表多肽的N-末端和C-末端)。完整的、未修飾的抗體(例如IgG抗體)結合抗原表位元的能力取決於可變結構域的存在和序列。除非另外注明，否則本文描述的蛋白分子的結構域的順序是呈“N- 末端至 C- 末端 ”方向。(a) 恆定結構域 (i) 輕鏈恆定結構域
優選的CL結構域是人IgG CL κ結構域。示例性人CL κ結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:1 )： RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC
可替選地，示例性的CL結構域是人IgG CL λ結構域。示例性的人CL λ結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:2 )： QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP TECS(ii) 重鏈 CH1 結構域
抗體的兩條重鏈的CH1結構域與抗體的輕鏈的“CL”恆定區複合，並且經由間插鉸鏈結構域連接至重鏈CH2結構域。
示例性的CH1結構域是人IgG1 CH1結構域。示例性的人IgG1 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:3 )： ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
示例性的CH1結構域是人IgG2 CH1結構域。示例性的人IgG2 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:4 )： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
示例性的CH1結構域是人IgG3 CH1結構域。示例性的人IgG3 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:5) ： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YTCNVNHKPS NTKVDKRV
示例性的CH1結構域是人IgG4 CH1結構域。示例性的人IgG4 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:6 )： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV(b) 重鏈鉸鏈區
一個示例性的鉸鏈結構域是人IgG1鉸鏈結構域。示例性的人IgG1鉸鏈結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:7 )：EPKSCDKTHTCPPCP。
另一示例性的鉸鏈結構域是人IgG2鉸鏈結構域。示例性的人IgG2鉸鏈結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:8 )：ERKCCVECPPCP。
另一示例性的鉸鏈結構域是人IgG3鉸鏈結構域。示例性的人IgG3鉸鏈結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:9 )： ELKTPLGDTT HTCPRCPEPK SCDTPPPCPR CPEPKSCDTP PPCPRCPEPK SCDTPPPCPR CP。
另一示例性的鉸鏈結構域是人IgG4鉸鏈結構域。示例性的人IgG4鉸鏈結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:10 )：ESKYGPPCPSCP。如本文所述的，IgG4鉸鏈結構域可包括穩定化突變，如S228P置換。示例性的穩定化的IgG4鉸鏈結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:11 )：ESKYGPPCPPCP。 (c) 重鏈CH2和CH3結構域
兩條重鏈的CH2和CH3結構域相互作用以形成IgG抗體的被細胞Fc受體識別的“Fc 結構域 ”，細胞Fc 受體 包括但不限於Fc γ受體(FcγR )。如本文所用，術語“Fc 區 ”用來限定IgG重鏈的C-末端區。一部分Fc區(包括含全部Fc區的部分)在本文中稱為“Fc 結構域 ”。如果Fc區的氨基酸序列相對於其他IgG同種型與該同種型最同源，那麼認為Fc區具有特定的IgG同種型、類別或亞類。除了抗體已知的在診斷中的用途，已經顯示抗體可用作治療劑。
示例性的人IgG1的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:12 )： 231 240 250 260 270 280 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 290 300 310 320 330 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 340 350 360 370 380 PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390 400 410 420 430 WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 440 447 ALHNHYTQKS LSLSPG X 如通過Kabat中所示的EU索引所編號，其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
示例性的人IgG2的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:13 )： 231 240 250 260 270 280 APPVA-GPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD 290 300 310 320 330 GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA 340 350 360 370 380 PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE 390 400 410 420 430 WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 440 447 ALHNHYTQKS LSLSPG X 如通過Kabat中所示的EU索引所編號，其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
示例性的人IgG3的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:14 )： 231 240 250 260 270 280 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD 290 300 310 320 330 GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 340 350 360 370 380 PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390 400 410 420 430 WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE 440 447 ALHNRFTQKS LSLSPG X 如通過Kabat中所示的EU索引所編號，其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
示例性的人IgG4的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:15 )： 231 240 250 260 270 280 APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD 290 300 310 320 330 GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS 340 350 360 370 380 SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390 400 410 420 430 WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE 440 447 ALHNHYTQKS LSLSLG X 如通過Kabat中所示的EU索引所編號，其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
貫穿本申請說明書，IgG重鏈的恆定區中的殘基的編號是按照Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, NH1, MD(1991) (“Kabat ”)中EU索引的編號，其通過引用清楚地併入本文。術語“如 Kabat 中的 EU 索引 ”指人IgG1 EU抗體的恆定結構域的編號。來自免疫球蛋白的成熟重鏈和輕鏈的可變結構域的氨基酸也通過氨基酸在所述鏈中的位置命名。Kabat描述了抗體的許多氨基酸序列，鑒定了對於每個亞組的氨基酸共有序列，並且指定了對每個氨基酸的殘基編號，並且如通過Kabat定義的，CDR被鑒定(應理解，如通過Chothia, C. & Lesk, A. M.所定義的CDRH 1((1987)“Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins ,” J. Mol. Biol. 196:901-917)提前五個殘基開始)。Kabat的編號方案可通過參照保守氨基酸比對考慮中的抗體與Kabat中的共有序列之一擴展至不包括在其手冊中的抗體。用於指定殘基編號的該方法在本領結構域中已經變得標準化，並且易於鑒定在不同抗體(包括嵌合或人源化變體)中在等同位置處的氨基酸。例如，在人抗體輕鏈的位置50處的氨基酸佔據與小鼠抗體輕鏈的位置50處的氨基酸等同的位置。
在抗體恆定區內在許多不同位置(例如Fc位置，包括但不限於通過Kabat中所示的EU索引所編號的位置270、272、312、315、356和358)已經觀察到多態性，並且因此在所呈現的序列和現有技術中的序列之間可存在輕微差異。已經很好地表徵了人免疫球蛋白的多態形式。目前，18個Gm異型是已知的：G1m (1、2、3、17)或G1m (a、x、f、z)、G2m (23)或G2m (n)、G3m (5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m (b1、c3、b3、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5) (Lefranc等“The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, Function And Regulation. ” Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990)；Lefranc, G.等1979, Hum. Genet.: 50, 199-211)。具體考慮本發明的抗體可包含任何免疫球蛋白基因的任何同種異型(allotype)、同種型(isoallotype)或單體型(haplotype)，並且不限於本文提供的序列的同種異型、同種型或單體型。而且，在一些表達系統中，CH3結構域的C-末端氨基酸殘基(以上粗體的)可被翻譯後去除。因此，在本發明的CD16 x DA 結合分子中，CH3結構域的C-末端殘基是任選的氨基酸殘基。具體地，通過本發明涵蓋的是沒有CH3結構域的C-末端殘基的CD16 x DA 結合分子。同樣具體地，本發明涵蓋的是包括CH3結構域的C-末端賴氨酸殘基的這種構建體。(d) 可變結構域
IgG分子的可變結構域由三個“互補決定區 ” (“CDR ”)以及稱為“框架區 ”(“FR ”)的間插非-CDR區段組成，CDR包含抗體的將與表位接觸的氨基酸殘基，FR大體上保持CDR環的結構並且確定CDR環的定位以允許這種接觸(儘管某些框架殘基也可接觸表位)。因此，VL和VH結構域具有結構n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c 。CDR的氨基酸序列確定抗體是否將能夠結合特定的表位。抗體輕鏈與抗體重鏈的相互作用，以及特別地它們的VL和VH結構域的相互作用形成抗體的表位結合位點。
作為(或可以用作)抗體輕鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文中分別命名為：CDRL 1 結構域 、CDRL 2 結構域 和CDRL 3 結構域 。類似地，作為(或可以用作)抗體重鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文中分別命名為：CDRH 1 結構域 、CDRH 2 結構域 和CDRH 3 結構域 。因此，術語CDRL 1結構域、CDRL 2結構域、CDRL 3結構域、CDRH 1結構域、CDRH 2結構域和CDRH 3結構域涉及這樣的多肽，當其併入蛋白時引起蛋白能夠結合至特定表位，而無論這種蛋白是具有輕鏈和重鏈的抗體還是雙抗體或單鏈結合分子(例如scFv、BiTe等)，或是另一類型蛋白。
術語“表位元結合結構域 ”意指結合分子的片段或部分(或者具有這種片段或部分的氨基酸序列的多肽)，其有助於結合分子免疫特異性地結合至表位的能力。表位元結合結構域可包含抗體的VL或VH結構域，或者抗體的CDR結構域中的1個、2個、3個、4個或5個，或者可包含抗體的CDR結構域中全部的6個，並且，儘管能夠免疫特異性地結合這種表位，但對不同於這種抗體的表位的這種表位可呈現免疫特異性、親和力或選擇性。表位元結合結構域可僅僅包含CDR的部分，即結合所需的CDR殘基的子集，被稱為SDR(Kim, J.H.等(2012)“Humanization By CDR Grafting And Specificity-Determining Residue Grafting ,” Methods Mol. Biol. 907:237-245；Kim, K.S.等(2010) “Construction Of A Humanized Antibody To Hepatitis B Surface Antigen By Specificity-Determining Residues (SDR)-Grafting And De-Immunization ,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 396(2):231-237；Kashmiri, S.V.等(2005) “SDR Grafting – A New Approach To Antibody Humanization ,” Methods 36(1):25-34；Gonzales, N.R.等(2004) “SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize Its Immunogenicity ,” Mol. Immunol. 41:863-872)。然而，優選地，表位元結合結構域將包含抗體的CDR結構域中全部的6個。表位元結合結構域可以是單條多肽鏈(例如，scFv)，或者可包含兩條或更多條多肽鏈，其可各自具有氨基端和羧基端 (例如，雙抗體、Fab片段、Fab2 片段等)，並且其可經由二硫鍵相互共價結合。2. 抗體的人源化
本發明也特別地包括結合分子，所述結合分子包括抗體的VL或VH結構域，並且優選抗體的VL和VH結構域兩者。優選地，這種抗體是人源化抗體。單克隆抗體典型地在非人物種，諸如小鼠和兔子中製備。這種抗體的可變結構域和/或恆定結構域可被識別為免疫原，因此引起針對它們的免疫應答。然而，這種分子可通過引入一個或多個氨基酸置換“人源化”以便使得這種抗體更像人所產生的抗體，從而減少或消除它們的免疫原性。術語“人源化 ”抗體是指通常使用重組技術製備的嵌合分子，其具有來自非人物種的免疫球蛋白的表位結合位點和該分子的基於人免疫球蛋白的結構和/或序列的剩餘免疫球蛋白結構。這種抗體的可變結構域的多核苷酸序列可用於基因操縱以產生這種衍生物並且改善這種抗體的親和力或其它特徵。針對各種抗體的這種方法的應用由下列報導：LoBuglio, A.F.等(1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224；Sato, K.等(1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L.等(1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy ,” Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.等(1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity ,” Science 239:1534-1536；Kettleborough, C. A.等(1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation ,” Protein Engineering 4:773-3783；Maeda, H.等(1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity ,” Human Antibody Hybridoma 2:124-134；Gorman, S. D.等(1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185；Tempest, P.R.等(1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo ,” Bio/Technology 9:266-271；Co, M. S.等(1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873；Carter, P.等(1992) “Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289；和Co, M.S.等(1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen ,” J. Immunol. 148:1149-1154。在一些實施方式中，人源化抗體保留所有CDR序列 (例如，包含來自小鼠抗體的全部六個CDR的人源化小鼠抗體)。在其它實施方式中，人源化抗體具有相對於原抗體序列不同的一個或多個CDR (一個、兩個、三個、四個、五個和/或六個)。
使抗體人源化的一般原則涉及保留抗體的表位元結合結構域的基本序列，同時以人抗體序列交換非人剩餘部分。存在使單克隆抗體人源化的四個常規步驟。這些步驟是：(1)確定起始抗體輕鏈和重鏈可變結構域的核苷酸和預測的氨基酸序列；(2)設計人源化抗體或犬源化抗體，即，決定在人源化或犬源化過程中使用哪個抗體框架區；(3)實際的人源化或犬源化方法/技術；和(4)人源化抗體的轉染和表達。參見，例如，美國專利號4,816,567；5,807,715；5,866,692和6,331,415。
已經描述了包含源自非人免疫球蛋白的表位元結合結構域的許多人源化抗體分子，包括具有齧齒動物可變結構域或修飾的齧齒動物可變結構域和它們與人恆定結構域融合的相關的互補決定區(CDR)的嵌合抗體(參見，例如Winter等(1991) “Man-made Antibodies ,” Nature 349:293-299；Lobuglio等(1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989)；Shaw等(1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen ,” J. Immunol. 138:4534-4538；和Brown等(1987) “Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody ,” Cancer Res. 47:3577-3583)。其它參考文獻描述了在與適當的人抗體恆定結構域融合之前移植至人支撐框架區(FR)的齧齒動物的CDR(參見，例如Riechmann, L.等(1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy ,” Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.等(1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity ,” Science 239:1534-1536；和Jones等(1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse ,” Nature 321:522-525)。另一參考文獻描述了由重組修飾的齧齒動物框架區支撐的齧齒動物的CDR。參見，例如，歐洲專利公開號519,596。這些“人源化的 ”分子被設計為使得對齧齒動物抗人抗體分子的不利免疫應答最小化，所述不利免疫應答限制了這些部分在人接受者中治療應用的持續時間和效力。也可使用人源化抗體的其它方法，其公開在以下文獻中：Daugherty等(1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins ,” Nucl. Acids Res. 19:2471-2476和美國專利號 6,180,377；6,054,297；5,997,867和5,866,692。本發明特別地涵蓋這樣的結合分子(包括抗體和雙抗體)，其包含“人源化”抗體的VL和/或VH結構域。
儘管這種成功，優化用於治療用途的穩定的、功能的異源二聚體的、非單特異性雙抗體的生產可通過認真考慮和佈置多肽鏈中採用的結構域而進一步改進。因此，本發明涉及提供特異性多肽，其被特別設計以通過共價結合形成能夠同時結合CD16和疾病抗原的穩定和治療有用的異源二聚體雙抗體和異源二聚體Fc雙抗體。B. 雙特異性抗體
如以上指出的，天然抗體能夠結合至僅一個表位種類，雖然它們可結合該種類的多個拷貝。抗體結合抗原的表位的能力取決於抗體的VL和VH結構域的存在和氨基酸序列。抗體的輕鏈和重鏈的相互作用，以及特別地其VL和VH結構域的相互作用形成天然抗體、諸如IgG的兩個表位元結合結構域中的一個。天然抗體能夠結合僅僅一個表位種類(即，它們是單特異性的)，儘管它們能夠結合該種類的多個拷貝(即呈現二價或多價)。
抗體的功能可通過產生能夠同時結合兩個獨立且不同的抗原(或相同抗原的不同表位)的基於多特異性抗體的分子和/或通過產生對相同表位和/或抗原具有較高價態(即，多於兩個結合結構域)的基於抗體的分子來提高。
為了提供比天然抗體具有更大能力的分子，已經開發了廣泛種類的重組雙特異性抗體形式(參見，例如PCT公開號WO 2008/003116、WO 2009/132876、WO 2008/003103、WO 2007/146968、WO 2009/018386、WO 2012/009544、WO 2013/070565)。大多數這樣的方法使用連接體肽以將另外的結合結構域(例如scFv、VL、VH等)與抗體核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)融合或融合在抗體核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)內，或將多個抗體結合部分相互融合(例如，兩個Fab片段或scFv)。可替選的形式使用連接體肽以將結合蛋白(例如scFv、VL、VH等)與二聚結構域、諸如CH2-CH3結構域或可替選的多肽融合(WO 2005/070966、WO 2006/107786A、WO 2006/107617A、WO 2007/046893)。典型地，這種方法涉及折中(compromises)和取捨(trade-offs)。例如，PCT公開號WO 2013/174873、WO 2011/133886和WO 2010/136172公開了連接體的使用可引起治療設置中的問題，並且教導了三特異性抗體，其中CL和CH1結構域從其各自的天然位置轉換並且已經使得VL和VH結構域多樣化(WO 2008/027236；WO 2010/108127)，以使得它們結合多於一個的抗原。因此，這些文獻中公開的分子用結合特異性換取(trade)用於結合另外的抗原種類的能力。PCT公開號WO 2013/163427和WO 2013/119903公開了修飾CH2結構域以包含包括結合結構域的融合蛋白加合物。文獻指出CH2結構域可能在介導效應子功能中僅起到微小作用。PCT公開號WO 2010/028797、WO2010028796和WO 2010/028795公開了重組抗體，其Fc區已經以另外的VL和VH結構域替換，以形成三價結合分子。PCT公開號WO 2003/025018和WO2003012069公開了重組雙抗體，其單獨的鏈包含scFv結構域。PCT公開號WO 2013/006544公開了多價Fab分子，其被合成為單多肽鏈且然後經歷蛋白水解以產生異源二聚體結構。因此，這些文獻中公開的分子用介導效應子功能的全部或一些能力換取結合另外的抗原種類的能力。PCT公開號WO 2014/022540、WO 2013/003652、WO 2012/162583、WO 2012/156430、WO 2011/086091、WO 2008/024188、WO 2007/024715、WO 2007/075270、WO 1998/002463、WO 1992/022583和WO 1991/003493公開了將另外的結合結構域或官能團添加至抗體或抗體部分(例如將雙抗體添加至抗體的輕鏈，或將另外的VL和VH結構域添加至抗體的輕鏈和重鏈，或添加異源融合蛋白或將多個Fab結構域相互連結)。因此，這些文獻中公開的分子用天然的抗體結構換取用於結合另外的抗原種類的能力。C. 嵌合抗原受體
本發明的結合分子可以是嵌合抗原受體(“CAR ”)，其包含能夠結合CD16和疾病抗原的單鏈可變片段(scFv )。如上所示，通過經由短連接肽使輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域連接在一起而形成scFv。第一代CAR典型地具有來自CD3 ζ-鏈的胞內結構域，其是來自內源性TCR的信號的初級傳遞介質。第二代CAR具有從各種共激蛋白受體(例如，CD28、41BB、ICOS等)至CAR的胞質尾區的另外胞內信號傳導結構域以便給T-細胞提供另外的信號。第三代CARs組合多個信號傳導結構域，諸如CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40，以便進一步增加功效(Tettamanti, S.等(2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric AntigenReceptor ,” Br. J. Haematol. 161:389-401；Gill, S.等(2014) “Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells ,” Blood 123(15): 2343-2354；Mardiros, A.等(2013) “T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia ,” Blood 122:3138-3148；Pizzitola, I.等(2014) “Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo ,” Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62。
本發明的CAR的胞內結構域優選選自下列任意一種的胞內結構域：41BB-CD3ζ、b2c-CD3ζ、CD28、CD28-4-1BB-CD3ζ、CD28-CD3ζ、CD28-FcεRIγ、CD28mut-CD3ζ、CD28-OX40-CD3ζ、CD28-OX40-CD3ζ、CD3ζ、CD4-CD3ζ、CD4-FcεRIγ、CD8-CD3ζ、FceRIγ、FcεRIγCAIX、調蛋白-CD3ζ、IL-13-CD3ζ或者Ly49H-CD3ζ(Tettamanti, S.等(2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric AntigenReceptor ,” Br. J. Haematol. 161:389-401；Gill, S.等(2014) “Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells ,” Blood 123(15): 2343-2354；Mardiros, A.等(2013) “T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia ,” Blood 122:3138-3148；Pizzitola, I.等(2014) “Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo ,” Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62)。II ．雙特異性雙抗體
現有技術已經另外地指出在能夠結合兩個或更多個不同表位種類方面(即，除了二價或多價外，還表現出雙特異性或多特異性)產生不同於天然抗體的雙抗體 的能力(參見，例如Holliger等(1993) “’Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments, ” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448；US 2004/0058400 (Hollinger等)；US 2004/0220388 (Mertens等.)；Alt等(1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94；Lu, D.等(2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672；WO 02/02781 (Mertens等.)；Olafsen, T.等(2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications ,” Protein Eng Des Sel. 17(1):21-27；Wu, A.等(2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange ,” Protein Engineering 14(2):1025-1033；Asano等(2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain ,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992；Takemura, S.等(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588；Baeuerle, P.A.等(2009) “Bispecific T cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy ,” Cancer Res. 69(12):4941-4944)。
雙抗體的設計基於單鏈可變結構域片段(scFv )的結構，其中輕鏈和重鏈可變結構域利用短連接肽相互連接。Bird等人(1988) (“Single-Chain Antigen-Binding Proteins ,” Science 242:423-426)描述了在一個可變結構域的羧基端和另一可變結構域的氨基端之間架起約3.5 nm的橋的連接肽的實例。已經設計和使用了其它序列的連接體(Bird等(1988) “Single-Chain Antigen-Binding Proteins ,” Science 242:423-426)。為了另外的功能、諸如藥物的連接或連接至固體載體，又可對連接體進行修飾。單鏈變體可以重組或合成產生。對於scFv的合成產生，可以使用自動合成器。對於scFv的重組產生，包含編碼scFv的多核苷酸的合適質粒可以被引入到合適的宿主細胞，真核細胞，諸如酵母、植物、昆蟲或哺乳動物細胞，或者原核細胞，諸如大腸桿菌(E. coli )。編碼目標scFv的多核苷酸可以通過常規操作、諸如多核苷酸的連接進行製備。所得scFv可以採用本領域已知的標準蛋白質提純技術進行分離。
提供非單特異性“雙抗體 ”相對於抗體帶來了顯著的優勢：共連接和共定位表達不同表位的細胞的能力。因此，雙特異性雙抗體具有廣泛範圍的應用，包括治療和免疫診斷。雙特異性允許在各種應用中在雙抗體的設計和改造上具有很大的靈活性，提供對多聚體抗原的增強的親合力、不同抗原的交聯、並且依賴於兩個靶抗原的存在定向靶向特定的細胞類型。由於它們的雙價、低解離率和從迴圈中快速清除(對於小尺寸的雙抗體，處於約50 kDa或低於約50 kDa)，本領域中已知的雙抗體分子還在腫瘤造影領域中顯示出特定用途(Fitzgerald等(1997)“Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221-1225)。
產生雙特異性雙抗體的能力已經導致它們用於(以“反式 ”)將兩個細胞共同連接在一起，例如通過共同連接不同細胞表面上存在的受體(例如，將細胞毒性T-細胞交聯到靶細胞，諸如表達疾病抗原的癌症細胞或病原體感染細胞) (Staerz等(1985)“Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,” Nature 314:628-631，和Holliger等(1996)“Specific Killing Of LymphomaCells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305；Marvin等(2005) “Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies ,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658；Sloan等(2015) “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells ,” PLoS Pathog 11(11): e1005233. doi:10.1371/journal.ppat.1005233))。可替選地(或另外地)，雙特異性(或多特異性)雙抗體可用於(以“順式”)共同連接存在於相同細胞表面上的分子、諸如受體等。不同細胞和/或受體的共同連接可用於調節效應子功能和/或免疫細胞信號傳導。包含表位元結合結構域的多特異性分子(例如，雙特異性雙抗體)可定向於在T淋巴細胞、天然殺傷(NK)細胞、抗原呈遞細胞或其它單核細胞上表達的任何免疫細胞的表面決定子，諸如CD2、CD3、CD8、CD16、TCR、NKG2D等；或者定向於B細胞的表面決定子，諸如CD19、CD20、CD22、CD30、CD37、CD40和CD74 (Moore, P.A.等(2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B-Cell Lymphoma ,” Blood 117(17):4542-4551；Cheson, B.D.等(2008) “Monoclonal Antibody Therapy For B-Cell Non-Hodgkin’s Lymphoma ,” N. Engl. J. Med. 359(6):613-626；Castillo, J.等(2008) “Newer Monoclonal Antibodies For Hematological Malignancies ,” Exp. Hematol. 36(7):755-768)。具體地，定向於免疫效應細胞上存在的細胞表面受體的表位元結合結構域可用於能夠介導重定向的細胞殺傷的多特異性結合分子的產生。
在許多研究中，結合效應細胞決定子、例如Fcγ受體(FcγR)的雙抗體，也發現啟動效應細胞(Holliger等(1996)“Specific KillingOf Lymphoma Cells By Cytotoxic T cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305；Holliger等(1999)“Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins,” Cancer Res. 59:2909-2916；WO 2006/113665；WO 2008/157379；WO 2010/080538；WO 2012/018687；WO 2012/162068)。通常，效應細胞啟動經由Fc結構域-FcγR相互作用通過將結合抗原的抗體結合至效應細胞被觸發；因此，在這點上，雙抗體分子可呈現出像Ig一樣的功能性，無論它們是否包括Fc結構域(例如，如本領域已知的或本文例證的任何效應子功能試驗所測試的(例如ADCC試驗))。通過交聯腫瘤細胞和效應細胞，雙抗體不僅將效應細胞帶入靠近腫瘤細胞的位置內，而且引起有效的腫瘤殺傷(參見，例如Cao等(2003)“Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics,” Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197)。
然而，上述雙特異性雙抗體的優勢付出了巨大的代價。這種非單特異性雙抗體的形成需要成功組裝兩個或更多個截然不同的多肽(即，這種形成需要雙抗體通過不同多肽鏈種類的異源二聚化形成)。該事實與單特異性雙抗體相反，單特異性雙抗體通過相同多肽鏈的同源二聚化形成。因為必須提供至少兩個不相似的多肽(即兩個多肽種類)以便形成非單特異性雙抗體，並且因為這種多肽的同源二聚化導致非活性的分子(Takemura, S.等(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588)，所以這樣的多肽的產生必須以防止相同種類的多肽之間的共價結合的方式完成(即，以便防止同源二聚化) (Takemura, S.等(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588)。因此，現有技術已經教導了這類多肽的非共價締合(參見，例如，Olafsen等(2004)“Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27；Asano等(2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain ,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992；Takemura, S.等(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588；Lu, D.等( 2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672)。
然而，現有技術已經認識到由非共價締合的多肽組成的雙特異性雙抗體是不穩定的並且容易解離為非功能單多肽鏈單體(參見，例如Lu, D.等( 2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672)。
在面對該挑戰時，現有技術已經成功開發出穩定的、共價結合的異源二聚體非單特異性雙抗體，命名為DART® 雙抗體，參見例如D.D.等(2015) “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells ,” PLoS Pathog. 11(11):e1005233. doi: 10.1371/journal.ppat.1005233；Al Hussaini, M.等(2015) “Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART®) Platform ,” Blood pii: blood-2014-05-575704；Chichili, G.R.等(2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates ,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82；Johnson, S.等(2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion ,” J. Molec. Biol. 399(3):436-449；Veri, M.C.等(2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIB (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold ,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943；Moore, P.A.等(2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B-Cell Lymphoma ,” Blood 117(17):4542-4551；美國專利號8,044,180、8,133,982、8,187,593、8,193,318、8,530,627、8,669,349、8,778,339、8,784,808、8,795,667、8,802,091、8,802,093、8,946,387、8,968,730、和8,993,730；美國專利公開號2009/0060910、2010/0174053、2011/0081347、2011/0097323、2011/0117089、2012/0009186、2012/0034221、2012/0141476、2012/0294796、2013/0149236、2013/0295121、2014/0017237和2014/0099318；歐洲專利文獻號EP 1868650、EP 2158221、EP 2247304、EP 2252631、EP 2282770、EP 2328934、EP 2376109、EP 2542256、EP 2601216、EP 2714079、EP 2714733、EP 2786762、EP 2839842、EP 2840091；和PCT公開號WO 2006/113665、WO 2008/157379、WO 2010/027797、WO 2010/033279、WO 2010/080538、WO 2011/109400、WO 2012/018687、WO 2012/162067、WO 2012/162068、WO 2014/159940、WO 2015/021089、WO 2015/026892和WO 2015/026894)。這種雙抗體包括兩個或更多個共價複合的多肽，並且涉及將一個或多個半胱氨酸殘基工程化進入每個採用的多肽種類，其允許二硫鍵形成並且因此將一對或多對這樣的多肽鏈相互共價結合。例如，已經顯示將半胱氨酸殘基添加至這種構建體的C-末端以允許在所涉及的多肽鏈之間二硫鍵鍵合，從而穩定化所得的異源二聚體，而不干擾雙抗體的結合特徵。
最簡單的DART® 雙抗體包括兩條多肽鏈，每條多肽鏈包括三個結構域(圖 1A-1B )。第一多肽鏈包括：(i)包含第一免疫球蛋白的輕鏈可變結構域的結合區的結構域(VL1)，(ii)包含第二免疫球蛋白的重鏈可變結構域的結合區的第二結構域(VH2)，和(iii)用來促進與第二多肽鏈的異源二聚化(“異源二聚體促進結構域 ”)並且將雙抗體的第一多肽鏈共價結合至第二多肽鏈的第三結構域。第二多肽鏈包含互補第一結構域(VL2結構域)、互補第二結構域(VH1結構域)和與第一多肽鏈的第三結構域複合以促進異源二聚化(“異源二聚體促進結構域 ”)和與第一多肽鏈的共價鍵合的第三結構域。這種分子是穩定的、有效的並且具有同時結合兩個或更多個抗原的能力。在一個實施方式中，第一和第二多肽鏈的第三結構域各自包含半胱氨酸(“© ”)殘基，其用來通過二硫鍵將多肽結合在一起。一條或兩條多肽鏈的第三結構域可另外地具有CH2-CH3結構域的序列，以使雙抗體多肽的複合形成能夠結合細胞(如B淋巴細胞、樹突細胞、天然殺傷細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞和肥大細胞)的Fc受體的Fc結構域。已經描述了這種分子的許多變型(參見，例如美國專利公開號2013-0295121、2010-0174053、2007-0004909、2009-0060910；歐洲專利公開號EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221和PCT公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538、WO 2006/113665)並且在本文中提供。已經描述了這種分子的許多變型(參見，例如美國專利公開號2015/0175697、2014/0255407、2014/0099318、2013/0295121、2010/0174053、2009/0060910、2007-0004909；歐洲專利公開號EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221、EP 1868650；和PCT公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538、WO 2006/113665)並且在本文中提供。
對於期望雙特異性或三價分子但是不需要Fc的應用來說可替選構建體在本領域是已知的，包括但不限於雙特異性T細胞接合分子，也被稱為“BiTE® 抗體 ”(參見，例如，PCT公開號WO 1993/11161；和WO 2004/106381)，和四價串聯抗體，也被稱為“TandAbs® ” (參見，例如美國專利公開號2011-0206672；歐洲專利公開號EP 2371866；和PCT公開號WO 1999/057150、WO 2003/025018和WO 2013/013700)。BiTE由包含串聯連接的scFv的單條多肽鏈形成，而TandAb通過兩條相同多肽鏈的同源二聚化形成，該兩條多肽鏈各自具有VH1、VL2、VH2和VL2結構域。
本發明提供能夠增強針對表達疾病抗原的靶細胞(例如，癌症細胞或病原體感染的細胞、病原體等)的殺傷的免疫應答的雙特異性結合分子。這種雙特異性結合分子能夠結合“第一表位 ”和“第二表位 ”，其中這種表位之一是CD16的表位且這種表位中的另一個是疾病抗原(“DA ”)的表位。特定表位被命名為第一vs.第二表位是沒有關係的；這種標記法僅僅與本發明結合分子的多肽鏈的結構域的存在和取向有關。因此，本發明的雙特異性分子包括能夠結合CD16的表位的“VLCD16 ”/“VHCD16 ”結構域和能夠結合疾病抗原的表位的“VLDA ”/“VHDA ”結構域。本發明尤其包括利用本文提供的任意方法所產生的雙特異性雙抗體、BiTE、抗體和TandAb。A. 缺少 Fc 結構域的雙抗體
在一種實施方式中，本發明的CD16結合分子將是雙特異性雙抗體並且將包括能夠結合第一和第二表位元兩者的結構域，但將缺少Fc結構域，並且因此不能經由Fc-FcγR相互作用結合FcγR分子。然而，這種分子能經由它們的CD16結合結構域的SDR或CDR結合至CD16。Fc結構域的缺乏因此用於防止分子結合至非CD16 FcγR，諸如抑制性受體CD32B。
雙特異性雙抗體的這種實施方式的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上優選包括：N-端、能夠結合第一或第二表位的單克隆抗體的VL結構域(即，VLCD16 或VLDA )、第一間插間隔子肽(連接體1)、能夠結合疾病抗原的表位的單克隆抗體的VH結構域(如果這種第一多肽鏈包含VLCD16 )或能夠結合CD16的單克隆抗體的VH結構域(如果這種第一多肽鏈包含VLDA )、任選包含半胱氨酸殘基的第二間插間隔子肽(連接體2)、異源二聚體-促進結構域和C-端(圖 1A-1B )。
雙特異性雙抗體的這種實施方式的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合第一或第二表位的單克隆抗體的VL結構域(即，VLCD16 或VLDA ，並且為不是選擇用於包括在雙抗體的第一多肽鏈中的VL結構域)、間插間隔子肽(連接體1)、能夠結合第一或第二表位的單克隆抗體的VH結構域(即，VHCD16 或VHDA ，並且為不是選擇用於包括在雙抗體的第一多肽鏈中的VH結構域)、任選包含半胱氨酸殘基的第二間插間隔子肽(連接體2)、異源二聚體-促進結構域和C-端(圖 1A-1B )。所採用的對於特定表位特異性的VL和VH結構域優選獲自或衍生自相同單克隆抗體。然而，這種結構域可衍生自不同單克隆抗體，條件是它們締合以形成能免疫特異性地結合這種表位元的功能夠結合結構域。這種不同的抗體在本文中被稱為“相應 ”抗體。
第一多肽鏈的VL結構域與第二多肽鏈的VH結構域相互作用以形成對表位之一(例如，第一表位)特異性的第一功能表位元結合結構域。同樣，第二多肽鏈的VL結構域與第一多肽鏈的VH結構域以便形成對另一表位(即，第二表位)特異性的第二功能表位元結合結構域。因此，對第一和第二多肽鏈的VL和VH結構域的選擇進行“協調 ”，使得雙抗體的兩條多肽鏈共同地包括能夠結合第一表位和第二表位兩者的VL和VH結構域(即，它們共同地包括VLCD16 /VHCD16 和VLDA /VHDA )。
最優選地，對間插間隔子肽(即，“連接體 1 ”，其分開這種VL和VH結構域)的長度進行選擇以基本上或完全地防止多肽鏈的VL和VH結構域相互結合(例如，由0個、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個或9個間插連接體氨基酸殘基組成)。因此，第一多肽鏈的VL和VH結構域基本上或完全不能夠相互結合。同樣，第二多肽鏈的VL和VH結構域基本上或完全不能相互結合。優選的間插間隔子肽(連接體1)具有序列(SEQ ID NO:16 )：GGGSGGGG。
第二間插間隔子肽(“連接體 2 ”)的長度和組成基於一個或多個促進這種二聚化的多肽結構域(即，“異源二聚體 - 促進結構域 ”)的選擇進行選擇。典型地，第二間插間隔子肽(連接體2)將包含3-20個氨基酸殘基。具體地，在所採用的異源二聚體-促進結構域包含/不包含半胱氨酸殘基的情況下，使用包含半胱氨酸的第二間插間隔子肽(連接體2)。包含半胱氨酸的第二間插間隔子肽(連接體2)將包含1個、2個、3個或更多個半胱氨酸。優選的含半胱氨酸的間隔子肽(連接體2)具有序列GGCGGG (SEQ ID NO:17 )。可替選地，連接體2不包含半胱氨酸(例如，GGG、GGGS(SEQ ID NO:18 )、LGGGSG(SEQ ID NO:19 )、GGGSGGGSGGG(SEQ ID NO:20 )、ASTKG(SEQ ID NO:21 )、LEPKSS(SEQ ID NO:22 )、APSSS(SEQ ID NO:23 )等)並且如下所述使用含半胱氨酸的異源二聚體-促進結構域。任選地，使用含半胱氨酸的連接體2和含半胱氨酸的異源二聚體-促進結構域兩者。
異源二聚體-促進結構域可以是一條鏈上的GVEPKSC (SEQ ID NO:24 )或VEPKSC (SEQ ID NO:25 )或AEPKSC (SEQ ID NO:26 )以及另一條多肽鏈上的GFNRGEC (SEQ ID NO:27 )或FNRGEC (SEQ ID NO:28 ) (US2007/0004909)。
在優選的實施方式中，異源二聚體-促進結構域將包括相反電荷的串聯重複螺旋結構域，例如“E-螺旋”異源二聚體-促進結構域(SEQ ID NO:29 ： E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K)，其谷氨酸殘基將在pH 7時形成負電荷，或“K-螺旋”異源二聚體-促進結構域(SEQ ID NO:30 ： K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E)，其賴氨酸殘基將在pH 7時形成正電荷。這種帶電結構域的存在促進第一和第二多肽之間的締合，並且因而促進異源二聚體形成。可以利用異源二聚體-促進結構域，其包含上述E-螺旋和K-螺旋序列的修飾以便包括一個或多個半胱氨酸殘基。這種半胱氨酸殘基的存在允許一條多肽鏈上存在的螺旋變得與另一條多肽鏈上存在的互補螺旋共價鍵合，由此使多肽鏈相互共價鍵合並且增加雙抗體的穩定性。這種特別優選的異源二聚體-促進結構域的實例包括具有氨基酸序列 E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:31 )的修飾的E-螺旋，和具有氨基酸序列 K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:32 )的修飾的K-螺旋。
如在WO 2012/018687中所公開，為了提高雙抗體的體內藥代動力學特性，雙抗體可以進行修飾以在雙抗體的一個或個末端上包含血清結合蛋白的多肽部分。最優選地，血清結合蛋白的這種多肽部分將被安裝在雙抗體的多肽鏈的C-端。白蛋白是血漿中最豐富的蛋白並且在人中具有19天的半衰期。白蛋白具有幾個小分子結合結構域，這允許其非共價結合其它蛋白並且因此延長其血清半衰期。鏈球菌(Streptococcus)菌株G148的G蛋白的白蛋白-結合結構域3 (ABD3)由形成穩定三螺旋束的46個氨基酸殘基組成並且具有寬的白蛋白結合特異性(Johansson, M.U.等(2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Module s,” J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120)。因此，用於提高雙抗體的體內藥物動力學特性的血清結合蛋白的特別優選的多肽部分是來自鏈球菌G蛋白的白蛋白-結合結構域(ABD)，並且更優選地鏈球菌菌株G148的G蛋白的白蛋白-結合結構域3(ABD3) (SEQ ID NO:33 ): LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALP。
如在WO 2012/162068(通過引用併入本文)中所公開，SEQ ID NO:33 的 “去免疫 ”變體具有減弱或消除MHC II類結合的能力。基於組合的突變結果，下述的置換組合被認為是用於形成這種去免疫ABD的優選置換：66D/70S +71A；66S/70S +71A；66S/70S +79A；64A/65A/71A；64A/65A/71A+66S；64A/65A/71A+66D；64A/65A/71A+66E；64A/65A/79A+66S；64A/65A/79A+66D；64A/65A/79A+66E。變體ABD具有修飾L64A、I65A和D79A或者修飾N66S、T70S和D79A。特別優選的是具有下列氨基酸序列： LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI D 66 NAK S 70 A 71 EGVKALIDE ILAALP (SEQ ID NO:34 )、 或者氨基酸序列： LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKN A 64 A 65 NNAKT VEGVKALI A 79 E ILAALP (SEQ ID NO:35) 、 或者氨基酸序列： LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI S 66 NAK S 70 VEGVKALI A 79 E ILAALP (SEQ ID NO:36) 的變體去免疫的ABD，因為這種去免疫的ABD呈現出基本上野生型的結合，同時提供減弱的MHC II類結合。因此，這種具有ABD的雙抗體的第一多肽鏈包含第三連接體(連接體3)，其優選位於這種多肽鏈的E-螺旋(或K-螺旋)結構域的C-末端以便間插在E-螺旋(或K-螺旋)結構域和ABD(其優選為去免疫的ABD)之間。這種連接體3的優選序列是SEQ ID NO:18 ：GGGS。B. 包含 Fc 結構域的雙抗體
本發明的一種實施方式涉及多特異性(例如，雙特異性、三特異性、四特異性等)雙抗體，其包含Fc結構域並且能同時結合CD16的表位和疾病抗原的表位。這種分子的Fc結構域可以是任何同種型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。所述分子可進一步包含CH1結構域和/或鉸鏈結構域。當存在時，CH1結構域和/或鉸鏈結構域可以是任何同種型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)，並且優選具有與期望Fc結構域相同的同種型。
將IgG的CH2-CH3結構域添加至雙抗體多肽鏈中的一者或兩者，使得雙抗體鏈的複合導致Fc結構域的形成、增加了雙抗體的生物學半衰期和/或改變雙抗體的價態。這種雙抗體包含兩條或更多條多肽鏈，其序列允許多肽鏈相互共價結合以形成能同時結合第一表位和第二表位的共價締合的雙抗體。將IgG的CH2-CH3結構域併入到雙抗體多肽的兩者上將允許形成兩鏈雙特異性含Fc結構域的雙抗體(圖 2 )。
可替選地，將IgG的CH2-CH3結構域併入雙抗體多肽中的僅僅一個上將允許形成更複雜的四鏈雙特異性含Fc結構域的雙抗體(圖 3A-3C )。圖 3C 顯示具有恆定輕(CL)結構域和恆定重CH1結構域的代表性四鏈雙抗體，然而可以可替選地採用這種結構域以及其它多肽的片段(參見，例如圖 3A 和 3B ，美國專利公開號2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；歐洲專利公開號EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221以及PCT公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538)。因此，例如，代替CH1結構域，可以採用衍生自人IgG的鉸鏈結構域的具有氨基酸序列GVEPKSC(SEQ ID NO:24 )、VEPKSC (SEQ ID NO:25 )或AEPKSC (SEQ ID NO:26 )的多肽，並且代替CL結構域，可以採用人κ輕鏈的C-末端的6個氨基酸，GFNRGEC (SEQ ID NO:27 )或FNRGEC (SEQ ID NO:28 )。代表性的含肽四鏈雙抗體顯示在圖 3A 中。可替選地或者另外地，可以採用這樣的肽，其包含相反電荷的串聯螺旋結構域，諸如“E-螺旋”螺旋形結構域(SEQ ID NO:29 ： E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K或SEQ ID NO:31 ： E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K)；和“K-螺旋”結構域(SEQ ID NO:30 ： K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E或SEQ ID NO:32 ： K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E)。代表性的包含螺旋結構域的四鏈雙抗體顯示在圖 3B 中。
本發明的包含Fc結構域的雙抗體分子可包含另外的間插間隔子肽(連接體)，一般這樣的連接體將被併入在異源二聚體結構域(例如，E-螺旋或K-螺旋)和CH2-CH3結構域之間和/或併入在CH2-CH3結構域和可變結構域(即，VH或VL)之間。典型地，另外的連接體將包含3-20個氨基酸殘基並且可任選地包含IgG鉸鏈結構域的全部或部分(優選地，IgG鉸鏈結構域的具有1個、2個、3個或更多個半胱氨酸殘基的含半胱氨酸部分)。可用在本發明的雙特異性包含Fc結構域的雙抗體分子中的連接體包括：GGGS (SEQ ID NO:18 )、LGGGSG (SEQ ID NO:19 )、GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:20 )、ASTKG (SEQ ID NO:21 )、LEPKSS (SEQ ID NO:22 )、APSSS (SEQ ID NO:23 )、APSSSPME (SEQ ID NO:37 )、VEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO:38 )、LEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO:39 )、DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40 )、scFv連接體：GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:41 )；“長”連接體：GGGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:42 )、GGC和GGG。LEPKSS (SEQ ID NO:22 )可以代替GGG或GGC使用以便於克隆。另外，氨基酸GGG或LEPKSS (SEQ ID NO:22 )可緊接DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:40) 以形成可替選的連接體：GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:43 )和LEPKSSDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:44 )。除了連接體外，本發明的雙特異性含Fc結構域的分子可包含IgG鉸鏈結構域，或本發明的雙特異性含Fc結構域的分子可包含代替連接體的IgG鉸鏈結構域。示例性的鉸鏈結構域包括：來自IgG1的EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:5 )、來自IgG2的ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:6 )、來自IgG3的ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKS CDTPPPCPRCP (SEQ ID NO:7 )、來自IgG4的ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO:8 )和ESKYGPPCP P CP (SEQ ID NO:9 )，包含穩定化S228P置換(如按照Kabat中所示的EU索引所編號)以減少鏈交換的IgG4鉸鏈變體。
如圖 3A-3C 所提供，本發明的包含Fc結構域的雙抗體可包含四條鏈。這種雙抗體的第一和第三多肽鏈包含三個結構域：(i)含VL1的結構域、(ii)含VH2的結構域、(iii)異源二聚體-促進結構域和(iv)含CH2-CH3序列的結構域。第二和第四多肽鏈包含：(i)含VL2的結構域、(ii)含VH1的結構域和(iii)異源二聚體-促進結構域，其中異源二聚體-促進結構域促進第一/第三多肽鏈與第二/第四多肽鏈的二聚化。第三和第四多肽鏈的VL和/或VH結構域以及第一和第二多肽鏈的VL和/或VH結構域可以相同或不同，以便允許單特異性的、雙特異性的或四特異性的四價結合。符號“VL3 ”和“VH3 ”分別表示結合這種雙抗體的“第三”表位元的輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域。符號“VL4 ”和“VH4 ”分別表示結合這種雙抗體的“第四”表位元的輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域。本發明的代表性四鏈雙特異性含Fc結構域的雙抗體的多肽鏈的一般結構提供在表1 中： HPD = 異源二聚體-促進結構域
在具體實施方式中，本發明的雙抗體是由總計四條多肽鏈構成的雙特異性的、三價的(即，具有四個表位元結合結構域)含Fc的雙抗體(圖 3A-3C )。本發明的雙特異性的、三價的含Fc的雙抗體包含兩個第一表位元結合結構域和兩個第二表位元結合結構域。
在進一步的實施方式中，本發明的含Fc結構域的雙抗體可包含三條多肽鏈。這種雙抗體的第一多肽包含三個結構域：(i)含VL1的結構域、(ii)含VH2的結構域和(iii)含CH2-CH3序列的結構域。這種雙抗體的第二多肽包含：(i)含VL2的結構域、(ii)含VH1的結構域和(iii)促進與雙抗體的第一多肽鏈異源二聚化和共價鍵合的結構域。這種雙抗體的第三多肽包CH2-CH3序列。因此，這種雙抗體的第一和第二多肽鏈一起締合以形成能夠結合第一或第二表位的VL1/VH1表位元結合結構域、以及能夠結合這種表位中的另一表位的VL2/VH2表位元結合結構域。第一和第二多肽通過在它們各自的第三結構域中的涉及二硫鍵的半胱氨酸殘基相互鍵合。特別地，第一和第三多肽鏈相互複合以形成經由二硫鍵穩定的Fc結構域。這種雙特異性雙抗體具有增強的功效。圖 4A 和 4B 示例這種雙抗體的結構。這種含Fc結構域的雙抗體可具有兩種取向的任一種(表 2 )： HPD = 異源二聚體-促進結構域
在具體實施方式中，本發明的雙抗體是由總計三條多肽鏈構成的雙特異性的、二價的(即，具有兩個表位元結合結構域)含Fc的雙抗體(圖 4A-4B )。本發明的雙特異性的、二價的含Fc的雙抗體包含一個對第一或第二表位免疫特異性的表位元結合結構域、以及能夠結合這種表位中的另一表位的VL2/VH2表位元結合結構域。
在進一步的實施方式中，含Fc結構域的雙抗體可包含總計五條多肽鏈。在特定的實施方式中，五條多肽鏈中的兩條具有相同的氨基酸序列。這種雙抗體的第一多肽鏈包含：(i)含VH1的結構域、(ii)含CH1的結構域和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域。第一多肽鏈可以是抗體的包含VH1和重鏈恆定區的重鏈。這種雙抗體的第二和第五多肽鏈包含：(i)含VL1的結構域和(ii)含CL的結構域。這種雙抗體的第二和/或第五多肽鏈可以是抗體的包含與第一/第三多肽鏈的VH1互補的VL1的輕鏈。第一、第二和/或第五多肽鏈可分離自天然發生的抗體。可替選地，它們可重組構建。這種雙抗體的第三多肽鏈包含：(i)含VH1的結構域、(ii)含CH1的結構域、(iii)含CH2-CH3序列的結構域、(iv)含VL2的結構域、(v)含VH3的結構域和(vi)異源二聚體-促進結構域，其中所述異源二聚體-促進結構域促進第三鏈與第四鏈的二聚化。這種雙抗體的第四多肽包含：(i)含VL3的結構域、(ii)含VH2的結構域和(iii)促進與雙抗體的第三多肽鏈的異源二聚化和共價鍵合的結構域。
因此，這種雙抗體的第一和第二多肽鏈、以及第三和第五多肽鏈一起締合以形成能夠結合第一表位的兩個VL1/VH1表位元結合結構域。這種雙抗體的第三和第四多肽鏈一起締合以形成能夠結合第二表位的VL2/VH2表位元結合結構域、以及能夠結合第三表位的VL3/VH3表位元結合結構域。第一和第三多肽通過在它們各自的恆定區中的涉及二硫鍵的半胱氨酸殘基相互鍵合。特別地，第一和第三多肽鏈相互複合以形成Fc結構域。這種多特異性雙抗體具有增強的功效。圖 5 示出這種雙抗體的結構。應理解，VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3結構域可以相同或不同，以便允許單特異性的、雙特異性的或三特異性的結合。
對多肽鏈的VL和VH結構域進行選擇以便形成對期望表位特異性的VL/VH表位元結合結構域。通過多肽鏈的締合形成的VL/VH表位元結合結構域可以相同或不同，以便允許單特異性的、雙特異性的、三特異性的或四特異性的四價結合。具體地，VL和VH結構域可以進行選擇，使得多價雙抗體可包含針對第一表位元的兩個結合結構域和針對第二表位元的兩個結合結構域；或者針對第一表位元的三個結合結構域和針對第二表位元的一個結合結構域；或者針對第一表位元的兩個結合結構域、針對第二表位元的一個結合結構域和針對第三表位元的一個結合結構域(如圖 5 中所描繪)。本發明的代表性五鏈含Fc結構域的雙抗體的多肽鏈的一般結構被提供在表 3 中： HPD = 異源二聚體-促進結構域
在具體實施方式中，本發明的雙抗體是由總計五條多肽鏈構成的雙特異性的、四價的(即，具有四個表位元結合結構域)含Fc的雙抗體，其具有對第一表位免疫特異性的兩個表位元結合結構域和對第二表位特異性的兩個表位元結合結構域。在另一實施方式中，本發明的雙特異性的、四價的、含Fc的雙抗體包含對第一表位免疫特異性的三個表位元結合結構域和對第二表位特異性的一個表位元結合結構域。如上所提供，VL和VH結構域可以進行選擇以允許三特異性結合。因此，本發明也涵蓋三特異性的、四價的、含Fc的雙抗體。本發明的三特異性的、四價的、含Fc的雙抗體包含對第一表位免疫特異性的兩個表位元結合結構域、對第二表位免疫特異性的一個表位元結合結構域、和對第三表位免疫特異性的一個表位元結合結構域。
在傳統的免疫功能中，抗體-抗原複合物與免疫系統的細胞的相互作用導致廣泛系列的應答，其範圍從效應子功能，諸如抗體依賴性細胞毒性、肥大細胞脫粒和吞噬作用到免疫調節信號，諸如調節淋巴細胞增殖和抗體分泌。所有這些相互作用通過抗體或免疫複合物的Fc結構域與造血細胞上的專用細胞表面受體的結合而啟動。如上所討論，由抗體和免疫複合物觸發的細胞應答的多樣性起因於三個Fc受體的結構異質性：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)和FcγRIII(CD16)是啟動型(即，免疫系統增強型)受體；FcγRIIB(CD32B)是抑制型(即，免疫系統減弱型)受體。此外，與新生Fc受體(FcRn)的相互作用介導IgG分子從內體到細胞表面並且釋放到血液中的再迴圈。上面呈現了示例性野生型IgG1(SEQ ID NO:12 )、IgG2(SEQ ID NO:13 )、IgG3(SEQ ID NO:14 )和IgG4(SEQ ID NO:15 )的氨基酸序列。
Fc結構域的修飾可導致表型改變，例如血清半衰期改變、穩定性改變、細胞酶敏感性改變或效應子功能改變。因此可期望例如就效應子功能而言修飾本發明的含Fc結構域的結合分子，以便增強這種分子在治療癌症方面的有效性。Fc結構域介導的效應子功能的減少或消除在某些情況下是期望的，例如在其作用機理涉及帶有靶抗原的細胞的阻截或對抗而非殺傷的抗體的情況下。增加的效應子功能當針對不期望的細胞、諸如腫瘤和外來細胞時一般是期望的，其中FcγR以低水準表達，例如具有低水準FcγRIIB的腫瘤特異性B細胞(例如，非霍奇金淋巴瘤、CLL和伯基特淋巴瘤)。本發明的具有這種賦予的或改變的效應子功能的分子可用於疾病、障礙或感染的治療和/或預防，其中效應子功能活性的療效增加是期望的。
因此，在某些實施方式中，本發明的含Fc結構域的分子的Fc結構域可以是工程化的變體Fc結構域。儘管本發明的雙特異性的含Fc結構域的分子的Fc結構域可具有結合一種或多種Fc受體(例如， FcγR)的能力，更優選地這種變體Fc結構域具有改變的結合FcγRIA(CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)(相對於野生型Fc結構域所呈現的結合)，例如將具有增強的結合啟動型受體和/或將具有基本上減少的或沒有結合一種或多種抑制型受體的能力。因此，本發明的含Fc結構域的分子的Fc結構域可以包括完整Fc結構域的CH2結構域的一些或全部和/或CH3結構域的一些或全部，或者可包含變體CH2和/或變體CH3序列(其相對於完整Fc結構域的CH2或CH3結構域可包括例如一個或多個插入和/或一個或多個缺失)。這種Fc結構域可包含非Fc肽部分，或者可包含非天然的完整Fc結構域的部分，或者可包含CH2和/或CH3結構域的非天然發生的取向(諸如，例如兩個CH2結構域或兩個CH3結構域、或者在N-末端至C-末端方向上，與CH2結構域連接的CH3結構域等)。
鑒別為改變效應子功能的Fc結構域修飾在本領域是已知的，包括增加結合啟動型受體(例如，FcγRIIA(CD16A)和減少結合抑制型受體(例如，FcγRIIB(CD32B)的修飾(參見，例如，Stavenhagen, J.B.等(2007) “Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors ,” Cancer Res. 57(18):8882-8890)。表 4 列出了增加結合啟動型受體和/或減少結合抑制型受體的示例性修飾的示例性單重、兩重、三重、四重或五重置換(編號(按照EU索引)和置換相對於上面所示的SEQ ID NO:12 的氨基酸序列)。
具有減少的結合CD32B和/或增加的結合CD16A的人IgG1 Fc結構域的示例性變體包含F243L、R292P、Y300L、V305I或P396L置換，其中所述編號是如Kabat中的EU索引的編號。這些氨基酸置換可以任意組合存在於人IgG1 Fc結構域中。在一種實施方式中，人IgG1 Fc結構域變體包含F243L、R292P和Y300L置換。在另一實施方式中，人IgG1 Fc結構域變體包含F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L置換。
在某些實施方式中，對於本發明含Fc結構域的結合分子的Fc結構域來說，優選的是呈現減少的(或基本上沒有)結合FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB (CD16b) (相對於野生型IgG1 Fc結構域(SEQ ID NO:12 )所呈現的結合)。在具體實施方式中，本發明的含Fc結構域的結合分子包含呈現減少的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)效應子功能的IgG Fc結構域。在優選的實施方式中，這種結合分子的CH2-CH3結構域包括下列置換中的任意1個、2個、3個或4個：L234A、L235A、D265A、N297Q和N297G，其中所述編號是如Kabat中的EU索引的編號。在另一實施方式中，CH2-CH3結構域包含N297Q置換、N297G置換、L234A和L235A置換或D265A置換，因為這些突變消除FcR結合。可替選地，利用固有地呈現減少的(基本上沒有)結合FcγRIIIA(CD16a)和/或減少的效應子功能(相對於由野生型IgG1 Fc結構域(SEQ ID NO:12 )所呈現的結合和效應子功能)的天然發生的Fc結構域的CH2-CH3結構域。在具體實施方式中，本發明的含Fc結構域的結合分子包含IgG2 Fc結構域(SEQ ID NO:13 )、IgG3 Fc結構域(SEQ ID NO:14 )或IgG4 Fc結構域(SEQ ID NO:15 )。當利用IgG4 Fc結構域時，本發明也包括引入穩定化突變，諸如上述鉸鏈區S228P置換(參見，例如，SEQ ID NO:11 )。由於N297G、N297Q、L234A、L235A和D265A置換消除了效應子功能，所以在期望效應子功能的環境下，將優選不利用這些置換。
對於具有減少或消除的效應子功能的本發明的含Fc結構域的分子的CH2和CH3結構域來說，優選的IgG1序列將包括置換L234A/L235A (SEQ ID NO:45 )： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
對於本發明的含Fc區的分子的CH2和CH3結構域來說，第二優選的IgG1序列包含S442C置換(底線所顯示)，以便允許兩個CH3結構域經由二硫鍵相互共價鍵合或允許藥物部分的接合。這種分子的氨基酸序列是(SEQ ID NO:46 )： APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS L C LSPG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
對於本發明的含Fc區的分子的CH2和CH3結構域來說，第三優選的IgG1序列包含L234A/L235A置換(底線所顯示)，其減少或消除效應子功能；以及S442C置換(底線所顯示)，其允許兩個CH3結構域經由二硫鍵相互共價鍵合或允許藥物部分的接合。這種分子的氨基酸序列是(SEQ ID NO:47 )： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS L C LSPG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
包含Fc結構域的蛋白質的血清半衰期可通過增加Fc結構域對FcRn的結合親和力而增加。如本文所用的術語“半衰期”意指分子的藥物動力學特性，其是所述分子在其施用後平均生存時間的度量。半衰期可表示為從受試者(例如，人患者或其它哺乳動物)的身體或其特定區室消除已知量的百分之五十(50%)的分子需要的時間，例如，如在血清中測量的，即迴圈半衰期，或在其他組織中測量的。一般而言，半衰期的增加導致施用的分子在迴圈中的平均停留時間(MRT)的增加。
在一些實施方式中，本發明的含Fc結構域的結合分子包含變體Fc結構域，所述變體Fc結構域包含相對於野生型Fc結構域的至少一個氨基酸修飾，使得所述分子具有增加的半衰期(相對於如果包含野生型Fc結構域的這種分子)。在一些實施方式中，本發明的含Fc結構域的結合分子包含變體IgG Fc結構域，所述變體IgG Fc結構域包含在選自由下列組成的組的一個或多個位置處的半衰期延長的氨基酸置換：238、250、252、254、256、257、256、265、272、286、288、303、305、307、308、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428、433、434、435和436，其中所述編號是如Kabat中的EU索引的編號。能夠增加含Fc結構域的分子的半衰期的許多突變在本領域是已知的，並且包括例如M252Y、S254T、T256E和其組合。例如，參見下列中描述的突變：美國專利號6,277,375、7,083,784、7,217,797、8,088,376；美國公開號2002/0147311、2007/0148164；和PCT公開號WO 98/23289、WO 2009/058492和WO 2010/033279，其通過引用以其全部內容併入本文。
在一些實施方式中，呈現增加的半衰期的本發明的含Fc結構域的結合分子具有變體Fc結構域，所述變體Fc結構域包括在Fc結構域殘基250、252、254、256、257、288、307、308、309、311、378、428、433、434、435和436中的兩個或更多個上的置換。具體地，選自下列的兩個或更多個置換：T250Q、M252Y、S254T、T256E、K288D、T307Q、V308P、A378V、M428L、N434A、H435K和Y436I，其中所述編號是如Kabat中的EU索引的編號。在具體實施方式中，這種分子可具有變體IgG Fc結構域，所述變體IgG Fc結構域包括下列置換： (A) M252Y、S254T和T256E； (B) M252Y和S254T； (C) M252Y和T256E； (D) T250Q和M428L； (E) T307Q和N434A； (F) A378V和N434A； (G) N434A和Y436I； (H) V308P和N434A；或 (I) K288D和H435K。
在優選的實施方式中，本發明的含Fc結構域的CD16 x DA 結合分子具有變體IgG Fc區，所述變體IgG Fc區包含下列置換中的1個、2個或3個：M252Y、S254T和T256E。本發明進一步涵蓋具有變體IgG Fc區的CD16 x DA 結合分子，所述變體IgG Fc區包含： (A) 改變效應子功能和/或FcγR的一個或多個突變；和 (B) 延長血清半衰期的一個或多個突變。
本發明的含Fc結構域的分子的CH2和CH3結構域的IgG1序列，其提供增加的半衰期(並且其在結合食蟹猴和人FcRn兩者方面具有10倍增加) (Dall’Acqua, W.F.等(2006) “Properties of Human IgG1s Engineered for Enhanced Binding to the Neonatal Fc Receptor (FcRn) ,” J. Biol. Chem. 281(33):23514-23524)，將包含置換M252Y/S254T/T256E (SEQ ID NO:48 )： APELLGGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
本發明的含Fc結構域的分子的CH2和CH3結構域的可替選IgG1序列，其組合了由置換L234A/L235A所提供的減少或消除的效應子功能和由置換M252Y/S254T/T256E所提供的增加的血清半衰期，由SEQ ID NO: 49 提供： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
本發明的含Fc區的分子的CH2和CH3結構域的進一步優選的IgG1序列包含L234A/L235A置換(底線所顯示)，其減少或消除效應子功能；和M252Y、S254T和T256E置換(底線所顯示)，以便延長血清半衰期；和S442C置換(底線所顯示)，以便允許兩個CH3結構域經由二硫鍵相互共價鍵合或允許藥物部分的接合。這種分子的氨基酸序列是(SEQ ID NO:50 )： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS L C LSPG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
對於期望具有不同氨基酸序列的含Fc結構域的多肽鏈(例如，其含Fc結構域的多肽鏈期望是不相同的)的某些抗體、雙抗體和三價結合分子，期望減少或防止同源二聚化發生在相同鏈的CH2-CH3結構域之間(例如，兩條第一多肽鏈，或者兩條第三多肽鏈的CH2-CH3結構域之間)。這種多肽鏈的CH2和/或CH3結構域在序列上不需要相同，並且有利地被修飾以促進兩條多肽鏈之間的異源二聚體複合。例如，氨基酸置換(優選地，用包含形成“杵 (knob) ”的龐大側基的氨基酸、例如色氨酸置換)可引入到CH2或CH3結構域，使得空間干擾將防止與類似的突變結構域的相互作用，並且將迫使突變的結構域與互補或適應性的突變已經被工程化到其中的結構域、即“臼 (hole) ”(例如，用甘氨酸置換)配對。這樣的突變組可被工程化進入任意對的多肽，其包含形成促進異源二聚化的Fc結構域的CH2-CH3結構域。相對於同源二聚化，支持異源二聚化的蛋白質工程化方法是本領域眾所周知的，特別是關於免疫球蛋白樣的分子的工程化方面，並且該方法涵蓋在本文中(參見，例如Ridgway等(1996)“‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621；Atwell等(1997)“Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26-35；和Xie等(2005)“A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101，其各自在此通過引用以其全部內容併入本文)。
優選的杵通過修飾IgG Fc結構域以包含修飾T366W形成。優選的臼通過修飾IgG Fc結構域以包含修飾T366S、L368A和Y407V形成。為了有助於從最終的雙特異性異源二聚體的含Fc結構域的分子中純化帶有臼的多肽鏈同源二聚體，多肽鏈的帶有臼的CH2和CH3結構域的蛋白A結合結構域優選地通過在位置435處的氨基酸置換(H435R)而突變。因此，帶有臼的多肽鏈同源二聚體將不會結合蛋白A，而雙特異性異源二聚體將保留其經由蛋白A結合結構域結合蛋白A的能力。在可替選的實施方式中，帶有臼的多肽鏈可在位置434和435處含有氨基酸置換(N434A/N435K)。
本發明的含Fc結構域的分子的一條含Fc結構域的多肽鏈的CH2和CH3結構域的優選IgG1氨基酸序列將具有“帶有杵 ”的序列(SEQ ID NO:51 )： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL W CLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
本發明的含Fc結構域的分子(其具有M252Y/S254T/T256E置換和“帶有杵”的序列)的一條含Fc結構域的多肽鏈的CH2和CH3結構域的可替選IgG1氨基酸序列是SEQ ID NO:52 ： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL W CLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
本發明的具有兩條多肽鏈的含Fc結構域的分子的另一條含Fc結構域的多肽鏈(或者具有三條、四條或五條多肽鏈的含Fc結構域的分子的第三多肽鏈)的CH2和CH3結構域的優選IgG1氨基酸序列將具有“帶有臼的”序列(SEQ ID NO:53 )： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL S C A VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V SKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN R YTQKS LSLSPG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
本發明的含Fc結構域的分子的另一含Fc結構域的多肽鏈的CH2和CH3結構域的可替選IgG1氨基酸序列(其具有M252Y/S254T/T256E置換和“帶有臼的”序列)是SEQ ID NO:54 ： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL S C A VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLV SKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNR YTQKS LSLSPG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
如將指出的，SEQ ID NO:51 、 SEQ ID NO:52 、 SEQ ID NO:53 和 SEQ ID NO:54 的 CH2-CH3結構域包括在位置234處用丙氨酸的置換和在位置235處用丙氨酸的置換，並且因此形成呈現出減少(或基本上沒有)的結合FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)(相對於由野生型Fc結構域(SEQ ID NO:12 )呈現出的結合)的Fc結構域。本發明也涵蓋這種CH2-CH3結構域，其包括野生型丙氨酸殘基，改變Fc結構域的效應子功能和/或FγR結合活性的可替選的和/或另外的置換。本發明也涵蓋這種CH2-CH3結構域，其進一步包括一個或多個半衰期延長的氨基酸置換。具體地，本發明包括進一步包含M252Y/S254T/T256E的這種帶有臼和這種帶有杵的CH2-CH3結構域。
本發明含Fc結構域的分子的一條含Fc結構域的多肽鏈的CH2和CH3結構域的IgG4氨基酸序列由於其具有Y252/T254/E256而具有增加的血清半衰期(相對於IgG1的CH2和CH3結構域) (SEQ ID NO:55 )： APEFLGGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
這種IgG4的CH2-CH3氨基酸序列的“帶有杵”的變體具有SEQ ID NO:56 的氨基酸序列： APEFLGGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSL W CLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
這種IgG4的CH2-CH3氨基酸序列的“帶有臼”的變體具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列： APEFLGGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSL S CA V K GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V SRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHN R YTQKS LSLSLG X 其中 X 是賴氨酸(K)或不存在。
優選地，第一多肽鏈將具有“帶有杵的”CH2-CH3序列，諸如SEQ ID NO:51 或 SEQ ID NO:52 的序列。然而，如將所認識到的，“帶有臼的”CH2-CH3結構域(例如， SEQ ID NO:53 或SEQ ID NO:54 )可以被應用在第一多肽鏈中，在這種情況下，“帶有杵的”CH2-CH3結構域(例如，SEQ ID NO:51 或SEQ ID NO:52 )將被應用在本發明的具有兩條多肽鏈的含Fc結構域的分子的第二多肽鏈中(或者被應用在具有三條、四條、或五條多肽鏈的含Fc結構域的分子的第三多肽鏈中)。
在其它實施方式中，本發明涵蓋含Fc結構域的結合分子，其包含已經利用本領域已知的突變進行工程化以相比同源二聚化支持異源二聚化的CH2和/或CH3結構域，諸如在PCT公開號WO 2007/110205、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/06867中所公開的那些，所有文獻均以其全部內容通過引用併入本文。III ．包含 Fc 結構域的三價結合分子
本發明進一步的實施方式涉及三價結合分子，其包含能夠同時結合第一表位、第二表位和第三表位元的Fc結構域，其中這種表位中的至少一個表位與另一個表位不相同。這種三價結合分子包含三個表位元結合結構域，其中兩個是雙抗體型結合結構域，其提供結合結構域A和結合結構域B，且其中之一是Fab型結合結構域或scFv型結合結構域，其提供結合結構域C(參見，例如，圖 6A-6H ， PCT公開號WO 2015/184207和WO 2015/184203)。這種三價結合分子因此包含能夠結合這種三價結合分子中的第一表位的“VL1 ”/“VH1 ”結構域和能夠結合第二表位的“VL2 ”/“VH2 ”結構域以及能夠結合“第三”表位的“VL3 ”和“VH3 ”結構域。“雙抗體型結合結構域”是存在於雙抗體中的那種表位元結合結構域，如上所述。“Fab型結合結構域”和“scFv型結合結構域”中的每一種均是這樣的表位元結合結構域，其通過免疫球蛋白輕鏈的VL結構域和免疫球蛋白重鏈的互補VH結構域的相互作用形成。Fab型結合結構域與雙抗體型結合結構域的區別在於形成Fab型結合結構域的兩條多肽鏈僅包含單個表位元結合結構域，而形成雙抗體型結合結構域的兩條多肽鏈包含至少兩個表位元結合結構域。類似地，scFv型結合結構域與雙抗體型結合結構域的區別也在於它們僅包含單個表位元結合結構域。因此，如本文所用，Fab型和scFv型結合結構域與雙抗體型結合結構域是截然不同的。
典型地，本發明的三價結合分子將包含四條不同的多肽鏈(參見圖6A-6B)，然而，所述分子可包含更少或更多數目的多肽鏈，例如通過將這樣的多肽鏈相互融合(例如，經由肽鍵)、或者將這樣的多肽鏈分開以形成另外的多肽鏈、或者通過將更少或另外的多肽鏈經由二硫鍵締合。圖 6E-6F 通過示意性地描繪具有三條多肽鏈的這種分子說明本發明的這一方面。如圖 6A-6H 中所提供，本發明的三價結合分子可具有可替選的取向，其中雙抗體型結合結構域是N-末端(圖 6A 、 6B 、 6C 、 6E 和 6F )或C-末端(圖 6D 、 6G 和 6H )至Fc結構域 。可用於產生三價結合分子的CH2和CH3結構域在上文提供並且包括帶有杵的和帶有臼的結構域。
在某些實施方式中，本發明的這種三價結合分子的第一多肽鏈包含：(i)含VL1的結構域、(ii)含VH2的結構域、(iii)異源二聚體-促進結構域和(iv)含CH2-CH3序列的結構域。VL1和VL2結構域位於至含CH2-CH3的結構域的N-末端或C-末端，如表4 所示(也參見圖 6A 和 6B )。這種實施方式的第二多肽鏈包含：(i)含VL2的結構域、(ii)含VH1的結構域和(iii)異源二聚體-促進結構域。這種實施方式的第三多肽鏈包含：(i)含VH3的結構域、(ii)含CH1的結構域和(iii)含CH2-CH3序列的結構域。第三多肽鏈可以是抗體的包含VH3和重鏈恆定區的重鏈，或者包含這種結構域的多肽。這種實施方式的第四多肽包含：(i)含VL3的結構域和(ii)含CL的結構域。第四多肽鏈可以是抗體的包含與第三多肽鏈的VH3互補的VL3的輕鏈，或者包含這種結構域的多肽。第三或第四多肽鏈可以分離自天然發生的抗體。可替選地，它們可以重組地、合成地或者通過其它手段構建。
第一和第二多肽鏈的輕鏈可變結構域通過間插間隔子肽與這種多肽鏈的重鏈可變結構域分開，所述間插間隔子肽的長度太短而不能允許第一和第二多肽鏈的VL1/VH2(或其VL2/VH1)結構域一起締合以形成能夠結合第一或第二表位元的表位元結合結構域。用於此目的的優選間插間隔子肽(連接體1)具有序列(SEQ ID NO:16 )：GGGSGGGG。三價結合分子的其它結構域可以通過任選地包含半胱氨酸殘基的間插間隔子肽(連接體)分開。具體地，如上所提供，這種連接體將典型地被併入在可變結構域(即，VH或VL)和肽異源二聚體-促進結構域(例如，E-螺旋或K-螺旋)之間以及在這樣的肽異源二聚體-促進結構域(例如，E-螺旋或K-螺旋)和CH2-CH3結構域之間。用於產生三價結合分子的示例性連接體被在上文提供並且也被提供在PCT公開號：PCT/US15/33081和PCT/US15/33076中。因此，這種三價結合分子的第一和第二多肽鏈締合在一起以形成能夠結合第一表位的VL1/VH1結合結構域，以及能夠結合第二表位的VL2/VH2結合結構域。這種三價結合分子的第三和第四多肽鏈締合在一起以形成能夠結合第三表位的VL3/VH3結合結構域。
如上所述，本發明的三價結合分子可包含三個多肽。包含三條多肽鏈的三價結合分子可在N-末端通過將第四多肽的結構域連接至第三多肽的含VH3的結構域(例如，利用間插間隔子肽(連接體 4 ))獲得。可替選地，使用本發明的三價結合分子的第三多肽鏈，其包含下列結構域：(i)含VL3的結構域、(ii)含VH3的結構域和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域，其中所述VL3和VH3通過間插間隔子肽彼此間隔開，所述間插間隔子肽足夠長(至少9個或更多個氨基酸殘基)以便允許這些結構域的締合以形成表位元結合結構域。用於此目的的一個優選的間插間隔子肽具有序列：GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:41 )。
將會理解，這種三價結合分子的VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3結構域可以不同以便允許結合是單特異性的、雙特異性的或三特異性的。具體地，VL和VH結構域可以進行選擇以便三價結合分子包含用於第一表位元的兩個結合結構域和用於第二表位元的一個結合結構域；或者用於第一表位元的一個結合結構域和用於第二表位元的兩個結合結構域；或者用於第一表位元的一個結合結構域、用於第二表位元的一個結合結構域和用於第三表位元的一個結合結構域。
本發明的代表性三價結合分子的多肽鏈的一般結構在圖 6A-6H 和表 5 中提供： HPD = 異源二聚體-促進結構域
如上所提供，這種三價結合分子可包含三條、四條、五條或更多條多肽鏈。IV ．本發明的實施方式
如上所述，本發明涉及CD16 x DA 結合分子 (例如，抗體、雙抗體、scFv、抗體、TandAb等)，其包含能夠結合CD16的表位元的結合結構域(即，“CD16-結合結構域”)和能夠結合疾病抗原的表位元的結合結構域(即，“疾病抗原-結合結構域”)。本發明因此包括這樣的結合分子，其包含抗體的結合至CD16的VH和/或VL結構域中的一個或多個，或者更優選地，這種結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3以及CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3部分。在本發明的優選實施方式中，這種結合分子將另外包含結合結構域，其足以允許這種分子結合至一種、兩種、三種或多於三種的疾病抗原的表位。本發明也涉及包含這種分子(一種或多種)的藥物組合物。
通過具有足以免疫特異性地結合CD16和疾病抗原的結合結構域，本發明的分子具有將CD16表達細胞(和尤其天然殺傷細胞)共同定位到表達疾病抗原的細胞的位點的能力，以便提高ADCC-介導的殺傷靶細胞的可能性。如上所討論，這種分子可以是雙特異性的，或者可以能夠結合多於兩個的表位。
在一種實施方式中，本發明的CD16結合分子將是單特異性的，以便具有結合至CD16的僅僅單個表位和疾病抗原的僅僅單個表位的能力。
可替選地，這種分子可以是多特異性的，即能夠結合一個、兩個、三個或總計四個表位元，其可以任何方式分配以結合CD16的一個、兩個或三個表位(其兩個或三個CD16表位可以相同或不同)和一個或多個疾病抗原的三個、兩個或一個表位。
因此，在這種分子能免疫特異性地結合至僅僅單個疾病抗原的情況下，它們可以能夠免疫特異性地結合至僅僅一個CD16表位以及疾病抗原中的一個、兩個或三個表位(其兩個疾病抗原表位可以相同或不同，並且其三個表位可以相同、或可以不同、或者可以是相同的兩個表位和不同的一個表位)，或者它們可以能夠免疫特異性地結合至僅僅兩個CD16表位(其兩個表位可以相同或不同)和疾病抗原的一個或兩個表位(其兩個疾病抗原表位可以相同或不同)，或者它們可以能夠免疫特異性地結合至三個CD16表位(其三個表位可以相同、或可以不同、或者可以是相同的兩個表位和不同的一個表位)和疾病抗原的一個表位。
類似地，在這種分子能夠免疫特異性結合兩種不同疾病抗原(例如，第一疾病抗原和第二疾病抗原)的情況下，它們可以能夠免疫特異性地結合至僅僅一個CD16表位以及第一疾病抗原的一個或兩個表位(其兩個第一疾病抗原表位可以相同或不同)和第二疾病抗原的兩個或一個表位(其兩個第二疾病抗原表位可以相同或不同)，或者它們可以能夠免疫特異性地結合至僅僅兩個CD16表位(其兩個表位可以相同或不同)以及第一疾病抗原的一個表位和第二疾病抗原的一個表位。
類似地，這種分子可以能夠免疫特異性結合至三個不同的疾病抗原(例如，第一疾病抗原、第二疾病抗原和第三疾病抗原)和僅僅一個CD16表位。
因此，例如，這種分子可結合： (1) CD16的單個表位和排列在靶細胞表面上的疾病抗原的單個表位； (2) CD16的單個表位和排列在靶細胞表面上的疾病抗原的兩個表位； (3) CD16的單個表位和排列在靶細胞表面上的疾病抗原的三個表位； (4) CD16的單個表位、排列在靶細胞表面上的第一疾病抗原的一個表位和排列在靶細胞表面上的第二疾病抗原的一個表位； (5) CD16的單個表位、排列在靶細胞表面上的第一疾病抗原的兩個表位和排列在靶細胞表面上的第二疾病抗原的一個表位； (6) CD16的兩個表位和排列在靶細胞表面上的疾病抗原的單個表位； (7) CD16的兩個表位和排列在靶細胞表面上的疾病抗原的兩個表位； (8) CD16的兩個表位以及排列在靶細胞表面上的第一疾病抗原的一個表位和排列在靶細胞表面上的第二疾病抗原的一個表位； (9) CD16的三個表位和排列在靶細胞表面上的疾病抗原的一個表位； 在其中結合至CD16或疾病抗原的多於一個表位元的所有情況下，這樣的表位可以相同或者可以不同、或者可以與一個這樣的表位相同或者與另一個這樣的表位不同。
表 6 示例本發明的示例性分子的可能的組合結合特異性。
通過形成更複雜的分子，可以獲得能夠結合一個或多個疾病抗原並且具有多於四個表位元結合結構域的CD16-結合分子。因此，對可由本發明的分子結合的表位或另外的表位的性質沒有限制，除了這種另外的結合能力不阻止能夠結合CD16的表位的分子或其結合結構域進行這種結合並且不阻止能夠結合疾病抗原的表位的分子或其結合結構域進行這種結合。因此，本發明的CD16結合分子可具有表位元結合結構域可替選的或另外的表位元結合結構域。作為實例，本發明考慮這樣的結合分子，其包含能夠免疫特異性地結合CD16的表位的第一表位元結合結構域以及能夠免疫特異性地結合排列在靶細胞表面上的疾病抗原的表位的第二表位元結合結構域和能夠免疫特異性地結合不同細胞表面分子(諸如天然殺傷細胞的非CD16的細胞表面分子)的第三表位元結合結構域。V. 示例性結合分子
本發明涉及由於其具有CD16結合結構域而能夠結合人CD16的分子(例如，抗體、雙抗體、scFv、抗體、TandAb等)。本發明特別地涉及這樣的CD-16結合分子，其為CD16 x DA 結合分子。 下面所列的是可用於產生本發明的結合分子和組合療法的示例性抗體。A. 示例性抗人 CD16 抗體 1. CD16-M1 和 CD16-M2 及其人源化衍生物 hCD16-M1 和 hCD16-M2
本發明提供鼠抗人CD16單克隆抗體：CD16-M1 和CD16-M2 及其人源化衍生物：hCD16-M1 和hCD16-M2 ，其是新型的高親和力抗人CD16單克隆抗體，很好地結合至CD16 158F異型和CD16 158V異型兩者，並且在不阻礙CD16-IgG結合的位點結合CD16。這種抗體對於的本發明的目的來說是特別優選的，因為它們可容易地應用在患者群體中，無論其158F/158V CD16A多態性。（ a ）抗人 CD16 單克隆抗體 CD16-M1
鼠抗人CD16單克隆抗體CD16-M1 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:64 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： EVKLVESGGT LVKPGGSLKL SCAASGFTFN NYGMS WVRQT PEKRLEWVA T ISGGGSYTFY PDSVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMSSLRSED TALYYCIR QS ARAPEPY WGQ GTLVTVSS
鼠抗人CD16單克隆抗體CD16-M1 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:65 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： DIVMTQSQKF MSTSVGDRVS VTC KASQNVG THVA WYQQKS GQSPKSLLY S ASYRYS GVPD RFSGSGSGTD FTLTISNVQS EDLAEYFC QQ YKSYPLT FGA GTKLELK
抗人CD16單克隆抗體CD16-M1 的CDRs在表 7 中顯示。
hCD16-M1 是鼠抗人CD16單克隆抗體CD16-M1 的人源化衍生物。hCD16-M1 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:72 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS NYGMS WVRQA PGKGLEWVA T ISGGGSYTFY PDSVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRTED TALYYCVR QS ARAPEPY WGQ GTLVTVSS
hCD16-M1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:73)顯示在下面(CDRL殘基用底線顯示)： DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITC RASQNVG THVA WYQQKP GKAPKSLLY S ASYRYS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQS EDIATYYC QQ YKSYPLT FGQ GTKLEIK
hCD16-M1A 是人源化抗人CD16單克隆抗體hCD16-M1 的優化衍生物。hCD16-M1A 包含hCD16-M1 的VL結構域(SEQ ID NO:73 )和在CDRH 3中含有突變的優化VH結構域。hCD16-M1A 的優化VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:58 )顯示在下面(突變的CDRH 3殘基用底線顯示)： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS NYGMSWVRQA PGKGLEWVAT ISGGGSYTFY PDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRTED TALYYCVRQS A NS P V PYWGQ GTLVTVSS
hCD16-M1B 是人源化抗人CD16單克隆抗體hCD16-M1 的優化衍生物。hCD16-M1B 包含hCD16-M1 的VH結構域(SEQ ID NO:72 )和在CDRL 3中含有突變的優化VL結構域。hCD16-M1B 的優化VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:59 )顯示在下面(突變的CDRL 3殘基用底線顯示)： DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQNVG THVAWYQQKP GKAPKSLLYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQS EDIATYYCQ D Y TN YPLTFGQ GTKLEIK
hCD16-M1AB 是人源化抗人CD16單克隆抗體hCD16-M1 的優化衍生物。hCD16-M1AB 包含hCD16-M1A 的優化VH結構域(SEQ ID NO:58 )和hCD16-M1B 的優化VL結構域(SEQ ID NO:59 )。
人源化抗人CD16單克隆抗體hCD16-M1 和優化的抗人 CD16單克隆抗體hCD16-M1A 、 hCD16-M1B 、 hCD16-M1AB 的 CDRs在表 8 中顯示。
如將要認識到的，hCD16-M1 、 hCD16-M1A 、 hCD16-M1B 和 hCD16-M1AB 的CDRL 1(RASQNVGTHVA; SEQ ID NO:74 )在其第一殘基不同於CD16-M1 的CDRL 1(KASQNVGTHVA; SEQ ID NO:69) 。任一 CDRL 1可互換地應用，並且本發明涵蓋人源化且優化的CD16結合分子，其包含具有下列CDRH 中的1個、2個或3個和/或這種CDRL 中的1個、2個或3個的氨基酸序列的CD16表位元結合結構域。（ b ）抗人 CD16 單克隆抗體 CD16-M2
鼠抗人CD16單克隆抗體CD16-M2 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:75 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： EVQLQQSGPE LVKPGASVKM SCKASGYTFT SSAMH WVKKN PGQGLEWIG Y INHYNDGIKY NERFKG KATL TSDKSSSTAY MELSSLTSED SAVYYCAT GY RYASWFAS WG QGTLVTVSS
鼠抗人CD16單克隆抗體CD16-M2 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:76 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： DILLTQSPAI LSVSPGERVS FSC RASQNIG TSIH WYQQRT DGSPRLLIK S VSESIS GIPS RFSGSGSGTD FTLTINGVES GDISDYYC QQ SNSWPLT FGA GTKLELK
抗人CD16單克隆抗體CD16-M2 的 CDRs在表 9 中顯示：
hCD16-M2 是 鼠抗人CD16單克隆抗體CD16-M2 的人源化衍生物。人源化導致兩個合適的VH結構域(hCD16-M2 VH1 和 hCD16-M2 VH2 )，其中任何一個均可以與所獲得的人源化VL結構域(hCD16-M2 VL1 )一起使用。
hCD16-M2 VH1 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:83 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SSAMH WVRQA PGQGLEWMG Y INHYNDGIKY NERFKG RVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAT GY RYASWFAS WG QGTLVTVSS
hCD16-M2 VH2 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:84 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SSAMH WVRQA PGQGLEWMG Y INHYNDGIKY NERFKG RVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR GY RYASWFAS WG QGTLVTVSS
如將要認識到的，hCD16-M2 VH1的氨基酸序列(SEQ ID NO:83)與hCD16-M2 VH2 的氨基酸序列(SEQ ID NO:84 )的區別在於在緊挨著CDRH 3之前的殘基中具有T98R置換(上面加框顯示)。
hCD16-M2 VL1 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:85 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： EIVLTQSPAT LSVSPGERAT LSC RASQNIG TSIH WYQQKP DQSPKLLIK S VSESIS GVPS RFSGSGSGTD FTLTINSLEA EDFATYYC QQ SNSWPLT FGQ GTKLEIK
人源化抗人CD16單克隆抗體hCD16-M2 的CDRs在表 10 中顯示。 B. 結合至效應細胞的細胞表面的示例性抗體
本發明的CD16 x DA 結合分子以及尤其本發明的三特異性CD16 x DA 結合分子可包含用於效應細胞的非CD16細胞表面分子的結合位點。如本文所用，術語“效應細胞 ”表示直接或間接介導靶細胞(例如，外來細胞、感染細胞或癌症細胞)殺傷的細胞。效應細胞的實施例包括輔助性T細胞、細胞毒性T細胞、自然殺傷(NK)細胞、漿細胞(抗體分泌B細胞)、巨噬細胞和粒細胞。這種細胞的優選細胞表面分子包括CD2、CD3、CD8、CD16、TCR和NKG2D受體。因此，能夠免疫特異性地結合這種分子的表位或者結合至其它效應細胞表面分子的分子可以按照本發明的原理進行使用。下面提供了示例性的抗體，其VH和VL結構域可用於構建能夠介導靶細胞的重定向的殺傷的分子。1. 示例性抗 NKG2D 抗體
天然殺傷效應細胞的優選的非CD16細胞表面分子是NKG2D受體。NKG2D受體在所有的人(和其它哺乳動物)的天然殺傷細胞上表達(Bauer, S.等(1999) “Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA ,” Science 285(5428):727-729；Jamieson, A.M.等(2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing ,” Immunity 17(1):19-29)以及所有CD8+ T 細胞上(Groh, V.等(2001) “Costimulation Of CD8αβ T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells ,” Nat. Immunol. 2(3):255-260；Jamieson, A.M.等(2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing ,” Immunity 17(1):19-29)。這種結合配體以及特別是不在正常細胞上表達的那些包括組織相容性60(H60)分子、視黃酸早期誘導基因-1的產物(RAE-1)、和鼠UL16-結合蛋白樣轉錄物1(MULT1) (Raulet D.H. (2003) “Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands ,” Nature Rev. Immunol. 3:781-790；Coudert, J.D.等(2005) “Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand-Expressing Tumor Cells ,” Blood 106:1711-1717)。特異性地結合至NKG2D受體的分子包括抗NKG2D抗體“KYK-1.0 ”和“KYK-2.0 ”(Kwong, KY等(2008) “Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity ,” J. Mol. Biol. 384:1143-1156)。
KYK-1.0的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:86 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： EVQLVESGGG VVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMH WVRQA PGKGLEWVA F IRYDGSNKYY ADSVKG RFTI SRDNSKNTKY LQMNSLRAED TAVYYCAK DR FGYYLDY WGQ GTLVTVSS
KYK-1.0的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:87 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： QPVLTQPSSV SVAPGETARI PC GGDDIETK SVH WYQQKPG QAPVLVIY DD DDRPS GIPER FFGSNSGNTA TLSISRVEAG DEADYYC QVW DDNNDEWV FG GGTQLTVL
KYK-2.0的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:88 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： QVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMH WVRQA PGKGLEWVA F IRYDGSNKYY ADSVKG RFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAK DR GLGDGTYFDY WGQGTTVTVS S
KYK-2.0的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:89 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： QSALTQPASV SGSPGQSITI SC SGSSSNIG NNAVN WYQQL PGKAPKLLIY YDDLLPS GVS DRFSGSKSGT SAFLAISGLQ SEDEADYYC A AWDDSLNGPV FGGGTKLTVL
結合至自然殺傷細胞的細胞表面的其它示例性抗體包括抗體：A1、AC2、EPR3678(2)、EPR20461、EPR20627和IMG17B5F11(其結合CD39 )；TB01、HNK-1/Leu-7和NK1(其結合CD57 )；FN50 (其結合CD69 )；5B5、B-L2、TS82b和C33 (其結合CD82 )；3B3、B199.2和EP7169(其結合CD161 )；17D9(其結合CLEC1B )；2F9(其結合KIR2DL1 )；EPR8825(其結合KIR2DL2 )；mAb 33(其結合KIR2DL4 )；11E3、17B4、EPR4392(2)、EPR20261和EPR 20627(其結合淋巴細胞啟動基因3 )；A10、C7、CX5、1D11和MM0489-10R27(其結合NKG2D )；BMK13(其結合PRG2 )；EPR9916(其結合SLAMF6 )；等。能夠結合各個這種示例性非CD16細胞表面分子的抗體可從Abcam plc和其它來源商購，並且可容易適應於本發明的目的。2. 示例性抗 CD2 抗體
在一種實施方式中，能夠介導靶細胞的重定向殺傷的本發明分子將通過免疫特異性地結合這種效應細胞表面上存在的CD2的表位而結合效應細胞。特異性地結合CD2的分子包括抗CD2抗體“CD2 mAb Lo-CD2a ”。
CD2 mAb Lo-CD2a (ATCC登錄號：11423)的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:90 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： EVQLQQSGPE LQRPGASVKL SCKASGYIFT EYYMY WVKQR PKQGLELVG R IDPEDGSIDY VEKFKK KATL TADTSSNTAY MQLSSLTSED TATYFCAR GK FNYRFAY WGQ GTLVTVSS
CD2 mAb Lo-CD2a (ATCC登錄號：11423)的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:91 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示): DVVLTQTPPT LLATIGQSVS ISC RSSQSLL HSSGNTYLN W LLQRTGQSPQ PLIY LVSKLE S GVPNRFSGS GSGTDFTLKI SGVEAEDLGV YYC MQFTHYP YT FGAGTKLE LK3. 示例性抗 CD8 抗體
在一種實施方式中，能夠介導靶細胞的重定向殺傷的本發明分子將通過免疫特異性地結合這種效應細胞表面上存在的CD8的表位而結合效應細胞。特異性地結合CD8的分子包括抗CD8抗體“OKT8 ”和“TRX2 ”。
OKT8 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:92 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： QVQLLESGPE LLKPGASVKM SCKA SGYTFT DYNMH WVKQS HGKSLEWIG Y IYPYTGGTGY NQKFKN KATL TVDSSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARNF RYTYWYFDVW GQGTTVTVSS
OKT8的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:93)顯示在下面(CDRL殘基用底線顯示)： DIVMTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVD SYDNSLMH WY QQKPGQPPKV LIY LASNLES GVPARFSGSG SRTDFTLTID PVEADDAATY YC QQNNEDPY T FGGGTKLEI KR
TRX2 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:94 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMN WVRQA PGKGLEWVA L IYYDGSNKFY ADSVKG RFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAK PH YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS S
TRX2 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:95 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KGSQDIN NYLA WYQQKP GKAPKLLIY N TDILHT GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYC YQ YNNGYT FGQG TKVEIKVI ．示例性的疾病抗原
本發明的疾病抗原包括具有癌症細胞特徵的細胞表面抗原(“癌抗原 ”)以及具有病原體細胞或者被病原體感染的細胞特徵的細胞表面抗原(病原體相關抗原 ”)。A ．排列在癌症細胞表面上的示例性癌抗原
如本文所用，術語“癌抗原 ”表示典型地在癌細胞表面上表達的並且因此可用抗體基分子或免疫調節分子治療的抗原。癌抗原的實例包括但不限於：19.9 ，如結腸癌、胃癌黏蛋白中發現的；4.2 ；A33 (結直腸癌抗原；Almqvist, Y. (2006) “In vitro and in vivo Characterization of 177Lu-huA33: A Radioimmunoconjugate Against Colorectal Cancer ,” Nucl. Med. Biol. 33(8):991-998)；ADAM-9 (美國專利公開號2006/0172350；PCT公開號WO 06/084075)；AH6 ，如胃癌中發現的；ALCAM (PCT公開號WO 03/093443)；APO-1 ( 惡性人淋巴細胞抗原 ) (Trauth, B.C.等(1989)“Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction Of Apoptosis,” Science 245:301-304)；B1 (Egloff, A.M.等(2006) “Cyclin B1 And Other Cyclins As Tumor Antigens In Immunosurveillance And Immunotherapy Of Cancer ,”Cancer Res . 66(1):6-9)；B7-H3 (Collins, M.等(2005) “The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands ,” Genome Biol. 6:223.1-223.7). Chapoval, A.等(2001) “B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production ,” Nature Immunol. 2:269–274; Sun, M.等(2002) “Characterization of Mouse and 人 B7-H3 Genes ,” J. Immunol. 168:6294-6297)；BAGE (Bodey, B. 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表11列出了示例性抗體，其VH和VL結構域可用於構建本發明的能夠結合排列在癌症細胞表面上的癌抗原並且介導這種癌症細胞的重定向的殺傷的結合分子，下面提供了可用於構建能夠結合排列在癌症細胞表面上的癌抗原並且介導這種癌症細胞的重定向的殺傷的分子的另外抗體。1. 示例性抗 B7-H3 抗體
B7-H3 是在各種實體腫瘤類型上過表達的癌抗原並且是涉及免疫調節的分子的B7家族的成員(參見美國專利號8,802,091；US 2014/0328750；US 2013/0149236；Loo, D.等(2012) “Development Of An Fc-Enhanced Anti-B7-H3 Monoclonal Antibody With Potent Antitumor Activity ,” Clin. Cancer Res. 18(14):3834-3845)。具體地，數個獨立的研究已經顯示人惡性癌症細胞(例如，成神經細胞瘤以及胃癌、卵巢癌和非小細胞肺癌的癌症細胞)呈現B7-H3蛋白表達的顯著增加以及該增加的表達與增加的疾病嚴重性相關(Zang, X.等(2007) “The B7 Family And Cancer Therapy: Costimulation And Coinhibition ,” Clin. Cancer Res. 13:5271-5279)，表明B7-H3被腫瘤利用為免疫逃逸路徑(Hofmeyer, K.等(2008) “The Contrasting Role Of B7-H3 ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278)。
B7-H3也已經被發現共同刺激CD4+和CD8+ T細胞增殖。B7-H3也刺激IFN-γ產生和CD8+溶解活性(Chapoval, A.等(2001) “B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production ,” Nature Immunol. 2:269–274；Sharpe, A.H.等(2002) “The B7-CD28 Superfamily ,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126)。然而，該蛋白也可能通過NFAT(啟動的T細胞的核因數)、NF-κB(核因數κ B)、和AP-1(啟動蛋白-1)因數作用以抑制T細胞啟動(Yi. K.H.等(2009) “FineTuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4 ,” Immunol. Rev. 229:145-151)。B7-H3也被認為體內抑制Th1、Th2或Th17(Prasad, D.V.等(2004) “Murine B7–H3 Is A Negative Regulator Of T Cells ,” J. Immunol. 173:2500-2506；Fukushima, A.等(2007) “B7–H3 Regulates The Development Of Experimental Allergic Conjunctivitis In Mice ,” Immunol. Lett. 113:52-57；Yi. K.H.等(2009) “FineTuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4 ,” Immunol. Rev. 229:145-151)。
優選的B7-H3-結合分子具有人源化抗人B7-H3單克隆抗體“B7-H3 mAb-B ”、“B7-H3 mAb-C ”、“B7-H3 mAb-D ”的VL和/或VH結構域，並且更優選地具有這種抗B7-H3單克隆抗體的VL區的CDRL 中的1個、2個或所有的3個和/或VH結構域的CDRH 中的1個、2個或所有的3個。
在人源化後，抗體B7-H3 mAb-B 產生兩個變體VH結構域：B7-H3 mAb-B VH1 和B7-H3 mAb-B VH2 ；和兩個變體VL結構域：B7-H3 mAb-B VL1 和B7-H3 mAb-B VL2 ，其可以以VH/VL結構域的任何組合來產生功能性的B7-H3結合結構域。
B7-H3 mAb-B VH1 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:96 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQ WVRQA PGQGLEWMG T IYPGDGDTRY TQKFKG RVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR RG IPRLWYFDV W GQGTTVTVSS
B7-H3 mAb-B VH2 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:97 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQ WVRQA PGQGLEWMG T IYPGGGDTRY TQKFQG RVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR RG IPRLWYFDV W GQGTTVTVSS
B7-H3 mAb-B VL1 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:98 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDIS NYLN WYQQKP GKAPKLLIY Y TSRLHS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYC QQ GNTLPPT FGG GTKLEIK
B7-H3 mAb-B VL2 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:99 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQSIS SYLN WYQQKP GKAPKLLIY Y TSRLQS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYC QQ GNTLPPT FGG GTKLEIK
人源化B7-H3 mAb-C 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:100 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMS WVRQA PGKGLEWVA T INSGGSNTYY PDSLKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR HD GGAMDY WGQG TTVTVSS
人源化B7-H3 mAb-C 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:101 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASESIY SYLA WYQQKP GKAPKLLVY N TKTLPE GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QH HYGTPPWT FG QGTRLEIK
B7-H3 mAb-D 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:102 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMH WVRQA PGKGLEWVAY ISSGSGTIYY ADTVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR HG YRYEGFDY WG QGTTVTVSS
B7-H3 mAb-D 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:103 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITC KASQNVD TNVA WYQQKP GKAPKALIY S ASYRYS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFAEYFC QQ YNNYPFT FGQ GTKLEIK
特別優選的是具有人源化VH和/或VL結構域的B7-H3-結合分子，其包括但不限於“恩比利珠單抗(Enoblituzumab)” (也被稱為MGA271；CAS登錄號1353485-38-7)。恩比利珠單抗是結合至HER2/neu並且介導提高的ADCC活性的Fc-優化的單克隆抗體。恩比利珠單抗的完整的重鏈和輕鏈的氨基酸序列在本領域是已知的(參見，例如，WHO Drug Information, 2017, 推薦的INN:列表77, 31(1):49)。
恩比利珠單抗的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:104 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMH WVRQA PGKGLEWVA Y ISSDSSAIYY ADTVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCGR GR ENIYYGSRLD Y WGQGTTVTV SS
恩比利珠單抗的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:105 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC KASQNVD TNVA WYQQKP GKAPKALIY S ASYRYS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YNNYPFT FGQ GTKLEIK
除了上面所鑒定的優選抗B7-H3結合分子，本發明還考慮使用下列抗B7-H3結合分子中的任一種：LUCA1 ； BLA8 ； PA20 ；或 SKN2 (參見美國專利號7,527,969；8,779,098和PCT專利公開WO 2004/001381)；M30 ； cM30 ； M30-H1-L1 ； M30-H1-L2 ； M30-H1-L3 ； M30-H1-L4 ； M30-H1-L5 ； M30-H1-L6 ； M30-H1-L7 ； M30-H4-L1 ； M30-H4-L2 ； M30-H4-L3 ；和 M30-H4-L4 (參見US專利公開2013/0078234和PCT專利公開WO 2012/147713)；和8H9 (參見美國專利號7,666,424；7,737,258；7,740,845；8,148,154；8,414,892；8,501,471；9,062,110；US專利公佈2010/0143245和PCT專利公佈WO 2008/116219)。
本發明具體地包括並涵蓋CD16 x B7-H3 結合分子 ，其包含B7-H3 mAb-B 、B7-H3 mAb-B VH1 、B7-H3 mAb-B VH2 、B7-H3 mAb-B VL1 、B7-H3 mAb-B VL2 、B7-H3 mAb-C 、B7-H3 mAb-D 、或恩比利珠單抗中的任一種或者本文提供的其它抗B7-H3抗體中的任一種的VL和/或VH結構域，和/或VL區的CDRL 中的1個、2個或所有3個和/或VH結構域的CDRH 中的1個、2個或所有3個；並且更優選地具有這種抗B7-H3單克隆抗體的VL區的CDRL 中的1個、2個或所有3個和/或VH結構域的CDRH 中的1個、2個或所有3個。2. 示例性抗 CEACAM5 和抗 CEACAM6 抗體
癌胚抗原相關的細胞黏附分子5(CEACAM5)和細胞黏附分子6(CEACAM6)已經發現與各種類型的癌症相關，所述各種類型的癌症包括甲狀腺髓樣癌、結直腸癌、胰腺癌、肝細胞癌、胃癌、肺癌、頭頸癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮內膜癌、乳腺癌、造血系統癌症、白血病和卵巢癌(PCT公開號WO 2011/034660)，以及特別地，結直腸癌、胃腸癌、胰腺癌、非小細胞肺癌(NSCL)、乳腺癌、甲狀腺癌、胃癌、卵巢癌和子宮癌(Zheng, C.等(2011) “A Novel Anti-CEACAM5 Monoclonal Antibody, CC4, Suppresses Colorectal Tumor Growth and Enhances NK Cells-Mediated Tumor Immunity ,” PLoS One 6(6):e21146, pp. 1-11)。
CEACAM5已經發現在90%的胃腸癌、結直腸癌和胰腺癌、70%的非小細胞肺癌細胞和50%的乳腺癌中過表達(Thompson, J.A.等(1991) “Carcinoembryonic Antigen Gene Family: Molecular Biology And Clinical Perspectives ,” J. Clin. Lab. Anal. 5:344-366)。過表達的癌胚抗原相關的細胞黏附分子6 (CEACAM6)在各種人癌症的侵襲和轉移中起著重要作用，其包括甲狀腺髓樣癌、結直腸癌、胰腺癌、肝細胞癌、胃癌、肺癌、頭頸癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮內膜癌、乳腺癌、造血系統癌症、白血病和卵巢癌(PCT公開號WO 2011/034660；Deng, X.等(2014) “Expression Profiling Of CEACAM6 Associated With The Tumorigenesis And Progression In Gastric Adenocarcinoma ,” Genet. Mol. Res. 13(3):7686-7697；Cameron, S.等(2012) “Focal Overexpression Of CEACAM6 Contributes To Enhanced Tumourigenesis In Head And Neck Cancer Via Suppression Of Apoptosis ,” Mol. Cancer 11:74, pp. 1-11；Chapin, C.等(2012) “Distribution And Surfactant Association Of Carcinoembryonic Cell Adhesion Molecule 6 In Human Lung ,” Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 302(2):L216-L25；Riley, C.J.等(2009) “Design And Activity Of A Murine And Humanized Anti-CEACAM6 Single-Chain Variable Fragment In The Treatment Of Pancreatic Cancer ,” Cancer Res. 69(5):1933-1940；Lewis-Wambi, J.S.等(2008) “Overexpression Of CEACAM6 Promotes Migration And Invasion Of Oestrogen-Deprived Breast Cancer Cells ,” Eur. J. Cancer 44(12):1770-1779；Blumenthal, R.D.等(2007) “Expression Patterns Of CEACAM5 And CEACAM6 In Primary And Metastatic Cancers ,” BMC Cancer. 7:2, pp. 1-15)。免疫特異性地結合CEACAM5和CEACAM6的抗體是可商購的(Santa Cruz Biotechnology, Inc.；Novus Biologicals LLC；Abnova Corporation)。
人源化抗CEACAM5/抗CEACAM6抗體16C3 (EP 2585476)的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:106 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： QVQLQQSGPE VVRPGVSVKI SCKGS GYTFT DYAMH WVKQS HAKSLEWIG L ISTYSGDTKY NQNFKG KATM TVDKSASTAY MELSSLRSED TAVYYCAR GD YSGSRYWFAY WGQGTLVTVS S
人源化抗CEACAM5/抗CEACAM6抗體16C3 (EP 2585476)的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:107 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC GASENIY GALN WYQRKP GKSPKLLIW G ASNLAD GMPS RFSGSGSGRQ YTLTISSLQP EDVATYY CQN VLSSPYT FGG GTKLEIK
人源化抗CEACAM5/CEACAM6抗體hMN15 (WO 2011/034660)的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:108 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SC SSSGFALT DYYMS WVRQA PGKGLEWLG F IANKANGHTT DYSPSVKG RF TISRDNSKNT LFLQMDSLRP EDTGVYFCAR DMGIRWNFDV WGQGTPVTVS S
人源化抗CEACAM5/CEACAM6抗體hMN15 (WO 2011/034660)的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:109 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： DIQLTQSPSS LSASVGDRVT MTC SASSRVS YIH WYQQKPG KAPKRWIY GT STLAS GVPAR FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYYC QQW SYNPPT FGQG TKVEIKR
本發明具體地包括並且涵蓋CD16 x CEACAM5/CEACAM6 結合分子 ，其包含抗CEACAM5/CEACAM6單克隆抗體16C3 或hMN15 的VL和/或VH結構域，和/或VL區的CDRL 中的1個、2個或所有3個和/或VH結構域的CDRH 中的1個、2個或所有3個。3. 示例性 抗 EGRF 抗體
表皮生長因數受體(EGFR)是某些轉移性結直腸癌、轉移性非小細胞肺癌和頭頸癌的癌抗原。示例性的結合人EGRF的抗體是“西妥昔單抗 ”和“帕尼單抗 ”。西妥昔單抗是重組人-小鼠嵌合表皮生長因數受體(EGFR)IgG1單克隆抗體(Govindan R. (2004) “Cetuximab In Advanced Non-Small Cell Lung Cancer ,” Clin. Cancer Res. 10(12 Pt 2):4241s-4244s；Bou-Assaly, W.等(2010) “Cetuximab (Erbitux) ,” Am. J. Neuroradiol. 31(4):626-627)。帕尼單抗(Vectibix®，Amgen)是全人源化表皮生長因數受體(EGFR)IgG2單克隆抗體(Foon, K.A.等(2004) “Preclinical And Clinical Evaluations Of ABX-EGF, A Fully Human Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Antibody ,” Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 58(3):984-990；Yazdi, M.H.等(2015) “A Comprehensive Review of Clinical Trials on EGFR Inhibitors Such as Cetuximab and Panitumumab as Monotherapy and in Combination for Treatment of Metastatic Colorectal Cancer ,” Avicenna J. Med. Biotechnol. 7(4):134-144)。
嵌合抗EGFR抗體西妥昔單抗 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:110 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： QVQLKQSGPG LVQPSQSLSI TCTVS GFSLT NYGVH WVRQS PGKGLEWLG V IWSGGNTDYN TPFTS RLSIN KDNSKSQVFF KMNSLQSNDT AIYYCAR ALT YYDYEFAY WG QGTLVTVSA
嵌合抗EGFR抗體西妥昔單抗 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:111 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： DILLTQSPVI LSVSPGERVS FSC RASQSIG TNIH WYQQRT NGSPRLLIK Y ASESIS GIPS RFSGSGSGTD FTLSINSVES EDIADYYC QQ NNNWPTT FGA GTKLELKR
帕尼單抗的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:112 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVS GGSVS SGDYY WTWIR QSPGKGLEWI G HIYYSGNTN YNPSLKS RLT ISIDTSKTQF SLKLSSVTAA DTAIYYCVR D RVTGAFDI WG QGTMVTVSS
帕尼單抗的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:113 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC QASQDIS NYLN WYQQKP GKAPKLLIY D ASNLET GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QH FDHLPLA FGG GTKVEIKR
本發明具體地包括並且涵蓋CD16 x EGFR結合分子，其包含抗EGFR單克隆抗體西妥昔單抗或帕尼單抗的VL和/或VH結構域，和/或VL區的CDRL 中的1個、2個或所有3個和/或VH結構域的CDRH 中的1個、2個或所有3個。4. 示例性抗 EphA2 抗體
受體酪氨酸激酶——肝配蛋白型-A受體2(EphA2 )在成年人上皮組織中的細胞與細胞接觸位點正常表達，然而最近的研究已經表明它在各種類型的上皮癌中過表達，其中最大水準的EphA2表達在轉移病灶中被觀察到。EphA2的高表達水準已經在大範圍的癌症和許多癌細胞系中發現，其包括前列腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌和黑色素瘤(Xu, J.等(2014) “High EphA2 Protein Expression In Renal Cell Carcinoma Is Associated With A Poor Disease Outcome ,” Oncol. Lett. Aug 2014; 8(2): 687-692；Miao, B.等(2014) “EphA2 is a Mediator of Vemurafenib Resistance and a Novel Therapeutic Target in Melanoma ,” Cancer Discov. pii: CD-14-0295)。EphA2並非似乎僅僅是癌症的標記物，而是似乎在許多人癌症中持續過表達並且功能上發生改變(Chen, P.等(2014) “EphA2 Enhances The Proliferation And Invasion Ability Of LnCap Prostate Cancer Cells ,” Oncol. Lett. 8(1):41-46)。示例性的結合人EphA2的抗體是“EphA2 mAb 1 ”、“EphA2 mAb 2 ”和“EphA2 mAb 3 ”。
EphA2 mAb 1 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:114 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLS RYSVH WVRQP PGKGLEWLG M IWGGGSTDYN SALKSRLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT AMYYCAR KHG NYYTMDY WGQ GTSVTVSS
EphA2 mAb 1 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:115 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISC RASQDIS NYLN WYQQKP DGTVKLLIY Y TSRLHS GVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFC QQ GYTLYT FGGG TKLEIK
EphA2 mAb 2 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:116 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGFTFT NYGMN WVKQA PGKGLKWMG W INTYIGEPTY ADDFKG RFVF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCAR EL GPYYFDY WGQ GTTLTVSS
EphA2 mAb 2 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:117 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQSLV HSSGNTYLH W YLQKPGQSPK LLIY KVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC SQSTHVP T FGSGTKLEI K
EphA2 mAb 3 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:118 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： EVQLVESGGG SVKPGGSLKL SCAASGFTFT DHYMY WVRQT PEKRLEWVA T ISDGGSFTSY PDSVKG RFTI SRDIAKNNLY LQMSSLKSED TAMYYCTR DE SDRPFPY WGQ GTLVTVSS
EphA2 mAb 3 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:119 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITC KASQDVT TAVA WYQQKP GQSPKLLIF W ASTRHA GVPD RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYC QQ HYSTPYT FGG GTKLEIK
本發明具體地包括並且涵蓋CD16 x EphA2 結合分子 ，其包含抗EphA2單克隆抗體EphA2 mAb 1 、EphA2 mAb 2 和EphA2 mAb 3 的VL和/或VH結構域，和/或VL區的CDRL 中的1個、2個或所有3個和/或VH結構域的CDRH 中的1個、2個或所有3個。5. 示例性抗 gpA33 抗體
43 kD的跨膜糖蛋白A33(gpA33 )在＞95%的所有結直腸癌中表達(Heath, J.K.等(1997) “The Human A33 Antigen Is A Transmembrane GlycoproteinAnd A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 94(2):469-474；Ritter, G.等(1997) “Characterization Of Posttranslational Modifications Of Human A33 Antigen, A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epithelium ,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 236(3):682-686；Wong, N.A.等(2006) “EpCAM and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasia ,” J. Clin. Pathol. 59(3):260-263)。示例性的結合人gpA33的抗體是“gpA33 mAb 1 ”。
gpA33 mAb 1 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:120 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMN WVRQA PGQGLEWIG R IYPGDGETNY NGKFKD RVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR IY GNNVYFDV WG QGTTVTVSS
gpA33 mAb 1 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:121 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC SARSSIS FMY WYQQKPG KAPKLLIY DT SNLAS GVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYC QQW SSYPLT FGQG TKLEIK
本發明具體地包括並且涵蓋CD16 x gpA33 結合分子 ，其包含抗gpA33單克隆抗體gpA33 mAb 1 、 或者WO 2015/026894中提供的抗gpA33單克隆抗體中的任一種的VL和/或VH結構域，和/或VL區的CDRL 中的1個、2個或所有3個和/或VH結構域的CDRH 中的1個、2個或所有3個。6. 示例性抗 HER2/neu 抗體
HER2/neu是185 kDa受體蛋白，其最初被鑒定為來自化學處理的大鼠的成神經細胞瘤的轉化基因的產物。HER2/neu由於其在數種人癌症和哺乳動物發育中的作用而已經被進行了廣泛的研究(Hynes等(1994) Biochim. Biophys. Acta 1198:165-184；Dougall等(1994) Oncogene 9:2109-2123；Lee等(1995) Nature 378:394-398)。示例性的結合人HER2/neu的抗體包括“瑪格妥昔單抗 (Margetuximab) ”、“曲妥珠單抗 (Trastuzumab) ”和“帕妥株單抗 (Pertuzumab) ”。瑪格妥昔單抗(也被稱為MGAH22；CAS登錄號1350624-75-7)是結合至HER2/neu並且介導提高的ADCC活性的Fc-優化的單克隆抗體。曲妥珠單抗(也被稱為rhuMAB4D5，並且作為Herceptin®出售；CAS登錄號180288-69-1；參見美國專利號5,821,337)是抗體4D5的人源化版本，具有IgG1/κ恆定區。帕妥株單抗(也被稱為rhuMAB2C4，並且作為PERJETA™出售；CAS登錄號380610-27-5；參見例如WO2001/000245)是抗體2C4的人源化版本，具有IgG1/κ恆定區。
本發明具體地包括並且涵蓋CD16 x HER2/neu 結合分子 ，其包含抗HER2/neu單克隆抗體瑪格妥昔單抗、曲妥珠單抗、或帕妥株單抗的VL和/或VH結構域，和/或VL區的CDRL 中的1個、2個或所有3個和/或VH結構域的CDRH 中的1個、2個或所有3個。
瑪格妥昔單抗的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:122) 顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： QVQLQQSGPE LVKPGASLKL SCTASGFNIK DTYIH WVKQR PEQGLEWIG R IYPTNGYTRY DPKFQD KATI TADTSSNTAY LQVSRLTSED TAVYYCSR WG GDGFYAMDY W GQGASVTVSS
瑪格妥昔單抗的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:123)顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITC KASQDVN TAVA WYQQKP GHSPKLLIY S ASFRYT GVPD RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYC QQ HYTTPPT FGG GTKVEIK
瑪格妥昔單抗的完整的重鏈和輕鏈的氨基酸序列在本領域是已知的(參見，例如，WHO Drug Information, 2014,推薦的INN:列表71, 28(1):93-94)。
曲妥珠單抗的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:124 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIH WVRQA PGKGLEWVA R IYPTNGYTRY ADSVKG RFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCSR WG GDGFYAMDY W GQGTLVTVSS
曲妥珠單抗的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:125 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDVN TAVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASFLY SGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ HYTTPPT FGQ GTKVEIK
帕妥株單抗的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:126)顯示在下面(CDRH殘基用底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFT DYTMD WVRQA PGKGLEWVA D VNPNSGGSIY NQRFKG RFTL SVDRSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAR NL GPSFYFDY WG QGTLVTVSS
帕妥株單抗的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:127 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQDVS IGVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASYRYT GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YYIYPYT FGQ GTKVEIK
除了上面所鑒定的優選抗HER2/neu結合分子外，本發明還包括並且涵蓋CD16 x HER2/neu 結合分子 ，其包含下列抗HER2/neu結合分子中的任一種的VL和/或VH結構域，和/或VL區的CDRL 中的1個、2個或所有3個和/或VH結構域的CDRH 中的1個、2個或所有3個：1.44.1 ； 1.140 ； 1.43 ； 1.14.1 ； 1.100.1 ； 1.96 ； 1.18.1 ； 1.20 ； 1.39 ； 1.24 ； 和1.71.3 (美國專利號8,350,011；8,858,942和PCT公開號WO 2008/019290)；F5 和 C1 (美國專利號7,892,554；8,173,424；8,974,792和PCT公開號WO 99/55367)；以及美國專利公開號US2013017114和PCT公開號WO2011/147986和WO 2012/143524的抗HER2/neu結合分子。
本發明具體地包括並且涵蓋CD16 x HER2/neu 結合分子 ，其包含瑪格妥昔單抗、曲妥珠單抗、或帕妥株單抗中的任一種或者本文提供的其它抗HER2/neu抗體中的任一種的VL和/或VH結構域，和/或VL區的CDRL 中的1個、2個或所有3個和/或VH結構域的CDRH 中的1個、2個或所有3個；並且更優選地具有這種抗HER2/neu單克隆抗體的VL區的CDRL 中的1個、2個或所有3個和/或VH結構域的CDRH 中的1個、2個或所有3個。7. 示例性抗 VEGF 抗體
VEGF-A是刺激多種疾病，尤其某些轉移癌，諸如轉移性結腸癌，以及某些肺癌、腎癌、卵巢癌和腦的多形性成膠質細胞瘤中的血管生成的化學信號。示例性的結合至人VEGF-A的抗體是“貝伐珠單抗 (Bevacizumab) ”(Avastin®)。貝 伐珠單抗是重組人源化IgG1單克隆抗體 (Midgley, R.等(2005) “Bevacizumab – Current Status And Future Directions ,” Ann. Oncol. 16(7):999-1004；Hall, R.D.等(2015) “Angiogenesis Inhibition As A Therapeutic Strategy In Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) ,” Transl. Lung Cancer Res. 4(5):515-523；Narita, Y. (2015) “Bevacizumab For Glioblastoma ,” Ther. Clin. Risk Manag. 11:1759-1765)。
貝伐珠單抗 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:128 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMN WVRQA PGKGLEWVG W INTYTGEPTY AADFKR RFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCA KYP HYYGSSHWYF DV WGQGTLVT VSS
貝 伐珠單抗 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:129 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC SASQDIS NYLN WYQQKP GKAPKVLIY F TSSLHS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YSTVPWT FGQ GTKVEIKR
本發明具體地包括並且涵蓋CD16 x VEGF 結合分子 ，其包含抗VEGF單克隆抗體貝 伐珠單抗的VL和/或VH結構域，和/或VL區的CDRL 中的1個、2個或所有3個和/或VH結構域的CDRH 中的1個、2個或所有3個。8. 示例性抗 5T4 抗體
癌胚蛋白5T4 是在許多癌症(包括腎癌、結腸癌、前列腺癌、肺癌)的細胞膜上以及在急性淋巴細胞性白血病中呈現的腫瘤相關蛋白(參見Boghaert, E.R.等(2008) “The Oncofetal Protein, 5T4, Is A Suitable Target For Antibody-Guided Anti-Cancer Chemotherapy With Calicheamicin ,” Int. J. Oncol. 32(1):221-234；Eisen, T.等(2014) “Naptumomab Estafenatox: Targeted Immunotherapy with a Novel Immunotoxin ,” Curr. Oncol. Rep. 16:370, pp. 1-6)。示例性的結合至人5T4的抗體包括“5T4 mAb 1 ”和“5T4 mAb 2 ”。
5T4 mAb 1 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 130 )顯示在下面(CDR殘基用底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKAS GYTFT SFWMH WVRQA PGQGLEWMG R IDPNRGGTEY NEKAKS RVTM TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAG GN PYYPMDY WGQ GTTVTVSS
5T4 mAb 1 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:131 )顯示在下面(CDR殘基用底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQGIS NYLA WFQQKP GKAPKSLIY R ANRLQS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYC LQ YDDFPWT FGQ GTKLEIK
5T4 mAb 2 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:132 )顯示在下面(CDR殘基用底線顯示)： QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKAS GYTFT SYWIT WVKQR PGQGLEWIG D IYPGSGRANY NEKFKS KATL TVDTSSSTAY MQLSSLTSED SAVYNCAR YG PLFTTVVDPN SYAMDY WGQG TSVTVSS
5T4 mAb 2 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:133 )顯示在下面(CDR殘基用底線顯示)： DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQSIV YSNGNTYLE W YLQKPGQSPK LLIY KVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYC FQGSHVP FT FGSGTKLE IK
本發明具體地包括並且涵蓋CD16 x 5T4 結合分子 ，其包含抗5T4單克隆抗體5T4 mAb 1 或5T4 mAb 2 或者WO 2013/041687或WO 2015/184203中提供的抗5T4抗體中的任一種的VL和/或VH結構域，和/或VL區的CDRL 中的1個、2個或所有3個和/或VH結構域的CDRH 中的1個、2個或所有3個。
本申請案另外具體地包括並且涵蓋能夠結合至5T4、CD16和CD8的CD16 x 5T4 三特異性 結合分子 ，以及尤其這樣的三特異性結合分子，其包含抗5T4單克隆抗體5T4 mAb 1 或5T4 mAb 2 或者WO 2015/184203中提供的抗5T4單克隆抗體中的任一種的VL和/或VH結構域，和/或VL區的CDRL 中的1個、2個或所有3個和/或VH結構域的CDRH 中的1個、2個或所有3個，和/或本文提供的抗CD8單克隆抗體中的任一種的VL和/或VH結構域，和/或VL區的CDRL 中的1個、2個或所有3個和/或VH結構域的CDRH 中的1個、2個或所有3個。9 ． 示例性 抗 IL13R α 2 抗體
白介素-13受體α2(IL13R α 2 )在多種癌症中過表達，所述癌症包括成膠質細胞瘤、結直腸癌、宮頸癌、胰腺癌、多發性黑素瘤、骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、前列腺癌和肺癌(PCT公開號WO 2008/146911；Brown, C.E.等(2013) “Glioma IL13R α 2 Is Associated With Mesenchymal Signature Gene Expression And Poor Patient Prognosis ,” PLoS One. 18;8(10):e77769；Barderas, R.等(2012) “High Expression Of IL-13 Receptor Α 2 In Colorectal Cancer Is Associated With Invasion, Liver Metastasis, And Poor Prognosis ,” Cancer Res. 72(11):2780-2790；Kasaian, M.T.等(2011) “IL-13 Antibodies Influence IL-13 Clearance In Humans By Modulating Scavenger Activity Of IL-13R α 2 ,” J. Immunol. 187(1):561-569；Bozinov, O.等(2010) “Decreasing Expression Of The Interleukin-13 Receptor IL-13Ralpha2 In Treated Recurrent Malignant Gliomas ,” Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 50(8):617-621；Fujisawa, T.等(2009) “A Novel Role Of Interleukin-13 Receptor Alpha2 In Pancreatic Cancer Invasion And Metastasis ,” Cancer Res. 69(22):8678-8685)。免疫特異性地結合至IL13Rα2的抗體是可商購的並且已經被描述在下列文獻中(Abnova Corporation, Biorbyt, LifeSpan BioSciences, United States Biologicals；也參見PCT公開號WO 2008/146911)。示例性的結合至人IL13Rα2的抗體包括“hu08 ”(參見，例如PCT公開號WO 2014/072888)。
hu08 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:134 )顯示在下面(CDR殘基用底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAAS GFTFS RNGMS WVRQA PGKGLEWVA T VSSGGSYIYY ADSVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR QG TTALATRFFD V WGQGTLVTV SS
hu08 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:135 )顯示在下面(CDR殘基用底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQDVG TAVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASYRST GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QH HYSAPWT FGG GTKVEIK
本發明具體地包括並且涵蓋CD16 x IL13R α 2 結合分子 ，其包含抗IL13Rα2單克隆抗體hu08 的VL和/或VH結構域，和/或VL區的CDRL 中的1個、2個或所有3個和/或VH結構域的CDRH 中的1個、2個或所有3個。10. 示例性抗 CD123 抗體
CD123(白介素3受體α，IL-3Ra)是40 kDa分子並且是白介素3受體複合物的一部分(Stomski, F.C.等(1996) “Human Interleukin-3 (IL-3) Induces Disulfide-Linked IL-3 Receptor Alpha- And Beta-Chain Heterodimerization, Which Is Required For Receptor Activation But Not High-Affinity Binding ,” Mol. Cell. Biol. 16(6):3035-3046)。白介素3(IL-3)驅動多能幹細胞早期分化成紅系祖細胞、髓系祖細胞和淋巴樣祖細胞的細胞。已經報導CD123在大範圍的血液學惡性腫瘤(包括急性髓細胞樣白血病(AML)和脊髓增生異常綜合征(MDS))中的惡性細胞上過表達(Muñoz, L.等(2001) “Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies ,” Haematologica 86(12):1261-1269)。CD123的過表達與AML中的較差的預後有關(Tettamanti, M.S.等(2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor ,” Br. J. Haematol. 161:389-401)。
示例性的結合至人CD123並且可用於本發明的抗體是“CD123 mAb 1 ”(參見，例如PCT公開號WO 2015/026892)。
CD123 mAb 1 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:136) 顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： EVQLVQSGAE LKKPGASVKV SCKASGYTFT DYYMK WVRQA PGQGLEWIG D IIPSNGATFY NQKFKG RVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR SH LLRASWFAY W GQGTLVTVSS
CD123 mAb 1 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:137 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： DFVMTQSPDS LAVSLGERVT MSC KSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP KLLIY WASTR ES GVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYC QNDYSY PYT FGQGTKL EIK
本發明具體地包括並且涵蓋CD16 x CD123 結合分子 ，其包含抗CD123單克隆抗體CD123 mAb 1 或者US 2017/081424和WO 2016/036937中公開的抗CD123抗體中的任一種的VL和/或VH結構域，和/或VL區的CDRL 中的1個、2個或所有3個和/或VH結構域的CDRH 中的1個、2個或所有3個。11. 示例性抗 CD19 抗體
CD19(B淋巴細胞表面抗原B4，Genbank登錄號M28170)是B細胞受體(BCR)複合物的組分，並且是調節B細胞啟動和體液免疫的閾值的B細胞信號傳導的正調節物。CD19是在B細胞譜系中最普遍存在表達的抗原之一並且在＞95%的B細胞惡性腫瘤上表達，包括急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。特別地，CD19表達維持在對抗-CD20療法變得抗性的B細胞淋巴瘤上(Davis等(1999) “Therapy of B-cell Lymphoma With Anti-CD20 Antibodies Can Result In The Loss Of CD20 Antigen Expression.” Clin Cancer Res, 5:611-615, 1999)。此外，建議CD19作為治療自體免疫疾病的靶標(Tedder (2009) “CD19: A Promising B Cell Target For Rheumatoid Arthritis ,” Nat. Rev. Rheumatol. 5:572-577)。
示例性的結合至人CD19並且可用於本發明中的抗體是WO 2016/048938中公開的抗CD19抗體(本文也稱為“CD19 mAb 1 ”)。
CD19 mAb 1 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:123 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMGVG WIR QPPGKALEWL A HIWWDDDKR YNPALKS RLT ISKDTSKNQV FLTMTNMDPV DTATYYCAR M ELWSYYFDY W GQGTTVTVSS
CD19 mAb 1 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:139 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： ENVLTQSPAT LSVTPGEKAT ITC RASQSVS YMH WYQQKPG QAPRLLIY DA SNRAS GVPSR FSGSGSGTDH TLTISSLEAE DAATYYC FQG SVYPF T FGQG TKLEIK
本發明具體地包括並且涵蓋CD16 x CD19結合分子，其包含抗CD19單克隆抗體CD19 mAb 1 或者美國專利US 7,112,324中公開的抗CD19抗體中的任一種的VL和/或VH結構域，和/或VL區的CDRL 中的1個、2個或所有3個和/或VH結構域的CDRH 中的1個、2個或所有3個。B. 示例性的病原體相關抗原
如本文所用，術語“病原體相關抗原 ”意指被典型地表達在病原體感染細胞的表面上並且因此可用基於抗體的分子或免疫調節分子治療的抗原。病原體相關抗原的實例包括但不限於在用下列感染的細胞的表面上表達的抗原：單純皰疹病毒(例如，感染的細胞蛋白(ICP)47、gD等)、水痘-帶狀瘡疹病毒、柯氏肉瘤相關的皰疹病毒(kaposi's sarcoma associated herpes virus)、愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr Virus)(例如，LMP-1、LMP-2A、LMP-2B等)、巨細胞病毒(例如，UL11等)、人免疫缺陷病毒(例如，env蛋白gp160、gp120、gp41等)、人乳頭瘤病毒(例如，E6、E7等)、人T細胞白血病病毒(例如，env蛋白gp64、gp46、gp21等)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、芽孢桿菌綱(Bacilli)細菌、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter) 細菌、 霍亂菌(Cholera) 、 白喉菌(Diphtheria) 、 腸桿菌屬(Enterobacter) 細菌、 淋球菌(Gonococci) 、 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori) 、 克雷伯氏菌屬(Klebsiella) 細菌、 軍團菌屬(Legionella) 細菌、 腦膜炎球菌(Meningococci) 、 分枝桿菌( mycobacteria) 、 假單胞菌屬(Pseudomonas) 細菌、 肺炎球菌(Pneumonococci) 、 立克次氏體細菌( rickettsiabacteria) 、 沙門氏菌屬(Salmonella) 細菌、 沙雷氏屬(Serratia) 細菌、 葡萄球菌(Staphylococci) 、 鏈球菌屬(Streptococci) 細菌、 破傷風(Tetanus) 、 麯黴屬真菌(Aspergillus)( 煙麯黴( fumigatus) 、 黑麯黴( niger) 等) 、 皮膚芽孢桿菌(Blastomyces dermatitidis) 、 念珠菌屬(Candida )(白色念珠菌(albicans)、克柔念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、熱帶念珠菌(tropicalis)等)、新生隱球菌(Cryptococcus neoformans )、 毛黴菌目屬( GenusMucorales) (毛黴菌(mucor)、犁頭黴(absidia)、根黴(rhizopus))、申克氏胞絲菌(Sporothrix schenkii )、 巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis )、 粗球孢子菌(Coccidioides immitis )、莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum )、鉤端螺旋體病(Leptospirosis )、 伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi )、寄生蠕蟲病(helminth parasite)(鉤蟲、絛蟲、吸蟲、扁蟲(例如血吸蟲(Schistosomia ))、賈第蟲(Giardia lambia )、旋毛蟲(trichinella )、脆雙核阿米巴(Dientamoeba Fragilis )、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei )、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi )和杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani ))。這種抗體可從多種來源商購，或者可以通過用這種抗原使小鼠或其它動物免疫獲得(包括產生單克隆抗體)。
下面提供了示例性抗體，其VH和VL結構域可用於構建能夠結合排列在病原體感染細胞 的表面上的病原體相關抗原的分子，另外的抗體在本領域是已知的。1. 示例性抗 HIV 抗體
HIV的env蛋白是示例性的病原體相關抗原，並且結合HIV的env蛋白的抗體是示例性的能夠結合病原體相關抗原的抗體。
HIV-1感染的初始步驟伴隨著細胞表面CD4結合至三聚體HIV-1包膜糖蛋白(env)、跨膜糖蛋白(gp41)和表面糖蛋白(gp120)的異源二聚體發生。gp120和gp41糖蛋白初始被合稱為單個gp160多肽，其隨後被切割以產生非共價締合的gp120/gp41複合物。Env的胞外結構域是品質約140 kDa的異源二聚體，由整個gp120組分和約20 kDa的gp41構成(Harris, A.等(2011) “Trimeric HIV-1 Glycoprotein Gp140 Immunogens And Native HIV-1 Envelope Glycoproteins Display The Same Closed And Open Quaternary Molecular Architectures ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 108(28):11440-11445)。免疫特異性地結合至env蛋白的抗體可商購並且已經描述在下列文獻中(參見，例如GenBank登錄號AFQ31503；Buchacher, A.等(1994) “Generation Of Human Monoclonal Antibodies Against HIV-1 Proteins; Electrofusion And Epstein-Barr Virus Transformation For Peripheral Blood Lymphocyte Immortalization ,” AIDS Res. Hum. Retroviruses 10(4):359-369；Shen, R. (2010) “GP41-Specific Antibody Blocks Cell-Free HIV Type 1 Transcytosis Through Human Rectal Mucosa And Model Colonic Epithelium ,” J. Immunol. 184(7):3648-3655；WO 2012/162068；和WO 2016/054101)。結合至HIV env的示例性抗體包括“7B2 ”(GenBank登錄號AFQ31503)和“A32 ”(PCT公開號WO 2014/159940)。
抗體 7B2 (Genbank登錄號JX188438和JX188439)是抗HIV env的人IgG1抗體，其在該分子的免疫顯性螺旋-環-螺旋區中在598-604處結合HIV gp41(Sadraeian, M.等(2017) “Selective Cytotoxicity Of A Novel Immunotoxin Based On Pulchellin A Chain For Cells Expressing HIV Envelope ,” Sci. Rep. 7(1):7579 doi: 10.1038/s41598-017-08037-3)。利用愛潑斯坦-巴爾(EB)病毒B細胞轉化和異源雜交瘤產生從HIV-1慢性感染的受試者分離抗體(Pincus, S.H.等(2003) “In Vivo Efficacy Of Anti-Glycoprotein 41, But Not Anti-Glycoprotein 120, Immunotoxins In A Mouse Model Of HIV Infection ,”J. Immunol. 170(4):2236-2241)。抗體7B2已經發現能夠識別病毒顆粒和感染細胞兩者(Santra, S.等(2015) “Human Non-neutralizing HIV-1 Envelope Monoclonal Antibodies Limit the Number of Founder Viruses during SHIV Mucosal Infection in Rhesus Macaques ,” PLoS Pathog. 11(8):e1005042. doi: 10.1371/journal.ppat.1005042；Tay, M.Z.等(2016) “Antibody-Mediated Internalization of Infectious HIV-1 Virions Differs among Antibody Isotypes and Subclasses ,” PLoS Pathog. 12(8):e1005817. doi: 10.1371/journal.ppat.1005817)。
7B2 的VH 結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:140 )顯示在下面(CDR殘基用底線顯示)： QVQLVQSGGG VFKPGGSLRL SCEASGFTFT EYYMT WVRQA PGKGLEWLAY ISKNGEYSKY SPSSNG RFTI SRDNAKNSVF LQLDRLSADD TAVYYCAR AD GLTYFSELLQ YIFDL WGQGA RVTVSS
7B2 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:141 )顯示在下面(CDR殘基用底線顯示)： DIVMTQSPDS LAVSPGERAT IHCK SSQTLL YSSNNRHSIA WYQQRPGQPP KLLLY WASMR LS GVPDRFSG SGSGTDFTLT INNLQAEDVA IYYC HQYSSH PPT FGHGTRV EIK
單克隆抗體A32識別HIV-1 Env gp120的C1區中的構象表位(Wyatt等(1995) “Involvement Of The V1/V2 Variable Loop Structure In The Exposure Of Human Immunodeficiency Virus Type 1 gp120 Epitopes Induced By Receptor Binding ,” J. Virol. 69:5723-5733)、介導強效的ADCC活性並且能阻斷相當大比例的HIV-1感染個體中可檢測的ADCC-介導的Ab活性(Ferrari, G.等(2011) “An HIV-1 gp120 Envelope Human Monoclonal Antibody That Recognizes a C1 Conformational Epitope Mediates Potent Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC) Activity and Defines a Common ADCC Epitope in Human HIV-1 Serum ,” J. Virol. 85(14):7029-7036)。
在現有技術中已經報導了抗體A32的多個VH結構域，其具有所報導的構架區1和/或4中的最小變化(參見，例如Protein Data Base登錄號PDB: 4YBL_H，US 2015/0239961和WO 2006/044410)。這些變體抗體A32的VH結構域中的任何一個可根據本發明進行使用。A32 的示例性VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:142 )顯示在下面(CDR殘基用底線顯示)： QVQLQESGPG LVKPSQTLSL SCTVSGGSSS SGAHYWS WIR QYPGKGLEWI G YIHYSGNTY YNPSLKS RIT ISQHTSENQF SLKLNSVTVA DTAVYYCAR G TRLRTLRNAF DI WGQGTLVT VSS
A32 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:143 )顯示在下面(CDR殘基用底線顯示)： QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SC TGTSSDVG GYNYVS WYQH HPGKAPKLII S EVNNRPS GV PDRFSGSKSG NTASLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTDIHNFV FGGGTKLTVL
A32 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:143 )可與A32的示例性VH結構域(SEQ ID NO:142 )或者與變體抗體A32的VH結構域中的任一種(參見，例如Protein Data Base登錄號PDB: 4YBL_H，US 2015/0239961和WO 2006/044410)一起使用以形成抗HIV-1 Env gp120的表位結合位點。
本發明具體地包括並且涵蓋CD16 x HIV 結合分子 ，其包含抗HIV單克隆抗體7B2 或A32 、或者在WO 2016196975、WO 2016/149710、WO 2016/149698、WO 2016/149695、WO 2015/048610、WO 2012/030904、WO 2013/163427、WO 2013/192589、WO 2014/063059、WO 20170/11413、WO 2016/054101、WO 2014/159940或WO 2017/011414中公開的抗HIV抗體中的任一種的VL和/或VH結構域，和/或VL區的CDRL 中的1個、2個或所有3個和/或VH結構域的CDRH 中的1個、2個或所有3個。
本申請案另外具體地包括並且涵蓋能夠結合至HIV、CD16和CD8的CD16 x HIV結合分子，尤其是這樣的三特異性結合分子，其包含抗HIV單克隆抗體7B2 或A32 或者在WO 2015/184203、WO 2016/054101、WO 2017/011413、WO 2017/011414中公開的抗HIV單克隆抗體中的任一種的VL和/或VH結構域，和/或VL區的CDRL 中的1個、2個或所有3個和/或VH結構域的CDRH 中的1個、2個或所有3個。2. 示例性抗 RSV 抗體
進一步例證性的病原體相關抗原是RSV糖蛋白F。示例性抗RSV糖蛋白F抗體是帕利珠單抗(Palivizumab)(參見，例如Protein Data Bank (PDB) ID號 2HWZ)。可替選的抗RSV糖蛋白F抗體包括莫維珠單抗(motavizumab)(參見，例如PDB ID號3IXT)以及帕利珠單抗變體(本文也被稱為“v 帕利珠單抗 ”，其已經被改造以從帕利珠單抗的CDRL 1中去除半胱氨酸殘基。帕利珠單抗變體的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:144 )顯示在下面(CDR殘基用底線顯示)： QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMSVG WIR QPPGKALEWL A DIWWDDKKD YNPSLKS RLT ISKDTSKNQV VLKVTNMDPA DTATYYCAR S MITNWYFDV W GAGTTVTVSS
帕利珠單抗變體的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:145 )顯示在下面(CDR殘基用底線顯示)： DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITC RASQSVG YMH WYQQKPG KAPKLLIY DT SKLAS GVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPD DFATYYC FQG SGYPFT FGGG TKLEIK
本發明具體地包括並且涵蓋CD16 x RSV 結合分子 ，其包含抗RSV單克隆抗體帕利珠單抗或v帕利珠單抗的VL和/或VH結構域，和/或VL區的CDRL 中的1個、2個或所有3個和/或VH結構域的CDRH 中的1個、2個或所有3個。VII. 本發明的 示例性 結合分子
本發明的原理通過一系列示例性CD16 x DA 結合分子 闡明，所述一系列示例性CD16 x DA結合分子含有不同的鼠或人源化抗CD16結合結構域並且具有對疾病抗原免疫特異性的結合結構域。這種示例性CD16 x DA 結合分子的 共價雙抗體結構和序列匯總在表 12 中並且在下面進行詳細描述。如將要認識到的，可同樣構建類似的雙抗體和其它雙特異性分子(通過利用期望抗體的VL和VH結構域代替示例性CD16 x DA 結合分子 的VL和VH結構域)。 A. CD16 x HER2/neu 結合分子， DART-A
被命名為“DART-A ”的CD16 x HER2/neu 結合分子 是第一示例性CD16 x DA 結合分子 。DART-A 是 能夠結合CD16和HER2/neu癌抗原的含Fc結構域的雙特異性雙抗體。DART-A 由三條多肽鏈構成並且具有包含抗人CD16抗體CD16-M1 的 VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對CD16的表位是免疫特異性的)和包含曲妥珠單抗的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對HER2/neu癌抗原的表位是免疫特異性的)。三條多肽鏈締合以形成能夠免疫特異性地結合CD16的表位和HER2/neu癌抗原的表位的共價結合的DART®雙抗體(參見，例如圖 4A )。
DART-A 的第一多肽鏈具有SEQ ID NO:151 的氨基酸序列： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIK GGG SGGGG EVKLV ESGGTLVKPG GSLKLSCAAS GFTFNNYGMS WVRQTPEKRL EWVATISGGG SYTFYPDSVK GRFTISRDNA KNSLYLQMSS LRSEDTALYY CIRQSARAPE PYWGQGTLVT VSS ASTKG EV AACEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEKGGGD KTHTCPPCPA PEAAGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLWCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK
這種示例性CD16 x DA 結合分子的 第一多肽鏈(SEQ ID NO:151 )的殘基1-107對應於曲妥珠單抗 的VL結構域(SEQ ID NO:125 )。第一多肽鏈的殘基108-115(帶雙底線的)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第一多肽鏈的殘基116-233對應於抗人CD16抗體CD16-M1 的VH結構域(SEQ ID NO:64 )。殘基234-23對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線的)。第一多肽鏈的殘基239-266對應於含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31 )。第一多肽鏈的殘基267-279對應於連接體(SEQ ID NO:43 )。第一多肽鏈的殘基280-496對應於“帶有杵的”(SEQ ID NO:51 )，其中最後的殘基是賴氨酸。
DART-A 的第二多肽鏈具有SEQ ID NO:152 的氨基酸序列： DIVMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVG THVAWYQQKS GQSPKSLLYS ASYRYSGVPD RFSGSGSGTD FTLTISNVQS EDLAEYFCQQ YKSYPLTFGA GTKLELK GGG SGGGG EVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFNIKDTYIH WVRQAPGKGL EWVARIYPTN GYTRYADSVK GRFTISADTS KNTAYLQMNS LRAEDTAVYY CSRWGGDGFY AMDYWGQGTL VTVSS ASTKG KVAACKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第二多肽鏈(SEQ ID NO:152 )的殘基1-107對應於抗人CD16抗體CD16-M1 的VL結構域(SEQ ID NO:65 )。第二多肽鏈的殘基108-115(帶雙底線的)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第二多肽鏈的殘基116-235對應於曲妥珠單抗 的VH結構域(SEQ ID NO:124 )。第二多肽鏈的殘基236-240對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線的)。第二多肽鏈的殘基241-268對應於含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO:32 )。
DART-A 的第三多肽鏈具有SEQ ID NO:153 的氨基酸序列： DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN R YTQKS LSLSPGK
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第三多肽鏈(SEQ ID NO:153 )的殘基1-10對應於連接體(SEQ ID NO:40 )。第三多肽鏈的殘基11-227對應於“帶有臼的” IgG1 CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:53 )，其包含H435R置換(加底線顯示)，並且其中最後的殘基是賴氨酸。如上所述，H435R置換消除了該分子結合至結合蛋白A的能力。
如將要認識的，DART-A 的第三多肽鏈不包含任何表位結合位點並且可因此用於各種CD16 x DA 結合分子 中。因此，DART-A 的第三多肽鏈被稱為“共同的雙抗體多肽鏈 ”。B. CD16 x HER2/neu 結合分子 ， “DART-B”
被稱為“DART-B ”的CD16 x Her2/neu 結合分子 是進一步示例性的CD16 x DA 結合分子 。DART-B 是能夠結合CD16和HER2/neu癌抗原的含Fc結構域的雙特異性雙抗體。DART-B 由三條多肽鏈構成，並且具有包含抗人CD16抗體CD16-M2 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對CD16的表位是免疫特異性的)和包含曲妥珠單抗 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對HER2/neu癌抗原的表位是免疫特異性的)。三條多肽鏈締合以形成能免疫特異性地結合CD16的表位和HER2/neu癌抗原的表位的共價結合的DART®雙抗體(參見，例如圖 4A )。
DART-B 的第一多肽鏈具有SEQ ID NO:154 的氨基酸序列： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIK GGG SGGGG EVQLQ QSGPELVKPG ASVKMSCKAS GYTFTSSAMH WVKKNPGQGL EWIGYINHYN DGIKYNERFK GKATLTSDKS SSTAYMELSS LTSEDSAVYY CATGYRYASW FASWGQGTLV TVSS ASTKG E VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEKGGG DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第一多肽鏈(SEQ ID NO:154 )的殘基1-107對應於曲妥珠單抗 的VL結構域(SEQ ID NO:125 )。第一多肽鏈的殘基108-115(帶有雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第一多肽鏈的殘基116-234對應於抗人CD16抗體CD16-M2 的VH結構域(SEQ ID NO:75 )。殘基235-239對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線)。第一多肽鏈的殘基240-267對應於包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31 )。第一多肽鏈的殘基268-280對應於連接體(SEQ ID NO:43 )。第一多肽鏈的殘基281-497對應於“帶有杵的”IgG1 CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:51 )，其中最後的殘基是賴氨酸。
DART-B 的第二多肽鏈具有SEQ ID NO:155 的氨基酸序列： DILLTQSPAI LSVSPGERVS FSCRASQNIG TSIHWYQQRT DGSPRLLIKS VSESISGIPS RFSGSGSGTD FTLTINGVES GDISDYYCQQ SNSWPLTFGA GTKLELK GGG SGGGG EVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFNIKDTYIH WVRQAPGKGL EWVARIYPTN GYTRYADSVK GRFTISADTS KNTAYLQMNS LRAEDTAVYY CSRWGGDGFY AMDYWGQGTL VTVSS ASTKG KVAACKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第二多肽鏈(SEQ ID NO:155 )的殘基1-107對應於抗人CD16抗體CD16-M2 的VL結構域(SEQ ID NO:76 )。第二多肽鏈的殘基108-115(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第二多肽鏈的殘基116-235對應於曲妥珠單抗 的VH結構域(SEQ ID NO:124 )。第二多肽鏈的殘基236-240對應於連接體(SEQ ID NO: 21 ，帶底線)。第二多肽鏈的殘基241-268對應於包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO:32 )。
DART-B 的第三多肽鏈具有共同的雙抗體多肽鏈 的氨基酸序列(SEQ ID NO:153 )。C. CD16 x HER2/neu 結合分子 ， “DART-C”
被命名為“DART-C ”的CD16 x HER2/neu 結合分子 是進一步示例性的CD16 x DA 結合分子。 DART-C 是能夠結合CD16和HER2/neu癌抗原的包含Fc結構域的雙特異性雙抗體。DART-C 由三條多肽鏈構成，並且具有包含人源化抗人CD16抗體hCD16-M1 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於CD16的表位是免疫特異性的)和包含曲妥珠單抗 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於HER2/neu癌抗原的表位是免疫特異性的)。三條多肽鏈締合以形成能夠免疫特異性地結合CD16的表位和HER2/neu癌抗原的表位的共價結合的DART®雙抗體(參見，例如圖 4A )。
DART-C 的第一多肽鏈具有SEQ ID NO:156 的氨基酸序列： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIK GGG SGGGG EVQLV ESGGGLVKPG GSLRLSCAAS GFTFSNYGMS WVRQAPGKGL EWVATISGGG SYTFYPDSVK GRFTISRDNA KNSLYLQMNS LRTEDTALYY CVRQSARAPE PYWGQGTLVT VSS ASTKG EV AACEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEKGGGD KTHTCPPCPA PEAAGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLWCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第一多肽鏈(SEQ ID NO:156 )的殘基1-107對應於曲妥珠單抗 的VL結構域(SEQ ID NO:125 )。第一多肽鏈的殘基108-115(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第一多肽鏈的殘基116-233對應於人源化抗人CD16抗體hCD16-M1 的VH結構域(SEQ ID NO:72 )。殘基234-238對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線)。第一多肽鏈的殘基239-266對應於包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31 )。第一多肽鏈的殘基267-279對應於連接體(SEQ ID NO:43 )。第一多肽鏈的殘基280-496對應於“帶有杵的”IgG1 CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:51 )，其中最後的殘基是賴氨酸。
DART-C 的第二多肽鏈具有SEQ ID NO:157 的氨基酸序列： DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQNVG THVAWYQQKP GKAPKSLLYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQS EDIATYYCQQ YKSYPLTFGQ GTKLEIK GGG SGGGG EVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFNIKDTYIH WVRQAPGKGL EWVARIYPTN GYTRYADSVK GRFTISADTS KNTAYLQMNS LRAEDTAVYY CSRWGGDGFY AMDYWGQGTL VTVSS ASTKG KVAACKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的的第二多肽鏈(SEQ ID NO:157 )的殘基1-107對應於人源化抗人CD16抗體hCD16-M1 的VL結構域(SEQ ID NO:73 )。第二多肽鏈的殘基108-115(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第二多肽鏈的殘基116-235對應於曲妥珠單抗 的VH結構域(SEQ ID NO:124 )。第二多肽鏈的殘基236-240對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線)。第二多肽鏈的殘基241-268對應於包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO:32 )。
DART-C 的第三多肽鏈具有共同的雙抗體多肽鏈 的氨基酸序列(SEQ ID NO:153 )。D. CD16 x HER2/neu 結合分子 ， “DART-D”
被命名為 “DART-D ”的CD16 x HER2/neu 結合分子 是進一步示例性的CD16 x DA 結合分子。 DART-D 是能夠結合CD16和HER2/neu癌抗原的包含Fc結構域的雙特異性雙抗體。DART-D 由三條多肽鏈構成，並且具有包含人源化抗人CD16抗體hCD16-M2 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於CD16的表位是免疫特異性的)和包含曲妥珠單抗 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於HER2/neu癌抗原的表位是免疫特異性的)。三條多肽鏈締合以形成能免疫特異性地結合CD16的表位和HER2/neu癌抗原的表位的共價結合的DART®雙抗體(參見，例如圖 4A )。
DART-D 的第一多肽鏈具有SEQ ID NO:158 的氨基酸序列： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIK GGG SGGGG QVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSSAMH WVRQAPGQGL EWMGYINHYN DGIKYNERFK GRVTITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CATGYRYASW FASWGQGTLV TVSS ASTKG E VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEKGGG DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第一多肽鏈(SEQ ID NO:158 )的殘基1-107對應於曲妥珠單抗 的VL結構域(SEQ ID NO:125 )。第一多肽鏈的殘基108-115(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第一多肽鏈的殘基116-234對應於人源化抗人CD16抗體hCD16-M2 的VH1結構域(SEQ ID NO:83 )。殘基235-239對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線)。第一多肽鏈的殘基240-267對應於包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31 )。第一多肽鏈的殘基268-280對應於連接體(SEQ ID NO:43 )。第一多肽鏈的殘基281-497對應於“帶有杵的”IgG1 CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:51 )，其中最後的殘基是賴氨酸。
DART-D 的第二多肽鏈具有SEQ ID NO:159 的氨基酸序列： EIVLTQSPAT LSVSPGERAT LSCRASQNIG TSIHWYQQKP DQSPKLLIKS VSESISGVPS RFSGSGSGTD FTLTINSLEA EDFATYYCQQ SNSWPLTFGQ GTKLEIK GGG SGGGG EVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFNIKDTYIH WVRQAPGKGL EWVARIYPTN GYTRYADSVK GRFTISADTS KNTAYLQMNS LRAEDTAVYY CSRWGGDGFY AMDYWGQGTL VTVSS ASTKG KVAACKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第二多肽鏈(SEQ ID NO:159 )的殘基1-107對應於人源化抗人CD16抗體hCD16-M2 的VL1結構域(SEQ ID NO:85 )。第二多肽鏈的殘基108-115(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第二多肽鏈的殘基116-235對應於曲妥珠單抗 的VH結構域(SEQ ID NO:124 )。第二多肽鏈的殘基236-240對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線)。第二多肽鏈的殘基241-268對應於包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO:32 )。
DART-D 的第三多肽鏈具有共同的雙抗體多肽鏈 的氨基酸序列(SEQ ID NO:153 )。E. CD16 x HER2/neu 結合分子 ， “DART-E”
被命名為“DART-E ”的CD16 x HER2/neu 結合分子 是進一步示例性的CD16 x DA 結合分子。 DART-E 是能夠結合CD16和HER2/neu癌抗原的雙特異性雙抗體。DART-E 由三條多肽鏈構成，並且具有包含人源化抗人CD16抗體hCD16-M2 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於CD16的表位是免疫特異性的)和包含曲妥珠單抗 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於HER2/neu癌抗原的表位是免疫特異性的)。三條多肽鏈締合以形成能免疫特異性地結合CD16的表位和HER2/neu癌抗原的表位的共價結合的DART®雙抗體(參見，例如圖 4A )。
DART-E 的第一多肽鏈具有SEQ ID NO:160 的氨基酸序列： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIK GGG SGGGG QVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSSAMH WVRQAPGQGL EWMGYINHYN DGIKYNERFK GRVTITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CARGYRYASW FASWGQGTLV TVSS ASTKG E VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEKGGG DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第一多肽鏈(SEQ ID NO:160 )的殘基1-107對應於曲妥珠單抗 的VL結構域(SEQ ID NO:125 )。第一多肽鏈的殘基108-115(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第一多肽鏈的殘基116-234對應於人源化抗人CD16抗體hCD16-M2 的VH2結構域(SEQ ID NO:84 )。殘基235-239對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線)。第一多肽鏈的殘基240-267對應於包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31 )。第一多肽鏈的殘基268-280對應於連接體(SEQ ID NO:43 )。第一多肽鏈的殘基281-497對應於“帶有杵的” IgG1 CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:51 )，其中最後的殘基是賴氨酸。
DART-E 的第二多肽鏈在序列上與DART-D 的第二多肽鏈(SEQ ID NO:159 )相同。
DART-E 的第三多肽鏈具有共同的雙抗體多肽鏈 的氨基酸序列(SEQ ID NO:153 )。F. CD16 x HIV env 結合分子 ， “DART-F”
被命名為“DART-F ”的CD16 x HIV env 結合分子 是進一步示例性的CD16 x DA 結合分子。 DART-F 是能夠結合CD16和HIV env蛋白的雙特異性雙抗體。DART-F 由三條多肽鏈構成，具有包含人源化抗人CD16抗體hCD16-M1 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於CD16的表位是免疫特異性的)和包含抗體A32 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於HIV env蛋白的表位是免疫特異性的)。三條多肽鏈締合以形成能夠免疫特異性地結合CD16的表位和HIV env蛋白的表位的共價結合的DART®雙抗體(參見，例如圖 4A )。
DART-F 的第一多肽鏈具有SEQ ID NO:161 的氨基酸序列： QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQH HPGKAPKLII SEVNNRPSGV PDRFSGSKSG NTASLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTDIHNFV FGGGTKLTVL GGGSGGGG EV QLVESGGGLV KPGGSLRLSC AASGFTFSNY GMSWVRQAPG KGLEWVATIS GGGSYTFYPD SVKGRFTISR DNAKNSLYLQ MNSLRTEDTA LYYCVRQSAR APEPYWGQGT LVTVSS ASTK G EVAACEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEKG GGDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第一多肽鏈(SEQ ID NO:161 )的殘基1-110對應於抗體A32 的VL結構域(SEQ ID NO:143 )。第一多肽鏈的殘基111-118(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第一多肽鏈的殘基119-236對應於人源化抗人CD16抗體hCD16-M1 的VH結構域(SEQ ID NO:72 )。殘基237-241對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線)。第一多肽鏈的殘基242-269對應於包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31 )。第一多肽鏈的殘基270-282對應於連接體(SEQ ID NO:43 )。第一多肽鏈的殘基283-499對應於“帶有杵的”IgG1 CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:51 )，其中最後的殘基是賴氨酸。
DART-F 的第二多肽鏈具有SEQ ID NO:162 的氨基酸序列： DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQNVG THVAWYQQKP GKAPKSLLYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQS EDIATYYCQQ YKSYPLTFGQ GTKLEIK GGG SGGGG QVQLQ ESGPGLVKPS QTLSLSCTVS GGSSSSGAHY WSWIRQYPGK GLEWIGYIHY SGNTYYNPSL KSRITISQHT SENQFSLKLN SVTVADTAVY YCARGTRLRT LRNAFDIWGQ GTLVTVSS AS TKG KVAACKE KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第二多肽鏈(SEQ ID NO:162 )的殘基1-107對應於人源化抗人CD16抗體hCD16-M1 的VL結構域(SEQ ID NO:73 )。第二多肽鏈的殘基108-115(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第二多肽鏈的殘基116-238對應於抗體A32 的VH結構域(SEQ ID NO:142 )。第二多肽鏈的殘基239-243對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線)。第二多肽鏈的殘基244-271對應於包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO:32 )。
DART-F 的第三多肽鏈具有共同的雙抗體多肽鏈 的氨基酸序列(SEQ ID NO:153 )。G. CD16 x HIV env 結合分子 ， “DART-G”
CD16 x HIV env 結合分子 被命名為“DART-G ”是進一步示例性的CD16 x DA 結合分子。 DART-G 是能夠結合CD16和HIV env蛋白的雙特異性雙抗體。DART-G 由三條多肽鏈構成，並且具有包含人源化抗人CD16抗體hCD16-M2 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於CD16的表位是免疫特異性的)和包含抗體A32 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於HIV env蛋白的表位是免疫特異性的)。三條多肽鏈締合以形成能免疫特異性地結合CD16的表位和HIV env蛋白的表位的共價結合的DART®雙抗體(參見，例如圖 4A )。
DART-G 的第一多肽鏈具有SEQ ID NO:163 的氨基酸序列： QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQH HPGKAPKLII SEVNNRPSGV PDRFSGSKSG NTASLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTDIHNFV FGGGTKLTVL GGGSGGGG QV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSS AMHWVRQAPG QGLEWMGYIN HYNDGIKYNE RFKGRVTITA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCATGYRY ASWFASWGQG TLVTVSS AST KG EVAACEKE VAALEKEVAA LEKEVAALEK GGGDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第一多肽鏈(SEQ ID NO:163 )的殘基1-110對應於抗體A32 的VL結構域(SEQ ID NO:143 )。第一多肽鏈的殘基111-118(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第一多肽鏈的殘基119-237對應於人源化抗人CD16抗體hCD16-M2 的VH結構域(SEQ ID NO:83 )。殘基238-242對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線)。第一多肽鏈的殘基243-270對應於包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31 )。第一多肽鏈的殘基271-283對應於連接體(SEQ ID NO:43 )。第一多肽鏈的殘基284-500對應於“帶有杵的”IgG1 CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:51 )，其中最後的殘基是賴氨酸。
DART -G 的第二多肽鏈具有SEQ ID NO:164 的氨基酸序列： EIVLTQSPAT LSVSPGERAT LSCRASQNIG TSIHWYQQKP DQSPKLLIKS VSESISGVPS RFSGSGSGTD FTLTINSLEA EDFATYYCQQ SNSWPLTFGQ GTKLEIK GGG SGGGG QVQLQ ESGPGLVKPS QTLSLSCTVS GGSSSSGAHY WSWIRQYPGK GLEWIGYIHY SGNTYYNPSL KSRITISQHT SENQFSLKLN SVTVADTAVY YCARGTRLRT LRNAFDIWGQ GTLVTVSS AS TKG KVAACKE KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第二多肽鏈(SEQ ID NO:164 )的殘基1-107對應於人源化抗人CD16抗體hCD16-M2 的VL結構域(SEQ ID NO:85 )。第二多肽鏈的殘基108-115(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第二多肽鏈的殘基116-238對應於抗體A32 的VH結構域(SEQ ID NO:142 )。第二多肽鏈的殘基239-243對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線)。第二多肽鏈的殘基244-271對應於包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO:32 )。
DART -G 的第三多肽鏈具有共同的雙抗體多肽鏈 的氨基酸序列(SEQ ID NO:153 )。H. CD16 x HIV env 結合分子， “DART-H”
被命名為“DART-H ”的CD16 x HIV env 結合分子 是進一步示例性的CD16 x DA 結合分子。 DART-H 是能夠結合CD16和HIV env蛋白的雙特異性雙抗體。DART-H 由三條多肽鏈構成，並且具有包含人源化抗人CD16抗體hCD16-M1 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於CD16的表位是免疫特異性的)和包含抗體7B2 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於HIV env蛋白的表位是免疫特異性的)。三條多肽鏈締合以形成能夠免疫特異性地結合CD16的表位和HIV env蛋白的表位的共價結合的DART®雙抗體(參見，例如圖 4A )。
DART-H 的第一多肽鏈具有SEQ ID NO:165 的氨基酸序列： DIVMTQSPDS LAVSPGERAT IHCKSSQTLL YSSNNRHSIA WYQQRPGQPP KLLLYWASMR LSGVPDRFSG SGSGTDFTLT INNLQAEDVA IYYCHQYSSH PPTFGHGTRV EIK GGGSGGG G EVQLVESGG GLVKPGGSLR LSCAASGFTF SNYGMSWVRQ APGKGLEWVA TISGGGSYTF YPDSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRTE DTALYYCVRQ SARAPEPYWG QGTLVTVSS A STKG EVAACE KEVAALEKEV AALEKEVAAL EKGGGDKTHT CPPCPAPEAA GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL WCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第一多肽鏈(SEQ ID NO:165 )的殘基1-113對應於抗體7B2 的VL結構域(SEQ ID NO:141 )。第一多肽鏈的殘基114-121(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第一多肽鏈的殘基122-239對應於人源化抗人CD16抗體hCD16-M1 的VH結構域(SEQ ID NO:72 )。殘基240-244對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線)。第一多肽鏈的殘基245-272對應於包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31 )。第一多肽鏈的殘基273-285對應於連接體(SEQ ID NO:43 )。第一多肽鏈的殘基286-502對應於“帶有杵的”IgG1 CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:51 )，其中最後的殘基是賴氨酸。
DART-H 的第二多肽鏈具有SEQ ID NO:166 的氨基酸序列： DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQNVG THVAWYQQKP GKAPKSLLYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQS EDIATYYCQQ YKSYPLTFGQ GTKLEIK GGG SGGGG QVQLV QSGGGVFKPG GSLRLSCEAS GFTFTEYYMT WVRQAPGKGL EWLAYISKNG EYSKYSPSSN GRFTISRDNA KNSVFLQLDR LSADDTAVYY CARADGLTYF SELLQYIFDL WGQGARVTVS S ASTKG KVAA CKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKE
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第二多肽鏈(SEQ ID NO:166 )的殘基1-107對應於人源化抗人CD16抗體hCD16-M1 的VL結構域(SEQ ID NO:73 )。第二多肽鏈的殘基108-115(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第二多肽鏈的殘基116-241對應於抗體7B2 的VH結構域(SEQ ID NO:140 )。第二多肽鏈的殘基242-246對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線)。第二多肽鏈的殘基247-274對應於包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO:32 )。
DART-H 的第三多肽鏈具有共同的雙抗體多肽鏈 的氨基酸序列(SEQ ID NO:153 )。I. CD16 x HER2/neu 結合分子， “DART-I”
被命名為“DART-I ”的CD16 x HER2/neu 結合分子 是進一步示例性的CD16 x DA 結合分子。 DART-I 類似於上述的DART-C ， 但包含hCD16-M1A 的VH(包含突變的CDRH 3)。如上所示，hCD16-M1A 的VL結構域具有與hCD16-M1 的VL結構域相同的氨基酸序列。
DART-I 的第一多肽鏈具有SEQ ID NO:186 的氨基酸序列： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIK GGG SGGGG EVQLV ESGGGLVKPG GSLRLSCAAS GFTFSNYGMS WVRQAPGKGL EWVATISGGG SYTFYPDSVK GRFTISRDNA KNSLYLQMNS LRTEDTALYY CVRQSANSPV PYWGQGTLVT VSS ASTKG EV AACEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEKGGGD KTHTCPPCP A PEAAGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLWCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第一多肽鏈(SEQ ID NO:186 )的殘基1-107對應於曲妥珠單抗 的VL結構域(SEQ ID NO:125 )。第一多肽鏈的殘基108-115(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第一多肽鏈的殘基116-233對應於優化抗人CD16抗體hCD16-M1A 的VH結構域(SEQ ID NO:58 )。殘基234-238對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線)。第一多肽鏈的殘基239-266對應於包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31 )。第一多肽鏈的殘基267-279對應於連接體(SEQ ID NO:43 )。第一多肽鏈的殘基280-496對應於“帶有杵的”IgG1 CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:51 )，其中最後的殘基是賴氨酸。
因為hCD16-M1A 的VL結構域與hCD16-M1 的VL結構域相同，所以DART-I 的第二多肽鏈的氨基酸序列與DART-C 的 第二多肽鏈的氨基酸序列相同(即，SEQ ID NO:157 )。類似地，DART-I 的第三多肽鏈具有共同的雙抗體多肽鏈 的氨基酸序列(SEQ ID NO:153 )。J. CD16 x HER2/neu 結合分子 “DART-J”
被命名為“DART-J ”的CD16 x HER2/neu 結合分子 是進一步示例性的CD16 x DA 結合分子。 DART-J 類似於上述 DART-C ， 但包含hCD16-M1B 的VL(包含突變的CDRL 3)。如上所示，hCD16-M1B 的VH結構域具有與hCD16-M1 的VH結構域相同的氨基酸序列。
因為hCD16-M1B 的VH結構域與hCD16-M1 的VH結構域相同，所以DART-J 的第一多肽鏈的氨基酸序列與DART-C 的第一多肽鏈的氨基酸序列相同(即，SEQ ID NO:156 )。
DART-J 的第二多肽鏈具有SEQ ID NO:187 的氨基酸序列： DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQNVG THVAWYQQKP GKAPKSLLYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQS EDIATYYCQD YTNYPLTFGQ GTKLEIK GGG SGGGG EVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFNIKDTYIH WVRQAPGKGL EWVARIYPTN GYTRYADSVK GRFTISADTS KNTAYLQMNS LRAEDTAVYY CSRWGGDGFY AMDYWGQGTL VTVSS ASTKG KVAACKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第二多肽鏈(SEQ ID NO:157 )的殘基1-107對應於人源化抗人CD16抗體hCD16-M1B 的VL結構域(SEQ ID NO:59 )。第二多肽鏈的殘基108-115(帶雙底線的)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第二多肽鏈的殘基116-235對應於曲妥珠單抗 的VH結構域(SEQ ID NO:124 )。第二多肽鏈的殘基236-240對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線的)。第二多肽鏈的殘基241-268對應於包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO:32 )。
DART-J 的第三多肽鏈具有共同的雙抗體多肽鏈 的氨基酸序列(SEQ ID NO:153 )。K. CD16 x HER2/neu 結合分子 “DART-K”
被命名為“DART-K ”的CD16 x HER2/neu 結合分子 是進一步示例性的CD16 x DA 結合分子。 DART-K 類似於上述DART-J ，但也包含hCD16-M1A 的VH(包含突變的CDRH 3)。因此，DART-K 包含hCD16-M1AB 的VL和VH(包含突變的CDRL 3和突變的CDRH 3)。
因為DART-K 包含hCD16-M1A 的VH，所以DART-K 的第一多肽鏈的氨基酸序列與DART-I 的第一多肽鏈的氨基酸序列相同(即，SEQ ID NO:186 )。
因為DART-K 包含hCD16-M1B 的VL結構域，所以DART-K 第二多肽鏈的的氨基酸序列與DART-J 的第二多肽鏈的氨基酸序列相同(即，SEQ ID NO:187 )。
DART-J 的第三多肽鏈具有共同的雙抗體多肽鏈 的氨基酸序列(SEQ ID NO:153 )。L. CD16 x CD19 結合分子 “DART-L”
被命名為“DART-L ”的CD16 x CD19 結合分子 是另一示例性的CD16 x DA 結合分子。 DART-L 是能夠結合CD16和CD19 B細胞腫瘤抗原的包含Fc結構域的雙特異性雙抗體。DART-L 由三條多肽鏈構成，並且具有包含抗人CD16抗體hCD16-M1 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於CD16的表位是免疫特異性的)和包含CD19 mAb 1 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於CD19癌抗原的表位是免疫特異性的)。三條多肽鏈締合以形成能免疫特異性地結合CD16的表位和CD19癌抗原的表位的共價結合的DART®雙抗體(參見，例如圖 4A )。
DART-L 的第一多肽鏈具有SEQ ID NO:188 的氨基酸序列： ENVLTQSPAT LSVTPGEKAT ITCRASQSVS YMHWYQQKPG QAPRLLIYDA SNRASGVPSR FSGSGSGTDH TLTISSLEAE DAATYYCFQG SVYPFTFGQG TKLEIK GGGS GGGG EVQLVE SGGGLVKPGG SLRLSCAASG FTFSNYGMSW VRQAPGKGLE WVATISGGGS YTFYPDSVKG RFTISRDNAK NSLYLQMNSL RTEDTALYYC VRQSARAPEP YWGQGTLVTV SS GGCGGG EV AACEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEKGGGD KTHTCPPCP A PEAAGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLWCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第一多肽鏈(SEQ ID NO:188 )的殘基1-106對應於CD19 mAb 1 的VL結構域(SEQ ID NO:139 )。第一多肽鏈的殘基107-114 (帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第一多肽鏈的殘基115-232對應於抗人CD16抗體hCD16-M1 的VH結構域(SEQ ID NO:72 )。殘基233-238對應於連接體(SEQ ID NO:17 ，帶底線)。第一多肽鏈的殘基239-266對應於包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31 )。第一多肽鏈的殘基267-279對應於連接體(SEQ ID NO:43 )。第一多肽鏈的殘基280-496對應於“帶有杵的”(SEQ ID NO:51 )，其中最後的殘基是賴氨酸。
DART-L 的第二多肽鏈具有SEQ ID NO:189 的氨基酸序列： DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQNVG THVAWYQQKP GKAPKSLLYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQS EDIATYYCQQ YKSYPLTFGQ GTKLEIK GGG SGGGG QVTLR ESGPALVKPT QTLTLTCTFS GFSLSTSGMG VGWIRQPPGK ALEWLAHIWW DDDKRYNPAL KSRLTISKDT SKNQVFLTMT NMDPVDTATY YCARMELWSY YFDYWGQGTT VTVSS GGCGG G KVAACKEKV AALKEKVAAL KEKVAALKE
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第二多肽鏈(SEQ ID NO:189 )的殘基1-107對應於抗人CD16抗體hCD16-M1 的VL結構域(SEQ ID NO:73 )。第二多肽鏈的殘基108-115(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第二多肽鏈的殘基116-235對應於CD19 mAb 1 的VH結構域(SEQ ID NO:138 )。第二多肽鏈的殘基236-241對應於連接體(SEQ ID NO:17 ，帶底線)。第二多肽鏈的殘基242-269對應於包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO:32 )。
DART-L 的第三多肽鏈具有共同的雙抗體多肽鏈 的氨基酸序列(SEQ ID NO:153 )。M. CD16 x CD19 結合分子 “DART-M”
被命名為“DART-M ”的CD16 x CD19 結合分子 是進一步示例性的CD16 x DA 結合分子。 DART-M 類似於上述DART-L ， 但包含hCD16-M1B 的VL(包含突變的CDRL 3)。如上所示，hCD16-M1B 的VH結構域具有與hCD16-M1 的VH結構域相同的氨基酸序列。
因為hCD16-M1B 的VH結構域與hCD16-M1 的VH結構域相同，所以DART-M 的第一多肽鏈的氨基酸序列與DART-L 的第一多肽鏈的氨基酸序列相同(即，SEQ ID NO:188 )。
DART-M 的第二多肽鏈具有SEQ ID NO:190 的氨基酸序列： DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQNVG THVAWYQQKP GKAPKSLLYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQS EDIATYYCQD YTNYPLTFGQ GTKLEIK GGG SGGGG QVTLR ESGPALVKPT QTLTLTCTFS GFSLSTSGMG VGWIRQPPGK ALEWLAHIWW DDDKRYNPAL KSRLTISKDT SKNQVFLTMT NMDPVDTATY YCARMELWSY YFDYWGQGTT VTVSS GGCGG G KVAACKEKV AALKEKVAAL KEKVAALKE
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第二多肽鏈(SEQ ID NO:190 )的殘基1-107對應於抗人CD16抗體hCD16-M1B 的VL結構域(SEQ ID NO:59 )。第二多肽鏈的殘基108-115(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第二多肽鏈的殘基116-235對應於CD19 mAb 1 的VH結構域(SEQ ID NO:138 )。第二多肽鏈的殘基236-241對應於連接體(SEQ ID NO:17 ，帶底線)。第二多肽鏈的殘基242-269對應於包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO:32 )。
DART-M 的第三多肽鏈具有共同的雙抗體多肽鏈 的氨基酸序列(SEQ ID NO:153 )。N. CD16 x CD19 結合分子 “DART-N”
被命名為“DART-N ”的CD16 x CD19 結合分子 是進一步示例性的CD16 x DA 結合分子。 DART-N 類似於上述DART-M ，但也包含hCD16-M1A 的VH(包含突變的CDRH 3)。因此，DART-N 包含hCD16-M1AB 的VL和VH(包含突變的CDRL 3和突變的CDRH 3))。
DART-N 的第一多肽鏈具有SEQ ID NO:191 的氨基酸序列： ENVLTQSPAT LSVTPGEKAT ITCRASQSVS YMHWYQQKPG QAPRLLIYDA SNRASGVPSR FSGSGSGTDH TLTISSLEAE DAATYYCFQG SVYPFTFGQG TKLEIK GGGS GGGG EVQLVE SGGGLVKPGG SLRLSCAASG FTFSNYGMSW VRQAPGKGLE WVATISGGGS YTFYPDSVKG RFTISRDNAK NSLYLQMNSL RTEDTALYYC VRQSANSPVP YWGQGTLVTV SS GGCGGG EV AACEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEKGGGD KTHTCPPCPA PEAAGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLWCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第一多肽鏈(SEQ ID NO:191 )的殘基1-106對應於CD19 mAb 1 的VL結構域(SEQ ID NO:139 )。第一多肽鏈的殘基107-114(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第一多肽鏈的殘基115-232對應於抗人CD16抗體hCD16-M1A 的VH結構域(SEQ ID NO:58 )。殘基233-238對應於連接體(SEQ ID NO:17 ，帶底線)。第一多肽鏈的殘基239-266對應於包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31 )。第一多肽鏈的殘基267-279對應於連接體(SEQ ID NO:43 )。第一多肽鏈的殘基280-496對應於“帶有杵的”(SEQ ID NO:51 )，其中最後的殘基是賴氨酸。
因為DART-N 包含hCD16-M1B 的VL結構域，所以DART-N 的第二多肽鏈的氨基酸序列與DART-M 的第二多肽鏈的氨基酸序列相同(即，SEQ ID NO:190 )。
DART-N 的第三多肽鏈具有共同的雙抗體多肽鏈 的氨基酸序列(SEQ ID NO:153 )。O. CD16 x HER2/neu 結合分子 “DART-1”
被命名為“DART-1 ”的CD16 x HER2/neu 結合分子 是進一步示例性的CD16 x DA 結合分子。 DART-1 是能夠結合CD16和HER2/neu癌抗原的雙特異性雙抗體。DART-1 與 DART-A 實質上相同，除了它具有人源化抗人CD16抗體h3G8 的VL和VH結構域( 參見，例如美國專利公開號2004/0010124；PCT公開號WO 2017/142928；Li, W.等(2016) “Identification Of High-Affinity Anti-CD16A Allotype-Independent Hum Antibody Domains ,” Exp. Mol. Pathol. 101(2):281-289)：人源化抗人 CD16 mAb h3G8 的 VH 結構域 (SEQ ID NO:62 )顯示在下面(CDRH 殘基用底線顯示)： QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMGVG WIR QPPGKALEWL A HIWWDDDKR YNPALKS RLT ISKDTSKNQV VLTMTNMDPV DTATYYCAQ I NPAWFAY WGQ GTLVTVSS人源化 CD16 mAb h3G8 的 VL 結構域 (SEQ ID NO:63 )顯示在下面(CDRL 殘基用底線顯示)： DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INC KASQSVD FDGDSFMN WY QQKPGQPPKL LIY TTSNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YC QQSNEDPY T FGQGTKLEI K 而不是存在於DART-A 中的抗人CD16抗體CD16-M1 的VH和VL結構域(分別地，SEQ ID NO:64 和SEQ ID NO:65 )。h3G8 的VH和VL結構域在本文中被用作比較物(comparator)CD16結合位點。DART-1 由三條多肽鏈構成，其具有包含抗人CD16抗體CD16-M1 的VL和VH結構域的兩個結合結構域(並且因此對於CD16的表位是免疫特異性的)和包含曲妥珠單抗的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於HER2/neu癌抗原的表位是免疫特異性的)。三條多肽鏈締合以形成能夠免疫特異性地結合CD16的表位和HER2/neu癌抗原的表位的共價結合的DART®雙抗體(參見，例如圖 4A )。
DART-1 的第一多肽鏈具有SEQ ID NO:167 的氨基酸序列： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIK GGG SGGGG QVTLR ESGPALVKPT QTLTLTCTFS GFSLSTSGMG VGWIRQPPGK ALEWLAHIWW DDDKRYNPAL KSRLTISKDT SKNQVVLTMT NMDPVDTATY YCAQINPAWF AYWGQGTLVT VSS ASTKG EV AACEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEKGGGD KTHTCPPCPA PEAAGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLWCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第一多肽鏈(SEQ ID NO:167 )的殘基1-107對應於曲妥珠單抗 的VL結構域(SEQ ID NO:125 )。第一多肽鏈的殘基108-115(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第一多肽鏈的殘基116-233對應於人源化抗人CD16抗體h3G8 的VH結構域(SEQ ID NO:62 )。殘基234-238對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線)。第一多肽鏈的殘基239-266對應於包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31 )。第一多肽鏈的殘基267-279對應於連接體(SEQ ID NO:43 )。第一多肽鏈的殘基280-496對應於“帶有杵的”IgG1 CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:51 )，其中最後的殘基是賴氨酸。
DART-1 的第二多肽鏈具有SEQ ID NO:168 的氨基酸序列： DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL LIYTTSNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSNEDPY TFGQGTKLEI K GGGSGGGG E VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFNIKD TYIHWVRQAP GKGLEWVARI YPTNGYTRYA DSVKGRFTIS ADTSKNTAYL QMNSLRAEDT AVYYCSRWGG DGFYAMDYWG QGTLVTVSS A STKG KVAACK EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第二多肽鏈(SEQ ID NO:168 )的殘基1-111對應於人源化抗人CD16抗體h3G8 的VL結構域(SEQ ID NO:63 )。第二多肽鏈的殘基112-119(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第二多肽鏈的殘基120-239對應於曲妥珠單抗 的VH結構域(SEQ ID NO:124 )。第二多肽鏈的殘基240-244對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線)。第二多肽鏈的殘基244-272對應於包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO:32 )。
DART-1 的第三多肽鏈具有共同的雙抗體多肽鏈 的氨基酸序列(SEQ ID NO:153 )。P. CD16 x RSV 結合分子 “DART-2”
被命名為“DART-2 ”的CD16 x RSV 結合分子 是進一步示例性的CD16 x DA 結合分子 。DART-2 是能夠結合CD16和RSV糖蛋白F的雙特異性雙抗體。DART-2 與DART-1 實質上相同，除了它具有抗RSV糖蛋白F抗體v 帕利珠單抗 的VH和VL結構域(分別地，SEQ ID NO:144 和SEQ ID NO:145 )，而不是存在於DART-1 雙抗體 中的曲妥珠單抗 的VH和VL結構域(分別地，SEQ ID NO:124 和SEQ ID NO:125 )。因此，DART-2 由三條多肽鏈構成，並且具有包含人源化抗人CD16抗體h3G8 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於CD16的表位是免疫特異性的)和包含v 帕利珠單抗 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於RSV糖蛋白F的表位是免疫特異性的)。第三多肽鏈具有共同的雙抗體多肽鏈 的氨基酸序列(SEQ ID NO:153 )。三條多肽鏈締合以形成能免疫特異性地結合CD16的表位和RSV糖蛋白F的表位的共價結合的DART®雙抗體(參見，例如圖 4A )。如上所示，h3G8 的VH和VL結構域在本文被用作比較物CD16結合位點。Q. CD16 x RSV 結合分子 “DART-3”
被命名為“DART-3 ”的CD16 x RSV 結合分子 是進一步示例性的CD16 x DA 結合分子。 CD16 x RSV DART-3 是能夠結合CD16和RSV糖蛋白F的雙特異性雙抗體。DART-3 由三條多肽鏈構成，並且具有包含人源化抗人CD16抗體hCD16-M1 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於CD16的表位是免疫特異性的)和包含v 帕利珠單抗 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於RSV糖蛋白F的表位是免疫特異性的)。三條多肽鏈締合以形成能免疫特異性地結合CD16的表位和RSV糖蛋白F的表位的共價結合的DART®雙抗體(參見，例如圖 4A )。
DART-3 的第一多肽鏈具有SEQ ID NO:169 的氨基酸序列： DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITCRASQSVG YMHWYQQKPG KAPKLLIYDT SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPD DFATYYCFQG SGYPFTFGGG TKLEIK GGGS GGGG EVQLVE SGGGLVKPGG SLRLSCAASG FTFSNYGMSW VRQAPGKGLE WVATISGGGS YTFYPDSVKG RFTISRDNAK NSLYLQMNSL RTEDTALYYC VRQSARAPEP YWGQGTLVTV SS ASTKG EVA ACEKEVAALE KEVAALEKEV AALEKGGGDK THTCPPCPAP EAAGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLWCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第一多肽鏈(SEQ ID NO:169 )的殘基1-106對應於v 帕利珠單抗 的VL結構域(SEQ ID NO:145 )。第一多肽鏈的殘基107-114(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第一多肽鏈的殘基115-232對應於人源化抗人CD16抗體hCD16-M1 的VH結構域(SEQ ID NO:72 )。殘基233-237對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線)。第一多肽鏈的殘基238-265對應於包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31 )。第一多肽鏈的殘基266-278對應於連接體(SEQ ID NO:43 )。第一多肽鏈的殘基279-495對應於“帶有杵的”IgG1 CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:51 )，其中最後的殘基是賴氨酸。
DART-3 的第二多肽鏈具有SEQ ID NO:170 的氨基酸序列： DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQNVG THVAWYQQKP GKAPKSLLYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQS EDIATYYCQQ YKSYPLTFGQ GTKLEIK GGG SGGGG QVTLR ESGPALVKPT QTLTLTCTFS GFSLSTSGMS VGWIRQPPGK ALEWLADIWW DDKKDYNPSL KSRLTISKDT SKNQVVLKVT NMDPADTATY YCARSMITNW YFDVWGAGTT VTVSS ASTKG KVAACKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第二多肽鏈(SEQ ID NO:170 )的殘基1-107對應於人源化抗人CD16抗體hCD16-M1 的VL結構域(SEQ ID NO:73 )。第二多肽鏈的殘基108-115(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第二多肽鏈的殘基116-235對應於v 帕利珠單抗 的VH結構域(SEQ ID NO:144 )。第二多肽鏈的殘基236-240對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線)。第二多肽鏈的殘基241-268對應於包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO:32 )。
DART-3 的第三多肽鏈具有共同的雙抗體多肽鏈 的氨基酸序列(SEQ ID NO:153 )。R. CD16 x HIV env 結合分子 “DART-4
被命名為“DART-4 ”的CD16 x HIV env 結合分子 是進一步示例性的CD16 x DA 結合分子。 DART-4 是能夠結合CD16和HIV env蛋白的雙特異性雙抗體。DART-4 與DART-1 實質上相同，除了它具有抗HIV env蛋白抗體7B2 的VH和VL結構域(分別地，SEQ ID NO:140 和SEQ ID NO:141 )，而不是存在於DART-1 中的 曲妥珠單抗 的VH和VL結構域(分別地，SEQ ID NO:124 和SEQ ID NO:125 )。因此，DART-4 由三條多肽鏈構成，並且具有包含人源化抗人CD16抗體h3G8 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於CD16的表位是免疫特異性的)和包含7B2 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於HIV env蛋白的表位是免疫特異性的)。第三多肽鏈具有共同的雙抗體多肽鏈 的氨基酸序列( SEQ ID NO:153 )。三條多肽鏈締合以形成能夠免疫特異性地結合CD16的表位和HIV env蛋白的表位的共價結合的DART®雙抗體(參見，例如圖 4A )。如上所示，h3G8 的VH和VL結構域在本文被用作比較物CD16結合位點。S. CD16 x RSV 結合分子 “DART-5”
被命名為“DART-5 ”的CD16 x RSV結合分子是進一步示例性的CD16 x DA 結合分子 。DART-5 是能夠結合CD16和RSV糖蛋白F的雙特異性雙抗體。DART-5 與DART-L 實質上相同，除了它具有抗RSV糖蛋白F抗體v 帕利珠單抗 的VL和VH結構域(分別地，SEQ ID NO:144 和SEQ ID NO:145 )，而不是存在於DART-L 中的CD19 mAb 1 的VH和VL結構域(分別地，SEQ ID NO:138 和SEQ ID NO:139 )。因此，DART-5 由三條多肽鏈構成，並且具有包含人源化抗人CD16抗體hCD16-M1 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於CD16的表位是免疫特異性的)和包含v 帕利珠單抗 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於RSV糖蛋白F的表位是免疫特異性的)。第三多肽鏈具有共同的雙抗體多肽鏈 的氨基酸序列( SEQ ID NO:153 )。三條多肽鏈締合以形成能夠免疫特異性地結合CD16的表位和RSV糖蛋白F的表位的共價結合的DART®雙抗體(參見，例如圖 4A )。T. CD16 x RSV 結合分子 “DART-6”
被命名為“DART-6 ”的CD16 x RSV 結合分子 是進一步示例性的CD16 x DA 結合分子 。DART-6 是能夠結合CD16和RSV糖蛋白F的雙特異性雙抗體。DART-6 與DART-M 實質上相同，除了它具有抗RSV糖蛋白F抗體v 帕利珠單抗 的VL和VH結構域(分別地，SEQ ID NO:144 和SEQ ID NO:145 )，而不是存在於DART-M 中的CD19 mAb 1 的VH和VL結構域(分別地，SEQ ID NO:138 和SEQ ID NO:139 )。因此，DART-6 由三條多肽鏈構成，並且具有包含優化的抗人CD16抗體hCD16-M1B 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於CD16的表位是免疫特異性的)和包含v 帕利珠單抗 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於RSV糖蛋白F的表位是免疫特異性的)。第三多肽鏈具有共同的雙抗體多肽鏈 的氨基酸序列( SEQ ID NO:153 )。三條多肽鏈締合以形成能夠免疫特異性地結合CD16的表位和RSV糖蛋白F的表位的共價結合的DART®雙抗體(參見，例如圖 4A )。U. CD16 x RSV 結合分子 “DART-7”
被命名為“DART-7 ”的CD16 x RSV 結合分子 是進一步示例性的CD16 x DA 結合分子 。DART-7 是能夠結合CD16和RSV糖蛋白F的雙特異性雙抗體。DART-7 與DART-N 實質上相同，除了它具有抗RSV糖蛋白 F抗體v 帕利珠單抗 的VL和VH結構域(分別地，SEQ ID NO:144 和SEQ ID NO:145 )，而不是存在於DART-N 中的CD19 mAb 1 的VH和VL結構域(分別地，SEQ ID NO:138 和SEQ ID NO:139 )。因此，DART-7 由三條多肽鏈構成，並且具有包含優化的抗人CD16抗體hCD16-M1AB 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於CD16的表位是免疫特異性的)和包含v 帕利珠單抗 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於RSV糖蛋白F的表位是免疫特異性的)。第三多肽鏈具有共同的雙抗體多肽鏈 的氨基酸序列( SEQ ID NO:153 )。三條多肽鏈締合以形成能夠免疫特異性地結合CD16的表位和RSV糖蛋白F的表位的共價結合的DART®雙抗體(參見，例如圖 4A )。V. CD16 x HIV env 分子 “DART-X”
被命名為“DART-X ”的CD16 x HIV env 結合分子 是進一步示例性的CD16 x DA 結合 分子 。DART-X 是能夠結合CD16和HIV env蛋白的雙特異性雙抗體。DART-X 由兩條多肽鏈構成，並且具有包含抗人CD16抗體CD16-M1 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於CD16的表位是免疫特異性的)和包含7B2 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於HIV env蛋白的表位是免疫特異性的)。兩條多肽鏈締合以形成能夠免疫特異性地結合CD16的表位和HIV env蛋白的表位的共價結合的DART®雙抗體(參見，例如圖 1A-1B )。
DART-X 的第一多肽鏈具有SEQ ID NO:171 的氨基酸序列： DIVMTQSPDS LAVSPGERAT IHCKSSQTLL YSSNNRHSIA WYQQRPGQPP KLLLYWASMR LSGVPDRFSG SGSGTDFTLT INNLQAEDVA IYYCHQYSSH PPTFGHGTRV EIK GGGSGGG G EVKLVESGG TLVKPGGSLK LSCAASGFTF NNYGMSWVRQ TPEKRLEWVA TISGGGSYTF YPDSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMSSLRSE DTALYYCIRQ SARAPEPYWG QGTLVTVSS A STKG EVAACE KEVAALEKEV AALEKEVAAL EK
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第一多肽鏈(SEQ ID NO:171 )的殘基1-113對應於7B2 的VL結構域(SEQ ID NO:141 )。第一多肽鏈的殘基114-121(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第一多肽鏈的殘基122-239對應於抗人CD16抗體CD16-M1 的VH結構域(SEQ ID NO:64 )。殘基240-244對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線)。第一多肽鏈的殘基245-272對應於包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31 )。
DART -X 的第二多肽鏈具有SEQ ID NO:172 的氨基酸序列： DIVMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVG THVAWYQQKS GQSPKSLLYS ASYRYSGVPD RFSGSGSGTD FTLTISNVQS EDLAEYFCQQ YKSYPLTFGA GTKLELK GGG SGGGG QVQLV QSGGGVFKPG GSLRLSCEAS GFTFTEYYMT WVRQAPGKGL EWLAYISKNG EYSKYSPSSN GRFTISRDNA KNSVFLQLDR LSADDTAVYY CARADGLTYF SELLQYIFDL WGQGARVTVS S ASTKG KVAA CKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKE
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第二多肽鏈(SEQ ID NO:172 )的殘基1-107對應於抗人CD16抗體CD16-M1 的VL結構域(SEQ ID NO:65 )。第二多肽鏈的殘基108-115(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第二多肽鏈的殘基116-241對應於7B2 的VH結構域(SEQ ID NO:140 )。第二多肽鏈的殘基242-246對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線)。第二多肽鏈的殘基247-274對應於包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO:32 )。W. CD16 x HIV env 結合分子 “DART-Y”
被命名為“DART-Y ”的CD16 x HIV env 結合分子 是進一步示例性的CD16 x DA 結合分子 。DART-Y 是能夠結合CD16和HIV env蛋白的雙特異性雙抗體。DART-Y 由兩條多肽鏈構成，並且具有包含抗人CD16抗體CD16-M2 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於CD16的表位是免疫特異性的)和包含7B2 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於HIV env蛋白的表位是免疫特異性的)。兩條多肽鏈締合以形成能夠免疫特異性地結合CD16的表位和HIV env蛋白的表位的共價結合的DART®雙抗體(參見，例如圖 1B )。
DART-Y 的第一多肽鏈具有SEQ ID NO:173 的氨基酸序列： DIVMTQSPDS LAVSPGERAT IHCKSSQTLL YSSNNRHSIA WYQQRPGQPP KLLLYWASMR LSGVPDRFSG SGSGTDFTLT INNLQAEDVA IYYCHQYSSH PPTFGHGTRV EIK GGGSGGG G EVQLQQSGP ELVKPGASVK MSCKASGYTF TSSAMHWVKK NPGQGLEWIG YINHYNDGIK YNERFKGKAT LTSDKSSSTA YMELSSLTSE DSAVYYCATG YRYASWFASW GQGTLVTVSS ASTKG EVAAC EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEK
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第一多肽鏈(SEQ ID NO:173 )的殘基1-113對應於7B2 的VL結構域(SEQ ID NO:141 )。第一多肽鏈的殘基114-121(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第一多肽鏈的殘基122-240對應於抗人CD16抗體CD16-M2 的VH結構域(SEQ ID NO:75 )。殘基241-245對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線)。第一多肽鏈的殘基246-273對應於包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31 )。
DART -Y 的第二多肽鏈具有SEQ ID NO:174 的氨基酸序列： DILLTQSPAI LSVSPGERVS FSCRASQNIG TSIHWYQQRT DGSPRLLIKS VSESISGIPS RFSGSGSGTD FTLTINGVES GDISDYYCQQ SNSWPLTFGA GTKLELK GGG SGGGG QVQLV QSGGGVFKPG GSLRLSCEAS GFTFTEYYMT WVRQAPGKGL EWLAYISKNG EYSKYSPSSN GRFTISRDNA KNSVFLQLDR LSADDTAVYY CARADGLTYF SELLQYIFDL WGQGARVTVS S ASTKG KVAA CKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKE
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第二多肽鏈(SEQ ID NO:174 )的殘基1-107對應於抗人CD16抗體CD16-M2 的VL結構域(SEQ ID NO:76 )。第二多肽鏈的殘基108 -115(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第二多肽鏈的殘基116-241對應於7B2 的VH結構域(SEQ ID NO:140 )。第二多肽鏈的殘基242-246對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線)。第二多肽鏈的殘基247-274對應於包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO:32 )。X. CD16 x HIV env 結合分子 “DART-0”
被命名為“DART-0 的CD16 x HIV env 結合分子 是進一步示例性的CD16 x DA 結合分子 。DART-0 是能夠結合CD16和HIV env蛋白的雙特異性雙抗體。DART-0 與DART-X 實質上相同，除了它具有人源化抗人CD16抗體h3G8 的VH和VL結構域(分別地，SEQ ID NO:62 和SEQ ID NO:63 )，而不是存在於DART-X 中的抗人CD16抗體CD16-M1 的VH和VL結構域(分別地，SEQ ID NO:64 和SEQ ID NO:65 )。因此，DART-0 由兩條多肽鏈構成，並且具有包含人源化抗人CD16抗體h3G8 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於CD16的表位是免疫特異性的)和包含7B2 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於HIV Env蛋白的表位是免疫特異性的)。這些多肽鏈締合以形成具有對於CD16的表位元免疫特異性的一個結合結構域和對於HIV env蛋白的表位元免疫特異性的一個結合結構域的由兩條多肽鏈構成的共價結合的DART®雙抗體(參見，例如圖 1A-1B )。如上所示，h3G8 的VH和VL結構域在本文被用作比較物CD16結合位點。Y. CD16 x HIV env 結合分子 “DART-Z”
被命名為“DART-Z” 的CD16 x HIV env 結合分子 是進一步示例性的CD16 x DA 結合分子 。DART-Z 是能夠結合CD16和HIV env蛋白的雙特異性雙抗體。DART-Z 與DART-X 實質上相同，除了它具有抗HIV env抗體A32的VH和VL結構域(分別地，SEQ ID NOs:142 和 143 )而不是抗HIV env抗體7B2的VH和VL結構域；並且它具有抗人CD16A scFv4-LS21 的VH和VL結構域(U.S.專利公開號2015/0218275)：抗人 CD16A scFv 4-LS21 的 VH 結構域 (SEQ ID NO:175) ： EEVQLVQSGA EVKKPGESLK VSCKASGYTF TSYYMHWVRQ APGQGLEWMG IINPSGGSTS YAQKFQGRVT MTRDTSTSTV YMELSSLRSE DTAVYYCARG SAYYYDFADY WGQGTLVTVS S抗人 CD16A scFv 4-LS21 的 VL 結構域 (SEQ ID NO:176) ： QPVLTQPSSV SVAPGQTATI SCGGHNIGSK NVHWYQQRPG QSPVLVIYQD NKRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCQVW DNYSVLFGGG TKLTVL 而不是存在於DART-X 中的抗人CD16抗體CD16-M1 的VH和VL結構域(分別地，SEQ ID NO:64 和SEQ ID NO:65 )。因此，DART-Z 由兩條多肽鏈構成，其具有包含抗人CD16A scFv4-LS21 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於CD16的表位是免疫特異性的)和包含A32 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於HIV env蛋白的表位是免疫特異性的)。這些多肽鏈締合以形成具有對於CD16的表位元免疫特異性的一個結合結構域和對於HIV env蛋白的表位元免疫特異性的一個結合結構域的由兩條多肽鏈構成的共價結合的DART®雙抗體(參見，例如圖 1A-1B )。4-LS21 的VH和VL結構域在本文被用作比較物CD16結合位點。Z. CD16 x HIV env x HIV env 三價分子
本發明的CD16 x DA 結合分子 進一步通過包含Fc結構域的雙特異性或三特異性的CD16 x HIV env x HIV env 三價分子 示例，其包含能夠結合至HIV env蛋白的表位元的兩個結合結構域和能夠結合至CD16的表位元的一個結合結構域。HIV env蛋白的這種表位可以相同(如在CD16 x HIV env x HIV env 三價分子 “TRIDENT-A ”中)，或者它們可以不同(如在CD16 x HIV env x HIV env 三價分子 “TRIDENT-B ”中)。示例性的三價TRIDENT™分子的結構和序列被匯總在表 13 中，並且在下面進行詳細描述。 1. CD16 x HIV env x HIV env 三價分子 “TRIDENT-A”
被命名為“TRIDENT-A ”的CD16 x HIV env x HIV env 三價分子 由四條多肽鏈構成，並且具有包含抗人CD16抗體hCD16-M1 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於CD16的表位是免疫特異性的)和各自包含A32 的VL和VH結構域的兩個結合結構域(並且因此對於由抗體A32 識別的HIV env蛋白的表位是免疫特異性的)。四條多肽鏈締合以形成能夠免疫特異性地結合由抗體A32 識別的HIV env蛋白表位的一個或兩個拷貝以及CD16的表位的共價結合的TRIDENT™分子(參見圖 6A )。
TRIDENT-A 的第一多肽鏈具有SEQ ID NO:177 的氨基酸序列： QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQH HPGKAPKLII SEVNNRPSGV PDRFSGSKSG NTASLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTDIHNFV FGGGTKLTVL GGGSGGGG EV QLVESGGGLV KPGGSLRLSC AASGFTFSNY GMSWVRQAPG KGLEWVATIS GGGSYTFYPD SVKGRFTISR DNAKNSLYLQ MNSLRTEDTA LYYCVRQSAR APEPYWGQGT LVTVSS ASTK G EVAACEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEKG GGDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第一多肽鏈(SEQ ID NO:177 )的殘基1-110對應於抗體A32 的VL結構域(SEQ ID NO:143 )。第一多肽鏈的殘基111-118(帶雙底線 )對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第一多肽鏈的殘基119-236對應於抗人CD16抗體hCD16-M1 的VH結構域(SEQ ID NO:72 )。殘基237-241對應於連接體(SEQ ID NO:21 ，帶底線)。第一多肽鏈的殘基242-269對應於包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31 )。第一多肽鏈的殘基270-282對應於連接體(SEQ ID NO:43 )。第一多肽鏈的殘基283-499對應於“帶有杵的”IgG1 CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:51 )，其中最後的殘基是賴氨酸。
TRIDENT-A 的第二多肽鏈具有SEQ ID NO:178 的氨基酸序列： DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQNVG THVAWYQQKP GKAPKSLLYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQS EDIATYYCQQ YKSYPLTFGQ GTKLEIK GGG SGGGG QVQLQ ESGPGLVKPS QTLSLSCTVS GGSSSSGAHY WSWIRQYPGK GLEWIGYIHY SGNTYYNPSL KSRITISQHT SENQFSLKLN SVTVADTAVY YCARGTRLRT LRNAFDIWGQ GTLVTVSS AS TKG KVAACKE KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
這種示例性的CD16 x DA 結合分子 的第二多肽鏈(SEQ ID NO:178 )的殘基1-107對應於抗體hCD16-M1 的VL結構域(SEQ ID NO:73 )。第二多肽鏈的殘基108-115(帶雙底線)對應於連接體1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16 )。第二多肽鏈的殘基116-238對應於抗體A32 的VH結構域(SEQ ID NO:142 )。第二多肽鏈的殘基239-243對應於連接體(SEQ ID NO:43 )。第二多肽鏈的殘基244-271對應於包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO:32 )。
TRIDENT-A 的第三多肽鏈具有SEQ ID NO:179 的氨基酸序列： QVQLQESGPG LVKPSQTLSL SCTVSGGSSS SGAHYWSWIR QYPGKGLEWI GYIHYSGNTY YNPSLKSRIT ISQHTSENQF SLKLNSVTVA DTAVYYCARG TRLRTLRNAF DIWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKR V EPKSCDKTH TCPPCP APEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LSCAVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLVSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN RYTQKSLSLS PGK
第三多肽鏈(SEQ ID NO:179 )的殘基1-123對應於抗體A32 的VH結構域(SEQ ID NO:142 )。第三多肽鏈的殘基124-221對應於人IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:3 )。第三多肽鏈的殘基222-236對應於IgG鉸鏈結構域(SEQ ID NO:7 ，帶底線)。第三多肽鏈的殘基237-453對應於“帶有臼的”IgG1 CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:53 )，其中最後的殘基是賴氨酸。
TRIDENT-A 的第四多肽鏈具有SEQ ID NO:180 的氨基酸序列： QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQH HPGKAPKLII SEVNNRPSGV PDRFSGSKSG NTASLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTDIHNFV FGGGTKLTVL RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC
第四多肽鏈(SEQ ID NO:180 )的殘基 1-110對應於抗體A32 的VL結構域(SEQ ID NO:143 )。第四多肽鏈的殘基111-217對應於人CL κ結構域(SEQ ID NO:1 )。2. CD16 x HIV env x HIV env 三價分子 “TRIDENT-B”
被命名為“TRIDENT-B ”的示例性CD16 x HIV env x HIV env 三價分子 也由四條多肽鏈構成。它具有包含抗人CD16抗體hCD16-M1 的VL和VH結構域的一個結合結構域(並且因此對於CD16的表位是免疫特異性的)，包含A32 的VL和VH結構域的結合結構域(並且因此對於由抗體A32 識別的HIV env蛋白的表位是免疫特異性的)和包含7B2 的VL和VH結構域的另外的結合結構域(並且因此對於由抗體7B2 識別的HIV env蛋白的表位是免疫特異性的)。四條多肽鏈締合以形成能夠免疫特異性地結合由抗體A32 識別的HIV env蛋白的表位和/或由抗體7B2 識別的HIV env蛋白的表位、和CD16的表位的共價結合的TRIDENT™分子(參見圖 6A )。
TRIDENT-B 的第一多肽鏈與TRIDENT-A 的第一多肽鏈(SEQ ID NO:177 )相同。
TRIDENT-B 的第二多肽鏈與TRIDENT-A 的第二多肽鏈(SEQ ID NO:178 )相同。
TRIDENT-B 的第三多肽鏈具有SEQ ID NO:181 的氨基酸序列： QVQLVQSGGG VFKPGGSLRL SCEASGFTFT EYYMTWVRQA PGKGLEWLAY ISKNGEYSKY SPSSNGRFTI SRDNAKNSVF LQLDRLSADD TAVYYCARAD GLTYFSELLQ YIFDLWGQGA RVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKSTSGGTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS LSSVVTVPSS SLGTQTYICN VNHKPSNTKV DKRV EPKSCD KTHTCPPCP A PEAAGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLSCAVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLVSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNRYTQKSL SLSPGK
第三多肽鏈(SEQ ID NO:181 )的殘基1-126對應於抗體7B2 的VH結構域(SEQ ID NO:140 )。第三多肽鏈的殘基127-224對應於人IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:3 )。第三多肽鏈的殘基225-239對應於IgG鉸鏈結構域(SEQ ID NO:7 ，帶底線)。第三多肽鏈的殘基240-456對應於“帶有臼的”IgG1 CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:53 )，其中最後的殘基是賴氨酸。
TRIDENT-B 的第四多肽鏈具有SEQ ID NO:182 的氨基酸序列： DIVMTQSPDS LAVSPGERAT IHCKSSQTLL YSSNNRHSIA WYQQRPGQPP KLLLYWASMR LSGVPDRFSG SGSGTDFTLT INNLQAEDVA IYYCHQYSSH PPTFGHGTRV EIKRTVAAPS VFIFPPSDEQ LKSGTASVVC LLNNFYPREA KVQWKVDNAL QSGNSQESVT EQDSKDSTYS LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC EVTHQGLSSP VTKSFNRGEC
第四多肽鏈(SEQ ID NO:182 )的殘基1-113對應於抗體7B2 的VL結構域(SEQ ID NO:141 )。第四多肽鏈的殘基114-220對應於人CL κ結構域(SEQ ID NO:1 )。VIII. 生產方法
本發明的分子最優選地通過編碼這種多肽的核酸分子的重組表達生產，如本領域所熟知的。
本發明的多肽可方便地利用固相肽合成製備(Merrifield, B. (1986) “Solid Phase Synthesis ,” Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) “General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135；Ganesan, A. (2006) “Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century ,” Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10)。
抗體可利用本領域已知的任何方法重組製備並且表達。抗體可通過首先分離從宿主動物製備的抗體、獲得基因序列、和利用該基因序列在宿主細胞(例如CHO細胞)中重組表達抗體而重組製備。可以採用的另一方法是在植物(例如，煙草)或轉基因牛奶中表達抗體序列。在植物或牛奶中重組表達抗體的合適方法已經被公開(參見，例如Peeters等(2001) “Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants ,” Vaccine 19:2756；Lonberg, N.等(1995) “Human Antibodies From Transgenic Mice ,” Int. Rev. Immunol 13:65-93；和Pollock等(1999) “Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies ,” J. Immunol. Methods 231:147-157)。製備抗體衍生物(例如人源化、單鏈等)的合適方法在本領域是已知的，並且在上面已經進行描述。在另一替選方案中，抗體可通過噬菌體展示技術重組製備(參見，例如美國專利號5,565,332、5,580,717、5,733,743、6,265,150；和Winter, G.等(1994) “Making Antibodies By Phage Display Technology ,” Annu. Rev. Immunol. 12.433-455)。
包含目標多核苷酸(例如，編碼本發明的結合分子的多肽鏈的多核苷酸)的載體可通過許多合適手段中的任何一種引入到宿主細胞中，所述手段包括電穿孔；利用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其它物質的轉染；微粒轟擊；脂質轉染和感染(例如，其中載體是感染劑，諸如牛痘病毒)。引入載體或多核苷酸的選擇將經常取決於宿主細胞的特徵。
能夠過表達異源DNA的任何宿主細胞可用於表達目標多肽或蛋白的目的。合適的哺乳動物宿主細胞的非限制性實施例包括但不限於COS、HeLa和CHO細胞。
本發明包括包含本發明的結合分子的氨基酸序列的多肽。本發明的多肽可通過本領域已知的程式製備。多肽可通過抗體的蛋白水解或其它降解、通過如上所述的重組方法(即，單個多肽或融合多肽)或通過化學合成產生。抗體的多肽、尤其高達約50個氨基酸的較短多肽，通過化學合成方便製備。化學合成的方法在本領域是已知的並且是可商購的。
本發明包括所公開的結合分子的變體，其包括不顯著影響這種分子的性能的功能上等同的多肽以及具有增加的或減少的活性的變體。多肽的修飾在本領域是常規實踐並且不需要在本文進行詳細描述。修飾的多肽的實例包括具有氨基酸殘基的保守置換、沒有顯著影響或沒有不利地改變化學類似物的功能活性或用途的氨基酸的一個或多個缺失或添加的多肽。可彼此保守置換的氨基酸殘基包括但不限於：甘氨酸/丙氨酸；絲氨酸/蘇氨酸；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸；天冬醯胺/穀氨醯胺；天冬氨酸/谷氨酸；賴氨酸/精氨酸；和苯丙氨酸/酪氨酸。這些多肽也包括糖基化和非糖基化的多肽，以及具有其它翻譯後修飾(諸如，例如用不同糖糖基化、乙醯化和磷酸化)的多肽。優選地，氨基酸置換將是保守的，即置換的氨基酸將具有與原始氨基酸相似的化學性能。這種保守置換是本領域已知的並且已經在上面提供實例。氨基酸修飾的範圍可從改變或修飾一個或多個氨基酸至區域諸如可變結構域的完全重新設計。可變結構域的變化可改變結合親和性和/或特異性。修飾的其它方法包括利用本領域已知的偶聯技術，其包括但不限於酶促方式、氧化置換和螯合。修飾可用於，例如連接用於免疫測試的標籤，諸如連接用於放射性免疫測試的放射性部分。修飾的多肽利用本領域建立的程式製備並且可利用本領域已知的標準測試篩選。
在一種實施方式中，提供了包含輕鏈、重鏈或者輕鏈和重鏈兩者的融合多肽。在另一實施方式中，融合多肽包含異源免疫球蛋白恆定區。在另一實施方式中，融合多肽包含從表面上沉積的雜種瘤中生產的抗體的VH和VL結構域。為了本發明的目的，抗體融合蛋白包含能使蛋白質免疫特異性地結合CD16和疾病抗原兩者的多肽結構域，並且其包含天然分子中未連接到其上的另一氨基酸序列，例如來自另一區的異源序列或同源序列(例如，去免疫化白蛋白-結合結構域、蛋白A識別序列、肽標籤等)。
本發明特別地涵蓋綴合到診斷或治療部分的這種結合分子(例如，抗體、雙抗體、三價結合分子等)。為了診斷目的，本發明的結合分子可被偶聯到可檢測物質。這種結合分子可用於監測和/或預後疾病的發展或進展作為臨床測試程式的部分，諸如測定特定療法的功效。可檢測物質的實例包括各種酶(例如，辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶等)、輔基(例如，抗生物素蛋白/生物素)、螢光物質(例如，傘形酮、螢光素、或藻紅蛋白)、發光物質(例如，魯米諾)、生物發光物質(例如，螢光素酶或發光蛋白質)、放射性物質(例如，碳14、錳54、鍶85或鋅65)、正電子發光金屬、和非放射性順磁金屬離子。可檢測物質可被利用本領域已知的技術直接地或者通過中間體(例如連接體)間接地偶聯或綴合至結合分子。
為了治療目的，本發明的結合分子可被綴合至治療部分，諸如細胞毒素(例如，細胞靜止劑或殺細胞劑)、治療劑或放射性金屬離子，例如、α-發射劑。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞 有害的任何試劑，諸如，例如假單胞菌外毒素、白喉毒素、肉毒桿菌毒素A至F、篦麻毒素、相思豆毒素、皂草素、和這種試劑的細胞毒素片段。治療劑包括具有治療效果以預防性地或治療性地治療障礙的任何試劑。這種治療劑可以是化學治療劑、蛋白質或多肽治療劑，並且包括具有期望的生物學活性和/或改變給定的生物學應答的治療劑。治療劑的實例包括烷基化劑、血管生成抑制劑、抗有絲分裂劑、激素治療劑和可用於治療細胞增生性障礙的抗體。治療部分可被利用本領域已知的技術直接地或者間接地通過中間體(例如連接體)偶聯或綴合至結合分子。IX. 本發明的結合分子的 用途
如上所討論，能夠結合CD16和疾病抗原的分子能夠介導靶細胞(即，癌細胞或病原體感染細胞)的重定向的細胞殺傷，所述靶細胞(即，癌細胞或病原體感染細胞)在其細胞表面上表達這種疾病抗原。這種分子可用於治療目的，例如在患有癌症或感染的受試者中。因此，本發明的結合分子具有治療在這種靶細胞的表面上與疾病抗原(尤其癌抗原或病原體相關抗原)的表達相關或特徵在於疾病抗原(尤其癌抗原或病原體相關抗原)的表達的任何疾病或病況的能力。因此，沒有限制地，本發明的結合分子可用於治療癌症，尤其特徵在於表達癌抗原的癌症。本發明的結合分子可用於治療感染，尤其特徵在於表達病原體相關抗原的感染。
具體地，本發明涵蓋這樣的方法，其中所述能夠結合CD16的分子包含能夠結合CD16的抗體的表位元-結合結構域並且也包含能夠結合靶細胞表上的疾病抗原(具體地，癌抗原或病原體相關抗原)的表位元-結合結構域以便介導靶細胞的重定向的殺傷(例如，通過介導重定向的細胞殺傷(例如，重定向的T細胞或重定向的NK細胞細胞毒性))。
在具體實施方式中，能夠結合CD16和疾病抗原的分子是雙特異性抗體、或其結合部分、(包括scFv)、BiTe、TandAb和CAR。
在具體實施方式中，能夠結合CD16和疾病抗原的分子是雙特異性雙抗體。
在具體實施方式中，能夠結合CD16和疾病抗原的分子是三價結合分子。
如本文所用，術語“提供治療 (providing a therapy) ”和“治療 (treating) ”是指與任何有利或期望結果的指征相關的組合物的任何施用，所述結果包括但不限於任何臨床結果，諸如減少疾病所引起的症狀；減輕感染的症狀(例如，病毒載量、發燒、疼痛、膿毒症等)；腫瘤(在癌症背景下，例如乳腺癌、胃癌或前列腺癌的腫瘤)尺寸的縮小；癌症細胞生長的減緩；轉移的開始、形成或進展的延遲；疾病所引起的症狀的減少；受體受試者生活品質的增加；提供以治療受試者疾病的其它藥物劑量的減少；另一藥物效果諸如經由靶向和/或內化的增強；疾病進展的延遲；和/或受試者存活的延長。
用於治療的受試者包括動物，最優選地哺乳動物物種，諸如非靈長類(例如，牛、馬、貓、犬、齧齒動物等)或靈長類(例如，猴子，如食蟹猴，人等)。在優選的實施方式中，受試者是人。
可通過本發明的各種實施方式治療的示例性障礙包括但不限於增生性障礙、細胞增殖性障礙、和癌症(尤其是表達由能夠介導重定向細胞殺傷的分子所結合的癌抗原的癌症)、病原體相關的疾病(尤其是與由能夠介導重定向細胞殺傷的分子所結合的病原體相關抗原的表達相關的慢性病毒感染)。在各種實施方式中，本發明涵蓋用於治療、預防或管理受試者中的疾病或障礙的方法或組合物，其包括向受試者施用治療有效量的本發明的結合分子。這種分子尤其可用於預防、抑制、減少原發腫瘤的生長或進展和腫瘤的轉移，以及用於減少病原體載量或消除病原體感染細胞。儘管不意欲受特定作用機理的束縛，但是這種分子可介導針對靶細胞的效應子功能、促進免疫系統對靶細胞的啟動、使細胞表面抗原和/或受體交聯在靶細胞上和增強細胞凋亡或負增長調節信號、或其組合，導致靶細胞的清除和/或數量減少。
可以由本發明的分子和由本發明的方法治療的癌症包括但不限於：腎上腺癌 ，包括但不限於：嗜鉻細胞瘤或腎上腺皮質癌；愛滋病相關癌症；腺泡狀軟組織肉瘤；星形細胞瘤；基底癌；膀胱癌 ，包括但不限於，移行細胞癌、鱗狀細胞癌、腺癌或癌肉瘤；骨和結締組織肉瘤 ，例如但不限於，骨瘤(bone sarcoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)、軟骨肉瘤、尤因氏肉瘤、惡性巨細胞瘤、骨的纖維肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、軟組織肉瘤、血管肉瘤(angiosarcoma)(血管內皮瘤(hemangiosarcoma))、纖維肉瘤、卡波濟氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神經鞘瘤、橫紋肌肉瘤、或滑膜肉瘤；腦癌， 包括但不限於，神經膠質瘤、星形細胞瘤、腦幹膠質瘤、室管膜瘤、少突神經膠質瘤、非膠質瘤(nonglial tumor)、聽神經鞘瘤、顱咽管瘤、髓母細胞瘤、腦膜瘤、松果體瘤、成松果體細胞瘤、或原發性腦淋巴瘤；腦和脊髓癌；乳腺癌 ，包括但不限於，腺癌、小葉(小細胞)癌、導管內癌、髓樣乳腺癌、黏液乳腺癌、管狀乳腺癌、乳頭狀乳腺癌、佩吉特氏病、或炎性乳腺癌；頸動脈體瘤；宮頸癌 ，包括但不限於，鱗狀細胞癌或腺癌；膽管癌，包括但不限於，乳頭狀、結節性、或彌漫性膽管癌；軟骨肉瘤；脊索瘤；嫌色性腎細胞癌；透明細胞癌；結腸癌；結直腸癌；皮膚良性纖維組織細胞瘤；促結締組織增生性小圓細胞腫瘤；室管膜瘤；眼癌 ，包括但不限於，眼黑色素瘤諸如虹膜黑色素瘤、脈絡膜黑色素瘤、和睫狀體黑色素瘤和視網膜母細胞瘤；食道癌 ，包括但不限於，鱗狀癌、腺癌、腺樣囊性癌、黏液表皮樣癌、腺鱗癌、肉瘤、黑素瘤、漿細胞瘤、疣狀癌和燕麥細胞(小細胞)癌；尤文氏瘤 ；骨外黏液樣軟骨肉瘤；骨纖維生成不良；骨纖維異常增殖症；膽囊癌或膽管癌 ，包括但不限於，腺癌；胃癌；妊娠滋養細胞疾病；生殖細胞瘤；頭頸癌 ；肝細胞癌 ；重鏈疾病；胰島細胞瘤；卡波西肉瘤 (Kaposi’s sarcoma) ；白血病 ，包括但不限於急性白血病；急性淋巴細胞性白血病；急性髓細胞樣白血病，諸如，但不限於成髓細胞白血病、早幼粒細胞白血病、髓單核細胞白血病、單核細胞白血病、紅白血病白血病或骨髓增生異常綜合征；慢性白血病 ，例如但不限於，慢性髓細胞(粒細胞)樣白血病、慢性淋巴細胞性白血病、毛細胞白血病；脂肪瘤/良性脂肪瘤；脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤；肝癌 ，包括但不限於，肝細胞癌或肝母細胞癌；淋巴瘤 ，例如但不限於，霍奇金病(Hodgkin’s disease)；非霍奇金病；肺癌 ，包括但不限於，非小細胞肺癌、鱗狀細胞癌(表皮樣癌)、腺癌、大細胞癌或小細胞肺癌；髓母細胞瘤；黑素瘤；腦膜瘤；良性單克隆丙種球蛋白病；一種意義不明的單克隆丙種球蛋白病；多發性內分泌腺瘤；多發性骨髓瘤 、例如但不限於，鬱積型多發性骨髓瘤、非分泌型骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、漿細胞白血病、孤立性漿細胞瘤和髓外漿細胞瘤；骨髓增生異常綜合征；神經母細胞瘤；神經內分泌腫瘤；口腔癌 ，包括但不限於鱗狀細胞癌；卵巢癌， 包括但不限於，卵巢上皮癌、交界性腫瘤、生殖細胞腫瘤、和間質瘤；胰腺癌， 包括但不限於，胰島瘤、促胃液素瘤、高血糖素瘤、血管活性腸肽瘤、生長激素抑制素-分泌瘤、或良性腫瘤或胰島細胞瘤；甲狀旁腺腫瘤；兒科癌症；陰莖癌 (penal cancer) ；外周神經鞘腫瘤；嗜鉻細胞瘤；咽癌 ，包括但不限於鱗狀細胞癌、或疣狀癌；垂體腺癌 ，包括但不限於，庫欣病(Cushing’s disease)、催乳激素-分泌腫瘤；肢端肥大症、或尿崩症腫瘤 (diabetes insipius tumor) ；前列腺癌 ，包括但不限於，腺癌、平滑肌肉瘤、或橫紋肌肉瘤；真性紅細胞增多症；後葡萄膜黑色素瘤 (posterious uveal melanoma)；罕見血液病；腎癌 ，包括但不限於，腺癌、腎上腺樣瘤、纖維肉瘤、腎轉移性癌、或移行細胞癌(腎盂和/或子宮)；橫紋肌樣瘤；橫紋肌肉瘤；唾腺癌 ，包括但不限於，腺癌、黏液表皮樣癌、或腺樣囊性癌；肉瘤；皮膚癌 ，包括但不限於，基底細胞癌、鱗狀細胞癌和黑色素瘤、淺表擴散性黑色素瘤、結節性黑色素瘤、小痣惡性黑色素瘤或肢端黑色素瘤(acral lentiginous melanoma)；軟組織肉瘤 ；鱗狀細胞癌；胃癌 ，包括但不限於，腺癌，真菌樣(息肉型)、潰瘍型、淺表擴散性、彌漫擴散性、或惡性淋巴瘤，脂肪肉瘤，纖維肉瘤，和癌肉瘤；滑膜肉瘤；睾丸癌 ，包括但不限於，胚組織瘤，精原細胞瘤，退行發育性、經典的(典型的)、精母細胞性、非精原細胞瘤，胚胎性癌，畸胎癌，或絨毛膜癌(卵黃囊瘤)；胸腺癌；胸腺瘤；甲狀腺癌 ，諸如但不限於，乳頭狀或濾泡性甲狀腺癌、轉移性甲狀腺癌、甲狀腺髓樣癌或未分化甲狀腺癌；子宮癌 ，包括但不限於，子宮內膜癌或子宮肉瘤；陰道癌 ，包括但不限於，鱗狀細胞癌、腺癌或黑色素瘤；外陰癌，包括但不限於， 鱗狀細胞癌、黑色素瘤、腺癌、基底細胞癌、肉瘤、或佩吉特病；瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症 (Waldenström’s macroglobulinemia) ；或維爾姆斯瘤 (Wilms’ tumor) 。此外，癌症包括黏液肉瘤、骨原性肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、間皮瘤、滑膜瘤、成血管細胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支氣管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌和乳頭狀腺癌(對於這些疾病的綜述，參見Fishman等, 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia和Murphy等 ., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc.)。
具體地，本發明的結合分子可用於治療腎上腺癌、膀胱癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、成膠質細胞瘤、腎癌、非小細胞肺癌、急性淋巴細胞性白血病、急性髓細胞樣白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓細胞樣白血病、毛細胞白血病、伯基特淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、小淋巴細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮膚癌、腎細胞癌、睾丸癌和子宮癌。
可通過本發明的CD16結合分子治療的病原體-相關疾病包括慢性的病毒性、細菌性、真菌性和寄生蟲性的感染。可通過本發明的CD16結合分子治療的慢性感染包括愛潑斯坦-巴爾病毒、甲型肝炎病毒(HAV)；乙型肝炎病毒(HBV)；丙型肝炎病毒(HCV)；皰疹病毒(例如，HSV-1、HSV-2、HHV-6、CMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、水泡性口炎病毒(VSV)、桿菌(Bacilli) 、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter) 、霍亂(Cholera )、白喉(Diphtheria )、腸桿菌屬(Enterobacter )、淋球菌(Gonococci )、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori )、克雷伯氏菌屬(Klebsiella )、軍團菌屬(Legionella )、腦膜炎球菌(Meningococci )、分枝桿菌(mycobacteria)、假單胞菌屬(Pseudomonas )、肺炎球菌屬(Pneumonococci )、立克次氏體細菌(rickettsiabacteria)、沙門氏菌屬(Salmonella )、沙雷氏菌屬(Serratia )、葡萄球菌屬(Staphylococci )、鏈球菌屬(Streptococci )、破傷風(Tetanus )、麯黴屬(Aspergillus )(煙麯黴、黑麯黴等)、皮膚芽孢桿菌(Blastomyces dermatitidis )、念珠菌屬(Candida )(白色念珠菌(albicans)、克柔念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、熱帶念珠菌等(tropicalis)等)、新生隱球菌(Cryptococcus neoformans )、毛黴菌屬(GenusMucorales )(毛黴菌(mucor)、犁頭黴(absidia)、根黴菌(rhizopus))、申克氏胞絲菌(Sporothrix schenkii )、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis )、粗球孢子菌(Coccidioides immitis )、莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum )、鉤端螺旋體病(Leptospirosis )、伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi )、寄生蠕蟲病(helminth parasite) (鉤蟲、絛蟲、吸蟲、扁蟲(例如血吸蟲(Schistosomia ))、賈第蟲(Giardia lambia )、旋毛蟲(trichinella )、脆雙核阿米巴(Dientamoeba Fragilis )、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei )、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi )和杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani ))。X. 藥物組合物
本發明涵蓋包括能夠結合CD16並且也能夠結合至疾病抗原的分子的組合物。本發明的組合物包括可用於製備藥物組合物的原料藥組合物(例如，不純或非滅菌的組合物)和可以以單位劑型的製劑使用的藥物組合物(即，適合於施用至受試者或患者的組合物)。這種組合物包括預防或治療有效量的能夠結合CD16並且也能夠結合至疾病抗原以便能夠介導靶細胞(例如，癌症細胞、病原體感染細胞等)的重定向的殺傷的分子，或者這種試劑和藥學上可接受的載體的組合。優選地，本發明的組合物包括預防或治療有效量的本發明的結合分子和藥學上可接受的載體。在優選的方面，這種組合物是基本上純化的(即，基本上不含限制其效果或產生不期望的副作用的物質)。
這種組合物的各種製劑可用於施用。除了藥理活性劑之外，本發明的組合物可包含合適的藥學上可接受的載體(包括賦形劑和輔料)，其是本領域熟知的並且其是有助於藥學有效物質的施用或者有助於將活性化合物加工成可藥學上用於遞送至作用位點的製劑的相對惰性物質。例如，賦形劑可給予形狀或稠度、或者充當稀釋劑。合適的賦形劑包括但不限於穩定劑、潤濕和乳化劑、用於改變滲透壓的鹽、膠囊化劑、緩衝劑、和皮膚滲透增強劑。
在具體實施方式中，術語“藥學上可接受的” 指獲得聯邦政府或州政府管理機構的許可或列於美國藥典或其他通常獲得認可的藥典中，用於動物，特別是用於人類。術語“載體 ”指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全)、賦形劑或媒介。通常，本發明組合物的成分被單獨提供或以單位劑型的形式混合在一起，例如作為標明活性劑量的氣封容器(如安瓿或袋(sachette))中的凍乾粉或無水濃縮物。當通過輸注施用組合物時，其可以用含有無菌的藥物級水或生理鹽水(saline)的輸注瓶分配。當通過注射施用所述組合物時，則可以提供注射用無菌水或生理鹽水的安瓿，以便可以在施用前混合所述成分。
本發明也提供了藥物包(pack)或試劑盒，其包括一個或多個容器，所述容器填充有單獨的本發明的結合分子或填充有本發明的結合分子與這種藥學上可接受的載體。另外，用於治療疾病的一種或多種其他預防或治療的試劑也可包括在藥物包或試劑盒中。本發明也提供了這樣的藥物包或試劑盒，其包括一個或多個容器，所述容器填充有本發明藥物組合物中的一種或多種成分。任選地與這類容器關聯的可以是以由管理藥物或生物製品的製造、使用或銷售的政府機構規定的形式的告示(notice)，所述告示反映了管理機構許可製造、使用或銷售，供人類施用。
本發明提供可用於上述方法的試劑盒。試劑盒可包括本發明的結合分子中的任一種。試劑盒還可在一個或多個容器中包括用於治療癌症的一種或多種其他預防和/或治療的試劑。XI. 施用方法
本發明的組合物可提供為通過向受試者施用有效量的本發明的CD16 x DA 藥物組合物，用於治療、預防和改善與疾病、障礙或感染相關的一種或多種症狀。在優選的方面中，這類組合物是基本上純的(即基本上不含限制其效果或產生不期望的副作用的物質)。在具體實施方式中，受試者是動物，優選哺乳動物，如非靈長類(例如牛科動物、馬、貓科動物、犬科動物、齧齒動物等)或靈長類(例如，猴子， 如食蟹猴、人等)。在優選的實施方式中，受試者是人。
施用本發明的CD16 x DA 結合分子或藥物組合物的方法包括但不限於，腸胃外施用(例如皮內、肌內、腹膜內、靜脈內和皮下)、硬膜外和黏膜(例如鼻內和口服路徑)。在具體實施方式中，肌內、靜脈內或皮下施用本發明的結合分子。可通過任何方便的路徑，例如通過輸注或彈丸注射、通過經上皮或黏膜皮膚保護層(例如，口腔黏膜、直腸和腸道黏膜等)吸收，施用所述組合物，並且所述組合物可與其他生物活性試劑一起施用。施用可以是全身的或局部的。
本發明也提供了本發明的結合分子的製劑被包裝在指示分子的數量的氣密密封容器，如安瓿或袋中。在一個實施方式中，這種分子作為乾燥滅菌的凍幹粉末或無水濃縮物提供在氣密密封容器中並且可以例如用水或生理鹽水重構至適當的濃度，以施用至受試者。優選地，本發明的結合分子作為乾燥無菌的凍幹粉末提供在氣密密封容器中。
本發明的結合分子的凍幹製劑應在它們的初始容器中儲存在2℃和8℃之間並且該分子應在重構之後的12小時內、優選地6小時內、5小時內、3小時內、或1小時內施用。在可替選的實施方式中，這種分子以液體形式提供在指示分子、融合蛋白或綴合分子的數量和濃度的氣密密封容器中。優選地，液體形式提供的這種結合分子提供在氣密密封的容器中。
可通過標準臨床技術確定本發明的這種製劑有效治療、預防或改善與障礙相關的一種或多種症狀的量。製劑中採用的精確劑量也取決於施用的路徑和病症的嚴重性，並且應根據醫師的判斷和每個患者的情況決定。有效的劑量可從源自體外或動物模型測試系統的劑量回應曲線外推。
如本文使用的，藥物組合物的“有效量 ”是足夠實現有益的或期望的結果的量，所述結果包括但不限於臨床結果，如減輕疾病引起的症狀、緩解感染的症狀(例如，病毒載量、發燒、疼痛、敗血症等)或癌症的症狀(例如癌症細胞的增殖、腫瘤存在、腫瘤轉移等)，從而提高患有該疾病的那些人的生活品質、減少治療該疾病需要的其它藥物的劑量、增強另一藥物治療的效果(諸如經靶向和/或內化)、延遲疾病的進展、和/或延長個體的存活。當應用於單個活性成分、單獨施用時，該術語是指單獨這個成分。當應用於組合時，該術語是指無論組合地、連續地或者同時地施用，導致治療效果的活性成分的組合量。
有效量可在一次或多次施用中施用。為了本發明的目的，藥物、化合物或藥物組合物的有效量是這樣的量：其足以直接地或間接地殺死癌症細胞和/或減少癌症細胞的增殖，和/或消除、減少和/或延遲從癌症原發部位轉移的發展；或降低傳染性病原體的增殖(或效果)和降低和/或延遲病原體介導的疾病的發展。在一些實施方式中，藥物、化合物或藥物組合物的有效量可以結合或不結合另一藥物、化合物或藥物組合物而實現。因此，“有效量”可在施用一種或多種化療劑的背景下考慮，並且如果結合一種或多種其他試劑，期望的結果可以實現或被實現，則可以考慮以有效量給予單一試劑。儘管個體需求不同，但是確定每個組分的有效量的最佳範圍在本領域技術人員的技能範圍內。
對於本發明涵蓋的結合分子，優選基於接收受試者的體重(kg)確定施用至患者的劑量。對於本發明涵蓋的結合分子，施用至患者的劑量通常是約0.01 μg/kg受試者的體重至約30 mg/kg受試者的體重、或更高。
可通過修飾、比如例如脂質化增強所述分子的吸收和組織滲透而降低或改變施用本發明的結合分子的劑量和頻率。
可計算用作單一試劑療法的施用至患者的本發明的結合分子的劑量。可替選地，所述分子可以結合其它治療性組合物使用，並且施用至患者的劑量小於當所述分子用作單一試劑療法時使用的劑量。
本發明的藥物組合物可局部施用至需要治療的區域；這可通過例如且無限制性地局部輸注、通過注射或者通過移植物實現，所述移植物是多孔的、無孔的或膠狀的材料，其包括膜，諸如SIALASTIC®膜，或纖維。優選地，當施用本發明的分子時，必須注意使用所述分子不吸附至其上的材料。
本發明的組合物可以在囊泡、尤其脂質體中遞送(參見Langer (1990)“New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533)；Treat等, in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989)；Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327)。
利用治療或預防有效量的本發明的結合分子治療受試者可包括單次治療，或優選地可包括一系列治療。在優選的實例中，用本發明的藥物組合物治療受試者約1至10周之間，優選地2至8周之間，更優選地約3至7周之間，甚至更優選地約4周、5周或6周。本發明的藥物組合物可以施用每天一次，其中這種施用一周發生一次、一周發生兩次、每兩周發生一次、一月發生一次、每六周發生一次、每兩月發生一次、一年發生兩次或一年發生一次等。可替選地，本發明的藥物組合物可以施用一天兩次，其中這種施用一周發生一次、一周發生兩次、每兩周發生一次、一月發生一次、每六周發生一次、每兩月發生一次、一年發生兩次或一年發生一次等。可替選地，本發明的藥物組合物可以施用一天三次，其中這種施用一周發生一次、一周發生兩次、每兩周發生一次、一月發生一次、每六周發生一次、每兩月發生一次、一年發生兩次或一年發生一次等。也將認識到用於治療的分子的有效劑量可隨著特定治療過程的推移而增加或減少。 實施例
已經總體上描述了本發明之後，通過參考下列實施例將更容易理解本發明，下列實施例通過例證的方式提供並且不意欲限制本發明，除非指明。實施例 1 CD16 結合分子的表徵
如上所討論，產生了一系列DART®雙抗體CD16 x DA 結合分子 ，其併入了不同的鼠、人源化或優化抗CD16結合結構域並且具有對下列任一種免疫特異性的結合結構域：(1)HER2/neu腫瘤抗原(來自曲妥珠單抗 的結合結構域)、(2)對HIV抗原免疫特異性的結合結構域(來自A32 或 7B2 的結合結構域)、(3)CD19 B-細胞抗原(來自CD19 mAb 1的結合結構域)或(4)對RSV抗原免疫特異性的結合結構域(來自帕利珠單抗 的結合結構域)(表 14 )。
用兩鏈雙抗體(DART-X 、 DART-Y 和 DART-0 )(包括鼠抗體CD16-M1 、鼠 抗體CD16-M2 、 人源化抗體3G8 和兩種普遍可商購的抗體：LNK16 和 DJ130c (Abcam等))進行競爭研究。進行ProteOn分析以評定測試製品與已經固定在晶片上的CD16分子的結合。CD16分子首先用捕獲的5 nM CD16-Fc(人IgG2)融合蛋白孵育，接著用10 nM第一測試製品(測試製品1)孵育，接著用10 nM第二測試製品(測試製品2)孵育。利用抗人Fc F(ab’)2 片段檢測結合。
該研究揭示CD16-M1 、 CD16-M2 、 LNK16 和3G8 結合結構域各自結合CD16的不同表位。CD16-M2 被發現與用於結合CD16的抗體DJ130c 競爭；DJ130c 已經被報導在與CD16的Fc結合位點不重疊的位點結合CD16 (Tamm, A.等(1996) “The Binding Epitopes Of Human CD16 (Fc Gamma RIII) Monoclonal Antibodies. Implications For Ligand Binding ,” J. Immunol. 157(4):1576-1581；Tamm, A.等(1996) “The Igg Binding Site Of Human FcgammaRIIIB Receptor Involves CC' And FG Loops Of The Membrane-Proximal Domain ,” J. Biol. Chem. 271(7):3659-3666)。
對CD16-M1 、 DJ130c 和LNK16 在IgG存在下結合CD16A的能力進行評價。發現IgG存在抑制LNK16的結合，但是IgG存在不抑制CD16A和CD16-M1 之間的結合。 3G8 表位元已經被報導與CD16的Fc結合位點重疊(Tamm, A.等(1996) J. Biol. Chem. 271(7):3659-3666)。
增加人IgG (hIgG)的濃度降低抗體LNK16至CD16的結合，因此表明被LNK16 識別的表位與CD16的Fc結合位點重疊；相反，通過DJ130c 或CD16-M1 的CD16結合結構域的結合基本上不受影響，因此表明被這些分子識別的CD16表位不與CD16的Fc結合位點重疊(圖 8 )。
如上所討論，CD16A具有兩種主要的同種異型，反映了158F對158V多態性。如表15 所示，CD16-M1 和CD16-M2 的CD16結合結構域被發現以類似的高親和力結合至兩種CD16同種異型(比h3G8 好大約3-25倍，其相對於CD16 158V同種異型，具有對CD16 158F同種異型10倍低的親和力。h3G8 的結合結構域被發現呈現快的解離率(off-rate)。利用BIACORE®格式進行分析，其中雙抗體分子被捕獲在山羊(Fab’)2 抗人Fc表面上，並且人CD16A V/F分子(用Avitag標記)越過(passed over)捕獲的雙抗體(標準化；1:1結合擬合)。
進行ProteOn分析以評估所構建的雙抗體的CD16結合結構域對已經固定在晶片上的CD16-His標記的分子(R&D Systems)的結合。CD16分子經由抗PentaHis抗體固定，然後用雙抗體孵育。CD16結合研究的結果被匯總在表 16 中(DART-Z的CD16結合結構域衍生自scFv 4-LS21，其對CD16A是特異性的)。
結果表明包含CD16-M1 或 CD16-M2 CD16結合結構域的雙抗體對CD16A的兩個等位基因都呈現較高的親和力並且與比較分子相比呈現較高的親和力。包含hCD16-M2 (VH1) CD16結合結構域的雙抗體相比包含hCD16-M2 (VH2) CD16結合結構域的雙抗體呈現稍微更好的結合(比較DART-D 與DART-E )。實施例 2 DART-F 和DART-G CD16 結合分子對 NK 細胞、嗜中性粒細胞和 T 細胞的結合
為了證明本發明的CD16 x DA 結合分子 結合CD16的能力，供體受試者的全血在CD16結合雙抗體的存在下進行孵育：DART-F 和DART-G 、 HIV x CD3 雙抗體 (作為經由其CD3結合結構域的T細胞結合的陽性對照)、HIV x RSV 雙抗體 (作為對於所有結合的陰性對照)和h3G8 x RSV 雙抗體比較分子。孵育後，細胞用下列進行標記：抗CD56-別藻藍蛋白(CD56 APC，NK細胞標記物)、抗CD66b-異硫氰酸螢光素(CD66b FITC，嗜中性粒細胞標記物)和抗CD3-多甲藻葉綠素蛋白-Cy5.5(CD3 PerCP Cy5.5，T細胞標記物)和抗人Fc-藻紅蛋白(αhFc PE)，以檢測雙抗體結合和細胞表面。標記的細胞通過對NK細胞設門的流式細胞儀進行分析。對第一受試者研究的共染色結果顯示在圖 9A-9C 中，並且表明DART-F (hCD16-M1)相對於DART-G (hCD16-M2)在NK細胞表面上對CD16A具有更高的親和力，這兩者相比h3G8 x RSV 雙抗體比較分子均具有較高的親和力(圖 9A )。相反，儘管h3G8 x RSV 雙抗體比較分子能夠結合嗜中性粒細胞的CD16B，但DART-G 具有較低的結合能力並且DART-F 基本上沒有結合能力(圖 9B )。如圖 9C 所示，CD16結合分子不能夠結合至T細胞。
利用第二供體受試者的全血觀察到類似的結合。淋巴細胞結合(CD16A F/V)和嗜中性粒細胞結合(CD16B，未確定的同種異型)基本上如所描述的利用DART-F (hCD16-M1)、DART-G (hCD16-M1)和h3G8 x RSV 雙抗體比較物進行評價。研究結果顯示在圖 10A-10B 中。如圖 10A 所示，DART-F (hCD16-M1)和DART-G (hCD16-M1)兩者呈現對設門的淋巴細胞群的CD16A表達細胞的結合，其中DART-F 呈現較大的結合；h3G8 x RSV 雙抗體比較分子呈現較弱的結合。如圖 10B 所示，與均呈現結合的DART-G 和 h3G8 x RSV 雙抗體比較分子相反，DART-F 不能夠結合設門的淋巴細胞系的CD16B表達細胞。實施例 3 抗 CD16 結合分子 CD16-M1 和 CD16-M2 的 CD16B 同種異型特異性
為了證明本發明的CD16 x DA 結合分子 區分CD16B的糖基化同種異型NA1和NA2的能力，DART-F (hCD16-M1)和h3G8 x RSV 雙抗體比較物在全血存在下進行孵育並且基本上如上所述進行分析。結果示出已經對CD66b+細胞(即嗜中性粒細胞和嗜酸粒細胞)設門的全血的雙抗體染色。圖 11A-11B 顯示這種分析的結果，並且表明h3G8 x RSV 雙抗體比較物呈現對NA1的強結合和對NA2的中等結合。相反，DART-F 呈現對NA2的強結合和對NA1的弱結合。實施例 4 CD16 結合分子 CD16-M1 和 CD16-M2 的 CD16B 同種異型特異性
為了進一步評估本發明的CD16 x DA 結合分子 結合白細胞的能力，對CD16-M1 的 CD16結合結構域結合來自全血的NK細胞和粒細胞的能力進行評價。DART-C 在全血白細胞的存在下進行孵育並且基本上如上所述進行分析。結果示出已經對NK細胞(0.6%的白細胞)或粒細胞(49%的白細胞)設門的全血的雙抗體染色。圖 12 顯示這種分析的結果，並且表明CD16-M1 優先結合至NK細胞。實施例 5 CD16 結合分子對人 CD16 、食蟹猴 CD16 和鼠 CD16 的結合
因為人CD16、食蟹猴CD16和鼠CD16的氨基酸序列享有不同程度的同源性(圖 13 ；分別地 SEQ ID NOs:183 、 184 和 185 )，所以研究了具有抗體CD16-M1 、 CD16-M2 和3G8 的CD16結合結構域的CD16 x DA 結合分子 結合至人CD16、食蟹猴CD16和鼠CD16的能力。利用BIACORE®格式進行分析，其中雙抗體分子被捕獲在Her2-His-標籤表面上並且CD16分子(IgG2-Fc融合蛋白，25 nM和100 nM)越過捕獲的雙抗體(標準化；二價結合擬合估計)。研究的結果匯總在表 17 中。
h3G8 的CD16結合結構域被發現能夠結合食蟹猴的CD16a，其中相對於其與人CD16a的結合親和力略微下降。DART-C (hCD16-M1)和DART-D (hCD16-M2)的CD16結合結構域被發現對食蟹猴CD16具有低的親和力。所測試的CD16結合分子中沒有一個被發現能夠結合至鼠CD16，與其對人CD16的較低同源性相應。實施例 6 CD16 結合分子介導的 HER2/Neu 陽性細胞的細胞毒性的評價
為了證明本發明的CD16 x DA 結合分子 介導細胞殺傷的能力，CD16 x HER2/neu 結合分子： DART-C (具有hCD16-M1 CD16結合結構域)；DART-D (具有hCD16-M2 CD16結合結構域)；DART-1( 具有h3G8 CD16結合結構域)； 或HER2/Neux RSV 雙抗體(陰性對照)在效應細胞(人PBMC(E:T = 30:1)或純化的人NK細胞(E:T = 2:1))的存在下分別以表達不同水準的HER2/neu的靶癌細胞孵育24小時。通過測量損傷細胞引起的乳酸脫氫酶(LDH)到介質中的釋放測定細胞毒性(即，重定向的細胞殺傷)百分比，基本上如下所述。該研究的結果顯示在圖 14A-14E 中。圖 14A 顯示由純化的NK細胞對N87 HER2/neu靶細胞所呈現的細胞毒性((HER2/neu表達：+++)；這種NK細胞的CD16A同種異型是158F/158F。圖 14B 顯示由純化的NK細胞對MCF7 HER2/neu靶細胞所呈現的細胞毒性(HER2/neu表達：+/-)。圖 14C 顯示由PBMCs對MDA-MB-231 HER2/neu靶細胞所呈現的細胞毒性(HER2/neu表達：+/-)；未評價這種PBMC製劑的NK細胞的CD16A同種異型。圖 14D 顯示由PBMCs對N87 HER2/neu靶細胞所呈現的細胞毒性(HER2/neu表達：+++)；這種PBMC製劑的NK細胞的CD16A同種異型是158F/158V。圖 14E 顯示由PBMCs對Hs700T HER2/neu靶細胞所呈現的細胞毒性(HER2/neu表達：+/-)；這種PBMC製劑的NK細胞的CD16A同種異型是158F/158V。結果表明包含hCD16-M1 CD16結合結構域的CD16 x DA 結合分子 相比包含hCD16-M2 CD16結合結構域的 CD16 x DA 結合分子 對HER2/neu-表達癌症細胞呈現更大的細胞毒性；並且包含這種CD16結合結構域的分子相比包含h3G8 CD16結合結構域的CD16 x DA 結合分子 呈現更大的細胞毒性。實施例 7 CD16 結合分子介導的對 HIV- 感染細胞的細胞毒性的評價
為了進一步證明本發明的CD16 x DA 結合分子 介導細胞殺傷的能力，CD16 x HIV env 結合分子 : DART-F (具有hCD16-M1 CD16結合結構域)；DART-G (具有hCD16-M2 CD16結合結構域)； 或DART-2 (h3G8 x RSV 雙抗體，在這裡被用作陰性對照))在效應細胞(人PBMC(E:T = 30:1)或純化人NK細胞(E:T = 3:1)的存在下分別用表達HIV Env的靶293HEK D371孵育24小時。使用LDH重定向的細胞殺傷試驗，通過測量損傷細胞引起的乳酸脫氫酶(LDH)到介質中的釋放測定細胞毒性(即，重定向的細胞殺傷)百分比，基本上如下所述。該研究的結果顯示在圖 15A-15C 中。圖 15A 顯示由第一供體的PBMC對293HEK D371靶細胞所呈現的細胞毒性；這種PBMC製劑的NK細胞的CD16A同種異型是158F/158V。圖 15B 顯示由第二供體的PBMC對293HEK D371靶細胞所呈現的細胞毒性；這種PBMC製劑的NK細胞的CD16A同種異型是158F/158V。圖 15C 顯示由純化的NK細胞對293HEK D371靶細胞MC所呈現的細胞毒性；NK細胞的CD16A同種異型是158F/158V。結果再次表明，包含hCD16-M1 CD16結合結構域的CD16 x DA 結合分子 相比包含hCD16-M2 CD16結合結構域的CD16 x DA 結合分子 對HIV env表達細胞呈現更大的細胞毒性。
如上所示，DART-F 和DART-G 均是由三條多肽鏈構成的含Fc結構域的雙抗體。為了證明本發明的缺少Fc結構域的CD16 x DA 結合分子 介導細胞殺傷的能力，CD16 x HIV env 結合分子： DART-X (具有hCD16-M1 CD16結合結構域)；DART-Y (具有hCD16-M2 CD16結合結構域)；DART-0 (具有h3G8 CD16結合結構域)； 或DART-3 (具有hCD16-M1 CD16結合結構域的CD16 x RSV 雙抗體，在這裡被用作陰性對照)在效應細胞(Jurkat/CD16A 158F(圖 16A )或158V/NFAT-Luc細胞(圖 16B ))的存在下分別用表達HIV env蛋白的靶HEK/D371細胞孵育。利用LDH重定向的細胞殺傷試驗通過測量損傷細胞引起的乳酸脫氫酶(LDH)到介質中的釋放測定細胞毒性(即，細胞殺傷)百分比，基本上如下所述。該研究的結果顯示在圖 16A-16B 中。
圖 16A-16B 顯示DART-X (具有hCD16-M1 CD16結合結構域)呈現比DART-Y (具有hCD16-M2 CD16結合結構域)更大的細胞毒性百分比。DART-0 (具有h3G8 CD16結合結構域)發現比DART-Y 介導更高水準的細胞毒性，但是該效果取決於具有158V同種異型的效應細胞(圖 16A 與圖 16B )。相反，DART-X 或DART-Y 所介導的細胞毒性不依賴於CD16A同種異型(圖 16A 與圖 16B )。實施例 8 與非人靈長類 CD16 結合的優化
如上所示，hCD16-M1被發現對食蟹猴CD16(cynoCD16)具有低的親和力。隨機誘變被用於在hCD16-M1的CDRL 3(Kabat位置90-95)和CDRH 3(Kabat位置96-100)結構域內引入置換。對突變體進行篩選以鑒定對非人靈長類CD16(例如，cynoCD16)具有增強的結合並且對人CD16的兩個等位基因保持結合親和力的克隆。選擇被命名為“hCD16-M1A ”的具有突變的CDRH 3的變體和被命名為“hCD16-M1B ”的具有突變的CDRL 3的變體用於進一步分析。此外，生成組合CDRH 3和CDRL 3突變的第三變體並且將其命名為“hCD16-M1AB ”。CDR以及VH和VL結構域的氨基酸序列已經提供在上面(參見，例如表 8 )。生成示例性的CD16 x DA 結合分子 ，其併入了優化的抗CD16結合結構域：hCD16-M1A 、hCD16-M1B 或hCD16-M1AB ，並具有抗HER2/neu結合結構域；並且將其分別命名為DART-I 、DART-J 和DART-K (對於總結參見表 12 並且對於詳細描述和完整的氨基酸序列參見上面)。
包含優化的hCD16-M1A 、hCD16-M1B 和 CD16-M1AB 的示例性CD16 x HER2/neu 結合分子 用於結合在人(圖 17A )、食蟹猴(圖 17B )和獼猴(rhesus monkey)(圖 17C )的NK細胞的表面上表達的CD16的能力通過流式細胞儀進行檢查。簡言之，將PBMC分離並且在CD16-結合雙抗體：DART-C (具有親本hCD16-M1 VH和VL結構域)、DART-I 、DART-J 、DART-K (分別具有優化的hCD16-M1A 、hCD16-M1B 和hCD16-M1AB VH/VL結構域)、HER2/neu x RSV 雙抗體(作為用於CD16結合的陰性對照)、DART-3 (具有親本hCD16-M1 VH和VL結構域的CD16 x RSV 雙抗體對照)或DART-1( h3G8 x HER2/neu雙抗體)比較分子的存在下孵育。孵育後，細胞用下列進行標記：抗CD56-別藻藍蛋白(CD56 APC，NK細胞標記物)和抗CD3-多甲藻葉綠素蛋白-Cy5.5(CD3 PerCP Cy5.5，T-細胞標記物)和抗人Fc-藻紅蛋白(αhFc PE)，以檢測雙抗體結合和細胞表面。標記的細胞通過對NK細胞設門的流式細胞儀進行分析。
該研究的共染色結果顯示在圖 17A-17C 中並且顯示包含優化變體尤其是hCD16-M1AB (DART-K )的CD16 x DA 結合分子 對非人靈長類CD16呈現提高的親和力(圖 17B-17C )，儘管包含hCD16-M1B (DART-J )和hCD16-M1AB (DART-K )的分子在該試驗中在與人CD16的結合方面呈現一些下降(圖 17A )。觀察到陰性對照沒有結合。
利用兩種不同的重定向的細胞殺傷試驗，評估具有優化的hCD16-M1A 、hCD16-M1B 、和hCD16-M1AB 結合結構域的CD16 x DA 結合分子 與來自幾個供體的人PBMCs(huPBMCs)或食蟹猴PBMC(cynoPBMCs)效應細胞一起介導JIMT-1-Luc靶細胞的重定向的細胞殺傷的能力。來自這些研究的代表性資料呈現在圖 18A-18D 中，並且匯總在表 18 中。在兩種試驗中，DART-C (具有親本hCD16-M1的VH和VL結構域)、DART-I 、DART-J 或DART-K (分別具有優化的hCD16-M1A 、hCD16-M1B 和hCD16-M1AB 的VH/VL結構域)；陰性對照(HER2/neu x RSV 雙抗體 或CD16 x RSV 雙抗體，DART-3 )；或DART-1( h3G8 x HER2/neu雙抗體)比較分子與以30:1的E:T比例的huPMBCs(圖 18A-18B )或cynoPBMCs(圖 18C-18D )和JIMT-1-Luc靶腫瘤細胞一起孵育並且測定細胞毒性(即，細胞殺傷)百分比。在一個試驗中，利用LDH重定向的細胞殺傷試驗通過測量損傷細胞引起的乳酸脫氫酶(LDH)到介質的釋放測定細胞殺傷，基本上如上所述(圖 18A 和18C) 。在另一試驗中，利用LUM重定向的細胞殺傷試驗通過螢光(LUM)試驗測量靶細胞的細胞螢光素酶活性測定細胞毒性，基本上如下所述(圖 18B 和18D )。24小時和48小時孵育後LDH試驗的EC50值(ng/mL)呈現在表 18 中。
這些資料表明，儘管包含hCD16-M1(DART-C )的CD16結合結構域的CD16 x DA 結合分子 以明顯 低的親和力結合cynoCD16，但是它能夠介導重定向的細胞殺傷。此外，與包含hCD16-M1 的相同分子(DART-C )相比，包含優化的CD16結合結構域hCD16-M1A (DART-I )、hCD16-M1B (DART-J )或hCD16-M1AB (DART-K )的CD16 x DA 結合分子 與CynoPBMCs一起呈現提高的細胞毒性，而與huPBMCs一起呈現僅僅輕微的下降。實施例 9 CD16 x CD19 結合分子
在進一步的研究中，生成了具有抗CD19結合結構域並且併入hCD16-M1 的抗CD16結合結構域或者hCD16-M1B 或hCD16-M1AB 的優化的抗CD16結合結構域的示例性CD16 x DA 結合分子 ，並且分別將其命名為DART-L 、DART-M 和DART-N (對於匯總參見表 12 並且對於詳細描述和完整的氨基酸序列參見上面)。生成了三種另外的分子並且將其命名為DART-5 (包含hCD16-M1 )、DART-6 (包含hCD16-M1A )和DART-7 (包含hCD16-M1AB )，其中CD19結合結構域用抗RSV結合結構域替換(對於匯總參見表12並且對於詳細描述參見上面)，這種示例性CD16 x RSV 結合分子 在下面被用作用於CD19結合的陰性對照。
DART-L 、DART-M 和DART-N ；對照分子：DART-5 、DART-6 和DART-7 ；或CD3 x CD19 DART®雙抗體duvortuxizumab(也被稱為MGD011；在WHO Drug Information, 2016, 推薦的INN: 列表116, 30(4):627-629中發現的氨基酸序列)與人PBMCs(huPBMCs)效應細胞(E:T = 30:1)一起用於介導Raji-Luc靶細胞的重定向的細胞殺傷的能力在LDH和LUM細胞殺傷試驗中進行評價，基本上如下所述。來自這些研究的代表性資料呈現在圖 19A-19D 中。LDH試驗的結果表明在24小時(圖 19A )和48小時(圖 19B )孵育後，CD16 x DA 結合分子 呈現與MGD011類似的細胞毒性活性，其中包含優化的CD16結合結構域hCD16-M1B (DART-M )或hCD16-M1AB (DART-N )的CD16 x DA 結合分子 相比包含hCD16-M1 的相同分子(DART-L )與huPBMCs一起呈現類似的細胞毒性。在LUM試驗中，24小時(圖 19C )和48小時(圖 19D )之後觀察到類似結果。在這些研究中對於缺少CD19結合結構域的對照分子(DART-5 、DART-6 和DART-7 )觀察到最小的細胞毒性。
對於示例性CD16 x DA 結合分子 DART-L 、DART-M 、DART-N (具有對於B細胞抗原CD19的結合位點)和陰性對照：DART-5 和DART-6 (具有對於CD16的結合位點和對於RSV的結合位點)，評價其在體外介導自體B細胞消耗的能力。簡言之，分離自人或食蟹猴的PMBCs在增加濃度的DART-L 、DART-M 、DART-N 以及缺少CD19結合結構域的對照分子DART-5 和DART-6 的存在下在補充介質中進行孵育。對於huPBMCs來說在孵育後的72小時和96小時(分別地，圖 20A-20B )以及對於cynoPBMCs來說在孵育後的72小時和144小時(分別地，圖 20C-20D )通過流式細胞儀分析B細胞水準(將CD3用於陰性選擇以及CD20用作B細胞標記物；CD3/CD20+ )。這些研究的代表性資料呈現在圖 20A-20D 中，並且表明所有CD16 x DA 結合分子 都能消耗來自huPBMCs(圖 20A-20B )和cynoPBMCs(圖 20C-20D )的自體B細胞。與包含hCD16-M1 的相同分子(DART-L )相比，包含優化的CD16結合結構域hCD16-M1B (DART-M )或hCD16-M1AB (DART-N )的CD16 x DA 結合分子 與huPBMCs和cynoPBMCs兩者一起介導B細胞更大的減少。然而，需要更大的濃度以消耗來自cynoPBMCs的B細胞。對於多個PBMC供體，觀察到這一趨勢。對於缺少CD19結合結構域的對照分子(DART-5 和DART-6 )，觀察到最小的B細胞消耗。實施例 10 示例性重定向的細胞殺傷試驗
LDH 重定向的細胞殺傷試驗 ：這些試驗可以利用CytoTox 96®非放射性細胞毒性試驗試劑盒(Promega)或者定量測量LDH釋放的類似物進行，基本上如下所述。靶細胞(例如，腫瘤靶細胞)以4x105 細胞/mL的密度(或者合適的密度以達到期望的E:T比)再懸浮在試驗介質(例如，沒有酚紅的RPMI 1640，10% FBS，1% pen/strep)中，並且優選地，使用在試驗開始時存活率高於90%並且以合適的密度(例如，4x105 細胞/mL)懸浮在試驗介質中以達到10:1或30:1的效應子對靶(E:T)細胞比例(或其它期望的E:T比)的分離的純化效應細胞(例如，從人或非人靈長類(例如，食蟹猴)供體純化的PBMC或NK細胞)。將靶細胞懸浮液的等分試樣(例如，50 μL，約20,000個細胞)、效應細胞懸浮液的等分試樣(例如，100 μL，對於10:1 E:T比，約20,000個細胞)和連續稀釋的測試製品(例如，5倍或10倍)的等分試樣(例如，50 μL)加入到微量滴定板的複製孔(duplicate wells)中並且孵育(37°C，含有5% CO2 )24-96小時、或者更長時間，如果期望的話。在孵育結束時，將裂解溶液的等分試樣(例如，30 μL)加入並且將板孵育約10分鐘以使靶細胞完全裂解。然後使板離心以將細胞碎片粒化(例如，212 x g，5分鐘)，並且將上清液的等分試樣(例如，40 μL)從試驗板的各孔轉移到平底ELISA板以及將LDH底物溶液的等分試樣(例如，40 μL)加入到各孔中。將板在黑暗中室溫下孵育10-20分鐘並且將終止液(Promega Cat # G183A)的等分試樣(例如，40 μL)加入。在Victor2 Multilabel平板閱讀器(Perkin Elmer # 1420-014)或類似物上在490 nm在1小時內測量光學密度。具體的的細胞裂解利用下式由光學密度(OD)資料進行計算：其中，“AICC ”是抗體非依賴性細胞毒性，“MR ”是最大釋放，並且“SR ”是自發釋放。劑量回應曲線利用GraphPad Prism 6軟體(或類似物)通過將細胞毒性數值曲線擬合成S形劑量響應函數而產生。
發光 (LUM) 重定向的細胞殺傷試驗 ：這些試驗可利用Steady-Glo螢光素酶底物(Promega)或類似底物進行，並且在改造成表達螢光素酶(luc)報告基因的活靶細胞(例如，JIMT-1-Luc，Raji-Luc細胞)中定量測量細胞螢光素酶活性，基本上如下所述。用於這些試驗的製劑和設置基本上與上述LDH試驗相同。孵育後，培養基的等分試樣(例如，100 µL)從各孔去除並且將Steady-Glo螢光素酶底物((Promega)或類似物)的等分試樣(例如，100 µL)隨後加入各孔，接著上下移液幾次以使靶細胞完全裂解。板在黑暗中室溫下孵育10分鐘，然後利用VictorX4 Multilabel平板閱讀器(Perkin Elmer # 1420-014或類似物)測量發光強度，其中發光相對光單位(RLU)作為輸出讀出。RLU指示靶細胞的相對存活率。劑量回應曲線利用GraphPad Prism 6軟體(或類似物)通過將RLU值曲線擬合成S形劑量回應函數而產生。
本說明書中提及的所有出版品和專利以相同的程度通過引用併入本文，如同每個出版品或專利申請被明確且單獨地指出以其全部內容通過引用併入一樣。儘管本發明已經結合其具體實施方式進行了描述，但是應當理解它能進一步改變，並且本申請案意欲涵蓋本發明的任何變化、應用或改編，其總體上遵循本發明的原理並且包括落入本發明所屬領域內的已知或慣常實踐內的並且可適用於前文所提出的實質特徵的這種偏離。
無
圖 1A-1B 提供由兩條多肽鏈構成的具有兩個表位結合位點的代表性共價結合的雙抗體的示意圖，每條多肽鏈具有E-螺旋(E-coil)或K-螺旋(K-coil)異源二聚體-促進結構域(下面提供可替選的異源二聚體-促進結構域)。半胱氨酸殘基可存在於連接體(圖 1A )和/或異源二聚體-促進結構域(圖 1B )。識別相同表位元的VL和VH結構域用相同的陰影或填充圖案顯示。這個圖以及所有提供結合分子結構域的示意圖示的圖中的波浪線(WWW)代表一個或多個任選的異源二聚體-促進結構域，其優選存在。
圖 2 提供由兩條多肽鏈構成的具有兩個表位結合位點的代表性共價結合的雙抗體分子的示意圖，每條多肽鏈具有CH2和CH3結構域，使得相關鏈形成Fc區的全部或部分。識別相同表位元的VL和VH結構域用相同的陰影或填充圖案顯示。
圖3A-3E提供由兩對多肽鏈(即總共四條多肽鏈)構成的具有四個表位結合位點的代表性共價結合的四價雙抗體的示意圖。每一對的一條多肽鏈具有CH2和CH3結構域，使得相關的鏈形成Fc區的全部或部分。識別相同表位元的VL和VH結構域用相同的陰影或填充圖案顯示。兩對多肽鏈可以相同。在其中所述兩對多肽鏈相同並且VL和VH結構域識別不同表位元的這種實施方式中(如圖 3A-3B 所示)，所得分子具有四個表位結合位點並且關於每個結合的表位是雙特異性的和二價的。在其中所述VL和VH結構域識別相同表位元的這種實施方式中(例如，相同VL結構域CDR和相同VH結構域CDR被用於兩條鏈上)，所得分子具有四個表位結合位點並且關於單個表位是單特異性的並且是四價的。可替選地，兩對多肽可能是不同的。在所述兩對多肽鏈不同並且每對多肽的VL和VH結構域識別不同表位元的這種實施方式中(如圖 3C 中的不同陰影和圖案所示)，所得分子具有四個表位結合位點並且關於每個結合的表位是四特異性的並且是單價的。圖 3A 顯示含Fc區的雙抗體，其包含含有半胱氨酸殘基的異源二聚體-促進結構域的肽。圖 3B 顯示含Fc區的雙抗體，其包含含有半胱氨酸殘基和連接體(具有任選的半胱氨酸殘基)的E-螺旋和K-螺旋異源二聚體-促進結構域。圖 3C 顯示含Fc區的雙抗體，其包含抗體CH1和CL結構域。圖 3D-3E 示例圖 3B 中顯示的結合結構域的選擇如何能導致具有對CD16的表位特異性的兩個結合位點和對DA 的表位特異性的兩個結合位點的CD16 x DA 結合分子。圖 3D-3E 示例如何選擇結構域以產生具有不同取向的CD16 x DA 結合分子(即，圖 3D 採用VL CD16結構域作為結合分子的VL1結構域，VH CD16結構域作為結合分子的VH1結構域，VLDA 結構域作為結合分子的VL2結構域，以及VHDA 結構域作為結合分子的VH2結構域。相反，圖 3E 採用VLDA 結構域作為結合分子的VL1結構域，VHDA 結構域作為結合分子的VH1結構域，VL CD16結構域作為結合分子的VL2結構域，以及VH CD16結構域作為結合分子的VH2結構域)。如下面所提供的，由多肽鏈的締合所形成的VL/VH結合位點可以相同或不同以便允許四價結合是單特異性的、雙特異性的、三特異性的或四特異性的。
圖 4A 和 4B 提供由三條多肽鏈構成的具有兩個表位結合位點的代表性共價結合的雙抗體分子的示意圖。多肽鏈中的兩條具有CH2和CH3結構域，使得締合的鏈形成Fc區的全部或部分。包含VL和VH結構域的多肽鏈進一步包含異源二聚體-促進結構域。識別相同表位元的VL和VH結構域用相同的陰影或填充圖案顯示。
圖 5A-5D 提供由五條多肽鏈構成的具有四個表位結合位點的代表性共價結合的雙抗體分子的示意圖。圖 5A 顯示這種CD16 x DA 結合分子的一般結構。多肽鏈中的兩條具有CH2和CH3結構域，使得所締合的鏈形成占Fc區的全部或部分的Fc區。包含連接的VL和VH結構域的多肽鏈進一步包含異源二聚體-促進結構域。識別相同表位元的VL和VH結構域用相同的陰影或填充圖案顯示。圖 5B 顯示可替選CD16 x DA 結合分子的結構，其中圖 5A 中顯示的可變結構域已經被選擇以產生所得的CD16 x DA 結合分子，其具有對示例性的DA 、HER2/neu特異性的兩個非雙抗體型結合結構域，以及對CD16特異性的兩個雙抗體型結合結構域。圖 5C 顯示可替選CD16 x DA 結合分子的結構，其中圖 5A 中顯示的可變結構域已經被選擇以產生所得的CD16 x DA 結合分子，其具有對CD16特異性的兩個非雙抗體型結合結構域以及對HER2/neu特異性的兩個雙抗體型結合結構域。圖 5D 顯示可替選CD16 x DA 結合分子的結構，其中圖 5A 中顯示的可變結構域已經被選擇以產生所得的CD16 x DA 結合分子，其具有對CD16的表位特異性的兩個非雙抗體型結合結構域、對HER2/neu的表位特異性的一個雙抗體型結合結構域以及對CD16的表位特異性的第二雙抗體型結合結構域。這種CD16表位可以相同或不同。如將會理解的，通過適當選擇圖 5A 中顯示的結合結構域，結合結構域中的任意三個可能已經被選擇以結合CD16的表位。同樣，結合結構域中的任意三個可能已經被選擇以結合HER2/neu的表位。如下面所提供的，由多肽鏈的締合所形成的VL/VH結合位點可以相同或不同以便允許四價結合是單特異性的、雙特異性的、三特異性的或四特異性的。
圖 6A-6H 提供代表性的具有三個表位結合位點的含Fc區的三價結合分子的示意圖。圖 6A 示意性地示例包含兩個雙抗體型結合結構域和具有不同結構域取向的Fab型結合結構域的三價結合分子的結構域，其中雙抗體型結合結構域相對於Fc區是N-末端或C-末端的。圖 6B-6C 顯示CD16 x DA 結合分子的示例性非限制性實例的結構，其中圖 6A 中顯示的可變結構域已經被選擇以產生所得的CD16 x DA 結合分子，其具有對CD16特異性的非雙抗體型結合結構域、對示例性DA 、HER2/neu特異性的雙抗體型結合結構域和對CD16特異性的第二雙抗體型結合結構域。圖 6D 示意性地示例包含兩個雙抗體型結合結構域和具有不同結構域取向的Fab型結合結構域的三價結合分子的結構域，其中雙抗體型結合結構域相對於Fc區是N-末端的或C-末端的。圖 6A-6D 中的分子包含四條鏈。圖 6E 和 6F 分別示意性地示例三價結合分子的結構域，其包含相對於Fc區處於N-末端的兩個雙抗體型結合結構域、以及其中輕鏈和重鏈經由多肽間隔子連接的Fab型結合結構域或scFv型結合結構域。圖 6G 和6H 中的三價結合分子分別示意性地示例三價結合分子的結構域，其包含相對於Fc區處於C-末端的兩個雙抗體型結合結構域、以及其中輕鏈和重鏈經由多肽間隔子連接的Fab型結合結構域或scFv型結合結構域。圖 6E -6H 中的三價結合分子包含三條鏈。識別相同表位元的VL和VH結構域用相同的陰影或填充圖案顯示。
圖 7 顯示人CD16A的158F異型(SEQ ID NO:146) 、CD16A的158V異型(SEQ ID NO:147) 、人CD16B的NA1異型(SEQ ID NO:148) 、人CD16B的NA2異型(SEQ ID NO:149) 和食蟹猴的CD16(SEQ ID NO:150 )的胞外結構域(ECD)的比對。相對於人CD16A的158F異型的序列差別以底線黑體顯示。在所示的人CD16A分子的部分中，158F/158V多態性見於位置160。
圖 8 顯示人IgG的濃度增加對LNK16 、DJ130c 和CD16-M1 的CD16結合結構域結合CD16的能力的影響。
圖 9A-9C 顯示與HIV x CD3 雙抗體 (作為經由其CD3結合結構域的T細胞結合的陽性對照)、HIV x RSV 雙抗體 (作為所有結合的陰性對照)和h3G8 x RSV 雙抗體比較分子相比，CD16結合分子：DART-F 和DART-G 結合至供體受試者的全血中的NK細胞(圖 9A ；CD16A: na)、嗜中性粒細胞(圖 9B ；CD16B:na)和T細胞(圖 9C )的能力。
圖 10A-10B 顯示與HIV x RSV 雙抗體 (作為所有結合的陰性對照)和h3G8 x RSV 雙抗體比較分子相比，CD16結合分子：DART-F 和DART-G 結合至設門的(gated)淋巴細胞群(圖 10A )和設門的粒細胞群(圖 10B )的CD16A表達細胞的能力。
圖 11A-11B 顯示CD16-M1 和h3G8 的CD16結合結構域區分糖基化異型NA1(圖 11A) 和NA2(圖 11B )的能力。
圖 12 顯示抗體hCD16-M1 的CD16結合結構域(存在於DART-C)優先結合至全血中的NK細胞的能力。
圖 13 展示人CD16(SEQ ID NO:183 )、食蟹猴CD16 (SEQ ID NO:184 )和鼠CD16 (SEQ ID NO:185 )的氨基酸序列的比對。與人CD16的序列差別以底線黑體顯示。
圖 14A-14E 顯示在下列CD16 x HER2/neu 結合分子：DART-C (具有hCD16-M1 CD16結合結構域)、DART-D (具有hCD16-M2 CD16結合結構域)、DART-1 (具有h3G8 CD16結合結構域)、陰性對照HER2/neu x RSV 雙抗體或陽性h3G8 x RSV 雙抗體的存在下，表達不同水準的HER2/neu和效應細胞(人PBMC(E:T = 30:1)或純化的人NK細胞(E:T = 2:1))的靶癌細胞的24小時孵育所產生的細胞毒性百分比。圖 14A ：N87 HER2/neu靶細胞(HER2/neu表達：+++)/NK細胞；CD16A異型158F/158F；圖 14B ：MCF7 HER2/neu靶細胞(HER2/neu表達：+/-)/NK細胞；CD16A異型158F/158F；圖 14C ：MDA-MB-231 HER2/neu靶細胞(HER2/neu表達：+/-)/PBMCs；CD16A異型，未評估；圖 14D ：N87 HER2/neu靶細胞(HER2/neu表達：+++)/PBMCs；CD16A異型158F/158V；圖 14E ：Hs700T HER2/neu靶細胞(HER2/neu表達：+/-)/PBMCs；CD16A異型158F/158V。
圖 15A-15C 顯示 在下列CD16 x HIV env CD16結合分子：DART-F (具有hCD16-M1 CD16結合結構域)、DART-G (具有hCD16-M2 CD16結合結構域)或DART-2 (具有h3G8 CD16結合結構域)的存在下，表達亞型HIV Env蛋白和效應細胞(人PBMC(E:T = 30:1)或純化的人NK細胞(E:T = 3:1))的HEK/D371靶細胞的24小時孵育所產生的細胞毒性百分比。圖 15A ：293HEK D371靶細胞/PBMCs；CD16A異型158F/158V；圖 15B ：293HEK D371靶細胞/PBMCs；CD16A異型158F/158F；圖 15C ：293HEK D371靶細胞/NK細胞；CD16A異型158F/158V。
圖 16A-16B 顯示在效應細胞(Jurkat/CD16A 158F(圖 16A )或158V/NFAT-Luc細胞(圖 16B ))的存在下表達HIV env蛋白的靶HEK/D371細胞在用DART-X (具有hCD16-M1 CD16結合結構域)、DART-Y (具有hCD16-M2 CD16結合結構域)、DART-0 (具有h3G8 CD16結合結構域)或DART-3 (具有hCD16-M1 CD16結合結構域的CD16 x RSV 雙抗體)孵育後的細胞毒性百分比。
圖 17A-17C 顯示與hCD16-M1 的親本 CD16結合結構域(存在於DART-C 和DART-3) 和h3G8 的CD16結合結構域(存在於DART-1 )相比，hCD16-M1A (存在於DART-I )、hCD16-M1B (存在於DART-J )、hCD16-M1AB (存在於DART-K )的優化的CD16結合結構域結合至PBMC樣品中存在的人NK細胞(圖 17A )、食蟹猴NK細胞(圖 17B )和獼猴NK細胞(圖 17C )的能力。HER2/neu x RSV 雙抗體(缺少CD16結合結構域)被包括作為陰性對照。
圖 18A-18D 顯示hCD16-M1A (存在於DART-I )、hCD16-M1B (存在於DART-J )、和hCD16-M1AB (存在於DART-K )的優化的CD16結合結構域與人和食蟹猴效應細胞兩者介導HER2/neu表達的靶細胞重定向的細胞殺傷的能力。所描繪的是在下列CD16 x HER2/neu 結合分子：DART-C (具有hCD16-M1 CD16結合結構域)、DART-I (具有hCD16-M1A CD16結合結構域)、DART-J (具有hCD16-M1B 結合結構域)、DART-K (具有hCD16-M1AB 結合結構域)、DART-1 (具有h3G8 CD16結合結構域)、或陰性對照HER2/neu x RSV 雙抗體的存在下，JIMT-1-Luc靶癌細胞和效應細胞(人PBMCs(圖 18A-18B )或食蟹猴PMBCs(圖 18C-18D ))(E:T = 30:1)的24小時孵育所產生的細胞毒性，如在LDH重定向的細胞殺傷試驗(以細胞毒性百分比描繪，圖 18A 和 18C )或LUM重定向的細胞殺傷試驗(螢光(LUM)以相對光單位(RLU)描繪，圖 18B 和 18D )中所測量的。
圖19A-19D顯示hCD16-M1B(存在於DART-M)和hCD16-M1AB(存在於DART-N )的優化的CD16結合結構域與人效應細胞介導CD19表達靶細胞的重定向的細胞殺傷的能力。在下列CD16 x CD19 結合分子：DART-L (具有hCD16-M1 CD16結合結構域)、DART-M (具有hCD16-M1B 結合結構域)、DART-N (具有hCD16-M1AB 結合結構域)、duvortuxizumab(陽性對照CD3 x CD19 雙抗體)或陰性對照CD16 x RSV 雙抗體DART-5 (具有hCD16-M1 CD16結合結構域)、DART-6 (具有hCD16-M1B 結合結構域)、DART-7 (具有hCD16-M1AB 結合結構域)的存在下，Raji-Luc靶癌細胞和人PBMC效應細胞(E:T = 30:1)的24小時(圖 19A 和19C )和48小時孵育(圖 19B 和19D )之後測量的細胞毒性，如在LDH重定向的細胞殺傷試驗(以細胞毒性百分比描繪，圖19A和19B)或LUM重定向的細胞殺傷試驗(LUM以RLU描繪，圖19C和19D)中所測量的。
圖 20A-20D 顯示在離體人和食蟹猴PBMC樣品中hCD16-M1B (存在於DART-M )和hCD16-M1AB (存在於DART-N )的優化的CD16結合結構域介導自體B細胞消耗的能力。在下列CD16 x CD19 結合分子：DART-L (具有hCD16-M1 CD16結合結構域)、DART-M (具有hCD16-M1B 結合結構域)、DART-N (具有hCD16-M1AB 結合結構域)、或陰性對照CD16 x RSV 雙抗體DART-5 (具有hCD16-M1 CD16結合結構域)、DART-6 (具有hCD16-M1B 結合結構域)的存在下，人(圖 20A-20B )或食蟹猴(圖 20C-20D )的PBMC在72小時(圖 20A 和 20C )、96小時(圖 20B )和144小時(圖 20D )孵育後的B細胞計數(CD3- /CD20+ 細胞)，如流式細胞術所測量的。

Claims (36)

  1. 一種CD16 x 疾病抗原 (CD16 x DA)結合分子，其包括能夠結合CD16的表位元的CD16結合結構域以及能夠結合疾病抗原的表位的疾病抗原-結合結構域，其中所述CD16結合結構域包括下列的一種或多種： (I) (A) 包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDRH1結構域； (B) 包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDRH2結構域； (C) 包含SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDRH3結構域； (D) 包含SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDRL1結構域； (E) 包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDRL2結構域；和 (F) 包含SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDRL3結構域； (II) (A) 包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDRH1結構域； (B) 包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDRH2結構域； (C) 包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDRH3結構域； (D) 包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDRL1結構域； (E) 包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDRL2結構域；和 (F) 包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的CDRL3結構域； (III)包含SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH結構域； (IV)包含SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL結構域； (V) 包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL結構域； (VI)包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL結構域； (VII)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL結構域； (VIII)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL結構域；和 (IX)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL結構域。
  2. 如請求項1所述的CD16 x 疾病抗原結合分子，其中所述分子是雙特異性抗體、雙特異性雙抗體、雙特異性TandAb、雙特異性三價分子或雙特異性CAR。
  3. 如請求項1-2中任一項所述的CD16 x 疾病抗原結合分子，其中所述分子能夠結合多於一個的疾病抗原和/或多於一個的CD16的表位。
  4. 如請求項1-3中任一項所述的CD16 x 疾病抗原結合分子，其中所述CD16結合結構域包括： (A) 包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDRH 1結構域； (B) 包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDRH 2結構域； (C) 包含SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDRH 3結構域； (D) 包含SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDRL 1結構域； (E) 包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDRL 2結構域；和 (F) 包含SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDRL 3結構域。
  5. 如請求項1-3中任一項所述的CD16 x 疾病抗原結合分子，其中所述CD16結合結構域包括： (A) 包含SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH結構域； (B) 包含SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL結構域； (C) 包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL結構域； (D) 包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL結構域； (E) 包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL結構域；或 (F) 包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL結構域。
  6. 如請求項1-3中任一項所述的CD16 x 疾病抗原結合分子，其中所述CD16結合結構域包括： (A) 包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDRH 1結構域； (B) 包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDRH 2結構域； (C) 包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDRH 3結構域； (D) 包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDRL 1結構域； (E) 包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDRL 2結構域；和 (F) 包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的CDRL 3結構域。
  7. 如請求項1-3中任一項所述的CD16 x 疾病抗原結合分子，其中所述CD16結合結構域包括： (A) 包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VH結構域； (B) 包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL結構域；或 (C) 包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL結構域。
  8. 如請求項1-7中任一項所述的CD16 x 疾病抗原結合分子，其中所述疾病抗原是癌抗原並且所述疾病是癌症。
  9. 如請求項6所述的CD16 x 疾病抗原結合分子，其中所述癌症選自由下列組成的組：腎上腺癌、膀胱癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、成膠質細胞瘤、腎癌、非小細胞肺癌、急性淋巴細胞性白血病、急性髓細胞樣白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓細胞樣白血病、毛細胞白血病、伯基特淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、小淋巴細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮膚癌、腎細胞癌、睾丸癌和子宮癌。
  10. 如請求項8和9中任一項所述的CD16 x 疾病抗原結合分子，其中所述癌抗原選自由下列癌抗原組成的組：19.9、4.2、A33、ADAM-9、AH6、ALCAM、B1、B7-H3、BAGE、β-聯蛋白、血型ALeb /Ley 、伯基特淋巴瘤抗原-38.13、C14、CA125、羧肽酶M、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD33、CD36、CD40/CD154、CD45、CD56、CD46、CD52、CD56、CD79a/CD79b、CD103、CD123、CD317、CDK4、CEA、CEACAM5/CEACAM6、CO17-1A、CO-43、CO-514、CTA-1、CTLA-4、細胞角蛋白8、D1.1、D1 56-22、DR5、E1 系列、EGFR、肝配蛋白受體、EphA2、Erb、GAGE、GD2/GD3/GM2神經節苷脂、GICA 19-9、gp100、Gp37、gp75、gpA33、HER2/neu、HMFG、人乳頭瘤病毒-E6/人乳頭瘤病毒-E7、HMW-MAA、I抗原、IL13Rα2、整聯蛋白β6、JAM-3、KID3、KID31、KS 1/4泛癌抗原、L6、L20、LEA、LUCA-2、M1:22:25:8、M18、M39、MAGE、MART、間皮素、MUC-1、MUM-1、Myl、N-乙醯葡糖胺基轉移酶、擬糖蛋白、NS-10、OFA-1、OFA-2、制瘤素M、p15、p97、PEM、PEMA、PIPA、PSA、PSMA、前列腺酸磷酸鹽、R24 、ROR1、鞘脂、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、sTn、T細胞受體衍生肽、T5 A7 、TAG-72、TL5、TNF-受體、TNF-γ受體、TRA-1-85、轉鐵蛋白受體、5T4、TSTA、VEGF、VEGF受體、VEP8、VEP9、VIM-D5、和Y半抗原、Ley 。
  11. 如請求項1-8中任一項所述的CD16 x 疾病抗原結合分子，其中所述疾病抗原是5T4、B7-H3、CEACAM5/CEACAM6、CD19、CD123、EGRF、EphA2、HER2/neu、IL13Rα2或VEGF。
  12. 如請求項1-7中任一項所述的CD16 x 疾病抗原結合分子，其中所述疾病抗原是病原體相關抗原。
  13. 如請求項12所述的CD16 x 疾病抗原結合分子，其中所述病原體相關抗原選自由下列病原體相關抗原組成的組：單純皰疹病毒感染的細胞蛋白(ICP)47、單純皰疹病毒gD、愛潑斯坦-巴爾病毒LMP-1、愛潑斯坦-巴爾病毒LMP-2A、愛潑斯坦-巴爾病毒LMP-2B、人類免疫缺陷病毒gp160、人類免疫缺陷病毒gp120、人類免疫缺陷病毒gp41等、人乳頭瘤病毒E6、人乳頭瘤病毒E7、人T細胞白血病病毒gp64、人T細胞白血病病毒gp46和人T細胞白血病病毒gp21。
  14. 如請求項12或13所述的CD16 x 疾病抗原結合分子，其中所述疾病抗原是HIV env抗原。
  15. 如請求項1-14中任一項所述的CD16 x 疾病抗原結合分子，其中所述分子是： (A) 雙抗體，所述雙抗體是包含兩條、或三條、四條或五條多肽鏈的共價結合的複合物；或 (B) 三價結合分子，所述三價結合分子是包含三條、四條或五條多肽鏈的共價結合的複合物；或 (C) 雙特異性抗體。
  16. 如請求項15所述的CD16 x 疾病抗原結合分子，其中所述分子包含Fc區。
  17. 如請求項16所述的CD16 x 疾病抗原結合分子，其中所述Fc區具有IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同種型。
  18. 如請求項16或17所述的CD16 x 疾病抗原結合分子，其中所述Fc區是變體Fc區，包含： (A) 一個或多個氨基酸修飾，其減少所述變體Fc區對於FcγR的親和力；和/或 (B) 一個或多個氨基酸修飾，其增加所述變體Fc區的血清半衰期。
  19. 如請求項18所述的CD16 x 疾病抗原結合分子，其中： (A) 減少所述變體Fc區對於FcγR的親和力的所述修飾包括L234A、L235A、或L234A和L235A的置換；和 (B) 增加所述變體Fc區的血清半衰期的所述修飾包括M252Y；M252Y和S254T；M252Y和T256E；M252Y、S254T和T256E；或K288D和H435K的置換， 其中所述編號是如Kabat中EU索引的編號。
  20. 一種CD16結合分子，其包含： (A) 包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDRH 1結構域； (B) 包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDRH 2結構域； (C) 包含SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDRH 3結構域； (D) 包含SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDRL 1結構域； (E) 包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDRL 2結構域；和 (F) 包含SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDRL 3結構域。
  21. 如請求項20所述的CD16結合分子，其中所述分子包含： (A) 包含SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH結構域； (B) 包含SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL結構域； (C) 包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL結構域； (D) 包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL結構域； (E) 包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL結構域；或 (F) 包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL結構域。
  22. 一種CD16結合分子，其包含： (A) 包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDRH 1結構域； (B) 包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDRH 2結構域； (C) 包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDRH 3結構域； (D) 包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDRL 1結構域； (E) 包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDRL 2結構域；和 (F) 包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的CDRL 3結構域。
  23. 如請求項22所述的CD16結合分子，其中所述分子包含： (A) 包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VH結構域； (B) 包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL結構域；或 (C) 包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL結構域。
  24. 如請求項20-23中任一項所述的CD16結合分子，其中所述分子選自由下列組成的組：抗體、多特異性抗體、Fab'片段、F(ab')2 片段、(Fv)片段、單鏈(scFv)、單鏈抗體、二硫化物連接的雙特異性Fv (sdFv)、雙抗體、三價結合分子和CAR-T分子。
  25. 一種藥物組合物，其包括如請求項1-19中任一項所述的CD16 x 疾病抗原結合分子和藥學上可接受的載體。
  26. 一種藥物組合物，其包括如請求項20-24中任一項所述的CD16結合分子和藥學上可接受的載體。
  27. 一種如請求項25所述的藥物組合物在治療特徵在於表達所述疾病抗原的疾病中的用途。
  28. 一種用於治療特徵在於表達疾病抗原的疾病的方法，包括向需要其的受試者施用治療有效量的如請求項25所述的藥物組合物。
  29. 如請求項27所述的用途或如請求項28所述的方法，其中所述CD16 x 疾病抗原結合分子能夠結合多於一個的疾病抗原和/或多於一個的CD16的表位。
  30. 如請求項27所述的用途或如請求項28所述的方法，其中所述CD16 x 疾病抗原結合分子的所述疾病抗原是癌抗原，並且所述疾病是癌症。
  31. 如請求項30所述的用途或方法，其中所述癌症選自由下列組成的組：腎上腺癌、膀胱癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、成膠質細胞瘤、腎癌、非小細胞肺癌、急性淋巴細胞性白血病、急性髓細胞樣白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓細胞樣白血病、毛細胞白血病、伯基特淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、小淋巴細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮膚癌、腎細胞癌、睾丸癌和子宮癌。
  32. 如請求項30所述的用途或方法，其中所述癌抗原選自由下列癌抗原組成的組：19.9、4.2、A33、ADAM-9、AH6、ALCAM、B1、B7-H3、BAGE、β-聯蛋白、血型ALeb /Ley 、伯基特淋巴瘤抗原-38.13、C14、CA125、羧肽酶M、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD33、CD36、CD40/CD154、CD45、CD56、CD46、CD52、CD56、CD79a/CD79b、CD103、CD123、CD317、CDK4、CEA、CEACAM5/CEACAM6、CO17-1A、CO-43、CO-514、CTA-1、CTLA-4、細胞角蛋白8、D1.1、D1 56-22、DR5、E1 系列、EGFR、肝配蛋白受體、EphA2、Erb、GAGE、GD2/GD3/GM2神經節苷脂、GICA 19-9、gp100、Gp37、gp75、gpA33、HER2/neu、HMFG、人乳頭瘤病毒-E6/人乳頭瘤病毒-E7、HMW-MAA、I抗原、IL13Rα2、整聯蛋白β6、JAM-3、KID3、KID31、KS 1/4泛癌抗原、L6、L20、LEA、LUCA-2、M1:22:25:8、M18、M39、MAGE、MART、間皮素、MUC-1、MUM-1、Myl、N-乙醯葡糖胺基轉移酶、擬糖蛋白、NS-10、OFA-1、OFA-2、制瘤素M、p15、p97、PEM、PEMA、PIPA、PSA、PSMA、前列腺酸磷酸鹽、R24 、ROR1、鞘脂、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、sTn、T細胞受體衍生肽、T5 A7 、TAG-72、TL5、TNF-受體、TNF-γ受體、TRA-1-85、轉鐵蛋白受體、5T4、TSTA、VEGF、VEGF受體、VEP8、VEP9、VIM-D5、和Y半抗原、Ley 。
  33. 如請求項32所述的用途或方法，其中所述疾病抗原是5T4、B7-H3、CEACAM5/CEACAM6、CD19、CD123、EGRF、EphA2、HER2/neu、IL13Rα2或VEGF。
  34. 如請求項27所述的用途或如請求項28所述的方法，其中所述CD16 x 疾病抗原結合分子的所述疾病抗原是病原體相關抗原。
  35. 如請求項34所述的用途或方法，其中所述病原體相關抗原選自由下列病原體相關抗原組成的組：單純皰疹病毒感染的細胞蛋白(ICP)47、單純皰疹病毒gD、愛潑斯坦-巴爾病毒LMP-1、愛潑斯坦-巴爾病毒LMP-2A、愛潑斯坦-巴爾病毒LMP-2B、人類免疫缺陷病毒gp160、人類免疫缺陷病毒gp120、人類免疫缺陷病毒gp41等、人乳頭瘤病毒E6、人乳頭瘤病毒E7、人T細胞白血病病毒gp64、人T細胞白血病病毒gp46和人T細胞白血病病毒gp21。
  36. 如請求項35所述的用途或方法，其中所述疾病抗原是HIV env抗原。
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