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TW201623613A - 賦予對鞘翅目害蟲之抵抗力的ｄｒｅ４核酸分子 - Google Patents

賦予對鞘翅目害蟲之抵抗力的ｄｒｅ４核酸分子 Download PDF

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TW201623613A
TW201623613A TW104114468A TW104114468A TW201623613A TW 201623613 A TW201623613 A TW 201623613A TW 104114468 A TW104114468 A TW 104114468A TW 104114468 A TW104114468 A TW 104114468A TW 201623613 A TW201623613 A TW 201623613A
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plant
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TW104114468A
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肯尼士 納爾瓦
莎拉Ｅ 沃登
梅根Ｌ 弗瑞
木魯蓋森 倫格沙米
卡尼卡 阿羅拉
巴拉吉 維拉瑪尼
普雷姆昌德 甘德拉
安卓斯 維爾辛斯卡斯
艾里恩 科諾爾
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陶氏農業科學公司
弗勞恩霍夫爾協會
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Abstract

此揭示係有關於核酸分子及使用其等用於控制鞘翅目害蟲的方法，其係透過RNA干擾-媒介的靶定編碼與轉錄的非編碼序列在鞘翅目害蟲中之抑制。本揭示亦有關於用於製造基因轉殖植物的方法，該植物表現對控制鞘翅目害蟲有用的核酸分子，且由此獲得的植物細胞與植物。

Description

賦予對鞘翅目害蟲之抵抗力的DRE4核酸分子 優先權主張
此申請案主張2014年5月7日提申之美國專利臨時申請案第61/989,843號，“DRE4 NUCLEIC ACID MOLECULES THAT CONFER RESISTANCE TO COLEOPTERAN PESTS”之利益。
發明領域
本發明一般而言係有關於由鞘翅目害蟲造成的植物損害之遺傳控制。在特定具體例中，本發明有關於辨識靶定的編碼與非編碼序列，及使用重組DNA技術用於轉錄後壓制或抑制靶定的編碼與非編碼序列在鞘翅目害蟲細胞中的表現，以提供一植物保護效果。
發明背景
西方玉米根蟲(WCR)，玉米根螢葉甲(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)，係為北美最具破壞性的玉米根蟲物種之一，且在美國中西方的玉米種植區係為一特別關心的事。北方玉米根蟲(NCR)，北方玉米根蟲(Diabrotica barberi Smith and Lawrence)，係為一種密切相關的物種， 該者共棲於WCR許多相同的範圍。還有其他數種相關的葉甲(Diabrotica)亞種在北美係為重大的害蟲：墨西哥玉米根蟲(MCR)，墨西哥玉米根葉甲(D.virgifera zeae Krysan and Smith)；南方玉米根蟲(SCR)，黃瓜十一星葉甲食根亞種(D.undecimpunctata howardi Barber)；巴西玉米根蟲(D.balteata LeConte)；黃瓜十一星葉甲球蟲(D.undecimpunctata tenella)；以及黃瓜十一星葉甲甘薯猿葉甲蟲(D.u.undecimpunctata Mannerheim)。美國農業部目前估計玉米根蟲每年造成10億美元歲入損失，包括8億美元的產量損失及2億美元的處理費用。
WCR與NCR兩者的卵於夏季期間皆沈積在土壤中。該等昆蟲在整個冬季依舊處於卵的階段。這些卵係為橢圓形、白色，且長度小於0.004英吋(0.010cm)。幼蟲在五月底或六月初孵化，卵孵化的精確時程由於溫度差異與位置而每一年有所不同。初孵化幼蟲係為長度小於0.125英吋(0.3175cm)的白色蠕蟲。一旦孵化，幼蟲開始取食玉米的根。玉米根蟲歷經3個幼蟲齡期。在取食數周之後，幼蟲蛻皮進入蛹的階段。它們在土壤中成蛹，然後在七月與八月時以成蟲從土壤中出現。成蟲根蟲長度係為約0.25英吋(0.635cm)。
玉米根蟲幼蟲在玉米與其他數種禾草物種上完成發育。在黃色狐尾草上飼養的幼蟲出現的較晚，且較諸於在玉米上飼養的幼蟲，成蟲具有一較小的頭殼尺寸。Ellsbury等人(2005)Environ.Entomol.34：627-634。WCR成 蟲取食玉米鬚(corn silk)、花粉及在暴露穗尖(ear tips)上的玉米粒。假若WCR成蟲在玉米生殖組織存在前出現，它們可能會取食葉組織，從而減緩植物生長，且偶爾會殺死該寄主植物。然而，當首選的鬚與花粉變得可得時，成蟲將會迅速搬移到鬚與花粉。NCR成蟲亦取食玉米植株的生殖組織，但相反地，很少取食玉米葉。
在玉米中，大部分根蟲損害係由幼蟲取食造成。剛孵化的根蟲最初取食纖細的玉米根毛並鑽入根尖。當幼蟲長得更大時，它們取食主根並鑽入主根。當玉米根蟲的量大量時，幼蟲取食常常引致根的削減，一直到玉米莖的基部。嚴重的根傷害干擾了根部輸送水分與養分到植株的能力，降低植物的生長，並引致降低的穀粒生產，從而常常大大降低了整體產量。嚴重的根傷亦常常引致玉米植株的倒伏，這使得收割更為困難，並進一步減低產量。更進一步，成蟲在玉米生殖組織上的取食可以引致鬚在穗尖的消減。假若此種“鬚修剪(silk clipping)”在散粉期間足夠嚴重的，則可能中斷授粉。
可以透過作物輪作、化學殺蟲劑、生物農藥(例如，形成孢子的革蘭氏陽性細菌，蘇力菌(Bacillus thuringiensis))，或其等之一組合，來嘗試控制玉米根蟲。作物輪作在耕地使用上遭受到安置非所欲限定的顯著缺點。再者，一些根蟲物種的產卵可能會發生在大豆田間，從而減輕以玉米及大豆實行輪作的有效性。
化學殺蟲劑係為實現玉米根蟲控制依賴得最嚴 重的策略。儘管如此，化學殺蟲劑的使用係為不完美的玉米根蟲控制策略；在，儘管使用了殺蟲劑，可是當將化學殺蟲劑的成本添加至可能發生的玉米根蟲損害費用時，美國每年因玉米根蟲可能損失超過10億美元。高族群的幼蟲、暴雨及殺蟲劑(等)的不當施用全部可能引致玉米根蟲的控制不夠充分。更進一步，持續使用殺蟲劑可能選擇抗殺蟲劑的根蟲品系，以及由於其等中許多者對非標靶物種的毒性，而提高顯著的環境關注。
RNA干擾(RNAi)係為一種利用內源性細胞途徑之方法，憑此，對一靶定基因序列之適當大小的全部或任何部分有特異性的干擾RNA(iRNA)分子(例如，一dsRNA分子)從而引致編碼之mRNA的降解。近年來，RNAi在許多物種與實驗系統中已被使用於執行基因“減量(knockdown)”；舉例而言，秀麗隱桿線蟲(Caenorhabitis elegans)、植物、昆蟲胚胎及組織培養中的細胞。參閱，例如，Fire等人之(1998)Nature 391：806-811；Martinez等人之(2002)Cell 110：563-574；McManus及Sharp之(2002)Nature Rev.Genetics 3：737-747。
RNAi透過的內源性途徑，包括DICER蛋白複合體，來達到mRNA降解。DICER切割長的dsRNA分子成為大約20個核苷酸的短片段，命名為短小干擾RNA(siRNA)。siRNA係解開成兩個單股RNA：過客股(passenger strand)及引導股(guide strand)。過客股係被降解的，而引導股係併入該RNA誘導的靜默複合體(RISC)。微抑制性核糖核酸(Micro inhibitory ribonucleic acid)(miRNA)分子可能類似地併入RISC。當該引導股特異性地結合至mRNA分子的互補序列且誘導藉由阿革蛋白家族(Argonaute)之切割時，阿革蛋白家族(Argonaute)為RISC複合體的催化劑組份，發生轉錄後基因靜默作用。儘管在某些真核生物，諸如植物、線蟲及一些昆蟲中siRNA及/或miRNA初始臨界濃度，但是此過程已知係系統性遍及生物體來散布。
美國專利第7,612,194號及美國專利公開案第2007/0050860號、第2010/0192265號與第2011/0154545號，揭露了從玉米根螢葉甲(D.v.virgifera LeConte)之蛹單離出的9112表現序列標籤(EST)的序列庫。在美國專利第7,612,194號及美國專利公開案第2007/0050860號中，其係建議可操縱地鏈接一啟動子至一核酸分子，該核酸分子係互補於於此揭露的玉米根螢葉甲(D.v.virgifera)液泡型H+-ATP酶(V-ATP酶)的數個特定的部分序列之一者，用於在植物細胞中表現反義RNA。美國專利公開案第2010/0192265號建議可操縱地鏈接一啟動子至一核酸分子，該核酸分子係互補於玉米根螢葉甲(D.v.virgifera)未知且未揭露功能基因之一特定的部分序列(該部分序列係聲明為與秀麗隱桿線蟲(C.elegans)中C56C10.3的基因產物有58%同一性)，用於在植物細胞中表現反義RNA。美國專利公開案第2011/0154545號建議可操縱地鏈接一啟動子至一核酸分子，該核酸分子係互補於玉米根螢葉甲(D.v.virgifera)外被體β次單元基因之二個特定的部分序列，用 於在植物細胞中表現反義RNA。再者，美國專利第7,943,819號揭露了從玉米根螢葉甲(D.v.virgifera LeConte)之幼蟲、蛹及切開的中腸(midgets)單離出的906表現序列標籤(EST)的序列庫，以及建議可操縱地鏈接一啟動子至一核酸分子，該核酸分子係互補於玉米根螢葉甲(D.v.virgifera)帶电荷的多胞體蛋白4b基因之一特定的部分序列，用於在植物細胞中表現雙股RNA。
在美國專利第7,612,194號，以及美國專利公開案第2007/0050860號、第2010/0192265號與第2011/0154545號中，除了V-ATP酶之數個特定的部分序列及未知功能之基因的特定部分序列之外，關於使用在其中列出超過9000序列之任何特定序列用於RNA干擾，沒有提供進一步的建議。更進一步，美國專利第7,612,194號與美國專利公開案2007/0050860號、第2010/0192265號與第2011/0154545號，對於所提供超過9000序列在玉米根蟲物種中使用做為dsRNA或siRNA時，何者將為致命的，或甚至是有用的，沒有提供任何引導。美國專利第7,943,819號除了帶电荷的多胞體蛋白4b基因之特定的部分序列之外，對於使用在其中列出超過9000序列之任何特定序列用於RNA干擾，沒有提供任何的建議。再者，美國專利第7,943,819號，對於所提供超過9000序列在玉米根蟲物種中使用做為dsRNA或siRNA時，何者將為致命的，或甚至是有用的，沒有提供任何引導。美國專利公開案第2013/040173號及PCT專利公開案第WO 2013/169923號中，說明使用由玉米根蟲 (Diabrotica virgifera)Snf7基因衍生的序列用於玉蜀黍(maize)之RNA干擾。(於Bolognesi等人之(2012)PLos ONE 7(10)：e47534.doi：10.1371/journal.pone.0047534中亦有說明)。
該些互補於玉米根蟲DNAs(例如前述)的序列之壓倒性的多數，當使用做為dsRNA或siRNA時為非致命的。舉例而言，Baum等人(2007，Nature Biotechnology 25：1322-1326)，描述藉由RNAi來抑制數個WCR基因的標靶的效果。這些作者記錄的是，26個他們測試的靶定基因中，在超過520ng/cm2之非常高的iRNA(例如，dsRNA)濃度時，8者不能提供實驗顯著的鞘翅目害蟲死亡率。
發明概要
本文揭露的為核酸分子(例如，靶定基因、DNAs、dsRNAs、siRNAs、miRNAs及hpRNAs)及其等之使用方法，用於控制鞘翅目害蟲，包括，舉例而言，玉米根螢葉甲(D.v.virgifera LeConte)(西方玉米根蟲，"WCR")；北方玉米根蟲(Diabrotica barberi Smith and Lawrence)(北方玉米根蟲，"NCR")；黃瓜十一星葉甲食根亞種(D.u.howardi Barber)(南方玉米根蟲，"SCR")；墨西哥玉米根葉甲(D.v.zeae Krysan and Smith)(墨西哥玉米根蟲，"MCR")；巴西玉米根蟲(D.balteata LeConte)；黃瓜十一星葉甲球蟲(D.u.tenella)；及黃瓜十一星葉甲甘薯猿葉甲蟲(D.u.undecimpunctata Mannerheim)。在特定例子中，示範 性的核酸分子係揭露的，該者可能同源於在一鞘翅目害蟲中一或多個天然核酸序列之至少一部分。
在這些及進一步例子中，該天然的核酸序列可以為一標靶基因，該標靶基因可以為下列之產物，舉例而言但不限於：涉及代謝過程；涉及生殖過程；或涉及幼蟲發育。在一些例子中，藉由一種包含同源於其等之序列的核酸分子，予以轉譯後抑制一種靶定基因在鞘翅目害蟲中的表現，可能為致命的，或是引致生長及/或發展下降。在此等例子中，可以選擇一種dre4基因作為用於轉錄後靜默之靶定基因。本文因而揭露一種經單離的核酸分子，其包含序列辨識編號：1之dre4基因的核苷酸序列；序列辨識編號：1之互補物；以及前述之任何片段。
亦揭露了核酸分子，其包含經由電腦模擬(in silico)可以反轉譯成一種多肽之核苷酸序列，該多肽係至少85%同一於dre4基因產物之內的胺基酸序列。進一步揭露包含一核苷酸序列之核酸分子，該核苷酸序列係為經由電腦模擬(in silico)可以反轉譯成一種多肽之核苷酸序列之反向互補物，該多肽係至少85%同一於dre4基因產物內的胺基酸序列。
亦揭露了可以使用於生產iRNA(例如，dsRNA、siRNA、miRNA以及hpRNA)分子的cDNA序列，該iRNA係互補於dre4鞘翅目害蟲靶定基因的全部或部分。在特定具體例中，dsRNAs、siRNAs、miRNAs及/或hpRNAs可以藉由一種基因改造生物體，諸如植物或是細菌，在活體外或活 體內生產。在特定具體例中，揭露了可以使用來生產序列辨識編號：1的dre4基因之全部或部分的iRNA分子之cDNA分子。
進一步揭露用於抑制鞘翅目害蟲中一種必要的dre4基因表現的構件，以及用於提供鞘翅目害蟲抵抗力給植物的構件。用於抑制鞘翅目害蟲中一必要的dre4基因表現的構件包括由下列所組成之單股或雙股RNA分子：序列辨識編號：2(dre4區域1，於此有時稱為dre4 reg1)，序列辨識編號：3(dre4區域2，於此有時稱為dre4 reg2)，序列辨識編號：4(dre4區域3，於此有時稱為dre4 reg3)，或是其之互補物。用於抑制鞘翅目害蟲中一必要的dre4基因表現的構件之功能均等物包括單股或雙股RNA分子，其實質上同源於包含序列辨識編號：1之WCR基因的全部或部分。用於提供鞘翅目dre4害蟲抵抗力到植物的構件係為一種DNA分子，該DNA分子包含可操縱地鏈接至一啟動子之一核酸序列，該核酸序列編碼用於抑制在一鞘翅目害蟲中一種必要的dre4基因表現的構件，其中該DNA分子係能夠併入到玉蜀黍(maize)植株之基因組中。
揭露了用於控制一種鞘翅目害蟲族群之方法，該方法包含提供一種iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA及hpRNA)分子至一鞘翅目害蟲，該iRNA一旦被鞘翅目害蟲攝取時，作用以抑制該鞘翅目害蟲內的生物功能，其中該iRNA分子包含選自於下列所組成的群組之核苷酸序列的全部或部分：序列辨識編號：1；序列辨識編號：1之互補 物；一種葉甲(Diabrotica)生物體(例如WCR)之天然核酸序列編碼序列，其包含序列辨識編號：1之全部或部分；一種葉甲(Diabrotica)生物體之天然編碼序列之互補物，該天然編碼序列包含序列辨識編號：1之全部或部分；一種葉甲(Diabrotica)生物體之天然非編碼序列，其轉錄成包含序列辨識編號：1之全部或部分之天然RNA分子；以及一種葉甲(Diabrotica)生物體之天然非編碼序列之互補物，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：1之全部或部分之天然RNA分子。
在特定的例子中，揭露了用於控制一種鞘翅目害蟲族群之方法，該方法包含提供一種iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA相似及hpRNA)分子至鞘翅目害蟲，該iRNA一旦被鞘翅目害蟲攝取，作用以抑制該鞘翅目害蟲內的生物功能，其中該iRNA分子包含選自於下列所組成的群組之核苷酸序列：序列辨識編號：1的全部或部分；序列辨識編號：1的全部或部分之互補物；序列辨識編號：2；序列辨識編號：2之互補物；序列辨識編號：3；序列辨識編號：3之互補物；序列辨識編號：4；以及序列辨識編號：4之互補物。
於此亦揭露的方法為在其中可在一種飲食為基礎的分析中，或在表現dsRNAs、siRNAs、miRNAs及/或hpRNAs的基因改造植物細胞中，提供dsRNAs、siRNAs、miRNAs及/或hpRNAs至一種鞘翅目害蟲。在這些及進一步例子中，該dsRNAs、siRNAs、miRNAs及/或hpRNAs可以由 鞘翅目害蟲幼蟲攝入。攝入本發明的dsRNAs、siRNAs、miRNAs及/或hpRNAs可能繼而引致該幼蟲中的RNAi，該者轉而可能引致對該鞘翅目害蟲活力必要的基因之靜默作用，並最終導致幼蟲死亡。因此，揭露了方法，其中包含對鞘翅目害蟲控制有用之示範性核酸序列(等)的核酸分子，係被提供至一種鞘翅目害蟲。在特定例子中，藉由使用本發明之核酸分子而控制的鞘翅目害蟲可能為WCR、SCR或NCR。
從下列數個參照附圖進行的具體例之詳細說明，前述特徵及其它特徵將變得更為明顯。
圖1包括用來提供特異性模板用於dsRNA生產之策略的說明，其使用單一轉錄模板(圖1A)及二個轉錄模板(圖1B)。
較佳實施例之詳細說明 序列表
在附隨的序列表中列出的核酸序列係使用核苷酸鹼基的標準字母縮寫來表示，如在37 C.F.R.§ 1.822中所界定者。每一核酸序列僅有顯示一股，但是互補股及反互補股藉由參照至展現股係如含括一般不言而明。在附隨的序列表中：序列辨識編號：1顯示一種示範性葉甲(Diabrotica)dre4 DNA序列。
序列辨識編號：2-4顯示葉甲(Diabrotica)dre4(dre4 reg1(區域1)、dre4 reg2(區域2)，以及dre4 reg3(區域3))之示範性非鄰接的片段，其等係用於活體外dsRNA合成(於5'及3'端之T7啟動子序列未顯示)。
序列辨識編號：5顯示一種T7噬菌體啟動子之DNA序列。
序列辨識編號：6顯示YFP編碼區域區段之DNA序列，其係用於活體外dsRNA合成(於5'及3'端之T7啟動子序列未顯示)。
序列辨識編號：7-12顯示引子，其係使用來擴增包含dre4 reg1、dre4 reg2及dre4 reg3之dre4序列的部分。
序列辨識編號：13顯示葉甲(Diabrotica)dre4髮夾v1-RNA-形成序列(如核酸分子，pDAB114546中發現者)。dre4意義股(sense strand)係由大寫字體列出的鹼基位置所構成，ST-LS1內含子係由劃底線字體列出的鹼基位置所構成，以及dre4反義股係由未劃底線、小寫字體列出的鹼基位置所構成：
序列辨識編號：14顯示葉甲(Diabrotica)dre4髮夾v2-RNA-形成序列(如核酸分子，pDAB114547中發現者)。dre4意義股係由大寫字體列出的鹼基位置所構成，ST-LS1內含子係由劃底線字體列出的鹼基位置所構成，以及dre4反義股係由未劃底線、小寫字體列出的鹼基位置所構成：
序列辨識編號：15顯示YFP髮夾-RNA-形成序列v2(如核酸分子中發現者，pDAB110853)。YFP意義股係由大寫字體列出的鹼基位置所構成，ST-LS1內含子係由劃底線字體列出的鹼基位置所構成，以及YFP反義股係由未劃 底線、小寫字體列出的鹼基位置所構成。
序列辨識編號：16顯示一種序列，其包含ST-LS1內含子。
序列辨識編號：17顯示一種YFP蛋白編碼序列，如同pDAB101556中發現者。
序列辨識編號：18顯示一種膜聯蛋白(Annexin)區域1之DNA序列。
序列辨識編號：19顯示一種膜聯蛋白(Annexin)區域2之DNA序列。
序列辨識編號：20顯示一種β-紅血球膜骨架蛋白質(spectrin)2區域1之DNA序列。
序列辨識編號：21顯示一種β-紅血球膜骨架蛋白質(spectrin)2區域2之DNA序列。
序列辨識編號：22顯示一種mtRP-L4區域1之DNA序列。
序列辨識編號：23顯示一種mtRP-L4區域2之DNA序列。
序列辨識編號：24-51顯示引子，其等使用來擴增膜聯蛋白(Annexin)、β-紅血球膜骨架蛋白質(spectrin)2、mtRP-L4，以及YFP之基因區域用於dsRNA合成。
序列辨識編號：52顯示一種玉蜀黍(maize)DNA序列，其編碼一種類TIP41蛋白質。
序列辨識編號：53顯示一種寡核苷酸T20NV之DNA序列。
序列辨識編號：54-58顯示引子及探針序列，其等使用來測量玉蜀黍(maize)之轉錄本位準。
序列辨識編號：59顯示一種SpecR編碼區域的部分之DNA序列，其係用於二元載體主幹偵測。
序列辨識編號：60顯示一種AAD1編碼區域的部分之DNA序列，其係用於基因複本數(genomic copy number)分析。
序列辨識編號：61顯示一種玉蜀黍(maize)轉化酶基因之DNA序列。
序列辨識編號：62-70顯示引子及探針序列，其等使用於基因複本數(genomic copy number)分析。
序列辨識編號：71-73顯示引子及探針序列，其等使用於玉蜀黍(maize)表現分析。
序列辨識編號：74顯示探針序列，其使用來測量 玉蜀黍(maize)轉錄本位準。
I.數個具體例概述
於此揭露的為用於基因控制鞘翅目害蟲侵擾的方法與組成物。亦提供用於辨識對鞘翅目害蟲生命週期必要之一個或多個基因(等)的方法，以使用做為RNAi媒介的鞘翅目害蟲族群控制之靶定基因。可以設計編碼一個或多個dsRNA分子的DNA質體載體，以箝制一個或多個對生長、生存、發育及/或生殖必要的靶定基因(等)。在一些具體例中，提供用於一靶定基因的轉錄後表現的壓制或抑制的方法，該者係經由互補於在一鞘翅目害蟲中之該靶定基因的編碼或非編碼序列之核酸分子。在這些及進一步具體例中，鞘翅目害蟲可能攝入一個或多個dsRNA、siRNA、miRNA及/或hpRNA分子，該者係轉錄自互補於一靶定基因之編碼或非編碼序列的核酸分子之全部或部分，從而提供植物保護效果。
因此，一些具體例涉及靶定基因產物表現的序列特異性抑制，其使用互補於該(等)靶定基因之編碼及/或非編碼序列的dsRNA、siRNA、miRNA及/或hpRNA，以實現至少部分的鞘翅目害蟲控制。揭露的是一組經單離及純化的核酸分子，其包含一核苷酸序列，舉例而言，如在序列辨識編號：1-4中任一者所陳述者，及其等之片段。在一些具體例中，可以從此序列、其之片段、或包括這些序列中之一者的基因而表現一穩定的dsRNA分子，用於一靶定基因的轉錄後靜默或抑制。在某些具體例中，經單離及純化 的核酸分子包含下列之全部或部分：序列辨識編號：1，或是其之互補物(例如，序列辨識編號：2；序列辨識編號：2之互補物；序列辨識編號：3；序列辨識編號：3之互補物；序列辨識編號：4；以及序列辨識編號：4之互補物)。
一些具體例涉及一重組宿主細胞(例如一植物細胞)，該者在其基因組中具有至少一重組DNA序列，其編碼至少一個iRNA(例如dsRNA)分子者(等)。在特定的具體例中，當由一鞘翅目害蟲攝入時，可製造該(等)dsRNA分子，以轉錄後靜默或抑制一靶定基因在該鞘翅目害蟲中的表現。該重組DNA序列可以包含，舉例而言下列之一者或多者，序列辨識編號：1-4中任一者；序列辨識編號：1-4中任一者之片段；一基因的部分序列，該基因包含序列辨識編號：1-4中之一者或多者；或其等之互補物。
特定的具體例涉及一種重組宿主細胞，該者在其基因組中具有編碼至少一個iRNA(例如dsRNA)分子(等)的一重組DNA序列，其中該重組DNA序列可包含全部或部分的序列辨識編號：1。當由鞘翅目害蟲攝入時，該(等)iRNA分子可靜默或抑制包含序列辨識編號：1之靶定基因在鞘翅目害蟲中的表現，且從而引致該鞘翅目害蟲生長、發育、生殖及/或取食的停止。
在一些具體例中，一種重組宿主細胞，該者在其基因組中具有編碼至少一個dsRNA分子的一重組DNA序列，可以為一種經轉形的植物細胞。一些具體例涉及基因轉殖植物，其包含此種轉形植物細胞。除了此種基因轉殖 植物，還提供任何基因轉殖植物世代的後代植株、基因轉殖種子及基因轉殖植物之產物全體，其中每一者包含重組DNA序列(等)。在特定的具體例中，本發明的dsRNA分子可以在一種基因轉殖植物細胞中表現。所以，在這些及其他具體例中，本發明之dsRNA分子可在從一基因轉殖植物細胞單離出。在特定具體例中，該基因轉殖植物為選自於玉米(玉蜀黍(Zea mays))、大豆(大豆(Glycine max))、及禾本科(Poaceae)植物所組成之群組的植物。
一些具體例涉及一種用於調變靶定基因在鞘翅目害蟲細胞中表現的方法。在這些及其他具體例中，可提供一種核酸分子，其中該核酸分子包含一種編碼dsRNA分子之核苷酸序列。在特定的具體例中，一種編碼dsRNA分子之核苷酸序列可以可操縱地鏈接至一啟動子，且亦可以可操縱地鏈接至一轉錄終止序列。在特定具體例中，一種用於調變靶定基因在鞘翅目害蟲細胞中表現的方法可以包含：(a)以一載體轉形一植物細胞，其中該載體包含一種編碼dsRNA分子之核苷酸序列；(b)在足以允許包含數個轉形植物細胞之植物細胞培養物發展的條件下，培養該經轉形的植物細胞；(c)選擇已經將該載體併入其基因組的轉形植物細胞；及(d)確定該選擇的轉形植物細胞，其包含由該載體的核苷酸序列所編碼之dsRNA分子。一植物可能從一植物細胞再生的，其中該細胞在其基因組中具有該併入的載體且包含由該載體核苷酸序列編碼的該dsRNA分子。
因此，亦揭露的是一種基因轉殖植物，其包含併 入在其基因組中之載體，該載體具有一種編碼dsRNA分子之核苷酸序列，其中該基因轉殖植物包含由該載體的核苷酸序列所編碼之該dsRNA分子。在特定實施例中，在植物中表現dsRNA分子，係足以調變接觸該轉形植物或植物細胞的鞘翅目害蟲之細胞中一靶定基因的表現，舉例而言，藉由取食該轉形植物、該植物的一部分(例如根)或植物細胞。本文所揭露的基因轉殖植物對鞘翅目害蟲侵擾可展現抵抗力及/或增強的耐受性。特定的基因轉殖植物可能會對選自於以下所組成之群組的一或多種鞘翅目害蟲展現抵抗力及/或增強的耐受性：WCR；NCR；SCR；MCR；巴西玉米根蟲(D.balteata LeConte)；黃瓜十一星葉甲球蟲(D.u.tenella)；及黃瓜十一星葉甲甘薯猿葉甲蟲(D.uundecimpunctata Mannerheim)。
本文亦揭露的是遞送控制劑，諸如一種iRNA分子，至一鞘翅目害蟲的方法。此種控制劑可能直接或間接地造成鞘翅目害蟲取食、生長、或以其它方式造成宿主損害之能力的毀損。在一些具體例中，提供一種方法，該方法包含遞送一穩定的dsRNA分子至一鞘翅目害蟲，以在該鞘翅目害蟲中箝制至少一靶定基因，從而降低或消除一鞘翅目害蟲所致的植物損害。在一些具體例中，一種抑制一靶定基因在鞘翅目害蟲中表現的方法可能會引致該鞘翅目害蟲生長、發育、生殖及/或取食的停止。在一些具體例中，該方法可能最終引致該鞘翅目害蟲的死亡。
在一些具體例中，提供組成物(例如一種局部組 成物)，該者包含本發明之iRNA(例如dsRNA)分子，用於在植物、動物及/或一植物或動物的環境中使用，以實現鞘翅目害蟲侵擾的消除或降低。在特定的具體例中，該組成物可能為餵食該鞘翅目害蟲之營養組成物或食物來源。一些具體例包含製成該鞘翅目害蟲可用的營養組成物或食物來源。攝入包含iRNA分子之組成物可能引致該分子被鞘翅目害蟲之一個或多個細胞攝取，該者轉而可能在鞘翅目害蟲細胞(等)中引致至少一靶定基因表現的抑制。由鞘翅目害蟲攝入或損害的植物或植物細胞在該鞘翅目害蟲存在的任何宿主組織或環境中，可能會受限制或被消除，其係藉由在該鞘翅目害蟲之宿主中提供一個或多個包含本發明之iRNA分子的組成物。
本文揭露之該組成物及方法可以與其它用於控制鞘翅目害蟲損害的方法與組成物一起組合使用。舉例而言，一種如於此所描述用於保護植物不受鞘翅目害蟲傷害的iRNA分子可能在一方法中使用，該方法包含以下的額外使用：一種或多種對鞘翅目害蟲有效的化學藥劑、對鞘翅目害蟲有效的生物農藥、作物輪作、或重組基因技術其展示特徵不同於本發明RNAi-媒介方法及RNAi組成物之特徵者(例如在植物中重組製造對鞘翅目害蟲有害的蛋白質(例如Bt毒素))。
II. 縮寫
III.術語
在下列之說明與圖表中，使用許多術語。為了提供本說明書與請求項清楚且一貫的理解，包括此等術語給 定的範圍，提供下面的定義：鞘翅目害蟲：當使用於本文中，術語"鞘翅目害蟲"意指葉甲屬(genus Diabrotica)的昆蟲，該等昆蟲取食玉米及其他真草。在特定例子中，一種鞘翅目害蟲係選自包含以下之一名單：西方玉米根螢葉甲(D.v.virgifera LeConte)(WCR)；北方玉米根蟲(D.barberi Smith and Lawrence)(NCR)；黃瓜十一星葉甲食根亞種((D.u.howardi))(SCR)；墨西哥玉米根葉甲(D.v.zeae)(MCR)；巴西玉米根蟲(D.balteata LeConte)；黃瓜十一星葉甲球蟲(D.u.tenella)；以及黃瓜十一星葉甲甘薯猿葉甲蟲(D.u.undecimpunctata Mannerheim)。
接觸(一生物體)：當使用於本文中，術語"接觸"一生物體(例如一鞘翅目害蟲)或由一生物體"攝取"，當就一核酸分子而言時，包括將該核酸分子內化(internalization)至該生物體內，舉例而言但不限於：由該生物攝入該分子(例如藉由取食)；將該生物體與包含該核酸分子之一組成物接觸；及將該生物體浸泡於包含該核酸分子之溶液。
片段重疊群(Contig)：當使用於本文中，術語"片段重疊群"意指一DNA序列其係重建於一組重疊的DNA區段，該重疊的DNA區段係衍生自一單一遺傳來源。
玉米植物：當使用於本文中，術語"玉米植物"意指物種玉蜀黍(Zea mays)(玉蜀黍(maize))之植物。
編碼一個dsRNA：當使用於本文中，術語"編碼一個dsRNA"包括一種基因，其之RNA轉錄產物能夠形成一 分子內dsRNA結構(例如一髮夾)或分子間dsRNA結構(例如藉由雜交至一靶定的RNA分子)。
表現：當使用於本文中，一編碼序列(舉例而言，一基因或轉基因)之"表現"意指一過程，在該過程中一核酸轉錄單元(包括，例如基因組DNA或cDNA)的編碼資訊係被轉換成細胞的操作、非操作、或結構部分，通常包括蛋白質的合成。外部訊號可以影響基因表現；舉例而言，將細胞、組織或生物體曝露至提高或減少基因表現之一藥劑。基因表現亦可以在從DNA至RNA至蛋白質的途徑中的任意處調控。基因表現的調控發生於下列情況，舉例而言，透過在轉錄、轉譯、RNA運輸及加工、中間分子諸如mRNA降解上的控制作用，或透過特定蛋白質分子在它們被製造之後的活化、去活化、分室作用(compartmentalization)或降解，或藉由其等之組合。基因表現可以藉由本技藝已知的任何方法，在RNA位準或蛋白質位準測量，包括但不限於，北方(RNA)墨漬法、RT-PCR、西方(免疫)墨漬法，或活體外、原位或活體內蛋白質活性分析(等)。
遺傳物質：當使用於本文中，術語"遺傳物質"包括所有的基因及核酸分子，諸如DNA與RNA。
抑制：當使用於本文中，術語"抑制"當使用以描述在一編碼序列(舉例而言，一基因)上的效果時，意指轉錄自該編碼序列之mRNA中，及/或該編碼序列的胜肽、多肽或蛋白質產物，在細胞位準上可測量的下降。在一些例子中，一編碼序列的表現可以被抑制，藉此，近似消除該表 現。"特異性抑制"意指一靶定編碼序列之抑制，而不必然地影響其他編碼序列(例如基因)在該細胞中的表現，其中在該細胞中達到特異性抑制。
經單離的：一種"經單離的"的生物成分(諸如核酸或蛋白質)實質上已與生物體細胞中，該成份天然發生區域中的其他生物成分(意即，其他染色體及染色體外的DNA及RNA，及蛋白質)分隔、分開製造或純化開來。已經“經單離的”核酸分子與蛋白質包括藉由標準純化方法來純化的核酸分子及蛋白質。該術語亦含括藉由在一宿主細胞中重組表現而製備的核酸及蛋白質，以及化學合成的核酸分子、蛋白質及胜肽。
核酸分子：當使用於本文中，如於此所使用，術語"核酸分子"可以意指核苷酸的聚合物形式，該者可包括RNA之意義股與反義股兩者、cDNA、基因組DNA，及上述的合成形式與混合聚合物。一種核苷酸可以意指一核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、或任一類型核苷酸的修飾形式。一種"核酸分子"當使用於本文中，如於此所使用係同義於"核酸"及"聚多核苷酸"。一核酸分子的長度通常至少10個鹼基，除非另有指明。按照慣例，一核酸分子的核苷酸序列係從該分子的5'端讀取到3'端。一種核苷酸序列的“互補物”意指可以與該核苷酸序列的核鹼基形成鹼基對(意即，A-T/U，及G-C)的核鹼基序列，從3'端到5'端。一核酸序列之“反向互補物”意指該核鹼基的序列，從3'端到5'端，其與該核苷酸序列的核鹼基形成鹼基對。
"核酸分子"包括單股及雙股形式的DNA；單股形式的RNA；及雙股形式的RNA(dsRNA)。術語"核苷酸序列"或"核酸序列"意指一核酸之意義股與反義股兩者，以個別單股或在雙聯體中任一。術語"核糖核酸"(RNA)係包括iRNA(抑制性RNA)、dsRNA(雙股RNA)、siRNA(短小干擾RNA)、mRNA(信使RNA)、miRNA(微RNA)、hpRNA(髮夾RNA)、tRNA(轉移RNA，不論裝載或未裝載一相應的醯化胺基酸)、及cRNA(互補的RNA)。術語"去氧核糖核酸"(DNA)係包括cDNA、基因組DNA、及DNA-RNA雜交體。術語"核酸區段"及"核苷酸序列區段"，或更普遍的"區段"，對本技藝之一般人士將理解為一功能性術語，其包括兩基因組序列、核糖體RNA序列、轉移RNA序列、信使RNA序列、操縱子序列，及較小的遺傳工程核苷酸序列，其編碼或可能適於編碼胜肽、多肽或蛋白質者。
寡核苷酸：一種寡核苷酸係為一種短的核酸聚合物。寡核苷酸可以藉由切割較長的核酸段，或藉由聚合個別的核苷酸前驅體而形成。自動合成器允許長度高達數百個鹼基的寡核苷酸之合成。因為寡核苷酸可以結合至一互補的核苷酸序列，它們可以使用做為偵測DNA或RNA的探針。由DNA構成的寡核苷酸(寡去氧核糖核苷酸)可以使用於PCR中，PCR為用於擴增DNA及RNA(反轉錄成cDNA)序列之技術。在PCR中，該寡核苷酸典型地稱為一種"引子"，引子允許DNA聚合酶延展該寡核苷酸並複製互補股。
一核酸分子可能包括由天然發生及/或非天然發 生核苷酸鏈結而鏈接在一起的天然存在及修飾的核苷酸兩者或兩者任一。核酸分子可能化學或生物化學修飾的，或可能含有非天然或衍生的核苷酸鹼基，如熟習該項技藝者將容易體會的。此種修飾包括，舉例而言，標示、甲基化、以一類似物取代一或多個天然發生的核苷酸、核苷酸間修飾(例如不帶電荷的鏈結：舉例而言，甲基膦酸酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯(phosphoramidates)、胺基甲酸酯......等等；帶電鏈結：舉例而言，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯......等等；懸垂(pendent)部分：舉例而言，胜肽；插入劑(intercalator)：舉例而言，吖啶、補骨脂素(psoralen)......等等；螯合劑；烷化劑；及修飾鏈結：舉例而言，α-變旋異構體核酸......等等)。術語"核酸分子"亦包括任何拓撲構形，包括單股、雙股、部分雙聯體(duplexed)、三聯體、髮夾形、圓形及扣鎖式(padlocked)構形。
當使用於本文中，就DNA而言，術語"編碼序列"、"結構性核苷酸序列"或是"結構性核酸分子"意指當置於適當的調控序列控制下時，一種核苷酸序列經由轉錄與mRNA最終轉譯成一種多肽者。就RNA而言，術語"編碼序列"意指一核苷酸序列，其轉譯成一種胜肽、多肽或是蛋白質。一種編碼序列的邊界係由5'-末端之一轉譯起始密碼子及3'-末端之一種轉譯終止密碼子來確定。編碼序列包括，但不限於：基因組DNA；cDNA；EST；以及重組核苷酸序列。
基因組：當使用於本文中，術語"基因組"意指在 一細胞之細胞核內發現的染色體DNA，且還意指在該細胞之次細胞組件內發現的胞器DNA。在本發明之一些具體例中，一DNA分子可以被引入到一植物細胞內，藉此，該DNA分子係併入到該植物細胞的基因組中。在這些及進一步具體例中，該DNA分子可能不是併入到該植物細胞的細胞核DNA，就是併入到該植物細胞的葉綠體或粒線體DNA。術語"基因組"，當它應用於細菌時，意指該細菌細胞之內的染色體與質體兩者。在本發明之一些具體例中，一DNA分子可以引入至一細菌中，藉此，該DNA分子係併入到該細菌的基因組中。在這些及進一步具體例中，該DNA分子可能不是併入到染色體，就是坐落如一穩定質體或位於一穩定的質體中。
序列同一性(Sequence identity)：術語兩個核酸或多肽序列之"序列同一性"或"同一性"，如於此上下文中所使用，意指當跨越一特定的比較窗口針對最大對應來對準時，在該兩個序列中相同的殘基。
當使用於本文中，術語"序列同一性百分比"可以意指藉由跨越一比較窗口上比較兩個最佳對準序列(例如核酸序列或多肽序列)而決定的值，其中在比較窗口中的部分序列針對該兩序列的最佳對準，可以包含添加或缺失(意即，間隙)，當相較於參考序列時(參考序列不包含添加或缺失)。百分比之計算係藉由確定在該兩者序列中同一的核苷酸或胺基酸殘基發生的位置數目，以產生匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗口中的位置總數，並將 該結果乘以100，以產生序列同一性的百分比。一序列與一參考序列在每一位置比較之下係同一的，稱為100%同一於該參考序列，反之亦然。
用於對準序列以比較的方法為本技藝所熟知的。各種程式及比對演算法係描述於，舉例而言：Smith及Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443；Pearson及Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444；Higgins及Sharp(1988)Gene 73：237-244；Higgins及Sharp(1989)CABIOS 5：151-153；Corpet等人之(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-10890；Huang等人之(1992)Comp.Appl.Biosci.8：155-165；Pearson等人之(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331；Tatiana等人之(1999)FEMS Microbiol.Lett.174：247-250。序列比對方法及同源性計算之詳細的考慮因素可以於，例如，Altschul等人之(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中找到。
國家生物技術資訊中心(NCBI)基本局部比對搜尋工具(BLASTTM；Altschul等人(1990))可從數個來源獲得，包括國家生物技術資訊中心(Bethesda,MD)，及在網際網路上，用於與數個序列分析程式聯合使用。使用此程式如何決定序列同一性之說明可從網際網路上在BLASTTM"help"一節上獲得。對於核酸序列之比較，可以利用BLASTTM(Blastn)程式的"Blast 2序列"功能，該者使用預設的BLOSUM62模式設為預設參數。當藉由此方法評估 時，對參考序列具更大同一性的核酸序列將顯示提高的同一性百分比。
特異性雜交/特異性互補：當使用於本文中，術語"特異性雜交"及"特異性互補"係為術語其指出充分程度的互補度，藉此，在核酸分子與一靶定核酸分子之間發生穩定且特異性結合。兩個核酸分子之間的雜交涉及在該兩個核酸分子之核酸序列之間形成一反平行對準。該兩分子繼而能夠與相反股上相應的鹼基形成氫鍵，以形成一種雙聯體分子，假若其足夠穩定，該雙聯體分子可以使用本技藝中眾所周知的方法偵測。一核酸分子不需要100%互補於其特異性雜交的靶定序列。然而，必須存在使得雜交為特異性的序列互補度的數量為所使用的雜交條件的函數。
導致特定程度嚴格度的雜交條件將取決於所抉擇的雜交方法的本質及雜交核酸序列之組成與長度，而有所不同。大體而言，雜交溫度及雜交緩衝液的離子強度(尤其是Na+及/或Mg++濃度)將決定雜交的嚴格度。清洗緩衝液的離子強度及清洗溫度亦影響嚴格度。考慮要求的雜交條件、用於得到特定程度嚴格度的計算，對於該技藝中之一般技藝人士係為知悉的，且係討論於，舉例而言Sambrook等人(ed.)之Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2nd ed.,vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989，第9及第11章，及更新；以及Hames與Higgins(eds.)Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,Oxford,1985。關於核酸雜交進一步詳細的教學與引導可能於以下 找到，舉例而言Tijssen，"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,"in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部，第2章，Elsevier,NY,1993；以及Ausubel等人，Eds.,Current Protocols in Molecular Biology，第2章，Greene Publishing and Wiley-Interscience,NY,1995，及更新。
當使用於本文中，"嚴格條件"含括條件，在該條件下雜交將只發生於如果該雜交分子與該靶定核酸分子內的同源序列之間有大於80%的序列匹配時。"嚴格條件"包括進一步特定位準的嚴格度。因此，當使用於本文中，"中嚴格度"條件係為那些在其下具有超過80%的序列匹配(亦即具有低於20%失配)的分子將會雜交；"高嚴格度"的條件係為那些在其下具有超過90%匹配(亦即具有低於10%失配)的序列將會雜交；以及"非常高嚴格度"的條件係為那些在其下具有超過95%匹配(亦即具有低於5%失配)的序列將會雜交。
下列為代表性的、非限制性雜交條件。
高嚴格度條件(偵測到共享至少90%的序列同一性之序列)：5×SSC緩衝液中於65℃下雜交歷時16小時；以2×SSC緩衝液中於室溫下清洗兩次，每次歷時15分鐘；及在0.5×SSC緩衝液中於65℃下清洗兩次，每次歷時20分鐘。
中嚴格度條件(偵測到共享至少80%序列同一性之序列)：5x-6x SSC緩衝液中，於65-70℃雜交歷時16-20小 時；以2×SSC緩衝液中於室溫下洗滌兩次，每次歷時5-20分鐘；以及以1x SSC緩衝液於55-70℃下洗滌兩次，每次歷時30分鐘。
非嚴格的控制條件(共享至少50%序列同一性之序列將雜交)：以6x SSC緩衝液於室溫至55℃雜交歷時16-20小時；以2x-3x SSC緩衝液於室溫至55℃至少洗滌兩次，每次歷時20-30分鐘。
當使用於本文中，就連續的核酸序列而言時，術語"實質上同源的"或"實質同源性"意指核酸分子擁有的連續核苷酸序列，該者在嚴格條件之下雜交到具有參考核酸序列的一核酸分子。舉例而言，核酸分子其具有實質上同源於序列辨識編號：1之參考核酸序列的序列者，係為在嚴格條件下(例如前文陳述之中嚴格度條件)雜交至包含序列辨識編號：1之參考核酸序列的一核酸分子者。實質上同源的序列可能具有至少80%的序列同一性。舉例而言，實質上同源的序列可能具有從大約80%至100%之序列同一性，諸如大約81%；大約82%；大約83%；大約84%；大約85%；大約86%；大約87%；大約88%；大約89%；大約90%；大約91%；大約92%；大約93%；大約94%；大約95%；大約96%；大約97%；大約98%；大約98.5%；大約99%；大約99.5%；及大約100%。實質同源性之性質係密切相關於特異性雜交。舉例而言，當有足夠程度的互補度以避免核酸與非靶定序列在希望特異性結合的條件下，舉例而言在嚴格的雜交條件下，進行非特異性結合時，一核酸分子係特 異性地雜交。
當使用於本文中，術語"異種同源物(ortholog)"意指在兩種或更多物種中，一基因已經從一共同的祖先核苷酸序列演變，並可能在該兩種或更多物種中保留相同的功能。
當使用於本文中，在5'至3'方向讀取序列之每一核苷酸係互補於另一序列在3'至5'方向中讀取的每一核苷酸時，兩個核酸序列分子被認為展示出"完整的互補度"。一種互補於參考核苷酸序列的核苷酸序列將展示出一序列，其與該參考核苷酸序列的反向互補序列為同一的。這些術語與說明在本技藝中係界定良好的，且熟悉此藝者將很容易理解。
可操縱地鏈接：當第一核酸序列與該第二核酸序列係在一功能關係中時，第一核苷酸序列係與第二核酸序列可操縱地鏈接。當重組生產時，可操縱鏈接的核酸序列一般係連續的，且在必要時在相同的讀取框架中(例如在一轉譯融合ORF中)，可以連結兩個蛋白質編碼區域。然而，核酸不需要連續地可操縱鏈接。
術語"可操縱地鏈接"，當參照一調控序列及一編碼序列使用時，意味著該調控序列影響該鏈接的編碼序列的表現。"調控序列"或"控制元素"意指核苷酸序列，其影響該關聯的編碼序列之轉錄的時機及位準/數量、RNA加工或穩定性、或轉譯。調控序列可以包括啟動子；轉譯前導序列；內含子；增強子；莖環結構；抑制子結合序列；終止 序列；聚腺苷酸識別序列等等。特定的調控序列可以位於可操縱地鏈接於此之編碼序列的上游及/或下游。還有，操縱地鏈接於一編碼序列的特定調控序列，可以位於雙股核酸分子之關聯互補股上。
啟動子：當使用於本文中，術語"啟動子"意指一DNA區域，該區域可能在轉錄起始的上游，並可能涉及識別及結合RNA聚合酶與其它蛋白質以引發轉錄。一啟動子可以可操縱地鏈接至一編碼序列，用於在細胞中表現，或者一啟動子可以可操縱地鏈接到編碼一訊號序列的核苷酸序列，其中該訊號序列可能可操縱地鏈接到一編碼序列，用於在一細胞中表現。一種"植物啟動子"可以為能夠在植物細胞中引發轉錄的啟動子。在發育控制下的啟動子之例子包括優先在某些組織中引發轉錄者的啟動子，諸如葉、根、種子、纖維、木質部導管、管胞、或厚壁組織。此種啟動子係稱為"組織優先的"。僅在某些組織中引發轉錄的啟動子被稱為"組織特異性"。一種"細胞類型特異性"啟動子主要在一個或多個器官中的某些細胞類型中驅動表現，舉例而言，在根或葉中的維管束細胞。一種"誘導型"啟動子可以為在環境控制之下的一啟動子。可以由誘導型啟動子引發轉錄之環境條件的例子包括厭氧條件及光的存在。組織特異性、組織優先的、細胞類型特異性及誘導型啟動子構成"非持續表現"型的啟動子。一種"持續表現型"啟動子為在大多數環境條件下，或在大多數組織或細胞類型中活耀的一種啟動子。
本發明之一些具體例中可以使用任何誘導型啟動子。參閱Ward等人之(1993)Plant Mol.Biol.22：361-366。藉由一可誘導的啟動子，轉錄速率對一誘導劑的回應係提高的。示範性的誘導型啟動子包括，但不限於：源自ACEI系統對銅回應的啟動子；源自玉米、對苯磺醯胺除草劑安全劑回應的In2基因；源自Tn10之Tet抑制子；以及源自類固醇激素基因的可誘導啟動子，該者之轉錄活性可以藉由一糖皮質類固醇激素(glucocorticosteroid hormone)誘導(Schena等人之(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10421-10425)。
示範性的持續表現型啟動子包括，但不限於：源自植物病毒之啟動子，諸如來自花椰菜嵌紋病毒(Cauliflower Mosaic Virus)(CaMV)的35S啟動子；源自水稻肌動蛋白基因的啟動子；泛素啟動子；pEMU；MAS；玉蜀黍(maize)H3組蛋白啟動子；以及ALS啟動子，Xba1/NcoI片段5'至大油菜(Brassica napus)ALS3結構基因(或是一種類似於Xba1/NcoI片段之核苷酸序列)(美國專利第5,659,026號)。
此外，本發明之一些實施例中可以利用任何組織特異性或組織優先的啟動子。以包含可操縱地鏈接至一組織特異性啟動子之一編碼序列的核酸分子轉形之植物，可在特定組織中專有地，或優先地生產該編碼序列的產物。示範性的組織特異性或組織優先性的啟動子包括，但不限於：一種子優先啟動子，諸如源自菜豆蛋白(phaseolin)基 因；一葉特異性及光誘導的啟動子，諸如源自cab或核酮糖雙磷酸羧化酶(rubisco)；一花藥特異性啟動子，諸如源自LAT52；一花粉特異性啟動子，諸如源自Zm13；及一孢子優先性啟動子，諸如源自apg。
轉形：當使用於本文中，術語"轉形"或"轉導"意指一種或多種核酸分子(等)轉移進入一細胞。當該核酸分子變成穩定而由細胞複製時，無論是藉由將該核酸分子併入該細胞基因組中，或藉由游離基因體複製，則該細胞係由轉導至細胞內的核酸分子所"轉形"。當使用於本文中，術語"轉形"含括可以導入一種核酸分子至此一細胞之內的所有技術。實例包括但不限於：用病毒載體轉染；用質體載體轉形；電穿孔(Fromm等人之(1986)Nature 319：791-793)；脂質體轉染法(lipofection)(Felgner等人之(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7417)；顯微注射(Mueller等人之(1978)Cell 15：579-585)；農桿菌(Agrobacterium)媒介的轉移(Fraley等人之(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803-4807)；直接DNA攝取；以及基因槍法(microprojectile bombardment)(Klein等人之(1987)Nature 327：70)。
轉基因(Transgene)：一種外源性核酸序列。在一些實例中，一轉基因可以為一序列，該者編碼能夠形成dsRNA分子之一股或兩股，該者包含一核苷酸序列其互補於在鞘翅目害蟲中找到的一核酸分子。在進一步的例子中，一轉基因可以為一反義核酸序列，其中該反義核酸序 列的表現會抑制一靶定核酸序列的表現。於再進一步的例子中，一轉基因可以為一基因序列(例如一除草劑抗性基因)、一種編碼在工業上或藥學上有用的化合物之基因，或是一種編碼一所欲的農業性狀之基因。在這些及其他例子中，一轉基因可以含有調控序列，其可操縱地鏈接該轉基因的編碼序列(例如一啟動子)。
載體：一種核酸分子，當其引入至一細胞時，舉例而言，以產生一轉形細胞。一載體可以包括容許其在該宿主細胞中複製的核酸序列，諸如複製起點。載體的實例包括，但不限於：一質體；黏質體(cosmid)；噬菌體；或是病毒其攜帶外源DNA進入一細胞中。一載體還可以為一種RNA分子。一載體還可以包括一個或多個基因、反義序列，及/或可選擇的標記基因及本技藝已知的其他遺傳元素。一載體可以轉導、轉形、或感染一細胞，藉此造成該細胞表現由該載體所編碼的核酸分子及/或蛋白質。一載體選擇性地包括協助實現該核酸分子進入細胞的物質(例如脂質體、蛋白質塗層等等)。
產量：大約100%或更大的穩定產量係相對於檢查品種(check variety)在相同生長位置，於相同時間及相同條件下生長。在特定具體例中，"改良產量"或"改善產量"意味相對於檢查品種的產量，具有105%至115%或更大的穩定產量之一栽培種，該者係在相同生長位置含有顯著密度傷害該作物之鞘翅目害蟲，於相同時間且在相同條件下生長。
除非具體地指出或暗示，當使用於本文中，術語"一(a)"、"一(an)"及"該"表示"至少一個"。
除非另有具體解釋，於此所使用的所有技術與科學術語具有相同的含義，如同此揭露內容所屬之技藝的一般技藝人士所普遍理解者。分子生物學常用術語的定義可以於下列中找到，舉例而言，Lewin的Genes X,Jones & Bartlett Publishers,2009(ISBN 10 0763766321)；Krebs等人(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；及Meyers R.A.(ed.),Molecular Biology and Biotechnology：A Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。所有的百分數係以重量計，且所有溶劑混合物比例係以體積計，除非另有說明。所有的溫度均為攝氏度。
IV. 包含鞘翅目害蟲序列的核酸分子 A.概述
本文所描述的是對控制鞘翅目害蟲有用的核酸分子。所描述的核酸分子包括靶定序列(例如，天然基因及非編碼序列)、dsRNAs、siRNAs、hpRNAs及miRNAs。舉例而言，一些具體例中描述dsRNAs、siRNA、miRNA及/或hpRNA分子，該等者可能特異性地互補於鞘翅目害蟲中一個或多個天然核酸序列之全部或部分。在這些及進一步具體例中，該(等)天然核酸序列可能為一個或多個靶定基因(等)，該者之產物可能為，舉例而言但不限於：涉及一代謝 過程；涉及一生殖過程；或是涉及幼蟲發育。本文所描述的核酸分子，當引入至細胞其包含至少一與該核酸分子特異性地互補的天然核酸序列(等)時，可能引發該細胞中的RNAi，且因此降低或消除該(等)天然核酸序列的表現。在一些實例中，藉由包含特異性地互補於其等之一序列的核酸分子，靶定基因在鞘翅目害蟲中表現的降低或消除，可能為致命的或是引致生長及/或生殖下降。
在一些具體例中，可以選擇鞘翅目害蟲中至少一種靶定基因，其中該靶定基因包含一種dre4核苷酸。在特定例子中，選擇鞘翅目害蟲中的一種靶定基因，其中該靶定基因包含新穎的dre4核苷酸序列(序列辨識編號：1)。
在一些具體例中，一靶定基因可以為包含一核苷酸序列之一核酸分子，其中該核苷酸序列經由電腦模擬(in silico)可以反轉譯成包含一連續胺基酸序列之多肽，該胺基酸序列係至少85%同一於(例如大約90%、大約95%、大約96%、大約97%、大約98%、大約99%、大約100%、或100%同一於)dre4的蛋白質產物之胺基酸序列。一靶定基因可能為鞘翅目害蟲中任何的核酸序列，該者之轉錄後抑制對鞘翅目害蟲具有不利的效果，或提供植物對抗鞘翅目害蟲之保護的益處。在特定例子中，一靶定基因為一種包含一核苷酸序列之核酸分子，該核苷酸序列經由電腦模擬(in silico)可以反轉譯成包含一連續胺基酸序列之多肽，該胺基酸序列至少85%同一於、大約90%同一於、大約95%同一於、大約96%同一於、大約97%同一於、大約98%同一於、大約99% 同一於、大約100%同一於，或是100%同一於，序列辨識編號：2-4中任一者之電腦模擬(in silico)反轉譯產物的胺基酸序列。
根據本發明所提供的為核苷酸序列，該者的表現將引致一種包含一核苷酸序列的RNA分子，該核苷酸序列特異性地互補於一種鞘翅目害蟲中由一編碼序列所編碼的天然RNA分子之全部或部分。在一些具體例中，在鞘翅目害蟲攝入該表現的RNA分子之後，在鞘翅目害蟲細胞中可得到編碼序列的向下調控。在特定具體例中，在鞘翅目害蟲細胞中編碼序列的向下調控可能在鞘翅目害蟲生長、活力、增殖及/或生殖上引致不利的效果。
在一些具體例中，靶定序列包括轉錄的非編碼RNA序列，諸如5'UTRs；3'UTRs；剪接前導序列；內含子序列；末端內含子(outron)序列(例如隨後在反式剪接中修飾的5'UTR RNA)；供體子(donatron)序列(例如提供供體序列用於反式剪接所要求的非編碼RNA)；及靶定鞘翅目害蟲基因的其他非編碼轉錄RNA。此種序列可能衍自於單順反子(mono-cistronic)與聚-順反子基因兩者。
因此，於此亦聯合一些具體例描述的係iRNA分子(例如dsRNAs、siRNAs、miRNAs及hpRNAs)，該者包含至少一種特異性互補於在鞘翅目害蟲中一靶定序列之全部或部分的核苷酸序列。在一些具體例中，一種iRNA分子可以包含核苷酸序列(等)其互補於數個靶定序列之全部或部分；舉例而言，2、3、4、5、6、7、8、9、10個、或更多 個靶定序列。在特定具體例中，一種iRNA分子可能在活體外生產，或藉由一基因改造生物體在活體內生產，諸如一植物或一細菌。亦揭露的是cDNA序列其可能使用於dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子及/或hpRNA分子之生產，該等者係特異性地互補於鞘翅目害蟲中之一靶定序列的全部或部分。進一步描述的為重組DNA建構物，供實現特定宿主標靶之穩定轉形使用。經轉形的宿主標靶可以從該重組DNA建構物表現有效位準的dsRNA、siRNA、miRNA及/或hpRNA分子。所以，亦描述的係一種植物轉形載體，該者包含至少一種可操縱地鏈接至植物細胞中有作用的異源性啟動子的核苷酸序列，其中該(等)核苷酸序列的表現引致一種RNA分子，其包含一種特異性互補於鞘翅目害蟲中靶定序列之全部或部分的核苷酸序列。
在一些具體例中，對控制鞘翅目害蟲有用的核酸分子可能包括：從包含dre4(例如序列辨識編號：1-4中任一者)之葉甲(Diabrotica)所單離的天然核酸序列之全部或部分；核苷酸序列，該者當表現時引致一種RNA分子，其包含特異性互補於由dre4所編碼之天然RNA分子的全部或部分的核苷酸序列；iRNA分子(例如dsRNAs、siRNAs、miRNAs及hpRNAs)，其包含至少一核苷酸序列，該者係特異性互補於dre4的全部或部分；cDNA序列，其可以使用於生產dsRNA分子、siRNA分子、miRNA及/或hpRNA分子，該等分子特異性互補於dre4的全部或部分；以及在實現特定宿主標靶之穩定轉形所使用的重組DNA建構物，其中一經轉 形宿主標靶包含一個或多個前述的核酸分子。
B.核酸分子
本發明提供，在其他事物之外，iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA及hpRNA)分子，該者抑制靶定基因在鞘翅目害蟲之細胞、組織或器官中的表現；及DNA分子，該者能夠在一細胞或微生物中表現為一種iRNA分子，以抑制靶定基因在鞘翅目害蟲之細胞、組織或是器官中的表現。
本發明之一些具體例提供一種經單離的核酸分子，其包含選自於下列所組成的群組之至少一個(例如，一個、二個、三個，或更多個)核苷酸序列：序列辨識編號：1；序列辨識編號：1之互補物；序列辨識編號：1之至少19個連續核苷酸的片段；序列辨識編號：1之至少19個連續核苷酸的片段之互補物；一種葉甲(Diabrotica)生物體(例如WCR)之天然編碼序列，其包含序列辨識編號：1；一種葉甲生物體之天然編碼序列之互補物，該天然編碼序列包含序列辨識編號：1；一種葉甲生物體之天然非編碼序列，其轉錄成包含序列辨識編號：1之天然RNA分子；一種葉甲生物體之天然非編碼序列之互補物，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：1之天然的RNA分子；一種葉甲生物體之天然編碼序列之至少19個連續核苷酸的片段，該天然編碼序列包含序列辨識編號：1；一種葉甲生物體之天然編碼序列之至少19個連續核苷酸的片段之互補物，該天然編碼序列包含序列辨識編號：1；一種葉甲生物體之天然非編 碼序列之至少19個連續核苷酸的片段，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：1之天然的RNA分子；以及一種葉甲生物體之天然非編碼序列之至少19個連續核苷酸的片段之互補物，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：1之天然的RNA分子。於特定的具體例中，一鞘翅目害蟲接觸或是攝取該經單離的核酸序列，抑制了鞘翅目害蟲的生長、發育、生殖及/或取食。
在一些具體例中，本發明之核酸分子可以包含至少一個(例如，一個、二個、三個，或更多個)DNA序列(等)，該者能夠在一細胞或微生物中表現為iRNA分子以抑制靶定基因在鞘翅目害蟲之細胞、組織或器官中的表現。此(等)DNA序列可以可操縱地鏈接到在包含該DNA分子之一細胞中作用的啟動子序列，以引發或增強能夠形成dsRNA分子(等)之該編碼RNA的轉錄。在一具體例中，至少一個(例如，一個、二個、三個，或更多個)DNA序列(等)可以衍生自包含序列辨識編號：1之核苷酸序列。序列辨識編號：1的衍生物包括序列辨識編號：1的片段。在一些具體例中，此種片段可能包含，舉例而言，序列辨識編號：1之至少19個連續核苷酸的片段，或其等之互補物。因此，此種片段可能包含，舉例而言，序列辨識編號：1之19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30個連續的核苷酸，或其等之互補物。在這些及進一步具體例中，此一片段可能包含，舉例而言，序列辨識編號：1之超過約19個連續的核苷酸，或其等之互補物。因此，序列辨識編號：1之片段可 能包含，舉例而言，序列辨識編號：1之19、20、21、大約25(例如22，23，24，25，26，27，28及29)、大約30、大約40(例如35，36，37，38，39，40，41，42，43，44及45)、大約50、大約60、大約70、大約80、大約90、大約100、大約110、大約120、大約130、大約140、大約150、大約160、大約170、大約180、大約190、大約200或更多個連續的核苷酸，或其等之互補物。
一些具體例包含引入部分或完全穩定的dsRNA分子到一鞘翅目害蟲中，以抑制一靶定基因在該鞘翅目害蟲之細胞、組織或器官中的表現。當表現為一種iRNA分子(例如dsRNA、siRNA、miRNA及hpRNA)，並由一鞘翅目害蟲攝取時，包含序列辨識編號：1之一個或多個片段之核酸序列可能造成鞘翅目害蟲的死亡、生長抑制、性別比例變化、卵的大小縮小、停止感染及/或停止取食之一者或多者。舉例而言，在一些具體例中，提供一種dsRNA分子，該者包含一核苷酸序列，其包括約19個至約300個核苷酸，該核苷酸序列實質上同源於一鞘翅目害蟲靶定基因序列，且包含含有序列辨識編號：1之核苷酸序列的一個或多個片段。此種dsRNA分子的表現可能，舉例而言，導致攝取該dsRNA分子之鞘翅目害蟲的死亡及/或生長抑制。
在某些具體例中，本發明所提供的dsRNA分子包含互補於包含序列辨識編號：1之靶定基因的核苷酸序列，及/或互補於序列辨識編號：1之片段的核苷酸序列，該靶定基因在鞘翅目害蟲中的抑制作用引致對該鞘翅目害蟲生 長、發育、或其他生物功能必要的蛋白質或核苷酸序列劑的降低或移除。一選擇的核苷酸序列可能對序列辨識編號：1、序列辨識編號：1所陳述之核苷酸序列之連續片段、或前述任一者之互補物，展現出從約80%至約100%的序列同一性。舉例而言，一選定的核苷酸序列可能對序列辨識編號：1、序列辨識編號：1所陳述之核苷酸序列之連續片段、或前述任一者之互補物，展現出約81%；約82%；約83%；約84%；約85%；約86%；約87%；約88%；約89%；約90%；約91%；約92%；約93%；約94%；約95%；約96%；約97%；約98%；約98.5%；約99%；約99.5%及約100%的序列同一性。
在一些具體例中，能夠在細胞或微生物中表現如一種iRNA分子以抑制靶定基因表現的DNA分子，可以包含一單一核苷酸序列，其係特異性地互補於一種或多種靶定鞘翅目害蟲物種中發現之一種天然核酸序列的全部或部分，或者該DNA分子可以從數個這種特異性地互補序列而建構為一嵌合體(chimera)。
在一些具體例中，一核酸分子可以包含由一種"間隙子序列"分隔的一第一及一第二核苷酸序列。一間隙子序列可能為一區域，當所欲時其在該第一及第二核苷酸序列之間包含促進二級結構形成的任何核苷酸序列。在一具體例中，該間隙子序列係為mRNA的意義或反義編碼序列的一部分。該間隙子序列可以任擇地包含能夠共價鏈接至一核酸分子的核苷酸或其等之同源的任何組合。
舉例而言，在一些具體例中，該DNA分子可能包含一種編碼一個或多個不同的RNA分子之核苷酸序列，其中該不同的RNA分子每一者包含一第一核苷酸序列及一第二核苷酸序列，其中該第一及第二核苷酸序列係彼此互補的。該第一及第二核苷酸序列可能藉由一間隙子序列而於一RNA分子內連接。該間隙子序列可能構成該第一核苷酸序列或該第二核苷酸序列的一部分。一種包含該第一及第二核苷酸序列之RNA分子的表現，可能藉由該第一及第二核苷酸序列之特異性分子內鹼基配對，而導致本發明之dsRNA分子的形成。該第一核苷酸序列或該第二核苷酸序列與鞘翅目害蟲內天然的核酸序列(例如一靶定基因，或轉錄的非編碼序列)、其等之衍生物或互補於此的序列，可能為實質上同一的。
dsRNA核酸分子包含雙股的聚合核糖核苷酸序列，且可能包括對該磷酸糖主幹或核苷任一的修飾。可能打造RNA結構中的修飾以允許特定的抑制作用。在一具體例中，dsRNA分子可能透過無處不在的酶促過程(enzymatic process)修飾，以便可以生成siRNA分子。此酶促過程可能利用一種RNAseIII酶，諸如真核生物中之DICER，在活體外或活體內進行。參閱Elbashir等人之(2001)Nature 411：494-498；及Hamilton與Baulcombe(1999)Science 286(5441)：950-952。DICER或功能等同的RNAse III酶會將較大的dsRNA股及/或hpRNA分子切割成為較小的寡核苷酸(例如siRNA)，其中每一者的長度係為約19-25個核苷 酸。由這些酶所產生之siRNA分子具有2至3個核苷酸之3'突出端，及5'磷酸酯末端與3'羥基末端。由RNAse III酶生成之siRNA分子在細胞中解開並分開為單股RNA。該siRNA分子繼而與一靶定基因轉錄的RNA序列特異性地雜交，而兩個RNA分子隨後係藉由固有的細胞RNA降解機制而降解。此過程可能引致該靶定基因編碼之RNA序列在該靶定生物中的有效降解或是移除。結果為該靶定基因的轉錄後靜默作用。在一些具體例中，由內源性RNAse III酶從異源性核酸分子所產生的siRNA分子可能有效地媒介鞘翅目害蟲中靶定基因的向下調控。
在一些具體例中，本發明之核酸分子可能包括至少一非天然存在的核苷酸序列，該者可以轉錄成一單股RNA分子，其能夠透過分子間雜交在活體內形成dsRNA分子。此種dsRNA序列典型地為自組裝，且可以在一鞘翅目害蟲營養源中提供，以實現一靶定基因的轉錄後抑制。在這些及進一步具體例中，本發明之核酸分子可能包含兩種不同的非天然存在的核苷酸序列，其中每一者係特異性地互補於一鞘翅目害蟲中之不同的靶定基因。當此一核酸分子係以一dsRNA分子提供至一鞘翅目害蟲時，該dsRNA分子抑制鞘翅目害蟲中至少兩種不同靶定基因的表現。
C.獲得核酸分子
可以使用各種在鞘翅目害蟲中的天然序列做為用於設計本發明之核酸分子的靶定序列，諸如iRNAs及編碼iRNA之DNA分子。然而，天然序列之選擇係非直截了當的 過程。在該鞘翅目害蟲中僅有很小數目的天然序列會是有效的標靶。舉例而言，無法確實的預測一特定的天然序列是否可以藉由本發明之核酸分子有效地向下調控，或一特定天然序列的向下調控是否將在該鞘翅目害蟲之生長、活力、增生及/或生殖上具有不利的效果。絕大多數的天然鞘翅目害蟲序列，諸如由此分離的EST序列(舉例而言，如美國專利第7,612,194號及第7,943,819號中所列出者)，在諸如WCR或NCR之鞘翅目害蟲的生長、活力、增生及/或生殖上不具有不利的效果。該等天然序列何者可能在鞘翅目害蟲具有不利的效果，能夠在重組技術中使用用於在宿主植物中表現互補於此種天然序列的核酸分子，並且依靠餵食在鞘翅目害蟲上提供不利的效果而不會對宿主植物造成危害，兩者皆為不可預測的。
在一些具體例中，本發明之核酸分子(例如在鞘翅目害蟲之宿主植物中提供的dsRNA分子)係選擇以靶定cDNA序列，其編碼對鞘翅目害蟲生存必要之蛋白質或部分的蛋白質，諸如胺基酸序列，其涉及代謝或分解生化途徑、細胞分裂、生殖、能量代謝、消化、寄主植物識別之類。如於此所描述，由一靶定生物體攝入含有一個或多個dsRNA的組成物，其中該一個或多個dsRNA中至少一區段係特異性地互補於該靶定害蟲生物體細胞中製造的至少實質上同一的RNA區段，可以引致該標靶的死亡或其他抑制作用。一種衍生自鞘翅目害蟲之核苷酸序列，DNA或RNA任一，可以使用以建構抗鞘翅目害蟲侵擾的植物細胞。該 鞘翅目害蟲的宿主植物(例如玉蜀黍(Z.mays)或大豆(G.max))，舉例而言，可以經轉形以含有如於此所提供、衍生自鞘翅目害蟲的一個或多個核苷酸序列。轉形到宿主的核苷酸序列可能編碼一個或多個RNA，其在該轉形宿主之內的細胞或生物液中形成一種dsRNA序列，因此假若/當該鞘翅目害蟲與該基因轉殖宿主形成一種營養關係時，會使得該dsRNA變得可獲得的。此可能引致該鞘翅目害蟲細胞中一個或多個基因表現的箝制，以及最終死亡或抑制其之生長或發育。
因此，在一些具體例中，本質上涉及一鞘翅目害蟲生長、發育及生殖之一基因係為靶定的。其他在本發明中使用的靶定基因可能包括，舉例而言，那些在鞘翅目害蟲活力、移動、遷移、生長、發育、感染性、取食部位建立及生殖中扮演重要角色者。一靶定基因因而可能為一種管家基因(housekeeping gene)或一種轉錄因子。此外，在本發明中使用之一天然鞘翅目害蟲核苷酸序列亦可能衍自於一植物、病毒、細菌或昆蟲基因的同源物(例如異種同源物(ortholog))，該者之功能對熟習該項技藝者係為知悉的，且該者之核苷酸序列與靶定鞘翅目害蟲之基因組中的靶定基因係特異性地雜交的。用一種已知核苷酸序列、藉由雜交來辨識基因之同源物的方法對熟習該項技藝人士係知悉的。
在一些具體例中，本發明提供用於獲得一核酸分子的方法，該核酸分子包含用於製造iRNA(例如dsRNA、 siRNA、miRNA及hpRNA)分子之核苷酸序列。一個這樣的具體例包含：(a)依靠dsRNA-媒介基因箝制，分析一個或多個靶定基因(等)在鞘翅目害蟲中的表現、功能及表型；(b)以一探針探測cDNA或gDNA庫，其中該探針包含源自靶定鞘翅目害蟲之核苷酸序列的全部或部分或其等之同源物，該核苷酸序列的全部或部分或其等之同源物在dsRNA-媒介的箝制分析中展示改變(例如降低)的生長或發育表型；(c)辨識與該探針特異性雜交之DNA選殖體；(d)單離在步驟(b)中辨識之該DNA選殖體；(e)定序包含在步驟(d)中單離之該選殖體的cDNA或gDNA片段，其中該經定序的核酸分子包含全部或大部分的RNA序列或其等的同源物；及(f)化學合成一基因序列或siRNA或miRNA或hpRNA或mRNA或dsRNA的全部或大部分。
在進一步具體例中，一種用於獲得一核酸片段的方法，該核酸片段包含用於製造大部分的iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA及hpRNA)分子的核苷酸序列，該方法包括：(a)合成第一及第二寡核苷酸引子，其特異性地互補於源自一靶定編鞘翅目害蟲的天然核苷酸序列之一部分；及(b)使用步驟(a)之該第一及第二寡核苷酸引子來擴增一選殖載體中存在的cDNA或gDNA插入子(insert)，其中該經擴增的核酸分子包含大部分的siRNA或miRNA或hpRNA或mRNA或dsRNA分子。
本發明之核酸可以藉由許多方法單離、擴增或產生。舉例而言，一種iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA及 hpRNA)分子可能藉由PCR擴增一種衍生自gDNA或cDNA庫的靶定核酸序列(例如一靶定基因或一靶定轉錄的非編碼序列)，或其等之部分而獲得。DNA或RNA可能從一靶定生物體萃取，且核酸庫可能使用該技藝一般技藝人士所知悉的方法由此而製備。從一靶定生物體生成之gDNA或cDNA庫可能使用於PCR擴增及靶定基因之定序。已確認的PCR產物可能使用做為一模板，用於以最小啟動子(minimal promoter)在活體外轉錄以生成意義及反義RNA。或者，核酸分子可能藉由許多技術任一者合成的(參閱，例如Ozaki等人之(1992)Nucleic Acids Research,20：5205-5214；及Agrawal等人之(1990)Nucleic Acids Research,18：5419-5423)，包括使用一種自動DNA合成儀(舉例而言，P.E.Biosystems公司(加州福斯特城)之392或394型DNA/RNA合成儀)，使用標準化學品，諸如亞磷醯胺(phosphoramidite)化學品。參閱，例如，Beaucage et al.(1992)Tetrahedron,48：2223-2311；美國專利第4,415,732號、第4,458,066號、第4,725,677號、第4,973,679號及第4,980,460號。亦可以採用任擇的引致非天然主幹基團之化學品，諸如硫代磷酸酯(phosphorothioate)、胺基磷酸酯(phosphoramidate)及之類。
本發明之RNA、dsRNA、siRNA、miRNA或hpRNA分子可能由熟習該項技藝者透過手動或自動反應化學或酶促予以製造，或是在活體內在包含一種核酸分子其包含編碼該RNA、dsRNA、siRNA、miRNA或hpRNA分子之序列 的細胞中製造。RNA亦可能藉由部分或總有機合成製造-任何修飾的核糖核苷酸可以藉由活體外酶促或是有機合成來引入。一種RNA分子可能藉由一細胞RNA聚合酶或一噬菌體RNA聚合酶(例如T3 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶及SP6 RNA聚合酶)予以合成。對選殖及核苷酸序列表現有用的表現建構物在該技藝中係已知的。參閱，例如美國專利第5,593,874號、第5,693,512號、第5,698,425號、第5,712,135號、第5,789,214號及第5,804,693號。化學合成或藉由活體外酶促合成的RNA分子可能在引入到一細胞之前純化。舉例而言，RNA分子可以藉由以一溶劑或樹脂提取、沈澱、電泳法、色層分析法，或其等之一組合，而從一混合物中純化。或者，化學合成或藉由活體外酶促合成的RNA分子可能沒有純化或最小純化而使用，舉例而言，以避免因為樣品處理的損失。該RNA分子可能乾燥用於儲存，或溶解在一水溶液中。該溶液可能含有緩衝液或鹽類以促進dsRNA分子雙聯體股的黏合，及/或穩定。
在具體例中，一種dsRNA分子可能由一單一的自我互補RNA股或從兩個互補的RNA股予以形成。dsRNA分子可能在活體內或在活體外合成。一種細胞內源性RNA聚合酶可能媒介一種或兩種RNA股在活體內的轉錄，或是可使用選殖的RNA聚合酶以媒介活體內或活體外的轉錄。在一鞘翅目害蟲中靶定基因的轉錄後抑制可能為宿主靶定的，其係藉由在該宿主之一器官、組織或細胞類型中的特異性轉錄(例如藉由使用一組織特異性啟動子)；該宿主中環 境條件的刺激(例如藉由使用對感染、壓力、溫度及/或化學誘導劑回應的一誘導型啟動子)；及/或於該宿主之發育階段或年齡的遺傳工程轉錄(例如藉由使用一發育階段特異性啟動子)。無論在活體外或活體內轉錄，形成dsRNA分子的RNA股可能或可能不能夠予以多腺苷酸化，且可能或可能不能夠藉由細胞的轉譯裝置予以轉譯成多肽。
D.重組載體及宿主細胞轉形
在一些具體例中，本發明亦提供一種DNA分子，用於引入至一細胞中(例如一細菌細胞、酵母細胞或植物細胞)，其中該DNA分子包含一核苷酸序列，該核苷酸序列一旦表現成RNA且由鞘翅目害蟲攝入，在該鞘翅目害蟲之細胞、組織或器官中實現一靶定基因的箝制。因此，一些具體例提供重組核酸分子，其包含能夠在一植物細胞中表現為一種iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA及hpRNA)分子的核酸序列，以抑制靶定基因在鞘翅目害蟲中的表現。為了引發或增強表現，此種重組的核酸分子可能包含一個或多個調控序列，該調控序列可能可操縱地鏈接到能夠表現為iRNA之核酸序列。在植物中表現一基因箝制分子的方法係為已知的，且可能使用以表現本發明之一種核苷酸序列。參閱，例如國際PCT公開案第WO06/073727號；及美國專利公開案第2006/0200878 A1號)。
在特定具體例中，本發明之一種重組DNA分子可能包含一種編碼dsRNA分子的核酸序列。此種重組DNA分子可能編碼dsRNA分子，該者一旦攝入，可能能夠抑制鞘 翅目害蟲細胞中內源性靶定基因(等)之表現。在許多具體例中，一轉錄的RNA可能形成一種dsRNA分子，其可以穩定形式來提供；例如以一髮夾及莖環結構。
在這些及進一步具體例中，dsRNA分子之一股可能藉由從一核苷酸序列轉錄而形成，該核苷酸序列實質上係同源於以下所組成的核苷酸序列：序列辨識編號：1；序列辨識編號：1之互補物；序列辨識編號：1之至少19個連續核苷酸的片段；序列辨識編號：1之至少19個連續核苷酸的片段之互補物；一種葉甲(Diabrotica)生物體(例如WCR)之天然編碼序列，其包含序列辨識編號：1；一種葉甲生物體之天然編碼序列之互補物，該天然編碼序列包含序列辨識編號：1；一種葉甲生物體之天然非編碼序列，其轉錄成包含序列辨識編號：1之天然的RNA分子；一種葉甲生物體之天然非編碼序列之互補物，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：1之天然的RNA分子；一種葉甲生物體(例如WCR)之天然編碼序列之至少19個連續核苷酸的片段，該天然編碼序列包含序列辨識編號：1；一種葉甲生物體之天然編碼序列之至少19個連續核苷酸的片段之互補物，該天然編碼序列包含序列辨識編號：1；一種葉甲生物體之天然非編碼序列之至少19個連續核苷酸的片段，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：1之天然RNA分子；以及一種葉甲生物體之天然非編碼序列之至少19個連續核苷酸的片段之互補物，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：1之天然的RNA分子。
在特定實施例中，一種編碼dsRNA分子的重組DNA分子可能在一轉錄序列之內包含至少兩個核苷酸序列區段，其中該序列係配置成，藉此，該轉錄序列相對於至少一啟動子，包含一個處於意義定向(sense orientation)的第一核苷酸序列區段，及處於反義定向的第二核苷酸序列區段(包含該第一核苷酸序列區段的互補物)，其中該意義核苷酸序列區段與該反義核苷酸序列區段係藉由從約五(~5)至約一千(~1000)個核苷酸的間隙子序列予以鏈接或連接。該間隙子序列可能在該意義及反義序列區段之間形成一個環。該意義核苷酸序列區段或該反義核苷酸序列區段可能實質上同源於一靶定基因(例如包含序列辨識編號：1之基因)的核苷酸序列，或其等之片段(例如序列辨識編號：2-4中任一者)。然而，在一些具體例中，一種重組DNA分子可能編碼一種dsRNA分子但不具間隙子序列。在具體例中，一意義編碼序列及一反義編碼序列長度可能是不同的。
辨識為在鞘翅目害蟲上具有不利影響或就鞘翅目害蟲具有一植物保護效果者之序列，可能透過在本發明的重組核酸分子中創造適當的表現卡匣(expression cassette)而輕易地併入被表現的dsRNA分子。舉例而言，此種序列可能表現為具有一莖環結構之髮夾，其係藉由取得相應於一靶定基因序列(例如序列辨識編號：1及其等之片段)的第一區段；鏈接此序列至不同源或不互補於該第一區段的第二區段間隙子區域；以及鏈接此至第三區段，其中該第三區段的至少一部分係實質上互補於該第一區段。此一建構 物藉由該第一區段與該三區段的分子內鹼基對而形成一種莖環結構，其中該環結構形成且包含該第二區段。參閱，例如美國專利公開案第2002/0048814號及第2003/0018993號；及國際PCT專利公開案第WO94/01550號及第WO98/05770號。一種dsRNA分子可能生成為，舉例而言，雙股結構形式諸如莖環結構(例如髮夾)，從而由於靶定基因的片段之共同表現，而使靶定天然鞘翅目害蟲序列的siRNA之製造提升，譬如在額外的植物表現卡匣，該者導致增強的siRNA生產，或降低甲基化，以防止該dsRNA髮夾啟動子的轉錄基因靜默作用。
本發明之具體例包括引入本發明之一重組核酸分子到一植物內(亦即，轉形)，以實現一個或多個iRNA分子表現之鞘翅目害蟲抑制位準。一重組DNA分子可能為，舉例而言，一載體，諸如一線形或一環狀閉合質體。載體系統可能為一單一載體或質體，或二個或多個一起含有引入宿主基因組內之總DNA的載體或質體。此外，載體可能為一表現載體。本發明之核酸序列可以，舉例而言，適當地插入到在一合適啟動子控制下的載體中，其中該啟動子係在一個或多個宿主中作用以驅動鏈接的編碼序列或其它DNA序列的表現。針對此目的，許多載體係可用的，而適當載體之選擇主要將取決於插入到該載體的核酸大小，及該載體轉形的特定宿主細胞。每一載體取決其功能(例如擴增DNA或表現DNA)及其相容的特定宿主細胞，而含有各種組份。
為了傳遞鞘翅目害蟲抵抗力至一基因轉殖植物，一重組DNA可能在重組植物的組織或流體內，舉例而言，轉錄成一種iRNA分子(例如形成一種dsRNA分子的RNA分子)。一種iRNA分子可能包含一核苷酸序列，該序列實質上同源且特異性地雜交至可能會造成宿主植物物種損害之鞘翅目害蟲之內的相應的轉錄核苷酸序列。該鞘翅目害蟲可能接觸在該基因轉殖宿主植物細胞中轉錄的iRNA分子，舉例而言，藉由攝入包含該iRNA分子之基因轉殖宿主植物的細胞或流體。因此，侵擾該基因轉殖宿主植物之鞘翅目害蟲內的靶定基因表現係由iRNA分子予以箝制。在一些具體例中，靶定基因在該靶定鞘翅目害蟲中表現的箝制作用可能引致該植物對該害蟲攻擊的抵抗力。
為了能夠遞送iRNA分子到鞘翅目害蟲，該鞘翅目害蟲與業已經本發明重組核酸分子轉形之植物細胞處於營養關係中，必須能在該植物細胞中表現(亦即，轉錄)iRNA分子。因此，重組核酸分子可能包含本發明的核苷酸序列，其可操縱地鏈接到在宿主細胞內作用之一個或多個調控序列，該調控序列諸如一異源性啟動子序列，宿主細胞諸如細菌細胞其中該核酸分子係予以擴增，及一植物細胞其中該核酸分子係被表現者。
適合在本發明之核酸分子中使用的啟動子包括那些誘導型、病毒、合成、或持續表現型，在該技藝中全部係為眾所周知的。說明此種啟動子的非限制性例子包括美國專利第6,437,217號(玉蜀黍(maize)RS81啟動子)；第 5,641,876號(水稻肌動蛋白啟動子)；第6,426,446號(玉蜀黍(maize)RS324啟動子)；第6,429,362號(玉蜀黍(maize)PR-1啟動子)；第6,232,526號(玉蜀黍(maize)A3啟動子)；第6,177,611號(持續表現型玉蜀黍(maize)啟動子)；第5,322,938號、第5,352,605號、第5,359,142號及第5,530,196號(CaMV 35S啟動子)；第6,433,252號(玉蜀黍(maize)L3油膜蛋白(oleosin)啟動子)；第6,429,357號(水稻肌動蛋白2啟動子及水稻肌動蛋白2內含子)；第6,294,714號(光誘導型啟動子)；第6,140,078號(鹽誘導型啟動子)；第6,252,138號(病原誘導型啟動子)；第6,175,060號(缺磷誘導型啟動子)；第6,388,170號(雙向啟動子)；第6,635,806號(γ-醇溶蛋白(coixin)啟動子)；及美國專利公開案第2009/757,089號(玉蜀黍(maize)葉綠體醛醇縮酶啟動子)。額外的啟動子包括胭脂鹼(nopaline)合成酶(NOS)啟動子(Ebert等人之(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(16)：5745-5749)及章魚鹼合成酶(OCS)啟動子(該等係於農桿腫瘤菌(Agrobacterium tumefaciens)之腫瘤誘導質體上實行)；花椰菜嵌紋病毒(caulimovirus)啟動子，諸如花椰菜嵌紋病毒(cauliflower mosaic virus)(CaMV)19S啟動子(Lawton等人之(1987)Plant Mol.Biol.9：315-324)；CaMV 35S啟動子(Odell等人之(1985)Nature 313：810-812)；玄參花嵌紋病毒(figwort mosaic virus)35S-啟動子(Walker等人之(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(19)：6624-6628”)；蔗糖合成酶啟動子(Yang及Russell之(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87： 4144-4148)；R基因複合體啟動子(Chandler等人之(1989)Plant Cell 1：1175-1183)；葉綠素a/b結合蛋白基因啟動子；CaMV 35S(美國專利第5,322,938號、第5,352,605號、第5,359,142號及第5,530,196號)；FMV 35S(美國專利第5,378,619號及第6,051,753號)；PC1SV啟動子(美國專利第5,850,019號)：SCP1啟動子(美國專利第6,677,503號)；及AGRtu.nos啟動子(GenBankTM登錄號V00087；Depicker等人之(1982)J.Mol.Appl.Genet.1：561-573；Bevan等人之(1983)Nature 304：184-187)。
在特定具體例中，本發明之核酸分子包含一種組織特異性啟動子，諸如一種根特異性啟動子。根特異性啟動子專門或優先地驅動可操縱鏈接編碼序列表現在根組織中。根特異性啟動子的例子在本技藝中為已知的。參閱，例如美國專利第5,110,732號；第5,459,252號及第5,837,848號；及Opperman等人之(1994)Science 263：221-3；及Hirel等人之(1992)Plant Mol.Biol.20：207-18。在一些具體例中，根據本發明用於鞘翅目害蟲控制之核苷酸序列或片段可能選殖在兩個根特異性啟動子之間，其中該兩啟動子相對於該核苷酸序列或片段係定向在相反的轉錄方向，且該核苷酸序列或片段在基因轉殖植物細胞中為可操縱的並在其中表現，以在該基因轉殖植物細胞中製造隨後可能形成dsRNA分子的RNA分子，如前文所描述。在植物組織中表現之iRNA分子可能由一種鞘翅目害蟲攝入，藉此，實現了靶定基因表現之箝制。
可能選擇性地可操縱鏈接至感興趣核酸分子之額外調控序列包括5'UTRs，其位於一啟動子序列及一編碼序列之間、作用為一轉譯前導序列。該轉譯前導序列係存在於完全加工的mRNA中，且其可能影響該初級轉錄本的加工，及/或RNA的穩定性。轉譯前導序列的例子包括玉蜀黍(maize)及矮牽牛(petunia)熱休克蛋白質前導(美國專利第5,362,865號)、植物病毒外殼蛋白質前導、植物核酮糖雙磷酸羧化酶前導、及其他。參閱，例如Turner及Foster之(1995)Molecular Biotech.3(3)：225-36。5'UTRs之非限制性例子包括GmHsp(美國專利第5,659,122號)；PhDnaK(美國專利第5,362,865號)；AtAnt1；TEV(Carrington及Freed之(1990)J.Virol.64：1590-7)；及AGRtunos(GenBankTM登錄號V00087；及Beva等人之(1983)Nature 304：184-7)。
可能選擇性地可操縱鏈接至感興趣核酸分子之額外調控序列還包括3'非轉譯序列、3'轉錄終止區域，或多腺苷酸化區域。這些係位於一核苷酸序列下游的遺傳元素，且包括多核苷酸其提供多腺苷酸化訊號，及/或其他能夠影響轉錄或mRNA加工的調控訊號。多腺苷酸化訊號在植物中作用以造成該mRNA前驅體3'端聚腺苷酸核苷酸的添加。該多腺苷酸化序列可以衍生自於各種植物基因，或衍生自T-DNA基因。3'轉錄終止區域之非限制性例子為胭脂鹼合成酶3'區域(nos 3'；Fraley等人之(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803-7)。不同的3'非轉譯區域之使用的一個例子係提供於Ingelbrecht等人之(1989)Plant Cell 1： 671-80。多腺苷酸化訊號的非限制性例子包括一者，其源自豌豆(Pisum sativum)RbcS2基因(Ps.RbcS2-E9；Coruzz等人之(1984)EMBO J.3：1671-9)及AGRtu.nos(GenBankTM登錄號E01312)。
一些具體例可能包括一種植物轉形載體，其包含經單離的及純化之DNA分子，該DNA分子包含至少一個上文描述、可操縱地鏈接到本發明之一個或多個核苷酸序列的調控序列。當表現時，該一個或多個核苷酸序列引致一個或多個RNA分子(等)，其包含特異性地互補於鞘翅目害蟲中的天然RNA分子之全部或部分的核苷酸序列。因此，該(等)核苷酸序列可能包含一區段，其編碼存在於一靶定鞘翅目害蟲RNA轉錄體中之一核糖核苷酸序列之全部或一部分，一個存在於，且可能包含一靶定鞘翅目害蟲轉錄本之全部或一部分的反向重複。一種植物轉形載體可能含有特異性地互補於超過一個靶定序列的序列，從而允許製造超過一個的dsRNA，用於抑制靶定鞘翅目害蟲之一個或多個族群或物種之細胞中二個或多個基因的表現。特異性地互補於存在不同基因中之核苷酸序列的核苷酸序列區段，可以組合成一單一複合核酸分子，用於在一基因轉殖植物中表現。此等區段可能為連續的或是由間隙子序列分隔開。
在一些具體例中，已經含有本發明至少一核苷酸序列(等)的本發明質體，可以藉由在相同質體中依序插入額外的核苷酸序列(等)而修飾，其中該(等)額外的核苷酸序列係如初始的至少一核苷酸序列(等)予以可操縱地鏈接到相 同的調控元件。在一些具體例中，一核酸分子可能設計用於抑制多重靶定基因。在一些具體例中，被抑制的多重基因可以從相同的鞘翅目害蟲物種獲得，該者可能增強該核酸分子的有效性。在其他具體例中，該基因可以衍生自不同的鞘翅目害蟲，該者可能擴大該(等)藥劑係為有效的鞘翅目害蟲範圍。當多重基因係靶定用於箝制或表現及箝制之組合時，可以製造一種多順反子DNA元素。
本發明之重組核酸分子或載體可能包含一個可選擇的標記，該者賦予轉形細胞，諸如一植物細胞，一種可選擇的表型。可選擇的標記亦可以使用以選擇包含本發明重組核酸分子的植物或植物細胞。該標記可能編碼殺生物劑抗性、抗生素抗性(例如卡那黴素(kanamycin)、Geneticin(G418)、博來黴素(bleomycin)、潮黴素(hygromycin)等等)、或除草劑抗性(例如嘉磷塞(glyphosate)等等)。可選擇標記之例子包括，但不限於：neo基因，該者編碼卡那黴素抗性且可以使用卡那黴素、G418......等等選擇；bar基因，該者編碼雙丙氨磷(bialaphos)抗性；一種突變的EPSP合成酶基因，該者編碼嘉磷塞(glyphosate)抗性；腈合成酶(nitrilase)基因，該者賦予對溴苯腈(bromoxynil)的抗性；一種突變乙醯乳酸合成酶(ALS)基因，該者賦予咪唑啉酮(imidazolinone)或磺醯脲素抗性；及一種抗胺甲基葉酸(methotrexate)DHFR基因。多重可選標記係為可用的，該者賦予對以下之抗性：胺芐青黴素(ampicillin)、博萊黴素(bleomycin)、氯黴素、建他黴素(gentamycin)、潮黴素 (hygromycin)、卡那黴素(kanamycin)、林可黴素(lincomycin)、胺甲基葉酸、草胺膦(phosphinothricin)、嘌呤黴素(puromycin)、觀黴素(spectinomycin)、利福平(rifampicin)、鏈黴素及四環黴素及之類。此種可選擇標記之例子係例示於，例如美國專利第5,550,318號；第5,633,435號；第5,780,708號及第6,118,047號。
本發明之重組核酸分子或載體亦可包括一種可篩選標記。可篩選標記可以使用以監控表現。示範性的可篩選標記包括β-葡萄糖醛酸苷酶或uidA基因(GUS)，該者編碼各種顯色基質係為已知的酶(Jefferson等人之(1987)Plant Mol.Biol.Rep.5：387-405)；R-基因座基因，該者編碼一產物其調控植物組織中花青素(anthocyanin)色素(紅色)的製造(Dellaporta等人之(1988)"Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac." In 18th Stadler Genetics Symposium,P.Gustafson and R.Appels,eds.(New York：Plenum),pp.263-82)；β-內醯胺酶基因(Sutcliffe等人之(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：3737-41)；一種基因，其編碼各種顯色基質係為已知的酶(例如PADAC，顯色頭孢菌素(cephalosporin))；一種螢光素酶基因(Ow等人之(1986)Science 234：856-9)；xylE基因，其編碼可以轉換顯色兒茶酚的兒茶酚雙加氧酶(Zukowski等人之(1983)Gene 46(2-3)：247-55)；澱粉酶基因(Ikatu等人之(1990)Bio/Technol.8：241-2)；酪胺酸酶基因，該者編碼能夠氧化酪氨酸成為DOPA及多巴醌(dopaquinone)之 酶，後者轉而縮合成黑色素(Katz等人之(1983)J.Gen.Microbiol.129：2703-14)；及α-半乳糖苷酶。
在一些具體例中，重組核酸分子，如前文所描述，可能在用於創造基因轉殖植物及在植物中表現異源性核酸的方法中使用，以製備對鞘翅目害蟲展示降低的易感性之基因轉殖植物。植物轉形載體可以，舉例而言，藉由將編碼iRNA分子的核酸分子插入到植物轉形載體並將它們引入到植物內來製備。
適合用於轉形宿主細胞的方法包括DNA可以被引入到一細胞中的任何方法，諸如藉由原生質的轉形(參閱，例如美國專利第5,508,184號)，藉由乾燥/抑制(desiccation/inhibition)媒介的DNA攝入(參閱，例如Potrykus等人之(1985)Mol.Gen.Genet.199：183-8)，藉由電穿孔(參閱，例如美國專利第5,384,253號)，藉由以碳化矽纖維攪拌(參閱，例如美國專利第5,302,523號及第5,464,765)，藉由農桿菌媒介轉形(參閱，例如美國專利第5,563,055號；第5,591,616號；第5,693,512號；第5,824,877號；第5,981,840號；及第6,384,301號)及藉由加速的DNA包覆顆粒(參閱，例如美國專利第5,015,580號；第5,550,318號；第5,538,880號；第6,160,208號；第6,399,861號；及第6,403,865號)等等。對轉形玉米特別有用的技術係描述，舉例而言，於美國專利第5,591,616號、第7,060,876號及第7,939,3281號。透過諸如這些技術的應用，幾乎任何物種的細胞可被穩定地轉形。在一些具體例中，轉形的DNA係併入到宿主細胞的基 因組中。在多細胞物種的情況下，基因轉殖細胞可能再生成一基因轉殖生物。這些技術任一者可能使用以製造基因轉殖植物，舉例而言，在該基因轉殖植物之基因組中包含一個或多個編碼一個或多個iRNA分子的核酸序列。
用於引入一表現載體至一植物內最廣泛利用的方法係奠基於各種農桿菌物種的天然轉形系統。農桿腫瘤菌(A.tumefaciens)及農桿根毛菌(A.rhizogenes)係為植物病原土壤細菌，其等會基因轉形植物細胞。農桿腫瘤菌(A.tumefaciens)及農桿根毛菌(A.rhizogenes)的Ti及Ri質體係分別攜帶負責植物基因轉形的基因。Ti(腫瘤誘導)-質體含有被稱為T-DNA的一大區段，該者係轉移到經轉形的植物中。Ti質體之另一區段，Vir區域，係負責T-DNA的轉移。該T-DNA區域係藉由末端重複接壤的。在修飾的雙元載體中，腫瘤誘導基因已被刪除，而利用Vir區域之功能以轉移由T-DNA交界序列接壤的外來DNA。T-區域亦可能含有用於有效地回收基因轉殖細胞及植物之可選擇的標記，以及一個多重選殖位點用於插入轉移的序列，諸如編碼核酸的dsRNA。
因此，在一些具體例中，一種植物轉形載體係衍生自農桿腫瘤菌的Ti質體(參閱，例如美國專利第4,536,475號、第4,693,977號、第4,886,937號及第5,501,967號；及歐洲專利第EP 0 122 791號)，或衍生自農桿根毛菌的Ri質體。額外的植物轉形載體包括，舉例而言但不限於，那些由以下所描述者：Herrera-Estrella等人之(1983)Nature 303： 209-13；Bevan等人之(1983)Nature 304：184-7；Klee等人之(1985)Bio/Technol.3：637-42；及歐洲專利第EP 0 120 516號，及那些衍生自於前述任一者。其他與植物自然交互作用的細菌，諸如中華根瘤菌(Sinorhizobium)、根瘤菌(Rhizobium)及中慢生根瘤菌(Mesorhizobium)，可以予以修飾以媒介許多歧異植物的基因轉移。這些植物關聯的共生細菌可以藉由取得無害的Ti質體及一種合適的雙元載體兩者而勝任基因轉移。
在提供外源DNA至接受細胞(recipient cell)之後，轉形細胞通常予以鑑定用於進一步培養及植物再生。為了改良鑑定轉形細胞的能力，可能希望採用一種可選擇或可篩選的標記基因，如先前所陳述，加上用來產生轉形體之轉形載體。在使用一種可選擇標記的情況下，轉形細胞係藉由曝露該細胞到一選擇性藥劑或藥劑等在潛在轉形細胞族群之內予以鑑定。在使用一種可篩選標記的情況下，細胞可能針對該所欲的標記基因性狀被篩選。
在暴露於選擇劑之後仍然生存的細胞，或是於篩選分析中已經評分為陽性的細胞，可以培養於支持植物的再生之培養基內。於一些具體例中，任何適合的植物組織培養基(舉例而言，MS和N6培養基)可以透過含括另外的物質而改良，例如生長調節劑。組織可以維持於帶有生長調節劑的基礎培養基上，直到可得到足夠的組織來開始植物再生工作，或是繼之重複循環的手工選擇，直到組織的形態適合再生為止(舉例而言，典型為至少2週)，接而轉移至 有助於莖(shoot)形成的培養基。週期性地轉移培養物直到足夠的莖形成已出現為止。一旦莖形成，將其等轉移至有助於根形成的培養基。一旦足夠的根形成，植物可以轉移至土壤用於進一步的生長和成熟。
為了確認再生的植物內一種感興趣核酸分子(舉例而言一種DNA序列，其編碼抑制靶定基因在鞘翅目害蟲中表現之一個或多個iRNA分子)的存在，可以執行各種各樣的分析。此等分析包括，舉例而言：分子生物分析，例如南方墨點和北方墨點、PCR以及核酸定序；生化分析，例如，舉例而言，透過免疫學的手段(ELISA及/或西方墨點)或是透過酵素功能來偵測蛋白質產物的存在；植物部分的分析，例如葉子或是根分析；以及全株再生植物之表型的分析。
併入事件可以，舉例而言，藉由PCR擴增來分析，例如使用對感興趣核酸分子特異性的寡核苷酸引子。PCR基因分型係理解為包括，但不限於，聚合酶連鎖反應(PCR)擴增衍生自經單離的宿主植物癒傷組織的基因組DNA，其中該癒傷組織係預測含有併入到該基因組中之一感興趣核酸分子，繼之標準選殖及定序分析PCR擴增產物。PCR基因分型方法已清楚描述(舉例而言，Rios,G等人之(2002)Plant J.32：243-53)，且可能應用到衍生自於任何植物物種(例如玉蜀黍(Z.mays)或大豆(G.max))或組織類型的基因組DNA，包括細胞培養。
使用依賴農桿菌轉形方法形成的基因轉殖植物 典型地含有插入到一染色體內的單一重組DNA序列。該單一重組DNA序列係稱為一"基因轉殖事件"或"併入事件"。此種基因轉殖植物因為插入的外源性序列係為半合子(hemizygous)。在一些具體例中，就轉基因而言，一基因轉殖植物同型合子可能藉由有性交配(自交)含有一單一外源性基因序列之獨立分離體基因轉殖植物到自身而獲得的，舉例而言一種T0植物，以產生T1種子。所產生的四分之一T1種子就該轉基因而言將為同型合子。發芽的T1種子引致植物，其可以用於異型合子歧異度測試者，典型地使用允許區別半合子與同型合子之間(意即，接合子(zygosity)分析)的SNP分析或熱放大分析。
在特定具體例中，在具有一鞘翅目害蟲抑制效果的植物細胞中，產生至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個或更多個不同的iRNA分子。該iRNA分子(例如dsRNA分子)可能從不同轉形事件中引入之多重核酸序列來表現，或從在一單一轉形事件中引入之單一核酸序列來表現的。在一些具體例中，數個iRNA分子係於一單一啟動子的控制下表現。在其他具體例中，數個iRNA分子係於多重啟動子控制下表現。可以表現包含多重核酸序列之單一iRNA分子，該多重核酸序列每一者係同源於一個或多個鞘翅目害蟲之內的不同基因座(舉例而言，由序列辨識編號：1所界定的基因座)，二者均於相同鞘翅目害蟲物種中的不同族群，或在不同物種的鞘翅目害蟲中。
除了用重組核酸分子直接轉形一植物之外，還可 以藉由將具有至少一種基因轉殖事件的第一植物與缺乏此種事件的第二植物雜交而製備基因轉殖植物。舉例而言，一種包含編碼一種iRNA分子之核苷酸序列的重組核酸分子，可能引入至一第一植物品系，其順應於轉形以產生一基因轉殖植物，該基因轉殖植物可能與一第二植物品系雜交以使編碼該iRNA分子之核苷酸序列基因滲入(introgress)到該第二植物品系內。
本發明亦包括含有本發明之一個或多個序列的商品產物。特定具體例包括重組植物或種子所生產的商品產物，該重組植物或種子含有本發明之一個或多個核苷酸序列。含有本發明之一個或多個序列的一種商品產物係意欲包括，但不僅於，一植物之膳食、油、粉碎或全穀物或種子，或是任何食品或動物飼料產品，其包含一重組植物或種子的任何膳食、油或粉碎或全穀物，其中該重組植物或種子含有本發明之一個或多個序列。在於此所思量之一個或多個商品或商品產物中偵測本發明之一個或多個序列為一事實上的證據，該者表明該商品或商品產物係產自於一種設計來表現本發明之一個或多個核苷酸序列的基因轉殖植物，為了達到使用dsRNA媒介基因箝制方法來控制鞘翅目植物害蟲的目的。
在一些態樣中，包括衍生自轉形植物細胞的基因轉殖植物所生產的種子及商品產物，其中該種子或商品產物包含可檢測數量的本發明之核酸序列。在一些具體例中，此種商品產物可以舉例而言，藉由獲得基因轉殖植物 並從該者製備食物或飼料來製造。包含本發明之一個或多個核酸序列之商品產物包括，舉例而言但不限於：一植物之膳食、油、粉碎或全穀物或種子，及包含一重組植物或種子的任何膳食、油或粉碎或全穀物的任何食品產物，其中該重組植物或種子含有本發明之一個或多個序列。在一個或多個商品或商品產物中偵測本發明之一個或多個序列係為一事實上的證據，該者表明該商品或商品產物係產自於設計來表現本發明之一個或多個iRNA分子的基因轉殖植物，為了達到控制鞘翅目害蟲的目的。
在一些具體例中，一種包含本發明之一核酸分子的基因轉殖植物或種子亦可能在其基因組中包含至少一種其他的基因轉殖事件，包括但不限於：一基因轉殖事件，該者轉錄一種iRNA分子，該iRNA分子在鞘翅目害蟲中靶定非由序列辨識編號：1所界定的基因座，例如舉例而言，選自於下列所組成的群組之一個或多個基因座：Caf1-180(美國專利公開案第2012/0174258號)、VatpaseC(美國專利公開案第2012/0174259號)、Rho1(美國專利公開案第2012/0174260號)、VatpaseH(美國專利公開案第2012/0198586號)、PPI-87B(美國專利公開案第2013/0091600號)、RPA70(美國專利公開案第2013/0091601號)，及RPS6(美國專利公開案第2013/0097730號)；一基因轉殖事件，該者轉錄一種iRNA分子，該iRNA分子在非鞘翅目害蟲之生物體內靶定一基因(例如一植物寄生線蟲)；一種編碼殺蟲蛋白質之基因(例如蘇力菌(Bacillus thuringiensis)的殺蟲蛋白 質，諸如舉例而言，Cry34Ab1(美國專利第6,127,180號、第6,340,593號，及第6,624,145號)，Cry35Ab1(美國專利第6,083,499號、第6,340,593號，及第6,548,291號)，“Cry34/35Ab1”組合以單一事件(例如玉蜀黍(maize)事件DAS-59122-7；美國專利第7,323,556號)，Cry3A(例如美國專利第7,230,167號)，Cry3B(例如美國專利第8,101,826號)，Cry6A(例如美國專利第6,831,062號)，及其等之組合(例如美國專利申請案第2013/0167268號、第2013/0167269號，及第2013/0180016號)；除草劑耐受性基因(例如一基因，其提供對嘉磷塞(glyphosate)、草銨膦(glufosinate)、汰克草(dicamba)、或2,4-D之耐受性(例如美國專利第7,838,733號))；及一基因，其促成該基因轉殖植物一所欲的表型，諸如提高的產量、改變的脂肪酸代謝、或細胞質雄性不育的修復)。在特定具體例中，本發明編碼iRNA分子的序列可能與在一植物中的其他昆蟲控制及疾病性狀組合，以實現所欲的性狀，用於增強昆蟲損害的控制及植物疾病。組合的昆蟲控制性狀其採用區別的作用模式者可能提供受保護的基因轉殖植物優越的耐久力，超越懷有一單一的控制性狀的植物，舉例而言，因為在田間對該(等)性狀抗性之發展的機率將會降低。
V. 鞘翅目害蟲中靶定基因的箝制 A.概述
在本發明之一些具體例中，可以提供至少一個對鞘翅目害蟲控制有用的核酸分子給一種鞘翅目害蟲，其中 該核酸分子在鞘翅目害蟲中導致RNAi媒介的基因靜默。在特定實施例中，可能提供一種iRNA分子(例如dsRNA、siRNA、miRNA及hpRNA)給該鞘翅目宿主。在一些具體例中，對鞘翅目害蟲控制有用之一核酸分子可能藉由使該核酸分子與該鞘翅目害蟲接觸而提供至一鞘翅目害蟲。在這些及進一步具體例中，對鞘翅目害蟲控制有用之核酸分子可以提供在該鞘翅目害蟲的飼料基質中，舉例而言，一營養組成物。在這些及進一步具體例中，對鞘翅目害蟲控制有用之核酸分子可能透過攝入包含該核酸分子的植物材料而提供，其中該核酸分子係由該鞘翅目害蟲攝入。在某些具體例中，該核酸分子係透過表現引入到該植物材料內之重組核酸序列而存在於該植物材料中，舉例而言，藉由以包含該重組核酸序列之載體轉形一植物細胞，並從該轉形植物細胞再生一植物材料或是整個植物。
B. RNAi-媒介之靶定基因箝制
在具體例中，本發明提供iRNA分子(例如dsRNA、siRNA、miRNA及hpRNA)，其可能設計以靶定在一鞘翅目害蟲(例如WCR、SCR或NCR)轉錄體學(transcriptome)中必要的天然核苷酸序列(例如必要基因)，舉例而言，其係藉由設計一種iRNA分子，該iRNA分子包含至少一股，該股包含特異性地互補於該靶定序列的核苷酸序列。如此設計的iRNA分子序列與該靶定序列可能是同一，或者可能併入不會防止該iRNA分子與其靶定序列之間特異性雜交的失配。
本發明之iRNA分子可能在一鞘翅目害蟲之基因箝制之方法中使用，由此降低由該害蟲在一植物(舉例而言，包含一種iRNA分子之受保護轉形植物)上所造成之損害的位準或發病率。如於此所使用，術語"基因箝制"意指用於降低基因轉錄為mRNA及隨後該mRNA轉譯之結果所製造的蛋白質位準之任何眾所周知的方法，包括降低蛋白質從一基因或一種編碼序列的表現，包括表現之轉錄後抑制及轉錄箝制。轉錄後抑制係藉由從用於箝制之靶定基因轉錄之mRNA的全部或是部分，與使用於箝制的相應iRNA分子之間特異性同源而媒介。此外，轉錄後抑制係意指在該細胞中可用於核糖體結合的mRNA數量之大量與可測量的降低。
在iRNA分子為一種dsRNA分子的具體例中，該dsRNA分子可能由該酶，DICER，予以切割成短的siRNA分子(長度大約20個核苷酸)。藉由DICER活性在該dsRNA分子上生成之雙股siRNA分子可能分開成兩個單股的siRNA；"過客股"與"引導股"。過客股可能被降解，而引導股可能併入到RISC中。轉錄後抑制發生係藉由該引導股與一種mRNA分子之特異性互補序列的特異性雜交，且隨後由酶，阿革蛋白家族(Argonaute)(RISC複合體之催化劑組份)予以切割。
在本發明之具體例中，可以使用任何形式的iRNA分子。熟習本技藝者將理解的是，較諸單股RNA分子，dsRNA分子在製備期間及在提供該iRNA分子至一細胞 之步驟期間典型係更穩定的。因此，雖然siRNA及miRNA分子，舉例而言，在一些具體例中可能同樣有效的，但是因dsRNA分子之穩定性可能擇取dsRNA分子。
在特定具體例中，提供一種包含一核苷酸序列之核酸分子，該核苷酸序列可能在活體外表現以產生一種iRNA分子，該iRNA分子係實質上同源於一鞘翅目害蟲之基因組內的一核苷酸序列所編碼的核酸分子。在某些具體例中，活體外轉錄的iRNA分子可能為包含一種莖環結構的穩定dsRNA分子。在一鞘翅目害蟲接觸活體外轉錄之iRNA分子之後，靶定基因(舉例而言，一必要基因)在該鞘翅目害蟲中的轉錄後抑制可能發生。
在本發明之一些具體例中，一核酸分子的表現係在使用於轉錄後抑制鞘翅目害蟲之一靶定基因的方法中，該核酸分子包含一核苷酸序列之至少19個連續核苷酸，其中該核苷酸序列係選自於以下所組成的群組：序列辨識編號：1；序列辨識編號：1之互補物；序列辨識編號：1之至少19個連續核苷酸的片段(例如序列辨識編號：2-4中任一者)；序列辨識編號：1之至少19個連續核苷酸的片段之互補物；一種葉甲(Diabrotica)生物體(例如WCR)之天然編碼序列，其包含序列辨識編號：1；一種葉甲生物體之天然編碼序列之互補物，該天然編碼序列包含序列辨識編號：1；一種葉甲生物體之天然非編碼序列，其轉錄成包含序列辨識編號：1之天然RNA分子；一種葉甲生物體之天然非編碼序列之互補物，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編 號：1之天然RNA分子；一種葉甲生物體之天然非編碼序列之互補物，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：1之天然的RNA分子；一種葉甲生物體(例如WCR)之天然編碼序列之至少19個連續核苷酸的片段，該天然編碼序列包含序列辨識編號：1；一種葉甲生物體之天然編碼序列之至少19個連續核苷酸的片段之互補物，該天然編碼序列包含序列辨識編號：1；一種葉甲生物體之天然非編碼序列之至少19個連續核苷酸的片段，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：1之天然的RNA分子；以及一種葉甲生物體之天然非編碼序列之至少19個連續核苷酸的片段之互補物，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：1之天然的RNA分子。在某些具體例中，一核酸分子之表現與前述任一者有至少80%同一性(例如80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約100%及100%)者可以使用。在這些及進一步具體例中，可以表現一種核酸分子，其特異性地雜交到存在於鞘翅目害蟲至少一細胞中之RNA分子。
在一些具體例中，至少一核酸分子的表現可以使用於轉錄後抑制鞘翅目害蟲之一靶定基因的方法中，該至少一核酸分子包含一核苷酸序列之至少19個連續核苷酸，其中該核苷酸序列係選自於以下所組成的群組：序列辨識編號：1；序列辨識編號：1之互補物；序列辨識編號：1之至少19個連續核苷酸的片段；序列辨識編號：1之至少19個 連續核苷酸的片段之互補物；一種葉甲(Diabrotica)生物體(例如WCR)之天然編碼序列，其包含序列辨識編號：1；一種葉甲生物體(例如WCR)之天然編碼序列之互補物，該天然編碼序列包含序列辨識編號：1；一種葉甲生物體之天然非編碼序列，其轉錄成包含序列辨識編號：1之天的RNA分子；一種葉甲生物體之天然非編碼序列之互補物，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：1之天然RNA分子；一種葉甲生物體(例如WCR)之天然編碼序列之至少19個連續核苷酸的片段，該天然編碼序列包含序列辨識編號：1；一種葉甲生物體之天然編碼序列之至少19個連續核苷酸的片段之互補物，該天然編碼序列包含序列辨識編號：1；一種葉甲生物體之天然非編碼序列之至少19個連續核苷酸的片段，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：1之天然的RNA分子；以及一種葉甲生物體之天然非編碼序列之至少19個連續核苷酸的片段之互補物，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：1之天然的RNA分子。在某些具體例中，一核酸分子之表現與前述任一者有至少80%同一性(例如80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約100%及100%)者可以使用。在這些及進一步具體例中，一核酸分子可以被表現，其特異性雜交至存在於一鞘翅目害蟲之至少一細胞中的一RNA分子。在特定具體例中，此一核酸分子可能包含一核苷酸序列，其包含序列辨識編 號：1-4之任一者，及其等之互補物。
於具體例中，該RNAi轉錄後抑制系統能夠容忍靶定基因中的序列變化，該者歸因於基因突變、品種多型性(strain polymorphism)或演化分歧係為可預期的。於是，所引入的核酸分子對於一靶定基因之初級轉錄產物或完全加工的mRNA任一者可以為小於絕對同源的，只要該引入的核酸分子係特異性地雜交至該靶定基因之初級轉錄產物或完全加工的mRNA任一者。再者，可能不需要為，相對於該靶定基因之初級轉錄產物或完全加工的mRNA任一者而言，該引入的核酸分子可以為比全長小的。
使用本發明之iRNA技術抑制一靶定基因係序列特異性的；亦即實質上同源於該(等)iRNA分子之者核苷酸序列係被靶定用於基因抑制。在一些具體例中，一種包含與部分的靶定基因序列有同一性之核苷酸序列的RNA分子，可以使用於抑制。在這些及進一步具體例中，可以使用一種包含一核苷酸序列之RNA分子，其相對於一靶定基因序列，該核苷酸序列具一個或多個插入、缺失及/或點突變。在特定具體例中，一種iRNA分子與一靶定基因之一部分可能共享，舉例而言，至少從約80%、至少從約81%、至少從約82%、至少從約83%、至少從約84%、至少從約85%、至少從約86%、至少從約87%、至少從約88%、至少從約89%、至少從約90%、至少從約91%、至少從約92%、至少從約93%、至少從約94%、至少從約95%、至少從約96%、至少從約97%、至少從約98%、至少從約99%、至少從約 100%、及100%的序列同一性。或者，一種dsRNA分子之雙聯體區域可能與一靶定基因轉錄本的一部分特異性地雜交。在特異性雜交的分子中，展示出較大同源性之小於全長的序列會補償一較長、較不同源的序列。與一靶定基因轉錄本的一部分有同一性之dsRNA分子雙聯體區域的核苷酸序列長度，可能為至少大約20(例如，19)、至少大約25、至少大約50、至少大約100、至少大約200、至少大約300、至少大約400、至少大約500，及/或至少大約1000個鹼基。在一些具體例中，可以使用大於約20至約100個核苷酸之序列。在特定具體例中，可以使用大於約200-300個核苷酸之序列。在特定具體例中，可以使用大於約500-1000個核苷酸之序列，取決於該靶定基因的大小。
在某些具體例中，靶定基因在鞘翅目害蟲中的表現可能在該鞘翅目害蟲之細胞內抑制至少10%；至少33%；至少50%；或至少80%，藉由此，一顯著的抑制發生。顯著的抑制意指抑制超過一閾值，該閾值引致一可偵測的表型(例如停止生長、停止取食、停止發育、引發死亡等等)，或是相應於該被抑制的靶定基因，在RNA及/或基因產物方面有可偵測的下降。雖然在本發明之某些具體例中，抑制發生在鞘翅目害蟲實質所有細胞中，但是在其他具體例中，抑制只發生在表現該靶定基因之子集細胞中。
在一些具體例中，細胞中的轉錄箝制係藉由出現一種dsRNA分子而媒介，該dsRNA分子對一啟動子DNA序列或其等之互補物展示實質的序列同一性，以招致稱為"啟 動子反向箝制(promoter trans suppression)"。基因箝制對可能攝入或接觸此種dsRNA分子之鞘翅目害蟲中的靶定基因可能為有效的，舉例而言，藉由攝入或接觸含有該dsRNA分子的植物材料。在啟動子反向箝制中使用的dsRNA分子可能特異性地設計，以抑制或箝制在該鞘翅目害蟲細胞中一個或多個同源或互補序列的表現。藉由反義或意義定向之RNA的轉錄後基因箝制以調控植物細胞中的基因表現，係揭露於美國專利第5,107,065號；第5,231,020號；第5,283,184號；及第5,759,829號。
C.表現提供至鞘翅目害蟲的iRNA分子
表現iRNA分子用於在一鞘翅目害蟲中RNAi媒介基因抑制，可能在許多活體外或活體內形式之任一者中實行。該iRNA分子繼而可以提供至一鞘翅目害蟲，舉例而言，藉由使該iRNA分子與該害蟲接觸，或是藉由使該害蟲攝入或其他方式內化該iRNA分子。本發明之一些具體例包括鞘翅目害蟲轉形之宿主植物、經轉形植物細胞、及轉形植物的後代。轉形植物細胞及轉形植物可以遺傳工程以舉例而言，在一異源性啟動子控制下表現一個或多個iRNA分子，以提供害蟲保護效果。因此，當一鞘翅目害蟲在取食期間消耗一基因轉殖植物或植物細胞時，該害蟲可能攝入該基因轉殖植物或細胞中表現的iRNA分子。本發明之核苷酸序列亦可能引入至廣泛種類的原核及真核微生物宿主，以生產iRNA分子。術語"微生物"包括原核及真核物種，諸如細菌及真菌。
基因表現之調變可能包括此種表現的部分或完全箝制。在另一具體例中，一種用於箝制鞘翅目害蟲中基因表現的方法包含：在該害蟲宿主之組織中提供一基因箝制數量的至少一種dsRNA分子，該dsRNA分子係在本文中所描述的核苷酸序列轉錄之後形成，且該核苷酸序列的至少一段係互補於該鞘翅目害蟲細胞內的一種mRNA序列。根據本發明，由鞘翅目害蟲攝入的一種dsRNA分子，包括其修飾形式，諸如siRNA、miRNA、或hpRNA分子，與從一核酸分子轉錄的一種RNA分子，其中該核酸分子包含序列辨識編號：1核苷酸序列，可以有至少約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約100%及100%的同一性。因而提供經單離且實質上純化的核酸分子，包括但不限於，非天然存在的核苷酸序列及提供本發明dsRNA分子之重組DNA建構物，該者當引入其中時，會箝制或抑制鞘翅目害蟲中內源性編碼序列或靶定編碼序列的表現。
特定具體例提供一種遞送系統，供遞送iRNA分子用於轉錄後抑制一鞘翅目植物害蟲中之一個或多個靶定基因(等)並控制該鞘翅目植物害蟲的族群。在一些具體例中，該遞送系統包含攝入一宿主基因轉殖植物細胞或攝入該宿主細胞內含物，該內含物含有在該宿主細胞中轉錄之RNA分子。在這些及進一步具體例中，一基因轉殖植物細胞或一基因轉殖植物係被創造，該者含有提供本發明之穩 定dsRNA分子的一重組DNA建構物。包含編碼一特定iRNA分子的核酸序列之基因轉殖植物細胞及基因轉殖植物，可以藉由採用重組DNA技術(該者之基本技術在該技藝中為眾所周知的)來產生，以建構包含一核苷酸序列的植物轉形載體，該核苷酸序列編碼本發明之一種iRNA分子(例如穩定的dsRNA分子)；轉形一植物細胞或植物；以及產生含有該轉錄iRNA分子的基因轉殖植物細胞或是基因轉殖植物。
為了賦予鞘翅目害蟲抵抗力至一種基因轉殖植物，一種重組DNA分子可能，舉例而言，轉錄成iRNA分子，諸如一種dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子或hpRNA分子。在一些具體例中，從一種重組DNA分子轉錄的RNA分子可能在該重組植物之組織或流體內形成dsRNA分子。此一種dsRNA分子可能包含在一核苷酸序列的一部分，該核苷酸序列與一相應的核苷酸序列為同一性的，該相應的核苷酸序列係從可能侵擾該宿主植物之鞘翅目害蟲類型內的DNA序列轉錄的。靶定基因在該鞘翅目害蟲內的表現係由該攝入的dsRNA分子而箝制，且該靶定基因在鞘翅目害蟲中表現之箝制引致了，舉例而言，鞘翅目害蟲停止取食，而最終的結果係為，舉例而言，該基因轉殖植物免受該鞘翅目害蟲的進一步損害。dsRNA分子的調變效果業已顯示為適用於在害蟲中表現的各種基因，包括，舉例而言，負責細胞代謝或細胞轉形之內源性基因，包括管家基因(house-keeping gene)；轉錄因子；蛻皮相關基因；及編碼涉及細胞代謝或正常生長及發育的多肽之其他基因。
為了從轉基因於活體內轉錄或是一表現建構物進行轉錄，在一些具體例中可以使用一調控區域(例如啟動子、增強子、靜默子及多腺苷酸化訊號)以轉錄該RNA股(或股等)。所以，在一些具體例中，如前文所陳述，一種供用於生產iRNA的核苷酸序列可能可操縱地鏈接到一個或多個在植物宿主細胞中作用的啟動子序列。該啟動子可能為一內源性啟動子，通常駐留在宿主基因組中。本發明之核苷酸序列，在可操縱鏈接之啟動子序列的控制下，可能進一步側接額外的序列，其有利地影響其轉錄及/或所得到轉錄本之穩定性。此種序列可能位於該可操縱鏈接啟動子的上游，該表現建構物3'端的下游，且可能發生於該啟動子上游與該表現建構物3'端下游兩者。
一些具體例提供方法，用於降低由取食植物之一鞘翅目害蟲所造成的宿主植物(例如玉米植物)損害，其中該方法包含在該宿主植物中提供一種表現本發明至少一種的核酸分子之轉形植物細胞，其中該(等)核酸分子一但由該鞘翅目害蟲取用，作用以抑制在該鞘翅目害蟲內一靶定序列的表現，該表現抑制引致該鞘翅目害蟲的死亡率、生長下降、及/或生殖下降，從而降低該鞘翅目害蟲對該宿主植物造成的損害。在一些具體例中，該(等)核酸分子包含dsRNA分子。在這些及進一步具體例中，該(等)核酸分子包含dsRNA分子，其中該dsRNA分子每一者包含超過一個特異性地雜交到鞘翅目害蟲細胞中表現之一核酸分子的核苷酸序列。在一些具體例中，該(等)核酸分子係由一核苷酸序列 組成，其中該核苷酸序列係特異性地雜交至在鞘翅目害蟲細胞中表現的一核酸分子。
在一些具體例中，提供一種用於提高玉米作物產量之方法，其中該方法包含引入本發明至少一種的核酸分子到玉米植物；培育該玉米植物以允許一種包含該核酸序列的iRNA分子表現，其中包含該核酸序列的iRNA分子之表現抑制鞘翅目害蟲生長及/或鞘翅目害蟲損害，從而降低或消除歸因於鞘翅目害蟲侵擾的產量損失。在一些具體例中，該iRNA分子為一種dsRNA分子。在這些及進一步具體例中，該(等)核酸分子包含dsRNA分子，其中該dsRNA分子每一者包含超過一個特異性地雜交到在鞘翅目害蟲細胞中表現之核酸分子的核苷酸序列。在一些具體例中，該核酸分子(等)係由一核苷酸序列組成，其中該核苷酸序列係特異性地雜交至在鞘翅目害蟲細胞中表現的一核酸分子。
在一些具體例中，提供一種用於調變一靶定基因在一鞘翅目害蟲中之表現的方法，該方法包含：以包含一核酸序列的一載體來轉形植物細胞，其中該核酸序列編碼本發明至少一核酸分子，其中該核苷酸序列係可操縱地鏈接至一啟動子及一轉錄終止序列；在足以允許包含數個轉形植物細胞之植物細胞培養物發展的條件下培養該轉形的植物細胞；選擇已經將該核酸分子併入其基因組的轉形植物細胞；篩選表現該併入核酸分子所編碼之iRNA分子的該轉形植物細胞；選擇表現該iRNA分子者之基因轉殖植物細胞；及餵食該經選擇的基因轉殖植物細胞至該鞘翅目害 蟲。植物亦可能從表現該併入核酸分子所編碼之iRNA分子的轉形植物細胞予以再生。在一些具體例中，該iRNA分子為一種dsRNA分子。在這些及進一步具體例中，該(等)核酸分子包含dsRNA分子，其中該dsRNA分子每一者包含超過一個特異性地雜交到在鞘翅目害蟲細胞中表現之核酸分子的核苷酸序列。在一些具體例中，該(等)核酸分子係由一核苷酸序列組成，其中該核苷酸序列係特異性地雜交至在鞘翅目害蟲細胞中表現的一核酸分子。
本發明之iRNA分子可以併入於一植物物種(例如玉米)之種子內，無論是做為源自併入植物細胞基因組中之一重組基因的產物表現，或是併入至種植之前施加到種子的塗料或種子處理。包含重組基因之一植物細胞係視為一基因轉殖事件。本發明具體例中亦包括用於遞送iRNA分子到鞘翅目害蟲的遞送系統。舉例而言，本發明之iRNA分子可能直接引入鞘翅目害蟲的細胞內。引入的方法可以包括將iRNA與源自一鞘翅目害蟲宿主的植物組織直接混合，以及施用包含本發明iRNA分子的組成物至宿主植物組織。舉例而言，iRNA分子可以噴灑到植物表面。或者，iRNA分子可能由微生物表現，且該微生物可以施用到該植物表面，或藉由諸如注射之物理手段，引入到根或莖中。如前文所討論，一基因轉殖植物亦可以遺傳工程處理，以表現足以殺死已知侵擾該植物的鞘翅目害蟲的數量之至少一種iRNA分子。藉由化學或酶促合成所製造的iRNA分子亦可能以一致於普遍農業做法的方式予以調配，並使用做為用於 控制鞘翅目害蟲植物損害的噴霧產品。該調配物可能包括針對有效葉面覆蓋(foliar coverage)所需的適當展著劑(stickers)及增濕劑，以及UV防護劑以保護iRNA分子(例如dsRNA分子)免受紫外線損害。此種添加劑在生物殺蟲劑工業係普遍的，且對熟習該項技藝者為眾所周知的。此種應用可以與其他噴霧殺蟲劑應用(基於生物學或其他方式)組合，以增強對鞘翅目害蟲的植物保護。
所有於此引用之參考文獻，包括公開案、專利與專利申請案，皆在此併入本案以作為參考資料，其內容與本揭示之明確細節並無不一致之處，因此每一單獨與特定指出之文獻皆完整併入本案以作為參考資料。於此所討論之參考文獻僅提供本發明申請日之前之揭示。於此揭示之內容不應被解釋為本發明人無權憑藉先前之發明來揭示本發明。
下列實施例提供某些特定特徵及/或態樣之說明。這些實施例不應解釋為將本揭示限制於所描述之特定特徵或態樣中。
實施例 實施例1：樣品製備及昆蟲飲食生物分析
許多dsRNA分子(包括那些相應於dre4 reg1(序列辨識編號：2)、dre4 reg2(序列辨識編號：3)，及dre4 reg3(序列辨識編號：4))係使用MEGASCRIPT® RNAi套組或是HiScribe® T7活體外轉錄套組(In Vitro Transcription Kit)予以合成及純化。純化的dsRNA分子係於100X稀釋的TE緩衝液pH 7.4中製備，且所有生物分析均含有由此緩衝液組成 之對照處理，該者擔任WCR(玉米根螢葉甲(Diabrotica virgifera virgifera LeConte))死亡率或生長抑制的背景檢查。dsRNA分子在該生物分析緩衝液中之濃度係使用NanoDropTM 8000分光光度計(THERMO SCIENTIFIC，Wilmington，DE)予以測量。
在生物分析中測試樣品的昆蟲活性，該生物分析係以新生的昆蟲幼蟲在人工昆蟲飲食上進行。WCR卵係從Crop Characteristics,INC.(Farmington，MN)獲得。
該生物分析係於特別針對昆蟲生物分析設計的128井塑膠盤中進行(C-D INTERNATIONAL，Pitman，NJ)。每井含有針對鞘翅目昆蟲生長設計的人工飲食大約1.0mL。60μL等分試樣的dsRNA樣品係藉由移液管而遞送至每一井的飲食表面上(40μL/cm2)。dsRNA樣品濃度係計算為該井中每平方公分表面積(1.5cm2)dsRNA的數量(ng/cm2)。經處理的井盤係維持在通風櫥中，直到該飲食表面上的液體蒸發或吸收到該飲食內。
在羽化幾個小時之內，個別幼蟲係以沾濕的駝毛刷挑起並放置在經處理的飲食上(每井一隻或二隻幼蟲)。該128井塑膠盤之受侵擾孔繼而以透明塑膠黏接片予以密封，並開孔以讓氣體交換。生物分析盤係維持在受控的環境條件下(28℃，~40%相對濕度，16：8(光：暗))達9天，在那之後，記錄曝露到每個樣品的昆蟲總數、死亡的昆蟲數，以及存活昆蟲的重量。計算對每一處理之死亡率平均百分比及平均生長抑制。生長抑制(GI)係如以下方式計算： GI=[1-(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]，其中TWIT為該處理中活蟲的總重量；TNIT為該處理中昆蟲的總數；TWIBC為在背景檢查(緩衝液對照)中活蟲的總重量；及TNIBC為在背景檢查(緩衝液對照)中昆蟲的總數。
統計分析使用JMPTM軟體(SAS，Cary，NC)進行。
LC50(致死濃度)係定義為殺死50%的測試昆蟲的劑量。GI50(生長抑制)係定義為測試昆蟲之平均生長(例如，活著的重量)，是背景檢查樣品所見之平均值的50%的劑量。
重複的生物分析證明，攝入特定樣品引致一令人驚訝且非預期的玉米根蟲幼蟲之死亡率及生長抑制。
實施例2：候選的靶定基因之鑑定
選擇WCR(玉米根螢葉甲(Diabrotica virgifera virgifera LeConte))的多階段發育用於匯集的轉錄體學分析，以提供用於藉由RNAi基因轉殖植物昆蟲抵抗力技術控制之候選的靶定基因序列。
於一範例中，從約0.9gm整隻的一齡WCR幼蟲(孵化後4至5天，維持在16℃)單離總RNA，並使用下列苯酚/TRI REAGENT®為基礎的方法(MOLECULAR RESEARCH CENTER，Cincinnati，OH)予以純化：幼蟲係於室溫下在15mL的均質機中以10mL TRI REAGENT®予以均質化，直至獲得一均勻的懸浮液為止。繼5分鐘室溫中培育之後，均質物係分配至1.5mL微量 離心管中(每管1mL)，加入200μL的氯仿，並將混合物劇烈震盪15秒。在允許萃取物於室溫靜置10分鐘後，該等相係藉由12,000x g於4℃下離心而分開。將上層相(包含約0.6mL)小心地轉移到另一個滅菌的1.5mL管子中，且添加等體積的室溫異丙醇。在室溫中培育5至10分鐘之後，混合物係於12,000x g予以離心8分鐘(4℃或25℃下)。
小心地移除並丟棄上清液，而RNA沈澱物係藉由以75%乙醇予以渦漩洗滌兩次，且在每次洗滌之後藉由7,500 x g離心5分鐘(4℃或25℃)予以回收。小心地移除乙醇，允許沈澱物風乾歷時3至5分鐘，然後溶解於無核酸酶的滅菌水中。RNA濃度係藉由測量260nm及280nm處的吸光度(A)而確定。一典型的萃取係從大約0.9gm的幼蟲產出超過1mg的總RNA，且A260/A280比值為1.9。由此萃取的RNA係儲存於-80℃，直到進一步加工。
RNA品質係藉由將等分試樣通過1%瓊脂糖凝膠展開而確定。瓊脂糖凝膠溶液係使用無菌的10x TAE緩衝液(Tris-乙酸EDTA；1x濃度為0.04M Tris-乙酸、1mM的EDTA(乙二胺四乙酸的鈉鹽)，pH為8.0)、以DEPC(焦碳酸二乙酯)-處理的水予以稀釋製成。使用1x TAE做為展開緩衝液。在使用之前，電泳槽及孔形成梳係以RNAseAwayTM(INVITROGEN INC.，Carlsbad，CA)予以清洗。2μL的RNA樣品係與8μL的TE緩衝液(10mM的Tris HCl，pH為7.0；1mM EDTA)及10μL的RNA樣品緩衝液(Novagen®目錄號70606；EMD4 Bioscience，Gibbstown，NJ)混合。樣品係於 70℃加熱歷時3分鐘，冷卻至室溫，且每孔加載5μL(含1μg至2μg的RNA)。市售的RNA分子量標記同時在分隔的孔中展開，用於分子大小比較。凝膠以60伏特展開歷時2小時。
一種標準化的cDNA庫係由商業服務提供商(EUROFINS MWG Operon，Huntsville，AL)從幼蟲總RNA來製備，使用隨機引動(priming)。標準化幼蟲cDNA庫係於1/2底片尺度(plate scale)，藉由GS FLX 454 TitaniumTM系列化學於EUROFINS MWG Operon予以定序，該者引致超過600,000的讀取伴隨348bp之平均讀取長度。350,000讀取係組裝成高於50,000的片段重疊群。未組裝讀取及片段重疊群兩者皆使用公開可用的程式，FORMATDB(可從NCBI獲得)轉換成BLASTable數據庫。
總RNA及標準化cDNA庫同樣從來自其他WCR發育階段收穫的材料來製備。一種用於靶定基因篩選的匯集轉錄體學庫係藉由組合代表各種發育階段的cDNA庫成員而建構。
使用資訊來選擇RNAi靶定的候選基因，其考慮特定基因在諸如果蠅(Drosophila)及穀蛀蟲(Tribolium)其他昆蟲中的致命RNAi效果。這些基因係假設為對鞘翅目昆蟲之生存與生長為必要的。選定的靶定基因同源物係如下文所描述般在該轉錄體學序列數據庫中予以辨識。該等靶定基因之全長或部分序列係藉由PCR予以擴增，以製備雙股RNA(dsRNA)製造的模板。
使用候選蛋白質編碼序列的TBLASTN搜尋，係 對含有未組裝葉甲(Diabrotica)序列讀取或經組裝重疊群的BLASTable數據庫展開。對葉甲(Diabrotica)序列之顯著命中(對片段重疊群同源物界定為比e-20更好，且對未組裝序列讀取同源物為比e-10更好)係使用BLASTX對NCBI非冗餘數據庫(non-redundant database)來確認。此BLASTX搜尋的結果確認的是，在TBLASTN搜尋中辨識的葉甲(Diabrotica)同源物候選基因序列的確包含葉甲(Diabrotica)基因，或為葉甲(Diabrotica)序列對非葉甲候選基因序列可獲得之最佳命中(best hit)。在大多數情況下，穀蛀蟲(Tribolium)候選基因註解為一種編碼一蛋白質、對葉甲轉錄體學序列中的一序列或序列等給予明白的序列同源性。在少數情況下，明顯的是，一些藉由與一非葉甲候選基因同源而選定的葉甲類片段重疊群或未組裝序列讀取係重疊的，而該片段重疊群之總成在加入這些重疊上已經失敗了。在該等情況下，SequencherTM v4.9(GENE CODES CORPORATION，Ann Arbor，MI)係使用以組裝該等序列成較長的片段重疊群。
一種編碼葉甲(Diabrotica)DRE4之候選靶定基因(dre4；序列辨識編號：1)係辨識為可能導致WCR之鞘翅目害蟲死亡率、抑制生長、抑制發育、或抑制生殖的基因。
於黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)方面，DRE4為一種涉及促進核小體辨識之染色質轉錄(Facilitates Chromatin Transcription)(FACT)複合物的組分。FACT係涉及需要DNA作為模版之多重加工，例如mRNA加長、DNA複製及DNA修復。在轉錄加長期間，FACT複合物作用為組 織蛋白伴護蛋白，其使核小體結構去穩定並恢復，同時促進RNA聚合酶II通過。葉甲(Diabrotica)dre4序列(序列辨識編號：1)與源自蜜蜂(Apis mellifera)(GENBANK登錄號XM_624003.3)之dre4基因片段有些相關。dre4 dsRNA轉基因可以與其他dsRNA分子組合，以提供冗餘的RNAi靶定以及協同RNAi效應。表現靶定dre4的dsRNA之基因轉殖玉米事件對於預防玉米根蟲之根攝食損害是有用的。dre4 dsRNA轉基因代表新的作用模式，其組合蘇力菌(Bacillus thuringiensis)的殺蟲蛋白質技術害蟲抵抗力管治基因錐體(Insect Resistance Management gene pyramids)，以減輕對此等根蟲控制技術有抵抗力之根蟲族群的發育。
全長(序列辨識編號：1)或前述葉甲(Diabrotica)候選基因序列之部分選殖體(序列辨識編號：2-4)，於此稱為dre4，係用來產生PCR擴增物用於dsRNA合成。
實施例3：靶定基因之擴增以生產dsRNA
引子係設計以藉由PCR來擴增每一靶定基因之部分的編碼區域。參閱表1。如果適當的話，將一種T7噬菌體啟動子序列(TTAATACGACTCACTATAGGGAGA；序列辨識編號：5))併入擴增的意義或反義股的5'端。參閱表1。總RNA係從WCR萃取，其係使用TRIzol®(Life Technologies，Grand Island，NY)，其中WCR幼蟲及成蟲係於室溫下、利用Pestle Motor Mixer(Cole-Parmer，Vernon Hills，IL)、以1mL TRIzol®於1.5mL微量離心管中予以均質化，直至獲得均質的懸浮液為止。在室溫中培育5分鐘之 後，將均質物離心以移除細胞碎屑，以及將1mL上清液轉移到一個新的管子中。加入200μL的氯仿，並將混合物劇烈震盪15秒。在允許萃取於室溫靜置2-3分鐘s.之後，該等相係藉由12,000x g於4℃下離心而分開。上層相(包含約0.6mL)係小心地轉移到另一個滅菌的1.5mL管子中，且加入500uL的室溫異丙醇。在室溫中培育10分鐘之後，混合物係於12,000 x g於4℃下離心10分鐘。小心地移除並丟棄上清液，而RNA沈澱物係藉由以75%乙醇渦漩洗滌兩次，且在每次洗滌之後藉由7,500 x g予以離心5分鐘(4℃或25℃)而回收。小心地移除乙醇，允許沈澱物風乾歷時3至5分鐘，然後溶解於無核酸酶的滅菌水中。
繼而使用總RNA、用SuperScriptIII® First-Strand Synthesis System及製造商Oligo dT primed之說明(Life Technologies，Grand Island，NY)來製造第一股cDNA。此第一股cDNA係使用作為PCR反應的模板，該者使用相反定位引子以擴增天然靶定基因序列的全部或部分。dsRNA亦從DNA選殖體予以擴增，該DNA選殖體包含黄色螢光蛋白(YFP)之編碼區域(序列辨識編號：6；Shagin等人之(2004)Mol.Biol.Evol.21(5)：841-50)。
實施例4：RNAi建構物 藉由PCR製備模板及dsRNA合成.
圖1A中顯示使用來提供用於dre4及YFP dsRNA生產之特異性模板的策略。意欲在dre4 dsRNA合成中使用的模板DNA係藉由PCR、使用在表1中的引子對來製備，而(做為PCR模板)第一股cDNA係從WCR第一齡幼蟲或成蟲單離之總RNA予以製備。對於每一選定的dre4及YFP靶定基因區域，PCR擴增在擴增的意義股及反義股的5'端引入一個 T7啟動子序列(YFP區段係從YFP編碼區域之DNA選殖體予以擴增)。靶定基因的各個區域之兩個PCR擴增的片段繼而以大約相等的數量混合，且混合物係使用作為dsRNA生產的轉錄模板。見圖1A。以該特定引子對擴增的dsRNA模板之序列為：序列辨識編號：2(dre4 reg1)、序列辨識編號：3(dre4 reg2)、序列辨識編號：4(dre4 reg3)，及YFP(序列辨識編號：6)。雙股RNA之合成及純化係使用AMBION® MEGASCRIPT® RNAi套組、遵照製造商(INVITROGEN)的說明，或是HiScribe® T7活體外轉錄套組、遵照製造商的說明(New England Biolabs，Ipswich，MA)。dsRNA濃度係使用NANODROPTM 8000分光光度計(THERMO SCIENTIFIC，Wilmington；DE)來測量。
植物轉形載體之建構
含有包含dre4(序列辨識編號：1)區段之髮夾形成的靶定基因建構物之輸入載體(entry vector)(pDAB114540及pDAB114541)，係使用化學合成片段(DNA2.0，Menlo Park，CA)及標準分子選殖方法之組合予以組裝。藉由(在一單一轉錄單元內)將靶定基因區段之兩個複本配置成彼此相反之定向而促進RNA初級轉錄本之分子內髮夾形成，該兩個區段係由ST-LS1內含子序列予以分隔開(序列辨識編號：16；Vancanneyt等人之(1990)Mol.Gen.Genet.220(2)：245-50)。因此，該初級mRNA轉錄本含有由內含子序列分隔開的兩個dre4基因區段序列，做為彼此大的反向重複。初級mRNA髮夾轉錄本之生產係藉由玉蜀黍(maize) 泛素1啟動子(美國專利第5,510,474號)之複本所驅動，以及包含源自玉蜀黍(maize)過氧化酶5基因的3'非轉譯區域(ZmPer5 3'UTR v2；美國專利第6,699,984號)之片段，係使用來終止髮夾-RNA-表現基因的轉錄。
輸入載體pDAB114540包含dre4髮夾v1-RNA建構物(序列辨識編號：13)，其包含dre4(序列辨識編號：1)區段
輸入載體pDAB114541包含dre4髮夾v2-RNA建構物(序列辨識編號：14)，其包含與pDAB114540中存在者不同的dre4(序列辨識編號：1)區段。
如上所述之輸入載體pDAB114540及pDAB114541係用一典型的雙元目標載體(pDAB115765)，使用標準GATEWAY®重組反應，來生產dre4髮夾RNA表現轉形載體供用於農桿菌媒介的玉蜀黍胚胎轉形(分別為pDAB114546及pDAB114547)。序列辨識編號：13顯示於pDAB114546中存在之dre4髮夾v1-RNA-形成序列，以及序列辨識編號：14顯示於pDAB114547中存在之dre4髮夾v2-RNA-形成序列。
一種陰性對照雙元載體，pDAB110853，其包含表現YFP髮夾dsRNA的基因，係用一典型的雙元目標載體(pDAB109805)及輸入載體pDAB101670，藉由標準GATEWAY®重組反應來建構。輸入載體pDAB101670包含YFP髮夾序列(序列辨識編號：15)，該YFP髮夾序列係在玉蜀黍(maize)泛素1啟動子(如上所述)及源自玉蜀黍(maize) 過氧化酶5基因的3'非轉譯區域之一片段(如上所述)的表現控制下。
雙元目標載體pDAB115765包含一種除草劑抗性基因(芳亞基鏈烷酸酯雙加氧酶(aryloxyalknoate dioxygenase)；AAD-1 v3)(美國專利第7838733(B2)號，及Wright等人之(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107：20240-5)，在甘蔗桿狀病毒(sugarcane bacilliform badnavirus)(ScBV)啟動子(Schenk等人之(1999)Plant Molec.Biol.39：1221-30)的調控下。一種合成的5'UTR序列，其包含玉蜀黍條斑病毒(Maize Streak Virus)(MSV)外套蛋白質基因5'UTR及源自乙醇脫氫酶1(ADH1)基因之內含子6，係放置於SCBV啟動子區段的3'端和AAD-1編碼區域的起始密碼子之間。一種包含源自玉蜀黍(maize)脂酶基因的3'非轉譯區域之一片段(ZmLip 3'UTR；美國專利第7,179,902號)，係使用來終止AAD-1 mRNA的轉錄。
一種另外的陰性對照雙元載體，pDAB101556，其包含表現YFP蛋白質的基因，係用一典型的雙元目標載體(pDAB9989)及輸入載體pDAB100287，藉由標準GATEWAY®重組反應來建構。雙元目標載體pDAB9989包含一種除草劑抗性基因(芳亞基鏈烷酸酯雙加氧酶(aryloxyalknoate dioxygenase)；AAD-1 v3)(如上所述)，其係在玉蜀黍(maize)泛素1啟動子(如上所述)及源自玉蜀黍(maize)脂酶基因的3'非轉譯區域之一片段(ZmLip 3'UTR；如上所述)的表現控制下。輸入載體pDAB100287包含YFP 編碼區域(序列辨識編號：17)，該YFP編碼區域係在玉蜀黍(maize)泛素1啟動子(如上所述)及源自玉蜀黍(maize)過氧化酶5基因的3'非轉譯區域之一片段(如上所述)的表現控制下。
實施例5：候選靶定基因之篩選
設計成抑制在實施例2中辨識的靶定基因序列之合成dsRNA，當在以飲食為基礎的分析中投藥至WCR時，造成死亡率及生長抑制。觀察到dre4 reg1、dre4 reg2，及dre4 reg3在此分析中超越其他篩選的dsRNAs，展現出大大提高的有效性。
重複的生物分析證明，攝入衍生自dre4 reg1、dre4 reg2，及dre4 reg3的dsRNA製備物，各者引致西方玉米根蟲幼蟲的死亡率及生長抑制。表2及表3顯示WCR幼蟲繼之9天曝露至這些dsRNA之後，飲食為基礎的餵食生物分析的結果，以及從黄色螢光蛋白(YFP)編碼區域(序列辨識編號：6)製備的陰性對照dsRNA樣品，所得到的結果。
*SEM=平均值標準誤差。圓括號中的字母表明統計位準。非由相同字母連接的位準為有顯著差異的(P<0.05)。
**TE=Tris HCl(1mM)加上EDTA(1mM)緩衝液，pH 7.2。
***YFP=黄色螢光蛋白
先前已有人建議，葉甲物種(Diabrotica spp.)的某些基因可以利用於RNAi媒介的昆蟲控制。參閱美國專利公開案第2007/0124836號，該者揭露了906序列，及美國專利第7,612,194號，該者揭露了9112序列。然而，確定的是，建議對RNAi-媒介的昆蟲控制具有用途的許多基因在控制葉甲(Diabrotica)不是有效的。亦確定的是，序列dre4 reg1、dre4 reg2，及dre4 reg3每一者提供了令人驚訝且非預期的葉甲優越控制，相較於其他的建議對RNAi-媒介的昆蟲控制具有用途的基因而言。
舉例而言，膜聯蛋白(Annexin)、β-紅血球膜骨架蛋白質(spectrin)2，及mtRP-L4每一者於美國專利第7,612,194號中係建議為，在RNAi媒介的昆蟲控制中有效的。序列辨識編號：18為膜聯蛋白區域1(Reg 1)的DNA序列，而序列辨識編號：19為膜聯蛋白區域2(Reg 2)的DNA序列。序列辨識編號：20為β-紅血球膜骨架蛋白質2區域1(Reg 1)的DNA序列，而序列辨識編號：21為β-紅血球膜骨架蛋白質2區域2(Reg 2)的DNA序列。序列辨識編號：22為mtRP-L4區域1(Reg 1)的DNA序列，而序列辨識編號：23為mtRP-L4區域2(Reg 2)的DNA序列。一種YFP序列(序列辨識編號：6)亦用來生產dsRNA作為陰性對照組。
前述提及的各個序列係經由實施例3之方法、使用來生產dsRNA。圖1B中顯示使用以提供用於dsRNA製造之特異性模板的策略。意欲在dsRNA合成中使用的模板DNA係藉由PCR、使用在表4中的引子對來製備，而(做為 PCR模板)第一股cDNA係從WCR第一齡幼蟲單離之總RNA予以製備。(YFP係從DNA選殖體予以擴增)。對於每一選定的靶定基因區域，執行兩個獨立的PCR擴增。第一個PCR擴增在擴增的意義股的5'端引入了一個T7啟動子序列。第二個反應在反義股的5'端併入該T7啟動子序列。靶定基因的各個區域之兩個PCR擴增的片段繼而以大約相等的數量混合，且混合物係使用作為dsRNA生產的轉錄模板。見圖1B。雙股RNA係使用AMBION® MEGAscript® RNAi套組、遵照製造商的說明(INVITROGEN)予以合成及純化。dsRNA濃度係使用NANODROPTM 8000分光光度計(THERMO SCIENTIFIC，Wilmington；DE)來測量。以及dsRNAs各自用上所述同樣的飲食為基礎的生物分析方法予以測試。表4列出使用以製造膜聯蛋白Reg 1、膜聯蛋白Reg 2、β-紅血球膜骨架蛋白質2 Reg 1、β-紅血球膜骨架蛋白質2 Reg 2、mtRP-L4 Reg 1，及mtRP-L4 Reg 2 dsRNA分子的引子序列。表4亦列出圖1B中描繪的方法使用的YFP引子序列。表5呈現WCR幼蟲繼之9天曝露至這些dsRNA之後，飲食為基礎的餵食生物分析的結果。重複的生物分析證明，這些dsRNA之攝入引致的西方玉米根蟲幼蟲死亡率或生長抑制，不超過以TE緩衝液、水或YFP蛋白質之對照樣品上看到的西方玉米根蟲幼蟲死亡率或生長抑制。
*TE=Tris HCl(10mM)加上EDTA(1mM)緩衝液，pH 8。
**YFP=黄色螢光蛋白
實施例6：包含殺蟲性dsRNA之基因轉殖玉蜀黍(maize)組織農桿菌媒介的轉形.
農桿菌媒介轉形之後，透過一種併入至植物基因組的一嵌合基因之表現穩定而產生出基因轉殖玉蜀黍(maize)細胞、組織及植物，該基因轉殖玉米細胞、組織及植物會生產一種或多種殺蟲性dsRNA分子(舉例而言，至少一種dsRNA分子，其包括靶定一基因的dsRNA分子，該基因包含dre4；序列辨識編號：1)。採用超級雙元(superbinary)或雙元轉形載體之玉蜀黍轉形方法為本技藝知悉的，如描述於舉例而言，美國專利第8,304,604號，其全體係在此併入以作為參考資料。轉形組織係藉由其在含合氯氟(Haloxyfop)培養基上生長的能力而選擇，且適當的係針對dsRNA製造而篩選。部分的此種轉形組織培養可能呈現給新生的玉米根蟲幼蟲用於生物分析，本質上如在實施例1中所描述。
農桿菌培養引發.
含有如上所述(實施例4)之雙元轉形載體pDAB114515、pDAB115770、pDAB110853或pDAB110556，之農桿菌菌株DAt13192細胞(WO 2012/016222A2)的甘油保存種(stocks)係劃線於含有適當抗生素的AB基本培養基平盤上(Watson等人之(1975)J.Bacteriol.123：255-64)，並於20℃中生長達3天。繼而將培養物劃線於含相同抗生素的YEP平盤(gm/L：酵母萃取物，10；蛋白腖，10；NaCl 5)，且該平盤係於20℃中培育1天。
農桿菌培養.
在實驗當天，實驗中製備合適建構物數量的體積之接種培養基的儲備溶液及乙醯丁香酮(acetosyringone)，以及移液至無菌、拋棄式250mL燒瓶內。接種培養基(Frame等人之(2011)Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos.IN Plant Embryo Culture Methods and Protocols：Methods in Molecular Biology.T.A.Thorpe and E.C.Yeung,(Eds),Springer Science and Business Media,LLC.pp 327-341)含有：2.2gm/L MS鹽類；1X ISU修飾的MS-維生素(Frame等人，出處同上)68.4gm/L蔗糖；36gm/L葡萄糖；115mg/L L-脯胺酸；以及100mg/L肌肌醇(myo-inositol)；於pH 5.4)。將配於100%二甲亞碸之1M儲備溶液的乙醯丁香酮添加至含有接種培養基的燒瓶內成為最終濃度200μM，以及充分混和溶液。
關於各個建構物方面，將來自YEP平盤之滿滿1或2個接種環的農桿菌懸浮在無菌、拋棄式50mL離心管中的15mL接種培養基/乙醯丁香酮儲備溶液中，且用分光光度計來測量溶液於550nm處的光密度(OD550)。懸浮液繼而使用額外的接種培養基/乙醯丁香酮混合物，而稀釋至0.3至0.4的OD550。繼而將農桿菌懸浮液的管子水平地放置在一平台搖動器上、設定在室溫下大約75rpm，以及搖動歷時1至4小時同時執行胚胎剝離。
穗滅菌及胚胎單離.
玉蜀黍(Maize)未成熟胚胎係從在溫室中生長、 且自花或近緣授粉(sib-pollinated)以產生穗的玉蜀黍(Zea mays)植物自交品系B104(Hallauer等人之(1997)Crop Science 37：1405-6)來獲得。在授粉後大概10至12天收穫穗。於實驗那天，去外皮的穗之表面滅菌係藉由浸漬在20%的商業性的次氯酸鈉溶液(ULTRA CLOROX® Germicidal Bleach，6.15%次氯酸鈉；加上二滴TWEEN 20)，並震盪20至30分鐘，繼之在通風櫥中用無菌去離子水中沖洗三次。未成熟合子胚(1.8至2.2mm長)係從每個穗無菌地剝離，且隨機地分配到微量離心管中，該微量離心管含有配於液體接種培養基及200μM乙醯丁香酮之2.0mL合適的農桿菌細胞懸浮液，其業已添加2μL的10%BREAK-THRU® S233界面活性劑(EVONIK INDUSTRIES；Essen，Germany)。在一套特定之實驗中，將源自匯集的穗之胚使用於每一轉形。
農桿菌共培養.
接種後，將胚胎放置在一盪動平台上歷時5分鐘。接而將管的內含物傾注至共培養培養基上，共培養培養基中含有4.33gm/L之MS鹽類；1X ISU修飾的MS維生素；30gm/L蔗糖；700mg/L之L-脯氨酸；在KOH中之3.3mg/L的汰克草(dicamba)(3,6-二氯-鄰-大茴香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)；100mg/L之肌肌醇；100mg/L之酪蛋白酵素水解產物；15mg/L的AgNO3；在DMSO中之200μM的乙醯丁香酮；及3gm/L之GELZANTM；於pH 5.8。用無菌、拋棄式移液吸管來移動液體農桿菌懸浮液。胚胎繼而使用無菌鑷子及顯微鏡的協助而將子葉盤(scutellum)面向上來 定向。蓋上平盤，用3MTM MICROPORETM醫療膠帶來密封，以及放置於大概60μmol m-2s-1之光合有效輻射(PAR)的持續光、在25℃孵化器內。
基因轉殖事件之癒合組織篩選與再生.
在共培養的期間之後，將胚芽轉移至休眠培養基，其含有4.33gm/L之MS鹽類；1X ISU修飾的MS維生素；30gm/L之蔗糖；700mg/L的L-脯氨酸；在KOH中之3.3mg/L的汰克草(dicamba)；100mg/L之肌肌醇；100mg/L之酪蛋白酵素水解產物；15mg/L的AgNO3；0.5gm/L的MES(2-(N-嗎啉)乙磺酸單水合物；PHYTOTECHNOLOGIES LABR.；Lenexa，KS)；250mg/L之卡本西林(Carbenicillin)；及2.3gm/L之GELZANTM；pH為5.8。將不超過36個胚胎移動到各個平盤。將平盤放置在一透明的塑膠箱子中，且於大概50μmol m-2s-1 PAR的持續光、在27℃下孵育歷時7至10天。癒合的組織胚胎接而轉移至選擇培養基I(<18/平盤)上，選擇培養基I係由休息培養基(上文)與100nM的R-合氯氟酸(0.0362mg/L；用於選擇含AAD-1基因之癒合組織)組成。將平盤放回透明的箱子中，且用大概50μmol m-2s-1 PAR的持續光、在27℃下孵育歷時7天。癒合的組織胚胎接而轉移至選擇培養基II(<12/平盤)上，選擇培養基II係由休息培養基(上文)與500nM的R-合氯氟酸(0.181mg/L)組成。將平盤放回透明的箱子中，且用大概50μmol m-2s-1 PAR的持續光、在27℃下孵育歷時14天。此選擇步驟允許基因轉殖癒合組織進一步增殖及分化。
增殖的胚性癒合組織係轉移至預再生培養基上(<9/平盤)。預再生培養基中含有4.33gm/L之MS鹽類；1X ISU修飾的MS維生素；45gm/L之蔗糖；350mg/L的L-脯氨酸；100mg/L之肌肌醇；50mg/L之酪蛋白酵素水解產物；1.0mg/L的AgNO3；0.25gm/L的MES；在NaOH中0.5mg/L之萘乙酸；在乙醇中2.5mg/L之離層酸(abscisic acid)；1mg/L之6-芐基腺嘌呤(6-benzylaminopurine)；250mg/L之卡本西林(Carbenicillin)；2.5gm/L之GELZANTM；及0.181mg/L的合氯氟酸；pH為5.8。將平盤儲存於透明的塑膠箱子中，且於大概50μmol m-2s-1 PAR的持續光、在27℃下孵育歷時7天。再生的癒合組織繼而轉移(<6/平盤)至PHYTATRAYSTM(SIGMA-ALDRICH)之再生培養基上，並於28℃下、及每日16小時光亮/8小時黑暗(在大概160μmol m-2s-1 PAR下)予以孵育歷時14天，或是直到莖和根發育出。再生培養基含有4.33gm/L之MS鹽類；1X ISU修飾的MS維生素；60gm/L之蔗糖；100mg/L之肌肌醇；125mg/L之卡本西林(Carbenicillin)；3gm/L的GELZANTM膠；以及0.181mg/L的R-合氯氟酸；pH為5.8。具初生根之小芽繼而予以單離並不經選擇而轉移至伸長培養基。伸長培養基含有4.33gm/L之MS鹽類；1X ISU修飾的MS維生素；30gm/L之蔗糖；以及3.5gm/L之GELZANTM；pH為5.8。
藉由其等在含有合氯氟的培養基上生長的能力而選擇的轉形植物芽，係從PHYTATRAYSTM移植至填充生長培養基(PROMIX BX；PREMIER TECH HORTICULTURE) 之小盆，覆蓋杯子或HUMI-DOMES(ARCO PLASTICS)，然後在CONVIRON生長室中使幼苗健化(hardened-off)(白天27℃/夜間24℃/16小時光照期，50-70%RH，200μmol m-2s-1 PAR)。於一些例子中，推定的基因轉殖小苗係藉由即時定量PCR分析、使用設計以偵測併入玉蜀黍基因組之AAD1除草劑耐受性基因的引子，針對轉基因相對複本數分析。再者，使用RNA qPCR分析以偵測推定的轉形體表現的dsRNAs中ST-LS1內含子序列的存在。選出的轉形小苗接而移至溫室內供進一步生長及測試。
在溫室中轉移並建立T0植物，用於生物分析及種子生產.
當植物達到V3-V4階段時，將其等移植至IE CUSTOM BLEND(PROFILE/METRO MIX 160)土壤混合物並在溫室中生長以開花(光暴露類型：光或同化作用(Photo or Assimilation)；強光限制(High Light Limit)：1200 PAR；16-小時日長；白天27℃/夜間24℃)。
用於昆蟲生物分析的植物係從小花盆移植到TINUSTM 350-4 ROOTRAINERS®(PENCER-LEMAIRE INDUSTRIES，Acheson，Alberta，Canada；)(每一ROOTRAINERS®一個植物一個事件)。移植到ROOTRAINERS®大約四天後，植物係侵擾用於生物分析。
T1世代的植物係藉由以從非基因轉殖原種(elite)自交品系B104植物或其他適當的花粉供體，所收集的花粉進行授粉T0基因轉殖植物之鬚，並種植所得到的種子而獲得。於可能時可執行回交。
實施例7：基因轉殖玉蜀黍組織之分子分析
玉蜀黍組織之分子分析(例如，RNA qPCR)係於源自葉子和根的樣品上執行，葉子和根樣品係於評估根攝食損害同一天從溫室生長的植物採集。
使用StPIN-II 3'UTR之RNA qPCR分析的結果來確認髮夾轉基因的表現。表現的RNAs中ST-LS1內含子序列(其係形成dsRNA髮夾分子不可缺少的)之RNA qPCR分析的結果係用來確認髮夾轉錄本的存在。測量轉基因RNA的表現位準，相較於一內源性玉蜀黍基因之RNA位準。
偵測基因組DNA中AAD1編碼區域的一部分之DNA qPCR分析，係使用來估計轉基因的插入複本數。此等分析的樣品係從環境室生長的植物採集。結果係與設計用來偵測單一複本天然基因的一部分之DNA qPCR的分析結果比較，以及簡單的事件(有一個或二個複本的轉基因)繼續用於進一步的溫室研究。
此外，設計用來偵測觀黴素(spectinomycin)抗性基因(SpecR；存在於T-DNA外部的雙元載體質體上)的一部分之qPCR的分析，係使用來判定基因轉殖植物是否含有外來併入的質體主幹序列。
髮夾RNA轉錄本表現位準：Per 5 3'UTR qPCR.
癒合細胞事件或基因轉殖植物係藉由該Per 5 3'UTR序列之即時定量PCR(qPCR)來分析，以確定全長髮夾轉錄本的相對表現位準，相較於一種內部玉蜀黍基因(序列辨識編號：52；GENBANK登錄號BT069734)的轉錄位準， 後者編碼一種類TIP41蛋白質(亦即，GENBANK登錄號AT4G34270之玉蜀黍同源物；具有74%同一性之tBLASTX分數)。RNA係使用RNAEASYTM 96套組(QIAGEN，Valencia，CA)予以單離。在沖洗之後，總RNA根據套組建議的協定而經歷DNAse1處理。RNA繼而於NANODROP 8000分光光度計(THERMO SCIENTIFIC)上定量，以及將濃度標準化成25ng/μL。第一股cDNA係使用HIGH CAPACITY cDNA SYNTHESIS KIT(INVITROGEN)、在10μL反應體積中以5μL的變性RNA製備的，實質上根據製造商推薦的實驗協定。該協定係稍微修改，以包括添加10μL的100μM T20VN寡核苷酸(IDT)(序列辨識編號：53；TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN，其中V為A、C或G，以及N為A、C、G或T/U)到隨機引子存料混合物的1mL管子中，俾以製備組合的隨機引子與寡dT之工作存料。
cDNA合成之後，樣品係以無核酸酶的水予以1：3稀釋，並儲存在-20℃，直到分析。
獨立的StPIN-II及類TIP41轉錄本之即時PCR分析係於LIGHTCYCLERTM 480(ROCHE DIAGNOSTICS，Indianapolis，IN)上，在10μL反應體積中執行。在PIN II分析方面，反應係用引子StPinIIF2 TAG(序列辨識編號：54)及StPinIIR2 TAG(序列辨識編號：55)，以及StPinIIFAM2 TAG(序列辨識編號：74)來進行。在類TIP41參考基因分析方面，使用引子TIPmxF(序列辨識編號：56)及TIPmxR(序列辨識編號：57)，以及用HEX(六氯螢光素)標記的探針 HXTIP(序列辨識編號：58)。
所有分析包括無模板(僅混合)的陰性對照組。對於標準曲線，一空白試樣(在源井(source well)中的水)亦包括在源盤上，以檢查樣品交叉污染。表6中列舉引子及探針序列。偵測各種轉錄本的反應組分配方係揭示於表7中，以及PCR反應條件係摘要於表8中。FAM(6-羧基螢光素醯胺(6-Carboxy Fluorescein Amidite))螢光部分係以465nm來激發，以及測量510nm的螢光；HEX(六氯螢光素)螢光部分對應的值為533nm及580nm。
*類TIP41蛋白質.
** NAv序列無法從供應者得到.
數據係使用LIGHTCYCLERTM軟體v1.5、藉由相對定量法，該者係使用一種二階導數的最大演算法用於計算Cq值，根據供應商的建議。對於表現分析，表現值係使用△△Ct方法(亦即，2-(Cq標靶-Cq REF))計算，該者依賴於 兩個標靶Cq值與在對最佳化PCR反應該產物每一週期加倍之假設之下，而選定的基準值2之間差異的比較。
髮夾轉錄本的大小及完整性：北方墨漬法分析.
於一些例子中，該基因轉殖植物之額外的分子表徵係藉由使用北方墨漬法(RNA墨漬法)分析而獲得，以確定在表現dre4髮夾dsRNA的基因轉殖植物中該dre4髮夾RNA的分子大小。
所有的材料及設備在使用之前係以RNAZAPTM(AMBION/INVITROGEN)處理。組織樣品(100mg至500mg)係收集於2ml SAFELOCK EPPENDORF管子中，以KLECKOTM組織粉碎機(GARCIA MANUFACTURING，Visalia，CA)藉由三個鎢珠在1ml TRIZOL(INVITROGEN)中破壞達5分鐘，然後於室溫(RT)培育達10分鐘。選擇性地，該等樣品係於4℃下、以11,000rpm離心10分鐘，且上清液係轉移至新的2ml SAFELOCK EPPENDORF管子中。在添加200μL的氯仿至均質物之後，該管子係藉由反轉達2至5分鐘而混合，於RT培育達10分鐘，並於4℃下以12,000 x g離心達15分鐘。將頂部相係轉移到滅菌的1.5mL EPPENDORF管子中，且添加600μL之100%異丙醇，繼之在RT下培育達10分鐘至2小時，然後在4℃至25℃下、以12,000 x g離心達10分鐘。丟棄上清液且RNA沈澱物係以1ml的70%乙醇洗滌兩次，伴隨洗滌之間於4℃至25℃、以7,500 x g離心達10分鐘。丟棄乙醇，且該沈澱物簡短地風乾3至5分鐘，然後再懸浮於50μL的無核酸酶水中。
總RNA係使用NANODROP® 8000(THERMO-FISHER)定量，且樣品係標準化至5μg/10μL。然後添加10μL的乙二醛(AMBION/INVITROGEN)到每個樣品。分配5-14ng的DIG RNA標準標記混合物(ROCHE APPLIED SCIENCE，Indianapolis，IN)，並加入等體積的乙二醛。樣品及標記RNA係於50℃下變性45分鐘，並儲存在冰上，直至加載在NORTHERNMAX 10X乙二醛展開緩衝液(AMBION/INVITROGEN)中的1.25%SEAKEM GOLD瓊脂糖(LONZA，Allendale，NJ)凝膠中為止。RNAs係藉由於65伏特/30mA電泳達2小時15分鐘而分開的。
電泳之後，凝膠係於2X SSC中沖洗5分鐘並於一GEL DOCTM工作站(BIORAD，Hercules，CA)上成像。然後，RNA係於RT下過夜以被動轉移至一尼龍膜(MILLIPORE)上，使用10X SSC做為轉移緩衝液(20X SSC由3M的氯化鈉及300mM的檸檬酸三鈉組成，pH=7.0)。繼轉移之後，該膜係於2X SSC中沖洗5分鐘，該RNA係UV交聯至該膜(AGILENT/STRATAGENE)，且該膜係允許在RT下乾燥高達2天。
該膜係於ULTRAHYB緩衝液(AMBION/INVITROGEN)中預雜交1至2小時。該探針係由含有感興趣序列的PCR擴增產物組成，(舉例而言，當恰當時為序列辨識編號：13或序列辨識編號：14之反義序列部分)，其係藉助於ROCHE APPLIED SCIENCE DIG程序以地高辛(digoxygenin)予以標示。在推薦的緩衝液中，雜交係於60℃ 的溫度下在一雜交管中執行隔夜。繼雜交之後，該墨漬係經受DIG洗滌、包裹、暴露於軟片達1至30分鐘，然後該軟片係顯影，全部均用DIG套組供應商所推薦的方法。
轉基因複本數判定.
將大約等於2個葉沖孔(leaf punches)的玉蜀黍葉片收集於96井收集平盤(QIAGEN)內。用一種KLECKOTM組織粉碎機(GARCIA MANUFACTURING，Visalia，CA)加上一個不鏽鋼珠、在BIOSPRINT96 AP1溶解緩衝液(提供自BIOSPRINT96 PLANT KIT；QIAGEN)中執行組織瓦解。組織離解之後，基因組DNA(gDNA)係使用一種BIOSPRINTTM 96 PLANT KIT及BIOSPRINT96萃取自動儀、以高輸出量格式予以單離。將基因組DNA稀釋2：3 DNA：水，然後設定qPCR反應。
qPCR分析.
轉基因偵測係使用一種LIGHTCYCLER®480系統、藉由即時PCR、透過水解探針分析來執行。使用LIGHTCYCLER® PROBE DESIGN SOFTWARE 2.0來設計水解探針分析使用的寡核苷酸，來偵測ST-LS1內含子序列(序列辨識編號：16)，或是來偵測SpecR基因的一部分(亦即，觀黴素(spectinomycin)抗性基因，存在雙元載體質體上；序列辨識編號：70；表9中的SPC1寡核苷酸)。再者，使用PRIMER EXPRESS軟體(APPLIED BIOSYSTEMS)來設計水解探針分析使用的寡核苷酸，來偵測AAD-1除草劑耐受性基因(序列辨識編號：64；表9中的GAAD1寡核苷酸)。 表9顯示引子及探針的序列。用內源性玉蜀黍染色體基因多重進行分析法(轉化酶(序列辨識編號：61；GENBANK登錄號U16123，於此稱為IVR1)，其擔任內部參考基因序列以確保各分析法中gDNA的存在。在擴增方面，LIGHTCYCLER®480 PROBES MASTER混合物(ROCHE APPLIED SCIENCE)係製備為1X最終濃度在10μL體積多重反應中，該者含有0.4μM的每個引子及0.2μM的每個探針(表10)。如同表11中概述者來執行兩步驟的擴增反應。FAM-及HEX標示的探針之螢光活化及放射係如上所述；CY5綴合物最大以650nm來激發，以及螢光最大於670nm。
Cq分數(螢光訊號與背景閾值交叉之處)係從即時PCR資料、使用配適點演算法(fit points algorithm)(LIGHTCYCLER® SOFTWARE釋放1.5)及相對定量模組(根據△△Ct方法)來判定。數據係如前所述予以處理(如上；RNA qPCR)。
CY5=花青(Cyanine)-5
*NA=不適用
**ND=未確定
實施例8：基因轉殖玉蜀黍的生物分析 活體外昆蟲生物分析.
本主體發明在植物細胞中產生的dsRNA之生物活性係藉由生物分析方法證明。參閱，例如Baum等人之(2007)Nat.Biotechnol.25(11)：1322-6。舉例而言，一者能夠藉由在受控制的餵食環境中，餵食各種植物組織或組織 塊至靶定昆蟲來證明有效性，該植物組織或組織塊係衍生自一種生產殺蟲性dsRNA的植物。或者，萃取物係從一種生產殺蟲性dsRNA的植物所衍生的各種植物組織來製備，以及經萃取的核酸係如於此先前所描述般分配到用於生物分析的人工飲食的頂部。此種餵食分析的結果係與採用源自不生產殺蟲性dsRNA的宿主植物的適當對照組織，或其他對照樣品以類似方式進行的生物分析的結果，作比較。
基因轉殖玉蜀黍事件之昆蟲生物分析.
選擇從清洗過的卵孵出的二隻西方玉米根蟲幼蟲(1至3天大)，以及放置於生物分析盤的各個井中。將而用"PULL N’PEEL"標籤蓋(BIO-CV-16，BIO-SERV)來覆蓋且放置於28℃及18hr/6hr光/暗週期之孵化器內。初始侵擾九天之後，評估幼蟲的死亡率，死亡率係計算為從各個處理的昆蟲總數裡死亡的昆蟲百分比。昆蟲樣品冷凍於-20℃歷時二天，然後匯集各個處理的昆蟲幼蟲並稱重。生長抑制百分比係計算為實驗處理的平均重量除以二個對照井處理的平均重量。數據表達為(陰性對照的)生長抑制百分比。超過對照平均重量之平均重量係標準化至零。
溫室中的昆蟲生物分析.
從源自CROP CHARACTERISTICS(Farmington，MN)的土壤得到西方玉米根蟲(WCR，玉米根螢葉甲(Diabrotica virgifera virgifera LeConte))的卵。WCR的卵係於28℃培養達10-11天。卵係從土壤洗滌出，放進0.15%之瓊脂溶液，且濃度係調整為每0.25mL等分試樣大 約75至100個卵。一孵化平盤係在具一等分試樣卵懸浮液的培養皿中建立，以監測孵化率。
ROOTRAINERS®中成長的玉蜀黍植物周圍的土壤係以150至200個WCR的卵侵擾。該昆蟲係允許取食達2週，在該時間之後，對每一植物給予"根等級(Root Rating)"。利用節點損害量表來分級，其實質上根據Oleson等人之(2005)J.Econ.Entomol.98：1-8。通過這種生物分析的植物係移植至5加侖花盆用於種子生產。用殺蟲劑來處理移植體以預防進一步的根蟲損傷及昆蟲釋放溫室中。以手工方式授粉植物用於種子生產。由這些植物生產的種子係保存用於T1及後續植物世代的評估。
溫室生物分析包括二種陰性對照植物。基因轉殖陰性對照植物係藉由懷有設計用來生產黄色螢光蛋白(YFP)或YFP髮夾dsRNA(見實施例4)之載體轉形來產生。非轉形陰性對照植物係產自於種子品系7sh382或B104。生物分析係於二個不同的日期進行，且各組植物材料含括陰性對照。
表12顯示髮夾dre4-髮夾植物的分子分析及生物分析的結果。於表12中摘要的生物分析檢查的結果顯示令人驚訝且意料之外的觀察結果，懷有表現dre4-髮夾dsRNA的建構物之大多數基因轉殖玉蜀黍植物被保護免受西方玉米根蟲幼蟲取食所發生的根部損害，其中該dre4-髮夾dsRNA包含序列辨識編號：1的區段，如同序列辨識編號：13及序列辨識編號：14中舉例說明的。37個分級的事件中二十二個事件之根等級為0.5或更小。表13顯示陰性對照植 物之分子分析及生物分析的結果。多數的植物沒有對抗WCR幼蟲取食的保護作用，雖然34株分級的植物中五株植物之根等級為0.75或更小。有時觀察到陰性對照植物中存在一些有低的根等級分數之植物，以及反映出溫室環境中進行此類生物分析的變異性及困難度。
*RTL=當對比類TIP4基因轉錄本位準所測量的相對基因轉錄本位準。
**NG=因植物尺寸小而未分級。
***ND=未做。
*RTL=當對比類TIP4基因轉錄本位準所測量的相對基因轉錄本位準。
**NG=因植物尺寸小而未分級。
***ND=未做。
實施例9：包含鞘翅目害蟲序列的基因轉殖玉蜀黍(Zea mays)
10至20株基因轉殖T0玉蜀黍植物係如實施例6中所描述般生成的。獲得另外的10-20株表現RNAi建構物的髮夾dsRNA之T1玉蜀黍獨立品系，用於玉米根蟲的考驗。髮夾dsRNA可以衍生如序列辨識編號：13、序列辨識編號：14中列舉者，否則進一步包含序列辨識編號：1。額外的髮夾dsRNA可以衍生自，舉例來說鞘翅目害蟲序列，諸如舉例而言，Caf1-180(美國專利公開案第2012/0174258號)、VatpaseC(美國專利公開案第2012/0174259號)、Rho1(美國專利公開案第2012/0174260號)、VatpaseH(美國專利公開案 第2012/0198586號)、PPI-87B(美國專利公開案第2013/0091600號)、RPA70(美國專利公開案第2013/0091601號)，或是RPS6(美國專利公開案第2013/0097730號)。這些係透過RT-PCR或是其他分子分析方法予以證實。源自選定的獨立T1品系的總RNA係選擇性地使用於RT-PCR，加上設計以結合在每一RNAi建構物中之髮夾表現卡匣的ST-LS1內含子的引子。此外，在RNAi建構物中每一靶定基因的特定引子係選擇性地使用來擴增，並確認對於在植物中之siRNA的生產所要求之加工前mRNA之生產。對每一靶定基因，所欲的電泳帶(band)的擴增證實了髮夾RNA在每一基因轉殖玉蜀黍植物中的表現。該等靶定基因之dsRNA髮夾加工成為siRNA係隨後選擇性地於獨立的基因轉殖品系中，使用RNA墨漬法雜交予以證實。
再者，具有對靶定基因失配的序列及超過80%序列同一性之RNAi分子，與具有對靶定基因100%序列同一性之RNAi分子，影響玉米根蟲的方式是相似的。失配的序列與天然序列的配對而於相同的RNAi建構物中形成髮夾dsRNA，遞送了經植物加工的siRNAs，其能夠影響餵食的鞘翅目害蟲之生長、發育及活力。
在植物界遞送相應於靶定基因的dsRNA、siRNA或miRNA，且隨後由鞘翅目害蟲透過取食攝取引致該靶定基因透過RNA媒介基因靜默而的向下調控鞘翅目害蟲的靶定基因。當一靶定基因之功能於一或多個發育階段為重要時，該鞘翅目害蟲的生長、發育及生殖受影響，且在WCR、 NCR、SCR、MCR、巴西玉米根蟲(D.balteata LeConte)；黃瓜十一星葉甲球蟲(D.u.tenella)；及黃瓜十一星葉甲甘薯猿葉甲蟲(D.u.undecimpunctata Mannerheim)中至少一者的情況下，導致無法成功侵擾、取食、發育及/或生殖，或導致該鞘翅目害蟲的死亡。抉擇標靶基因並繼而成功的應用RNAi係使用來控制鞘翅目害蟲。
基因轉殖RNAi品系及未轉形玉蜀黍的表型比較.
選定用於創造髮夾dsRNA的靶定鞘翅目害蟲基因或序列，對任何已知的植物基因序列不具有相似度。因此，因靶定這些鞘翅目害蟲基因或序列的建構物而製造或活化的(系統性)RNAi，對基因轉殖植物預期是不會發生任何不利影響。然而，基因轉殖品系的發育與形態特徵係與未轉形植物進行比較，以及與那些以沒有髮夾表現基因之"空"的載體所轉形的基因轉殖品系進行比較。比較植物的根、芽、葉羣及生殖特徵。在基因轉殖及未轉形植物之根長度與生長模式中，沒有可觀察到的差異。植物的芽特徵，諸如高度、葉片數及大小，開花時間，花的大小及外觀都是類似的。一般而言，當在活體外及在溫室土壤中培養時，在基因轉殖品系及那些沒有表現靶定iRNA分子者之間沒有觀察到形態差異。
實施例10：包含鞘翅目害蟲序列及額外的RNAi建構物之基因轉殖玉蜀黍
一種在其基因組包含一異源性編碼序列之基因轉殖玉蜀黍植物，該異源性編碼序列轉錄成靶定鞘翅目害 蟲以外的生物體的iRNA分子，係經由農桿菌或WHISKERSTM方法學(見Petolino and Arnold(2009)Methods Mol.Biol.526：59-67)予以二次轉形，以產生-種或多種殺蟲的dsRNA分子(舉例而言，至少一種dsRNA分子，其包括靶定包含序列辨識編號：1的基因之dsRNA分子)。實質上如實施例4所描述般製備的植物轉形質體載體，係經由農桿菌或WHISKERSTM-媒介轉形方法遞送至從一基因轉殖Hi II或B104玉蜀黍植物獲得的玉蜀黍懸浮液細胞或是未成熟的玉蜀黍胚胎中，其中該玉蜀黍植物在其基因組包含一異源性編碼序列，該者轉錄成靶定鞘翅目害蟲以外之生物體的一種iRNA分子。
實施例11：包含RNAi建構物及額外的鞘翅目害蟲對照序列之基因轉殖玉蜀黍
一種在其基因組包含一異源性編碼序列之基因轉殖玉蜀黍植物，該異源性編碼序列轉錄成靶定鞘翅目害蟲生物體(舉例而言，至少一種dsRNA分子，其包括靶定包含序列辨識編號：1的基因之dsRNA分子)的iRNA分子，經由農桿菌或WHISKERSTM方法學(見Petolino and Arnold(2009)Methods Mol.Biol.526：59-67)予以二次轉形，以產生一種或多種殺蟲的dsRNA蛋白質分子，舉例而言，Cry3、Cry34及Cry35殺蟲的蛋白質。實質上如實施例4所描述般製備的植物轉形質體載體，係經由農桿菌或WHISKERSTM-媒介轉形方法遞送至從一基因轉殖B104玉蜀黍植物獲得的玉蜀黍懸浮液細胞或是未成熟的玉蜀黍胚胎中，其中該基因 轉殖B104玉蜀黍植物在其基因組包含一異源性編碼序列，該者轉錄成靶定鞘翅目害蟲生物體的一種iRNA分子。獲得雙重轉形的植物，其會生產iRNA分子及殺蟲的蛋白質用於控制鞘翅目害蟲。
<110> 陶氏農業科學公司 弗勞恩霍夫爾協會
<120> 賦予對鞘翅目害蟲之抵抗力的DRE4核酸分子
<130> 75747
<160> 74
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 3423
<212> DNA
<213> 玉米根螢葉甲(Diabrotica virgifera)
<400> 1
<210> 2
<211> 175
<212> DNA
<213> 玉米根螢葉甲
<400> 2
<210> 3
<211> 127
<212> DNA
<213> 玉米根螢葉甲
<400> 3
<210> 4
<211> 459
<212> DNA
<213> 玉米根螢葉甲
<400> 4
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 啟動子序列(Promotor oligonucleotide)
<400> 5
<210> 6
<211> 503
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 部分編碼區域
<400> 6
<210> 7
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 7
<210> 8
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 8
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 9
<210> 10
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 10
<210> 11
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 11
<210> 12
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 12
<210> 13
<211> 615
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 13
<210> 14
<211> 519
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 14
<210> 15
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 15
<210> 16
<211> 225
<212> DNA
<213> 馬鈴薯
<400> 16
<210> 17
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 17
<210> 18
<211> 218
<212> DNA
<213> 玉米根螢葉甲
<400> 18
<210> 19
<211> 424
<212> DNA
<213> 玉米根螢葉甲
<220>
<221> 其他特徵
<223> n為a、c、g或t
<222> (393)..(393)
<220>
<221> 其他特徵
<223> n為a、c、g或t
<222> (394)..(394)
<220>
<221> 其他特徵
<222> (395)..(395)
<223> n為a、c、g或t
<400> 19
<210> 20
<211> 397
<212> DNA
<213> 玉米根螢葉甲
<400> 20
<210> 21
<211> 490
<212> DNA
<213> 玉米根螢葉甲
<400> 21
<210> 22
<211> 330
<212> DNA
<213> 玉米根螢葉甲
<400> 22
<210> 23
<211> 320
<212> DNA
<213> 玉米根螢葉甲
<400> 23
<210> 24
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 24
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 25
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 26
<210> 27
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 27
<210> 28
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 28
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 29
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 30
<210> 31
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 31
<210> 32
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 32
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 33
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 34
<210> 35
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 35
<210> 36
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 36
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
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<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 38
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<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 39
<210> 40
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 40
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 41
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 42
<210> 43
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 43
<210> 44
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 44
<210> 45
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 45
<210> 46
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 46
<210> 47
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 47
<210> 48
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 48
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 49
<210> 50
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 50
<210> 51
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 51
<210> 52
<211> 1150
<212> DNA
<213> 玉蜀黍
<400> 52
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<220>
<221> 其他特徵
<223> n為a、c、g或t
<222> (22)..(22)
<400> 53
<210> 54
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 54
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 55
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 56
<210> 57
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 57
<210> 58
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 大腸桿菌
<400> 59
<210> 60
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 部分編碼區域
<400> 60
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<211> 4233
<212> DNA
<213> 玉蜀黍
<400> 61
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 62
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 63
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針寡核苷酸
<400> 64
<210> 65
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 65
<210> 66
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 66
<210> 67
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針寡核苷酸
<400> 67
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 68
<210> 69
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 69
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針寡核苷酸
<400> 70
<210> 71
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 71
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 72
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針寡核苷酸
<400> 73
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針寡核苷酸
<400> 74

Claims (56)

  1. 一種可操縱地鏈接至一異源性啟動子之經單離的多核苷酸，該多核苷酸包含至少一選自於以下所組成的群組中的核苷酸序列：序列辨識編號：1；序列辨識編號：1之互補物；序列辨識編號：1之至少19個連續核苷酸的一片段；序列辨識編號：1之至少19個連續核苷酸的一片段之互補物；一葉甲(Diabrotica)生物體(例如WCR(西方玉米根蟲))之天然編碼序列，其包含序列辨識編號：1；一葉甲生物體之天然編碼序列之互補物，該天然編碼序列包含序列辨識編號：1；一葉甲生物體之天然非編碼序列，其轉錄成包含序列辨識編號：1之天然的RNA分子；一葉甲生物體之天然非編碼序列之互補物，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：1之天然的RNA分子；一葉甲生物體(例如WCR)之天然編碼序列之至少19個連續核苷酸的片段，該天然編碼序列包含序列辨識編號：1；一葉甲生物體之天然編碼序列之至少19個連續核苷酸的片段之互補物，該天然編碼序列包含序列辨識編號：1；一葉甲生物體之天然非編碼序列之至少19個連續核苷酸的片段，該非天然編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：1之天然的RNA分子；以及一葉甲生物體之天然非編碼序列之至少19個連續核苷酸的片段之互補物，該非天然編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：1之天然的RNA分子。
  2. 如請求項1之多核苷酸，其中該多核苷酸係選自於以下所組成的群組：序列辨識編號：1；序列辨識編號：1之互補物；序列辨識編號：2；序列辨識編號：2之互補物；序列辨識編號：3；序列辨識編號：3之互補物；序列辨識編號：4；序列辨識編號：4之互補物；序列辨識編號：13；序列辨識編號：13之互補物；序列辨識編號：14；以及序列辨識編號：14之互補物。
  3. 如請求項1之多核苷酸，其中該至少一核苷酸序列係可操縱地鏈接至一在植物細胞中有作用的異源性啟動子。
  4. 一種植物轉形載體，其包含如請求項1之多核苷酸。
  5. 如請求項1之多核苷酸，其中該葉甲(Diabrotica)生物體係選自於以下所組成的群組：玉米根螢葉甲(D.v.virgifera LeConte)；北方玉米根蟲(D.barberi Smith and Lawrence)；黃瓜十一星葉甲食根亞種(D.u.howardi)；墨西哥玉米根葉甲(D.v.zeae)；巴西玉米根蟲(D.balteata LeConte)；黃瓜十一星葉甲球蟲(D.u.tenella)；以及黃瓜十一星葉甲甘薯猿葉甲蟲(D.u.undecimpunctata Mannerheim)。
  6. 如請求項1之多核苷酸，其中該多核苷酸為核糖核酸(RNA)分子。
  7. 如請求項1之多核苷酸，其中多核苷酸為去氧核糖核酸(DNA)分子。
  8. 如請求項1之多核苷酸，其進一步包含一編碼一源自蘇力菌(Bacillus thuringiensis)的多肽之多核苷酸。
  9. 如請求項8之多核苷酸，其中該源自蘇力菌(B.thuringiensis)的多肽係選自於包含Cry3、Cry34及Cry35的群組。
  10. 一種雙股核糖核酸分子，其係產自於如請求項7之多核苷酸的表現。
  11. 如請求項10之雙股核糖核酸分子，其中將該多核苷酸序列與鞘翅目害蟲接觸，抑制一內源性核苷酸序列的表現，該內源性核苷酸序列特異性地互補於如請求項1之多核苷酸序列。
  12. 如請求項11之雙股核糖核酸分子，其中將該核糖核酸分子與鞘翅目害蟲接觸，殺死或抑制鞘翅目害蟲的生長、生殖及/或取食。
  13. 如請求項10之雙股核糖核酸分子，其包含一第一、一第二及一第三多核苷酸序列，其中該第一多核苷酸序列包含如請求項1之多核苷酸，其中該第三多核苷酸序列係藉由該第二多核苷酸序列而鏈接至該第一多核苷酸序列，以及其中該第三多核苷酸序列實質上係該第一多核苷酸序列的反向互補物，藉此當該第一與該第三多核苷酸序列轉錄成核糖核酸時，其雜交以形成該雙股核糖核酸分子。
  14. 如請求項6之多核苷酸，其係選自於以下所組成的群組：長度介於約19個與約30個核苷酸之間的一雙股核糖核酸分子及一單股核糖核酸分子。
  15. 一種核糖核酸分子，其係產自於如請求項7之多核苷酸 的表現，其中該核糖核酸分子係選自於以下所組成的群組：長度介於約個19與約30個核苷酸之間的一雙股核糖核酸分子及一單股核糖核酸分子。
  16. 一種植物轉形載體，其包含如請求項1之多核苷酸，其中該至少一核苷酸序列係可操縱地鏈接至一在植物細胞中有作用的異源性啟動子。
  17. 一種細胞，其係由如請求項1之多核苷酸予以轉形者。
  18. 如請求項17之細胞，其中該細胞為一原核細胞。
  19. 如請求項17之細胞，其中該細胞為一真核細胞。
  20. 如請求項19之細胞，其中該細胞為一植物細胞。
  21. 如請求項17之細胞，其中該細胞包含一編碼一源自蘇力菌的多肽之多核苷酸。
  22. 如請求項21之細胞，其中該源自蘇力菌的多肽係選自於包含Cry3、Cry34及Cry35的群組。
  23. 一種植物，其係由如請求項1之多核苷酸予以轉形者。
  24. 如請求項23之植物，其中該植物包含一編碼一源自蘇力菌的多肽之多核苷酸。
  25. 如請求項24之植物，其中該源自蘇力菌的多肽係選自於包含Cry3、Cry34及Cry35的群組。
  26. 一種如請求項23之植物的種子，其中該種子包含該多核苷酸。
  27. 如請求項23之植物，其中該至少一核苷酸序列在該植物中係表現為一雙股核糖核酸分子。
  28. 如請求項20之細胞，其中該細胞為玉蜀黍(Zea mays)細 胞。
  29. 如請求項23之植物，其中該植物為玉蜀黍(Zea mays)。
  30. 如請求項23之植物，其中該至少一核苷酸序列在該植物中係表現為一核糖核酸分子，以及當鞘翅目害蟲攝入該植物的一部分時，該核糖核酸分子抑制一內源性鞘翅目害蟲核苷酸序列的表現，該內源性鞘翅目害蟲核苷酸序列特異性地互補於該至少一核苷酸序列。
  31. 如請求項1之多核苷酸，其包含超過一個選自於以下所組成的群組之核苷酸序列：序列辨識編號：1；序列辨識編號：1之互補物；序列辨識編號：2；序列辨識編號：2之互補物；序列辨識編號：3；序列辨識編號：3之互補物；序列辨識編號：4；序列辨識編號：4之互補物；序列辨識編號：1之至少19個連續核苷酸的片段；序列辨識編號：1之至少19個連續核苷酸的片段之互補物；一葉甲(Dibbrotica)生物體之天然編碼序列，其包含序列辨識編號：1；一葉甲生物體之天然編碼序列之互補物，該天然編碼序列包含序列辨識編號：1；一葉甲生物體之天然非編碼序列，其轉錄成包含序列辨識編號：1之天然RNA分子；以及一葉甲生物體之天然非編碼序列之互補物，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：1之天然的RNA分子。
  32. 一種植物轉形載體，其包含如請求項31之多核苷酸，其中該等核苷酸序列係各自可操縱地鏈接至一在植物細胞中有作用的異源性啟動子。
  33. 一種細胞，其係由如請求項31之多核苷酸予以轉形者。
  34. 一種植物，其係由如請求項31之多核苷酸予以轉形者。
  35. 如請求項34之植物，其中該超過一個核苷酸序列在該植物細胞中係表現為一雙股核糖核酸分子。
  36. 如請求項33之細胞，其中該細胞為玉蜀黍(Zea mays)細胞。
  37. 如請求項35之植物，其中該植物為玉蜀黍(Zea mays)。
  38. 如請求項30之植物，其中該鞘翅目害蟲為葉甲物種(Diabrotica sp.)。
  39. 如請求項31之植物，其中該鞘翅目害蟲係選自於以下所組成的群組：玉米根螢葉甲(D.virgifera virgifera LeConte)、北方玉米根蟲(D.barberi Smith and Lawrence)、墨西哥玉米根葉甲(D.virgifera zeae Krysan and Smith)、黃瓜十一星葉甲食根亞種(D.undecimpunctata howardi Barber)、巴西玉米根蟲(D.balteata LeConte)、黃瓜十一星葉甲球蟲(D.undecimpunctata tenella)，以及黃瓜十一星葉甲甘薯猿葉甲蟲(D.undecimpunctata undecimpunctata Mannerheim)。
  40. 一種商品產品，其產自於如請求項23之植物，其中該商品產品包含可偵測數量之如請求項1之多核苷酸。
  41. 一種用於控制一鞘翅目害蟲族群的方法，該方法包含提供一包含一雙股核糖核酸分子的製劑，其一旦與該鞘翅目害蟲接觸時，作用以抑制該鞘翅目害蟲內的生物功 能，其中該製劑包含一選自於以下所組成之群組中的核苷酸：序列辨識編號：1；序列辨識編號：1之互補物；序列辨識編號：1之至少19個連續核苷酸的片段；序列辨識編號：1之至少19個連續核苷酸的片段之互補物；一葉甲(Diabrotica)生物體之天然編碼序列，其包含序列辨識編號：1；一葉甲生物體之天然編碼序列之互補物，該天然編碼序列包含序列辨識編號：1；一葉甲生物體之天然非編碼序列，其轉錄成包含序列辨識編號：1之天然的RNA分子；一葉甲生物體之天然非編碼序列之互補物，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：1之天然的RNA分子；一葉甲生物體之天然編碼序列之至少19個連續核苷酸的片段，該天然編碼序列包含序列辨識編號：1；一葉甲生物體之天然編碼序列之至少19個連續核苷酸的片段之互補物，該天然編碼序列包含序列辨識編號：1；一葉甲生物體之天然非編碼序列之至少19個連續核苷酸的片段，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：1之天然RNA分子；以及一葉甲生物體之天然非編碼序列之至少19個連續核苷酸的片段之互補物，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：1之天然RNA分子。
  42. 一種用於控制一鞘翅目害蟲族群的方法，該方法包含提供包含一第一與一第二多核苷酸序列之製劑，其一旦與該鞘翅目害蟲接觸時，作用以抑制該鞘翅目害蟲內的生物功能，其中該第一多核苷酸序列包含一區域，其對序 列辨識編號：1之從約19個至約30個連續的核苷酸展現從約90%至約100%的序列同一性，以及其中該第一多核苷酸序列係特異性地雜交至該第二多核苷酸序列。
  43. 如請求項42之方法，其中該第一多核苷酸序列進一步包含一區域，其對一鞘翅目害蟲基因之從約19個至約30個連續的核苷酸展現出約90%至約100%的序列同一性，該鞘翅目害蟲基因是選自於以下所組成的群組：液泡型ATP酶之C次單元；液泡型ATP酶之H次單元；以及Rho1小GTP-結合蛋白。
  44. 一種用於控制鞘一翅目害蟲族群的方法，該方法包含：在一鞘翅目害蟲之宿主植物中提供一經轉形的植物細胞，該經轉形的植物細胞包含如請求項1之多核苷酸，其中該多核苷酸被表現以生成一核糖核酸分子，其一旦與屬於該族群之鞘翅目害蟲接觸時，作用以抑制在該鞘翅目害蟲內一靶定序列的表現，且致使該鞘翅目害蟲或該鞘翅目害蟲族群之下降的生長，相對於在相同物種但缺乏該經轉形植物細胞之宿主植物上的生長。
  45. 如請求項44之方法，其中該核糖核酸分子為一雙股核糖核酸分子。
  46. 如請求項44之方法，其中相對於侵擾相同物種但缺乏該經轉形植物細胞之宿主植物的鞘翅目害蟲族群，該鞘翅目害蟲族群係降低的。
  47. 一種控制一植物中植物鞘翅目害蟲侵擾的方法，該方法包含在一鞘翅目害蟲的飲食中提供如請求項1之多核苷 酸。
  48. 如請求項47之方法，其中該飲食包含一植物細胞，該植物細胞係經轉形以表現如請求項1之多核苷酸。
  49. 一種用於改良一玉米作物產量的方法，該方法包含：將如請求項3之多核苷酸引入至一玉米植物內，以生產一基因轉殖玉米植物；以及培養該玉米植物以允許該至少一核苷酸序列的表現；其中該至少一核苷酸序列的表現抑制鞘翅目害蟲感染或生長，以及歸因於鞘翅目害蟲感染的產量損失。
  50. 如請求項49之方法，其中該至少一核苷酸序列的表現產生一RNA分子，該RNA分子在已經接觸該玉米植物之一部分的鞘翅目害蟲中抑制至少一第一標靶基因。
  51. 一種用於生產一基因轉殖植物細胞的方法：以一載體轉形一植物細胞，該載體包含如請求項1之多核苷酸，其可操縱地鏈接至一植物啟動子及一轉錄終止序列；在足以允許一包含數個經轉形植物細胞之植物細胞培養物之發展的條件下，培養該經轉形的植物細胞；選擇已經將該至少一核苷酸序列併入至其等基因組內的經轉形植物細胞；篩選表現由該至少一核苷酸序列所編碼之核糖核酸分子的經轉形植物細胞；以及選擇表現dsRNA之植物細胞。
  52. 一種用於生產一抗鞘翅目害蟲基因轉殖植物的方法，該 方法包含：提供藉由如請求項51之方法所生產的基因轉殖植物細胞；以及從該基因轉殖植物細胞再生一基因轉殖植物，其中表現由該至少一核苷酸序列所編碼之核糖核酸分子係足以調變一接觸該經轉形植物的鞘翅目害蟲中之一標靶基因的表現。
  53. 如請求項51之方法，其中該經轉形植物包含一編碼一源自蘇力菌的多肽之核苷酸序列。
  54. 如請求項53之方法，其中該源自蘇力菌的多肽係選自於包含Cry3、Cry34及Cry35的群組。
  55. 一種用於控制一鞘翅目害蟲族群的方法，其包含提供一製劑給該鞘翅目害蟲族群，該製劑包含用於抑制一鞘翅目害蟲中必要的dre4基因表現的構件。
  56. 如請求項55之方法，其中提供該製劑包含引入一構件至易受鞘翅目害蟲侵擾的植物，該構件係用於提供鞘翅目dre4害蟲抵抗力給該植物。
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