TW201619381A

TW201619381A - 控制鞘翅目及半翅目害蟲之ｇｈｏ／ｓｅｃ２４ｂ２以及ｓｅｃ２４ｂ１核酸分子

Info

Publication number: TW201619381A
Application number: TW104133057A
Authority: TW
Inventors: 肯尼士Ｅ納爾瓦; 卡尼卡阿羅拉; 莎拉Ｅ沃登; 木魯蓋森倫格沙米; 李華榮; 梅根弗瑞; 布萊爾西格弗萊德; 哲凡卡哈傑拉; 伊蓮費希萊維奇
Original assignee: 陶氏農業科學公司; 內布拉斯加大學董事會
Priority date: 2014-10-08
Filing date: 2015-10-07
Publication date: 2016-06-01
Also published as: JP2017530709A; PH12017500612A1; EP3204498A4; KR20170065538A; UY36349A; CO2017003557A2; WO2016057822A3; IL251577A0; MX2017004291A; BR112017006869A2; AU2015330834A1; CA2963427A1; EP3204498A2; US20160186203A1; CL2017000802A1; RU2017112037A; BR102015025537A2; WO2016057822A2; CN107109409A; AR102216A1

Abstract

本揭示內容關於核酸分子及使用該核酸分子經由昆蟲害蟲內的標靶編碼與所轉錄非編碼序列之RNA干擾-介導抑制來控制昆蟲害蟲-包括鞘翅目及/或半翅目害蟲-的方法。本揭示內容亦關於製作表現可用於控制昆蟲害蟲之核酸分子的基因轉殖植物的方法，以及藉由該方法獲得的植物細胞與植物。

Description

控制鞘翅目及半翅目害蟲之GHO/SEC24B2以及SEC24B1核酸分子

優先權主張

本申請案主張2014年10月8日所提申之美國臨時專利申請案編號62/061,608提申日期之利益，茲此將其整體揭露內容以參照方式併入本案。

發明領域

本發明大致上關於昆蟲害蟲(譬如鞘翅目害蟲及半翅目害蟲)所造成之植物損傷的基因控制。在特定具體例中，本發明關於標靶編碼與非編碼聚核苷酸的識別，以及重組DNA技術用於轉錄後抑止或抑制昆蟲害蟲細胞內之標靶編碼與非編碼聚核苷酸的表現以提供植物保護效應的用途。

發明背景

西方玉米根蟲(WCR)(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)是北美最具破壞性的玉米根蟲物種之一且在美國中西部的玉米種植區域受到特別關注。北方玉米根蟲(NCR)(Diabrotica barberi Smith and Lawrence)是和 WCR共同棲息在許多相同範圍的密切相關物種。有數個其他相關的條葉甲屬(Diabrotica)亞種是北美的重要害蟲：墨西哥玉米根蟲(MCR)(D.virgifera zeae Krysan and Smith)；南方玉米根蟲(SCR)(D.undecimpunctata howardi Barber)；黄瓜條葉甲(D.balteata LeConte)；特氏斑點黄瓜條葉甲(D.undecimpunctata tenella)；及曼氏斑點黄瓜條葉甲(D.u.undecimpunctata Mannerheim)。美國農業部估計玉米根蟲造成每年十億美金的財政損失，包括八億美金的產量損失與兩億美金的處理費用。

WCR與NCR係於夏季期間產卵在土壤中。該昆蟲在整個冬天停留於卵階段。卵是長橢圓形、白色，且長度小於0.1mm。幼蟲在五月底或六月初孵化，卵孵化的確切時間由於溫度差異和位置所致，每年不盡相同。剛孵出的幼蟲是長度小於0.318mm的白色蟲子。一旦孵化，幼蟲開始食用玉米根部。玉米根蟲要經歷三齡幼蟲。在食用數週後，幼蟲蛻皮成蛹。它們化蛹在土壤中，隨後在七月和八月以成蟲從土壤中冒出。成年根蟲的長度約6.35mm。

玉米根蟲幼蟲在玉米與數種其他草類物種上完成發育。比起在玉米上取食的幼蟲，在金色狗尾草上取食的幼蟲稍晚冒出並具有較小的成蟲頭囊尺寸。Ellsbury et al.(2005)Environ.Entomol.34：627-634。WCR成蟲食用外露穗頂上的玉米鬚、花粉、與穀粒。假使WCR成蟲在玉米繁殖組織出現之前冒出，它們可能食用葉部組織，因此減緩植物生長且偶爾殺死宿主植物。然而，當玉米鬚與花粉存在時，成蟲會迅速轉移到偏好的玉米鬚與花粉。NCR成蟲亦食用玉米植物的繁殖組織，但反而極少食用玉米葉。

在玉米的大部分根蟲損傷是由幼蟲取食造成。剛孵出的根蟲最初食用微細玉米根毛並鑽入根尖。隨著幼蟲越長越大，它們食用並鑽入主根。當玉米根蟲富集時，幼蟲的食用時常導致根部縮減，一路直到玉米秸稈的基部。嚴重的根部損傷會干擾根部輸送水和養分至該植物的能力、減緩植物生長，並導致糧食生產減少，因此時常大幅降低整體產量。嚴重的根部損傷亦時常導致玉米植物倒伏，這使得收割更加困難，並進一步降低產量。而且，成蟲食用玉米繁殖組織可能導致穗頂上的玉米鬚縮減。假使此「玉米鬚剪切(silk clipping)」在花粉脫落期間極為嚴重，可能打亂授粉。

玉米根蟲的控制可嘗試藉由輪作、化學殺蟲劑、生物農藥(譬如生成孢子的革蘭氏陽性菌，蘇力菌(Bacillus thuringiensis))、或彼等的組合。輪作有加諸耕地使用不必要限制的顯著缺點。再者，一些根蟲物種可能產卵在玉米以外的作物田地或延長滯育導致卵在多年後孵化，因此減低玉米和大豆實行輪作的有效性。

在實現玉米根蟲控制的策略上，最重度倚賴的是化學殺蟲劑。雖然使用化學殺蟲劑是不夠完善的玉米根蟲控制策略；當化學殺蟲劑的成本加至儘管使用殺蟲劑仍可能發生的根蟲損害的成本時，每年在美國因玉米根蟲可能損失超過十億美金。幼蟲群體過多、暴雨、以及不正確施用(多個)殺蟲劑可能都會導致不適當的玉米根蟲控制。而且，持續使用殺蟲劑可能選出殺蟲劑-抗藥性根蟲株，還有由於許多殺蟲劑對非標靶物種的毒性所出現的重大環境議題。

椿象及其他半翅目昆蟲(異翅目(heteroptera))包含另一重要的農業害蟲難題。已知全世界有超過50種密切相關的椿象物種造成作物損傷。McPherson & McPherson(2000)Stink bugs of economic importance in America north of Mexico,CRC Press。該等昆蟲出現在眾多重要作物，包括玉蜀黍、大豆、果實、蔬菜、與穀物。

椿象在到達成蟲階段之前要經歷多個若蟲階段。從卵發育為成蟲的時間約30-40天。若蟲和成蟲皆取食軟組織的汁液，其中它們也注入消化酶，造成口外組織消化和壞死。所消化的植物材料和養分隨後被攝入。從植物維管系統消耗的水和養分導致植物組織損傷。發育中穀粒與種子的損傷是最重大的，因為產量與發芽會顯著減少。在溫暖氣候發生的多個世代導致顯著的昆蟲壓力。椿象的現今管理仰賴以個別田地為基礎的殺蟲劑處理。因此，迫切需要替代性管理策略，以使作物損失減至最少。

RNA干擾(RNAi)是利用內源性細胞途徑的方法，藉由該方法，對於標靶基因序列的全部、或適當大小的任何部分為特異性的干擾RNA(iRNA)分子(譬如雙股RNA(dsRNA)分子)導致其所轉錄的mRNA降解。近年，RNAi已用於在眾多物種與實驗系統進行基因「減弱(knockdown)」；舉例來說，秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)、植物、昆蟲胚胎、以及組織培養的細胞。參閱，譬如Fire et al.(1998)Nature 391：806-811；Martinez et al.(2002)Cell 110：563-574；McManus and Sharp(2002)Nature Rev.Genetics 3：737-747。

RNAi係經由內源性途徑，包括DICER蛋白質複合體達到mRNA之降解。DICER將長的dsRNA分子切成大約20個核苷酸的短片段，稱作小型干擾RNA(siRNA)。該siRNA開展成兩個單股RNAs：隨從股(passenger strand)與引導股(guide strand)。隨從股被降解，引導股被併入RNA-誘發的靜默複合體(RISC)。轉錄後基因靜默在該引導股特異性地結合至一互補mRNA分子，並誘發阿若戈蛋白(Argonaute)-RISC複合體的催化組分-切割時發生。儘管最初siRNA及/或miRNA的濃度有限，但已知此過程在諸如植物、線蟲與一些昆蟲的一些真核生物中係全身性地傳播。

美國專利7,612,194與美國專利公開案編號2007/0050860、2010/0192265、與2011/0154545揭示了單離自西方玉米根蟲蛹的9112個表現序列標籤(EST)序列庫。美國專利7,612,194與美國專利公開案編號2007/0050860當中提議將一促進子以操作方式聯接至互補至其中所揭示之西方玉米根蟲液泡型H⁺-ATPase(V-ATPase)的數個特定部分序列之一的一核酸分子，以表現植物細胞中的反股RNA。美國專利公開案編號2010/0192265提議將一促進子以操作方式聯接至互補至未知與未揭露功能的西方玉米根蟲基因之特定部分序列(部分序列係陳述為58%一致於秀麗隱桿線蟲的C56C10.3基因產物)的一核酸分子，以表現植物細胞中的反股RNA。美國專利公開案編號2011/0154545提議將一促進子以操作方式聯接至互補至西方玉米根蟲衣被蛋白乙型次單元基因的兩個特定部分序列的一核酸分子，以表現植物細胞中的反股RNA。又，美國專利7,943,819揭露單離自西方玉米根蟲幼蟲、蛹、與剖分中腸的906個表現序列標籤(EST)序列庫，並提議將一促進子以操作方式聯接至互補至西方玉米根蟲帶電多泡體蛋白質4b基因的特定部分序列的一核酸分子，以表現植物細胞中的雙股RNA。

除了V-ATPase的數個特定部分序列與未知功能基因的特定部分序列以外，美國專利7,612,194及美國專利公開案編號2007/0050860、2010/0192265、與2011/0154545在使用其中所列示用於RNA干擾的超過九千個序列的任何特定序列上並無提供進一步提議。而且，美國專利7,612,194、及美國專利公開案編號2007/0050860與2010/0192265、與2011/0154545對於所提供之超過九千個序列當中的其他何者在用作dsRNA或siRNA時對玉米根蟲物種致死、或者甚至可用於玉米根蟲物種，皆無提供任何指示。除了帶電多泡體蛋白質4b基因的特定部分序列以外，美國專利7,943,819在使用其中所列示用於RNA干擾的超過九千個序列上並無提供提議。而且，美國專利7,943,819對於所提供之超過九千個序列當中的其他何者在用作dsRNA或siRNA時對玉米根蟲物種致死、或者甚至可用於玉米根蟲物種，並無提供指示。美國專利申請案公開編號U.S.2013/040173與PCT申請案公開編號WO 2013/169923說明了衍生自西方玉米根蟲Snf7基因的序列，以在玉蜀黍進行RNA干擾。(亦揭示於Bolognesi et al.(2012)PLOS ONE 7(10)：e47534.doi：10.1371/journal.pone.0047534)。

互補至玉米根蟲DNAs的絕大多數序列(例如前述)在用作dsRNA或siRNA時並不提供植物免於玉米根蟲物種的保護效應。舉例來說，Baum et al.(2007)Nature Biotechnology 25：1322-1326說明藉由RNAi抑制數個WCR基因標靶的效應。該等作者報導他們所測試的26個標靶基因的當中8個在超過520ng/cm²之極高iRNA(譬如dsRNA)濃度沒能提供實驗上顯著的鞘翅目害蟲死亡率。

美國專利7,612,194與美國專利公開案編號2007/0050860的作者首次報導靶向西方玉米根蟲的玉米植物之植物RNAi。Baum et al.(2007)Nat.Biotechnol.25(11)：1322-6。該等作者說明一高通量活體內膳食RNAi系統，以篩揀發展基因轉殖RNAi玉蜀黍的潛力標靶基因。在具290個標靶的初始基因池中，僅14個展現幼蟲控制潛力。最有效的雙股RNAs(dsRNA)之一係靶向編碼液泡ATPase次單元A(V-ATPase)的一基因，結果以低濃度dsRNA快速壓抑對應內源性mRNA並觸發特異性RNAi回應。於是，該等作者首次記載植物RNAi作為可能的害蟲管理工具，並同時證實有效標靶無法以事前演繹(a priori)準確識別，即便從相對小的候選基因組。

發明概要

本案揭露的是核酸分子(譬如標靶基因、DNAs、dsRNAs、siRNAs、miRNAs、shRNAs、與hpRNAs)、及其用於控制昆蟲害蟲的方法，包括，舉例來說，鞘翅目害蟲，例如西方玉米根蟲(D.v.virgifera LeConte(西方玉米根蟲，“WCR”))；北方玉米根蟲(D.barberi Smith and Lawrence(北方玉米根蟲，“NCR”))；南方玉米根蟲(D.u.howardi Barber(南方玉米根蟲，“SCR”))；墨西哥玉米根蟲(D.v.zeae Krysan and Smith(墨西哥玉米根蟲，“MCR”))；黄瓜條葉甲；特氏斑點黄瓜條葉甲(D.u.tenella)；曼氏斑點黄瓜條葉甲(D.u.undecimpunctata Mannerheim)，以及半翅目害蟲，例如英雄美洲蝽(Euschistus heros(Fabr.))(新熱帶褐椿，“BSB”)；褐臭椿(E.servus(Say)(褐椿象)；稻綠椿(Nezara viridula(L.))(南方綠椿象)；紅肩綠蝽(Piezodorus guildinii(Westwood))(紅帶蝽象)；褐翅椿(Halyomorpha halys(Stål))(褐翅椿象)；綠椿(Chinavia hilare(Say))(綠椿象)；馬格那椿(C.marginatum(Palisot de Beauvois))；馬勒卡椿(Dichelops melacanthus(Dallas))；弗卡待克蝽(D.furcatus(F.))；地中海椿(Edessa meditabunda(F.))；新熱帶紅肩綠蝽(Thyanta perditor(F.))(新熱帶紅肩綠蝽象)；諾比蟲(Horcias nobilellus(Berg))(棉花蟲)；斑蝽(Taedia stigmosa(Berg))；秘魯紅蝽(Dysdercus peruvianus(Guérin-Méneville))；擬新扭白蟻(Neomegalotomus parvus (Westwood))；葉足蟲(Leptoglossus zonatus(Dallas))；尼氏蟲(Niesthrea sidae(F.))；草盲蝽(Lygus hesperus(Knight))(西部牧草盲蝽)；和美國牧草盲蝽(L.lineolaris(Palisot de Beauvois))。在特定例子中，揭露了可和昆蟲害蟲的一或多個原生核酸之至少一部分同源的例示性核酸分子。

在該等與進一步例子中，原生核酸可為標靶基因，其產物可以，舉例來說且不設限：涉及代謝過程或涉及幼蟲/若蟲發育。在一些例子中，標靶基因的表現藉由包含其同源聚核苷酸之一核酸分子的轉譯後抑制可對鞘翅目及/或半翅目害蟲致死、或導致其生長及/或發育減少。在特異例子中，Gho/Sec24B2基因或Sec24B1基因可選作用於轉錄後靜默的標靶基因。在特定例子中，可用於轉錄後抑制的標靶基因為稱作Sec24B2的新穎條葉甲屬基因(譬如SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：107)、稱作BSB_Gho的新穎英雄美洲蝽基因(譬如SEQ ID NO：84與EQ ID NO：85)、或稱作Sec24B1的新穎條葉甲屬基因(譬如SEQ ID NO：102)。包含下列聚核苷酸的一單離核酸分子係因此揭示於本案：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：102、或SEQ ID NO：107；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：102、或SEQ ID NO：107的互補體；以及前述任何一者的片段(譬如SEQ ID NOs：3-6、SEQ ID NOs：86-88、SEQ ID NO：104、與SEQ ID NO：109)。

亦揭露的是一種核酸分子，其包含編碼和標靶基因產物(舉例來說，Gho/Sec24B2基因或Sec24B1基因的產物) 內部之胺基酸序列至少約85%一致的多肽的一聚核苷酸。舉例來說，一核酸分子可包含編碼下列的一聚核苷酸：和GHO/SEC24B2至少85%一致之多肽(譬如SEQ ID NO：2(SEC24B2)、SEQ ID NO：98(BSB_GHO)、SEQ ID NO：99(BSB-GHO)、與SEQ ID NO：108(SEC24B2))；Gho/Sec24B2產物內部之一胺基酸序列；SEC24B1(譬如SEQ ID NO：103)；及/或Sec24B1產物內部之一胺基酸序列。更揭露了一種包含一聚核苷酸的核酸分子，該聚核苷酸為編碼和標靶基因產物內部之一胺基酸序列至少85%一致之多肽的一聚核苷酸的反向互補體。

亦揭露的是一種cDNA聚核苷酸，其可用於製造互補至全部或部分之鞘翅目及/或半翅目害蟲標靶基因，舉例來說，Gho/Sec24B2基因或Sec24B1基因的iRNA(譬如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、與hpRNA)分子。在特定具體例中，dsRNAs、siRNAs、miRNAs、shRNAs、及/或hpRNAs可在體外、或藉由基因改造生物，例如植物或細菌在體內製造。在特定例子中，所揭露的是一種cDNA分子，其可用於製造互補至全部或部分之稱作Sec24B2的新穎條葉甲屬基因(譬如SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：107)、稱作BSB_Gho的新穎英雄美洲蝽基因(譬如SEQ ID NO：84與EQ ID NO：85)、或稱作Sec24B1的新穎條葉甲屬基因(譬如SEQ ID NO：102)的iRNA分子。

另揭露的是抑制鞘翅目害蟲關鍵基因之表現的措施，以及保護植物免於鞘翅目害蟲的措施。抑制鞘翅目害蟲關鍵基因之表現的措施是選自於由下列所構成之群組的一聚核苷酸所編碼的雙股RNA分子：SEQ ID NO：18與SEQ ID NO：19；及其互補體。抑制鞘翅目害蟲關鍵基因之表現的措施的功能性等效物包括實質上同源於包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：102、及/或SEQ ID NO：107之WCR基因的全部或部分轉錄體的單一-或雙股RNA分子。保護植物免於鞘翅目害蟲的措施是一種DNA分子，其包含操作性地聯結至一促進子之編碼抑制鞘翅目害蟲關鍵基因之表現的措施的一聚核苷酸，其中該DNA分子能夠嵌入植物，例如，舉例來說，玉蜀黍的基因組。

另揭露的是抑制半翅目害蟲關鍵基因之表現的措施，以及保護植物免於半翅目害蟲的措施。抑制半翅目害蟲關鍵基因之表現的措施是選自於由下列所構成之群組的一聚核苷酸所編碼的單股RNA分子：SEQ ID NOs：86-88之任一者。抑制半翅目害蟲關鍵基因之表現的措施的功能性等效物包括實質上同源於包含SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：85之BSB基因的全部或部分轉錄體的單股RNA分子。保護植物免於半翅目害蟲的措施是一種DNA分子，其包含操作性地聯結至一促進子之編碼抑制半翅目害蟲關鍵基因之表現的措施的一聚核苷酸，其中該DNA分子能夠嵌入植物，例如，舉例來說，玉蜀黍的基因組。

所揭露的是用於控制昆蟲害蟲(譬如鞘翅目或半翅目害蟲)群體的方法，該方法包含將一iRNA(譬如dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、與hpRNA)分子提供給一昆蟲害蟲(譬如鞘翅目或半翅目害蟲)，該分子在被該害蟲攝食後發揮功能，以抑制害蟲內的生物功能，其中該iRNA分子包含選自於由下列所構成之群組的(譬如至少15個鄰接核苷酸)的聚核苷酸的任一者之全部或一部分：SEQ ID NO：112；SEQ ID NO：112的互補體；SEQ ID NO：113；SEQ ID NO：113的互補體；SEQ ID NO：114；SEQ ID NO：114的互補體；SEQ ID NO：115；SEQ ID NO：115的互補體；SEQ ID NO：116；SEQ ID NO：116的互補體；SEQ ID NO：119；SEQ ID NO：119的互補體；SEQ ID NO：120；SEQ ID NO：120的互補體；SEQ ID NO：121；SEQ ID NO：121的互補體；SEQ ID NO：122；SEQ ID NO：122的互補體；SEQ ID NO：123；SEQ ID NO：123的互補體；SEQ ID NO：124；SEQ ID NO：124的互補體；SEQ ID NO：125；SEQ ID NO：125的互補體；SEQ ID NO：126；SEQ ID NO：126的互補體；SEQ ID NO：127；SEQ ID NO：127的互補體；雜交至包含SEQ ID NOs：1、102、及/或107之任一者全部或一部分的條葉甲屬生物(譬如WCR)之一原生編碼聚核苷酸的一聚核苷酸；雜交至包含SEQ ID NOs：1、102、及/或107之任一者全部或一部分的條葉甲屬生物之一原生編碼聚核苷酸的一聚核苷酸的互補體；雜交至包含SEQ ID NO：84及/或SEQ ID NO：85之任一者全部或一部分的英雄美洲蝽生物之一原生編碼聚核苷酸的一聚核苷酸；以及雜交至包含SEQ ID NO：84及/或SEQ ID NO：85之任一者全部或一部分的英雄美洲蝽生物之一原生編碼聚核苷酸的一聚核苷酸的互補體。

在特定具體例中，在被一昆蟲害蟲攝食後發揮功能以抑制該害蟲內的生物功能的一iRNA係轉錄自一DNA，其包含選自於由下列所構成之群組的全部或部分(譬如至少15個鄰接核苷酸)的聚核苷酸：SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：1的互補體；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：3的互補體；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：4的互補體；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：5的互補體；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：6的互補體；SEQ ID NO：84；SEQ ID NO：84的互補體；SEQ ID NO：84；SEQ ID NO：84的互補體；SEQ ID NO：85的互補體；SEQ ID NO：85的互補體；SEQ ID NO：86；SEQ ID NO：86的互補體；SEQ ID NO：87；SEQ ID NO：87的互補體；SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：88的互補體；SEQ ID NO：102；SEQ ID NO：102的互補體；SEQ ID NO：104；SEQ ID NO：104的互補體；SEQ ID NO：107；SEQ ID NO：107的互補體；SEQ ID NO：109；SEQ ID NO：109的互補體；包含SEQ ID NOs：1、3-6、102、104、107、與109之任一者全部或一部分的條葉甲屬生物(譬如WCR)的原生編碼聚核苷酸；包含SEQ ID NOs：1、3-6、102、104、107、與109之任一者全部或一部分的條葉甲屬生物的原生編碼聚核苷酸的互補體；包含SEQ ID NOs：84-88之任一者全部或一部分的英雄美洲蝽生物的原生編碼聚核苷酸；以及包含SEQ ID NOs：84-88之任一者全部或一部分的英雄美洲蝽生物的原生編碼聚核苷酸的互補體。

本案亦揭露一種方法，其中dsRNAs、siRNAs、shRNAs、miRNAs、及/或hpRNAs可於以膳食為主的試驗、或於表現dsRNAs、siRNAs、shRNAs、miRNAs、及/或hpRNAs之基因改造植物細胞提供給一昆蟲害蟲。在該等與進一步例子中，dsRNAs、siRNAs、shRNAs、miRNAs、及/或hpRNAs可被害蟲攝入。本發明之dsRNAs、siRNA、shRNAs、miRNAs、及/或hpRNAs的攝入可隨後在害蟲內產生RNAi，繼而可導致就害蟲發育極為關鍵的基因靜默並最終導致死亡。在特定例子中，使用本發明核酸分子受到控制的鞘翅目及/或半翅目害蟲可為WCR、NCR、英雄美洲蝽、褐臭椿、紅肩綠蝽、褐翅椿、稻綠椿、綠椿、馬格那椿、馬勒卡椿、弗卡待克蝽、地中海椿、地中海椿、新熱帶紅肩綠蝽、諾比蟲、斑蝽、秘魯紅蝽、擬新扭白蟻、葉足蟲、尼氏蟲、及/或美國牧草盲蝽。

前述及其他特徵將由下列數個具體例的詳細說明並參照附圖而變得更加顯明。

圖1包括用於以單對引子從單一轉錄模板生成dsRNA的策略圖示。

圖2包括用於從兩個轉錄模板生成dsRNA的策略圖示。

圖3包括顯示特定dsRNAs對WCR死亡率之效應的數據整理。所繪示的是在餵食曝露至500ng Gho/Sec24B2或Sec24B1 dsRNA/膳食外加物、或相同份量的GFP dsRNA、或水的WCR成蟲後的成年西方玉米根蟲百分比死亡。

序列表

隨附序列表所列的核酸序列係使用37 C.F.R.§ 1.822所定義的核苷酸鹼基標準字母縮寫顯示。所列的核酸與胺基酸序列係定義具有以所述方式排列之核苷酸與胺基酸單體的分子(即，分別為聚核苷酸與多肽)。所列的核酸與胺基酸序列亦各別定義包含以所述方式排列之核苷酸與胺基酸單體的一類聚核苷酸或多肽。鑑於基因密碼子的冗餘性，將理解到的是包括一編碼序列的一核苷酸序列亦說明編碼相同多肽的該類聚核苷酸作為包括該參考序列一聚核苷酸。另將理解到的是一胺基酸序列說明編碼該多肽的該類聚核苷酸ORFs。

僅顯示各別核酸序列當中的一股，但互補股係理解為任何提及展示股時被包括在內。因為主要核酸序列的互補體與反向互補體是主要序列所必要揭露的，所以該核酸序列的互補性序列與反向互補性序列在任何提及核酸序列時被包括在內，除非有明確指示不然(或從序列出現的上下文可清楚為其他方式)。而且，本領域可理解到RNA股的核苷酸序列是由其所轉錄的DNA序列決定(但以尿嘧啶(U)核鹼基取代胸腺嘧啶(T))，RNA序列在任何提及編碼其之DNA序列時被包括在內。在隨附序列表：SEQ ID NO：1顯示包含一例示性條葉甲屬Sec24B2聚核苷酸的DNA：

SEQ ID NO：2顯示一例示性條葉甲屬Sec24B2 DNA所編碼之條葉甲屬SEC24B2多肽的胺基酸序列：

SEQ ID NO：3顯示一例示性條葉甲屬Sec24B2 DNA，在本案一些地方稱作Sec24B2 reg1，在一些實施例中，其係用於製造dsRNA：

SEQ ID NO：4顯示一例示性條葉甲屬Sec24B2 DNA，在本案一些地方稱作Sec24B2 reg2，在一些實施例中，其係用於製造dsRNA：

SEQ ID NO：5顯示一例示性條葉甲屬Sec24B2 DNA，在本案一些地方稱作Sec24B2 ver1，在一些實施例中，其係用於製造dsRNA：

SEQ ID NO：6顯示一例示性條葉甲屬Sec24B2 DNA，在本案一些地方稱作Sec24B2 ver2，在一些實施例中，其係用於製造dsRNA：

SEQ ID NO：7顯示T7噬菌體促進子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：8顯示用於YFP dsRNA正股的DNA模板。

SEQ ID NO：9顯示用於GFP dsRNA正股的DNA模板。

SEQ ID NOs：10-17顯示用於擴增例示性條葉甲屬Sec24B2基因之基因區(即，Sec24B2 reg1、Sec24B2 ver1、與Sec24B2 ver2)的引子。

SEQ ID NO：18顯示編碼條葉甲屬Sec24B2 v1髮夾-生成RNA的一例示性DNA；含有正股聚核苷酸、包含一內含子的環圈序列(底線)、與反股聚核苷酸(粗體)：

SEQ ID NO：19顯示編碼條葉甲屬Sec24B2 v2髮夾-生成RNA的一例示性DNA；含有正股聚核苷酸、包含一內含子的環圈序列(底線)、與反股聚核苷酸(粗體)：

SEQ ID NO：20顯示編碼YFP v2髮夾-生成RNA的一例示性DNA；含有正股聚核苷酸、包含一內含子的環圈序列(底線)、與反股聚核苷酸(粗體)：

SEQ ID NO：21顯示包含一ST-LS1內含子的一例示性DNA。

SEQ ID NO：22顯示YFP蛋白質編碼序列。

SEQ ID NO：23顯示膜聯蛋白(annexin)第1區的DNA序列。

SEQ ID NO：24顯示膜聯蛋白第2區的DNA序列。

SEQ ID NO：25顯示乙型血影蛋白2(beta spectrin 2)第1區的DNA序列。

SEQ ID NO：26顯示乙型血影蛋白2第2區的DNA序列。

SEQ ID NO：27顯示mtRP-L4第1區的DNA序列。

SEQ ID NO：28顯示mtRP-L4第2區的DNA序列。

SEQ ID NOs：29-58顯示用於擴增gfp、yfp、膜聯蛋白、乙型血影蛋白2、與mtRP-L4基因區以供dsRNA合成的引子。

SEQ ID NO：59顯示玉蜀黍TIP41-樣蛋白質編碼序列。

SEQ ID NO：60顯示T20VN引子寡聚核苷酸的核苷酸序列。

SEQ ID NOs：61-65顯示用於dsRNA轉錄體表現分析的引子與探針。

SEQ ID NO：66顯示用於二元載體骨架偵測的bSpecR編碼區之一部分的核苷酸序列。

SEQ ID NO：67顯示用於基因組拷貝數分析的AAD1編碼區的核苷酸序列。

SEQ ID NO：68顯示玉蜀黍轉化酶基因。

SEQ ID NOs：69-77顯示用於基因拷貝數分析的引子與探針。

SEQ ID NOs：78-80顯示用於玉蜀黍表現分析的引子與探針。

SEQ ID NO：81顯示包含一肌動蛋白基因的DNA。

SEQ ID NOs：82與83顯示用於擴增肌動蛋白基因區以供dsRNA合成的引子。

SEQ ID NO：84顯示包含一例示性英雄美洲蝽BSB_Gho聚核苷酸的DNA：

SEQ ID NO：85顯示包含另外的例示性英雄美洲蝽BSB_Gho聚核苷酸的DNA：

SEQ ID NO：86顯示一例示性英雄美洲蝽BSB_Gho DNA，在本案一些地方稱作BSB_Gho-1，在一些實施例中，其係用於製造dsRNA：

SEQ ID NO：87顯示一例示性英雄美洲蝽BSB_Gho DNA，在本案一些地方稱作BSB_Gho-2，在一些實施例中，其係用於製造dsRNA：

SEQ ID NO：88顯示一例示性英雄美洲蝽BSB_Gho DNA，在本案一些地方稱作BSB_Gho-3，在一些實施例中，其係用於製造dsRNA：

SEQ ID NOs：89-94顯示用於擴增例示性BSB_Gho基因之基因區(即，BSB_Gho-1、BSB_Gho-2、與BSB_Gho-3)的引子。

SEQ ID NO：95顯示一例示性YFP DNA，其互補股係轉錄成為正股YFP dsRNA(YFP v2)。

SEQ ID NOs：96與97顯示用於擴增YFP v2部分的引子。

SEQ ID NO：98顯示一例示性BSB_Gho DNA所編碼的英雄美洲蝽BSB_GHO多肽胺基酸序列：

SEQ ID NO：99顯示另外的例示性BSB_Gho DNA所編碼的英雄美洲蝽BSB_GHO多肽胺基酸序列：

SEQ ID NO：100顯示編碼YFP v2-1髮夾-生成RNA的一例示性DNA；含有正股聚核苷酸、RTM1內含子環圈(底線)、與反股聚核苷酸(粗體)：

SEQ ID NO：101顯示用於測量玉蜀黍轉錄體位準的探針。

SEQ ID NO：102顯示包含一例示性條葉甲屬Sec24B1聚核苷酸的DNA：

SEQ ID NO：103顯示一例示性條葉甲屬Sec24B1 DNA所編碼的條葉甲屬SEC24B1多肽胺基酸序列：

SEQ ID NO：104顯示一例示性條葉甲屬Sec24B1 DNA，在本案一些地方稱作Sec24B1 reg1，在一些實施例中，其係用於製造dsRNA：

SEQ ID NOs：105-106顯示用於擴增條葉甲屬Sec24B1基因之基因區(Sec24B1 reg1)的引子。

SEQ ID NO：107顯示包含另外的例示性條葉甲屬Sec24B2聚核苷酸的DNA：

SEQ ID NO：108顯示一例示性條葉甲屬Sec24B2 DNA所編碼的條葉甲屬SEC24B2多肽胺基酸序列：

SEQ ID NO：109顯示一例示性條葉甲屬Sec24B2 DNA，在本案一些地方稱作Sec24B2 reg3，在一些實施例中，其係用於製造dsRNA：

SEQ ID NOs：110 and 111顯示用於擴增條葉甲屬Sec24B2基因之基因區(Sec24B2 reg3)的引子。

SEQ ID NOs：112-127顯示用於特定實施例的例示性iRNAs，以減少鞘翅目及/或半翅目害蟲內之標靶基因的表現。

實行本發明之(多個)模式 I. 數個具體例的概觀

吾人開發RNA干擾(RNAi)作為昆蟲害蟲管理的工具，使用供表現dsRNA之基因轉殖植物的最有可能標靶害蟲物種之一；西方玉米根蟲。到目前為止，推論作為根蟲幼蟲RNAi標靶的大部分基因並無確實達成其目的。在此，吾人說明在例示性昆蟲害蟲-西方玉米根蟲與新熱帶褐椿-RNAi-介導的Gho/Sec24B2及/或Sec24B1減弱，在，舉例來說，iRNA分子透過攝入或注射Gho/Sec24B2或Sec24B1 dsRNA傳遞時，其顯示具有致死表型。在本案具體例中，藉由餵食昆蟲傳遞Gho/Sec24B2或Sec24B1 dsRNA的能力賦予對於昆蟲(譬如鞘翅目及半翅目)害蟲管理極為有益的RNAi效應。藉由結合Gho/Sec24B2及/或Sec24B1-介導的 RNAi和其他有益的RNAi標靶，舉例來說，以多重作用模式影響多重標靶序列的潛力可增加發展涉及RNAi技術之昆蟲害蟲管理的永續方式的機會。

本案揭露的是以基因控制昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲侵擾的方法與組成物。亦提供了識別對昆蟲害蟲生命週期不可或缺而用作RNAi-介導之控制昆蟲害蟲群體的標靶基因的一或多個(多個)基因的方法。可設計編碼RNA分子的DNA質體載體，以壓抑就生長、存活、及/或發育而言不可或缺的一或多個(多個)標靶基因。在一些具體例中，該RNA分子可能能夠形成dsRNA分子。在一些具體例中，提供了透過互補至昆蟲害蟲之標靶基因的編碼或非編碼序列的核酸分子在轉錄後抑止表現或抑制標靶基因的方法。在該等與進一步的具體例中，害蟲可攝入互補至一標靶基因的編碼或非編碼序列的核酸分子的全部或一部分所轉錄的一或多個dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、及/或hpRNA分子，藉此提供植物保護效應。

於是，一些具體例涉及使用互補至(多個)標靶基因的編碼及/或非編碼序列之iRNA(譬如dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA及/或hpRNA)標靶基因產物表現的序列-特異性抑制，以達到昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲的至少部分控制。所揭露的是一組單離與純化的核酸分子，包含，舉例來說，SEQ ID NOs：1、84、85、102、與107之任一者、及彼等之片段所列聚核苷酸。在一些具體例中，穩定的dsRNA分子可從該等聚核苷酸、其片段、或包含該等聚核苷酸一或多者的基因表現，以供轉錄後靜默或抑制標靶基因。在某些具體例中，單離與純化的核酸分子包含SEQ ID NOs：1、3-6、84-88、102、104、107、與109之任一者的全部或部分。在一些具體例中，用於達到鞘翅目及/或半翅目害蟲的至少部分控制的一iRNA包含SEQ ID NOs：1、84、85、102、與107之任一者所轉錄之RNA分子的全部或部分互補體。在某些具體例中，一iRNA包含SEQ ID NOs：112-127之任一者的全部或部分。

一些具體例涉及在其基因組具有編碼至少一個(多個)iRNA(譬如dsRNA)分子之至少一個重組DNA的重組宿主細胞(譬如植物細胞)。在特定具體例中，該(多個)dsRNA分子可在鞘翅目及/或半翅目害蟲攝入後製造，以轉錄後靜默或抑制害蟲標靶基因的表現。該重組DNA可包含，舉例來說，SEQ ID NOs：1、3-6、84-88、102、104、107、與109之任一者；SEQ ID NOs：1、3-6、84-88、102、104、107、與109之任一者的片段；由包含SEQ ID NOs：1、3-6、84-88、102、104、107、與109之一者的基因部分序列構成的聚核苷酸；及/或彼等的互補體。

一些具體例涉及在其基因組具有編碼至少一個(多個)iRNA(譬如dsRNA)分子之重組DNA的重組宿主細胞，該iRNA包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：102、及/或SEQ ID NO：107所編碼的全部或部分RNA；及/或彼等的互補體(譬如選自包含SEQ ID NOs：112-127群組的至少一個聚核苷酸)。在被昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲攝入時，該(多個)iRNA分子可靜默或抑制害蟲之標靶Gho/Sec24B2及/或Sec24B1 DNA(譬如包含選自由SEQ ID NOs：1、84、85、102、及/或107)構成之群組的全部或部分聚核苷酸的DNA)的表現，藉此造成害蟲停止進食、生長、及/或發育。

在一些具體例中，在其基因組具有編碼能夠形成dsRNA分子之至少一個RNA分子的至少一個重組DNA的重組宿主細胞可為經轉形之植物細胞。一些具體例涉及包含此類經轉形植物細胞的基因轉殖植物。除了此類基因轉殖植物之外，任何基因轉殖植物世代的植物子代、基因轉殖種子、與基因轉殖植物產物皆有提供，其各別包含(多個)重組DNA。在特定具體例中，能夠形成dsRNA分子之RNA分子可在基因轉殖植物細胞中表現。因此，在該等與其他具體例中，dsRNA分子可從基因轉殖植物細胞單離。在特定具體例中，該基因轉殖植物為選自包含下列之群組的植物：玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、與禾本科(Poaceae)植物。

一些具體例涉及用於調節在昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲細胞內之標靶基因的表現的方法。在該等與其他具體例中，可提供核酸分子，其中該核酸分子包含編碼能夠形成dsRNA分子之RNA分子的一聚核苷酸。在特定具體例中，編碼能夠形成dsRNA分子之RNA分子的一聚核苷酸可操作性地聯結至一促進子，亦可操作性地聯結至一轉錄終止序列。在特定具體例中，用於調節在昆蟲害蟲細胞內之標靶基因的表現的方法：(a)以包含編碼能夠形成dsRNA分子之RNA分子的一聚核苷酸的載體轉形一植物細胞；(b)在足以容許包含複數個經轉形之植物細胞的植物細胞培養物發育的條件下培養該經轉形之植物細胞；(c)選擇該至少一個聚核苷酸已嵌入其基因組的經轉形植物細胞；及(d)測定該經選擇之經轉形植物細胞包含該載體之聚核苷酸所編碼之能夠形成dsRNA分子的RNA分子。一植物可從具有該載體嵌入其基因組且包含該載體之聚核苷酸所編碼之dsRNA分子的一植物細胞再生。

於是，亦揭露的是包含一載體的基因轉殖植物，其載體具有編碼能夠形成嵌入其基因組的dsRNA分子之RNA分子的聚核苷酸，其中該基因轉殖植物包含載體聚核苷酸所編碼的dsRNA分子。在特定具體例中，能夠在植物形成dsRNA分子之RNA分子的表現係足以調節接觸該經轉形植物或植物細胞(舉例來說，在經轉形植物、一部分的植物(譬如根部)或植物細胞上進食)的昆蟲(譬如鞘翅目或半翅目)害蟲細胞標靶基因的表現，俾使害蟲的生長及/或存活受到抑制。本案揭露的基因轉殖植物可展現對昆蟲害蟲侵擾的抗性及/或增強之耐受性。特定的基因轉殖植物可展現免於選自於由下列所構成群組之一或多個鞘翅目及/或(多個)半翅目害蟲的抗性及/或增強之保護：WCR；NCR；SCR；MCR；黄瓜條葉甲；特氏斑點黄瓜條葉甲；曼氏斑點黄瓜條葉甲；英雄美洲蝽；紅肩綠蝽；褐翅椿；稻綠椿；綠椿；褐臭椿；馬勒卡椿；弗卡待克蝽；地中海椿；新熱帶紅肩綠蝽；馬格那椿；諾比蟲；斑蝽；秘魯紅蝽；擬新扭白蟻；葉足蟲；尼氏蟲；草盲蝽；和美國牧草盲蝽。

本案亦揭露的是對昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲投遞控制劑，例如一iRNA分子的方法。此類控制劑可直接或間接地造成昆蟲害蟲群體進食、生長、或以其他方式造成宿主損傷的能力受到損害。在一些具體例中，提供了包含投遞穩定的dsRNA分子至昆蟲害蟲以壓抑害蟲之至少一個標靶基因的方法，藉此得到RNAi並減少或消除害蟲宿主的植物損傷。在一些具體例中，抑制昆蟲害蟲之標靶基因的表現的方法可造成害蟲停止生長、存活、及/或發育。

在一些具體例中，提供了包含一iRNA(譬如dsRNA)分子的組成物(譬如局部組成物)，其和植物、動物、及/或植物或動物的環境使用，以達到消除或減少昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲侵擾。在特定具體例中，該組成物可為欲餵食昆蟲害蟲的營養組成物或食物來源。一些具體例包含製作害蟲可取得的營養組成物或食物來源。攝入包含iRNA分子的組成物可造成害蟲的一或多個細胞攝取該分子，其可繼而造成抑制害蟲的(多個)細胞之至少一個標靶基因表現。藉由在害蟲宿主內提供包含一iRNA分子的一或多個組成物，在存在有害蟲的任何宿主組織或環境內或上之昆蟲害蟲侵擾所致的植物或植物細胞的攝入或損傷可能受限或消除。

本案所述的組成物與方法可連同其他方法與組成物一起使用，以控制昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲所致的損傷。舉例來說，本案所述用於保護植物免於昆蟲害蟲的一iRNA分子可用於包含額外使用下列的方法：有效抵抗昆蟲害蟲的一或多個化學劑、有效抵抗此類害蟲的生物農藥、輪作、展現不同於RNAi-介導方法之特徵的特徵的重組基因技術與RNAi組成物(譬如在植物中重組製造對昆蟲害蟲有害的蛋白質(譬如Bt毒素))。

通

II. 縮寫

BSB 新熱帶褐椿(英雄美洲蝽)

dsRNA 雙股核糖核酸

EST 表現序列標籤

GI 生長抑制

NCBI 國家生技資訊中心

gDNA 基因組DNA

iRNA 抑制性核糖核酸

ORF 開放讀取框

RNAi 核糖核酸干擾

miRNA 微型核糖核酸

siRNA 小型抑制性核糖核酸

shRNA 短髮夾核糖核酸

hpRNA 髮夾核糖核酸

UTR 未轉譯區

WCR 西方玉米根蟲

NCR 北方玉米根蟲

MCR 墨西哥玉米根蟲

PCR 聚合酶鏈反應

qPCR 定量聚合酶鏈反應

RISC RNA-誘發的靜默複合體

SCR 南方玉米根蟲

SEM 平均值的標準誤差

YFP 黃色螢光蛋白質

III. 術語

在以下說明與表格中，使用眾多術語。為了提供對說明書與專利申請範圍，包括此類術語給定的範疇的清楚與一致性理解，提供了下列定義：鞘翅目害蟲：用於本案時，術語「鞘翅目害蟲」指的是鞘翅目的昆蟲，包括條葉甲屬的害蟲昆蟲，其食用農業作物與作物產物，包括玉米與其他真草。在特定例子中，一鞘翅目害蟲係選自包含下列的清單：西方玉米根蟲(WCR)；北方玉米根蟲(NCR)；南方玉米根蟲(SCR)；墨西哥玉米根蟲(MCR)；黄瓜條葉甲；特氏斑點黄瓜條葉甲；及曼氏斑點黄瓜條葉甲。

接觸(到一生物)：用於本案時，提到核酸分子，術語「接觸到」或「被攝入」一生物(譬如鞘翅目或半翅目害蟲)包括核酸分子內化進入生物，舉例來說且不設限：該分子被該生物攝入(譬如藉由食用)；以包含該核酸分子的組成物接觸該生物；以包含該核酸分子的溶液浸泡生物。

重疊群(Contig)：用於本案時，術語「重疊群」指的是從衍生自單一基因來源的一組重疊DNA區段重新建構的DNA序列。

玉米植物：用於本案時，術語「玉米植物」指的是植物物種玉米(玉蜀黍)。

表現：用於本案時，編碼聚核苷酸(舉例來說，基因或轉殖基因)的「表現」指的是一過程，藉由該過程，核酸轉錄單元(包括，譬如gDNA或cDNA)的編碼訊息轉換成細胞的操作性、非操作性、或結構部分，時常包括蛋白質的合成。基因表現可藉由外部信號影響；舉例來說，使細胞、組織、或生物暴露至增加或減少基因表現之藥劑。基因的表現亦可在從DNA至RNA至蛋白質的途徑的當中任何地方受到調控。基因表現的調控發生在，舉例來說，經由作用在轉錄、轉譯、運送與加工、中介分子，例如mRNA的降解上來控制、或經由活化、去活化、隔室化、或已製作特定蛋白質分子後的降解、或藉由彼等的任何組合。基因表現可藉由本領域習知的任何方法於RNA位準或蛋白質位準測量，包括但不限於北方墨點法、RT-PCR、西方墨點法、或(多個)體外、原位、或體內蛋白質活性試驗。

基因材料：用於本案時，術語「基因材料」包括所有基因、與核酸分子，例如DNA與RNA。

半翅目害蟲：用於本案時，術語「半翅目害蟲」指的是半翅目的昆蟲，包括，舉例來說但不限於，蝽科(Pentatomidae)、盲蝽科(Miridae)、紅蝽科(Pyrrhocoridae)、緣蝽科(Coreidae)、蛛緣蝽科(Alydidae)、與姬緣蝽科(Rhopalidae)的昆蟲，其食用廣泛範圍的宿主植物並具有刺吸式口器。在特定例子中，半翅目害蟲選自包含下列清單：英雄美洲蝽(新熱帶褐椿)、稻綠椿象(南方綠椿)、紅肩綠蝽(紅帶蝽象)、褐翅椿(褐翅椿象)、綠椿(綠椿象)、褐臭椿(褐椿象)、馬勒卡椿、弗卡待克蝽、地中海椿、新熱帶紅肩綠蝽(新熱帶紅肩綠蝽象)、馬格那椿、諾比蟲(棉花蟲)、斑蝽、秘魯紅蝽、擬新扭白蟻、葉足蟲、尼氏蟲、草盲蝽(西部牧草盲蝽)、和美國牧草盲蝽。

抑制：用於本案時，術語「抑制」一在用於說明針對編碼聚核苷酸(舉例來說，基因)效應時一指的是編碼聚核苷酸所轉錄的mRNA細胞位準及/或該編碼聚核苷酸的肽、多肽、或蛋白質產物之可測得減量。在一些例子中，編碼聚核苷酸的表現可受到抑制，俾使表現大致上被消除。「特異性抑制」指的是抑制標靶編碼聚核苷酸而不因而影響細胞內的其他編碼聚核苷酸(譬如基因)的表現，其中該特異性抑制係於該細胞內達成。

昆蟲：在本案論及害蟲使用時，術語「昆蟲害蟲」特異性地包括鞘翅目昆蟲害蟲與半翅目昆蟲害蟲。在一些具體例中，該術語亦包括一些其他昆蟲害蟲。

單離：一「單離」生物組分(例如核酸或蛋白質)已從該組分天然存在之生物細胞內的其他生物組分實質上分離、製造、或純化(即，其他染色體與染色體外DNA與RNA、和蛋白質)，同時在該組分產生化學或功能變化(譬如一核酸可藉由打斷連結該核酸至染色體其餘DNA的化學鍵而從染色體單離)。已被「單離」的核酸分子與蛋白質包括藉由標準純化方法純化的核酸分子與蛋白質。該術語亦涵括藉由在宿主細胞重組表現製備的核酸與蛋白質，以及化學合成的核酸分子、蛋白質、與肽。

核酸分子：用於本案時，術語「核酸分子」可指稱核苷酸的聚合形式，其可包括RNA、cDNA、gDNA的正股與反股，以及合成形式與上述的混合聚合物。一核苷酸或核鹼基可指稱核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、或兩類核苷酸的修飾形式。「核酸分子」在用於本案時係同義於「核酸」與「聚核苷酸」。核酸分子通常為至少10個鹼基長度，除非另有指明。慣例上，核酸分子的核苷酸序列係自分子5'端讀至3'端。核酸分子的「互補體」指的是具有可和該核酸分子的核鹼基形成鹼基對(即，A-T/U、與G-C)的核鹼基的一聚核苷酸。

一些具體例包括包含一模板DNA的核酸，其係轉錄成一RNA分子，其為一mRNA分子的互補體。在該等具體例中，該轉錄成mRNA分子的核酸的互補體係以5’至3’方向出現，俾使RNA聚合酶(其以5’至3’方向轉錄DNA)將從該互補體轉錄一核酸，其可雜交至mRNA分子的互補體。除另有明確陳述之外，或從上下文清楚看出其他方式，術語「互補體」因此指的是具有可和參考核酸之核鹼基自5’至3’形成鹼基對的核鹼基的聚核苷酸。同樣地，除另有明確陳述之外(或從上下文清楚看出其他方式)，核酸的「反向互補體」指的是呈相反方向的互補體。前述係以下列例子展示： 5’ATGATGATG 3’聚核苷酸

5’TACTACTAC 3’聚核苷酸的「互補體」

5’CATCATCAT 3’聚核苷酸的「反向互補體」

本發明一些具體例包括髮夾RNA-生成iRNA分子。在該等iRNAs中，RNA干擾所靶向的核酸的互補體與反向互補體可在相同分子找到，俾使單股RNA分子可「折起」且以包含該互補與反向互補聚核苷酸之區自體雜交，如下列繪圖所展示：5’AUGAUGAUG-聯結子聚核苷酸-CAUCAUCAU 3’，其雜交形成：

「核酸分子」包括所有聚核苷酸，舉例來說：DNA的單-與雙股形式；RNA的單股；及RNA(dsRNA)的雙股形式。術語「核苷酸序列」或「核酸序列」指的是核酸的正股與反股作為個別單股或位於雙螺旋。術語「核糖核酸(RNA)」包括了iRNA(抑制性RNA)、dsRNA(雙股RNA)、siRNA(小型干擾RNA)、mRNA(信使RNA)、miRNA(微-RNA)、shRNA(小型髮夾RNA)、hpRNA(髮夾RNA)、tRNA(運送RNAs，無論連同對應醯化胺基酸呈帶電或未帶電)、與cRNA(互補RNA)。術語「去氧核糖核酸」(DNA)包括了cDNA、gDNA、及DNA-RNA雜交物。術語「聚核苷酸」、「核酸」、彼等的「區段(區段s)」、及彼等的「片段 (fragments)」被熟習此藝者理解為包括，舉例來說，gDNAs；核糖體RNAs；運送RNAs；RNAs；信使RNAs；操縱組；編碼或可適於編碼肽、多肽、或蛋白質的小型改造聚核苷酸；以及在核酸分子之內被其對應核苷酸序列劃定的結構性及/或功能性元件。

寡聚核苷酸：寡聚核苷酸為短的核酸聚合物。寡聚核苷酸可藉由切割長的核酸區段、或藉由聚合個別核苷酸前驅物來形成。自動化合成儀允許合成高達數百個鹼基對長度的寡核苷酸。因為寡聚核苷酸可結合至一互補核酸，彼等可用作偵測DNA或RNA的探針。由DNA(寡聚去氧核糖核苷酸)構成的寡聚核苷酸可用於PCR，一種用於擴增DNA與RNA(反向轉錄成為cDNA)序列的技術。在PCR，寡聚核苷酸通常被稱作「引子」，其容許DNA聚合酶延長寡核苷酸並複製互補股。

一核酸分子可包括藉由天然存在及/或非天然存在的核苷酸聯結方式聯結在一起的天然存在與修飾核苷酸之一或兩者。熟習此藝者將輕易理解到的是，核酸分子可以化學方式或生物方式修飾，或可含有非天然或衍化核苷酸鹼基。此類修飾包括，舉例來說，標記、甲基化、以類似物取代一或多個天然存在核苷酸、核苷酸內修飾(譬如未帶電聯結：舉例來說，甲基膦酸酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯等等；帶電聯結：舉例來說，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等等；側基部分：舉例來說，肽；內嵌劑：舉例來說，吖啶、補骨脂等等；螯合劑；烷化劑；和修飾性聯接：舉例來說，甲型端基異構核酸等等)。術語「核酸分子」亦包括任何拓撲構形，包括單-股、雙-股、部分地雙螺旋、三螺旋、髮夾型、環型、以及鎖型構形。

在本案關於DNA使用時，術語「編碼聚核苷酸」、「結構性聚核苷酸」、或「結構性核酸分子」指的是透過轉錄與mRNA-在置於適當調控元件控制時-最終轉譯成一多肽的一聚核苷酸。關於RNA，術語「編碼聚核苷酸」指的是轉譯成肽、多肽、或蛋白質的一聚核苷酸。一編碼聚核苷酸的邊界是由5'-端的轉譯起始密碼子與3'-端的轉譯停止密碼子決定。編碼聚核苷酸包括，但不限於：gDNA；cDNA；ESTs；和重組聚核苷酸。

用於本案時，「所轉錄的非編碼聚核苷酸」指的是不轉譯成肽、多肽、或蛋白質的mRNA分子區段，例如5'UTR、3'UTR與內含子區段。再者，「所轉錄的非編碼聚核苷酸」指稱轉錄成在細胞發揮功能的RNA的核酸，舉例來說，結構性RNAs(譬如核糖體RNA(rRNA)，例子有5S rRNA、5.8S rRNA、16S rRNA、18S rRNA、23S rRNA、與28S rRNA、及等等)；運送RNA(tRNA)；與snRNAs，例如U4、U5、U6、及等等。所轉錄的非編碼聚核苷酸亦包括，舉例來說，而不限於，小型RNAs(sRNA)，該術語經常用於說明小型細菌非編碼RNAs；小核仁RNAs(snoRNA)；微RNAs；小型干擾RNAs(siRNA)；Piwi-交互作用RNAs(piRNA)；與長的非編碼RNAs。又再者，「所轉錄的非編碼聚核苷酸」指稱可原生存在於核酸的基因內「間隔子」且轉錄成RNA 分子的聚核苷酸。

致死RNA干擾：用於本案時，術語「致死RNA干擾」指稱導致，舉例來說，經傳遞dsRNA、miRNA、siRNA、及/或hpRNA之個體死亡或降低存活力的RNA干擾。

基因組：用於本案時，術語「基因組」指稱在細胞細胞核發現的染色體DNA，亦指稱在細胞的亞細胞組分發現的胞器DNA。在本發明一些具體例中，可將DNA分子引進植物細胞，俾使該DNA分子嵌入植物細胞的基因組。在該等與進一步具體例中，該DNA分子可嵌入植物細胞的細胞核DNA、或嵌入植物細胞的葉體綠或粒線體DNA。術語「基因組」在應用至細菌時是指稱細菌細胞的染色體與質體兩者。在本發明一些具體例中，可將DNA分子引進細菌，俾使該DNA分子嵌入細菌的基因組。在該等與進一步具體例中，該DNA分子可嵌入染色體或定位為或定位於穩定的質體。

序列一致性：本案針對兩個聚核苷酸或多肽使用的術語「序列一致性」或「一致性」指稱-當在特定比對窗口以最大對應性對齊時-兩分子序列內的相同殘基。

用於本案時，術語「序列一致性百分比」可指稱在比對窗口比對一分子的兩個最佳化對齊序列(譬如核酸序列或多肽序列)所決定的值，其中在相比於參考序列(其不包含添加或刪除)以供兩個序列的最佳化對齊時，在比對窗口的序列部分可包含添加或刪除(即空隙)。百分比係藉由下列計算：決定兩序列中存在一致性核苷酸或胺基酸殘基的位置數目以生成配對位置數目、將配對位置數目除以比對窗口中的全部位置數目、並將結果乘以100以生成序列一致性百分比。比對參考序列在每個位置皆一致的序列被稱作和參考序列100%一致，反之亦然。

對齊序列以供比對的方法在本領域係眾所周知。各式程式與對齊演算法係說明於，舉例來說：Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444；Higgins and Sharp(1988)Gene 73：237-44；Higgins and Sharp(1989)CABIOS 5：151-3；Corpet et al.(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang et al.(1992)Comp.Appl.Biosci.8：155-65；Pearson et al.(1994)Methods Mol.Biol.24：307-31；Tatiana et al.(1999)FEMS Microbiol.Lett.174：247-50。序列對齊方法與同源性計算的詳細考量可在譬如Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10找到。

國家生技資訊中心(NCBI)鹼基局部對齊搜尋工具(Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST®；Altschul et al.(1990))可得自數個來源，包括國家生技資訊中心(Bethesda,MD)、與網路上，以連同數個序列分析程式使用。如何使用此程式決定序列一致性的說明可在網路上於BLAST®的“幫助(help)”章節取得。就核酸序列比對而言，可使用預設BLOSUM62矩陣設置為預設參數運用BLAST®(Blastn)程式的「比對兩個序列(Blast 2 sequences)」功能。和參考聚核苷酸序列具甚至更大序列相似度的核酸在藉此方法評估時將顯示增多之一致性百分比。

特異性地雜交/特異性地互補：用於本案時，術語「特異性地雜交」與「特異性地互補」為指出足夠互補程度，俾使核酸分子與標靶核酸分子之間發生穩定的特異性結合的術語。兩核酸分子之間的雜交涉及在兩核酸分子的核鹼基之間形成反向平行對齊。該兩分子隨後能夠和相對股上的對應鹼基形成氫鍵，而形成使用本領域眾所周知的方法可偵測到的雙螺旋分子，假使該分子足夠穩定。一聚核苷酸不必100%互補於欲特異性地雜交之標靶核酸。然而，必須存在以使雜交具特異性的互補性份量係為所使用雜交條件的函數。

產生特定嚴苛度的雜交條件將取決於挑選的雜交方法本質和雜交核酸序列的組成物與長度而有所不同。一般而言，雜交溫度與雜交緩衝液的離子強度(尤其是Na⁺及/或Mg⁺⁺濃度)將決定雜交嚴苛性，儘管洗滌時間亦影響嚴苛性。關於實現特定嚴苛度所必需的雜交條件的計算係熟習此藝者所習知的，並在舉例來說，Sambrook et al.(ed.)Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2^nd ed.,vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989,chapters 9 and 11；與Hames and Higgins(eds.)Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,Oxford,1985中有討論。關於核酸雜交的進一步詳細指示與指導可在，舉例來說，Tijssen,“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,”in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I,Chapter 2,Elsevier,NY,1993；與Ausubel et al.,Eds.,Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 2,Greene Publishing and Wiley-Interscience,NY,1995，和更新版本中找到。

用於本案時，「嚴苛條件」係涵蓋雜交僅會-在假使雜交分子與標靶核酸分子內的同源性序列之間有少於20%未配對-發生的條件。「嚴苛條件」包括另外的特定嚴苛性位準。於是，用於本案時，「中度嚴苛性」條件為該等具多於20%序列未配對之分子將不會雜交的條件；「高度嚴苛性」條件為該等具多於10%未配對之序列將不會雜交的條件；以及「極高度嚴苛性」條件為該等具多於5%未配對之序列將不會雜交的條件。

下列為代表性、非設限雜交條件。

高度嚴苛條件(偵測共享至少90%序列一致性的聚核苷酸)：在5x SSC緩衝液於65℃雜交16小時；在2x SSC緩衝液於室溫洗滌兩次，各為15分鐘；以及在0.5x SSC緩衝液於65℃洗滌兩次，各為20分鐘。

中度嚴苛條件(偵測共享至少80%序列一致性的聚核苷酸)：在5x-6x SSC緩衝液於65-70℃雜交16-20小時；在2x SSC緩衝液於室溫洗滌兩次，各為5-20分鐘；以及在1x SSC緩衝液於55-70℃洗滌兩次，各為30分鐘。

非嚴苛控制條件(共享至少50%序列一致性的聚核苷酸將會雜交)：在6x SSC緩衝液於室溫至55℃雜交16-20小時；在2x-3x SSC緩衝液於室溫至55℃洗滌至少兩次，各為20-30分鐘。

用於本案時，關於核酸的術語「實質上同源」或「實質同源性」指稱具有在嚴苛條件下雜交至參考核酸之鄰接核鹼基的聚核苷酸。舉例來說，實質上同源於SEQ ID NOs：1、3-6、84-88、102、104、107、與109之任一者的參考核酸的核酸為該等在嚴苛條件下(譬如列舉的中度嚴苛條件，見上文)雜交至SEQ ID NOs：1、3-6、84-88、102、104、107、與109之任一者的參考核酸的核酸。實質上同源的聚核苷酸可具有至少80%序列一致性。舉例來說，實質上同源的聚核苷酸可具有約80%至100%序列一致性，例如79%；80%；約81%；約82%；約83%；約84%；約85%；約86%；約87%；約88%；約89%；約90%；約91%；約92%；約93%；約94%；約95%；約96%；約97%；約98%；約98.5%；約99%；約99.5%；及約100%。實質同源性的特性與特異性雜交密切相關。舉例來說，一核酸分子在有足夠互補程度時可特異性地雜交，以避免在特異性結合係為所欲的條件下，舉例來說，在嚴苛雜交條件下，核酸非特異性結合至非標靶聚核苷酸。

用於本案時，術語「同系物(ortholog)」指稱在二或多個物種內從共同袓先核酸演化並在該二或多個物種內可保留相同功能的基因。

用於本案時，當聚核苷酸的每一個核苷酸以5'至 3'方向讀取時係互補於另一聚核苷酸的每一個核苷酸以3'至5'方向讀取時，兩個核酸分子被稱為展現「完全互補性」。互補於參考聚核苷酸的聚核苷酸將展現和參考聚核苷酸的反向互補體的序列一致性。該等術語與說明在本領域中係明確定義且為具本領域通常知識者所容易理解的。

操作性地聯結：當一第一聚核苷酸與一第二聚核苷酸呈功能性關聯時，該第一聚核苷酸係和該第二聚核苷酸操作性地聯結。當重組地製造時，以及，在有必要接合在相同讀取框(譬如在轉譯融合的ORF)的兩蛋白質-編碼區域時，操作性地聯結的核酸序列一般為鄰接。然而，核酸不需鄰接以操作性地聯結。

在提及調控基因元件與編碼聚核苷酸所使用的術語「操作性地聯結」意指調控元件影響所聯結編碼聚核苷酸的表現。「調控元件」或「控制元件」指稱影響轉錄時點與位準/份量、RNA加工或穩定性、或相連編碼聚核苷酸轉譯的聚核苷酸。調控元件可包括促進子；轉譯前導子；內含子；增強子；主幹-環圈結構；抑制子結合聚核苷酸；帶有終止序列的聚核苷酸；帶有聚腺苷酸化識別序列的聚核苷酸；等等。特定調控元件可位於操作性地聯結至彼等的編碼聚核苷酸上游及/或下游。又，操作性地聯結至一編碼聚核苷酸的特定調控元件可位於雙股核酸分子的相連互補股上。

促進子：用於本案時，術語「促進子」指稱可在轉錄起點上游且可涉及啟始轉錄的RNA聚合酶與其他蛋白之識別與結合的DNA區域。一促進子可操作性地聯結至一編碼聚核苷酸以供在細胞中表現、或一促進子可操作性地聯結至一編碼信號肽的聚核苷酸，該信號肽可操作性地聯結至一編碼聚核苷酸以供在細胞中表現。「植物促進子」可為能夠在植物細胞內啟始轉錄的促進子。在發育控制之下的促進子例子包括偏好在某些組織啟始轉錄的促進子，例如葉、根、種子、纖維、木質部導管、管胞、或厚壁組織。此類促進子被稱作「組織-偏好性」。僅在某些組織啟始轉錄的促進子被稱作「組織-特異性」。「組織-特異性」促進子主要驅動在一或多個器官中的某些細胞類型的表現，舉例來說，根或葉中的維管束細胞。「可誘發」促進子可為可受到環境控制的促進子。藉由可誘發促進子可啟始轉錄的環境條件例子包括厭氧條件與光照。組織-特異性、組織-偏好性、細胞類型-特異性、及可誘發促進子構成「非-組成性」促進子類別。

任何可誘發促進子可用於本發明一些具體例。見Ward et al.(1993)Plant Mol.Biol.22：361-366。藉由可誘發促進子，回應誘發劑的轉錄率增加了。例示性可誘發促進子包括，但不限於：回應銅的來自ACEI系統的促進子；回應苯磺醯胺除草劑安全劑的來自玉米的In2基因；來自Tn10的Tet抑制子；與來自類固醇激素基因的可誘發促進子，其轉錄活性可被糖皮質類固醇激素誘發(Schena et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：0421)。

例示性組成促進子包括，但不限於：來自植物病毒的促進子，例如來自花椰菜鑲嵌病毒(CaMV)的35S促進子；來自水稻肌動蛋白基因的促進子；泛素促進子；pEMU；MAS；玉蜀黍H3組蛋白促進子；與ALS促進子，Xba1/NcoI片段5'至油菜ALS3結構基因(或類似於該Xba1/NcoI片段的聚核苷酸)(國際PCT公開案編號WO96/30530)。

此外，任何組織-特異性或組織-偏好性促進子可利用在本發明的一些具體例。以包含操作性地聯結至一組織特異性促進子之一編碼聚核苷酸的核酸分子轉形的植物可在特定組織中專一地、或偏好地製造所編碼聚核苷酸的產物。例示性組織-特異性或組織-偏好性促進子包括，但不限於：種子-偏好性促進子，例如來自菜豆基因者；葉-特異性與光-誘發促進子，例如來自cab或植物加氧酶(rubisco)的促進子；花粉囊-特異性促進子，例如來自LAT52者；花粉-特異性促進子，例如來自Zm13者；以及小孢子-偏好性促進子，例如來自apg者。

大豆植物：用於本案時，術語「大豆植物」指稱大豆屬(Glycine sp)物種的植物，舉例來說，大豆(G.max)。

轉形：用於本案時，術語「轉形」或「轉導」指稱轉移一或多個(複數個)核酸分子進入細胞。當一核酸分子變成穩定被一細胞複製時，無論藉由核酸分子併入細胞基因組、或藉由游離基因複製，則該細胞被轉導進入細胞的該核酸分子「轉形」。用於本案時，術語「轉形」涵蓋可藉以將一核酸分子引進此類細胞的所有技術。例子包括，但不限於：以病毒載體轉染；以質體載體轉形；電穿孔(Fromm et al.(1986)Nature 319：791-3)；脂質轉染(Felgner et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7)；顯微注射(Mueller et al.(1978)Cell 15：579 85)；農桿菌-介導的轉移(Fraley et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803-7)；直接DNA攝取；以及微彈轟擊bombardment(Klein et al.(1987)Nature 327：70)。

轉殖基因：一外源性核酸。在一些例子中，一轉殖基因可為編碼能夠形成dsRNA分子之RNA的一或兩(多)股的DNA，其包含互補於在鞘翅目及/或半翅目害蟲中所找到的核酸分子的聚核苷酸。在另外的例子中，一轉殖基因可為一基因(譬如除草劑-耐受基因、編碼工業上或藥學上有用化合物的基因、或編碼所欲農業性狀的基因)。在該等與其他例子中，轉殖基因可含有操作性地聯結至該轉殖基因的編碼聚核苷酸的調控元件(譬如促進子)。

載體：一種引進細胞-舉例來說-以製造轉形細胞的核酸分子。一載體可包括容許其在宿主細胞內複製的基因元件，例如複製起點。載體的例子包括，但不限於：攜帶外源性DNA進入細胞的質體；黏接質體；噬菌體；或病毒。一載體亦可包括一或多個基因，包括本領域習知製造反股分子、及/或可擇標記基因及其他基因元件。一載體可轉導、轉形、或轉染細胞，藉此致使該細胞表現該載體所編碼的核酸分子及/或蛋白質。一載體任擇地包括有助於實現核酸分子進入細胞的材料(譬如脂質體、蛋白質外衣等等)。

產量：在相同生長位置於相同時間與相同條件下生長，相較於檢查品種產量之約100%或更大穩定產量。在特定具體例中，「改良之產量(improved yield)」或「改良產量(improving yield)」意指-在含有有損於在相同時間與相同條件下生長的作物的鞘翅目及/或半翅目害蟲顯著密度的相同生長位置-具有相較於檢查品種產量之105%或更大穩定產量的栽培種，該害蟲係為本案組成物與方法所靶向。

除明確指示或暗示以外，術語「一(a)」、「一(an)」、與「該(the)」用於本案時象徵「至少一個」。

除非另有明確解釋，否則本案使用的所有技術性與科學性術語係具有本揭示內容所屬領域中具有通常技藝者所一般理解的相同意義。分子生物學中的常用術語定義可在，舉例來說，Lewin’s Genes X,Jones & Bartlett Publishers,2009(ISBN 10 0763766321)；Krebs et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；與Meyers R.A.(ed.),Molecular Biology and Biotechnology：A Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)找到。所有百分比係以重量計且所有溶劑混合物比例係以體積計，除非另有註記。所有溫度為攝氏度。

IV. 包含昆蟲害蟲聚核苷酸的核酸分子 A. 概觀

本案所揭露的是可用於控制昆蟲害蟲的核酸分子。在一些例子中，該昆蟲害蟲為鞘翅目或半翅目昆蟲害蟲。所述核酸分子包括標靶聚核苷酸(譬如原生基因、與非編碼聚核苷酸)、dsRNAs、siRNAs、shRNAs、hpRNAs、與miRNAs。舉例來說，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、及/或hpRNA分子係在一些具體例中說明，該等可特異性地互補至鞘翅目及/或半翅目害蟲內一或多個原生核酸的全部或部分。在該等與進一步具體例中，(多個)原生核酸可為一或多個(多個)標靶基因，其產物可為，舉例來說而不限於：涉及幼蟲/若蟲發育。本案所述核酸分子-當被引進包含該核酸分子所特異性地互補之至少一個(多個)原生核酸的細胞時-可啟始細胞的RNAi，結果減少或消除該(多個)原生核酸的表現。在一些例子中，特異性地互補至標靶基因之核酸分子所致的減少或消除該標靶基因表現可造成減少或停止害蟲生長、發育、及/或進食。

在一些具體例中，在昆蟲害蟲的至少一個標靶基因可被選定，其中該標靶基因包含Gho/Sec24B2或Sec24B1聚核苷酸。在特定例子中，在鞘翅目或半翅目害蟲的一標靶基因被選定，其中該標靶基因包含選自SEQ ID NOs：1、84、85、102、與107的一聚核苷酸。

在一些具體例中，一標靶基因可為包含可以電腦模擬(in silico)轉譯成包含和Gho/Sec24B2或Sec24B1聚核苷酸的蛋白質產物胺基酸序列至少約85%一致(譬如至少84%、85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約100%、或100%一致)的鄰接胺基酸序列之多肽的聚核苷酸的核酸分子。一標靶基因可為昆蟲害蟲的任何Gho/Sec24B2或Sec24B1核酸，彼等的轉錄後抑制對害蟲的生長及/或存活具有不利效應，舉例來說，提供植物抵抗害蟲的保護益處。在特定例子中，一標靶基因是包含可以電腦模擬反向轉譯成包含和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：103、或SEQ ID NO：108之胺基酸序列至少約85%一致、約90%一致、約95%一致、約96%一致、約97%一致、約98%一致、約99%一致、約100%一致、或100%一致的鄰接胺基酸序列之多肽的聚核苷酸的核酸分子。

在一些具體例中所提供的是DNAs，其表現產生RNA分子，該RNA分子包含特異性地互補至昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲之一編碼聚核苷酸所編碼的一原生RNA分子的全部或一部分的聚核苷酸。在一些具體例中，在表現的RNA分子被昆蟲害蟲攝入後，可獲得害蟲細胞的編碼聚核苷酸被向下調控。在特定具體例中，昆蟲害蟲細胞的編碼序列被向下調控可造成對害蟲生長、發育、及/或存活的不利效應。

在一些具體例中，標靶聚核苷酸包括所轉錄的非編碼RNAs，例如5'UTRs；3'UTRs；剪接前導子；內含子；外含子(outron)(譬如之後在反向剪接修飾的5'UTR RNA)；予體子(donatrons)(譬如提供用於反向剪接的予體序列所需的非編碼RNA)；以及標靶昆蟲害蟲基因的其他非編碼的經轉錄RNA。此類聚核苷酸可衍生自單順反子和多順反子基因。

於是，本案亦連同一些具體例說明的是iRNA分子(譬如dsRNAs、siRNAs、miRNAs、shRNAs、與hpRNAs)，其包含特異性地互補至昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲內一標靶核酸之全部或一部分的至少一個聚核苷酸。在一些具體例中，一iRNA分子可包含互補至複數個標靶核酸之全部或一部分的(多個)聚核苷酸；舉例來說，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多個標靶核酸。在特定具體例中，一iRNA分子可在體外、或在例如植物或細菌之基因改造生物體內製造。亦揭露了可用於製造特異性地互補至昆蟲害蟲內一標靶核酸之全部或一部分的dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、shRNA分子、及/或hpRNA分子的cDNAs。另外說明了用於達到特定宿主標靶穩定轉形的重組DNA構築體。經轉形宿主標靶可表現來自該重組DNA構築體的dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、及/或hpRNA分子的有效位準。因此，也說明了一植物轉形載體，其包含操作性地聯結至在植物細胞內發揮功能的一異源性促進子的至少一個聚核苷酸，其中(多個)聚核苷酸的表現產生包含特異性地互補至昆蟲害蟲內一標靶核酸之全部或一部分的一串鄰接核鹼基RNA分子。

在特定例子中，可用來控制昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲的核酸分子可包括：單離自條葉甲屬包含Gho/Sec24B2或Sec24B1聚核苷酸的一原生核酸之全部或一部分(譬如SEQ ID NOs：1、102、與107之任一者)；在表現時產生包含特異性地互補至條葉甲屬Gho/Sec24B2或Sec24B1所轉錄的原生RNA分子之全部或一部分聚核苷酸的RNA分子的DNAs；包含特異性地互補至條葉甲屬Gho/Sec24B2或Sec24B1之全部或一部分的至少一個聚核苷酸的iRNA分子(譬如dsRNAs、siRNAs、miRNAs、shRNAs、與hpRNAs)；可用於製造特異性地互補至條葉甲屬Gho/Sec24B2或Sec24B1之全部或一部分的dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、shRNA分子、及/或hpRNA分子的cDNAs；單離自英雄美洲蝽包含Gho/Sec24B2或Sec24B1聚核苷酸的一原生核酸之全部或一部分(譬如SEQ ID NO：84與SEQ ID NO：85)；在表現時產生特異性地互補至英雄美洲蝽Gho/Sec24B2或Sec24B1所轉錄的一原生RNA分子之全部或一部分聚核苷酸的RNA分子的DNAs；包含特異性地互補至英雄美洲蝽Gho/Sec24B2或Sec24B1的至少一個聚核苷酸的iRNA分子(譬如dsRNAs、siRNAs、miRNAs、shRNAs、與hpRNAs)；可用於製造特異性地互補至英雄美洲蝽Gho/Sec24B2或Sec24B1的dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、shRNA分子、及/或hpRNA分子的cDNAs；和用於達到特定宿主標靶穩定轉形的重組DNA構築體，其中一經轉形宿主標靶包含前述核酸分子之一或多者。

B. 核酸分子

本發明尤其提供抑制昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲的細胞、組織、或器官之標靶基因表現的iRNA(譬如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、與hpRNA)分子；和能夠在細胞或微生物表現成iRNA分子的DNA分子，以抑制昆蟲害蟲的細胞、組織、或器官之標靶基因表現。

本發明一些具體例提供一種單離核酸分子，其可包含選自於由下列所構成之群組的至少一個(譬如一、二、三、或更多個)(多個)聚核苷酸：SEQ ID NOs：1、84、85、102、與107之任一者；SEQ ID NOs：1、84、85、102、與107之任一者的互補體；SEQ ID NOs：1、84、85、102、與107之任一者的至少15個鄰接核苷酸片段(譬如SEQ ID NOs：3-6、86-88、104、與109之任一者)；SEQ ID NOs：1、84、85、102、與107之任一者的至少15個鄰接核苷酸片段的互補體；包含SEQ ID NO：1、102、或107之條葉甲屬生物(譬如WCR)原生編碼聚核苷酸；包含SEQ ID NO：1、102、或107之條葉甲屬生物原生編碼聚核苷酸的互補體；包含SEQ ID NO：1、102、或107之條葉甲屬生物原生編碼聚核苷酸的至少15個鄰接核苷酸片段；包含SEQ ID NO：1、102、或107之條葉甲屬生物原生編碼聚核苷酸的至少15個鄰接核苷酸片段的互補體；包含SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：85之英雄美洲蝽生物原生編碼聚核苷酸；包含SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：85之英雄美洲蝽生物原生編碼聚核苷酸的互補體；包含SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：85之英雄美洲蝽生物原生編碼聚核苷酸的至少15個鄰接核苷酸片段；和包含SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：85之英雄美洲蝽生物原生編碼聚核苷酸的至少15個鄰接核苷酸片段的互補體。在特定具體例中，昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲接觸或攝入該單離聚核苷酸所轉錄的iRNA抑制該害蟲的生長、發育及/或進食。

在一些具體例中，本發明的單離核酸分子可包含選自於由下列所構成之群組的至少一個(譬如一、二、三、或更多個)(多個)聚核苷酸：SEQ ID NO：112；SEQ ID NO：112的互補體；SEQ ID NO：113；SEQ ID NO：113的互補體；SEQ ID NO：114；SEQ ID NO：114的互補體；SEQ ID NO：115；SEQ ID NO：115的互補體；SEQ ID NO：116；SEQ ID NO：116的互補體；SEQ ID NO：119；SEQ ID NO：119的互補體；SEQ ID NO：120；SEQ ID NO：120的互補體；SEQ ID NO：121；SEQ ID NO：121的互補體；SEQ ID NO：122；SEQ ID NO：122的互補體；SEQ ID NO：123；SEQ ID NO：123的互補體；SEQ ID NO：124；SEQ ID NO：124的互補體；SEQ ID NO：125；SEQ ID NO：125的互補體；SEQ ID NO：126；SEQ ID NO：126的互補體；SEQ ID NO：127；SEQ ID NO：127的互補體；SEQ ID NOs：112-116與119-127之任一者的至少15個鄰接核苷酸片段；SEQ ID NOs：112-116與119-127之任一者的至少15個鄰接核苷酸片段的互補體；在條葉甲屬生物內由包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、或SEQ ID NO：5之基因轉錄的原生聚核糖核苷酸；在條葉甲屬生物內由包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6之基因轉錄的原生聚核糖核苷酸的互補體；在條葉甲屬生物內由包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104 SEQ ID NO：107、或SEQ ID NO：109之基因轉錄的原生聚核糖核苷酸的至少15個鄰接核苷酸片段；在條葉甲屬生物內由包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：102、或SEQ ID NO：107之基因轉錄的原生聚核糖核苷酸的至少15個鄰接核苷酸片段的互補體；在英雄美洲蝽生物內由包含SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：85之基因轉錄的原生聚核糖核苷酸；在英雄美洲蝽生物內由包含SEQ ID NO：84或SEQ ID NOs：85-88之基因轉錄的原生聚核糖核苷酸的互補體；在英雄美洲蝽生物內由包含SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：85之基因轉錄的原生聚核糖核苷酸的至少15個鄰接核苷酸片段；和在英雄美洲蝽生物內由包含SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：85之基因轉錄的原生聚核糖核苷酸的至少15個鄰接核苷酸片段的互補體。在特定具體例中，鞘翅目及/或半翅目害蟲接觸或攝入該單離聚核苷酸抑制該害蟲的生長、發育及/或進食。

在一些具體例中，本發明的核酸分子可包含能夠在細胞或微生物表現成iRNA分子的至少一個(譬如一、二、三、或更多個)(多個)DNA，以抑制鞘翅目及/或半翅目害蟲的細胞、組織、或器官之標靶基因表現。此類(多個)DNA可操作性地聯結至在包含該DNA分子的細胞內發揮功能的一促進子，以啟始或增進能夠形成(多個)dsRNA分子的編碼RNA的轉錄。在一個具體例中，該至少一個(譬如一、二、三、或更多個)(多個)DNA可衍生自選自包含SEQ ID NOs：1與72之群組的聚核苷酸。SEQ ID NOs：1與72的衍生物包括SEQ ID NO：1及/或SEQ ID NO：72的片段。在一些具體例中，此類片段可包含，舉例來說，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：72 的至少約15個鄰接核苷酸、或彼等的互補體。於是，此類片段可包含，舉例來說，SEQ ID NO：1及/或SEQ ID NO：72的15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多個鄰接核苷酸、或彼等的互補體。在一些例子中，此類片段可包含，舉例來說，SEQ ID NO：1及/或SEQ ID NO：72的至少19個鄰接核苷酸(譬如19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30個鄰接核苷酸)、或彼等的互補體。

一些具體例包含將部分-或完全-穩定的dsRNA分子引進鞘翅目及/或半翅目害蟲，以抑制鞘翅目及/或半翅目害蟲的細胞、組織、或器官之標靶基因表現。當表現成iRNA分子(譬如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、與hpRNA)且被鞘翅目及/或半翅目害蟲攝入時，包含SEQ ID NOs：1、3、67、72、73、與彼等的互補體之任一者的一或多個片段的聚核苷酸可導致鞘翅目及/或半翅目害蟲死亡、發育中斷、生長抑制、性別比改變、減少孵育大小、停止侵染、及/或停止進食之一或多者。在特定例子中，包含SEQ ID NOs：1、3、67、72、73、與彼等的互補體之任一者的一或多個片段的聚核苷酸(譬如包括約15至約300個核苷酸的聚核苷酸)導致降低既有害蟲世代產生後續害蟲世代的能力。

在某些具體例中，本發明所提供的dsRNA分子包含互補至來自包含SEQ ID NOs：1、84、85、102、與107之任一者的標靶基因、與彼等的片段的聚核苷酸的一轉錄體，抑制昆蟲害蟲內的該標靶基因造成減少或去除就害蟲的生長、發育、或其他生物功能而言不可或缺的多肽或聚核苷酸物質。一選定聚核苷酸可展現和SEQ ID NOs：1、84、85、102、與107之任一者；SEQ ID NOs：1、84、85、102、與107的鄰接片段之任一者；及/或前述任一者的互補體之約80%至約100%的序列一致性。舉例來說，一選定聚核苷酸可展現和SEQ ID NOs：1、3-6、102、84-88、107、與109；SEQ ID NOs：1、3-6、84-88、102、104、107、與109及/或前述任一者的互補體；以及前述任一者的互補體之79%；80%；約81%；約82%；約83%；約84%；約85%；約86%；約87%；約88%；約89%；約90%；約91%；約92%；約93%；約94%約95%；約96%；約97%；約98%；約98.5%；約99%；約99.5%；或約100%的序列一致性。

在一些具體例中，能夠在細胞或微生物表現成iRNA分子以抑制標靶基因表現的一DNA分子可包含特異性地互補至在一或多個標靶昆蟲害蟲物種(譬如鞘翅目或半翅目害蟲物種)發現的一原生聚核苷酸之全部或一部分的一單一聚核苷酸，或該DNA分子可從複數個此類特異性地互補之聚核苷酸建構成嵌合體。

在一些具體例中，核酸分子可包含被「間隔子」隔開的一第一與一第二聚核苷酸。一間隔子可為包含任何核苷酸序列的一區，當有需要時，該間隔子有助於該第一與第二聚核苷酸之間形成二級結構。在一個具體例中，該間隔子是供mRNA用的正股或反股編碼聚核苷酸的一部分。該間隔子可另擇地包含能夠共價性地聯結至核酸分子的核苷酸或其同源物的任何組合。在一些例子中，該間隔子可為內含子(譬如ST-LS1內含子或RTM1內含子)。

舉例來說，在一些具體例中，該DNA分子可包含編碼一或多個不同iRNA分子的聚核苷酸，其中不同iRNA分子各別包含一第一聚核苷酸與一第二聚核苷酸，其中該第一與第二聚核苷酸彼此互補。該第一與第二聚核苷酸可藉由間隔子在一RNA分子內相連。該間隔子可構成該第一聚核苷酸或該第二聚核苷酸的一部分。包含該第一與第二核苷酸聚核苷酸之RNA分子的表現可藉由該第一與第二核苷酸聚核苷酸之特異性分子內鹼基配對進而形成dsRNA分子。該第一聚核苷酸或該第二聚核苷酸可和昆蟲害蟲(譬如鞘翅目或半翅目害蟲)的原生聚核苷酸(譬如標靶基因、或轉錄的非編碼聚核苷酸)、其衍生物、或其互補聚核苷酸實質上一致。

dsRNA核酸分子包含聚合的核糖核苷酸雙股，並可包括對於磷酸酯-糖骨架或核苷的修飾。RNA結構的修飾可量身訂做，以允許特異性抑制。在一個具體例中，dsRNA分子可經由泛素酶促過程修飾，俾使可生成siRNA分子。此酶促方法可利用RNase III酶，例如真核生物的DICER，在體外或體內。見Elbashir et al.(2001)Nature 411：494-8；與Hamilton and Baulcombe(1999)Science 286(5441)：950-2。DICER或功能上等效的RNAse III酶將較大的dsRNA股及/或hpRNA分子切成較小的寡聚核苷酸(譬如siRNAs)，各別約為長度19-25個核苷酸。該等酶製造的siRNA分子具有2至3個核苷酸的3'外掛物、和5'的磷酸酯與3'的羥基端。RNAse III酶所生成的siRNA分子在細胞內係開展並分成單股RNA。該siRNA分子隨後和標靶基因所轉錄的RNAs特異性地雜交，兩RNA分子之後被細胞固有的RNA-降解機制降解。此過程可在標靶生物內造成有效降解或去除標靶基因所編碼的RNA。此結果是所標靶之基因的轉錄後靜默。在一些具體例中，內源性RNAse III酶從異源性核酸分子製造的siRNA分子可有效率地介導鞘翅目及/或半翅目害蟲之標靶基因向下調控。

在一些具體例中，核酸分子可包括至少一個非天然存在的聚核苷酸，其可轉錄成能夠經由分子間雜交形成dsRNA分子的單股RNA分子。此類dsRNAs通常自體組合，並可提供於昆蟲(譬如鞘翅目或半翅目)害蟲的營養來源，以達到標靶基因的轉錄後抑制。在該等與進一步具體例中，一核酸分子可包含兩個不同非天然存在的聚核苷酸，各別特異性地互補至昆蟲害蟲的不同標靶基因。當此類核酸分子作為dsRNA分子提供給，舉例來說，鞘翅目及/或半翅目害蟲時，dsRNA分子抑制害蟲內至少兩個不同標靶基因的表現。

C. 獲得核酸分子

昆蟲(譬如鞘翅目及半翅目)害蟲的眾多聚核苷酸可用作設計核酸分子的標靶，例如編碼有iRNAs的iRNAs與DNA分子。然而，選擇原生聚核苷酸不是簡單的過程。舉例來說，僅有少數的鞘翅目或半翅目害蟲原生聚核苷酸將是有效標靶。無法確定地預測特定原生聚核苷酸是否可有效地被本發明核酸分子下調，或特定原生聚核苷酸的下調是否將對昆蟲害蟲的生長、發育及/或存活具有不利效應。絕大多數的原生鞘翅目及半翅目害蟲聚核苷酸，例如自其單離的ESTs(舉例來說，美國專利7,612,194所列的鞘翅目害蟲聚核苷酸)對害蟲的生長、發育、及/或存活並不具有不利效應。也無法預測哪個對昆蟲害蟲可具有不利效應的原生聚核苷酸能夠用於重組技術，以表現互補於宿主植物的此類原生聚核苷酸的核酸分子，並且在投予時對害蟲提供不利效應，而不造成宿主植物的損害。

在一些具體例中，核酸分子(譬如在昆蟲(譬如鞘翅目或半翅目)害蟲宿主植物內提供的dsRNA分子)係經選擇，以靶向編碼對害蟲發育而言不可或缺的蛋白質或蛋白質之部分，例如涉及代謝或酵解生化途徑、細胞分裂、能量代謝、消化、宿主植物辨識、及等等的多肽的cDNAs。如本案所述，含有一或多個dsRNAs的組成物被一標靶害蟲生物攝入一該一或多個dsRNAs的至少一個區段係特異性地互補至該標靶害蟲生物細胞製造的RNA的至少實質上一致區段一可造成該標靶死亡或其他抑制。衍生自昆蟲害蟲的聚核苷酸一DNA或RNA一可用於建構抵抗害蟲侵擾的植物細胞。鞘翅目及/或半翅目害蟲的宿主植物(譬如玉米或大豆)，舉例來說，可經轉形，以含有本案提供之衍生自鞘翅目及/或半翅目害蟲的一或多個聚核苷酸。經轉形進入宿主的聚核苷酸可編碼在經轉形宿主內之細胞或生物體液形成dsRNA結構的一或多個RNAs，於是使得假若/當該害蟲和該基因轉殖宿主形成營養關聯時，可得到該dsRNA。此可造成害蟲細胞之一或多個基因表現受到壓抑，最終死亡或抑制其生長或發育。

於是，在一些具體例中，基本上涉及昆蟲(譬如鞘翅目或半翅目)害蟲的生長與發育的一基因係被靶向。用於本發明的其他標靶基因可包括，舉例來說，在害蟲移動、遷徙、生長、發育、侵染性、與覓食點建立扮演重要角色的基因。標靶基因因此可為管家基因或轉錄因子。此外，用於本發明的原生昆蟲害蟲聚核苷酸亦可衍生自植物、病毒、細菌或昆蟲基因的同源物(譬如同系物)，其功能是熟習此藝者所習知的，且該聚核苷酸可和標靶害蟲基因組內的標靶基因特異性地雜交。以已知核苷酸序列藉由雜交識別基因同源物的方法是熟習此藝者所習知的。

在一些具體例中，本發明提供獲得一核酸分子的方法，該核酸分子包含用於製造iRNA(譬如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、與hpRNA)分子的聚核苷酸。一個此類具體例包含：(a)在昆蟲(譬如鞘翅目或半翅目)害蟲內在dsRNA-介導的基因壓抑後以表現、功能、與表型分析一或多個(多個)標靶基因；(b)以包含在dsRNA-介導的壓抑分析中展現改變的(譬如減少的)生長或發育表型的經靶向害蟲的聚核苷酸或其同源物之全部或一部分的探針探測一cDNA或gDNA庫；(c)識別和該探針特異性地雜交的DNA選殖體；(d)單離步驟(b)所識別的該DNA選殖體；(e)將包含步驟(d)所單離的選殖體的cDNA或gDNA片段定序，其中該經定序核酸分子包含該RNA或其同源物之全部或一實質部分；和(f)以化學方式合成一基因、或siRNA、miRNA、hpRNA、mRNA、shRNA、或dsRNA之全部或一實質部分。

在另外具體例中，獲得包含用於製造一iRNA(譬如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、與hpRNA)分子之實質部分的一聚核苷酸的一核酸片段的方法包括：(a)合成特異性地互補至來自經靶向昆蟲(譬如鞘翅目或半翅目)害蟲之原生聚核苷酸一部分的第一與第二寡聚核苷酸引子；和(b)使用步驟(a)的該第一與第二寡聚核苷酸引子擴增存在於選殖載體的一cDNA或gDNA插入序列，其中該擴增的核酸分子包含siRNA、miRNA、hpRNA、mRNA、shRNA、或dsRNA分子之實質部分。

核酸可藉由許多方式單離、擴增、或製造。舉例來說，iRNA(譬如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、與hpRNA)分子可藉由衍生自gDNA或cDNA庫的標靶聚核苷酸(譬如標靶基因或標靶所轉錄的非編碼聚核苷酸)、或其部分的PCR擴增獲得。DNA或RNA可從標靶生物抽取，核酸庫可使用熟習此藝者熟知的方法從彼等製備。從標靶生物生成的gDNA或cDNA庫可用於標靶基因的PCR擴增與定序。經確認的PCR產物可用於在體外轉錄以最少促進子生成正股與反股RNA的模板。或者，核酸分子可藉由許多技術的任一者合成(參閱，譬如Ozaki et al.(1992)Nucleic Acids Research,20：5205-5214；and Agrawal et al.(1990)Nucleic Acids Research,18：5419-5423)，包括使用自動化DNA合成儀(舉例來說，P.E.Biosystems,Inc.(Foster City,Calif.)型號392或394 DNA/RNA合成儀)、使用標準化學方法，例如磷醯胺化學方法。參閱，譬如Beaucage et al.(1992)Tetrahedron,48：2223-2311；美國專利4,980,460、4,725,677、4,415,732、4,458,066、與4,973,679。亦可運用產生非天然骨架基團的另擇化學方法，例如硫代磷酸酯、亞磷醯胺等等。

本發明的RNA、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、或hpRNA分子可藉由熟習此藝者經由手動或自動化反應、或在包含著包含編碼該RNA、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、或hpRNA分子之聚核苷酸的核酸分子的細胞體內以化學方式或酶促方式製造。RNA亦可藉由部分或全有機合成-可藉由體外酶促或有機合成引進任何經修飾核糖核苷酸。RNA分子可藉由細胞RNA聚合酶或噬菌體RNA聚合酶(譬如T3 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、與SP6 RNA聚合酶)合成。可用於選殖與聚核苷酸表現的表現構築體是本領域所習知的。參閱，譬如國際PCT公開案編號WO97/32016；以及美國專利5,593,874、5,698,425、5,712,135、5,789,214、與5,804,693。化學合成或藉由體外酶促合成的RNA分子可在引進細胞之前純化。舉例來說，RNA分子可藉由溶劑或樹脂提取、沉澱、電解、層析、或彼等之組合從混合物中純化。或者，化學合成或藉由體外酶促合成的RNA分子可以無純化或最少地純化來使用，舉例來說，以避免樣本加工所導致的損失。該RNA分子可乾燥儲存或溶於水溶液。溶液可含有緩衝液或鹽，以促進dsRNA分子雙股的黏合、及/或穩定。

在具體例中，dsRNA分子可藉由單一自身互補的RNA股或兩條互補的RNA股形成。dsRNA分子可在體內或體外合成。細胞的內源性RNA聚合酶可在體內介導該一或兩股RNA的轉錄，或選殖的RNA聚合酶可用於在體內或體外介導轉錄。昆蟲害蟲之標靶基因的轉錄後抑制可為宿主-靶向型，其藉由宿主之器官、組織、或細胞類型的特異性轉錄(譬如使用組織特異性促進子)；宿主的環境條件刺激(譬如使用回應至感染、脅迫、溫度、及/或化學誘導劑的可誘導促進子)；及/或在宿主發育階段或育齡的改造轉錄(譬如使用發育階段-特異性促進子)。形成dsRNA分子的RNA股-無論在體外或體內轉錄-可或可不為聚腺苷酸化，且可或可不能夠被細胞的轉譯裝置轉譯成多肽。

D. 重組載體與宿主細胞轉形

在一些具體例中，本發明亦提供用於引進細胞(譬如細菌細胞、酵母細胞、或植物細胞)的DNA分子，其中該DNA分子包含-在表現成RNA並被昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲攝食後-實現壓抑害蟲細胞、組織、或器官之標靶基因的聚核苷酸。於是，一些具體例提供一種重組核酸分子，其包含能夠在植物細胞表現成iRNA(譬如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、與hpRNA)分子的聚核苷酸，以抑制昆蟲害蟲的標靶基因表現。為了啟始或增進表現，此類重組核酸分子可包含一或多個調控元件，該調控元件可操作性地聯結至能夠表現成iRNA的聚核苷酸。在植物中表現基因壓抑分子的方法是習知的，並可用來表現本發明的聚核苷酸。參閱，譬如國際PCT公開案編號WO06/073727；以及美國專利公開案編號2006/0200878 A1。

在明確具體例中，本發明的重組DNA分子可包含編碼有可形成dsRNA分子之RNA的聚核苷酸。此類重組DNA分子可編碼有在攝食後可形成能夠抑制昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲細胞的(多個)內源性標靶基因表現的dsRNA分子的RNAs。在許多具體例中，所轉錄的RNA可形成可以穩定形式提供的dsRNA分子；譬如像是髮夾型與莖環型結構。

在一些具體例中，一股dsRNA分子可藉由從實質上同源於選自於由下列所構成之群組的聚核苷酸轉錄形成：SEQ ID NOs：1、84、85、102、與107之任一者；SEQ ID NOs：1、84、85、102、與107之任一者的互補體；SEQ ID NOs：1、84、85、102、與107(譬如SEQ ID NOs：3-6、86-88、104、與109)之任一者的至少15個鄰接核苷酸片段；SEQ ID NOs：1、84、85、102、與107之任一者的至少15個鄰接核苷酸片段的互補體；包含SEQ ID NOs：1、3-6、102、104、107、與109之任一者之任一者的條葉甲屬生物(譬如WCR)原生編碼聚核苷酸；包含SEQ ID NOs：1、3-6、102、104、107、與109之任一者的條葉甲屬生物原生編碼聚核苷酸的互補體；包含1、3-6、102、104、107、與109之任一者的條葉甲屬生物原生編碼聚核苷酸的至少15個鄰接核苷酸片段；包含1、3-6、102、104、107、與109之任一者的條葉甲屬生物原生編碼聚核苷酸的至少15個鄰接核苷酸片段的互補體；包含SEQ ID NOs：84-88之任一者的英雄美洲蝽生物(即BSB)原生編碼聚核苷酸；包含SEQ ID NOs：84-88之任一者的英雄美洲蝽生物原生編碼聚核苷酸的互補體；包含SEQ ID NOs：84-88之任一者的英雄美洲蝽生物原生編碼聚核苷酸的至少15個鄰接核苷酸片段；和包含SEQ ID NOs：84-88之任一者的英雄美洲蝽生物原生編碼聚核苷酸的至少15個鄰接核苷酸片段的互補體。

在一些具體例中，一股dsRNA分子可藉由從實質上同源於選自於由下列所構成之群組的聚核苷酸轉錄形成：SEQ ID NOs：3-6、86-88、104、與109之任一者；SEQ ID NOs：3-6、86-88、104、與109之任一者的互補體；SEQ ID NOs：3-6、86-88、104、與109之任一者的至少15個鄰接核苷酸片段；和SEQ ID NOs：3-6、86-88、104、與109之任一者的至少15個鄰接核苷酸片段的互補體。在特定例子中，dsRNA藉由從包含SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19的聚核苷酸轉錄形成。

在特定具體例中，編碼有可形成dsRNA分子之RNA的一重組DNA分子可包含一編碼區，其中至少兩個聚核苷酸係經排列，俾使相對於至少一個促進子，一聚核苷酸係於正股方向，另一聚核苷酸係於反股方向，其中該正股聚核苷酸與反股聚核苷酸是藉由帶有，舉例來說，約五(~5)至約一千個(~1000)核苷酸的間隔子聯結或連結。該間隔子可在正股與反股聚核苷酸之間形成環圈。正股聚核苷酸或反股聚核苷酸可實質上同源於標靶基因(譬如包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：102、或SEQ ID NO：107的Gho/Sec24B2基因或Sec24B1基因)或彼等的片段。在一些具體例中，然而，重組DNA分子可編碼可形成無間隔子之dsRNA分子的RNA。在具體例中，正股編碼聚核苷酸與反股編碼聚核苷酸可為不同長度。

經由在本發明的重組核酸分子創建適當的表現匣，被識別具有針對昆蟲害蟲之不利效應或關於害蟲之植物保護效應的聚核苷酸可輕易地併入表現的dsRNA分子。舉例來說，此類聚核苷酸可藉下列表現成帶有莖幹與環圈結構的髮夾：取對應於標靶基因聚核苷酸(譬如包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：102、或SEQ ID NO：107的Gho/Sec24B2基因或Sec24B1基因，前述之任一者的片段)的一第一區段；將此聚核苷酸聯結至不同源或互補至該第一區段的一第二區段間隔子區域；並將此聯結至一第三區段，其中該第三區段的至少一部分係實質上互補至該第一區段。此類構築體藉由第一區段和第三區段的分子內鹼基配對形成莖幹與環圈結構，其中該環圈結構形成為包含該第二區段。參閱，譬如美國專利公開案編號2002/0048814與2003/0018993；與國際PCT公開案編號WO94/01550與WO98/05770。一dsRNA分子可以，舉例來說，雙股結構的形式，例如莖幹-環圈結構(譬如髮夾)生成，從而藉由，舉例而言，在額外的植物可表現匣上的所靶向基因片段的共同表現，所靶向原生昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲聚核苷酸的siRNA製造增強了，其產生增強之siRNA製造，或減少甲基化以避免dsRNA髮夾促進子的轉錄基因靜默。

本發明之具體例包括將本發明的重組核酸分子引進植物(即，轉形)，以達到一或多個iRNA分子表現的昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲-抑制位準。重組DNA分子可為，舉例來說，載體，例如線性或密閉環狀質體。載體系統可為單一載體或質體、或共同含有欲引進宿主基因組的總DNA的兩或多個載體或質體。除此之外，載體可為表現載體。本發明的核酸可以，舉例來說，適用於嵌入在一或多個宿主中發揮功能的適宜促進子控制之下的載體，以驅動所聯結之編碼聚核苷酸或其他DNA元件的表現。有許多載體可用於此目的，適當載體的選擇將主要取決於欲嵌入載體的核酸尺寸及欲以該載體轉形的特定宿主細胞。各別載體含有取決於其功能(譬如DNA擴增或DNA表現)的各式各樣組分及其所相容的特定宿主細胞。

為賦予基因轉殖植物免於昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲的保護作用，重組DNA可以，舉例來說，轉錄成重組植物組織或體液之內的iRNA分子(譬如形成dsRNA分子的RNA分子)。一iRNA分子可包含實質上同源於且可特異性地雜交至可導致宿主植物物種損傷的昆蟲害蟲內的對應轉錄聚核苷酸的聚核苷酸。害蟲可接觸在基因轉殖宿主植物細胞內轉錄的iRNA分子，舉例來說，藉由攝食包含該iRNA分子的基因轉殖宿主植物的細胞或體液。於是，在特定例子中，侵染該基因轉殖宿主植物的鞘翅目及/或半翅目害蟲內的標靶基因表現會被該iRNA分子壓抑。在一些具體例中，標靶鞘翅目及/或半翅目害蟲內的標靶基因表現之壓抑可造成該植物免於被該害蟲侵襲。

為了能夠將iRNA分子傳遞至和經本發明重組核酸分子轉形之一植物細胞呈營養關聯的昆蟲害蟲，iRNA分子在該植物細胞表現(即，轉錄)是必要的。於是，一重組核酸分子可包含操作性地聯結至在一宿主細胞，例如欲擴增該核酸分子的細菌細胞、與欲表現該核酸分子的植物細胞中發揮功能的一或多個調控元件，例如異源性促進子元件的本發明聚核苷酸。

適用於本發明核酸分子的促進子包括可誘導性、病毒性、合成性、或組成性促進子，以上皆為本領域眾所習知的。說明此類促進子的非設限例子包括美國專利6,437,217(玉蜀黍RS81促進子)；5,641,876(水稻肌動蛋白促進子)；6,426,446(玉蜀黍RS324促進子)；6,429,362(玉蜀黍PR-1促進子)；6,232,526(玉蜀黍A3促進子)；6,177,611(組成性玉蜀黍促進子)；5,322,938、5,352,605, 5,359,142、與5,530,196(CaMV 35S促進子)；6,433,252(玉蜀黍L3油質蛋白促進子)；6,429,357(第2型水稻肌動蛋白促進子與第2型水稻肌動蛋白內含子)；6,294,714(光誘導性促進子)；6,140,078(鹽誘導性促進子)；6,252,138(病原體誘導性促進子)；6,175,060(缺磷誘導性促進子)；6,388,170(雙向促進子)；6,635,806(珈瑪-薏苡醇溶蛋白促進子)；與美國專利公開案編號2009/757,089(玉蜀黍葉綠體醛縮酶促進子)。額外的促進子包括胭脂鹼合成酶(NOS)促進子(Ebert et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(16)：5745-9)與章魚鹼合成酶(OCS)促進子(農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的腫瘤誘導質體上所攜帶)；花椰菜花葉病毒促進子，例如花椰菜鑲嵌病毒(CaMV)19S促進子(Lawton et al.(1987)Plant Mol.Biol.9：315-24)；CaMV 35S促進子(Odell et al.(1985)Nature 313：810-2；玄參鑲嵌病毒35S-促進子(Walker et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(19)：6624-8)；蔗糖合成酶促進子(Yang and Russell(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：4144-8)；R基因複合體促進子(Chandler et al.(1989)Plant Cell 1：1175-83)；葉綠素a/b結合蛋白質基因促進子；CaMV 35S(美國專利5,322,938、5,352,605, 5,359,142、與5,530,196)；FMV 35S(美國專利6,051,753、與5,378,619)；PC1SV促進子(美國專利5,850,019)；SCP1促進子(美國專利6,677,503)；與AGRtu.nos促進子(GenBank®寄存號V00087；Depicker et al.(1982)J.Mol.Appl.Genet.1：561-73；Bevan et al.(1983)Nature 304：184-7)。

在特定具體例中，本發明的核酸分子包含組織- 特異性促進子，例如根部-特異性促進子。根部-特異性促進子係驅動以可操作方式聯結的專一或偏好在根部組織的編碼聚核苷酸的表現。本領域習知根部-特異性促進子的例子。參閱，譬如美國專利5,110,732；5,459,252與5,837,848；及Opperman et al.(1994)Science 263：221-3；與Hirel et al.(1992)Plant Mol.Biol.20：207-18。在一些具體例中，根據本發明用於鞘翅目及/或半翅目害蟲控制的聚核苷酸或片段可選殖在以相對於該聚核苷酸或片段之相反轉錄方向定位的兩個根部-特異性促進子之間，且該等促進子係可在基因轉殖植物細胞操作並在該細胞內表現，以在基因轉殖植物細胞內製造後續可形成dsRNA分子的RNA分子，如上文所述。在植物組織表現的iRNA分子可被昆蟲害蟲攝食，俾使達到標靶基因表現之壓抑。

可任擇地操作性地聯結至核酸的額外調控元件包括位於促進子元件與編碼聚核苷酸之間、作用如同轉譯前導元件的5'UTRs。轉譯前導元件係存在於完整加工的mRNA，並可影響初級轉錄物的加工、及/或RNA穩定性。轉譯前導元件的例子包括玉蜀黍與矮牽牛熱休克蛋白前導子(美國專利5,362,865)、植物病毒外殼蛋白前導子、植物加氧酶(rubisco)前導子、及其他。參閱，譬如Turner and Foster(1995)Molecular Biotech.3(3)：225-36。5'UTRs的非設限例子包括GmHsp(美國專利5,659,122)；PhDnaK(美國專利5,362,865)；AtAntl；TEV(Carrington and Freed(1990)J.Virol.64：1590-7)；以及AGRtunos(GenBank®寄存號 V00087；與Bevan et al.(1983)Nature 304：184-7)。

可任擇地操作性地聯結至核酸的額外調控元件亦包括3'非轉譯元件、3'轉錄終止區、或聚腺苷酸化區。該等為位於聚核苷酸下游的基因元件，並包括提供聚腺苷酸化信號的聚核苷酸、及/或能夠影響轉錄或mRNA加工的其他調控信號。該聚腺苷酸化信號係作用在植物中，以致使聚腺苷酸化核苷酸加至mRNA前驅物的3'端。聚腺苷酸化元件可衍生自眾多植物基因、或來自T-DNA基因。3'轉錄終止區的非設限例子是胭脂鹼合成酶3'區(nos 3'；Fraley et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803-7)。使用不同3'非轉譯區的例子係提供於Ingelbrecht et al.,(1989)Plant Cell 1：671-80。聚腺苷酸化信號的非設限例子包括來自豌豆(Pisum sativum)RbcS2基因(Ps.RbcS2-E9；Coruzzi et al.(1984)EMBO J.3：1671-9)與AGRtu.nos(GenBank®寄存號E01312)當中一者。

一些具體例可包括一種包含經單離與純化DNA分子的植物轉形載體，該DNA分子包含操作性地聯結至本發明一或多個聚核苷酸的至少一個上述調控元件。在表現時，該一或多個聚核苷酸產生一或多個(多個)iRNA分子，其包含特異性地互補至一昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲的一原生RNA分子之全部或一部分的聚核苷酸。於是，該(多個)聚核苷酸可包含編碼有存在於所靶向鞘翅目及/或半翅目害蟲RNA轉錄體的聚核糖核苷酸之全部或一部分的一區段，並可包含所靶向害蟲轉錄體之全部或一部分的反向重複。植物轉形載體可含有特異性地互補至不止一個標靶聚核苷酸的聚核苷酸，於是容許製造不止一個dsRNA，以用來抑制標靶昆蟲害蟲的一或多個群體或物種之細胞內的兩或多個基因表現。特異性地互補至存在於不同基因之聚核苷酸的聚核苷酸區段可合併成單一複合核酸分子，以用來在基因轉殖植物表現。此類區段可鄰接或被間隔子隔開。

在一些具體例中，已含本發明至少一個(多個)聚核苷酸的本發明質體可藉由在相同質體依次插入額外的(多個)聚核苷酸來修飾，其中該額外的(多個)聚核苷酸係操作性地聯結至如同原始之至少一個(多個)聚核苷酸的相同調控元件。在一些具體例中，核酸分子可被設計成抑制多重標靶基因。在一些具體例中，欲抑制的該多重基因可獲自相同昆蟲(譬如鞘翅目或半翅目)害蟲物種，其可增強核酸分子的有效性。在其他具體例中，該基因可衍生自不同昆蟲害蟲，其可擴展該(多)劑係有效對抗的害蟲範圍。當多重基因被靶向為壓抑或是表現與壓抑之組合時，可加設順反子DNA元件。

本發明的一重組核酸分子或載體可包含授予經轉形細胞，例如植物細胞可擇表型的可擇標記。可擇標記亦可用於選擇包含本發明重組核酸分子的植物或植物細胞。該標記可編碼殺生物劑抗性、抗生素抗性(譬如卡那黴素(kanamycin)、正大黴素(gentamycin)(G418)、巴龍黴素(bleomycin)、與潮黴素(hygromycin)、等等)、或除草劑耐受性(譬如草甘膦(glyphosate)、等等)。可擇標記的例子包括，但不限於：neo基因，其編碼卡那黴素抗性並可使用卡那黴素、G418等等選擇；bar基因，其編碼畢拉草(bialaphos)抗性；突變EPSP合成酶基因，其編碼草甘膦耐受性；腈水解酶基因，其授予溴苯腈(bromoxynil)抗性；突變乙醯乳酸合成酶(ALS)基因，其授予咪唑啉酮類或磺醯脲類耐受性；與氨甲喋呤(methotrexate)抗性DHFR基因。可取得授予下列抗性之多重可擇標記：安比西林(ampicillin)、巴龍黴素、氯黴素(chloramphenicol)、正大黴素、潮黴素、卡那黴素、林可黴素(lincomycin)、氨甲喋呤、膦絲菌素(phosphinothricin)、嘌羅黴素(puromycin)、大觀黴素(spectinomycin)、利福平(rifampicin)、鏈黴素(streptomycin)和四環素(tetracycline)及等等。此類可擇標記的例子係例示於，譬如美國專利5,550,318；5,633,435；5,780,708與6,118,047。

本發明的一重組核酸分子或載體亦可包括可篩揀標記。可篩揀標記可用於監控表現。例示性可篩揀標記包括β-半乳糖苷酶或uidA基因(GUS)，其編碼已知各種顯色受質的酶(Jefferson et al.(1987)Plant Mol.Biol.Rep.5：387-405)；R-基因座基因，其編碼調控植物組織製造花青素色素(紅色)的一產物(Dellaporta et al.(1988)“Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac.”In 18^th Stadler Genetics Symposium,P.Gustafson and R.Appels,eds.(New York：Plenum),pp.263-82)；β-內醯胺酶基因(Sutcliffe et al.(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：3737-41)；一基因，其編碼已知各種顯色受質(譬如PADAC，顯色頭孢菌素(cephalosporin))的酶；螢光素酶基因(Ow et al.(1986)Science 234：856-9)；xylE基因，其編碼可以轉換顯色兒茶酚的兒茶酚雙加氧酶(Zukowski et al.(1983)Gene 46(2-3)：247-55)；澱粉酶基因(Ikatu et al.(1990)Bio/Technol.8：241-2)；酪胺酸酶基因，其編碼能夠氧化酪胺酸成為DOPA和多巴醌的酶，該等繼而縮合成黑色素(Katz et al.(1983)J.Gen.Microbiol.129：2703-14)；與α-半乳糖苷酶。

在一些具體例中，如上文所述的重組核酸分子可用於創建基因轉殖植物並在植物表現異源性核酸以製備展現對於昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲的敏感性降低的基因轉殖植物的方法。植物轉形載體可藉由，舉例來說，將編碼iRNA分子的核酸分子插入植物轉形載體並將該等引進植物來製備。

用於轉形宿主細胞的適宜方法包括可將DNA引進細胞的任何方法，例如藉由原生質體轉形(參閱，譬如美國專利5,508,184)、藉由乾化/抑制-介導的DNA攝取(參閱，譬如Potrykus et al.(1985)Mol.Gen.Genet.199：183-8)、藉由電穿孔(參閱，譬如美國專利5,384,253)、藉由以碳化矽纖維攪動(參閱，譬如美國專利5,302,523與5,464,765)、藉由農桿菌-介導的轉形(參閱，譬如美國專利5,563,055；5,591,616；5,693,512；5,824,877；5,981,840；與6,384,301) 與藉由DNA-包覆顆粒的加速(參閱，譬如美國專利5,015,580；5,550,318；5,538,880；6,160,208；6,399,861；與6,403,865)等等。特別可用於轉形玉米的技術係說明於，舉例來說，美國專利7,060,876與5,591,616；與國際PCT公開案WO95/06722。經由應用例如該等技術，幾乎所有物種的細胞可被穩定轉形。在一些具體例中，轉形DNA係嵌入宿主細胞基因組。就多細胞物種而言，基因轉殖細胞可再生成基因轉殖生物。該等技術任一者可用於製造，舉例來說，包含編碼基因轉殖植物基因組之一或多個iRNA分子的一或多個核酸的基因轉殖植物。

用於將表現載體引進植物的廣泛利用方法係以農桿菌的天然轉形系統為基礎。根瘤農桿菌(A.tumefaciens)與毛根農桿菌(A.rhizogenes)為以基因方式轉形植物細胞的植物致病性土壤細菌。根瘤農桿菌與毛根農桿菌的Ti與Ri質體分別攜帶負責植物基因轉形的基因。Ti(腫瘤誘導)-質體含有大型區段，習知為T-DNA，其被轉移至經轉形植物。Ti質體的另一區段，Vir區，是負責T-DNA運送。T-DNA區的邊界是末端重複。在經修飾的二元載體中，腫瘤誘導基因已被刪除，Vir區的功能係用來運送被T-DNA邊界元件包夾的外來DNA。T-區亦可含有有效回收基因轉殖細胞與植物的可擇標記，以及用於插入供運送，例如編碼核酸的dsRNA之聚核苷酸的多重選殖部位。

於是，在一些具體例中，植物轉形載體係衍生自根瘤農桿菌的Ti質體(參閱，譬如美國專利4,536,475、 4,693,977、4,886,937、與5,501,967；與歐洲專利號EP 0 122 791)或毛根農桿菌的Ri質體。額外的植物轉形載體包括，舉例來說而不限於，該等說明於Herrera-Estrella et al.(1983)Nature 303：209-13；Bevan et al.(1983)Nature 304：184-7；Klee et al.(1985)Bio/Technol.3：637-42；及於歐洲專利號EP 0 120 516，以及該等衍生自前述之任一者。天然地和植物交互作用的其他細菌，例如中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)、根瘤菌屬(Rhizobium)、與慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)可經修飾，以介導基因運送至眾多不同植物。藉由獲取卸防之Ti質體與適宜二元載體兩者，該等植物相關共生菌可勝任基因運送。

在提供外源性DNA至接受者細胞後，一般係辨識經轉形細胞，以供進一步培養與植物再生。為了增進辨識經轉形細胞的能力，可能想要運用可擇或可篩標記基因連同如前文所述之用於生成轉形體的轉形載體。在使用可擇標記的情況中，在有可能經轉形的細胞群體內，可藉由使細胞暴露至選擇劑或多個劑來識別經轉形細胞。在使用可篩標記的情況中，細胞可以所欲標記基因性狀篩揀。

暴露至選擇劑後存活的細胞、或在篩揀試驗中標為陽性的細胞可在支持植物再生的介質中培養。在一些具體例中，任何適宜植物組織培養介質(譬如MS與N6介質)可藉由包括另外物質，例如生長調節劑來修飾。組織可維持在帶有生長調節劑的基礎介質上，直到得到足夠的組織以開始植物再生的努力，或在重複的手動選擇循環後，直到組織的形態適用於再生(譬如至少2週)，隨後移至有助於嫩芽形成的介質。定期地轉移培養物，直到發生足夠的嫩芽形成。一旦形成嫩芽，將彼等移至有助於根形成的培養介質。一旦形成足夠的根，可將植物移至土壤，以供進一步生長和成熟。

為確認再生植物中感興趣核酸分子(舉例來說，編碼抑制鞘翅目及/或半翅目害蟲之標靶基因表現的一或多個iRNA分子的DNA)的存在，可進行眾多試驗。例如說，包括，舉例來說：分生試驗，例如南方與北方墨點法、PCR、與核酸定序；生化試驗，例如偵測蛋白產物的存在，譬如藉由免疫方式(ELISA及/或西方墨點法)或藉由酶的功能；植物部分試驗，例如葉部或根部試驗；與分析整株再生植物的表型。

嵌入事件可藉由，舉例來說，使用譬如專一對感興趣核酸分子的寡核苷酸引子的PCR擴增來分析。PCR基因分型被理解為包括，但不限於，衍生自被預測含有嵌入基因組的感興趣核酸分子的單離宿主植物癒傷組織的基因組DNA的聚合酶鏈反應(PCR)擴增，接著PCR擴增產物的標準選殖與序列分析。PCR基因分型方法已有詳細說明(舉例來說，Rios,G.et al.(2002)Plant J.32：243-53)，並可應用至衍生自任何植物物種(譬如玉米或大豆)或組織類型，包括細胞培養物的gDNA。

使用農桿菌-依賴性轉形方法形成的基因轉殖植物通常含有插入一染色體的單一重組DNA。單一重組DNA 的聚核苷酸係稱作「基因轉殖事件」或「嵌入事件」。此類基因轉殖植物為所插入外源性聚核苷酸的雜合子。在一些具體例中，帶有轉殖基因的基因轉殖植物雜合子可藉由含有單一外源性基因的獨立分離子基因轉殖植物，舉例來說，T₀植物的自身有性交配(自交)製造T₁種子來獲得。所製得T₁種子的四分之一會是帶有轉殖基因的純合子。萌發之T₁種子產生可用來測試雜合性的植物，通常使用允許區分雜合子與純合子的SNP試驗或熱擴增試驗(即，合子性試驗)。

在特定具體例中，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多個不同iRNA分子係於具有昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲-抑制效應的植物細胞以內製造。iRNA分子(譬如dsRNA分子)可從在不同轉形事件引進的多重核酸、或從在單一轉形事件引進的單一核酸表現。在一些具體例中，複數個iRNA分子是在單一促進子控制之下表現。在其他具體例中，複數個iRNA分子是在多重促進子控制之下表現。可表現單一iRNA分子，其包含各別同源於在相同昆蟲害蟲物種的不同群體、或不同昆蟲害蟲物種的一或多個昆蟲害蟲內的不同基因座(舉例來說，SEQ ID NOs：1、84、85、102、與107定義的基因座)的多重聚核苷酸。

除了以重組核酸分子直接轉形植物以外，基因轉殖植物可藉由使具有至少一個基因轉殖事件的第一植物和缺少此類事件的第二植物交配來製備。舉例來說，包含編碼iRNA分子的聚核苷酸的一重組核酸分子可被引進順應轉形的一第一植物系，以製造基因轉殖植物，該基因轉殖植物可和一第二植物系交配，以編碼iRNA分子的聚核苷酸漸滲進入該第二植物系。

在一些態樣中，衍生自經轉形植物細胞的基因轉殖植物所生產的種子與商品被包括在內，其中該種子或商品包含可偵測量之本發明核酸。在一些具體例中，此類商品可藉由，舉例來說，獲得基因轉殖植物且從其製備食物或飼料來製造。包含本發明一或多個聚核苷酸的商品包括，舉例來說而不限於：包含本發明一或多個核酸的膳食、油、或植物種子之壓碎或全穀粒，與包含任何膳食、油、或重組植物或種子之壓碎或全穀粒的任何食物產品。在一或多個貨品或商品偵測到本發明一或多個聚核苷酸是實際的證據，該貨品或商品是從為了表現本發明一或多個iRNA分子以控制昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲所設計的基因轉殖植物製造。

在一些具體例中，包含本發明核酸分子的基因轉殖植物或種子亦可包含至少一個其他基因轉殖事件在其基因組，包括而不限於：轉錄靶向昆蟲害蟲之SEQ ID NOs：1、84、85、102、與107所定義者以外的基因座的iRNA分子的基因轉殖事件，例如，舉例來說，選自於由下列所構成之群組的一或多個基因座：Cafl-180(美國專利申請案公開案編號2012/0174258)、VatpaseC(美國專利申請案公開案編號2012/0174259)、Rhol(美國專利申請案公開案編號2012/0174260)、VatpaseH(美國專利申請案公開案編號2012/0198586)、PPI-87B(美國專利申請案公開案編號 2013/0091600)、RPA70(美國專利申請案公開案編號2013/0091601)、與RPS6(美國專利申請案公開案編號2013/0097730)；轉錄靶向鞘翅目及/或半翅目害蟲以外的生物(譬如植物-寄生性線蟲)之基因的iRNA分子的基因轉殖事件；編碼殺昆蟲蛋白質(譬如蘇力菌殺昆蟲蛋白質)的基因；除草劑耐受性基因(譬如提供草甘膦耐受性的基因)；與有助於基因轉殖植物所欲表型的基因，例如增加產量、調整脂肪酸代謝、或恢復細胞質雄性不育)。在特定具體例中，編碼本發明iRNA分子的聚核苷酸可和植物的其他昆蟲控制與疾病性狀合併，以實現加強控制植物疾病與昆蟲損傷的所欲性狀。合併運用不同作用模式的昆蟲控制性狀可提供超越帶有單一控制性狀的植物之優異耐用性的受保護基因轉殖植物，舉例來說，因為較不可能在田間發展出抵抗該(多個)性狀的抗性。

V. 在鞘翅目及/或半翅目害蟲之標靶基因壓抑 A. 概觀

在本發明一些具體例中，可用於控制鞘翅目及/或半翅目害蟲的至少一個核酸分子可提供至鞘翅目及/或半翅目害蟲，其中該核酸分子造成該(多個)害蟲的RNAi-介導的基因靜默。在特定具體例中，一iRNA分子(譬如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、與hpRNA)可提供至鞘翅目及/或半翅目宿主。在一些具體例中，可用於控制鞘翅目及/或半翅目害蟲的一核酸分子可藉由以該害蟲接觸核酸分子來提供至害蟲。在該等與進一步具體例中，可用於控制鞘翅目及/或半翅目害蟲的一核酸分子可於害蟲食用基質提供，舉例來說，營養組成物。在該等與進一步具體例中，可用於控制鞘翅目及/或半翅目害蟲的一核酸分子可經由害蟲所攝食的包含該核酸分子的植物材料提供。在某些具體例中，該核酸分子係經由，舉例來說，以包含該重組核酸的載體轉形植物細胞並由該經轉形植物細胞再生植物材料或整株植物引進植物材料的重組核酸的表現而出現在植物材料。

B. RNAi-介導的標靶基因壓抑

在具體例中，本發明提供可設計成靶向昆蟲害蟲(舉例來說，鞘翅目(譬如WCR或NCR)或半翅目(譬如BSB)害蟲)轉錄組內的關鍵原生聚核苷酸(譬如關鍵基因)的iRNA分子(譬如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、與hpRNA)，舉例來說，藉由設計包含含有特異性地互補至該標靶聚核苷酸的聚核苷酸之至少一股的iRNA分子。如此設計的iRNA分子的序列可和標靶聚核苷酸的序列一致、或可併入不會阻止iRNA分子及其標靶聚核苷酸之間的特異性雜交的錯配。

本發明的iRNA分子可用於昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲之基因壓抑的方法，藉此降低害蟲在植物(舉例來說，包含iRNA分子的受保護經轉形植物)上導致損傷的位準或發生率。用於本案時，術語「基因壓抑」指稱用於降低由基因轉錄成mRNA與後續mRNA轉譯的結果所製得蛋白質的位準的任何方法，包括降低來自基因或編碼聚核苷酸的蛋白質表現，包括轉錄後抑制表現與轉錄壓抑。轉錄後抑制係藉由經靶向壓抑之基因所轉錄的mRNA之全部或一部分與用於壓抑的對應iRNA分子之間的特異同源性介導。此外，轉錄後抑制指稱細胞中供核糖體結合的mRNA份量的實質與可測得減少。

在具體例中，其中iRNA分子為dsRNA分子，該dsRNA分子可被DICER酶切成短的siRNA分子(長度為大約20個核苷酸)。DICER活性作用在dsRNA分子上所生成的雙股siRNA分子可分成兩個單股siRNAs；「隨從股」與「引導股」。隨從股可被降解，引導股可被併入RISC。轉錄後抑制在該引導股特異性地雜交至一mRNA分子的特異性地互補聚核苷酸時且後續被阿若戈蛋白酶(RISC複合體的催化組分)切割時發生。

在本發明具體例中，可使用任何形式的iRNA分子。熟習此藝者將理解dsRNA分子在製備期間與提供iRNA分子至細胞的步驟期間通常比單股RNA分子更加穩定，且在細胞中亦通常更加穩定。於是，當siRNA與miRNA分子，舉例來說，在一些具體例中可相等地有效時，由於穩定性，可選擇dsRNA分子。

在特定具體例中，核酸分子係以包含聚核苷酸被提供，該聚核苷酸可在體外表現，以製造實質上同源於昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲基因組內的聚核苷酸所編碼核酸分子的iRNA分子。在某些具體例中，體外轉錄的iRNA分子可為包含莖幹-環圈結構的穩定dsRNA分子。在昆蟲害蟲接觸該體外轉錄的iRNA分子後，可發生害蟲標靶基因(舉例來說，關鍵基因)的轉錄後抑制。

在本發明一些具體例中，包含聚核苷酸之至少15個鄰接核苷酸(譬如至少19個鄰接核苷酸)的核酸分子的表現係用於轉錄後抑制昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲標靶基因的方法中，其中該聚核苷酸係選自於由下列所構成之群組：SEQ ID NO：112；SEQ ID NO：112的互補體；SEQ ID NO：113；SEQ ID NO：113的互補體；SEQ ID NO：114；SEQ ID NO：114的互補體；SEQ ID NO：115；SEQ ID NO：115的互補體；SEQ ID NO：116；SEQ ID NO：116的互補體；SEQ ID NO：119；SEQ ID NO：119的互補體；SEQ ID NO：120；SEQ ID NO：120的互補體；SEQ ID NO：121；SEQ ID NO：121的互補體；SEQ ID NO：122；SEQ ID NO：122的互補體；SEQ ID NO：123；SEQ ID NO：123的互補體；SEQ ID NO：124；SEQ ID NO：124的互補體；SEQ ID NO：125；SEQ ID NO：125的互補體；SEQ ID NO：126；SEQ ID NO：126的互補體；SEQ ID NO：127；SEQ ID NO：127的互補體；由包含SEQ ID NO：1之條葉甲屬生物原生編碼聚核苷酸表現的RNA；由包含SEQ ID NO：1之條葉甲屬生物原生編碼聚核苷酸表現的RNA的互補體；由包含SEQ ID NO：102之條葉甲屬生物原生編碼聚核苷酸表現的RNA；由包含SEQ ID NO：102之條葉甲屬生物原生編碼聚核苷酸表現的RNA的互補體；由包含SEQ ID NO：107之條葉甲屬生物原生編碼聚核苷酸表現的RNA；由包含SEQ ID NO：107之條葉甲屬生物原生編碼聚核苷酸表現的RNA的互補體；由包含SEQ ID NO：84之英雄美洲蝽生物原生編碼聚核苷酸表現的RNA；由包含SEQ ID NO：84之英雄美洲蝽生物原生編碼聚核苷酸表現的RNA的互補體；由包含SEQ ID NO：85之英雄美洲蝽生物原生編碼聚核苷酸表現的RNA；由包含SEQ ID NO：85之英雄美洲蝽生物原生編碼聚核苷酸表現的RNA的互補體。包含前述聚核苷酸至少15個鄰接核苷酸的核酸分子包括，舉例來說而不限於，包含選自於由SEQ ID NOs：112-116與119-127所構成群組的聚核苷酸的至少15個鄰接核苷酸片段。在某些具體例中，可使用和前述任一者至少約80%一致(譬如79%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約100%、與100%)的核酸分子的表現。在該等與進一步具體例中，特異性地雜交至存在於昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲之至少一個細胞的一RNA分子的一核酸分子可被表現。

本案一些具體例的重要特徵是RNAi轉錄後抑制系統能夠耐受標靶基因由於基因突變、品系多態性或演化分歧可以預期的序列變異。所引進的核酸分子可不必絕對地同源於標靶基因的初級轉錄產物或經完全加工的mRNA，只要該引進的核酸分子可特異性地雜交至標靶基因的初級轉錄產物或已完全加工的mRNA即可。再者，相對於標靶基因的初級轉錄產物或已完全加工的mRNA，所引進的核酸分子可不必為全長。

使用本發明iRNA技術的標靶基因抑制是序列-特異性；即，實質上同源於(多個)iRNA分子的聚核苷酸是靶向基因抑制。在一些具體例中，一包含帶有和標靶基因之一部分帶有的核苷酸序列一致之核苷酸序列的聚核苷酸的RNA分子可用來抑制。在該等與進一步具體例中，可使用包含帶有相對於標靶聚核苷酸的一或多個插入、刪除、及/或點突變的聚核苷酸的一RNA分子。在特定具體例中，一iRNA分子與標靶基因之一部分可共享，舉例來說，至少自約80%、至少自約81%、至少自約82%、至少自約83%、至少自約84%、至少自約85%、至少自約86%、至少自約87%、至少自約88%、至少自約89%、至少自約90%、至少自約91%、至少自約92%、至少自約93%、至少自約94%、至少自約95%、至少自約96%、至少自約97%、至少自約98%、至少自約99%、至少自約100%、與100%的序列一致性。或者，dsRNA分子的雙螺旋區和標靶基因轉錄體之一部分可特異性地雜交。在可特異性地雜交的分子中，展現較大同源性的少於全長聚核苷酸係彌補較大、較少同源性的聚核苷酸。和標靶基因轉錄體之一部分一致的dsRNA分子雙螺旋區的聚核苷酸長度可為至少約25、50、100、200、300、400、500、或至少約1000個鹼基。在一些具體例中，可使用大於20-100個核苷酸的聚核苷酸。在特定具體例中，可使用大於約200-300個核苷酸的聚核苷酸。在特定具體例中，取決於標靶基因尺寸，可使用大於約500-1000個核苷酸的聚核苷酸。

在某些具體例中，在害蟲細胞內的害蟲(譬如鞘翅目或半翅目)害蟲之標靶基因表現可被抑制至少10%；至少33%；至少50%；或至少80%，俾使發生顯著的抑制。顯著抑制指的是超過可偵測表型臨界值的抑制(譬如停止生長、停止進食、停止發育、誘發死亡等等)、或對應於經抑制之標靶基因的RNA及/或基因產物的可偵測減少。儘管，在本發明某些具體例中，抑制發生在害蟲的實質上所有細胞，在其他具體例中，抑制僅發生在表現該標靶基因的細胞亞群。

在一些具體例中，轉錄壓抑係藉由細胞中所存在的展現和促進子DNA或其互補體之實質序列一致性以作用稱作「促進子反壓抑」的dsRNA分子來介導。基因壓抑可有效抵抗可攝食或接觸此類dsRNA分子，舉例來說，藉由攝食或接觸含有該dsRNA分子的植物材料的昆蟲害蟲之標靶基因。用於促進子反壓抑的dsRNA分子可特異性地設計成抑制或壓抑昆蟲害蟲細胞之一或多個同源或互補聚核苷酸的表現。用以調控植物細胞基因表現之反股或正股方向RNA所致的轉錄後基因壓抑係揭示於美國專利5,107,065；5,759,829；5,283,184；與5,231,020。

C. 提供給昆蟲害蟲的iRNA分子表現

用於在昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲之RNAi-介導的基因抑制的iRNA分子表現可以許多體外或體內型式進行。該iRNA分子隨後可提供至昆蟲害蟲，舉例來說，藉由以該害蟲接觸該iRNA分子、或藉由使該害蟲攝入或以其他方式內化該iRNA分子。一些具體例包括鞘翅目及/或半翅目害蟲的經轉形宿主植物、經轉形植物細胞、與經轉形植物的子代。該經轉形植物細胞與經轉形植物可經改造，以在，舉例來說，異源性促進子控制之下表現該iRNA分子之一或多者，以提供害蟲保護效應。於是，當一基因轉殖植物或植物細胞在進食期間被昆蟲害蟲消耗時，害蟲可攝入在該基因轉殖植物或細胞表現的iRNA分子。本發明的聚核苷酸亦可引進各種各樣的原核與真核微生物宿主，以製造iRNA分子。術語「微生物」包括原核與真核物種，例如細菌與真菌。

基因表現的調節可包括此類表現的部分或完全壓抑。在另一具體例中，用於壓抑昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲的基因表現的方法包含在害蟲宿主組織中提供本案所述聚核苷酸在轉錄後所形成的至少一個dsRNA分子的基因壓抑量，該聚核苷酸之至少一個區段係互補至昆蟲害蟲細胞之mRNA。被昆蟲害蟲攝食的dsRNA分子，包括其修飾形式，例如siRNA、miRNA、shRNA、或hpRNA分子可和Gho/Sec24B2或Sec24B1 DNA分子所轉錄RNA分子，舉例來說，包含選自於由SEQ ID NOs：112-116與119-127所構成群組的聚核苷酸至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或約100%一致。因此提供了用於提供dsRNA分子之包括，但不限於，非天然存在聚核苷酸與重組DNA構築體的單離與實質上純化核酸分子，在將該等引進昆蟲害蟲時，該等壓抑或抑制昆蟲害蟲之內源性編碼聚核苷酸或標靶編碼聚核苷酸的表現。

特定具體例提供一種用於傳遞iRNA分子的傳遞系統，該iRNA分子係用於轉錄後抑制昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)植物害蟲之一或多個(多個)標靶基因並控制該植物害蟲的群體。在一些具體例中，該傳遞系統包含攝入包含在宿主細胞中轉錄之RNA分子的宿主基因轉殖植物細胞或宿主細胞內含物。在該等與進一步具體例中，創建了含有提供本發明之穩定dsRNA分子的重組DNA構築體的一基因轉殖植物細胞或一基因轉殖植物。包含編碼特定iRNA分子之核酸的基因轉殖植物細胞與基因轉殖植物可藉由下列製造：運用重組DNA技術(該基本技術為本領域眾所周知)建構包含編碼本發明iRNA分子的聚核苷酸的一植物轉形載體(譬如穩定的dsRNA分子)；轉形一植物細胞或植物；以及生成含有該轉錄之iRNA分子的基因轉殖植物細胞或基因轉殖植物。

為了將免於昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲的保護作用賦予基因轉殖植物，一重組DNA分子可以，舉例來說，轉錄成一iRNA分子，例如一dsRNA分子、一siRNA分子、一miRNA分子、一shRNA分子、或一hpRNA分子。在一些具體例中，由重組DNA分子所轉錄的一RNA分子可形成重組植物組織或體液內的一dsRNA分子。此類dsRNA分子可被包含在和可侵染宿主植物的昆蟲害蟲種類之DNA所轉錄的對應聚核苷酸一致的聚核苷酸之一部分以內。害蟲標靶基因的表現被該dsRNA分子壓抑，且害蟲標靶基因之表現壓抑造成基因轉殖植物可抵抗該害蟲。已顯示dsRNA分子的調節效應可應用至害蟲所表現的各式基因，包括，舉例來說，負責細胞代謝或細胞轉形的內源性基因，包括持家基因；轉錄因子；蛻皮相關基因；以及編碼涉及細胞代謝或正常生長與發育之多肽的其他基因。

為了從體內轉殖基因或表現構築體轉錄，在一些具體例中可使用調控區(譬如促進子、加強子、靜默子、與聚腺苷酸化信號)，以轉錄該RNA股(或多股)。因此，在一些具體例中，如上文所述，用於製造iRNA分子的聚核苷酸可操作性地聯結至在植物宿主細胞發揮功能的一或多個促進子元件。該促進子可為常駐在宿主基因組的內源性促進子。本發明的聚核苷酸-在操作性地聯結之促進子元件的控制之下-可進一步側接有利地影響其轉錄及/或所得轉錄體穩定性的額外元件。此類元件可位於該操作性地聯結之促進子上游、表現構築體的3'端下游，並可同時發生在促進子上游與表現構築體的3'端下游。

一些具體例提供用於減少在植物上進食的昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲所導致的宿主植物(譬如玉米植物)損傷的方法，其中該方法包含將表現本發明至少一個核酸分子的經轉形植物細胞提供至宿主植物，其中該(多個)核酸分子在被該(多個)害蟲攝入後發揮功能，以抑制該(多個)害蟲之標靶聚核苷酸的表現，該表現抑制造成該(多個)害蟲死亡及/或減少生長，藉此減少該(多個)害蟲所導致的宿主植物損傷。在一些具體例中，該(多個)核酸分子包含dsRNA分子。在該等與進一步具體例中，該(多個)核酸分子包含了各別包含可特異性地雜交至表現於鞘翅目及/或半翅目害蟲細胞的核酸分子的不止一個聚核苷酸的dsRNA分子。在一些具體例中，該(多個)核酸分子係由可特異性地雜交至表現於昆蟲害蟲細胞的核酸分子的一個聚核苷酸所構成。

在一些具體例中，提供了用於增加玉米作物產量的方法，其中該方法包含將本發明至少一個核酸分子引進一玉米植物；培養該玉米植物，以容許包含該核酸的iRNA分子表現，其中包含該核酸的iRNA分子的表現抑制昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲損傷及/或生長，藉此減少或消除由於害蟲侵擾所致的產量損失。在一些具體例中，該iRNA分子為dsRNA分子。在該等與進一步具體例中，包含dsRNA分子的該(多個)核酸分子包含可特異性地雜交至表現於昆蟲害蟲細胞的核酸分子的不止一個聚核苷酸。在一些例子中，該(多個)核酸分子包含可特異性地雜交至表現於鞘翅目及/或半翅目害蟲細胞的核酸分子的聚核苷酸。

在一些具體例中，提供了用於調節昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲之標靶基因表現的方法，該方法包含，以包含編碼本發明至少一個iRNA分子的聚核苷酸的一載體轉形植物細胞，其中該聚核苷酸係操作性地聯結至一促進子與一轉錄終止元件；在足以容許包含複數個經轉形之植物細胞的植物細胞培養物發育的條件下培養該經轉形植物細胞；選擇該聚核苷酸已嵌入其基因組的經轉形植物細胞；就該嵌入聚核苷酸所轉錄的iRNA分子的表現，篩揀該經轉形植物細胞；選擇表現該iRNA分子的基因轉殖植物細胞；以及將該選定基因轉殖植物細胞餵給昆蟲害蟲。植物亦可從表現該嵌入核酸分子所轉錄之iRNA分子的經轉形植物細胞再生。在一些具體例中，該iRNA分子為dsRNA分子。在該等與進一步具體例中，該(多個)核酸分子包含dsRNA分子，其各別包含可特異性地雜交至表現於昆蟲害蟲細胞的一核酸分子的不止一個聚核苷酸。在一些例子中，該(多個)核酸分子包含可特異性地雜交至表現於鞘翅目及/或半翅目害蟲細胞的一核酸分子的聚核苷酸。

作為併入植物細胞基因組之重組基因的表現產物、或併入在種植前施用至種子之塗層或種子處理，本發明的iRNA分子可併入植物物種(譬如玉米)種子。包含重組基因的一植物細胞被視為基因轉殖事件。亦包括在本發明具體例的是用於將iRNA分子傳遞至昆蟲(譬如鞘翅目及/或半翅目)害蟲的傳遞系統。舉例來說，本發明的iRNA分子可直接引進(多個)害蟲的細胞。引進的方法可包括直接混合iRNA和來自(多個)昆蟲害蟲宿主的植物組織，還有將包含本發明iRNA分子的組成物施用至宿主植物組織。舉例來說，iRNA分子可灑在植物表面上。或者，一iRNA分子可藉由微生物表現，且可將該微生物施用至植物表面上、或藉由物理方式引進根或莖，例如注射。如上文所討論，一基因轉殖植物亦可基因改造成表現足以殺死習知侵染該植物之昆蟲害蟲的份量的至少一個iRNA分子。化學或酶促合成所製造的iRNA分子亦可以和普通農業實踐一致的方式調配，並用作控制昆蟲害蟲所致之植物損傷的噴灑產品。該調配物可包括有效的葉面覆蓋所需的適當佐劑(譬如膠黏劑和濕潤劑)，還有保護iRNA分子(譬如dsRNA分子)免於UV損傷的UV保護劑。此類添加劑慣常用於生物殺蟲劑工業，並為熟習此藝者眾所周知。此類施用可和其他噴灑殺蟲劑施用(以生物為基礎或其他方式)組合，以增進免於害蟲的植物保護作用。

本案列舉的所有參考文獻，包括出版品、專利、與專利申請案係以參照方式併入本案，在某種程度上，彼等和本揭示內容的明確細節不一致，並以彷彿各別參考文獻是個別地且明確地被指出以參照方式併入且以全文列示於本案的相同程度併入。本案所討論的參考文獻僅僅是為了彼等的揭露是早於本申請案的申請日而被提供。本案並無內容被解讀為承認本發明人無權憑藉先前發明而先於此類揭露內容。

提供下列實施例以例示某些特定特徵及/或態樣。該等實施例不應解讀成本揭示內容限於所說明的特定特徵或態樣。

實施例實施例1：材料與方法

樣本製備和生物試驗。

眾多dsRNA分子(包括對應於Gho/Sec24B2 reg1 (SEQ ID NO：3)、Gho/Sec24B2 reg2(SEQ ID NO：4)、Gho/Sec24B2 ver1(SEQ ID NO：5)、Gho/Sec24B2 ver2(SEQ ID NO：6)、Sec24B1 reg1(SEQ ID NO：104)、與Gho/Sec24B2 reg3(SEQ ID NO：109)者)是使用MEGAscript^® T7 RNAi套組(LIFE TECHNOLOGIES,Carlsbad,CA)或T7 Quick高產量RNA合成套組(NEW ENGLAND BIOLABS,Whitby,Ontario)合成與純化。純化的dsRNA分子是在TE緩衝液製備，所有生物試驗含有由此緩衝液構成的控制處理組，其適宜作為WCR(西方玉米根蟲)死亡或生長抑制的背景檢查。在生物試驗緩衝液中的dsRNA分子濃度是使用NANODROP® 8000分光光度計(Thermo Scientific,Wilmington,DE)測量。

樣本係以足齡昆蟲幼蟲在人工昆蟲膳食上進行的生物試驗測試昆蟲活性。WCR卵係獲自Crop Characteristics,Inc.(Farmington,MN)。

生物試驗係於為了昆蟲生物試驗特別設計的128-孔塑料盤(C-D International,Pitman,NJ)進行。各孔含有為了鞘翅目昆蟲生長所設計的約1.0mL人工膳食。將一份60μL的dsRNA樣本以移液管傳至各孔的膳食表面(40μL/cm²)。dsRNA樣本濃度係計算成孔中表面積(1.5cm²)每平方公分的dsRNA份量(ng/cm²)。將處理盤置於通風櫃，直到膳食表面上的固體蒸發或吸收進入膳食。

在孵化幾小時內，以濕潤的駱駝毛刷子將個別幼蟲挑起並放在處理膳食上(每孔一或兩隻幼蟲)。隨後以透明塑料膠黏片將128-孔塑料盤的遭侵染孔密封並排氣以允許氣體交換。使生物試驗盤維持在受控制環境條件(28℃，~40%相對濕度，16：8(明：暗))，達9天，在該時間後，記錄曝露至各樣本的昆蟲總數、死亡昆蟲數、與存活昆蟲重量。計算各個處理的平均百分比死亡與平均生長抑制。生長抑制(GI)係如下計算： GI=[1-(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]，其中TWIT為處理組的活昆蟲總重；TNIT為處理組的昆蟲總數；TWIBC為背景檢查組(緩衝液控制組)的活昆蟲總重；及TNIBC為背景檢查組(緩衝液控制組)的昆蟲總數。

LC₅₀(致死濃度)係定義為殺死50%測試昆蟲的劑量。GI₅₀(生長抑制)係定義為測試昆蟲的平均生長(譬如活重)是背景檢查組樣本所見平均值的50%的劑量。統計分析是使用JMP®軟體(SAS,Cary,NC)執行。

重複的生物試驗證實特定樣本的攝入造成玉米根蟲幼蟲出乎意料和出於預期的死亡與生長抑制。

實施例2：識別條葉甲屬的候選標靶基因

來自WCR(西方玉米根蟲)多個發育階段的昆蟲被挑選用於匯集轉錄組分析，以提供受到RNAi基因轉殖植物昆蟲保護技術控制的候選標靶基因序列。

在一個範例中，總RNA係單離自約0.9gm完全一齡WCR幼蟲；(孵化後4至5日；維持在16℃)，並使用下列以酚/TRI REAGENT^®為主的方法純化(Molecular Research Center,Cincinnati,OH)。

使幼蟲於室溫以10mL的TRI REAGENT^®在15mL均質機中均質化，直到獲得均質的懸浮液。在室溫培育5min.後，將均質物分配至1.5mL離心管(每管1mL)，加入200μL氯仿，使混合物劇烈攪拌15秒。使提取靜置於室溫10min後，藉由於4℃離心12,000 x g使相分離。小心地將上層相(包含約0.6mL)移至另一無菌1.5mL管，並加入同樣體積的室溫異丙醇。於室溫培育5至10min後，使混合物於12,000 x g離心8min(4℃或25℃)。

小心地將上清液移除丟棄，以75%乙醇渦旋振盪洗滌RNA丸粒兩次，每次洗滌後以7,500 x g離心5min(4℃或25℃)回收。小心地將乙醇移除，使丸粒風乾3至5min，隨後溶於不含核酸酶的無菌水。測量260nm與280nm吸光度(A)來決定RNA濃度。從約0.9gm幼蟲的典型提取產生超過1mg總RNA，A₂₆₀/A₂₈₀比例為1.9。將依此提取的RNA儲存於-80℃，直到進一步加工。

RNA品質是藉由1%瓊脂凝膠試跑一份來測定。瓊脂凝膠溶液係在高壓滅菌容器內使用高壓滅菌的10x TAE緩衝液(Tris-乙酸鹽EDTA；1x濃度為0.04M Tris-乙酸鹽，1mM EDTA(乙二胺四乙酸鈉鹽)，pH 8.0)以DEPC(焦碳酸二乙酯)-處理過的水稀釋製作。1x TAE係用作運行緩衝液。在使用前，以RNase Away®(Invitrogen Inc.,Carlsbad,CA)清潔電泳槽與成孔梳。將兩μL的RNA樣本和8μL的TE緩衝液(10mM Tris HCl pH 7.0；1mM EDTA)與10μL的RNA樣本緩衝液(Novagen^® Catalog No 70606；EMD4 Bioscience,Gibbstown,NJ)混合。使樣本於70℃加熱3min，冷卻至室溫，並在每孔載入5μL(含1μg至2μg RNA)。市購RNA分子量標記係於分別的孔同時運行，以比對分子大小。使凝膠於60伏特運行2小時。

正規化cDNA庫係由商業服務提供商(Eurofins MWG Operon,Huntsville,AL)使用隨機引子方式從幼蟲總RNA製備。將正規化幼蟲cDNA庫以1/2盤規模藉由GS FLX 454 Titanium^TM系列化學於Eurofins MWG Operon定序，其產生600,000個讀取，平均讀取長度為348bp。350,000個讀取組合成超過50,000個重疊群。未組合讀取與重疊群皆使用公眾可用程式FORMATDB(得自NCBI)轉換成BLASTable資料庫。

總RNA與正規化cDNA庫係由其他WCR發育階段收集的材料以類似方式製備。用於標靶基因篩揀的匯集轉錄組庫係藉由合併代表各種發育階段的cDNA庫成員來建構。

RNAi靶向的候選基因被假設對害蟲昆蟲存活與生長不可或缺。選定標靶基因同源物係如下述般於轉錄組序列資料庫識別。以PCR擴增標靶基因的全長或部分序列，以製備雙股RNA(dsRNA)製造模板。

使用候選蛋白質編碼序列的TBLASTN搜尋係針對含未組合條葉甲屬序列讀取或組合重疊群的BLASTable資料庫執行。顯著符合的條葉甲屬序列(定義為就重疊群同源物而言，優於e^-20，就未組合序列讀取同源物而言，優於 e^-10)係使用BLASTX針對NCBI非冗餘資料庫確認。此BLASTX搜尋結果確認了TBLASTN搜尋所識別的條葉甲屬同源候選基因序列確實包含條葉甲屬基因、或為最佳符合的存在於條葉甲屬序列的非-條葉甲屬候選基因序列。在大多數情況中，註解為編碼蛋白質的擬榖盜屬(Tribolium)候選基因給出和條葉甲屬轉錄組序列之一序列或多個序列的明確序列同源性。在一些情況中，很清楚的是藉由非-條葉甲屬候選基因同源性所選出的若干條葉甲屬重疊群或未組合序列讀取有重疊，且重疊群組合無法加入該等重疊。在那些情況中，Sequencher® v4.9(Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI)係用來將序列組合成較長的重疊群。

編碼條葉甲屬Gh0/Sec24B2(SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：107)與Sec24B1(SEQ ID NO：102)的候選標靶基因被識別為可造成鞘翅目害蟲死亡、生長抑制、或WCR發育抑制的基因。Gho/Sec24B2與Sec24B1是殼蛋白質複合體II(COPII)組分，其促進形成從內質網(ER)到高爾基複合體(Golgi complex)的運輸小泡(參閱，網路上，uniprot.org/uniprot/P40482)。該殼具有兩個主要功能，ER膜物理變形成小泡與選擇負載分子。Sec23與Sec24在結構上相關並形成異二聚體。Sec24主要是負責負載召集至COPII小泡，Sec23/Sec24內殼複合物形成COPII外殼平台(參閱，網路上，cshperspectives.cshlp.org/content/5/2/a013367.long)。

吾等在本案的結果指出編碼Sec23/Sec24複合體蛋白質(譬如西方玉米根蟲蛋白質)的基因是可造成昆蟲害蟲，舉例來說，鞘翅目害蟲死亡、生長抑制、或發育抑制的候選標靶基因。

SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：102的序列是新穎的。該序列未在公共資料庫提供且未揭露於WO/2011/025860；美國專利申請案號20070124836；美國專利申請案號20090306189；美國專利申請案號US20070050860；美國專利申請案號20100192265；或美國專利號7,612,194。在GENBANK搜尋沒有找到顯著同源性核苷酸序列。條葉甲屬GHO/SEC24B2胺基酸序列(SEQ ID NO：2)的最接近同源物是擬穀盜(Tribolium casetanum)蛋白質，其具有GENBANK寄存號XP_971886.1(77%相似；同源區有67%一致)。條葉甲屬SEC24B1胺基酸序列(SEQ ID NO：103)的最接近同源物是擬穀盜蛋白質，其具有GENBANK寄存號XP_974325.2(84%相似；同源區有74%一致)。於是，即使該等編碼多肽並不具有和任何已知蛋白質超過85%的顯著同源性。

Gho/Sec24B2與Sec24B1 dsRNA轉殖基因可和其他dsRNA分子合併，以提供冗餘RNAi靶向與協同RNAi效應。表現標靶Gho/Sec24B2及/或Sec24B1之dsRNA的基因轉殖玉米事件可用於防止玉米根蟲所致的食根損傷。Gho/Sec24B2與Sec24B1 dsRNA轉殖基因代表了結合在昆蟲抗性管理基因金字塔的蘇力菌殺昆蟲蛋白質技術的新穎作用模式，以減緩可抗該等根蟲控制技術根蟲群體的發展。

實施例3：從條葉甲屬擴增標靶基因

Gho/Sec24B2與Sec24B1候選基因序列的全長或部分選殖體係用來生成供dsRNA合成的PCR擴增子。引子係設計成藉由PCR擴增各別標靶基因的一部分編碼區。見表1。若適當的話，將T7噬菌體促進子序列(TTAATACGACTCACTATAGGGAGA；SEQ ID NO：13)併入經擴增正股或反股的5'端。見表1。總RNA係使用TRIzol^®(Life Technologies,Grand Island,NY)從WCR提取，隨後用於以SuperScriptIII^®首股合成系統製成首股cDNA並製作寡聚dT引子指令(Life Technologies,Grand Island,NY)。首股cDNA係使用位置相對的引子用作PCR反應的模板，以擴增全部或部分的原生標靶基因序列。dsRNA亦從包含黃色螢光蛋白質(YFP)編碼區的DNA選殖體擴增(SEQ ID NO：8；Shagin et al.(2004)Mol.Biol.Evol.21(5)：841-50)。

實施例4：RNAi構築體

藉由PCR與dsRNA合成製備模板。

用來提供製造Gho/Sec24B2、Sec24B1、與YFP dsRNA的特異性模板的策略係顯示於圖1與圖2。意圖用於Gho/Sec24B2或Sec24B1dsRNA合成的模板DNAs係藉由PCR使用表1的引子對與單離自WCR一齡幼蟲的總RNA製備的(作為PCR模板)首股cDNA來製備。就各別選定Gho/Sec24B2、Sec24B1、與YFP標靶基因區而言，PCR擴增引進位於所擴增正股與反股5'端的T7促進子序列(YFP區段係從YFP編碼區的DNA選殖體擴增)。標靶基因各區的該兩個PCR擴增片段隨後以約略相等量混合，且混合物係用作dsRNA製造的轉錄模板。見圖1。以特定引子對擴增的dsRNA模板序列為：SEQ ID NO：3(Gho/Sec24B2 reg1)、SEQ ID NO：4(Gho/Sec24B2 reg2)、SEQ ID NO：5(Gho/Sec24B2 ver1)、SEQ ID NO：6(Gho/Sec24B2 ver2)、SEQ ID NO：109(Sec24B2 reg3)、GFP(SEQ ID：8)、與YFP(SEQ ID NO：7)。昆蟲生物試驗的雙股RNA是依照製造商指示(Invitrogen)使用Ambion^® MEGAscript^® RNAi套組或依照製造商指示(New England Biolabs,Ipswich,MA)使用HiScribe^® T7體外轉錄套組來合成純化。dsRNAs的濃度是使用NanoDrop® 8000分光光度計(Thermo Scientific,Wilmington,DE)測量。

建構植物轉形載體。

夾帶用於形成髮夾的包含Gho/Sec24B2(SEQ ID NO：1)及/或Sec24B1(SEQ ID NO：102)區段之標靶基因構築體的進入載體係使用化學合成片段(DNA2.0,Menlo Park,CA)組合與標準分子選殖方法來組裝。RNA初級轉錄體所形成的分子內髮夾係以下列促成，藉由(在單一轉錄單元內)使Gho/Sec24B2標靶基因序列區段的兩個拷貝彼此以相反方向排列，該兩個區段被聯結子序列(譬如ST-LS1,Vancanneyt et al.(1990)Mol.Gen.Genet.220(2)：245-50)分開，以形成環圈結構。於是，初級mRNA轉錄體含有被聯結子序列分開之作為彼此的大型反向重複的兩個Gho/Sec24B2基因區段序列。一份拷貝的促進子(譬如玉蜀黍泛素1，美國專利5,510,474；來自花椰菜鑲嵌病毒(CaMV)的35S；來自水稻肌動蛋白基因的促進子；泛素促進子；pEMU；MAS；玉蜀黍H3組蛋白促進子；ALS促進子；菜豆基因促進子；cab；rubisco；LAT52；Zm13；及/或apg)係用於驅動產生初級mRNA髮夾轉錄體，以及一包含3'未轉譯區的片段，舉例來說但不限於，玉蜀黍過氧化物酶5基因(ZmPer5 3'UTR v2；美國專利6,699,984)、AtUbi10、AtEf1、或StPinII係用於終止髮夾-RNA-表現基因的轉錄。

進入載體pDAB114538包含Gho/Sec24B2髮夾v1-RNA構築體(SEQ ID NO：18)，其包含Gho/Sec24B2區段(SEQ ID NO：1)。進入載體pDAB114548包含有別於在pDAB114538發現的Gho/Sec24B2髮夾v2-RNA構築體(SEQ ID NO：19)，其包含Gho/Sec24B2區段(SEQ ID NO：1)。上述進入載體pDAB114538與pDAB114548係和典型二元目的載體(pDAB115765)用於標準GATEWAY®重組反應，以製造供農桿菌-介導的玉蜀黍胚芽轉形用的Gho/Sec24B2髮夾RNA表現轉形載體(分別為pDAB114544與pDAB114549)。

包含表現YFP髮夾dsRNA的基因的負向控制組二元載體係藉由和典型二元目的載體(pDAB109805)與進入載體pDAB101670的標準GATEWAY®重組反應建構。進入載體pDAB101670包含在玉蜀黍泛素1促進子(如上文)表現控制下的YFP2髮夾序列(SEQ ID NO：20)與包含來自玉蜀黍過氧化物酶5基因(如上文)的3'未轉譯區片段。

二元目的載體包含在植物可操作促進子(譬如甘蔗桿狀病毒(ScBV)促進子(Schenk et al.(1999)Plant Molec.Biol.39：1221-1230)或ZmUbi1(美國專利5,510,474))的調控之下的除草劑耐受性基因(芳氧基鏈烷酸雙加氧酶；AAD-1 v3)(美國專利7838733(B2)，與Wright et al.(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107：20240-20245)。來自該等促進子的5'UTR與內含子係座落於促進子區段3'端與AAD-1編碼區起始密碼子之間。包含來自玉蜀黍脂解酶基因的3'未轉譯區片段(ZmLip 3'UTR；美國專利7,179,902)係用於終止AAD-1 mRNA的轉錄。

另一負向控制組二元載體pDAB101556-其包含表現YFP蛋白質的基因-係藉由和典型二元目的載體(pDAB9989)與進入載體(pDAB100287)的標準GATEWAY®重組反應建構。二元目的載體pDAB9989包含在玉蜀黍泛素1促進子(如上文)調控之下的除草劑耐受性基因(芳氧基鏈烷酸雙加氧酶；AAD-1 v3)(如上文)與包含來自玉蜀黍脂解酶基因的3'未轉譯區片段(ZmLip 3'UTR；如上文)。進入載體pDAB100287包含在玉蜀黍泛素1促進子(如上文)之表現控制下的YFP編碼區(SEQ ID NO：32)與包含來自玉蜀黍過氧化物酶5基因(如上文)的3'未轉譯區片段。

實施例5：篩揀條葉甲屬幼蟲的候選標靶基因

在以膳食為主的試驗中投予WCR時，設計用來抑制實施例2所識別的標靶基因序列的合成dsRNA導致死亡與生長抑制。

重複的生物試驗證實攝入衍生自Gho/Sec24B2 reg1、Gho/Sec24B2 reg2、Gho/Sec24B2 ver1、Gho/Sec24B2 ver2、Sec24B2 reg3的dsRNA製劑各別造成西方玉米根蟲幼蟲死亡及/或生長抑制。表2與表3顯示曝露至該等dsRNAs的9天後以膳食為主的WCR幼蟲進食生物試驗結果，還有以從黃色螢光蛋白質(YFP)編碼區(SEQ ID NO：8)製備的dsRNA負向控制組樣本獲得的結果。

先前已建議條葉甲屬的某些基因可利用於RNAi-介導的昆蟲控制。見美國專利公開案編號2007/0124836，其揭露906個序列，和美國專利號7,612,194，其揭露9,112個序列。然而，建議具有RNAi-介導的昆蟲控制利用性的許多基因被測定無效於控制條葉甲屬。亦測到序列Gho/Sec24B2 reg1、Gho/Sec24B2 reg2、Gho/Sec24B2 ver1、Gho/Sec24B2 ver2、與Sec24B2 reg3各別提供條葉甲屬出乎意料和出於預期的優越控制，相較於被建議具有RNAi-介導的昆蟲控制利用性的其他基因。

舉例來說，膜聯蛋白、乙型血影蛋白2、與mtRP-L4各者在美國專利號7,612,194被建議有效於RNAi-介導的昆蟲控制。SEQ ID NO：23為膜聯蛋白第1區(Reg 1)的DNA序列，SEQ ID NO：24為膜聯蛋白第2區(Reg 2)的DNA序列。SEQ ID NO：25為乙型血影蛋白2第1區(Reg 1)的DNA序列，SEQ ID NO：26為乙型血影蛋白2第2區(Reg2)的DNA序列。SEQ ID NO：27為mtRP-L4第1區(Reg 1)的DNA序列，SEQ ID NO：28為mtRP-L4第2區(Reg 2)的DNA序列。YFP序列(SEQ ID NO：8)亦用於製造作為負向控制組的dsRNA。

前述序列係各別用於藉由實施例3的方法製造dsRNA。用來提供製造dsRNA的特異性模板的策略顯示於圖2。意圖用於dsRNA合成的模板係藉由PCR使用表4的引子對與單離自WCR一齡幼蟲的總RNA製備的(作為PCR模板)首股cDNA來製備。(YFP係從DNA選殖體擴增。)就各別選定標靶基因區而言，進行兩個分開的PCR擴增。首個PCR擴增引進位於所擴增正股5'端的T7促進子序列。第二個反應將T7促進子序列併入反股5'端。標靶基因各區的該兩個PCR擴增片段隨後以約略相等量混合，且混合物係用作dsRNA製造的轉錄模板。見圖2。雙股RNA是依照製造商指示(Invitrogen)使用Ambion^® MEGAscript^® RNAi套組來合成純化。dsRNAs的濃度是使用NanoDrop® 8000分光光度計(Thermo Scientific,Wilmington,DE)測量且dsRNAs係各別藉由上述以膳食為主的相同生物試驗方法測試。表4列出用於製造膜聯蛋白Reg1、膜聯蛋白Reg2、乙型血影蛋白2 Reg1、乙型血影蛋白2 Reg2、mtRP-L4 Reg1、mtRP-L4 Reg2、與YFP dsRNA分子的引子序列。表5代表曝露至該等dsRNAs的9天後以膳食為主的WCR幼蟲進食生物試驗結果。重複的生物試驗證實攝入該等dsRNAs並無造成超過TE緩衝液控制組樣本、水、或YFP蛋白質所見的西方玉米根蟲幼蟲的死亡或生長抑制。

實施例6：成蟲試驗的樣本與生物試驗

西方玉米根蟲的RNA干擾(RNAi)係藉由餵食對應於Gho/Sec24B2或Sec24B1標靶基因序列區段的dsRNA至成蟲來執行。測試昆蟲為24至48小時年齡的成蟲。昆蟲係獲自Crop Characteristics,Inc.(Farmington,MN)。對於所有生物試驗，成蟲係飼養於23±1℃，相對濕度>75%，8hr：16hr明：暗週期。昆蟲飼養膳食係變化自Branson and Jackson(1988)J.Kansas Entomol.Soc.61：353-5。將乾燥成分(48gm/100mL)加至包含二次蒸餾水和2.9%瓊脂與7mL甘油的溶液。除此之外，包含47%丙酸與6%磷酸溶液的0.5mL混合物係加至每100mL膳食，以抑制微生物生長。對於所有成蟲dsRNA進食試驗，膳食係經改變，以提供切割膳食外加物所必需的稠度。將乾燥成分以60gm/100mL添加並將瓊脂增加至3.6%。使瓊脂溶於沸水且加入乾燥成分、甘油、與丙酸/磷酸溶液，充分混合，並倒至大約2mm深度。固化膳食外加物(約為直徑4mm，高度2mm；25.12mm³)係以1號打孔器從膳食切下並以3μl的dsRNA或水處理。

使成蟲在以Gho/Sec24B2 reg1(SEQ ID NO：3)或Sec24B1 reg1(SEQ ID NO：104)基因特異性dsRNA(500ng/膳食外加物；約20ng/mm³)處理過的人工膳食表面外加物上進食。控制處理組包括曝露至以相同濃度的GFP(綠螢光蛋白質)dsRNA(SEQ ID NO：9)或相同體積的水處理的膳食的成蟲。GFP dsRNA係使用5'端具有T7促進子序列的相反引子(SEQ ID NOs：29與30)如上述般製備。在整個實驗中，每隔一天提供經dsRNA處理的新鮮人工膳食。三個重複(Rep1、Rep2、與Rep3)-各別包含十隻成蟲-係於不同天數進行。圖3以圖式表示表6所代表的資料，顯示曝露至500ng/膳食外加物的Gho/Sec24 reg1 dsRNA、Sec24B1 reg1 dsRNA、相同份量的GFP dsRNA、或相同體積的水的成年西方玉米根蟲百分比死亡。一μg總RNA係用於首股cDNA合成。針對Gho/Sec24B2 reg1(SEQ ID NOs：10與11)及肌動蛋白引子對(SEQ ID NOs：82與83)進行引子效率測試，以測定RT-qPCR分析的適用性。RT-qPCR係使用SYBR®綠色主要混合物(APPLIED BIOSYSTEMS,Grand Island,NY)和APPLIED BIOSYSTEMS 7500快速即時PCR系統進行。WCR肌動蛋白基因係用作參考基因，以計算相對轉錄體冗餘性。新鮮處理的人工物係於第1與3天提供。

LC₅₀測定。使成蟲曝露至0、0.1、1、10、100、或1000ng/膳食外加物濃度的Gho/Sec24B2 reg1(SEQ ID NO：3)、Sec24B1 reg1(SEQ ID NO：104)、或GFP(SEQ ID NO：9)，以測定LC₅₀值。單獨水建立控制組死亡。新鮮人工膳食(如上述)係以dsRNA處理，並隔一天提供，直到第10天。第10天後，使成蟲維持在未處理人工膳食上，隔一天提供新鮮膳食。每天記錄死亡，共15天。LC₅₀是使用Polo Plus軟體(LeOra Software,Berkeley,CA)計算。LC₅₀計算顯示0、0.1、1、10、100、及/或1000ng/膳食為有效濃度的dsRNA。

曝露時間。使成蟲曝露至50ng/膳食外加物Gho/Sec24B2 reg1(SEQ ID NO：3)、Sec24B1 reg1(SEQ ID NO：104)、或GFP(SEQ ID NO：9)dsRNA、或等體積的水，達3、6、或48小時，隨後移至未處理人工膳食，以測定達到顯著死亡的最小曝露時間。每天記錄死亡，共15天。死亡測量顯示3、6、及/或48小時為dsRNAs的有效曝露時間。

實施例7：製造包含殺昆蟲dsRNAs的基因轉殖玉蜀黍組織

農桿菌-介導的轉形。經由穩定嵌入植物基因組之嵌合基因的表現製造一或多個殺昆蟲dsRNA分子(舉例來說，至少一個dsRNA分子，包括靶向包含Gho/Sec24B2(譬如SEQ ID NO：1)之基因的一dsRNA分子)的基因轉殖玉蜀黍細胞、組織、與植物係按照農桿菌-介導的轉形製造。運用超級二元或二元轉形載體的玉蜀黍轉形方法為本領域所習知，舉例來說，說明於美國專利8,304,604，其以參照方式整體併入本案。經轉形組織係以在含有蓋草(Haloxyfop)的介質上生長的能力來選擇且視情況以dsRNA製造來篩揀。將一部分的此類經轉形組織培養物呈現於新生玉米根蟲幼蟲，以用於基本上如實施例1所說明的生物試驗。

農桿菌培養啟始。將夾帶上述二元轉形載體pDAB114515、pDAB115770、pDAB110853或pDAB110556(實施例4)的農桿菌菌株DAt13192細胞(WO 2012/016222A2)的甘油庫存液劃在含適當抗生素的AB最少養份培養介質盤上(Watson et al.(1975)J.Bacteriol.123：255-264)並於20℃生長3天。隨後將該培養物劃在含相同抗生素的的YEP盤上(gm/L：酵母萃取物，10；蛋白腖，10；NaCl，5)並於20℃培育1天。

農桿菌培養。在實驗當天，將培育介質與乙醯丁香酮的庫存液製備成適用於實驗構築體數目的體積並移液至無菌、拋棄式250mL燒瓶。培育介質(Frame et al.(2011)Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos.IN Plant Embryo Culture Methods and Protocols：Methods in Molecular Biology.T.A. Thorpe and E.C.Yeung,(Eds),Springer Science and Business Media,LLC.pp 327-341)含有：2.2gm/L MS鹽；1X ISU修飾MS維生素(Frame et al.,ibid.)68.4gm/L蔗糖；36gm/L葡萄糖；115mg/L L-脯胺酸；與100mg/L肌醇；pH 5.4)。將乙醯丁香酮從溶於100%二甲亞碸的1M庫存液加至含有培育介質的燒瓶，至200μM最終濃度，使溶液充分混合。

就個別構築體而言，將來自YEP盤、充滿農桿菌的1或2個接種圈懸浮於無菌拋棄式50mL離心管中的15mL培育介質/乙醯丁香酮庫存液，並以分光光度計測量溶液在550nm(OD₅₅₀)的光密度。隨後使用額外培育介質/乙醯丁香酮混合物將懸浮液稀釋至OD₅₅₀為0.3至0.4。隨後於室溫將農桿菌懸浮液管水平地置於設為約75rpm平台振盪器並振盪1至4小時，同時進行胚芽剝離。

穗消毒和胚芽單離。玉蜀黍未成熟胚芽係獲自長在溫室且自體或同胞授粉的玉米自交系B104植物(Hallauer et al.(1997)Crop Science 37：1405-1406)，以產生穗部。穗部是在授粉後的大約10至12天採收。在實驗當天，使去掉外皮的穗部浸在20%市售漂白劑溶液(Ultra Clorox® Germicidal Bleach，6.15%次氯酸鈉；兩滴TWEEN 20)並振晃20至30min，接著在層流通風櫥以無菌去離子水潤洗三次進行表面消毒。未成熟合子胚芽(1.8至2.2mm長)係以無菌方式從各個穗部剝離並隨機分配到含有溶於液體培育介質和200μM乙醯丁香酮的2.0mL適當農桿菌細胞懸浮液的微量離心管，對其已加入2μL的10% BREAK-THRU^® S233表面活性劑(Evonik Industries；Essen,Germany)。就既定實驗組別而言，來自匯集穗部的胚芽係用於各別轉形。

農桿菌共同培養。在單離之後，將胚芽置於搖動平台上5分鐘。隨後將該管內容物倒至共同培養介質盤上，其含有4.33gm/L MS鹽；1X ISU修飾MS維生素；30gm/L蔗糖；700mg/L L-脯胺酸；3.3mg/L麥草畏(Dicamba)(3,6-二氯-o-茴香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)，溶於KOH；100mg/L肌醇；100mg/L酪蛋白酶解產物；15mg/L AgNO₃；200μM乙醯丁香酮，溶於DMSO；與3gm/L GELZAN^TM，於pH 5.8。以無菌拋棄式移液管將液體農桿菌懸浮液移除。隨後用無菌鑷子在顯微鏡的幫助下將胚芽定位使子葉盤朝上。將該盤封閉，以3M® MICROPORE®醫用膠帶密封，並置於25℃培育器和大約60μmol m^-2s^-1光合活性輻射(PAR)的連續光照。

癒傷組織的選擇與基因轉殖事件的再生。在共同培養期後，將胚芽移至休止介質，其由下列構成：4.33gm/L MS鹽；1X ISU修飾MS維生素；30gm/L蔗糖；700mg/L L-脯胺酸；3.3mg/L麥草畏，溶於KOH；100mg/L肌醇；100mg/L酪蛋白酶解產物；15mg/L AgNO₃；0.5gm/L MES(2-(N-嗎啉代)乙磺酸單水合物；PhytoTechnologies Labr.；Lenexa,KS)；250mg/L羧芐青黴素；與2.3gm/L Gelzan^TM；於pH 5.8。不超過36個胚芽被移至各盤。將該盤置於透明塑料箱並於27℃培育，以大約50μmol m^-2s^-1 PAR連續照光7至10天。隨後將癒痂胚芽移至(<18個/盤)選擇介質I上，其包含休止介質(上文)和100nM R-蓋草酸(0.0362mg/L；選擇夾帶AAD-1基因的癒傷組織)。將該盤放回透明箱並於27℃培育，以大約50μmol m^-2s^-1 PAR連續照光7天。隨後將癒痂胚芽移至(<12個/盤)選擇介質II上，其包含休止介質(上文)和500nM R-蓋草酸(0.181mg/L)。將該盤放回透明箱並於27℃培育，以大約50μmol m^-2s^-1 PAR連續照光14天。此選擇步驟容許基因轉殖癒傷組織進一步增生與分化。

將增生胚性癒傷組織移至(<9個/盤)預再生介質上。預再生介質含有4.33gm/L MS鹽；1X ISU修飾MS維生素；45gm/L蔗糖；350mg/L L-脯胺酸；100mg/L肌醇；50mg/L酪蛋白酶解產物；1.0mg/L AgNO₃；0.25gm/L MES；0.5mg/L萘乙酸，溶於NaOH；2.5mg/L脫落酸，溶於乙醇；1mg/L 6-苄胺基嘌呤；250mg/L羧芐青黴素；2.5gm/L Gelzan^TM；與0.181mg/L蓋草酸；於pH 5.8。將該盤儲存於透明箱並於27℃培育，以大約50μmol m^-2s^-1 PAR連續照光7天。隨後將再生癒傷組織移至(<6個/盤)至Phytatrays^TM(sigma-aldrich)之再生介質並於28℃培育，每天16小時明/8小時暗(大約160μmol m^-2s^-1 PAR)共14天或直到發育出芽和根。再生介質含有4.33gm/L MS鹽；1X ISU修飾MS維生素；60gm/L蔗糖；100mg/L肌醇；125mg/L羧芐青黴素；3gm/L Gellan^TM膠；與0.181mg/L R-蓋草酸；於pH 5.8。隨後將帶有主根的小芽單離並移至延長培養基，並無選擇。延長培養基含有4.33gm/L MS鹽；1X ISU修飾MS維生素；30gm/L蔗糖；與3.5gm/L Gelrite®；於pH 5.8。

經轉形植物幼芽係以在含有蓋草的介質上生長的能力來選擇，並從Phytatrays^TM移植至填有生長介質的小盆(ProMix BX；Premier Tech Horticulture)，以杯子或HUMI-DOMES(ARCO PLASTICS)覆蓋，隨後在Conviron®生長室(27℃日/24℃夜，16-小時光周期，50-70% RH，200μmol m^-2s^-1 PAR)強化。在一些例子中，推定基因轉殖小植株的選殖基因相對拷貝數係使用設計用來偵測嵌入玉蜀黍基因組的AAD1除草劑耐受性基因的引子藉由定量即時PCR試驗分析。再者，RNA qPCR試驗係用於偵測推定轉化體所表現的dsRNAs是否存在聯結子序列。隨後將選定的經轉形小植株搬進溫室，供進一步生長與測試。

在溫室轉移並建立供生物試驗與種子製造之T₀植物。當植物達到V3-V4階段，將彼等移植至IE Custom Blend(PROFILE/METRO MIX 160)土壤混合物並於溫室長至開花(曝光類型：照光或趨同；亮度限制：1200 PAR；16-小時日長；27℃日/24℃夜)。

將用於昆蟲生物試驗的植物從小盆移植至Tinus^TM 350-4 Rootrainers^®(Spencer-Lemaire Industries,Acheson,Alberta,Canada；)(每個Rootrainer^®每事件一植物)。在移植至Rootrainers^®約四天後，使植物被侵染以用於生物試驗。

T₁代植物係藉由以非-基因轉殖優秀自交系B104植物或其他適當花粉予體收集的花粉授粉T₀基因轉殖植物的穗絲，並栽種所得種子。可能的話，進行正反雜交。

實施例8：基因轉殖玉蜀黍組織的分子分析

玉蜀黍組織的分子分析(譬如RNA qPCR)是在評估食根損傷的同一天從溫室生長植物所收集的葉與根樣本上進行。

Per5 3'UTR的RNA qPCR試驗結果係用於確效髮夾選殖基因的表現。(在非-經轉形玉蜀黍植物偵測到低位準的Per5 3'UTR是可預期的，因為通常有玉蜀黍組織內源性Per5基因的表現。)在經表現RNAs的重複序列之間的中介序列(其為形成dsRNA髮夾分子所不可或缺的)的RNA qPCR試驗結果係用於確效髮夾轉錄體的存在。選殖基因RNA之表現位準係相對於內源性玉蜀黍基因之RNA位準來測量。

偵測gDNA的一部分AAD1編碼區的DNA qPCR分析係用於估算選殖基因插入拷貝數。該等分析的樣本是從生長在環境室的植物收集。該結果係和設計用來偵測一部分的單一拷貝原生基因的試驗的DNA qPCR結果比對，簡單事件(具有選殖基因的一或兩個拷貝)係繼續進行以供溫室的進一步研究。

此外，設計用來偵測一部分的大觀黴素抗性基因(SpecR；夾帶在T-DNA以外的二元載體質體上)的qPCR試驗係用於測定基因轉殖植物是否含有外來的嵌入質體骨架序列。

髮夾RNA轉錄體表現位準：Per 5 3'UTR qPCR。癒傷組織細胞事件或基因轉殖植物係藉由Per 5 3'UTR序列的即時定量PCR(qPCR)分析，以測定相較於編碼TIP41-樣蛋白質(即，GENBANK寄存號AT4G34270的玉蜀黍同源物；具有74%一致性的tBLASTX得分)的內部玉蜀黍基因(SEQ ID NO：59；GENBANK寄存號BT069734)的轉錄體位準的全長髮夾轉錄體的相對表現位準。RNA係使用RNeasy® 96套組(Qiagen,Valencia,CA)單離。在沖提後，根據套組的建議流程將總RNA投至DNAse1處理。隨後使RNA於NanoDrop 8000分光光度計(Thermo Scientific)定量並將濃度正規化至25ng/μL。首股cDNA係使用10μL反應體積的高容量cDNA合成套組(INVITROGEN)和5μL變性d RNA實質上根據製造商的建議流程製備。將該流程稍做調整，以包括添加10μL的100μM T20VN寡聚核苷酸(IDT)(SEQ ID NO：60；TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN，其中V為A、C、或G，且N為A、C、G、或T/U)至1mL管的隨機引子庫存混合物，以製備合併隨機引子與寡聚dT的工作庫存。

在cDNA合成後，樣本以不含核酸酶的水以1：3稀釋，並儲存於-20℃直到試驗。

StPIN II 3' UTR與TIP41-樣轉錄體的分別即時PCR試驗係於10μL反應體積的LightCycler® 480(Roche diagnostics,Indianapolis,IN)上進行。就PIN II試驗而言，反應係以引子StPinIIF2 TAG(SEQ ID NO：61)與StPinIIR2 TAG(SEQ ID NO：62)、與StPinIIFAM2 TAG(SEQ ID NO：101)運行。就TIP41-樣參考基因試驗而言，使用引子TIPmxF(SEQ ID NO：63)與TIPmxR(SEQ ID NO：64)、與以HEX(六氯螢光素)標記的探針HXTIP(SEQ ID NO：65)。

所有試驗包括無模板的負向控制組(僅混合物)。就標準曲線而言，空白(來源孔的水)亦包括在來源盤內，以檢查樣本交叉汙染。引子與探針序列係列於表7。供偵測各式轉錄體的反應組分配方係揭露於表8，PCR反應條件匯整於表9。FAM(6-羧基螢光素氨基亞酸酯)螢光部分係於465nm激發且螢光係於510nm測量；HEX(六氯螢光素)螢光部分的對應值為533nm與580nm。

資料係使用LightCycler®軟體v1.5分析，根據供應商的建議使用第二導數最大演算法計算Cq值之相對定量。就表現分析而言，表現值係使用△△Ct方法(即，2-(Cq標靶-Cq REF))計算，其倚賴比對兩目標之間的Cq值差異，將基底值選為2是就最佳化PCR反應而言，產物在每個循環變成兩倍的假定之下。

髮夾轉錄體尺寸與嵌入：北方墨點試驗。在一些例子中，基因轉殖植物的額外分子定性係使用北方墨點法(RNA墨點法)分析獲得，以測定表現Gho/Sec24B2髮夾dsRNA之基因轉殖植物的Gho/Sec24B2髮夾RNA分子尺寸。

所有材料與設備在使用前係以RNasezap(AMBION/INVITROGEN)處理。將組織樣本(100mg至500mg)收集在2mL safelock Eppendorf管中，以三顆鎢珠加1mL TRIzol(INVITROGEN)在Klecko^TM組織粉碎機(Garcia Manufacturing,Visalia,CA)中破壞5min，隨後於室溫(RT) 培育10min。任擇地，使樣本於4℃、11,000rpm離心10min，將上清液移至新鮮的2mL safelock Eppendorf管。在將200μL氯仿加至該均質物後，以倒置2至5min使該管混合，於RT培育10分鐘，並於4℃、12,000 x g離心15min。將上層相移至無菌1.5mL Eppendorf管，加入600μL 100%異丙醇，於RT培育10min至2hr，隨後於4℃至25℃、12,000 x g離心10min。將上清液丟棄，以1mL 70%乙醇洗滌RNA丸粒兩次，在洗滌之間，於4℃至25℃、7,500 x g離心10min。將乙醇丟棄，在再懸浮於50μL不含核酸酶的水之前，使丸粒短暫風乾3至5min。

總RNA係使用Nanodrop® 8000(Thermo-Fisher)正規化並將樣本正規化至5μg/10μL。隨後將10μL乙二醛(AMBION/INVITROGEN)加至各樣本。將五至14ng的DIG RNA標準標記混合物(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)分配並加至等體積的乙二醛中。樣本與標記RNAs係於50℃變性45min並儲存在冰上，直到載入溶於NorthernMax 10 X乙二醛運行緩衝液(AMBION/INVITROGEN)的1.25% SeaKem gold瓊脂(Lonza,Allendale,NJ)凝膠。RNAs係藉由於65伏特/30mA電泳2hr又15min分離。

在電泳後，該凝膠以2X SSC潤洗5min，並於gel doc工作站(BioRad,Hercules,CA)成像。隨後，使用10X SSC作為轉移緩衝液(20X SSC，包括3M氯化鈉與300mM檸檬酸三鈉，pH 7.0)，使RNA於RT被動地移至尼龍膜(Millipore)過夜。在轉移後，該膜以2X SSC潤洗5分鐘，RNA係UV-交聯至該膜(Agilent/Stratagene)，並使該膜於室溫乾燥長達2天。

使該膜於UltraHyb®緩衝液(AMBION/INVITROGEN)預先雜交1至2hr。探針係由藉助Roche Applied Science DIG程序以毛地黃毒苷(digoxigenin)標記、含感興趣序列(舉例來說，若適當的話，SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19的反股序列部分)的PCR擴增產物所構成。在建議緩衝液中進行的雜交係在雜交管中、於60℃溫度過夜。在雜交後，使墨點接受DIG洗滌、包裹、曝光至膜1至30分鐘，隨後使該膜顯影，以上皆依照DIG套組的供應商建議的方法。

選殖基因拷貝數測定。將約略等於2個葉片沖孔的玉蜀黍葉片收集在96-孔收集盤(Qiagen®)。組織破壞係以一個不銹鋼珠在Klecko^TM組織粉碎機(Garcia Manufacturing,Visalia,CA)於Biosprint96^TM AP1裂解緩衝液(Biosprint96^TM植物套組所供應；Qiagen®)進行。在組織消蝕後，基因組DNA(gDNA)係以高通量格式使用Biosprint96^TM植物套組與Biosprint96^TM萃取機械手單離。在設立qPCR反應前，基因組DNA被稀釋成2：3 DNA：水。

qPCR分析。藉由水解探針試驗的選殖基因偵測係使用LightCycler^®480系統以即時PCR進行。欲用於水解探針試驗以偵測聯結子序列(譬如ST-LS1，SEQ ID NO：21)、或偵測一部分的SpecR基因(即，二元載體質體上攜帶的大觀黴素抗性基因；SEQ ID NO：66；表10的SPC1寡聚核苷酸) 的寡聚核苷酸係使用LightCycler^®探針設計軟體2.0設計。再者，欲用於水解探針試驗以偵測AAD-1除草劑耐受性基因區段(SEQ ID NO：67；表10的GAAD1寡聚核苷酸)的寡聚核苷酸係使用引子表現軟體(Applied Biosystems)設計。表10顯示引子與探針的序列。試驗係以適用為內部參考序列的內源性玉蜀黍染色體基因(轉化酶(SEQ ID NO：68；GENBANK寄存號：U16123；本案稱作IVR1)的試劑多工化，以確保gDNA於各試驗中出現。就擴增而言，LightCycler^®480探針Master混合物(Roche Applied Science)係以1x最終濃度製備在含0.4μM各引子與0.2μM各探針的10μL體積多工反應(表11)。兩步驟擴增反應係如表12概述般進行。螢光團激活與FAM-與HEX-標記探針的發光係如上述；CY5共軛物的最大激發在650nm且螢光的最大值在670nm。

Cp得分(螢光信號與背景臨界值交錯的點)係由即時PCR資料使用擬合點演算法(LightCycler^®軟體1.5版)與相對定量模塊(以△△Ct方法為基礎)測定。資料係如前述般操作(RNA qPCR)。

實施例9：基因轉殖玉蜀黍的生物試驗

昆蟲生物試驗。植物細胞所製之本發明dsRNA的生物活性係藉由生物試驗方法證實。參閱，譬如Baum et al.(2007)Nat.Biotechnol.25(11)：1322-1326。吾人能夠藉由在受控的進食環境將，舉例來說，衍生自製造殺昆蟲dsRNA之植物的各式植物組織或組織碎片餵給標靶昆蟲來證實效力。或者，萃取物係由衍生自製造殺昆蟲dsRNA之植物的各式植物組織製備，所提取的核酸係如本案先前所述分配在人工膳食上方，以供生物試驗。此類進食試驗的結果係和運用來自不製造殺昆蟲dsRNA的宿主植物的適當控制組組織以類似方式執行的生物試驗比對、或和其他控制組樣本比對。在膳食測試上的標靶昆蟲的生長與存活相較於控制組的生長與存活係減少了。

基因轉殖玉蜀黍事件的昆蟲生物試驗。從洗滌過的卵孵化的兩隻西方玉米根蟲幼蟲(1至3日齡)被選擇並置於生物試驗托盤的各孔上。隨後使該孔覆以“PULL N' PEEL”標籤封面(BIO-CV-16,BIO-SERV)並置於18hr/6hr明/暗週期的28℃培育器。在首次侵擾的九天後，評估幼蟲的死亡，其以各處理昆蟲總數計算為死亡昆蟲百分比。觀察到顯著的死亡。將昆蟲樣本凍在-20℃兩天，隨後將各處理的昆蟲幼蟲倒出並秤重。生長抑制百分比係以實驗處理組的平均重量除以兩個控制孔處理組的平均重量計算。資料表示為(負向控制組的)生長抑制百分比。超過控制組平均重量的平均重量被正規化至零。觀察到顯著的生長抑制。

溫室的昆蟲生物試驗。在土壤中的西方玉米根蟲卵係從CROP CHARACTERISTICS(Farmington,MN)接收。使WCR卵於28℃培育10至11天。從土壤將卵洗出，置於0.15%瓊脂溶液，將濃度調為每份0.25mL約75至100個卵。帶有一份卵懸浮液的孵化盤被設置在培養皿中，以監控孵化率。

生長在ROOTRANERS^®的玉蜀黍植物的周圍土壤被150至200 WCR個卵侵染。使該昆蟲進食2周，在該時間後，對各植物提供「根分級」。基本上根據Oleson et al.(2005)J.Econ.Entomol.98：1-8的節點損傷量表係用於分級。將通過此生物試驗、顯示減少之損傷的植物移植至18.9升盆，以製造種子。移植物以殺蟲劑處理，以避免進一步的根蟲損傷與昆蟲在溫室的釋放。植物係以手授粉，以製造種子。該等植物所製種子被保留用於評估植物的T₁與後續世代。

溫室生物試驗包括兩種負向控制組植物。基因轉殖負向控制組植物係以夾帶設計為製造黃色螢光蛋白質(YFP)或YFP髮夾dsRNA(見實施例4)的基因的載體轉形所生成。非-經轉形負向控制組植物係由親代玉米品種7sh382或B104的種子長成。生物試驗在兩個分別的日期執行，負向控制組包括在各組植物材料中。

表13顯示Gho/Sec24B2-髮夾植物的分子分析與生物試驗的合併結果。檢查匯整於表13的生物試驗結果透露了出乎意料和出於預期的觀察，絕大多數夾帶表現包含SEQ ID NO：1區段(譬如SEQ ID NO：18與SEQ ID NO：19)之Gho/Sec24B2髮夾dsRNA的構築體的基因轉殖玉蜀黍植物係受到保護而免於西方玉米根蟲幼蟲進食所招致的根部損傷。37個分級事件當中的二十二個具有0.5或更低的根部分級。表14顯示負向控制組植物的分子分析與生物試驗的合併結果。大部分植物不具有免於WCR幼蟲進食的保護作用。

實施例10：包含鞘翅目害蟲序列的基因轉殖玉米

10-20株基因轉殖T₀玉米植物係如實施例6說明般生成。獲得以RNAi構築體表現髮夾dsRNA的另外的10-20株T₁玉米獨立系，以挑戰玉米根蟲。可如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19列示般、或另外包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：102、或SEQ ID NO：107來衍生髮夾dsRNA。額外髮夾dsRNAs係衍生自，舉例來說，鞘翅目害蟲序列，例如，舉例來說，Cafl-180(美國專利申請案公開案編號2012/0174258)、VatpaseC(美國專利申請案公開案編號 2012/0174259)、Rho1(美國專利申請案公開案編號2012/0174260)、VatpaseH(美國專利申請案公開案編號2012/0198586)、PPI-87B(美國專利申請案公開案編號2013/0091600)、RPA70(美國專利申請案公開案編號2013/0091601)、或RPS6(美國專利申請案公開案編號2013/0097730)。該等係經由RT-PCR或其他分子分析方法確認。

從選定的獨立T₁系製備總RNA係任擇地連同設計為結合在各別RNAi構築體的髮夾表現匣聯結子的引子用於RT-PCR。除此之外，在RNAi構築體的各別標靶基因的特異性引子係任擇地用於擴增與確認在植物製造siRNA所需的加工前mRNA的製造。各別標靶基因所欲帶的擴增確認了各別基因轉殖玉米植物中的髮夾RNA表現。標靶基因的dsRNA髮夾加工成siRNA係於後續任擇地使用RNA墨點雜交在獨立基因轉殖系中確認。

再者，具有和標靶基因超過80%序列一致性的錯配序列的RNAi分子係以類似於在具有和標靶基因100%序列一致性之RNAi分子所見的方式影響玉米根蟲。錯配序列和原生序列配對而在相同RNAi構築體形成髮夾dsRNA傳遞了能夠影響進食鞘翅目害蟲的生長、發育與生存力的植物加工siRNAs。

在植物中傳遞對應於標靶基因的dsRNA、siRNA或miRNA及鞘翅目害蟲經由後續進食攝入造成鞘翅目害蟲之標靶基因經由RNA-介導的基因靜默向下調控。當標靶基因的功能於一或多個發育階段極為重要時，鞘翅目害蟲的生長及/或發育受到影響，就WCR、NCR、SCR、MCR、黄瓜條葉甲、特氏斑點黄瓜條葉甲、與曼氏斑點黄瓜條葉甲之至少一者而言，造成鞘翅目害蟲無法成功侵染、進食、及/或發育、或造成死亡。隨後將標靶基因的選擇與RNAi的成功施用用於控制鞘翅目害蟲。

基因轉殖RNAi系與非經轉形玉米的表型比對。選定用於創建髮夾dsRNA的標靶鞘翅目害蟲基因或序列不具有和任何已知植物基因序列的相似度。因此，並不預期靶向該等鞘翅目害蟲基因或序列的構築體所製造或活化(全身性)的RNAi對於基因轉殖植物有任何不利效應。然而，基因轉殖系的發育與形態特性係和非-經轉形植物，以及經不具有髮夾-表現基因的「空白」載體轉形的基因轉殖系比對。針對植物根、芽、葉與和繁殖特性進行比對。基因轉殖與非-經轉形植物的根長與生長模式並無可觀察到的差異。植物芽特性，例如高度、葉數與尺寸、開花時間、花尺寸與外觀是類似的。一般而言，在體外與在溫室的土壤培養時，基因轉殖系與不表現標靶iRNA分子者之間並無可觀察到的形態差異。

實施例11：包含鞘翅目害蟲序列與額外RNAi構築體的基因轉殖玉米

包含轉錄成靶向鞘翅目害蟲以外之生物的iRNA分子的異源性編碼序列在其基因組的基因轉殖玉米植物係透過農桿菌或WHISKERS^TM方法二次轉形(見Petolino and Arnold(2009)Methods Mol.Biol.526：59-67)，以製造一或多個殺昆蟲dsRNA分子(舉例來說，至少一個dsRNA分子，其包括靶向包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：102、及/或SEQ ID NO：107之基因dsRNA分子)。基本上如實施例4所述製備的植物轉形質體載體係透過農桿菌或WHISKERS^TM-介導的轉形方法傳遞至獲自包含轉錄成靶向鞘翅目害蟲以外之生物的iRNA分子的異源性編碼序列在其基因組的基因轉殖Hi II或B104玉米植物的玉蜀黍懸浮液細胞或不成熟玉蜀黍胚芽。獲得製造供控制鞘翅目害蟲的iRNA分子與殺昆蟲蛋白質的雙重轉形植物。

實施例12：包含RNAi構築體與額外鞘翅目害蟲控制序列的基因轉殖玉米

包含轉錄成靶向鞘翅目害蟲生物的iRNA分子(舉例來說，至少一個dsRNA分子，其包括靶向包含SEQ ID NO：1,SEQ ID NO：102、或SEQ ID NO：107之基因的dsRNA分子)的異源性編碼序列在其基因組的基因轉殖玉米植物係透過農桿菌或WHISKERS^TM方法二次轉形(見Petolino and Arnold(2009)Methods Mol.Biol.526：59-67)，以製造一或多個殺昆蟲蛋白質分子，舉例來說，Cry3、Cry34與Cry35殺昆蟲蛋白質。基本上如實施例4所述製備的植物轉形質體載體係透過農桿菌或WHISKERS^TM-介導的轉形方法傳遞至獲自包含轉錄成靶向鞘翅目害蟲生物的iRNA分子的異源性編碼序列在其基因組的基因轉殖B104玉米植物的玉蜀黍懸浮液細胞或不成熟玉蜀黍胚芽。獲得製造供控制鞘翅目害蟲的iRNA分子與殺昆蟲蛋白質的雙重轉形植物。

實施例13：篩揀新熱帶褐椿(英雄美洲蝽)的候選標靶基因

新熱帶褐椿(BSB；英雄美洲蝽)群體。將BSB養在27℃、65%相對濕度、16：8小時明：暗週期的培育器中。將2-3天收集到的一克卵種在底部有濾紙盤的5L容器中，該容器係覆以#18篩目，以供通氣。各飼養容器產生300-400隻成年BSB。在所有階段，每週三次以新鮮青豆飼餵昆蟲，一包含有向日葵種子、大豆、與花生(3：1：1，以重量比例計)的種子混合物係每周更換一次。以棉花外加物作為吸液芯，在瓶中補水。在初始的兩周後，每周一次將昆蟲移至新的容器上。

BSB人工膳食。將新熱帶褐椿(BSB；英雄美洲蝽)養在如下文般製備的BSB人工膳食上。將凍乾青豆於MAGIC BULLET^®混拌機中拌成細末，同時生的(有機)花生在另一MAGIC BULLET^®混拌機中混拌。將所混拌的乾燥成分於大型MAGIC BULLET^®混拌機中合併(重量百分比：青豆，35%；花生，35%；蔗糖，5%；綜合維生素(譬如昆蟲用的Vanderzant維生素混合物，SIGMA-ALDRICH，型錄號V1007)，0.9%)，將其封蓋且充分振盪，以混合組分。隨後將混合的乾燥成分加至混合碗中。在分開的容器中，讓水與苯菌靈(benomyl)抗真菌劑(50ppm；25μL 20,000ppm溶液/50mL膳食溶液)充分混合，隨後加至乾燥成分混合物。用手混合所有成分，直到溶液完全混和。將膳食塑形成所欲尺寸，以鋁箔鬆散地包裹，於60℃加熱4小時，隨後冷卻並儲存於4℃。該人工膳食係於製備的兩週內使用。

BSB轉錄組組合。BSB發育的六個階段被選定用於製備mRNA庫。總RNA係從凍於-70℃的昆蟲提取，並在FastPrep^®-24儀器(MP BIOMEDICALS)上的Lysing MATRIX A 2mL管(MP BIOMEDICALS,Santa Ana,CA)的10倍體積裂解/結合緩衝液內均質。總mRNA係使用mirVana^TM miRNA單離套組(AMBION；INVITROGEN)根據製造商的流程提取。使用illumina^® HiSeq®系統(San Diego,CA)的RNA定序提供用於RNAi昆蟲控制技術的候選標靶基因序列。HiSeq®在六個樣本生成總共約3.78億個讀取。各別樣本的讀取係使用TRINITY®組合軟體(Grabherr et al.(2011)Nature Biotech.29：644-652)個別地組合。所組合轉錄體係合併生成匯集轉錄組。此BSB匯集轉錄組含有378,457個序列。

BSB Gho/Sec24B2同系物識別。BSB匯集轉錄組的tBLASTn搜尋係使用果蠅屬Sec24CD同系物(智人)蛋白質(即，sten或gho)Sec24CD-PB；GENBANK寄存號NP_001259917作為詢問序列進行。BSB Gho(SEQ ID NO：78與SEQ ID NO：79)係識別作為英雄美洲蝽候選標靶基因產物。

模板製備與dsRNA合成cDNA係使用TRIzol®試劑((LIFE TECHNOLOGIES)由提取自單一年輕的成年昆蟲(約90mg)的總BSB RNA製備。使昆蟲於室溫、1.5mL微量離心管中使用200μL的TRIzol®丸粒研杵(Fisherbrand型錄號12-141-363)與研杵馬達混合物(Cole-Parmer,Vernon Hills,IL)均質化。在均質化後，加入額外的800μL TRIzol®，使均質物渦旋，隨後於室溫培育五分鐘。藉由離心將細胞殘渣移除並將上清液移至新的管子。在製造商建議用於1mL TRIzol®的TRIzol®提取流程後，使RNA丸粒於室溫乾燥並使用第4類沖提緩衝液(即10mM Tris-HCl pH8.0)再懸浮於來自GFX PCR DNA AND Gel Extraction套組(illustra®；GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES)的200μL Tris緩衝液。RNA濃度係使用NanoDrop® 8000分光光度計(Thermo Scientific,Wilmington,DE)測定。

將200μL氯仿加入並使混合物渦旋15秒。使提取靜置於室溫2至3min後，藉由於4℃、12,000 x g離心15分鐘使相分離。小心地將上層水相移至另一不含核酸酶的1.5mL微量離心管，以500μL室溫異丙醇使RNA沉澱。於室溫培育十分鐘後，使混合物如上文般離心10分鐘。RNA丸粒以1mL室溫75%乙醇潤洗並如上文般再離心10分鐘。使RNA丸粒於室溫乾燥並使用第4類沖提緩衝液(即10mM Tris-HCl pH8.0)再懸浮於來自GFX PCR DNA AND Gel Extraction套組(illustra®；GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES)的200μL Tris緩衝液。RNA濃度係使用NanoDrop® 8000分光光度計(Thermo Scientific,Wilmington,DE)測定。

cDNA係使用供RT-PCR用的SuperScript III首股合成系統^TM(Invitrogen)由5μg BSB總RNA模板與寡聚dT 引子依照供應商的建議流程反向轉錄。轉錄反應的最終體積係以不含核酸酶的水加滿至100μL。

cDNA擴增。用以擴增BSB_Gho-1模板BSB_Gho-2-For(SEQ ID NO：91)的BSB_Gho-1-For(SEQ ID NO：89)與BSB_Gho-1-Rev(SEQ ID NO：90)，與用以擴增BSB_Gho-2模板的BSB_Gho-2-Rev(SEQ ID NO：92)，以及用以擴增BSB_Gho-3模板的BSB_Gho-3-For(SEQ ID NO：93)與BSB_Gho-3-Rev(SEQ ID NO：94)引子係以1μL cDNA(上文)作為模板用於遞減PCR(黏合溫度從60℃以每個循環減少1℃降至50℃)。包含Gho的397bp區段：BSB_Gho第1區，亦稱作BSB_Gho-1(SEQ ID NO：86)、Gho的494bp區段：BSB_Gho第2區，亦稱作BSB_Gho-2(SEQ ID NO：87)、與485bp BSB_Gho第3區，亦稱作BSB_Gho-3(SEQ ID NO：88)的片段分別在35個PCR循環期間生成。上述流程亦用於擴增301bp負向控制組模板YFPv2(SEQ ID NO：95)，使用YFPv2-F(SEQ ID NO：96)與YFPv2-R(SEQ ID NO：97)引子。BSB_Gho與YFPv2引子含有位於其5'端的T7噬菌體促進子序列(SEQ ID NO：7)，於是能夠使用YFPv2(SEQ ID NO：95)、BSB_Gho-1(SEQ ID NO：86)、BSB_Gho-2(SEQ ID NO：87)、與BSB_Gho-3(SEQ ID NO：88)DNA片段來轉錄dsRNA。

dsRNA合成。dsRNA係使用2μL PCR產物(上文)作為模板以根據製造商指示使用的MEGAscript® T7 RNAi套組(AMBION)合成。見圖1。dsRNA係於NANODROP® 8000分光光度計定量，並於不含核酸酶的0.1X TE緩衝液(1 mM Tris HCL,0.1mM EDTA,pH 7.4)稀釋至500ng/μL。

將dsRNA注入BSB血腔。將BSB-如同群體-養在27℃、65%相對濕度、16：8小時明：暗週期的培育器中的青豆與種子膳食上。二齡若蟲(各重達1至1.5mg)用小刷子輕輕處理，以避免損傷，並置於冰上培養皿，以冰凍固定昆蟲。各別昆蟲被注以55.2nL 500ng/μL dsRNA溶液(即，27.6ng dsRNA；每克體重的劑量為18.4至27.6μg)。注射係使用配備有從Drummond 88.9mm #3-000-203-G/X玻璃毛細管拔出的注射針頭的NANOJECT^TM II注射器(DRUMMOND SCIENTIFIC,Broomhall,PA)來進行。將針尖弄斷，並以輕質礦物油回填毛細管，隨後填入2至3μL dsRNA。將dsRNA注入若蟲的腹部(每個dsRNA、每次試驗注射10隻昆蟲)，在不同的三天重複試驗。將被注射的昆蟲(每孔5隻)移至含人工BSB膳食丸的32-孔托盤(Bio-RT-32飼養托盤；BIO-SERV,Frenchtown,NJ)，並覆以Pull-N-Peel^TM標籤(BIO-CV-4；BIO-SERV)。水分係藉由1.5mL微量離心管的1.25mL水以棉花吸液芯補充。托盤係於26.5℃、60%濕度、與16：8小時明：暗週期培育。存活力計數與重量是在注射7天後取得。

BSB_Gho為致死dsRNA標靶。如表15所匯整，2^nd齡BSB若蟲的血腔被注入27.6ng BSB_Gho-1(SEQ ID NO：86)、BSB_Gho-2(SEQ ID NO：87)、或BSB_Gho-3(SEQ ID NO：88)dsRNA，其在七天內製造高死亡率。以BSB_Gho-1、BSB_Gho-2、與BSB_Gho-3 dsRNA測到的死亡率係顯著不同於相同份量的注入YFPv2 dsRNA(負向控制組)的死亡率，分別為p=0.03135，p=0.003023，與p=0.005459(斯頓氏t-測試)。

實施例14：包含半翅目害蟲序列的基因轉殖玉米

夾帶包含SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87及/或SEQ ID NO：88之核酸的表現載體的十至20株基因轉殖T₀玉米植物係如實施例4說明般生成。獲得以RNAi構築體表現髮夾dsRNA的另外的10-20株T₁玉米獨立系，以挑戰BSB。髮夾dsRNA可衍生成包含SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：85、或其區段(譬如SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、與SEQ ID NO：88)。該等係經由RT-PCR或其他分子分析方法確認。從選定的獨立T₁系製備總RNA係任擇地連同設計為結合在各別RNAi構築體的髮夾表現匣聯結子的引子用於RT-PCR。除此之外，在RNAi構築體的各別標靶基因的特異性引子係任擇地用於擴增與確認在植物製造siRNA所需的加工前mRNA的製造。各別標靶基因所欲帶的擴增確認了各別基因轉殖玉米植物中的髮夾RNA表現。標靶基因的dsRNA髮夾加工成siRNA係於後續任擇地使用RNA墨點雜交在獨立基因轉殖系中確認。

再者，具有和標靶基因超過80%序列一致性的錯配序列的RNAi分子係以類似於在具有和標靶基因100%序列一致性之RNAi分子所見的方式影響半翅目。錯配序列和原生序列配對而在相同RNAi構築體形成髮夾dsRNA傳遞了能夠影響進食半翅目害蟲的生長、發育與生存力的植物加工siRNAs。

在植物中傳遞對應於標靶基因的dsRNA、siRNA或miRNA及半翅目害蟲經由後續進食攝入造成半翅目害蟲之標靶基因經由RNA-介導的基因靜默向下調控。當標靶基因的功能於一或多個發育階段極為重要時，半翅目害蟲的生長、發育、及/或存活受到影響，就英雄美洲蝽、紅肩綠蝽、褐翅椿、稻綠椿象、擬綠椿(Acrosternum hilare)、與褐臭椿之至少一者而言，造成半翅目害蟲無法成功侵染、進食、發育、及/或造成死亡。隨後將標靶基因的選擇與RNAi的成功施用用於控制半翅目害蟲。

基因轉殖RNAi系與非-經轉形玉米的表型比對。選定用於創建髮夾dsRNA的標靶半翅目害蟲基因或序列不具有和任何已知植物基因序列的相似度。因此，並不預期靶向該等半翅目害蟲基因或序列的構築體所製造或活化(全身性)的RNAi對於基因轉殖植物有任何不利效應。然而，基因轉殖系的發育與形態特性係和非-經轉形植物，以及經不具有髮夾-表現基因的「空白」載體轉形的基因轉殖系比對。針對植物根、芽、葉與和繁殖特性進行比對。基因轉殖與非-經轉形植物的根長與生長模式並無可觀察到的差異。植物芽特性，例如高度、葉數與尺寸、開花時間、花尺寸與外觀是類似的。一般而言，在體外與在溫室的土壤培養時，基因轉殖系與不表現標靶iRNA分子者之間並無可觀察到的形態差異。

實施例15：包含半翅目害蟲序列基因轉殖大豆

夾帶包含SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：85、或其區段(譬如SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、與SEQ ID NO：88)之核酸的表現載體的十至20個基因轉殖T₀大豆植物係如本領域習知般生成，包括，舉例來說，藉由下文農桿菌-介導的轉形。以氯氣消毒成熟大豆種子過夜，達十六小時。在以氯氣消毒後，將種子置於Laminar^TM通風櫥的開放容器中，以驅散氯氣。接著，使用黑盒子在黑暗中、24℃使消毒過的種子吸飽無菌H₂O，達十六小時。

製備裂種大豆。包含一部分胚胎軸的開裂大豆種子需要製備縱向切開的大豆種子材料，其係使用固定至解剖刀的#10刀片沿著種子的種臍分開移除種子外衣，並將種子分成兩個子葉部分。注意小心地部分除去胚胎軸，其中約1/2-1/3個胚胎軸仍連在子葉的節點端部。

接種。包含一部分胚胎軸的開裂大豆種子浸在含有包含SEQ ID NO：89及/或SEQ ID NO：91之二元質體的農桿菌(譬如EHA 101或EHA 105菌株)溶液約30分鐘。在浸漬包含胚胎軸的子葉之前，將農桿菌溶液稀釋成最終濃度為λ=0.6OD₆₅₀。

共同培養。在接種後，使開裂的大豆種子和農桿菌菌株在覆以一片濾紙之培養皿的共同培養介質(Agrobacterium Protocols,vol.2,2^nd Ed.,Wang,K.(Ed.)Humana Press,New Jersey,2006)上共同培養5天。

誘芽。在共同培養5天後，開裂的大豆種子係以由B5鹽、B5維生素、28mg/L亞鐵、38mg/L Na₂EDTA、30g/L蔗糖、0.6g/L MES、1.11mg/L BAP、100mg/L Timentin®、200mg/L頭孢噻肟(cefotaxime)、與50mg/L萬古黴素(vancomycin)(pH 5.7)構成的液體誘芽(SI)介質洗滌。隨後將開裂的大豆種子培養在由B5鹽、B5維生素、7g/L諾布爾瓊脂、28mg/L亞鐵、38mg/L Na₂EDTA、30g/L蔗糖、0.6g/L MES、1.11mg/L BAP、50mg/L Timentin®、200mg/L頭孢噻肟、50mg/L萬古黴素(pH 5.7構成的誘芽I(SI I)介質，同時使子葉的平面側朝上，子葉節點埋入介質中。培養2週後，將經轉形的開裂大豆種子的外植體移至含有補充有6mg/L草銨膦(Liberty^®)之SI I介質的誘芽II(SI II)介質。

芽延長。在SI II介質上培養2週後，將子葉從外植體移開並將含有胚胎軸的萌芽墊在子葉底部切割來切除。將從子葉單離的芽墊移至芽延長(SE)介質。SE介質係由MS鹽、28mg/L亞鐵、38mg/L Na₂EDTA、30g/L蔗糖與0.6g/L MES、50mg/L天門冬醯胺、100mg/L L-焦穀胺酸、0.1mg/L IAA、0.5mg/L GA3、1mg/L玉米素核苷、50mg/L Timentin®、200mg/L頭孢噻肟、50mg/L萬古黴素、6mg/L草銨膦、7g/L諾布爾瓊脂、(pH 5.7)。每2週將培養物移至新鮮的SE介質。使培養物在24℃與80-90μmol/m²sec光密度之18h光週期的Conviron®生長室中生長。

生根。從子葉芽墊伸長的芽係藉由子葉芽墊底部切割來單離，並使伸長的芽浸於1mg/L IBA(吲哚3-丁酸)1-3分鐘，以促進生根。接著，將伸長的芽移至在非塔(phyta)托盤中的生根介質(MS鹽、B5維生素、28mg/L亞鐵、38mg/L Na₂EDTA、20g/L蔗糖與0.59g/L MES、50mg/L天門冬醯胺、100mg/L L-焦穀胺酸、7g/L諾布爾瓊脂、pH 5.6)。

培養。在24℃、18h光週期的Conviron®生長室培養1-2週後，將已發展出根部的芽移到加蓋聖代杯子的土壤混拌物中並置於120-150μmol/m²sec光密度的長日照條件下(16小時明/8小時暗)、於恆常溫度(22℃)與濕度(40-50%)的Conviron®生長室(型號CMP4030與CMP3244，Controlled Environments Limited,Winnipeg,Manitoba,Canada)，以馴化幼小植株。讓生根幼小植株在聖代杯子適應數週，然後移至溫室進一步馴化並建立健壯的基因轉殖大豆植物。

獲得以RNAi構築體表現髮夾dsRNA的另外的10-20株T₁大豆獨立系，以挑戰BSB。髮夾dsRNA可衍生成包含SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：85、或其區段(譬如SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、與SEQ ID NO：88)。該等係經由RT-PCR或本領域習知的其他分子分析方法確認。從選定的獨立T₁系製備總RNA係任擇地連同設計為結合在各別RNAi構築體的髮夾表現匣聯結子的引子用於RT-PCR。除此之外，在RNAi構築體的各別標靶基因的特異性引子係任擇地用於擴增與確認在植物製造siRNA所需的加工前mRNA的製造。各別標靶基因所欲帶的擴增確認了各別基因轉殖大豆植物中的髮夾RNA表現。標靶基因的dsRNA髮夾加工成siRNA係於後續任擇地使用RNA墨點雜交在獨立基因轉殖系中確認。

具有和標靶基因超過80%序列一致性的錯配序列的RNAi分子係以類似於在具有和標靶基因100%序列一致性之RNAi分子所見的方式影響BSB。錯配序列和原生序列配對而在相同RNAi構築體形成髮夾dsRNA傳遞了能夠影響進食半翅目害蟲的生長、發育與生存力的植物加工siRNAs。

在植物中傳遞對應於標靶基因的dsRNA、siRNA、shRNA、或miRNA及半翅目害蟲經由後續進食攝入造成半翅目害蟲之標靶基因經由RNA-介導的基因靜默向下調控。當標靶基因的功能於一或多個發育階段極為重要時，半翅目害蟲的生長、發育、及/或存活受到影響，就英雄美洲蝽、紅肩綠蝽、褐翅椿、稻綠椿象、綠椿、褐臭椿、馬勒卡椿、弗卡待克蝽、地中海椿、新熱帶紅肩綠蝽、馬格那椿、諾比蟲、斑蝽、秘魯紅蝽、擬新扭白蟻、葉足蟲、尼氏蟲、與美國牧草盲蝽之至少一者而言，造成半翅目害蟲無法成功侵染、進食、及/或發育、或造成死亡。隨後將標靶基因的選擇與RNAi的成功施用用於控制半翅目害蟲。

基因轉殖RNAi系與非-經轉形大豆的表型比對。選定用於創建髮夾dsRNA的標靶半翅目害蟲基因或序列不具有和任何已知植物基因序列的相似度。因此，並不預期靶向該等半翅目害蟲基因或序列的構築體所製造或活化(全身性)的RNAi對於基因轉殖植物有任何不利效應。然而，基因轉殖系的發育與形態特性係和非-經轉形植物，以及經不具有髮夾-表現基因的「空白」載體轉形的基因轉殖系比對。針對植物根、芽、葉與和繁殖特性進行比對。基因轉殖與非-經轉形植物的根長與生長模式並無可觀察到的差異。植物芽特性，例如高度、葉數與尺寸、開花時間、花尺寸與外觀是類似的。一般而言，在體外與在溫室的土壤培養時，基因轉殖系與不表現標靶iRNA分子者之間並無可觀察到的形態差異。

實施例16：人工膳食上的英雄美洲蝽生物試驗。

在人工膳食上的Gho/Sec24B2 dsRNA進食試驗中，將32孔托盤置入~18mg人工膳食丸粒與水，如同注射實驗(見實施例13)。將200ng/μL濃度的dsRNA加至食物丸粒與水樣本；100μL至兩孔的各者。將五隻2^nd齡英雄美洲蝽若蟲引進各孔。水樣本與標靶YFP轉錄體的dsRNA係用作負向控制組。在不同的三天重複試驗。將存活昆蟲秤重，在處理8天後測定死亡率。相較於控制組孔，在提供有BSB_Gho dsRNA的孔觀察到顯著的死亡及/或生長抑制。

實施例17：包含半翅目害蟲序列的基因轉殖阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)

含有用於形成髮夾的包含Gho/Sec24B2區段(譬如SEQ ID NO：84及/或SEQ ID NO：85)之標靶基因構築體的阿拉伯芥(Arabidopsis)轉形載體係使用類似於實施例4的標準分子方法生成。阿拉伯芥轉形係使用標準的以農桿菌為主的流程進行。T₁種子係以草銨膦耐受性可擇標記挑選。生成基因轉殖的T₁阿拉伯芥植物且生成純合子的簡單拷貝T₂基因轉殖植物，以供昆蟲研究。生物試驗係以帶有花序的生長中的阿拉伯芥植物進行。將五至十隻昆蟲置於各植物上並在14天內監控存活。

建構阿拉伯芥轉形載體。以夾帶用於形成髮夾的包含Gho/Sec24B2區段(譬如SEQ ID NO：84及/或SEQ ID NO：85)之標靶基因構築體的進入載體pDAB3916為主的進入選殖體係使用化學合成片段(DNA2.0,Menlo Park,CA)組合與標準分子選殖方法來組裝。RNA初級轉錄體所形成的分子內髮夾係以下列促成，藉由(在單一轉錄單元內)使標靶基因區段的兩個拷貝彼此以相反方向排列，該兩個區段被聯結子序列分開(譬如ST-LS1內含子；SEQ ID NO：21)(Vancanneyt et al.(1990)Mol.Gen.Genet.220(2)：245-50)。於是，於是，初級mRNA轉錄體含有被聯結子序列分開之作為彼此的大型反向重複的兩個Gho/Sec24B2基因區段序列。一份拷貝的促進子(譬如阿拉伯芥泛素10促進子(Callis et al.(1990)J.Biological Chem.265：12486-12493))係用於驅動產生初級mRNA髮夾轉錄體，包含來自農桿菌開放讀取框23的3'未轉譯區的一片段(AtuORF23 3' UTR v1；US專利5,428,147)係用於終止髮夾-RNA-表現基因的轉錄。

進入載體之內的髮夾選殖體係連同二元目的載體(pDAB101836)用於標準GATEWAY^®重組反應，以製造用於農桿菌-介導之阿拉伯芥轉形的髮夾RNA表現轉形載體。

二元目的載體pDAB101836包含除草劑耐受性基因、DSM-2v2(美國專利申請號2011/0107455)、在木薯葉脈鑲嵌病毒促進子(CsVMV促進子v2，美國專利7,601,885；Verdaguer et al.(1996)Plant Mol.Biol.31：1129-39)調控之下。包含來自農桿菌開放讀取框1的3'未轉譯區的一片段(AtuORF1 3' UTR v6；Huang et al.(1990)J.Bacteriol.172：1814-22)係用於終止DSM2v2 mRNA的轉錄。

包含表現YFP髮夾RNA之基因的負向控制組二元構築體pDAB114507係藉由標準GATEWAY^®重組反應以典型的二元目的載體(pDAB101836)與進入載體pDAB3916建構。進入構築體pDAB112644係包含在阿拉伯芥泛素10促進子(上文)表現控制之下的YFP髮夾序列(hpYFP v2-1,SEQ ID NO：100)與包含農桿菌ORF23 3'未轉譯區之一片段(上文)。

製造包含殺昆蟲髮夾RNAs的基因轉殖阿拉伯芥：農桿菌-介導的轉形。含有髮夾序列的二元質體係以電穿孔方式進入農桿菌菌株GV3101(pMP90RK)。重組農桿菌選殖體係以重組農桿菌選殖體的質體製備的限制分析來確認。Qiagen Plasmid Max Kit(Qiagen,Cat# 12162)係用於依照製造商建議的流程從農桿菌培養物提取質體。

阿拉伯芥轉形與T₁選擇。使十二至十五株阿拉伯芥植物(哥倫比亞培養品種)生長在溫室的4"盆中，光密度為250μmol/m²、25℃、與18：6小時的明：暗條件。轉形前一週修剪初級花莖。農桿菌接種物係藉由將10μL重組農桿菌甘油庫存液培育於28℃、100mL LB發酵液(Sigma L3022)+100mg/L大觀黴素+50mg/L卡那黴素並於225rpm晃動72小時來製備。在浸漬花之前，農桿菌細胞被採收並懸浮於5%蔗糖+0.04% Silwet-L77(Lehle Seeds Cat # VIS-02)+10μg/L苄胺基嘌呤(BA)溶液至OD₆₀₀ 0.8~1.0。使植物的地上部分浸在農桿菌溶液5-10分鐘，同時溫和攪動。隨後將植物移至溫室，以定期澆水和施肥正常生長，直到採集種子。

實施例18：基因轉殖阿拉伯芥的生長與生物試驗

選擇經髮夾RNAi構築體轉形的T₁阿拉伯芥。使各別轉形的至多200mg T₁種子於0.1%瓊脂溶液分層。將種子種在#5日照介質的發芽托盤(10.5”x 21”x 1”；T.O.Plastics Inc.,Clearwater,MN.)。在種植6與9天後，以280g/ha Ignite^®(草銨膦)耐受性選擇轉形體。將選定事件移植到4”直徑盆。插入拷貝數分析係使用Roche LightCycler® 480透過水解定量即時PCR(qPCR)在移植一週內進行。PCR引子與水解探針係使用LightCycler®探針設計軟體2.0(Roche)針對DSM2v2可擇標記設計。使該盤維持於24℃，在100-150mE/m²s密度之螢光燈和白熾燈下的16：8小時明：暗光週期。

英雄美洲蝽植物進食生物試驗。為各別構築體選定至少四個低拷貝數(1-2個插入)、四個中等拷貝數(2-3個插入)、與四個高拷貝數(4個插入)事件。讓植物生長到繁殖階段(含有花和長莢的植物)。土壤表面係覆有~50mL體積的白沙，以易於識別昆蟲。將五至十隻2^nd齡英雄美洲蝽若蟲引進各別植物上。植物被覆蓋直徑3”、高16”及壁厚0.03”的塑料管(項目編號484485，Visipack Fenton MO)；該管係覆有尼龍篩目以隔離昆蟲。使植物在生長室(conviron)維持正常溫度、光、澆水條件。在14天後，收集昆蟲並秤重；計算死亡百分比以及生長抑制(1-重量處理/重量控制)。 YFP髮夾-表現植物係用於控制。相較於控制組植物的若蟲，觀察到在基因轉殖Gho/Sec24B2 dsRNA植物上進食的若蟲的顯著死亡及/或生長抑制。

T₂阿拉伯芥種子生成與T₂生物試驗。對於各別構築體，T₂種子係製自選定低拷貝數(1-2個插入)事件。將植物(純合子及/或雜合子)投至如上所述的英雄美洲蝽進食生物試驗。採收純合子的T₃種子並儲存以供未來分析。

實施例19：額外作物物種的轉形

棉花係經Gho/Sec24B2及/或Sec24B1(有或無葉綠體轉運肽)轉形，以利用熟習此藝者習知的方法提供鞘翅目及/或半翅目昆蟲的控制，舉例來說，先前說明於美國專利7,838,733的實施例14、或PCT國際專利公開案編號WO 2007/053482的實施例12的實質上相同技術。

實施例20：用於昆蟲管理的Gho/Sec24B2及/或Sec24B1 dsRNA

Gho/Sec24B2及/或Sec24B1 dsRNA選殖基因於基因轉殖植物中係和其他dsRNA分子合併，以提供冗餘的RNAi靶向與協同的RNAi效應。基因轉殖植物包括，舉例來說而不限於，表現靶向Gho/Sec24B2及/或Sec24B1之dsRNA的玉米、大豆、與棉花，以避免鞘翅目及半翅目昆蟲所致的進食損傷。Gho/Sec24B2及/或Sec24B1 dsRNA選殖基因於植物中亦和蘇力菌殺昆蟲蛋白質技術合併，以代表昆蟲抗性管理基因金字塔的新穎作用模式。在基因轉殖植物中，當和靶向昆蟲害蟲的其他dsRNA分子、及/或和蘇力菌殺昆蟲蛋白質合併時，觀察到亦減緩抗性昆蟲群體之發育的協同殺昆蟲效應。

<110> 陶氏農業科學公司內布拉斯加大學董事會

<120> 控制鞘翅目及半翅目害蟲之GHO/SEC24B2以及SEC24B1核酸分子

<130> 2971-P12413US(75878-US-PSP)

<160> 127

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3664

<212> DNA

<213> 西方玉米根蟲

<400> 1

<210> 2

<211> 1083

<212> PRT

<213> 西方玉米根蟲

<400> 2

<210> 3

<211> 320

<212> DNA

<213> 西方玉米根蟲

<400> 3

<210> 4

<211> 418

<212> DNA

<213> 西方玉米根蟲

<400> 4

<210> 5

<211> 287

<212> DNA

<213> 西方玉米根蟲

<400> 5

<210> 6

<211> 128

<212> DNA

<213> 西方玉米根蟲

<400> 6

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T7促進子寡核苷酸

<400> 7

<210> 8

<211> 503

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> YFP部分編碼區

<400> 8

<210> 9

<211> 376

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GFP部分編碼區

<400> 9

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子sec24BT7_F

<400> 10

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子sec24BT7_R

<400> 11

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子gho-2F

<400> 12

<210> 13

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子gho-2R

<400> 13

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子Gho_v1F

<400> 14

<210> 15

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子Gho_v1R

<400> 15

<210> 16

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子Gho_v2F

<400> 16

<210> 17

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子Gho_v2R

<400> 17

<210> 18

<211> 839

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼Sec24B2 v1 hpRNA之DNA

<400> 18

<210> 19

<211> 521

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼Sec24B2 v2 hpRNA之DNA

<400> 19

<210> 20

<211> 471

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼YFP v2 hpRNA之DNA

<400> 20

<210> 21

<211> 225

<212> DNA

<213> 馬鈴薯

<400> 21

<210> 22

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> YFP基因

<400> 22

<210> 23

<211> 218

<212> DNA

<213> 西方玉米根蟲

<400> 23

<210> 24

<211> 424

<212> DNA

<213> 西方玉米根蟲

<220>

<221> misc_feature

<222> (393)..(395)

<223> n為a、c、g、或t

<400> 24

<210> 25

<211> 397

<212> DNA

<213> 西方玉米根蟲

<400> 25

<210> 26

<211> 490

<212> DNA

<213> 西方玉米根蟲

<400> 26

<210> 27

<211> 330

<212> DNA

<213> 西方玉米根蟲

<400> 27

<210> 28

<211> 320

<212> DNA

<213> 西方玉米根蟲

<400> 28

<210> 29

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GFP引子

<400> 29

<210> 30

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GFP引子

<400> 30

<210> 31

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子YFP-F_T7

<400> 31

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子YFP-R

<400> 32

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子YFP-F

<400> 33

<210> 34

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子YFP-R_T7

<400> 34

<210> 35

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子Ann-F1_T7

<400> 35

<210> 36

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子Ann-R1

<400> 36

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子Ann-F1

<400> 37

<210> 38

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子Ann-R1_T7

<400> 38

<210> 39

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子Ann-F2_T7

<400> 39

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子Ann-R2

<400> 40

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子Ann-F2

<400> 41

<210> 42

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子Ann-R2_T7

<400> 42

<210> 43

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子Betasp2-F1_T7

<400> 43

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子Betasp2-R1

<400> 44

<210> 45

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子Betasp2-F1

<400> 45

<210> 46

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子Betasp2-R1_T7

<400> 46

<210> 47

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子Betasp2-F2_T7

<400> 47

<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子Betasp2-R2

<400> 48

<210> 49

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子Betasp2-F2

<400> 49

<210> 50

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子Betasp2-R2_T7

<400> 50

<210> 51

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子L4-F1_T7

<400> 51

<210> 52

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子L4-R1

<400> 52

<210> 53

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子L4-F1

<400> 53

<210> 54

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子L4-R1_T7

<400> 54

<210> 55

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子L4-F2_T7

<400> 55

<210> 56

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子L4-R2

<400> 56

<210> 57

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子L4-F2

<400> 57

<210> 58

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子L4-R2_T7

<400> 58

<210> 59

<211> 1150

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 59

<210> 60

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T20VN引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> n為a、c、g、或t

<400> 60

<210> 61

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子StPinIIF2 TAG

<400> 61

<210> 62

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子StPinIIR2 TAG

<400> 62

<210> 63

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子TIPmxF

<400> 63

<210> 64

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子TIPmxR

<400> 64

<210> 65

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HXTIP探針

<400> 65

<210> 66

<211> 151

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<400> 66

<210> 67

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAD1編碼區

<400> 67

<210> 68

<211> 4233

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 68

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子GAAD1-F

<400> 69

<210> 70

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子GAAD1-R

<400> 70

<210> 71

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子GAAD1-P(FAM)

<400> 71

<210> 72

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子IVR1-F

<400> 72

<210> 73

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子IVR1-R

<400> 73

<210> 74

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IVR1-P(HEX)

<400> 74

<210> 75

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子SPC1A

<400> 75

<210> 76

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子SPC1S

<400> 76

<210> 77

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TQSPEC(CY5)探針

<400> 77

<210> 78

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子ST-LS1-F

<400> 78

<210> 79

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子ST-LS1-R

<400> 79

<210> 80

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針ST-LS1-P(FAM)

<400> 80

<210> 81

<211> 633

<212> DNA

<213> 西方玉米根蟲

<400> 81

<210> 82

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 肌動蛋白引子

<400> 82

<210> 83

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 肌動蛋白引子

<400> 83

<210> 84

<211> 4273

<212> DNA

<213> 英雄美洲蝽

<400> 84

<210> 85

<211> 4809

<212> DNA

<213> 英雄美洲蝽

<400> 85

<210> 86

<211> 397

<212> DNA

<213> 英雄美洲蝽

<400> 86

<210> 87

<211> 494

<212> DNA

<213> 英雄美洲蝽

<400> 87

<210> 88

<211> 485

<212> DNA

<213> 英雄美洲蝽

<400> 88

<210> 89

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子BSB_Gho-1-For

<400> 89

<210> 90

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子BSB_Gho-1-Rev

<400> 90

<210> 91

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子BSB_Gho-2-For

<400> 91

<210> 92

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子BSB_Gho-2-Rev

<400> 92

<210> 93

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子BSB_Gho-3-For

<400> 93

<210> 94

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子BSB_Gho-3-Rev

<400> 94

<210> 95

<211> 301

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> YFPv2基因

<400> 95

<210> 96

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子YFPv2-F

<400> 96

<210> 97

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子YFPv2-R

<400> 97

<210> 98

<211> 1184

<212> PRT

<213> 英雄美洲蝽

<400> 98

<210> 99

<211> 1157

<212> PRT

<213> 英雄美洲蝽

<400> 99

<210> 100

<211> 410

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼之DNAYFP v2-1 hpRNA

<400> 100

<210> 101

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子StPinIIFAM2 TAG

<400> 101

<210> 102

<211> 4297

<212> DNA

<213> 西方玉米根蟲

<400> 102

<210> 103

<211> 1180

<212> PRT

<213> 西方玉米根蟲

<400> 103

<210> 104

<211> 205

<212> DNA

<213> 西方玉米根蟲

<400> 104

<210> 105

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子Sec24B1_F

<400> 105

<210> 106

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子Sec24B1_R

<400> 106

<210> 107

<211> 4488

<212> DNA

<213> 西方玉米根蟲

<400> 107

<210> 108

<211> 1180

<212> PRT

<213> 西方玉米根蟲

<400> 108

<210> 109

<211> 444

<212> DNA

<213> 西方玉米根蟲

<400> 109

<210> 110

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子Sec24B2_Reg3_F

<400> 110

<210> 111

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子Sec24B2_Reg3_R

<400> 111

<210> 112

<211> 3664

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反股Sec24B2聚核苷酸

<400> 112

<210> 113

<211> 320

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反股Sec24B2 reg1聚核苷酸

<400> 113

<210> 114

<211> 418

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反股Sec24B2 reg2聚核苷酸

<400> 114

<210> 115

<211> 287

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反股Sec24B2 ver1聚核苷酸

<400> 115

<210> 116

<211> 128

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反股Sec24B2 ver2聚核苷酸

<400> 116

<210> 117

<211> 839

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Sec24B2 v1 hpRNA

<400> 117

<210> 118

<211> 521

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Sec24B2 v2 hpRNA

<400> 118

<210> 119

<211> 4273

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反股BSB_Gho聚核苷酸

<400> 119

<210> 120

<211> 4809

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反股BSB_Gho聚核苷酸

<400> 120

<210> 121

<211> 397

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反股BSB_Gho-1聚核苷酸

<400> 121

<210> 122

<211> 494

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反股BSB_Gho-2聚核苷酸

<400> 122

<210> 123

<211> 485

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反股BSB_Gho-3聚核苷酸

<400> 123

<210> 124

<211> 4297

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反股Sec24B1聚核苷酸

<400> 124

<210> 125

<211> 205

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反股Sec24B1 reg1聚核苷酸

<400> 125

<210> 126

<211> 4488

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反股Sec24B2聚核苷酸

<400> 126

<210> 127

<211> 444

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反股Sec24B2 reg3聚核苷酸

<400> 127

Claims

一種單離核酸，該核酸包含操作性地聯結至一異源性促進子的至少一個聚核苷酸，其中該聚核苷酸係選自於由下列所構成之群組：SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：1的互補體；SEQ ID NO：1之至少15個鄰接核苷酸片段；SEQ ID NO：1之至少15個鄰接核苷酸片段的互補體；包含SEQ ID NO：1的條葉甲屬(Diabrotica)生物的原生編碼序列；包含SEQ ID NO：1的條葉甲屬生物的原生編碼序列的互補體；包含SEQ ID NO：1的條葉甲屬生物的原生編碼序列之至少15個鄰接核苷酸片段；包含SEQ ID NO：1的條葉甲屬生物的原生編碼序列之至少15個鄰接核苷酸片段的互補體；SEQ ID NO：102；SEQ ID NO：102的互補體；SEQ ID NO：102之至少15個鄰接核苷酸片段；SEQ ID NO：102之至少15個鄰接核苷酸片段的互補體；包含SEQ ID NO：102的條葉甲屬生物的原生編碼序列；包含SEQ ID NO：102的條葉甲屬生物的原生編碼序列的互補體；包含SEQ ID NO：102的條葉甲屬生物的原生編碼序列之至少15個鄰接核苷酸片段；包含SEQ ID NO：102的條葉甲屬生物的原生編碼序列之至少15個鄰接核苷酸片段的互補體；SEQ ID NO：107；SEQ ID NO：107的互補體；SEQ ID NO： 107之至少15個鄰接核苷酸片段；SEQ ID NO：107之至少15個鄰接核苷酸片段的互補體；包含SEQ ID NO：107的條葉甲屬生物的原生編碼序列；包含SEQ ID NO：107的條葉甲屬生物的原生編碼序列的互補體；包含SEQ ID NO：107的條葉甲屬生物的原生編碼序列之至少15個鄰接核苷酸片段；包含SEQ ID NO：107的條葉甲屬生物的原生編碼序列之至少15個鄰接核苷酸片段的互補體；SEQ ID NO：84；SEQ ID NO：84的互補體；SEQ ID NO：84之至少15個鄰接核苷酸片段；SEQ ID NO：84之至少15個鄰接核苷酸片段的互補體；包含SEQ ID NO：84的美洲蝽屬(Euschistus)生物的原生編碼序列；包含SEQ ID NO：84的美洲蝽屬生物的原生編碼序列的互補體；包含SEQ ID NO：84的美洲蝽屬生物的原生編碼序列之至少15個鄰接核苷酸片段；包含SEQ ID NO：84的美洲蝽屬生物的原生編碼序列之至少15個鄰接核苷酸片段的互補體；SEQ ID NO：85；SEQ ID NO：85的互補體；SEQ ID NO：85之至少15個鄰接核苷酸片段；SEQ ID NO：85之至少15個鄰接核苷酸片段的互補體；包含SEQ ID NO：85的美洲蝽屬生物的原生編碼序列；包含SEQ ID NO：85的美洲蝽屬生物的原生編碼序列的互補體；包含SEQ ID NO：85的美洲蝽屬生物的原生編碼序列之至少15個鄰接核苷酸片段；以及包含SEQ ID NO：85的美洲蝽屬生物的原生編碼序列之至少15個鄰接核苷酸片段的互補體。
如請求項1之聚核苷酸，其中該聚核苷酸係選自於由下列所構成之群組：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、以及前述任一者的互補體。
一種植物轉形載體，其包含如請求項1之聚核苷酸。
如請求項1之聚核苷酸，其中該生物係選自於由下列所構成之群組：西方玉米根蟲(D.v.virgifera LeConte)；北方玉米根蟲(D.barberi Smith and Lawrence)；南方玉米根蟲(D.u.howardi)；墨西哥玉米根蟲(D.v.zeae)；黄瓜條葉甲(D.balteata LeConte)；特氏斑點黄瓜條葉甲(D.u.tenella)；曼氏斑點黄瓜條葉甲(D.u.undecimpunctata Mannerheim)；英雄美洲蝽(Euschistus heros(Fabr.))(新熱帶褐椿)、稻綠椿象(Nezara viridula(L.))(南方綠椿)、紅肩綠蝽(Piezodorus guildinii(Westwood))(紅帶蝽象)、褐翅椿(Halyomorpha halys(Stål))(褐翅椿象)、綠椿(Chinavia hilare(Say))(綠椿象)、褐臭椿(E.servus(Say)(褐椿象)、馬勒卡椿(Dichelops melacanthus(Dallas))、弗卡待克蝽(D.furcatus(F.))、地中海椿(Edessa meditabunda(F.))、新熱帶紅肩綠蝽(Thyanta perditor(F.)) (新熱帶紅肩綠蝽象)、馬格那椿(Chinavia marginatum(Palisot de Beauvois))、諾比蟲(Horcias nobilellus(Berg))(棉花蟲)、斑蝽(Taedia stigmosa(Berg))、秘魯紅蝽(Dysdercus peruvianus(Guérin-Méneville))、擬新扭白蟻(Neomegalotomus parvus(Westwood))、葉足蟲(Leptoglossus zonatus(Dallas))、尼氏蟲(Niesthrea sidae(F.))、草盲蝽(Lygus hesperus(Knight))(西部牧草盲蝽)、和美國牧草盲蝽(Lygus lineolaris(Palisot de Beauvois))。
一種核糖核酸(RNA)分子，其係由如請求項1之聚核苷酸所轉錄。
一種雙股核糖核酸分子，其係由如請求項1之聚核苷酸之表現所製造。
如請求項6之雙股核糖核酸分子，其中以一鞘翅目或半翅目害蟲接觸該聚核苷酸序列係抑制特異性地互補至該聚核苷酸之內源性核苷酸序列的表現。
如請求項7之雙股核糖核酸分子，其中以一鞘翅目或半翅目害蟲接觸該核糖核苷酸分子係殺死或抑制該害蟲的生長、及/或進食。
如請求項6之雙股RNA，包含一第一、一第二與一第三RNA區段，其中該第一RNA區段包含該聚核苷酸，其中該第三RNA區段係藉由該第二聚核苷酸序列聯結至該第一RNA區段，且其中該第三RNA區段實質上為該第一RNA區段的反向互補體，俾使該第一與該第三RNA區段在轉錄成一核糖核酸時雜交，以形成該雙股RNA。
如請求項5之RNA，其係選自於由下列所構成之群組：長度介於約15個與約30個核苷酸之間的一雙股核糖核酸分子與一單股核糖核酸分子。
一種植物轉形載體，其包含如請求項1之聚核苷酸，其中該異源性促進子係於一植物細胞內發揮功能。
一種細胞，其係經如請求項1之聚核苷酸轉形。
如請求項12之細胞，其中該細胞為一原核細胞。
如請求項12之細胞，其中該細胞為一真核細胞。
如請求項14之細胞，其中該細胞為一植物細胞。
一種植物，其係經如請求項1之聚核苷酸轉形。
一種如請求項16之植物的種子，其中該種子包含該聚核苷酸。
一種由如請求項16之植物所製造的商品，其中該商品包含一可偵測量之該聚核苷酸。
如請求項16之植物，其中該至少一個聚核苷酸係以一雙股核糖核酸分子在植物內表現。
如請求項15之細胞，其中該細胞為玉蜀黍、大豆、或棉花細胞。
如請求項16之植物，其中該植物為玉蜀黍、大豆、或棉花。
如請求項16之植物，其中該至少一個聚核苷酸係以核糖核酸分子在植物內表現，當鞘翅目或半翅目害蟲攝食該植物的一部分時，該核糖核酸分子係抑制特異性地互補至該至少一個聚核苷酸之內源性聚核苷酸的表現。
如請求項1之聚核苷酸，其更包含編碼有抑制內源性害蟲基因表現的RNA分子的至少一個額外聚核苷酸。
一種植物轉形載體，其包含如請求項23之聚核苷酸，其中該(多個)額外聚核苷酸係各別操作性地聯結至在植物細胞內發揮功能的異源性促進子。
一種用於控制昆蟲害蟲群體的方法，該方法包含提供包含核糖核酸(RNA)分子之一劑，該劑在接觸到昆蟲害蟲後發揮功能，以抑制該害蟲內的生物功能，其中該RNA可和一聚核苷酸特異性地雜交，該聚核苷酸選自於由下列所構成之群組：SEQ ID NOs：112-127；SEQ ID NOs：112-127之任一者的互補體；SEQ ID NOs：112-127之任一者的至少15個鄰接核苷酸片段；SEQ ID NOs：112-127之任一者的至少15個鄰接核苷酸片段的互補體；SEQ ID NOs：1、84、85、102、與107之任一者的轉錄體；SEQ ID NOs：1、84、85、102、與107之任一者的轉錄體的互補體。
如請求項25之方法，其中該劑為一雙股RNA分子。
如請求項25之方法，其中該昆蟲害蟲為一鞘翅目或半翅目害蟲。
一種用於控制鞘翅目或半翅目害蟲群體的方法，該方法包含，提供包含一第一與一第二聚核苷酸序列之一劑，該劑在接觸到該鞘翅目害蟲後發揮功能，以抑制該鞘翅目害蟲內的生物功能，其中該第一聚核苷酸序列包含一區，該區展現和選自於由SEQ ID NOs：112-116與124-127所構成群組之一序列中約15至約30個鄰接核苷酸之約90%至約100%序列一致性，且其中該第一聚核苷酸序列特異性地雜交至該第二聚核苷酸序列。
一種用於控制鞘翅目或半翅目害蟲群體的方法，該方法包含：提供一鞘翅目或半翅目害蟲之宿主植物內的一經轉形植物細胞，該細胞包含如請求項1之聚核苷酸，其中該聚核苷酸係經表現，以製造一核糖核酸分子，該分子在接觸到屬於該群體之一鞘翅目或半翅目害蟲後發揮功能，以抑制該鞘翅目或半翅目害蟲內標靶序列的表現並導致該鞘翅目或半翅目害蟲或害蟲群體生長及/或存活減少，其係相較於不包含該聚核苷酸的相同宿主植物物種之植物上的相同害蟲物種。
如請求項29之方法，其中該核糖核酸分子為一雙股核糖核酸分子。
如請求項29之方法，其中相較於侵擾缺少該經轉形植物細胞之一相同宿主植物物種之宿主植物的相同害蟲物種群體，該鞘翅目或半翅目害蟲群體係減少了。
如請求項29之方法，其中該核糖核酸分子為一雙股核糖核酸分子。
如請求項30之方法，其中相較於侵擾缺少該經轉形植物細胞之一相同物種宿主植物的鞘翅目或半翅目害蟲群體，該鞘翅目或半翅目害蟲群體係減少了。
一種用於在植物控制昆蟲害蟲侵擾的方法，該方法包含在該昆蟲害蟲的膳食中提供一和選自於由下列所構成之群組的一聚核苷酸可特異性地雜交的核糖核酸(RNA)：SEQ ID NOs：112-127；SEQ ID NOs：112-127之任一者的互補體；SEQ ID NOs：112-116與119-127之任一者的至少15個鄰接核苷酸片段；SEQ ID NOs：112-116與119-127之任一者的至少15個鄰接核苷酸片段的互補體；SEQ ID NOs：1、84、85、102、與107之任一者的轉錄體；SEQ ID NOs：1、84、85、102、與107之任一者的轉錄體的互補體；SEQ ID NOs：1、84、85、102、與107之任一者的轉錄體的至少15個鄰接核苷酸片段；以及SEQ ID NOs：1、84、85、102、與107之任一者的轉錄體的至少15個鄰接核苷酸片段的互補體。
如請求項34之方法，其中該膳食包含一經轉形以表現該聚核苷酸之植物細胞。
如請求項34之方法，其中該可特異性地雜交的RNA被包含在一雙股RNA分子之內。
一種用於改善玉米作物產量的方法，該方法包含：將如請求項1之核酸引進一玉米植物，以製造一基因轉殖玉米植物；以及培養該玉米植物，以容許該至少一個聚核苷酸表現；其中該至少一個聚核苷酸的表現係抑制鞘翅目及/或半翅目害蟲的發育或生長以及由於鞘翅目及/或半翅目害蟲侵染所致的產量損失。
如請求項37之方法，其中該至少一個聚核苷酸的表現製造一RNA分子，該RNA分子係壓抑已接觸一部分玉米植物的鞘翅目及/或半翅目害蟲內的至少一第一標靶基因。
一種用於製造一基因轉殖植物細胞的方法，該方法包含，以一包含如請求項1之核酸的載體轉形一植物細胞；在足以容許包含複數個經轉形之植物細胞的植物細胞培養物發育的條件下培養該經轉形之植物細胞；選擇該至少一個聚核苷酸已嵌入其基因組的經轉形植物細胞；就至少一個聚核苷酸所編碼之核糖核酸(RNA)分子的表現，篩揀該經轉形植物細胞；以及選擇表現該RNA的植物細胞。
如請求項39之方法，其中該RNA分子為雙股RNA分子。
一種用於製造一抵抗鞘翅目及/或半翅目害蟲之基因轉殖植物的方法，該方法包含：提供如請求項39之方法所製造的基因轉殖植物細胞；以及從該基因轉殖植物細胞再生一基因轉殖植物，其中該至少一個聚核苷酸所編碼之核糖核酸分子的表現係足以調節接觸該經轉形植物之一鞘翅目及/或半翅目害蟲內的標靶基因的表現。
一種用於製造一基因轉殖植物細胞的方法，該方法包含，以包含保護植物免於鞘翅目害蟲之措施的一載體轉形一植物細胞；在足以容許包含複數個經轉形之植物細胞的植物細胞培養物發育的條件下培養該經轉形植物細胞；選擇該提供鞘翅目害蟲抗性至一植物之措施已嵌入其基因組的經轉形植物細胞；就該抑制鞘翅目害蟲內之關鍵基因表現之措施的表現，篩揀該經轉形植物細胞；以及選擇表現該抑制鞘翅目害蟲內之關鍵基因表現之措施的一植物細胞。
一種用於製造一抵抗鞘翅目害蟲之基因轉殖植物的方法，該方法包含：提供如請求項42之方法所製造的基因轉殖植物細胞；以及從該基因轉殖植物細胞再生一基因轉殖植物，其中該抑制一鞘翅目害蟲內之關鍵基因表現之措施的表現係足以調節接觸該經轉形植物之一鞘翅目害蟲內的標靶基因的表現。
一種用於製造一基因轉殖植物細胞的方法，該方法包含，以包含提供半翅目害蟲抗性至一植物之措施的一載體轉形一植物細胞；在足以容許包含複數個經轉形之植物細胞的植物細胞培養物發育的條件下培養該經轉形植物細胞；選擇該提供半翅目害蟲抗性至一植物之措施已嵌入其基因組的經轉形植物細胞；就該抑制半翅目害蟲內之關鍵基因表現之措施的表現，篩揀該經轉形植物細胞；以及選擇表現該抑制半翅目害蟲內之關鍵基因表現之措施的一植物細胞。
一種用於製造一抵抗半翅目害蟲之基因轉殖植物的方法，該方法包含：提供如請求項44之方法所製造的基因轉殖植物細胞；以及從該基因轉殖植物細胞再生一基因轉殖植物，其中該抑制一半翅目害蟲內之關鍵基因表現之措施的表現係足以調節接觸該經轉形植物之一半翅目害蟲內的標靶基因的表現。
如請求項1之核酸，其更包含編碼來自蘇力菌之多肽的一聚核苷酸。
如請求項46之核酸，其中來自蘇力菌之該多肽選自於包含Cry3、Cry34、與Cry35的群組。
如請求項15之細胞，其中該細胞包含編碼來自蘇力菌之多肽的一聚核苷酸。
如請求項48之細胞，其中來自蘇力菌之該多肽選自於包含Cry3、Cry34、與Cry35的群組。
如請求項16之植物，其中該植物包含編碼來自蘇力菌之多肽的一聚核苷酸。
如請求項50之植物，其中來自蘇力菌之該多肽選自於包含Cry3、Cry34、與Cry35的群組。
如請求項39之方法，其中該經轉形植物細胞包含編碼來自蘇力菌之多肽的一核苷酸序列。
如請求項52之方法，其中來自蘇力菌之該多肽選自於包含Cry3、Cry34、與Cry35的群組。
一種用於改善植物作物產量的方法，該方法包含：將一核酸引進玉米植物，以製造一基因轉殖植物，其中該核酸包含下列之多於一者編碼靶向Gho/Sec24B2基因及/或Sec24B1基因之至少一個siRNA的一聚核苷酸，編碼來自蘇力菌之殺昆蟲多肽的一聚核苷酸，及以及培養該植物以容許該至少一個聚核苷酸表現；其中該至少一個聚核苷酸的表現係抑制鞘翅目及/或半翅目害蟲發育或生長以及由於鞘翅目及/或半翅目害蟲侵染所致的產量損失。
如請求項54之方法，其中該植物為玉蜀黍、大豆或棉花。