TW201305203A - 藉變異區突變獲得的抗血管內皮生長因子（ｖｅｇｆ）之重組抗體 - Google Patents
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Abstract
本發明展現人類重組抗體，其等辨識人類血管內皮生長因子A(VEGF-A)、阻斷其與VEGFR2受體之交互作用，以及干擾其之活體外增殖作用和活體內促血管生成作用。該等抗體識別不同於任何其他先前的報告的人類VEGF-A上之一抗原決定位，以及係藉由組合一個免疫球蛋白輕鏈變異區與其他的三個重鏈變異區所獲得。該等抗體係藉由人類免疫球蛋白變異區突變所獲得的，以及可以使用於血管分佈之增加有關聯的病理實體，例如老年性黃斑部退化、癌症，和其他的，之免疫療法。
Description
本發明係有關於生物技術和藥學工業領域，特別地加上專一地辨識人類血管內皮生長因子-A(縮寫VEGF-A)的人類重組抗體之發展和應用(Ferrara,N.等人2003. Nature Medicine 9: 669-676)。本發明中所包含之不同類型的重組抗體係使用遺傳工程的技術來組合一個相同的免疫球蛋白輕鏈變異區(VL)與其他的三個重鏈變異區(VH)而發展出。該等重組抗體辨識VEGF-A內之非先前說明的抗原決定位、阻斷VEGF-A和其之VEGFR2受體的交互作用，以及結果，干擾VEGF-A之活體外和活體內的刺激作用和促血管生成作用(proangiogenic effects)。因為此等性質，新的人類重組抗體可以使用於與血管分佈增加有關聯的病理實體，例如老年性黃斑部退化、癌症、類風濕性關節炎和其他的，之免疫療法。
從早已存在的血管形成新的血管(血管生成)的方法係藉由作用於血管內皮和其之骨髓的前驅物上之促血管生成因子和抗血管生成因子之平衡來調控。血管內皮生長因子為一種分子的家族，其等以直接的且專一的方式來誘導新的血管形成(Leung,D.等人1989. Science 246:1306-1309)。此家族包括血管通透因子(縮寫VPF)，其亦知道為血管內皮生長因子A(VEGF-A)、胎盤生長因子”(縮寫PLGF)、血小板衍生生長因子(縮寫PDGF)A和B，以及在結構上和生化上有關於VEGF-A的其他分子，其已經命名為VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D，及VEGF-E(Olofsson,B.等人1996. Proc Natl Acad Sci USA 93: 2576-2581;Joukov,V.等人1996. EMBO J 15:290-298;Yamada,Y.等人1997. Genomics 42:483-488;Ogawa,S.等人1998. J Biol Chem 273:31273-31282)。
VEGF-A為一種由2個23 kDa的次單元形成的二聚合分子醣蛋白(Ferrara,N.等人1989. Biochem Biophys Res Comun 161: 851-858)。存在有由一個相同的核糖核酸(RNA)之差異性剪接所衍生的5個同質體(isoforms)。此等包括2個細胞膜結合的同質體(VEGF 189 y VEGF 206)以及三個分泌為可溶的因子(VEGF 121、VEGF 145，和VEGF 165)。VEGF 165為哺乳動物組織內最大量的，心臟和肺臟例外，該處VEGF 189佔絕大多數(Neufeld G等人1995. Canc Met Rev 15:153-158)。於胎盤內，VEGF 121的表現為更高的(Shibuya,M. 1995. Adv Cancer Res 67: 281-316)。VEGF家族分子係藉由結合至酪胺酸激酶第III類細胞受體，其包括VEGFR1(Flt1)、VEGFR2(KDR/Flk1)和VEGFR3(Flt4)(Kaipainen,A. 1993. J Exp Med 178: 2077-2088)，而發揮其等之功能和作用。
VEGF-A為研究最多的以及已經描述了此家族之定特徵的蛋白和一些疾病，該處此蛋白是與引起疾病的過程有關的(Carmeliet,P. y Jain,RK. 2000. Nature 407: 249-257;Kuwano M,等人2001. Intern Med 40: 565-572)。VEGF-A的過度表現係有關於不同起源和局部化之腫瘤的生長，以及其等之散播(Grunstein,J.等人1999. Cancer Res 59: 1592-1598)。於特定狀況的腫瘤，表現VEGF-A之三個基本同質體(121、165和且189)的細胞為活體內生長較快的細胞(Grunstein,J. 2000. Mol Cell Biol 20: 7282-7291)。
VEGF-A亦已經與慢性發炎的過程有關，如潰瘍性大腸炎和克隆氏症(Crohn’s disease)(Kanazawa,S.等人2001. Am J Gastroenterol 96: 822-828)、牛皮癬(Detmar,M.等人1994. J Exp Med 180: 1141-1146)、呼吸窘迫(Thickett,DR.等人2001. Am J Respir Crit Care Med 164: 1601-1605)、動脈粥狀硬化(Celletti,FL.等人2001. Nat Med 7: 425-429)、子宮內膜異位(McLaren,J. 2000. Hum Reprod Update 6: 45-55)、氣喘(Hoshino,M.等人2001. J Allergy Clin Immunol 107: 295-301)、類風濕性關節炎(rheumatoide arthritis)和骨關節炎(Pufe,T.等人2001. J Rheumatol 28: 1482-1485)、甲狀腺炎(Nagura,S.等人2001. Hum Pathol 32: 10-17)、糖尿病視網膜病變和新生兒視網膜病變(Murata,T.等人1996. Lab Invest 74: 819-825;Reynolds,JD. 2001. Paediatr Drugs 3: 263-272)、黃斑部退化和青光眼(Wells,JA.等人1996. Br J Ophthalmol 80: 363-366)、組織水腫(Kaner,RJ.等人2000. Am J Respir Cell Mol Biol 22: 640-641)、肥胖(Tonello,C.等人1999. FEBS Lett 442: 167-172)、血管瘤(Wizigmann,S. y Plate,KH. 1996. Histol Histopathol 11: 1049-1061)、發炎關節病變(Bottomley,MJ.等人2000. Clin Exp Immunol 119:182-188)以及移植排斥(Vasir,B.等人2001. Transplantation 71: 924-935)。
一種用於許多此等疾病之引人注目的治療程序是根據刺激反常的血管形成之促血管生成因子的活性之抑制作用，使用能夠中和其等之作用的分子。許多新的治療策略根據血管生成的抑制作用，尤其癌症，是根據VEGF-A及/或其之受體的阻斷。在被許可的產物之中或是於臨床試驗中，吾人可以發現到：(1)阻斷VEGF-A或是KDR受體之單株抗體，(2)金屬蛋白酶抑制劑，如同Neovastat和Prinomastat，(3) VEGF抑制劑，如同沙利多邁、蘇拉明(Suramin)、Troponina I，和IFN-α，(4) VEGF受體阻斷劑，如SU5416、FTK787和SU6668)，(5)腫瘤內皮細胞凋亡誘導子，如Endostatin和CA4-P，以及(6)核糖核酸酵素，其等減少VEGF或其之受體(Angiozyme)的表現。
由上文所提及的全體，中和VEGF-A的促血管生成作用(pro-angiogenic effects)之抗體和抗體片段為進步最多的，就應用和接受為治療產物方面來說。於醫學的實施上，擬人化的重組抗體貝伐單抗(Bevacizumab)，商業上知道為Avastin(Ferrara,N.等人2005. Biochem Biophys Res Comun 333: 328-335;Kim,KJ.等人1992. Growth Factors 7: 53-64)，其辨識人類VEGF-A且中和其之促血管生成作用，已經於數個國家許可用於不同癌症的治療(Allison,M. 2010. Nature Biotechnology,28(9): 879-880)。
近來，數個國家已經許可雷珠單抗(Ranibizumab)(Gaudreault,J.等人2005. Invest Ophthalmol Visual Sci 46: 726-733)，商業上知道的Lucentis，以其之濕的形式用於老年性黃斑部退化的治療之用途。雷珠單抗為藉由使用遺傳工程操作貝伐單抗來發展的Fab型之重組抗體片段。雷珠單抗之玻璃體內的注射使局部生產的VEGF-A中和，以及影響視網膜的更深層內之血管生成，其為此疾病的基礎。
除了貝伐單抗和雷珠單抗的實例之外，衛生當局已經登記，還有辨識且中和人類VEGF之其他的抗體和抗體片段的報告(Muller, Y.等人1997. Proc Natl Acad Sci USA 94: 7192-7197;Asano,M.等人1998. Hybridoma 17:185-190;Vitaliti A.等人2000. Cancer Res 60: 4311-4314;Brekken,RA. y Thorpe,PE. 2001. J Controlled Release 74:173-181;Jayson,G.等人2002. JNCI 94: 1484-1493;Brekken,RA.等人2000. Cancer Res 60: 5117-5124;Fuh,G.等人2006. J Biol Chem 281: 6625-6631;US 5730977;WO2008/052489 A1)。
2H1為單鏈Fv型(縮寫scFv)之人類抗體片段，其專一地辨識人類VEGF(WO2008/052489 A1)。2H1係由一人類起源的scFv絲狀噬菌體展示庫所獲得。2H1 scFv為對於人類VEGF-A為專一的，但是展示出對於此分子之低親和性。考慮到其發源的庫係用來自不同來源(末梢血液、脾臟、扁桃腺、骨髓)及不同的健康個體之人類淋巴細胞獲得的初始型變異區(nave variable regions)予以建構的可以解釋此情況(Rojas G.,等人2005. Biochem Biophys Res Comun 336:1207-1213)。如同技藝現狀所知道的，展示由初始型變異區庫之scFv的噬菌體可以生產對於其等之專一抗原中等的親和性和低親和性之抗體。此就自身抗原來說可以是更加惡名昭彰的，因其就是此狀況(Marks J.D.，等人，1991. J. Mol. Biol. 222: 581-597)。中等的親和性或低親和性的抗體(o fan antibody)通常相應於變異區內低量突變的存在，有關於其等發源的免疫球蛋白生殖系列的序列而言。低親和性的重組抗體當與具有對於相同的抗原而言更高的親和性之相似分子比較時，於免疫化學的應用和活體內之治療程序具有不足的效能。
目前，發展中和人類VEGF的作用，以及可以使用於發展過度的血管生成之實體療法中之新的抗體持續是有興趣的主題。
本發明解決前述的問題，因其提供專一地辨識人類VEGF-A之新的人類重組抗體。
本發明中所說明之不同的重組抗體當與由2H1scFv抗體片段所衍生之相似的分子比較時，展示出較好的免疫化學的、生物的，和治療效能。為了發展此等抗體，於scFv抗體片段2H1之VL和VH變異區的互補性決定區域3(CDR3)內實行突變。新的經突變的變異區，使用絲狀的噬菌體展示技術來選擇更好的人類VEGF-A之辨識，係使用遺傳工程技術來組合以獲得具有所想要的提升且新穎的免疫化學性質和生物性質之新的抗體結合位址。關於此工作，首先進行編碼scFv抗體片段2H1的基因之序列的分析，其指示出VL和VH CDR3有關於V、D及/或J人類原始的生殖基因區域具有非常少的變化。此發現解釋了2H1對於抗原之低親和性。
接而設計一特定的突變策略，專有地針對編碼2H1 scFv抗體片段之VL(8個胺基酸殘基)和VH(7個胺基酸殘基)區域的CDR3區域(domain)之基因序列。簡約突變(Parsimonius Mutagenesis)的技術(縮寫PM)(Balint,R. y Larrick J.W. 1993. Gene,I37: 109-118)係使用來誘導突變。以PM，實行突變的序列分析以及可以修飾一抗體結合位址的特徵之最小的變化係藉由電腦實行，考慮到關於公開的資料庫內可得到之已知的免疫球蛋白序列之現存的資訊。使用簡併的合成寡核苷酸和聚合酶連鎖反應(PCR)，PM於非常短時間內生產了所想要的基因區域之百萬個新的突變體。
PM各自地應用於2H1 scFv抗體片段的VL和VH區域之CDR3區域以及，使用新的變異區之選殖於一適當的噬質體(phagemid)載體內，生產2個大的scFv抗體片段庫(ca.5 x 108個體)，其中結合位址已經於前述的胺基酸序列內予以突變(實施例1)。於命名為#1之庫中，原始的2H1 scFv抗體片段VL區域為恆定的，聯合CDR3內經突變的百萬個新的VH區域。於庫命名為#2中，原始的2H1 scFv抗體片段VH區域為恆定的，聯合CDR3內經突變的百萬個新的VL區域。
展示該等2個庫之新的scFv抗體片段的代表物之噬菌體係對於人類VEGF-A來選擇，同時使用遞增濃度之可溶的2H1 scFv，以有利於具有對於VEGF-A更高的親和性之新的scFv抗體片段之單離(實施例2)。
以選自於2個庫的各個之新的scFv片段的選殖株來開始，其等之VEGF-A相對辨識之實驗性估計係藉由ELISA來實行的，有關於2H1 scFv亦展示於噬菌體之上(實施例2)。此等實驗指示出那一些經突變的VL和VH變異區對新的片段實現較好的抗原辨識特徵和親和性。
經識別之新的變異區係予以定序來決定新的CDR3之核苷酸組成物。就VH區域之新的CDR3區域來說，來自選自於庫#1之最佳的scFv抗體片段，在其等之中兩者之全部的此等區域具有不同的胺基酸序列，以及關於2H1 scFv抗體片段之原始的VH(實施例2，表2)。具最好的抗原辨識之scFv抗體片段命名為3F3、3E3和4D8，以及含有新的VH區域。3F3 scFv含有由吾人命名為H6之VH(序列辨識編號(SEC ID No)1代表鹼基序列及序列辨識編號4代表胺基酸演繹(deduced)序列)。3E3 scFv含有由吾人命名為H5之VH(序列辨識編號2代表鹼基序列及序列辨識編號5代表胺基酸演繹序列)。4D8 scFv含有由吾人命名為H7之VH(序列辨識編號3代表鹼基序列及序列辨識編號6代表演繹胺基酸序列)。
就VL區域之新的CDR3區域來說，來自選自於庫#2之最佳的scFv抗體片段(實施例2，表3)，吾人發現到新的scFv抗體片段內之突變群集在有關於原始的區域之數個位置。於具有最好的人類VEGF辨識之4個scFv片段的3個之中，8個CDR3殘基的7個為恆定的，且位置5上的那個胺基酸是隨著事例而變化的胺基酸。此分析結果指示出增加結合位址和抗原之間的接觸可以藉由於此特定的位置5生產額外的取代來進一步的探究之可能性。展示於噬菌體之內的新的scFv抗體片段接而拿此組最佳的結合物之典型的VL CDR3為基礎來建構，該處編碼第五胺基酸的CDR3核苷酸係予以取代俾以生產胺基酸P、E或是D。以此方式生產之新的VL區域選殖株各別命名為L1、L2，和L3。
由此等取代，有關於其他的2個新突變體、全部先前的VL突變體以及，當然，原始的2H1 scFv，包括有胺基酸D的該者為提供給展示scFv抗體片段的一噬菌體最好的抗原辨識之的該者(實施例3，表4)。
為了持續增加抗原辨識特徵，吾人接而組合經識別為來自庫#1最佳的VH區域H6、H5 y H7，以及新的L3 VL區域(序列辨識編號7代表鹼基和序列辨識編號8代表演繹胺基酸序列)。一旦展示於噬菌體之上此等三個新的scFv抗體片段，命名為L3H6、L3H5和L3H7，進行對於VEGF-A之親和性的比較，關於2H1 scFv抗體片段，以及展示選自於庫#1和#2的scFv之其他噬菌體(實施例4，表V)。此研究顯示出展示於噬菌體之上的三個新的scFv抗體片段L3H6、L3H5和L3H7係優於全部其他的scFv。在此等三者之中，L3H6為抑制分析中展示出更好的IC50之該者，指示出必需添加更多量的可溶的2H1 scFv片段於分析內來抑制L3H6對人類VEGF之平均結合。
於本發明不同的具體例中，使用編碼變異區H6(序列辨識編號1)、H5(序列辨識編號2)、H7(序列辨識編號3)和L3(序列辨識編號7)之基因來生產不同類型的重組抗體：(a)可溶的scFv片段，命名為scFv L3H6、scFv L3H5和scFv L3H7之，(b)可溶的Fab片段，命名為Fab L3H6、Fab L3H5和Fab L3H7，以及(c)二價抗體型分子scFv2-Fc L3H6、scFv2-Fc L3H5和scFv2-Fc L3H7。
為了生產重組抗體片段scFv L3H6、scFv L3H5以及scFv L3H7，編碼VHs區域H6(序列辨識編號1)、H5(序列辨識編號2)和H7(序列辨識編號3)之基因組合以VL區域L3(序列辨識編號7)，藉由連結子區段留有空隙，以及以VH-連結子-VL的次序，使用pACR.1載體(實施例5)。pACR.1載體係設計用於使重組蛋白表現至細菌周質，以及添加有用於作為分析目的的標記之分子c-myc胜肽區域的C端末端，接著六個組胺酸區域來促進使用金屬離子的親和力層析術(縮寫IMAC)之純化(Porath J. 1992. Prot. Expr. Purif. 3: 263-281)。抗體片段scFv L3H6(序列辨識編號9代表鹼基序列及序列辨識編號10代表胺基酸序列)、scFv L3H5(序列辨識編號11代表鹼基序列及序列辨識編號12代表胺基酸序列)和scFv L3H7(序列辨識編號13代表鹼基序列及序列辨識編號14代表胺基酸序列)，於十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(縮寫SDS-PAGE)有ca. 29 kDa的表觀分子量，可以由經轉形的細菌之培養基重新獲得以及容易地係使用IMAC予以純化。
為了生產Fab重組抗體片段Fab L3H6、Fab L3H5和Fab L3H7，編碼於變異區H6(序列辨識編號1)、H5(序列辨識編號2)、H7(序列辨識編號3)和L3(序列辨識編號7)之中所含有的序列之基因係選殖於pFabHum-1載體(實施例9)內。pFabHum-1質體為一種雙順反子載體，其係建構用於表現帶有人類免疫球蛋白CH1和Cλ恆定區之Fab片段，至細菌周質。該載體添加6個組胺酸和c-myc區域至選殖的分子的C端。於此質體內，H6、H5或H7區域係基因上與恆定CH1區結合，而L3係與恆定Cλ區結合，給予結果Fab抗體片段Fab L3H6(有核苷酸序列序列辨識編號15和序列辨識編號16，其編碼胺基酸序列序列辨識編號17和序列辨識編號18)、Fab L3H5(有核苷酸序列序列辨識編號19和序列辨識編號20，其編碼胺基酸序列序列辨識編號21和序列辨識編號22)，以及Fab L3H7(有核苷酸序列序列辨識編號23和序列辨識編號24，其編碼胺基酸序列序列辨識編號25和序列辨識編號26)。
抗體片段Fab L3H6、Fab L3H5和Fab L3H7係表現於大腸桿菌內且藉由IMAC使用IMAC而從經轉形的細菌之培養基予以純化以及於SDS-PAGE於非還原的條件下有ca. 50 kDa的表觀分子量。
二價重組抗體scFv2-Fc L3H6、scFv2-Fc L3H5和scFv2-Fc L3H7包括抗體片段scFv L3H6、L3H5和L3H7的序列，於各個狀況中聯合有3’序列，其編碼10個胺基酸連結子，接著編碼人類IgG1免疫球蛋白之樞紐、CH2和CH3區域的核苷酸序列。所提及的抗體係藉由選殖編碼前述的scFv片段之基因的PCR產物，於pVSJG-HucFc載體內而獲得(實施例10)。pVSJG-HucFc載體已經設計用表現該抗體類型的分子，其包括2個完全相同的scFv，聯合一人類IgG1型免疫球蛋白Fc，於哺乳動物細胞內。分子scFv2-Fc L3H6(序列辨識編號27代表核苷酸序列及序列辨識編號28代表胺基酸序列)、scFv2-Fc L3H5(序列辨識編號29代表核苷酸序列及序列辨識編號30代表胺基酸序列)，和scFv2-Fc L3H7(序列辨識編號31代表核苷酸序列及序列辨識編號32代表胺基酸序列)，係生產於用對應的質體轉染的CHO細胞的上清液之內。使用蛋白A或蛋白G的親和力層析術予以純化之scFv2-Fc分子於SDS-PAGE展示出介於100和120 kDa之間的表觀分子量。
本發明的重組抗體目標有關於會辨識或是中和人類VEGF-A之其他的抗體和抗體片段，包括由2H1 scFv抗體片段之原始變異區所衍生的該等，為新穎的。此係因為本發明的重組抗體目標：
(a)於其等之變異區CDR3內擁有新穎的DNA序列。此使得其等不同於由其他的作者所報告之其他的抗VEGF-A抗體，如由融合瘤所衍生的該等(Kim,KJ.等人1992. Growth Factors 7:53-64;Muller, Y.等人1997. Proc Natl Acad Sci USA 94: 7192-7197;Asano,M.等人1998. Hybridoma 17:185-190;Schaeppi,JM.等人1999. J Cancer Res Clin Oncol 125:336-342;Brekken,RA.等人2000. Cancer Res 60: 5117-5124;Brekken,RA. and Thorpe,PE. 2001. J Controlled Release 74:173-181)，或是改變(alter)人類細胞之病毒轉形(US 5730977)所獲得的、藉由遺傳工程早已存在的抗體之修飾(Jayson,G.等人2002. JNCI 94: 1484-1493;Ferrara,N.等人2005. Biochem Biophys Res Comun 333: 328-335)，以及由人類抗體片段庫所衍生的該等(Vitaliti,A.等人2000. Cancer Res 60: 4311-4314;Fuh,G.等人2006. J Biol Chem 281: 6625-6631)。
有關於2H1 scFv抗體片段之VL和VH區域(WO2008/052489 A1)，於本發明中所說明的抗體也是不同的。VH區域H6(序列辨識編號4)、H5(序列辨識編號5)以及H7(序列辨識編號6)於全部的7個CDR3胺基酸內有關於2H1為不同的。VL區域L3(序列辨識編號8)有關於2H1於8個CDR3胺基酸的3個是不同的。
(b) 擁有不同於由其他庫所獲得之人類Fab抗體片段的該等之對於人類VEGF-A之免疫化學的專一性(Fuh G.等人2006. J. Biol Chem 281: 6625-6631)，以及亦不同於貝伐單抗之免疫化學的專一性。不同於本發明中所說明的抗體，貝伐單抗不能夠辨識小鼠VEGF。並且，貝伐單抗識別減少了的VEGF-A，然而本發明中所說明的抗體不會。於本發明的實施例6、7和9之中，說明了新的重組抗體如何擁有不同的且較好的人類VEGF-A之辨識，有關於2H1 scFv抗體片段，以及由2H1所衍生的重組抗體(WO2008/052489 A1)。
(c)抗體片段scFv L3H6和由其衍生的重組抗體(Fab L3H6和scFv2-Fc-L3H6)辨識人類VEGF-A內之功能抗原決定位，該功能抗原決定位不同於會中和人類VEGF-A的作用之其他的抗體所識別之全部其他的功能抗原決定位(Muller,Y.等人1997. PNAS USA 94: 7192-7197;Muller,AY.等人1998. Structure 6: 1153-1167;Schaeppi,JM.等人1999. J Cancer Res Clin Oncol 125: 336-342;Brekken,RA.等人2000. Cancer Res 60: 5117-5124;Fuh,G.等人2006. J Biol Chem 281:6625-6631;WO2005012359;WO2008/052489 A1)。
本發明中所說明之人類VEGF-A內藉由新的重組抗體scFv L3H6、Fab L3H6和scFV2-Fc-L3H6所界定的新的功能抗原決定位，具有殘基K101、R103、E105及Y25為關鍵性的胺基酸(實施例11)。設若取代此等胺基酸，嚴重地影響本發明中所說明的抗體之辨識作用。
本發明中所說明的新穎重組抗體可以結合可溶的人類VEGF-A、吸附至固體表面的人類VEGF-A，或是結合或接近生產此因子的人類細胞之人類VEGF-A，在後者之中，細胞呈現於人類腫瘤內，其等生長於裸(無胸腺)鼠體內。
本發明中所說明的新穎重組抗體專一地辨識人類VEGF-A同質體121和165，經識別的小鼠VEGF，以及阻斷VEGF-A與VEGFR2受體之交互作用，但是不包括VEGFR1受體。後面的2個性質區別了本發明中所說明的新穎重組抗體與貝伐單抗和雷珠單抗。
本發明中所說明的新穎重組抗體較由2H1 scFv抗體片段所衍生的重組抗體擁有對於人類VEGF-A之較高的親和性，如同實施例8中顯示的。結果，此等新的抗體於測量以下的測試中具有較好的效能，有關於scFv 2H1和由2H1所衍生的抗體：(a) VEGF和VEGFR2的締合之阻斷(實施例7)，(b)於人類VEGF-A的刺激下，內皮細胞於培養物內之增殖的抑制作用(實施例12)，(c)小鼠體內由含有VEGF之Matrigel小丸所誘導的皮下的血管生成之抑制作用(實施例13)，以及移植至裸鼠之人類腫瘤生長的抑制作用(實施例14)。
本術語敘述一種抗體的部分，其專一地與一種抗原(或其之部分)交互作用。一抗體結合位址主要藉由2個抗體變異區，輕鏈(VL)和重鏈(VH)變異區，來形成。抗體結合位址係藉由變異區之非共價交互作用來形成。抗體結合位址可以經由連接2個變異區與不會干擾專一的抗原結合性質之胜肽而人工地穩定。此係就scFv型的片段來說。在本質上，抗體結合位址係藉由變異區的非共價交互作用予以總成，藉由CH1和CL(κ o λ)恆定區域之非共價交互作用予以強化，以及係藉由一個存在於CL內的半胱胺酸和另一個座落於抗體的重鏈之樞紐區域之間所建立的雙硫鍵予以強化。完全天然的抗體具有2個或更多個完全相同的抗原結合位址。
術語敘述一種免疫球蛋白或其之部分，其係經由重組DNA的技術或是人工基因的合成而完全或部分地以合成的形式來生產，且經由一個或更多個抗原結合位址而專一的辨識一種抗原(Gavilondo,J. y Larrick. J.W. 2000. Biotechniques 29: 128-136)。重組抗體之實例為所謂的嵌合的且擬人化的抗體，其中使用遺傳工程來締合由一種物種所獲得的變異區基因(或其之部分)，及另一種物種之免疫球蛋白恆定區。在重組抗體之中吾人亦可以發現到藉由遺傳工程所生產的抗體片段，其等包括一個或更多個抗原結合位址。重組抗體片段之實例為：(i) Fab片段，其包括VL、VH、CL和CH1免疫球蛋白區域；(ii) Fd片段，其在於含有VH和CH1區域；(iii) Fv片段，其由一單一抗體的VL和VH所組成；(iv) scFv片段，該處一假定的抗體之VH和 VL區域以不同的次序(VH-VL或是VL-VH)與允許2個變異區締合且形成一個抗原結合位址之胜肽連結子組合(Bird等人1988. Science 242: 423-426;Huston等人1988. PNAS USA 85: 5879-5883)；(v)“二聚抗體(diabodies)”，其等為以相似於scFv的方式建構的多價或多專一性片段，但是有不會允許一個相同的分子之VH和VL區域總成至一個結合位址之短胜肽連結子，以及後者必須藉由2個或更多個scFv之締合而產生，因而提供多價性(WO94/13804;Holliger P等人1993. PNAS USA 90: 6444-6448)；(vi)其他的片段如dAb(Ward SE等人1989. Nature 341: 544-546)、經單離的CDRs、F(ab')2片段、奈米抗體，以及雙專一性scFv二聚物(PCT/US92/09965;Holliger P y Winter G. 1993. Current Opinion Biotechnol. 4: 446-449;de Haard,H等人1998. Adv. Drug Delivery Rev. 31:5-31)。一些類型的片段，如同scFv和Fab，可以由抗體庫獲得，該處一種物種之變異區的大的合成或是天然的基因譜型(repertoire)隨機地組合來生產變異區之特定的締合，其接而展示於絲狀的噬菌體的表面上作為抗體片段。
亦考慮到的重組抗體為藉由遺傳工程所生產的“抗體-類型的”分子，該處使抗體片段總成至抗體恆定區。舉例而言，建構一種二價“抗體型”分子(這裡命名為scFv2-Fc)是可能的，其係藉由使scFv連結與由一種免疫球蛋白Fc的樞紐、CH2、CH3以及有時CH4區域而形成的一區域。取決於其之建構所牽涉的部份，以及醣化的存在，該分子可以展示出與免疫球蛋白Fc有關聯之全部的效應子功能的。一旦其表現於適合的宿主內，scFv2-Fc分子具有由2個完全相同的scFv所代表的二個結合位址。
最後，重組抗體也是分子，其中使從一來源獲得的輕鏈和重鏈之變異區(亦即scFv或是Fab)，總成至一種人類免疫球蛋白的恆定區，舉例而言，對於重鏈變異區，為CH1、樞紐、CH2、CH3及有時CH4，以及對於輕鏈變異區，為C κ或是C λ。
一抗體的均等變異體為由其之變異區之確切的序列之締合和操作所衍生的多肽分子，其之變異區之確切的序列保留專一辨識抗原的能力及發展有關其之作用，及有關其之生物性質的作用。此等多肽分子可以取其他的重組抗體片段之形式，像是座落在連結子和VH scFv區域之前的VL區域，或是技藝現狀所知道的其他連結子區段係使用，或是生產的如同F(ab')2、Fabc、Facb、二聚合、三聚合或四聚合(tertrameric)scFv片段(Winter G,Milstein C. 1991. Nature 349: 293-299;WO94/13804;de Haard,H等人1998. Adv. Drug Delivery Rev. 31:5-31)。並且，當多價分子係經由添加免疫球蛋白衍生的序列來生產(Bestagno M等人2001. Biochemistry 40: 10686-10692)。當一抗體的變異區之確切的序列係括含於二價抗體中，或是以完全尺寸的抗體形式，結合至一種人類免疫球蛋白或來自其他物種之恆定區域時，亦生產出一抗體的均等變異體。所有此等遺傳工程的操作為此技術區域內的熟悉此藝者所知道的。
一抗體的均等變異體亦考慮到藉由所謂的CDR移植所生產的該等分子或變異體，其中將變異區的CDR序列人工地放置於外來的免疫球蛋白框架內，以及此操作不會影響辨識原始抗原的能力和激起生物作用和生化作用之能力。
提到一情況，其中一種抗體或其之片段不會顯著地結合與其之專一的結合對(抗原)不同的其他分子。此術語亦適用以下的狀況，該處一個抗原結合位址係對於出現於一些有關的抗原或是無關的抗原內之特定的抗原決定位為專一的，於該狀況下該抗體結合位址將能夠識別帶有所提及的抗原決定位之數個抗原。
當抗原為大的時，一種抗體可以排他地結合抗原之特定的部分，其係命名為抗原決定位。由一抗體結合位址予以辨識之抗原決定位，就抗原為一蛋白來說，可以由一直系的胺基酸序列來形成，或是可以為構形的，那就是，於抗原內與抗體結合位址交互作用之胺基酸在結構上為蛋白之三級結構上接近的，但是不必然在其之主要結構上為連續的。就蛋白來說，一假定的抗原決定位本質上係離散的，係藉由透過非共價鍵與抗體的胺基酸交互作用之一組專一的胺基酸予以界定。
功能抗原決定位係經由抗原內之專一的胺基酸的取代而實驗性決定的，以及有關喪失抗體辨識的作用(或是其之變異體的該者)係藉由免疫化學方法來評估。
本發明中所說明的新抗體對於非人類的靈長類動物的實驗模型內之脈胳膜新血管形成之預防為有用的，該實驗模型之眼睛損傷係藉由雷射光凝所造成(實施例16)。
因為其等阻斷VEGF和VEGFR2受體之間的交互作用，本發明中所說明的新抗體影響了活化的內皮細胞和其等之骨髓前驅物增殖的能力，以及影響了不同的疾病內病理地形成的新血管之生理穩定性的維持。此阻斷亦可以影響關於人類VEGF所說明之其他的生物功能，如舉例而言其作為免疫反應的負調節物之角色(Chouaib S等人1997. Immunology Today 18:493-497)。
本發明中所說明的新穎重組抗體之後者對於發展異常的或是過度的血管生成的疾病之新穎的治療程序是有用的，在其等之中吾人可發現到：
(a) 癌症，主要意指實性腫瘤和其之轉移；此等治療的可能性包括，且不限於：表皮樣腫瘤、鱗狀頭和頸癌、結腸直腸腫瘤、攝護腺癌、乳房腫瘤、肺小細胞癌和非小細胞癌、胰臟腫瘤、甲狀腺癌、卵巢癌、肝腫瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi sarcoma)、中樞神經系統贅瘤(神經胚細胞瘤、血管母細胞瘤、腦脊髓膜瘤，和腦轉移)、黑色素瘤、腎和胃腸癌、橫紋肌肉瘤(rhabdomiosarcoma)、神經膠母細胞瘤以及平滑肌肉瘤(leiomiosarcoma)。
本發明中所說明之重組抗體scFv2-Fc L3H6、scFv2-Fc L3H5、scFv2-Fc L3H7及scFv2-Fc L3H7顯示出對於移植至裸鼠之人類腫瘤的生長之作用(實施例14)。因為於本發明中所說明的重組抗體擁有一新穎的抗原決定位辨識人類VEGF-A，此等在其等干擾人類VEGF-A和其之VEGFR2受體的結合之方式上係不同於其他的抗體和抗血管生成分子，其可以導致不同的活體內之治療作用。有大量文件證明用抗相同抗原所生產的，但是辨識不同的抗原決定位或是具有不同的親和性之抗體來產生活體內不同的治療作用是可能的，包括於帶有癌症的人類體內減少附屬的效應(Allan D.G.P. 2005. The Oncologist 10: 760-761;Boland,W. K y Bebb,G. 2009. Expert Opin. Biol. Ther. 9(9): 1-8)。
(b) 眼睛疾病如以其之濕的形式之老年性黃斑部退化、新生血管性青光眼，以及糖尿病視網膜病變和新生兒視網膜病變。本發明中所說明之scFv L3H6和scFv2-Fc L3H6分子顯示出對於非人類的靈長類動物的實驗模型內由雷射燒傷所誘導之脈胳膜新血管形成之預防和治療作用(實施例16)，指示出此抗體對於老年性黃斑部退化(AMD)(Gaudreault,J.等人2005. Invest Ophthalmol Visual Sci 46:726-733;Costa,RA等人2006. Investig Ophthalmol Visual Sci 47:4569-4578)，和共有相似的病理基礎之其他眼睛疾病之治療為有用的。
(c) 慢性的和急性的發炎過程，像是氣喘、呼吸窘迫、子宮內膜異位，以及動脈粥狀硬化和組織水腫。
(d) 感染性疾病，像是肝炎和卡波西氏肉瘤。
(e) 自體免疫疾病，像是糖尿病、牛皮癬、類風濕性關節炎和甲狀腺炎。
(f) 其他的數種疾病和狀態，如同器官移植排斥、血管瘤，和血管纖維瘤。
本發明中所說明的重組抗體可以耦合或接合至一酵素或是其之片段、至一生物反應修飾劑(BRM)、至一毒素或是藥物，或是至放射性同位素，其將會使原始的分子添加不同於其之結合人類VEGF-A之功能特徵。本發明中所說明之scFv L3H6分子係經放射標記以及注射至帶有人類腫瘤之無胸腺裸鼠(實施例15)。展現出該分子進入腫瘤內以及甚至在注射之後三天繼續存在於解剖學上的區域內。以此方式，耦合至其他的治療劑之本發明中所說明的重組抗體可以為包括其等之投藥作為藥物或藥學組成物之治療方法的基礎。化學上或是基因上耦合至治療放射性核種、毒素、藥物或BRM之抗體可以使耦合元素之治療作用對準具有異常的人類VEGF-A濃度之解剖學上的區域，其可以為腫瘤和其之臨近的地區，以及發揮治療作用。投藥的量、頻率和治療的間隔取決於疾病的本質和嚴重性以及此等判定為專家和醫生根據本領域中已經知道的事物之責任能力。
本發明的另一態樣為所說明的重組抗體生產一種藥學組成物之用途，該藥學組成物可以抑制血管生成以及可以使用於治療與其有關聯的病理病況。此等治療包括投藥有效量之所說明的分子至一人類。
用本發明中所說明的重組抗體所生產的組成物可以分別地或是組合其他的治療來投藥，會是此同時或是連續的，其之一切取決於待治療的疾病。藥學組成物除了活性成分之外，還包括可接受的藥學賦形劑、緩衝液、安定劑或是載劑，以及此技術領域中熟悉此藝者所知道的其他的材料。此等材料不是有毒的，不會干擾活性成分的效力，以及其等之本質取決於投藥的途徑，是此口部的、黏膜的，或是腸胃外的，舉例而言，經由靜脈內的注射。於一特定的具體例中，本發明中的組成物為用於經控制的釋放本發明的重組抗體之組成物，以及經控制的釋放該組成物內的其他活性成分。
本發明中所說明的重組抗體，或其之均等變異體，係藉由表現編碼核酸所生產的。結果，編碼所說明的重組抗體之任一者之核酸序列也是本發明的部分，以及關於表現該核酸的程序也是本發明的部分。於一較佳的具體例中，該核酸優先地但是不是排他地編碼例示於序列辨識編號9、序列辨識編號11、序列辨識編號13(各別為scFv L3H6、scFv L3H5和scFv L3H7)；序列辨識編號15、序列辨識編號16、序列辨識編號19、序列辨識編號20、序列辨識編號23、序列辨識編號24(各別為Fab L3H6、Fab L3H5和Fab L3H7，個別的鏈)；序列辨識編號27、序列辨識編號29、序列辨識編號31(各別為scFv2-Fc L3H6、scFv2-Fc L3H5和scFv2-Fc L3H7)之中的鹼基序列。
關於本發明中所說明的分子，或其之均等變異體之重組表現，可以建構或是挑選適當的載體，其含有必需的調節序列，包括啟動子、終止子、增強子、多腺苷酸化作用序列、標識基因以及認為恰當的其他者。載體可以為質體。
第1圖. 使用於大腸桿菌周質與培養上清液內生產可溶的scFv片段之pACR.1質體的示意圖示。該載體具有一個LacZ啟動子、一個核糖體結合位址(RBS)，以及pelB訊息胜肽(SP)。
第2圖. (A)帶有使用IMAC來純化scFv L3H6抗體片段的結果之12% SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，從用質體pACR.1 scFv L3H6予以轉形的大腸桿菌BL-21細胞之上清液來開始；樣品用β-巰基乙醇製備於裝載緩衝液中。徑1：分子量標記；徑2：用250 mM咪唑之洗提顯示出相應於該片段之電泳帶，具ca. 29 kDa。(B)使用抗c-myc抗體9E10來顯影的電泳的複製品之西方墨點。
第3圖. 競爭ELISA來評估不同濃度的抗體片段scFv L3H6、scFv L3H5以及scFv L3H7阻斷受體VEGFR2(KDR-Fc)和VEGFR1(FLT-1-Fc)的可溶形式接近吸附至固相之人類VGF-A的能力。結合的可溶受體之偵測係使用接合HRPO的抗人類IgG抗體來進行。(A) KDR-Fc之阻斷。使用scFv 2H1片段作為參考以及一種抗-HBsAg無關的scFv作為陰性對照。(B) FLT-1-Fc之阻斷。使用抗-HBsAg無關的scFv作為陰性對照以及Fab片段Lucentis(雷珠單抗)作為抑制對照。
第4圖. 使用於大腸桿菌周質與培養上清液內生產可溶的Fab片段之質體pFabHum-1的示意圖示。該載體具有一個LacZ啟動子、一個核糖體結合位址(RBS)，以及pelB和p3M13訊息胜肽(PS)於各個的表現卡匣內，連同恆定人類免疫球蛋白區域CH1或是C λ。
第5圖. (A) 帶有使用IMAC來純化Fab L3H6抗體片段的結果之12% SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，從用質體pFabHum-1 Fab scFv L3H6予以轉形的大腸桿菌BL-21細胞之上清液來開始；樣品用β-巰基乙醇製備於裝載緩衝液中。徑1：分子量標記。徑2：Fab的之二鏈為可看見的，具有ca. 28-30 KDa。徑3：使用抗c-myc抗體9E10來顯影的電泳的複製品之西方墨點。只有辨識出含有c-myc區域之Fab重鏈。(B) 樣品係製備於沒有β-巰基乙醇(沒有還原)的裝載緩衝液中之。徑1：Fab帶為明顯的，具有ca. 50 kDa。徑2：使用抗c-myc抗體9E10來顯影的電泳的複製品之西方墨點。
第6圖.(A)質體pVSJG-HucFc的示意圖示，係藉由選殖介於Afl II和Xba限制位址之間的scFv片段基因而使用於生產“類抗體的”的二價分子。(B)在一旦scFv基因已經選殖於載體內，以此質體轉染之後由哺乳動物細胞所生產之本類型的分子之示意圖示。
第7圖.人類VEGF-A之溶劑暴露的(表面)殘基的圖示，使用PyMol程式。2個二聚合分子鏈係以白色和淺灰色來代表。於白色鏈內，有關於由本發明中所說明的重組抗體所辨識的抗原決定位之關鍵性的胺基酸K101、R103、E105以及Y25已經以深灰色來強調。可以看見此等係於分子的一區域內界定出顯示良好的溶劑暴露之“群集”或構形分組。
第8圖.抗體片段(A) scFv L3H6、scFv L3H5，和scFv L3H7，以及二價重組抗體(B) scFv2-Fc L3H6、scFv2-Fc L3H5和scFv2-Fc L3H7阻斷人類VEGF-A對於人類臍帶靜脈內皮細胞(HuVEC)的增殖之刺激作用的能力。使用抗體片段scFv 2H1和二價重組抗體scFv2-Fc 2H1 8.2作為參考。圖形顯示出當將含有：40 μg/mL之抗體片段(A)，或是10 μg/mL之二價分子(B)的樣品添加至細胞時，有關於添加VEGF和沒有抗體(100%)之增殖相對值。陰性對照為一種無關的抗-HBsAg scFv和抗-EGF受體擬人化的抗體尼妥珠單抗(Nimotuzumab)。使用可溶的KDR-Fc作為抑制對照。各個長條代表由組做出之三個複製品的平均值，連同其之對應的標準偏差。
第9圖. 於C57Bl/6小鼠體內之二價重組抗體scFv2-Fc L3H6、scFv2-Fc L3H5和scFv2-Fc L3H7干擾Matrigel皮下小丸中所含有的人類VEGF-A之血管生成刺激作用的能力。使用一種無關的抗-HBsAg單株抗體作為陰性對照。使用可溶的KDR-Fc作為抑制的對照。使用二價分子scFv2-Fc 2H1 8.2作為參考。於實驗的終止，Matrigel小丸的內含物對於血紅素加工來評估新血管之相對量。圖形呈現有關於添加VEGF和沒有抗體之相對的血紅素濃度值(100%)。各個長條代表各組所包括的動物之平均值，連同其之對應的標準偏差。
第10圖. 2,5 mg/kg的體重劑量之二價分子scFv2-Fc L3H6、scFv2-Fc L3H5、scFv2-Fc L3H7及scFv2-Fc 2H1 8.2的腹膜內注射，對於由接種人類腫瘤細胞株A673至裸鼠所衍生的皮下腫瘤的生長之作用。曲線內的點為關於每組5隻動物所估計的平均腫瘤值。使用相同劑量的無關的CB-Hep.1單株抗體作為陰性對照。
各別對應於2H1 scFv抗體片段的VH和VL區域之CDR3(WO2008/052489 A1)，的序列LVVRDTE和LLSYSGAR係使用作為突變作用的標的。一組的合成寡核苷酸(表1)遵循簡約突變(Parsimonius Mutagenesis)的原理來設計(PM,Balint,R. and Larrick,J.W. 1993. Gene,I37:109-118)。
執行一種2步驟的PCR程序。於第一個PCR步驟中，使用引子VH-B和VH來生產且擴增經突變的scFv VH區域，以及關於經突變的scFv VL區域用引子VL-B和VL(見表1)。帶有“野生型”2H1 scFv抗體片段基因(命名為2H1-F；WO2008/052489 A1)的噬質體載體pHG-1m(Rojas,G.等人2004. J. Immunol. Meth. 293: 71-83)係於兩個狀況中都使用作為模板DNA以及KOD熱穩定酵素(Novagen)，依據製造商的用法說明。於此第一個PCR中實行20個擴增週期。後來反應產物係使用QIA Quick管柱(Qiagen)而由瓊脂糖凝膠來各自純化以及於水中洗提。DNA濃度係使用DNA標準(NEB)藉由電泳予以估計。繼而，關於VH區域擴增使用引子VH-B和VH-F以及關於VL區域擴增使用引子VL-B和VL-F來進行第二個PCR步驟(見表1)。於兩者狀況中，使用來自各自的第一個PCR反應之10 ng之經純化的DNA。相同的熱穩定的酵素(Novagen)係依據製造商的用法說明來使用以及實行15個擴增週期。後來反應產物係使用QIAQuick管柱(Qiagen)而由瓊脂糖凝膠來各自純化以及於水中洗提。DNA濃度係使用DNA標準(NEB)藉由電泳予以估計。
2H1-F載體和來自經突變的VH區域之經純化的DNA產物的樣品係用Sfi I和ApaL I(Fermentas和NEB)予以消化，使用QIAQuick管柱(Qiagen)而各別由瓊脂糖凝膠來純化以及使用T4 DNA連接酶(NEB)1:1.5予以接合。接合產物係使用QIAquick管柱(Qiagen)予以純化以及於水中洗提。
同樣地，2H1-F載體和來自經突變的VL區域之經純化的DNA產物係用Sal I和Not I(Fermentas和NEB)予以消化，如同以上所說明的予以純化和接合。
XL 1-Blue MRF′電穿孔勝任細胞(electrocompetent cells)(1 x 109/μg，Stratagene)係用各個接合各別予以轉形於各個50個不同的反應內關於各個，亦各別平盤培養於2xYT/胺芐青黴素大培養皿內，以及於37℃孵育歷時24小時。用來計算庫的大小的參考盤顯示出兩個庫都含有大約5x108個成員。含有經突變的CDR3 VH區域且維持來自2H1 scFv之野生型VL的庫命名為庫#1，然而帶有經突變的CDR3 VL區域和來自2H1 scFv之野生型VH的庫命名為庫#2。
由平盤刮削細菌菌落，根據其等之起源予以集合，以及使細胞成丸。高純度的DNA係使用MaxiPrep套組(Qiagen)依據製造商的用法說明由細胞之小丸獲得。
經突變的變異區庫之DNA係使用來各自地電穿孔TG1大腸桿菌細胞，其等接而用輔助噬菌體M13K07予以感染以生產噬菌體。噬菌體係予以純化以及以等分試樣保存於-20℃直到要使用於選擇實驗為止。
關於選擇，各庫之2 x 1012個噬菌體係稀釋於PBS-4%脫脂乳之內連同50 μg/ml的可溶的scFv 2H1(WO2008/052489 A1)，後者有利於噬菌體上對於人類VEGF-A具比scFv 2H1更高的(higher that)高親和性的scFv之單離。此等混合物係各自獨立與人類GST-VEGF像人的(humano)孵育歷時5小時(Morera,Y等人2006. Biotechnol. Appl. Biochem. 44:45-53)，固定於Maxisorp免疫試管(Nunc)內。免疫試管事先在16小時的期間於4℃係用配於PBS內之10 μg/mL的蛋白予以塗覆，以及接而用PBS-4%脫脂乳予以封阻。未結合的噬菌體係使用PBS-0.1% TWeen以20次清洗，接著2次PBS額外的清洗來排除。繼而，結合的噬菌體係用100 mmol/L三乙胺溶液予以洗提10 min，以及立即用0.5 mol/L Tris(pH 7.5)予以中和。洗提的噬菌體係擴增於大腸桿菌TG1細胞內以及使用作為另一種選擇週期的起始材料。此程序於相似的條件下重複2次。從第一個和第二個選擇週期所洗提的噬菌體係使用來感染TG1細胞，其等係予以平盤培養。代表性隨機選擇的細菌菌落係予以單離以及予以感染而以96井平盤規模來生產噬菌體(Marks,J.等人1991,J. Molec. Biol. 222:581-587)。此等的噬菌體選殖株展示scFv於其等之蛋白III上來結合GST-VEGF之能力係藉由ELISA予以評估。Maxisorp 96井平盤(Nunc)係用10 μg/mL的人類GST-VEGF予以塗覆，以及接而於22℃在1小時的期間用PBS-4%脫脂乳予以封阻，接著用PBS-0.1% Tween 20溶液予以清洗數次。結合的噬菌體係偵測和(and)耦合至過氧化酶(Amersham-Pharmacia)之抗-M13抗體，於22℃歷時1小時。在數次清洗之後，反應係用受質溶液予以顯影。在一微量平盤讀數器內於492 nm測量吸光度。
由各庫所單離之會於ELISA產生更高的吸光度數值之廣泛的選殖株樣品(19個或更多個)係各自地加工來獲得編碼scFv(Macrogen,Korea)的核苷酸序列。
表2顯示出由庫#1所單離的選殖株之重鏈(VH)變異區CDR3的核苷酸序列所演繹的胺基酸序列。全部獲得的序列(19)為不同的。於相同的表中，關於各個噬菌體，IC50值說明了抑制ELISA內噬菌體與塗覆VEGF的固相之結合所需要的可溶的scFv 2H1片段的濃度。關於此，Maxisorp 96井平盤(Nunc)係用10 μg/mL GST-VEGF予以塗覆，接著用PBS-4%脫脂乳予以封阻。用以評估之來自各個選殖株之相同量的噬菌體係與連續稀釋的可溶的scFv 2H1混合以及於22℃孵育於平盤中歷時1小時。在用PBS-0.1% Tween 20數次清洗之後，VEGF-結合的噬菌體係使用一種接合至過氧化酶(Amersham-Pharmacia)之抗-M13抗體予以偵測，於22℃歷時1小時。在數次清洗之後，反應係用受質溶液予以顯影。於一微量平盤讀數器內在492 nm讀取吸光度。所獲得的吸光度數值，相對可溶的scFv 2H1之濃度予以繪圖以及阻斷展示scFv的噬菌體與經固定的VEGF的結合之50%(IC50)所需要的濃度係以μg/ml來計算。此值為不同的選殖株對於抗原之親和性的相對的指標。較高的IC50值對應於較高的親和性。表2亦為了比較的目的而顯示關於展示scFv 2H1之原始的噬菌體的IC50值。展示帶有經突變的CDR3序列於重鏈內之scFv的噬菌體之新的選殖株之中，命名為3F3、3E3和4D8的該等具有關於人類VEGF之最高的相對親和性。此等值比展示scFv 2H1之原始的噬菌體所獲得的值為更高6倍和10倍之間。此等選殖株的VH序列命名為H6(序列辨識編號1代表鹼基序列及序列辨識編號4代表演繹胺基酸序列)、H5(序列辨識編號2代表鹼基序列及序列辨識編號5代表演繹胺基酸序列)，以及H7(序列辨識編號3代表鹼基序列及序列辨識編號6代表演繹胺基酸序列)。
表3顯示出由庫#2所單離的選殖株之輕鏈變異區(VL)的CDR3核苷酸序列所演繹之胺基酸序列。21個選殖株的序列分析展現出13個為不同的，以及看見各別聚集5個、3個和3個選殖株之3個重複的模式。表3亦顯示出IC50值，其敘述抑制如同以上所說明之ELISA測試內與塗覆人類VEGF的固體表面之結合所需要的原始可溶的scFv 2H1的濃度。本表為了比較的目的顯示出展示scFv 2H1的原始的噬菌體之IC50值。最高的IC50值對應於命名為1B1、1H2、2F6和1H3之選殖株。此等值比展示scFv 2H1之原始的噬菌體所獲得的值為更高23倍和30倍之間。
考慮到實施例2的2個的表內報告的序列和IC50，實行分析於VL CDR3內製造可能的新突變，俾以增加進一步對於抗原之相對親和性。決定維持序列RLSY(x)LAR，由於其於4個最佳的IC50選殖株的3個中為恆定的，以及集中突變於此序列的第5個位置。考慮到此等特定的殘基之特徵，及是否其等出現於此位置上的之或是不在其他的選殖株內，關於此位置上的突變之計劃的新胺基酸為P、D或是E。
一種相似於實施例1a中說明的該者之2步驟的PCR，係利用選殖株2F6的DNA作為模板以及合成的寡核苷酸作為引子而使用來製造此等新的突變體。
關於新的片段之選殖，噬質體載體2H1-F和新的PCR帶之連續的消化係以相似於實施例1b中說明的程序來實行之。三個新的重組載體係各別予以轉形以及選擇出各個轉形的5個菌落代表物。由各個樣品來純化DNA以及驗證所欲的突變之存在。獲得高純度的DNA以及使用來各自地電穿孔大腸桿菌TG1細胞，細胞接而用M13輔助噬菌體予以感染。生成的噬菌體係如同於此相同的實施例中以上說明的予以純化以及測試來決定IC50。
各個新的噬菌體選殖株之IC50值，其敘述於此相同的實施例中在以上所使用的相似的ELISA測試內所判定的抑制噬菌體與塗覆有人類VEGF的固相的結合之50%所需要的原始可溶的scFv 2H1的濃度，係顯示於表4中。為了比較的目的也包括展示scFv 2H1之原始的噬菌體的值。亦顯示其他的先前說明的選殖株。最高的IC50值相應於新的選殖株L3，其比展示scFv 2H1之原始的噬菌體的IC50值為更高73倍。
限制消化和選殖的程序係如同以上所說明的來執行，來獲得3個新的抗體片段，其等組合編碼來自選殖株L3的基因(gen)之VL(同樣地命名為L3；序列辨識編號7代表核苷酸序列以及序列辨識編號8代表演繹胺基酸序列)與已經於實施例2中提及的、編碼以下重鏈的該等基因：H6(序列辨識編號1代表核苷酸序列以及序列辨識編號4代表演繹胺基酸序列)、H5(序列辨識編號2代表核苷酸序列以及序列辨識編號5代表演繹胺基酸序列)以及H7(序列辨識編號3代表核苷酸序列以及序列辨識編號6代表演繹胺基酸序列)。XL 1-Blue MRF′電穿孔勝任細胞係各別用此等3個新的重組質體予以轉形以及從各者挑選5個獨立的菌落且使其生長來獲得DNA。在確認正確的序列之後，使用此等質體來各自地電穿孔TG1大腸桿菌細胞，其等接而用輔助噬菌體M13K07予以感染來生產噬菌體。噬菌體係如同實施例2中說明的予以純化以及使用於ELISA來評估IC50。
表5顯示出各個新的噬菌體選殖株的IC50值，其敘述如同以上所說明之於ELISA內抑制噬菌體與塗覆有人類VEGF的固相之結合所需要的可溶的scFv 2H1抗體片段的濃度。高的IC50值且因而更好的抗原辨識對應於新的選殖株L3H6。
載體pACR.1為一種經設計用表現抗體片段至大腸桿菌的周質之質體(第1圖)。作為首要的元素，其具有一LacZ啟動子、一訊息胜肽、關於插入編碼基因的片段之NcoI和Not I限制位址、編碼c-myc胜肽的一區域，以及編碼6個組胺酸的一序列，後者用於IMAC純化。對應於編碼展示的scFv抗體片段L3H6、L3H5和L3H7之噬質體的DNA係使用作為三個個別的PCR反應的模板。此等程序係使用ProofStart(Stratagene)酵素以及遵循製造商的用法說明來實行。表6中之合成的寡核苷酸係使用作為引子。
由三個擴增獲得預期尺寸(700 bp)的帶，其等係使用QIAquick Gel Extraction套組(QIAGEN)而由1%瓊脂糖凝膠來純化。不同的DNA係用Nco I和Not I(Promega)限制酵素來消化，以及再純化用於接合。pACR.1載體同樣地予以消化和再純化，以及經消化的帶係使用T4 DNA連接酶(Promega)各自接合至載體。接合反應產物係藉由電穿孔而用來轉形大腸桿菌勝任細胞(XL-1Blue;Stratagene)。經轉形的細胞係予以平盤培養於固態選擇性培養基中以及生長於37℃。所使用的方法為廣泛地知道的(Sambrook,Fritsch y Maniatis. 1989 Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition)。
質體DNA係由不同的轉形之菌落來純化(QIAGEN DNA Plasmid MiniPrep套組)，藉由限制酵素消化來檢查插入的基因，以及經由轉形的數個菌落之質體係使用與pACR.1載體的選殖區雜合之引子予以自動的DNA定序。一致序列關於scFv L3H6為序列辨識編號9、關於scFv L3H5為序列辨識編號11以及關於scFv L3H7為序列辨識編號13。此等序列敘述該等片段為編碼VH-連結子-VL-c myc-組胺酸。此等建構物的質體代表物命名為pACR.1-scFv L3H6、pACR.1-scFv L3H5以及pACR.1-scFv L3H7。
BL21大腸桿菌勝任細胞係用質體pACR.1-scFv L3H6、pACR.1-scFv L3H5以及pACR.1-scFv L3H7予以轉形。
轉形係平盤培養於選擇性固態培養基之內以及允許在37℃下生長歷時16小時。各建構物的菌落代表物係生長於液態培養基內以及於600 nm OD等於1誘導歷時12小時添加1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖哌喃糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopiranoside)(IPTG)至培養基。使細胞離心以及培養上清液係於耦合的緩衝劑內(NaH2PO4 50mM,300mM NaCl,pH 7-8)透析以及直接且各自地應用至Agarose-NTA(QIAGEN)。在用咪唑10 mM清洗而排除污染物之後，結合的蛋白係用250 mM咪唑予以洗提。
所獲得的區分部分係藉由12% SDS-PAGE和西方墨點予以評估，後者使用接合至過氧化酶之9E10單株抗體，其會辨識此等蛋白具有之c-myc衍生的胜肽。第2圖闡明，就抗體片段scFv L3H6來說，此等程序的結果。第2A圖，徑2，顯示出含有抗體片段之高純度的洗提，其遷移接近29kDa。第2B圖顯示出經純化的蛋白係藉由9E10單株抗體於免疫化學上辨識的。
Nunc 96-井Maxisorp免疫平盤係用人類VEGF-A之同質體121和165(Peprotech)、小鼠VEGF(Peprotech)和P64K-VEGFKDR-(Morera,Y.，等人2008. Angiogenesis 11(4): 381-393)，以配於PBS內之1 μg/ml的濃度，於4℃塗覆歷時16小時。P64K-VEGFKDR-為一種於大腸桿菌內生產的重組蛋白，其為人類VEGF的代表物，其係於殘基82、84和86上突變來降低其與VEGFR2受體(KDR)的交互作用。在用PBS-脫脂乳4%封阻平盤之後，將稀釋於PBS-脫脂乳4%之內的scFv L3H6、L3H5、L3H7和2H1抗體片段以濃度10 μg/mL予以添加以及於22℃孵育歷時1h。在數次清洗之後，添加接合至過氧化酶的9E10單株抗體歷時1小時。在清洗之後，結合至固相的片段係藉由添加受質溶液來偵測。於一微量平盤讀數器內在492 nm讀取吸光度。一種無關的抗-HBsAg scFv使用一陰性對照(Ayala,M.等人1995. Biotechniques 18: 832-842)。
表7顯示出抗體片段scFv L3H6、scFv L3H5和scFv L3H7有關於scFv 2H1具有不同的辨識模式，以及實現更高的吸光度數值(在492 nm)(三個井的平均，拿由陰性對照所生產的作為參考)。此為對於人類抗原較高的親和性之指示。
使用ELISA競爭系統，吾人評估純化的抗體片段scFv L3H6、scFv L3H5、scFv L3H7以及scFv 2H1阻斷人類VEGF-受體以及VEGF重組受體VEGFR2(KDR)和VEGFR1(FLT-1)之間的交互作用之能力。分析係根據藉由添加遞增濃度的片段之可溶的受體KDR-Fc和FLT-1-Fc與吸附至固體表面的人類VEGF-A的結合之抑制作用。
Nunc 96-井Maxisorp平盤係用配於PBS內之1 μg/ml的濃度之人類VEGF-A之同質體121(Peprotech)於4℃塗覆歷時16小時。平盤係予以封阻、清洗，以及井係用遞增的濃度之(高至70 μg/mL)純化的抗體片段scFv L3H6、scFv L3H5、scFv L3H7和scFv 2H1予以孵育，或是PBS-leche al 4%，以及連同0.5 μg/mL的可溶的受體KDR-Fc(R&D)或是FLT-1-Fc(R&D)。一種無關的抗-HBsAg scFv係使用一陰性對照(Ayala,M.等人1995. Biotechniques 18: 832-842)，以及Fab片段Lucentis(雷珠單抗)作為抑制對照。結合至固相內的人類VEGF-A之KDR-Fc或是FLT-1-Fc可溶的受體係用接合至過氧化酶(Sigma)的抗人類IgG抗體來偵測。就KDR-Fc(VEGFR2)來說，如同第3A圖中顯示的，抗體片段scFv L3H6、scFv L3H5和scFv L3H7阻斷受體與結合固相的人類VEGF-A之結合，伴隨清楚的劑量依賴性。抗體片段scFv L3H6、scFv L3H5和scFv L3H7之抑制值係比相同的實驗中用參考scFv 2H1抗體片段所觀察到的該等為更高得多的。
就FLT-1-Fc(VEGFR1)來說，如同第3B圖中顯示的，抗體片段scFv L3H6、scFv L3H5、scFv L3H7和scFv 2H1不會阻斷該受體的結合至人類VEGF-A，而雷珠單抗會。
抗體片段scFv L3H6、scFv L3H5、scFv L3H7和scFv 2H1關於人類VEGF之結合親和性係使用BIAcore-X(BIAcore,Sweden)來測量。一種CM5感測器晶片係依據製造商的用法說明，使用N-乙基-N′-[3-二甲基胺基丙基]碳二亞胺-鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺(N-hidroxysuccinimide)(NHS)，經由人類VEGF的共價結合而予以活化。將人類VEGF的同質體165(PeproTech)稀釋至5 μg/ml於10 mmol/l醋酸鈉緩衝液(pH 5.5)內，以及以5 μl/min的流速來注射以獲得大概290個反應單位的耦合蛋白。
關於動力學測量法，經純化的片段scFv L3H6、scFv L3H5、scFv L3H7和scFv 2H1的連續稀釋製備物係注射於HBS緩衝液(10 mmol/l HEPES，150 mmol/l NaCl，3 mmol/lEDTA，0,005% of P20表面活性劑，pH 7.4)中於25℃以及以25 μl/min的流速。
使用BIA評估3.2軟體來計算動力學參數和平衡解離常數(KD)。結合資料係總體地調整成朗謬1:1的結合模型。所獲得的KD係顯示於表8中。
此等結果展現出抗體片段scFv L3H6、scFv L3H5和scFv L3H7以比抗體片段scFv 2H1為更高5和20倍之間的親和性來辨識人類VEGF-A。
第4圖為質體pFabHum-1的示意圖示，使用來生產可溶的Fab抗體片段於經轉形的大腸桿菌之周質和培養基內。該載體具有一LacZ啟動子、一RBS、一SP序列、輕鏈變異區的選殖位址(Sal I y Avr II)，和編碼一種人類免疫球蛋白Cλ區域的序列，接著另一個RBS、SP，和重鏈變異區的選殖位址(Apa LI y Bst EII)，接著編碼一種人類免疫球蛋白CH1區域的序列，其已經延伸以包括人類IgG1 Fc樞紐區域的第一個半胱胺酸(cisteine)。使重鏈變異區-CH1表現聯合用於IMAC純化之6個組胺酸區域，以及用於分析的目的之c-myc胜肽，兩者都於該載體中提供於C端內。
編碼抗體片段scFv L3H6、scFv L3H5和scFv L3H7之噬質體DNA首先用Apa LI和Bst EII酵素予以消化來獲得對應的VH區域。在驗證1.5%瓊脂糖內之凝膠的大小之後，三種VH係分別地選殖於pFabHum-1內，用相同的酵素予以預消化。一旦經由限制酵素分析來驗證選殖，便複製中間質體(命名為pFab-RVH6、pFab-RVH5和pFab-RVH7)，純化以及接受用Sal I和Avr II酵素之新的消化。在驗證1.5%瓊脂糖內之凝膠的大小之後，編碼抗體片段scFv L3H6之噬質體係用Sal I和Avr II酵素來消化以獲得獨特的VL區域L3，其接而選殖於經消化的質體pFab-RVH6、pFab-RVH5和pFab-RVH7內。一旦經由限制酵素分析來驗證選殖，便複製三種生成的質體(命名為pFab L3H6、pFab L3H5和pFab L3H7)、純化以及接受自動的DNA定序。DNA序列，其編碼組成抗體片段Fab L3H6、Fab L3H5和Fab L3H7之2個成熟的蛋白鏈(於重鏈內沒有6個組胺酸和c-myc區域)，各別地相應於序列辨識編號15和序列辨識編號16、序列辨識編號19和序列辨識編號20，以及序列辨識編號23和序列辨識編號24。此等Fab抗體片段的演繹胺基酸序列係各別地說明於序列辨識編號17和序列辨識編號18、序列辨識編號21和序列辨識編號22，以及序列辨識編號25和序列辨識編號26之中。
BL21大腸桿菌勝任細胞係用pFab L3H6、pFab L3H5和pFab L3H7予以轉形。轉形係平盤培養於選擇性固態培養基之內以及允許於37℃生長歷時16小時。各建構物的菌落代表物係生長於液態培養基內以及於600 nm OD等於1，藉由添加IPTG至培養基來誘導Fab的表現。使細胞離心且培養上清液係於耦合的緩衝劑內透析以及直接且各自地應用至Agarose-NTA(QIAGEN)。在用清洗而排除污染物之後，結合的蛋白係用250 mM咪唑予以洗提。
關於電泳的研究使用2個條件。於第一個狀況中，樣品係孵育於帶有β-巰基乙醇的電泳緩衝液內，以來產生還原。於第二個狀況中，沒有使用β-巰基乙醇。第5A圖顯示出純化和西方墨點的結果(連同還原的樣品和抗c-myc 9E10抗體用於顯影)。於SDS-PAGE中，Fab的兩鏈都可以看見(徑2)具有大概28-30 KDa。於西方墨點中，只有偵測到Fab重鏈，因為其含有c-myc(徑3)。於第5B圖中，可以看見接受不還原的樣品。SDS-PAGE顯示出對應於Fab的帶，具有大概50kDa(徑1)，其係於西方墨點中使用9E10接合的單株抗體(徑2)來辨識。
經純化的抗體片段Fab L3H6、Fab L3H5和Fab L3H7係於ELISA內評估關於人類VEGF-A的辨識，使用作為參考Fab 2H1-32(WO2008/052489 A1)。Nunc 96-井Maxisorp免疫平盤係用人類VEGF-A之同質體121和165(Peprotech)、小鼠VEGF(Peprotech)和P64K-VEGFKDR-(Morera,Y.,等人2008. Angiogenesis 11(4): 381-393)，以配於PBS內之1 μg/ml的濃度，於4℃塗覆歷時16小時。在用PBS-脫脂乳4%封阻平盤之後，將稀釋於PBS-脫脂乳4%之內的Fab抗體片段以濃度10 μg/mL予以添加，以及於22℃孵育歷時1h。在數次清洗之後，添加接合至過氧化酶的9E10單株抗體歷時1小時。在清洗之後，結合至固相的片段係藉由添加受質溶液來偵測。於一微量平盤讀數器內在492 nm讀取吸光度。一種無關的Fab，由抗人類EGF受體抗體尼妥珠單抗的酵素消化所衍生的，亦也命名為hR3(Boland,W. K y Bebb,G. 2009. Expert Opin. Biol. Ther. 9(9): 1-8)。
表9顯現出抗體片段Fab L3H6、Fab L3H5和Fab L3H7具有不同於Fab 2H1-32的辨識模式，以及展示出更高的吸光度數值(492 nm；三個井的平均)，拿由陰性對照所生產的作為參考，全部其等的為對於人類抗原更好的親和性之指示。
為了獲得類抗體分子scFv2-Fc L3H6、scFv2-Fc L3H5和scFv2-Fc L3H7，使用質體pACR.1-scFv L3H6、pACR.1-scFv L3H5及pACR.1-scFv L3H7作為模板以及顯示於表10中之合成的寡核苷酸來執行PCR，以修飾編碼此等抗體片段之DNA序列使得其相容於下列的選殖。此程序係依據製造商的用法說明用KOD DNA聚合酶(Novagen)來執行。
將PCR擴增的DNA序列選殖至pVSJG-HucFc載體之內。此載體(第6A圖)係設計用於表現一多肽(polypetide)鏈於哺乳動物細胞內，該多肽含有以此次序：來自一種鼠的單株抗體的重鏈訊息胜肽，接著scFv編碼序列，由10個胺基酸分隔開(其作用為一間隔子)一致序列編碼來自人類IgG1免疫球蛋白的樞紐、CH2和CH3區域。由於訊息胜肽，此多肽鏈指向內質網，該處經由於樞紐區域形成共價的雙硫鍵以及CH2和CH3區域的互補性結合而發生二聚合。樞紐、CH2和CH3區域形成一種人類免疫球蛋白Fc區域，其係經由其之N-端連同2個完全相同的scFv聯合而成為一種二價類抗體分子(第6B圖)。
PCR擴增的片段係用Afl II和Xba I限制酶予以消化以及各自選殖至pVSJG-HucFc載體之內。自動的DNA定序確認了選殖的產物之同一性。編碼所生成的三個成熟的蛋白scFv2-Fc L3H6、scFv2-Fc L3H5以及scFv2-Fc L3H7之核苷酸序列係各別地說明於序列辨識編號27、序列辨識編號29、序列辨識編號31之內，而演繹胺基酸序列係各別地說明於序列辨識編號28、序列辨識編號30、序列辨識編號32之內。
質體pVSJG-HucFc L3H6、pVSJG-HucFc L3H5和pVSJG-HucFc L3H7係於無內毒素的條件下使用Pure Yield Plasmid Midiprep套組(Promega)予以純化。CHO細胞(EACC Cat. No. 85050302)係使用SuperFect(QIAGEN)以此等質體予以轉染。轉染瘤係於含有G418作為抗性標識之培養基進行選擇。由伴隨G418生長的轉染瘤菌落所獲得之細胞培養上清液係藉由ELISA予以評估。Maxisorp 96井平盤(Nunc)係用人類VEGF121(Peprotech)予以塗覆。將稀釋於PBS-2%脫脂乳之內的上清液添加至平盤以及scFv2-Fc抗-VEGF分子係用接合至過氧化酶(Sigma)的抗人類Fc抗體予以偵測。具有更高的分泌位準，經由ELISA偵測的，之scFv2-Fc抗-VEGF分子之轉染瘤細胞菌落係藉由於含有G418之培養基內限制性稀釋而重複地選殖以及總是藉由ELISA來測試其之分泌能力。在至少2個連續選殖之後，獲得生產類抗體分子之三個穩定的選殖株係，命名為scFv2-Fc L3H6、scFv2-Fc L3H5 y scFv2-Fc L3H7。
於含有0.5%胎牛血清之培養基內在162 cm2燒瓶內培養生產scFv2-Fc L3H6、scFv2-Fc L3H5和scFv2-Fc L3H7分子的轉染瘤選殖株。在得到高的細胞密度之後收集(colected)上清液，1:1稀釋於pH 7.0的0.1 M磷酸氫二鈉緩衝液之內，以及接而scFv2-Fc分子係藉由使用蛋白A sepharose fast flow 4(Amersham)之親和力層析術予以純化。不同的scFv2-Fc分子係各自用pH 4.0的0.2 M甘胺酸緩衝液予以洗提，以及立即(inmediatly)用pH 10.0的1 M Tris中和。於PBS內透析(dialisis)之後，蛋白濃度係藉由在280 nm之吸光度測量(messurement)來計算。純度係藉由12% SDS-PAGE來估計。經純化的分子之樣品係藉由係如同(a)中所說明的ELISA來測試，與未經純化的上清液相比較，顯示出對人類VEGF-A之適合的辨識活性。
為了獲得且展示人類VEGF121突變體首先根據分子的三維結構分析(PDB: 1FLT)，已報告的其他抗體所辨識之區域的位置以及人類VEGF和鼠VEGF之間的差異，來選擇殘基用作突變。用作突變的殘基係顯示於表11中。
突變係使用合成的寡核苷酸(表12)藉由PCR來生產，合成的寡核苷酸會雜交於人類VEGF121之N端和C端編碼序列以及於引進所欲的突變之特定的區域。
執行一種2步驟的PCR來引進突變，其使用含有人類VEGF121作為模板之質體pVEGF(Ojalvo,A. G.等人2003. Electronic J. Biotechnol. 6,208-222)，以及KOD DNA聚合酶酵素(Novagen)。於第一個步驟中，根據熱穩定的聚合酶酵素製造商的用法說明於15個週期的反應內使用對末端之互補性寡核苷酸(VEGF-FOR或VEGF-BACK)，藉由與對應(M-BACK或M-FOR)之反應來配對，每突變體。於第二個PCR中，來自步驟1之2個先前的反應之混合物係使用作為各個突變體的模板。使用來引進突變之寡核苷酸(M-BACK y M-FOR)係稀釋1:100，以及連同對末端之互補性寡核苷酸(VEGF-FOR或VEGF-BACK)一起使用。DNA擴增的片段係各自使用QIAquick管柱(Qiagen)予以純化以及接而在4小時的期間用ApaL I和Not-I HF(NEB)予以雙重地消化。在反應用QIAquick管柱(Qiagen)純化和於水中洗提之後，經消化的DNA片段係予以選殖於事先用相同的酵素消化之pHG-1m載體內(Rojas,G.等人2004. J. Immunol. Meth. 293: 71-83)，在1小時的期間用磷酸酶(NEB)來處理(trated)以及使用相同的管柱從瓊脂糖凝膠來純化。pHG-1m載體內之選殖的基因係展示於絲狀的噬菌體的表面上如同蛋白III融合。於接合反應之中使用1：5載體：帶比率和T4連接酶(NEB)於16℃歷時12小時。
TOP 10 F1’細胞(Invitrogen)係各別用突變體之各個接合予以轉形，平盤培養於含有胺芐青黴素的選擇性LB培養基之內以及於37℃孵育歷時24小時。5個菌落係選自於各個突變體以及生長於5 ml培養物內，俾以使用質體Miniprep套組(Qiagen)來純化質體。DNA係予以定序以及驗證所欲的突變之存在。獲得足夠的材料用於噬菌體的表現研究。
TG1大腸桿菌電穿孔勝任細胞係各別用編碼各個突變體的噬質體予以轉形。編碼野生型(WT)VEGF以及編碼一種無關的(NR)蛋白之噬質體亦包括於此實驗中作為對照。經轉形的細胞係用M13K07予以感染來生產噬菌體。純化噬菌體以及使用於ELISA內來評估以下不同的抗-VEGF抗體之各者的辨識：貝伐單抗、兔多株抗體(pAb)以及scFv L3H6抗體片段。96井平盤係用配於PBS內之10 μg/mL之此等抗體於4℃塗覆16小時的期間。在用PBS-4%脫脂乳封阻平盤之後，將展示於噬菌體之上的突變體或野生型VEGF添加至平盤以及孵育1小時的期間。平盤係用PBS-0.1 % Tween 20溶液予以清洗以及結合的噬菌體係用一種接合至過氧化酶(Amersham-Pharmacia)之抗-M13抗體在1小時的期間予以偵測。再一次清洗平盤以及用受質溶液來顯影反應。在20 min之後，用1M H2SO4來終止反應以及於一微量平盤讀數器內在492 nm測量吸光度。
表13顯示出關於各個抗-VEGF抗體以三個井的平均吸光度數值來表達的，對抗展示於噬菌體上不同的突變體，WT-VEGF或是NR蛋白之免疫反應性。
於表中13突變體M2(R56E)和M10(R56A)係以灰色格來強調，其導致所測試的三種抗體之辨識的減損。已知道此胺基酸於人類VEGF和其他的家族成員，例如PLGF和PDGF，之結構的完整性扮演著極其重要的角色(Keyt,B.A.等人1996. J. Biol. Chem. 271: 5638-5646)。此等突變體係使用作為實驗中有關該分子全部的結構之減損的內部對照。於相同的表13中對應於突變體：M11(K101R)、M22(E103A)、M23(R105A)以及M24(Y25A)的數據以粗體和斜體字來強調。此等突變顯著地影響scFv L3H6抗體片段的辨識，然而於相同的實驗中所使用之兔子獲得的抗-VEGF多株抗體或是擬人化的治療抗體貝伐單抗，之辨識不受影響。
此等結果指示出人類VEGF上由scFv L3H6抗體片段和由其所衍生之其他的重組抗體(Fab L3H6和scFv2-Fc-L3H6)所界定之新的功能抗原決定位的；於本發明中所說明的，確切地具有殘基K101、R103、E105及Y25作為關鍵性的胺基酸。
第7圖顯示出使用PyMol軟體所獲得的人類VEGF-A二聚合分子上之表面殘基的示意圖示。於此圖示中以深灰色來強調2個二聚合分子的一者內之胺基酸K101、R103、E105以及Y25，其等對於本發明中所說明之新的重組抗體之抗原辨識為關鍵性的(crtitical)。
使用PyMol軟體所獲得之人類VEGF-A二聚合分子的圖示顯示出胺基酸K101、R103、E105以及Y25於該分子具有良好的溶劑暴露之區域內界定出一構形群集。
分子scFv L3H6、scFv L3H5、scFv L3H7、scFv2-Fc L3H6、scFv2-FcL3H5以及scFv2-FcL3H7的活體外抗增殖作用係於人類臍帶靜脈內皮細胞(HuVEC)的模型中，用人類VEGF來刺激而判定。使用抗體scFv 2H1和scFv2-Fc 2H1-8.2(WO2008/052489 A1)作為參考，以及使用scFv抗-HBsAg(Ayala,M.等人1995. Biotechniques 18: 832-842)和尼妥珠單抗(Center for Molecular Immunology,Havana)作為陰性對照，使用可溶的KDR-Fc a 1 μg/mL(Sigma)作為抑制對照。
簡言之，事先用1%明膠(Sigma)塗覆的96-井培養平盤(Costar)的每井之3,000個HuVEC細胞(PromoCell GmbH)係予以平盤培養於補充以1%(v/v)胎牛血清(Gibco)之RPMI 1640培養基內、生長在37℃於5% CO2內在72小時的期間。細胞係用只有10 ng/mL的人類VEGF-A(Peprotech；生長對照任意定義為100%)來刺激，或是用10 ng/mL的人類VEGF-A和40 μg/mL的scFv片段來刺激，或是10 μg/mL的二價分子來刺激。於實驗的終止，細胞用配於20%甲醇之0.5%結晶紫來染色。平盤係用水予以清洗以及風乾。染色係用配於0.1M檸檬酸鈉之1:1溶液的乙醇來洗提以及於一平盤讀數器內在562 nm讀取吸光度。把基礎的細胞增殖之吸光度數值視為100%。由各個測試分子的作用所衍生的吸光度數據係有關於最大的增殖對照而估計如百分比。此等增殖的值，有關於100%，為一假定的分子抑制用人類VEGF來刺激的HuVEC細胞之生長的能力之指示。如同第8A圖(關於分子scFv L3H6、scFv L3H5和scFv L3H7)，以及第8B圖(scFv2-Fc L3H6、scFv2-Fc L3H5和scFv2-Fc L3H7)中顯示的，本發明的重組抗體目標以所使用的劑量來抑制HuVEC細胞的增殖。由各類型的重組抗體(scFv或二價分子)所產生的抑制係優於由相等劑量的抗體片段scFv 2H1或二價分子scFv2-Fc 2H1 8.2所產生的抑制。大體而言，二價分子於阻斷VEGF接近細胞受體為更有效的以及，結果，以較低的劑量抑制HuVEC細胞的增殖。
二價分子scFv2-Fc L3H6、scFv2-Fc L3H5和scFv2-Fc L3H7的活體內之抗血管生成作用係於Passaniti等人(Passaniti A等人1992. Lab Invest. 67:519-28)所說明之實驗模型中研究。為了比較，使用二價抗體型分子scFv2-Fc 2H1 8.2(WO2008/052489 A1)。於此模型中，血管生成係於促血管生成因子的存在下經由C57B1/6小鼠(CENPALAB,Habana)用細胞外基質(Matrigel,Becton Dickinson)的蛋白萃取物來皮下接種而誘導。將動物分配成10隻的群組以及和於腹部的區域內皮下注射500 μL的Matrigel，其含有200 ng的人類VEGF(Peprotech)，100 μg的測試分子，包括無關的抗體(CB-Hep.1，抗-HBsAg，Heber Biotec,Havana)，或是10 μg的KDR-Fc(Sigma)，作為抑制對照。在6天之後，將動物犧牲，萃取Matrigel小丸，以及各者的血紅素含量係依據製造商的用法說明而使用Drabkin’s試劑套組(Sigma)藉由Drabkin方法來決定。分子scFv2-Fc L3H6、scFv2-Fc L3H5和scFv2-Fc L3H7 2顯著地(p<0.001)抑制Matrigel小丸內由人類VEGF所誘導的血管形成，此與血紅素含量的降低有關聯。所達成的抑制值為比由重組抗體scFV2-Fc 2H1 8.2所產生的該等為3倍更高，如同於第9圖內可以看見的。
由腫瘤和一些腫瘤基質細胞所誘導的血管生成對於腫瘤生長及散播為必要的。此促血管生成作用之主要的媒介者為由此等細胞元素所生產的VEGF。因為此，使用於分析抗血管生成物質的模型為動物體內之腫瘤生長抑制的模型。因為此專利中所說明之新的抗體較佳為識別人類VEGF，所以小鼠體內之腫瘤生長模式是將人類腫瘤細胞接種至同基因型無胸腺小鼠(裸鼠；nu/nu)來實行。於實驗中，吾人使用5組的8-10週年齡大之5隻BALB/c品系(CENPALAB,Havana)nu/nu無胸腺小鼠。治療組分配在重組抗體scFv2-Fc L3H6、scFv2-Fc L3H5和scFv2-Fc L3H7之中，重組分子scFv2-Fc 2H1-8.2(WO2008/052489 A1)作為參考，y以及抗HBsAg CB-Hep.1鼠單株抗體(Heber Biotec,Habana)作為陰性對照，全部以配於PBS pH 7.2內之2.5 mg/kg的劑量。小鼠用1.5x107人類A673腫瘤細胞(ATCC,CRL 1598)皮下注射於右背區域內。此高的細胞接種體，連同使用的治療劑量係用來迅速地展現出不同的測試抗體之抗腫瘤效力的差異。當腫瘤達到200 mm3的體積時，使小鼠隨機化成5隻的5個群組，以及隨著指示而開始各實驗組的治療。在3週的期間每2天以200 μL的體積來實行腹膜內投藥。腫瘤生長的追蹤係使用數位卡尺用最高的(長度)，和最小的(寬度)腫瘤直徑之測量來實行。腫瘤體積係計算為：腫瘤體積(mm3)=0.52×長度(mm)x寬度2(mm)。沿著觀察的期間之腫瘤體積係使用單因子ANOVA stadigraph以及Bonferroni事後測試來比較。在建立的治療期間之後，將動物犧牲且將腫瘤外科移除以及使用蘇木精(Hematoxiline)和曙紅來組織分析。
如同第10圖中顯示的，用scFv2-Fc L3H6、scFv2-Fc L3H5和scFv2-Fc L3H7予以接種的全部動物有關於陰性對照顯示出幾乎總體的腫瘤生長之控制。圖示也顯示出本發明的目標之新重組抗體有關於重組抗體scFv2-Fc 2H1 8.2於效能上為較好的。組織分析顯示出用scFv2-Fc L3H6、scFv2-Fc L3H5和scFv2-Fc L3H7予以治療的動物腫瘤於血管密度有顯著的降低，血管直徑的降低，腫瘤細胞凋亡的增加，以及有絲分裂像的降低。
為了決定scFv L3H6片段進入相應於A673細胞的腫瘤生長之區域的能力，將此片段，和陰性對照(鼠類抗肝炎B表面抗原scFv；scFv-Hep.1；Ayala,M.等人1995. Biotechniques 18: 832-842)使用Iodogen程序(Fraker PJ,Speck JC Jr. 1978. Biochem Biophys Res Comm 80:849-857)來標記131I(Amersham,UK)用於各別為1.51 MBq/5 μg和1.55 MBq/5 μg之最終的專一活性。
放射性標誌的產物係於薄層層析法來分析以偵測併入至蛋白內，各別為93和95%的放射性之報告值。放射性標誌的產物偵測其等對應的抗原(人類VEGF和HBsAg)之能力係於一系統內研究，該處聚苯乙烯免疫試管係用人類重組VEGF之同質體121(5 μg/mL;Peprotech)，或是重組HBsAg(5 μg/mL;Heber Biotec,Havana)予以塗覆，接而封阻，以及放置與對應的專一性之放射性標誌的片段的樣品接觸，調整成理論上可以被固相捕獲的量。在孵育和清洗之後，吾人判定固相關於scFv L3H6和the scFv-Hep.1各別能夠結合87.3%和84.5%的放射性，顯示出放射性標誌的程序沒有重要地改變片段的生物活性。
為了研究生物分布，吾人使用30隻nu/nu小鼠。動物係用A673培養株之5x106人類腫瘤細胞皮下接種於右背區域內。當腫瘤達到約300 mm3的體積時，使動物隨機化成5隻動物的6個群組以及開始治療。小鼠係用放射性標誌的產物(15隻用scFv L3H6以及15隻用scFv Hep.1)經由尾部靜脈來注射，以及在24、48，和72小時之後各個產物犧牲5隻每個群組。腫瘤、脾臟、肝臟、腎臟、腸、肌肉、骨髓以及血液係藉由外科移除或是取樣。放射性之積累係表達為每克組織之注射的劑量之百分比。使用注射劑量之標準的樣品來實行校正。放射性係使用閃爍γ計數器來測量。
表14顯示出從此等組織內進行的測量來計算之腫瘤：血液的放射性比率。實驗顯示出於24和72小時之間的，scFv L3H6片段優先地定位於腫瘤組織內，不同於非專一的scFv Hep.1片段。於不同於腫瘤之其他的組織內發現放射性標誌的scFv L3H6之非專一的沈積；在48小時的注射之後。
各個比率係由從5隻小鼠重新獲得的組織所衍生的平均值來計算。此等結果暗示scFv L3H6可以專一地定位存在有大的局部濃度之人類VEGF之解剖學上的區域，以及因而有用於專一地運送不同的治療產物至此區域，如放射性同位素或是最後一藥物或毒素。
至於實驗性脈胳膜新血管形成(CNV)的模型，吾人使用由Krzystolik等人(Krzystolik M.G.,等人2006. Acta Ophthalmol,120:338-346)所報告的該個模型。供養六隻石蟹獼猴(Macaca fascicularis,CENPALAB,Havana)以及根據機構的優良實驗動物操作規範來操作。全部的程序均用克他明鹽酸鹽(ketamine hydrochlorate)、馬來酸乙烯丙嗪(acepromazine maleate)，以及阿托品硫酸鹽之肌肉內的注射使動物麻醉。也使用丙對卡因鹽酸鹽(proparacaine hydrochlorate)之局部的麻醉。在摘出之前麻醉以及用靜脈內戊巴比妥鈉實行安樂死。CNV膜係使用氬雷射燒傷於斑內誘導，確保該程序產生一氣泡和小的出血，用介於50和100 μm之間的作用點。使用攝影術和螢光血管造影來偵測且測量損害的擴展和特徵。在不同的日子檢查動物的眼睛，在施用片段和安慰劑以及雷射燒傷程序之前和之後，以及於實驗的終止，其以摘出和動物犧牲作為終止。
動物分配成3隻的2個群組，根據要研究的分子：scFv L3H6抗體片段或是免疫球蛋白類型scFv2-Fc L3H6的二價分子。各動物的右邊眼睛根據群組經由玻璃體內的注射來接受配於50 μL的PBS內之300 μg的scFv L3H6或是scFv2-Fc L3H6，然而左邊眼睛只有注射載體。眼睛在雷射治療之前接受2次的注射(第0和14天)。於第21天，全部的眼睛接受雷射治療用於誘導CNV。各個眼睛在第2天用專一的產物或是載體來重複注射。在雷射誘導三週之後(第42天)，動物接受玻璃體內的注射，此次全體根據群組而用scFv L3H6片段或是scFv2-Fc L3H6分子，於第56天以最終的相似注射作為終止。
於治療的第I期(在第42天之前)，研究顯示出投藥scFvL3H6或是scFv2-Fc L3H6的眼睛內之第4級損害的開始降低，與各自的對照眼睛相比，其等之全部暗示著該等分子有助於CNV之預防。於治療的第二期中，當全部的眼睛接受scFv L3H6或是scFv2-Fc L3H6時，吾人偵測到第4級損害之降低，其暗示著該片段和二價分子對於已確立的損害也是有益的。
第1圖. 使用於大腸桿菌周質與培養上清液內生產可溶的scFv片段之pACR.1質體的示意圖示。該載體具有一個LacZ啟動子、一個核糖體結合位址(RBS)，以及pelB訊息胜肽(SP)。
第2圖. (A)帶有使用IMAC來純化scFv L3H6抗體片段的結果之12% SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，從用質體pACR.1 scFv L3H6予以轉形的大腸桿菌BL-21細胞之上清液來開始；樣品用β-巰基乙醇製備於裝載緩衝液中。徑1：分子量標記；徑2：用250 mM咪唑之洗提顯示出相應於該片段之電泳帶，具ca. 29 kDa。(B)使用抗c-myc抗體9E10來顯影的電泳的複製品之西方墨點。
第3圖. 競爭ELISA來評估不同濃度的抗體片段scFv L3H6、scFv L3H5和scFv L3H7阻斷受體VEGFR2(KDR-Fc)和VEGFR1(FLT-1-Fc)的可溶形式接近吸附至固相之人類VGF-A的能力。結合的可溶受體之偵測係使用接合HRPO的抗人類IgG抗體來進行。(A) KDR-Fc之阻斷。使用scFv 2H1片段作為參考以及一種抗-HBsAg無關的scFv作為陰性對照。(B) FLT-1-Fc之阻斷。使用抗-HBsAg無關的scFv作為陰性對照以及Fab片段Lucentis(雷珠單抗)作為抑制對照。
第4圖. 使用於大腸桿菌周質與培養上清液內生產可溶的Fab片段之質體pFabHum-1的示意圖示。該載體具有一個LacZ啟動子、一個核糖體結合位址(RBS)，以及pelB和p3M13訊息胜肽(PS)於各個的表現卡匣內，連同恆定人類免疫球蛋白區域CH1或是C λ。
第5圖.(A) 帶有使用IMAC來純化Fab L3H6抗體片段的結果之12% SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，從用質體pFabHum-1 Fab scFv L3H6予以轉形的大腸桿菌BL-21細胞之上清液來開始；樣品用β-巰基乙醇製備於裝載緩衝液中。徑1：分子量標記。徑2：Fab的之二鏈為可看見的，具ca. 28-30 KDa.徑3：使用抗c-myc抗體9E10來顯影的電泳的複製品之西方墨點。只有辨識出含有c-myc區域之Fab重鏈。(B)樣品係製備於沒有β-巰基乙醇(沒有還原)的裝載緩衝液中之。徑1：Fab帶為明顯的，具ca. 50 kDa。徑2：使用抗c-myc抗體9E10來顯影的電泳的複製品之西方墨點。
第6圖.(A)質體pVSJG-HucFc的示意圖示，係藉由選殖介於Afl II和Xba限制位址之間的scFv片段基因而使用於生產“類抗體的”的二價分子。(B)在一旦scFv基因已經選殖於載體內，以此質體轉染之後由哺乳動物細胞所生產之本類型的分子之示意圖示。
第7圖. 人類VEGF-A之溶劑暴露的(表面)殘基的圖示，使用PyMol程式。2個二聚合分子鏈係以白色和淺灰色來代表。於白色鏈內，有關於由本發明中所說明的重組抗體所辨識的抗原決定位之關鍵性的胺基酸K101、R103、E105以及Y25已經以深灰色來強調。可以看見此等係於分子的一區域內界定出顯示良好的溶劑暴露之“群集”或構形分組。
第8圖. 抗體片段(A) scFv L3H6、scFv L3H5，和scFv L3H7，以及二價重組抗體(B) scFv2-Fc L3H6、scFv2-Fc L3H5和scFv2-Fc L3H7阻斷人類VEGF-A對於人類臍帶靜脈內皮細胞(HuVEC)的增殖之刺激作用的能力。使用抗體片段scFv 2H1和二價重組抗體scFv2-Fc 2H1 8.2作為參考。圖形顯示出當將含有：40 μg/mL之抗體片段(A)，或是10 μg/mL之二價分子(B)的樣品添加至細胞時，有關於添加VEGF和沒有抗體(100%)之增殖相對值。陰性對照為一種無關的抗-HBsAg scFv和抗-EGF受體擬人化的抗體尼妥珠單抗(Nimotuzumab)。使用可溶的KDR-Fc作為抑制對照。各個長條代表由組做出之三個複製品的平均值，連同其之對應的標準偏差。
第9圖. 於C57Bl/6小鼠體內之二價重組抗體scFv2-Fc L3H6、scFv2-Fc L3H5和scFv2-Fc L3H7干擾Matrigel皮下小丸中所含有的人類VEGF-A之血管生成刺激作用的能力。使用一種無關的抗-HBsAg單株抗體作為陰性對照。使用可溶的KDR-Fc作為抑制的對照。使用二價分子scFv2-Fc 2H1 8.2作為參考。於實驗的終止，Matrigel小丸的內含物對於血紅素加工來評估新血管之相對量。圖形呈現有關於添加VEGF和沒有抗體之相對的血紅素濃度值(100%)。各個長條代表各組所包括的動物之平均值，連同其之對應的標準偏差。
第10圖. 2,5 mg/kg的體重劑量之二價分子scFv2-Fc L3H6、scFv2-Fc L3H5、scFv2-Fc L3H7及scFv2-Fc 2H1 8.2的腹膜內注射，對於由接種人類腫瘤細胞株A673至裸鼠所衍生的皮下腫瘤的生長之作用。曲線內的點為關於每組5隻動物所估計的平均腫瘤值。使用相同劑量的無關的CB-Hep.1單株抗體作為陰性對照。
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Claims (21)
- 一種重組抗體，其包含：i)重鏈變異區，其係由選自於由序列辨識編號1、序列辨識編號2和序列辨識編號3之序列所構成之群組的核苷酸序列所編碼，和由核苷酸序列之序列辨識編號7所編碼的輕鏈變異區，或ii)重鏈變異區，其係選自於由胺基酸序列之序列辨識編號4、序列辨識編號5和序列辨識編號6所構成的群組，和具有序列辨識編號8之胺基酸序列的輕鏈變異區。
- 一種重組抗體，其識別人類血管內皮生長因子A(VEGF-A)內之功能性抗原決定位，其中該胺基酸殘基K101、R103、E105和Y25對於抗體-抗原交互作用為重要的。
- 如申請專利範圍第2項之重組抗體，其包含：i)由核苷酸序列之序列辨識編號1所編碼之重鏈變異區和由核苷酸序列之序列辨識編號7所編碼之輕鏈變異區，或是ii)由胺基酸序列之序列辨識編號4所組成之重鏈變異區，和由胺基酸序列之序列辨識編號8所組成之輕鏈變異區。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之重組抗體，其干擾人類VEGF-A之不同的同質體(isoforms)的活體外刺激作用，以及活體內的促血管生成作用(pro-angiogenic effects)。
- 如申請專利範圍第1至4項中任一項之重組抗體，其為單鏈Fv(scFv)型之抗體片段。
- 如申請專利範圍第5項之重組抗體，其：i)係由一核苷酸序列所編碼，該核苷酸序列係選自於由序列辨識編號9、序列辨識編號11和序列辨識編號13所構成的核苷酸序列之群組；或是ii)具有一胺基酸序列，其係選自於由序列辨識編號10、序列辨識編號12及序列辨識編號14所構成的群組。
- 如申請專利範圍第1至4項中任一項之重組抗體，其為Fab型之抗體片段。
- 如申請專利範圍第7項之重組抗體，其：i)係由核苷酸序列對所編碼，該等核苷酸序列對係選自於由序列辨識編號15和序列辨識編號16、序列辨識編號19和序列辨識編號20，及序列辨識編號23和序列辨識編號24所構成的群組，作為其等之二鏈，或是ii)係由胺基酸序列對所構成，該等胺基酸序列對係選自於由序列辨識編號17和序列辨識編號18、序列辨識編號21和序列辨識編號22，以及序列辨識編號25和序列辨識編號26所構成的群組，作為其等之二鏈。
- 如申請專利範圍第1至4項中任一項之重組抗體，其係為scFV2-Fc型，其中scFv片段係經由間隔子而連結至人類免疫球蛋白的樞紐、CH2和CH3恆定區域，以其之蛋白質形式共價地結合至另一個完全相同的多肽鏈來形成一個二聚合分子。
- 如申請專利範圍第9項之重組抗體，其：i)係由一核苷酸序列所編碼，該核苷酸序列係選自於由核苷酸序列序列辨識編號27、序列辨識編號29和序列辨識編號31所構成的群組；或是ii)具有一胺基酸序列，其係選自於由序列辨識編號28、序列辨識編號30及序列辨識編號32所構成的群組。
- 如申請專利範圍第9項之重組抗體，其中該人類免疫球蛋白之Fc恆定區域係IgG1、IgG2、IgG3或是IgG4型。
- 如申請專利範圍第1至4項中任一項之重組抗體，其中編碼該重鏈變異區之該等核苷酸序列之序列辨識編號1、序列辨識編號2或序列辨識編號3，及編碼該輕鏈變異區之序列辨識編號7，係被包含於編碼二個多肽鏈的序列內，一者為該重鏈變異區，其接著一人類IgG1免疫球蛋白之恆定區域CH1、樞紐、CH2和CH3，以及第二者為該輕鏈變異區，其接著人類C κ或是C λ恆定區域。
- 如申請專利範圍第12項之重組抗體，其中該人類免疫球蛋白恆定區域係IgG2、IgG3或是IgG4型。
- 一種重組抗體，其為如申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體的等效變異體。
- 如申請專利範圍第1至14項中任一項之重組抗體，其係額外地與放射性同位素、化學劑或生物製劑接合。
- 如申請專利範圍第1至14項中任一項之重組抗體，其係於重組細菌內或於哺乳動物的細胞內產生。
- 一種載體，其編碼申請專利範圍第1至14項中任一項所含有之重組抗體，其係藉由重組DNA基因操作所獲得的，其係為能夠合併入宿主細胞中的載體、質體或是序列。
- 一種藥學組成物，其包含申請專利範圍第1至14項中任一項之重組抗體。
- 如申請專利範圍第18項之藥學組成物，其特徵在於可以控制方式釋放。
- 一種如申請專利範圍第1至14項中任一項之重組抗體之供用於製造藥物的用途，該藥物係用於發展出血管生成增量之主體的免疫療法，如惡性腫瘤和其轉移、急性的和慢性的發炎過程、自體免疫過程，以及眼睛疾病如老年性黃斑部退化。
- 一種如申請專利範圍第1至14項中任一項之重組抗體供用於製造放射性藥品的用途，該放射性藥品係藉由成像技術而用於活體內惡性腫瘤和其轉移的診斷。
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