TW201237169A

TW201237169A - Culture method to obtain and maintain a pure or enriched population of mammalian neural stem cells and/or neural progenitor cells that are prone to differentiate into oligodendrocyte-lineage cells in vitro

Info

Publication number: TW201237169A
Application number: TW101101245A
Authority: TW
Inventors: Tsuneo Kido
Original assignee: Tsuneo Kido
Priority date: 2011-01-12
Filing date: 2012-01-12
Publication date: 2012-09-16
Also published as: PL2663638T3; MX364742B; PH12013501496B1; TWI586805B; AU2012206411B2; PH12013501496A1; NZ611902A; SG191729A1; EP2663638A1; NZ712598A; MY173219A; KR20140071512A; ES2732938T3; AU2012206411A1; US8993320B2; CA2821065A1; CN109749996A; WO2012095730A1; US20120177614A1; EP2663638B1

Description

201237169 六、發明說明： t 明戶斤肩*标々貝】發明領域本發明普遍關於神經幹細胞及神經祖源細胞之細胞生物學領域。更特別的是，本發明提供一種在體外易於分化為寡樹突膠質細胞-族系細胞之哺乳類神經幹細胞及/或神經祖源細胞的純或增富族群’其合適於使用在生物學研究、藥物篩選及人類治療。相關申請案之相互參照本申請案係與2011年1月12日所提出的美國暫時性專利申請案案號61/431,944及在2011年11月u日所提出的 61/558,527相關。與聯邦贊助的研究或發展有關之說明不適用。 L ^ 發明背景在中樞神經系統發展期間，原始、多潛能神經幹細胞 (NSC)增生，引起祖源細胞短暫分裂，其最終分化成構成成人腦的多種細胞型式。成人中樞神經系統主要由神經元及神經膠細胞（其包括星形細胞及寡樹突神經膠質細胞）組成。神經元、星形細胞及寡樹突神經膠質細胞的祖源細胞相繼地源自於在成長中腦中之神經幹細胞（參見第1圖）。神經元祖源細胞首先形成及分化成許多型式的神經元。其次，星形細胞成長及作用為支撐神經元存活。最後，寡樹 201237169 大·膠質祖源細胞開始顯露且遍及中樞神經系統遷移。然後，它們分化成成熟的募樹突神經膠質細胞，其產生適合的神經元功能所需要之髓鞘。因為券樹突神經膠質細胞在支援中拖神經系統上扮演重要角色，寡樹突神經膠質細胞或其前期細胞（即，寡樹突膠質前祖源細胞及/或寡樹突膠質祖源細胞）之純或增富族群將對諸如在神經性疾病之治療中的細胞治療及再生藥有用，包括先天性髓鞘脫失病（例如，克拉培氏(Krabbe)病或豕族性腦中葉硬化症（penzaeus_Merzbacher disease))、脊趙損傷及在髓鞘（其絕緣神經細胞）中產生缺陷的其它症狀。這二細胞亦可使用來研究及鑑別用來治療許多神經性疾病 (諸如多發性硬化及精神分裂症）的新型藥物。成熟的寡樹突神經膠質細胞在培養時不增生且無法良好地存活，直接從組織獲得足以使用在研究或人類治療之寡樹突神經膠質細胞量的能力極困難。結果，由於這些細胞缺乏可用度，將寡樹突神經膠質細胞使用於這些目的受阻礙。此問題的解決之一包括從組織獲得神經幹細胞及/或神經祖源細胞，在培養中擴展細胞以獲得足夠大量的細胞，其隨後可分化成寡樹突神經膠質細胞。分化可活體外或活體内（諸如，在移殖的情況中）發生。此將產生大族群的 I樹突神經膠質細胞或其祖源細胞或前祖源細胞，用以使用於研究及人類治療。但是’科學家已努力鑑別出准許長時間培養寡樹突膠 201237169 質袓源細胞及/或前祖源細胞（特別是來自人類或非人類靈長類動物）及其大量擴展之培養條件’其中所產生已擴展的細胞族群主要由保留分化成寡樹突神經膠質細胞的能力之細胞組成。一些科學家已報導從大白鼠獲得寡樹突膠質袓源細胞 ((瑞夫(Raff)等人，J. iVewmsci·. ’ 3 : 1289，1983 ;瑞夫等人，自然(Nature)，3〇3 : 390 ’ 1983 ;愛思賓諾沙狄洛斯莽泰若斯(Espinosa de los Monteros)等人，iVoc.論".dScA ί/ϋ ’ 90 : 50，1993)。這些增生性寡樹突膠質祖源細胞已知為0-2A祖源細胞，此係因為其活體外分化成寡樹突神經膠質細胞或型式2星形細胞之能力。其它科學家已鑑別出在原始培養中的大白鼠或老鼠寡樹突膠質前祖源細胞((加洛（Gallo)，阿姆斯壯（Armstrong)RC，J.〜㈣仙·.，15 : 394， 19% ;葛林斯潘(Grinspan)，法蘭斯趣尼(Franceschini)B， ·/·纰_仙·. i?es.，41 : 540，1995 ;戴克(Decker)等人，M〇/ Ce//· ’ 16 : 422，2000)。已認為這些細胞係寡樹突膠質祖源細胞的先驅，且因為其優異的遷移能力（如與寡樹突膠質祖源細胞比較）’預計其在細胞治療上更有益。不幸的是，科學家尚無法活體外有效地擴展這些細胞一段長時間。比較上，科學家已報導使用經B104調理的媒質或生長因子組合(諸如⑴衍生性血小板生長因子_AA(pDGF_AA) 與驗性纖軸織母細财制子(bFGF級性f gf)及神經營養因子·3(ΝΤ_3)，或(ii)PDGF_AA與睫狀神經營養性因子 (CNTF)及NT-3)培養來自大白鼠的視神經或脊趙的〇2A祖 201237169 源細胞。但是，無人已成功地使用這些生長因子大量擴展來自靈長類動物組織的這些細胞型式。因此，仍然非常難以獲得及擴展一來自除了大白鼠或老鼠外的哺乳類之純或增富的寡樹突神經膠質細胞及/或其前期細胞族群。特別難以獲得及擴展來自人類及非人類靈長類動物的這些細胞。因此，對產生在體外易於分化成寡樹突膠質細胞-族系細胞之哺乳類神經幹細胞或祖源細胞的純或增富族群之方法存在有重大需求。 I：發明内容3 發明概要本發明係關於一種經分離可擴展的人類神經細胞，其中該細胞係祖源細胞或幹細胞，其中該細胞維持其分化成神經元、星形細胞及寡樹突神經膠質細胞的能力，其中該細胞遍及隨後的繼代有效率地維持其分化成寡樹突膠質細胞族系細胞的能力，及其中該細胞表現出至少細胞表面抗原 CD133及CD140ot。本發明亦關於一種活體外培養一可擴展的神經細胞之方法，其中該細胞係一分離自哺乳類中樞神經系統的祖源細胞或幹細胞，其中該細胞維持其分化成神經元、星形細胞及寡樹突神經膠質細胞的能力及其有效率地分化成寡樹突膠質細胞-族系細胞的能力，其中該方法包括從人類胎兒神經組織分離及解離出至少一種細胞；在溫度37°C下，於包含1-20% 02及5% C02的環境中及在化學限定的無血清培養媒質中培養該細胞，其中該媒質包含至少5奈克/毫升 6 201237169 PDGF-ΑΑ、至少0.5奈克/毫升bFGF及至少1〇丨_硫甘油，及繼代該細胞以獲得可擴展的人類神經細胞。本發明進一步關於—種治療由髓朝喪失或募樹突神經膠質細胞喪失所造成的絲之方法，其包括將—治療有效 ®包含經分離可擴展的人類神經細胞之組成物給藥至患者，其中該細胞能夠維持其分化成神經元、星形細胞及寡樹突神經膠質細胞的能力，其中該細胞遍及隨後的繼代有效率地維持其分化成寡樹突膠質細胞族系細胞之能力，及其中s玄細胞表現出至少細胞表面抗原(：1)133及CD丨4〇α。本發明亦關於-種活體外培養包含至少一種經分離從哺乳類中_經減獲得的神經細胞，其帽該細胞浸沒於化學限定的無血清培養媒質中，其中該媒f具有至少5奈克/毫升PDGF-AA、至少5奈克/毫升bFGF及至少1〇 _ ^ 硫甘油。别於一種包含一經分離可擴展的人類神經細胞之醫藥用神經幹細胞組成物。本發明額外關於—醫藥用神經幹細胞組成物之用途，其使用在藥劑中以治療一症狀。本發明亦關於-種活體外培養及擴展從哺乳類中拖神經系統分離出之神經幹細胞及/或神經袓源細胞的方法，其中該經培養及祕的細胞_其分化絲錢料細胞· 族系細胞之能力。在本發明中的細胞培養係-種黏附培養。本發歧步m能分離已擴展的哺乳類神經幹切經㈣細胞（喊增富_，其在體外易於分 7 201237169 化成寡樹突膠質細胞-族系細胞（即，具有蜘蛛網形態的〇4_ 陽性細胞，如顯示在第7圖及第15圖中）。再者，本發明係關於經由活體外擴展及分化從哺乳類中樞神經系統分離之神經幹細胞及/或神經祖源細胞的哺乳類寡樹突膠質細胞-族系細胞。圖式簡單說明第1圖描出神經幹細胞及神經祖源細胞發展成在腦中的三種主要細胞型式，神經元、星形細胞及寡樹突神經膠質細胞；第2圖顯示出多種CNS細胞的標識表現性之比較；第3圖係以幻燈片A-F描出人類胎兒幹細胞（殖株#2b) 的對比影像；第4圖闡明HFSC細胞（殖株#2b)於不同生長因子組合存在下之擴展速率；第5圖闡明高劑量PDGF-AA(100奈克/毫升）及1-硫甘油在HFSC細胞（殖株#2b)之增生上的效應；第6圖闡明HFSC細胞（殖株#2b)的生長曲線；第7圖係以幻燈片A-F描出HFSC細胞於無血清媒質中之自發性分化；第8圖係以倒立式顯微鏡所擷取之相位對比影像，其顯示出HFSC細胞（殖株#3)在多種繼代時之形態；第9圖闡明HFSC細胞（殖株#3)之生長曲線；第10圖係以倒立式顯微鏡所擷取的相位對比影像，其〇在幻燈片A-F中顯示出HFSC細胞（殖株4A及4B)於多種繼代 201237169 時之形態；第11圖闡明HFSC細胞（殖株#4A及#4B)的生長曲線；第12圖係以幻燈片A-S闡明未分化的HFSC細胞之免疫表現型；第13圖顯示出流動式細胞測量術資料，其在幻燈片A-H 中闡明未分化的HFSC細胞（殖株#2b，繼代13)之比例；第14圖闡明已分化的HFSC細胞（殖株#3，繼代15)之免疫表現型；及第15圖係以幻燈片A-E闡明HFSC細胞（殖株#2b，繼代 15)的分化潛力。圖式詳細說明第1圖描出神經幹細胞及神經祖源細胞發展成在腦中的三種主要細胞型式，神經元、星形細胞及寡樹突神經膠質細胞。實心箭頭指示線指示出一種細胞型式進展至另一種。從HFSC細胞至神經元限制性先驅細胞(NRp)的虛線指示出HFSC細胞具有較低變成神經元命運的趨勢。從HFSc 細胞至02A細胞的粗黑線指示出HFSC細胞具有較大產生寡樹突膠質細胞-族系細胞的趨勢。HFS(^^胞分化成神經元、星形細胞及寡樹突膠質細胞的多潛力顯示在實施例7中 (參見第14圖）。H F S C細胞分化成寡樹突膠質細胞_族系細胞的趨勢顯示在實施例2(參見第7圖）及實施例8(參見第15圖）中。第2圖顯示出多種CNS細胞的標識表現性之比較。本發明在實施例7中揭示出HFSC細胞之表現型（參見第12圖及 201237169 第13圖）及以此圖形總整理出其。如晚後所討論，HFSC細胞不與任何其它細胞型式相同且具有神經幹細胞及寡樹突膠質細胞型式-2星形細胞祖源(〇2A)二者特徵。第3圖係在幻燈片A-F中描出人類胎兒幹細胞（殖株#2b) 之對比影像。第3圖幻燈片A係以倒立式顯微鏡所擷取的相位對比影像，其顯示出HFSC細胞（殖株#2b)係在培養器中以包含麩醯胺酸與HEPES之DMEM/F12培養，且以B27補充品 (因維錯俊(Invitrogen)™)、非必需胺基酸⑽从)(因維錯俊TM)、 1·5πιΜ丙酮酸鹽（因維錯俊ΤΜ)、55μΜβ·巯基乙醇(因維錯俊TM) 及1 mM N-乙醯基-L-半胱胺酸（西格瑪（Sigma))(於此之後，其組合指為“HFSCM1媒質”)與20奈克/毫升pDGF_AA&1〇奈克/毫升bFGF補充，其中該培養器維持在37。匸、5〇/。〇2及 5¾ C〇2下。所顯示出的細胞係來自繼代〇，第7天。該等細胞形成球狀物，且在繼代1時，將這些球狀物直接平板培養到塗佈聚鳥胺酸之培養板上而沒有解離球狀物。第3圖幻燈片B及幻燈片C係以倒立式顯微鏡所擷取的相位對比影像，其顯示出HFSC細胞（殖株#2b)係如在於此上述的第3圖幻燈片A之說明中所描述般培養。所顯示出的細胞係各別來自繼代1 ’第1天及繼代2，第14天。將該等細胞直接平板培養到所接附的塗佈聚鳥胺酸之培養板上及從球狀物敷開（第3圖，幻燈片B)〇該等繼代細胞可在此培養條件下於隨後的繼代中成功地擴展（第3圖，幻燈片c)。第3圖幻燈片D-F係以倒立式顯微鏡所擷取的相位對比影像，其顯示出在多重繼代後及在培養器中於HFSCM1. 201237169 質與100奈克/毫升PDGF-AA、10奈克/毫升bFGF、10奈克/ 毫升IGF-1及50 μΜ 1-硫甘油中培養（其中該培養器維持在 37°C ' 5% 02及5% C02下）的HFSC細胞（殖株#2b)。大部分 HFSC細胞係相位暗而與週圍細胞團化的細胞。與該團簇分開的散亂細胞趨向於自發性分化成突起生育 (process-bearing)多極性細胞(所謂的“换蛛網狀”形態），其係原寡樹突膠質母細胞或未成熟的寡樹突膠質細胞之特徵 (由在第3圖幻燈片D及E中之白色箭頭指示出），但是其顯露頻率通常少於1%。顯示在第3圖幻燈片D、E及F中之細胞係各別來自繼代8，第8天；繼代11，第11天；及繼代19，第 11天。第4圖闡明HFSC細胞（殖株#2b)於不同生長因子組合存在下之擴展速率：（1) : 20奈克/毫升PDGF-AA+10奈克/毫升 bFGF ; (2) : 20奈克/毫升PDGF-AA+10奈克/毫升 bFGF+5 奈克/毫升NT-3 ; (3) : 20奈克/毫升PDGF-AA+10奈克/毫升 bFGF+ΙΟ奈克/毫升IGF];⑷：2〇奈克/毫升pDGF AA+1〇奈克/毫升bFGF+5奈克/毫升NT-3+10奈克/毫升IGF-卜在繼代3的第11天時採集細胞(p3D11)並計數在每種條件下的活細胞數目。然後，在相同細胞密度下，在與繼代3所使用之相同條件下繼代其。在繼代4的第8天時採集細胞(P4D8)並計數在每種條件下的活細胞數目（在它們變成次群集（因為其開始形成球形）前採集這些細胞）。條件(4)在繼代3時最有效，但在繼代4時則否。條件(3)在二繼代皆有效。第5圖闡明高劑量的PDGF_AA(1〇〇奈克/毫升)及丨_硫甘 201237169 油在HFSC細胞（殖株#2b)之增生上的效應；其於下列生長因子組合存在下，在HFSCM1媒質中培養：（1) : 20奈克/毫升 PDGF-AA+10奈克/毫升bFGF+ΙΟ奈克/毫升igF-Ι ; (2) : 20 奈克/毫升PDGF-AA+10奈克/毫升bFGF+ΙΟ奈克/毫升 IGF-1+50 μΜ 1-硫甘油；（3) : 100奈克/毫升pdgF-AA+10 奈克/毫升bFGF+ΙΟ奈克/毫升IGF-1 ; (4) : 1〇〇奈克/毫升 PDGF-AA+10奈克/毫升bFGF+ΙΟ奈克/毫升IGF_1+50 μΜ ^ 硫甘油；（5): 100奈克/毫升PDGF-AA+10奈克/毫升bFGF+50 μΜ 1 -硫甘油*在繼代5的第7天時採集細胞(在它們變成次群集前（因為它們開始形成球形’如它們在繼代4時般)採集這些細胞），並計數在每種條件下的活細胞數目。亦測試2〇奈克/毫升PDGF-AΑ+10奈克/毫升bFGF之組合，但是所回收的細胞數目太低而無法評估（少於1χ1〇4細胞，其在可計數的 I巳圍下）及其資料從此圖形中消除。條件（1)可在繼代3時擴展細胞’但是在繼代5時無法擴展細胞。加入5〇 μΜ 1-硫甘油[條件(2)]或將PDGF-ΑΑ濃度增加至1 〇〇奈克/毫升[條件 (3) ]在擴展速率上具有非常些微的正效應。當結合加入5〇 μΜ 1-硫甘油且將PDGF-ΑΑ濃度增加至1〇〇奈克/毫升[條件 (4) ]時，細胞擴展速率戲劇性地改善且細胞可成功地擴展。當從此條件中消除IGF-1時[條件(5)]，擴展速率減少至d，此指示出IGF-1亦促進HFSC細胞增生及/或存活。第6圖顯示出人類HFSC細胞（殖株#2b)的生長曲線（空心圓與黑線）。HFSC細胞（殖株#2b)初始於1〇奈克/毫升 PDGF-ΑΑ及10奈克/毫升bFGF存在下培養。從繼代3時加入 12 201237169 10奈克/毫升IGF-1。從繼代6時將PDGF-ΑΑ濃度從20奈克/ 毫升增加至100奈克/毫升。但是，它們在細胞的擴展速率上具有非常些微或無效應。從繼代7時加入50 μΜ 1-硫甘油。HFSC細胞（殖株#2b)於1〇〇奈克/毫升PDGF-AA、10奈克 /毫升bFGF、10奈克/毫升IGF-1及5〇 μΜ 1-硫甘油存在下開始快速生長。在繼代17時加入1〇奈克/毫升ΝΤ-3。ΝΤ-3提高細胞生長少許，但是其效應在一繼代後消失。此專題討論小組亦包括在繼代10的第6天時(Ρ10第6天：空心圓與虛線）及繼代11的第11天時(Ρ11第11天：空心圓與點線)所冷凍的人類HFSC細胞（殖株#2b)之生長曲線。經冷凍的細胞在解凍後可以類似的速度擴展。第7圖係在幻燈片A-F中描出HFSC細胞於無血清媒質中之自發性分化。幻燈片A及B係以倒立式顯微鏡所擷取的相位對比影像，其顯示出HFSC細胞（殖株#2b)在繼代12第9 天時的形態改變（第7圖，幻燈片A及B)，其中該影像係在 HFSCM1媒質中培養’以20奈克/毫升pDGF_aa、10奈克/ 毫升bFGF、10奈克/毫升IGF-1及50 μΜ 1-硫甘油（第7圖，幻燈片Α)或沒有1-硫甘油（第7圖，幻燈片Β)補充後取得。HFSC 細胞在改變媒質間沒有再補充bFGF而自發性分化。甚至在相同條件下’若每天再補充bFGF時，HFSC細胞不分化且似乎慢慢生長。此外’當使用40奈克/毫升或較高的pDGF-AA 時’ HFSC細胞的分化受阻擋及形成團簇。藉由將pDGF_AA 的濃度從100奈克/毫升減少至20奈克/毫升且不再補充 bFGF，s亥專細胞可自發性分化成具有给蛛網狀形態之突起 13 201237169 生育多極性細胞，其表現出04抗原（第7圖，幻燈片C及D) 及/或GalC抗原（第7圖，幻燈片e及F)，一種寡樹突膠質細胞 -族系細胞的限定特徵[即，原寡樹突膠質母細胞(〇 4 -陽性及 GalC-陰性）、未成熟寡樹突膠質細胞（04-陽性及GalC-陽性)]。第8圖係以倒立式顯微鏡所擷取的相位對比影像，其顯示出HFSC細胞（殖株#3)在多種繼代時的形態。習知的神經幹細胞於bFGF及EGF存在下15天初始地擴展（參見第8圖，幻燈片A在繼代0的第15天時）。在此之後，於培養器中以 HFSCM1媒質與2〇奈克/毫升pdGF-ΑΑ及10奈克/毫升bFGF 培養該等細胞，其中該培養器維持在37°C、5% 02及5% C〇2。從繼代4時將PDGF-ΑΑ濃度增加至1〇〇奈克/毫升及加入10 奈克/毫升IGF-1(參見第9圖）。從繼代8時加入50 μΜ卜硫甘油（參見第9圖）。在數個繼代後，其形態變成幾乎與殖株#2b 相同。第9圖顯示出人類HFSC細胞（殖株#3)之生長曲線（空心圓與黑線）〇HFSC細胞(殖株初始於1〇奈克/毫升EGF^1〇奈克/毫升bFGF存在下培養，以擴展習知的神經幹細胞。然後，從繼代1時將該生長因子組合改變成2〇奈克/毫升 PDGF-ΑΑ及10奈克/毫升奸〇!?。從繼代2時加入1〇奈克/毫升 IGF-1及10奈克/毫升NT-3。根據顯示在第4圖中的資料，從繼代4時，從此培養物中移除NT-3且將PDGF-ΑΑ的濃度從 20奈克/毫升增加至1〇〇奈克/毫升。但是，如在殖株“b中所顯示，它們在細胞擴展速率上具有非常些微或無效應。從 14 201237169 繼代5時加入50 μΜ 1-硫甘油，然後，於100奈克/毫升 PDGF-AA、10 奈克 / 毫升 bFGF、10 奈克 / 毫升 IGF-1 及 50μΜ 1-硫甘油存在下，HFSC細胞（殖株#3)開始快速生長，如 HFSC細胞（殖株#2b)般。此專題討論小組亦包括在繼代1〇的第7天時所冷凍之人類HFSC細胞（殖株#3)的生長曲線 (P10第7天：空心圓與虛線）。該冷凍細胞可在解凍後以類似速度擴展。第10圖係以倒立式顯微鏡所擷取的相位對比影像，其在幻燈片A-F中顯示出HFSC細胞（殖株4A及4B)的多種繼代之形態。在培養器中，以HFSCM1媒質及50 μΜ 1-硫甘油與 2〇奈克/毫升PDGF-AA、20奈克/毫升bFGF及2〇奈克/毫升 IGF-1(殖株#4A)或100奈克/毫升PDGF-AA、20奈克/毫升 bFGF及20奈克/毫升IGF-1(殖株#4B)培養該等細胞，其中該培養器維持在37t、5% 〇2及5% C02。初始時，殖株#4A成長的比殖株#4B慢，但是從繼代2起，開始以與殖株#4B約相同的速度生長。在3繼代後’殖株#2b或#3變成幾乎均質及其形態變成幾乎相同。第11圖顯示出人類HFSC細胞的生長曲線（殖株#4A :空心方形與虛線；及#4B :空心圓與黑線）。HFSC細胞（殖株 #4A)係於2〇奈克/毫升PDGF-AA、20奈克/毫升bFGF、20奈克/毫升、IGF-1及50 μΜ 1-硫甘油存在下培養。HFSC細胞 (殖株#4B)係於1〇〇奈克/毫升PDGF-AA、20奈克/毫升bFGF 及2〇奈克/毫升IGF-1及50 μΜ 1-硫甘油存在下培養。二殖株的細胞數目首先戲劇性減少及此遞減在殖株#4Α中更顯 15 201237169 著。在此細胞數量初始遞減後，它們開始快速擴展。此專題討論小組亦包括在繼代5的第6天時所冷凍之人類HFSC 細胞(殖株#4B)的生長曲線(P5第6天：空心圓與虛線）。第12圖係在幻燈片A-S中闡明未分化的HFSC細胞之免疫表現型；（殖株#2b，繼代12-16)於100奈克/毫升 PDGF-AA、10 奈克 / 毫升 bFGF、10 奈克 / 毫升 IGF-1 及 50μΜ 1-硫甘油存在下培養，及對CD133、Sox2、巢蛋白（Nstin)、 01ig2、PDGF-Roc、NG2、A2B5、PSA-NCAM、GFAP或中間絲蛋白（Vmentin)進行陽性染色。使用DAH來對比染色細胞核。這些圖形顯示出至少90%的細胞對CD133、Sox2、巢蛋白、01ig2、PDGF-Ra、NG2、A2B5及中間絲蛋白呈陽性，但是無GFAP-陽性細胞。pSa-NCAM之染色些許弱，但是仍然多於90%細胞看起來對psA_NCAM呈陽性。第13圖在幻燈片A-Η中顯示出流動式細胞測量術資料，其闡明未分化的HFSC細胞(殖株#2b，繼代13)之比例。黑線分佈圖代表同型式触及填絲色的分佈圖代表每種測試的抗原。此資料顯示出大部分的HFSC細胞係CD133_ 陽性（第13圖，幻燈片A)、CD9_陽性（第13圖幻燈片B)、 CD140CX-陽性（第13圖，幻燈片C)、NG2•陽性（第13圖，幻燈片D)、A2B5陽性（第13圖，幻燈片Ε)、〇4·陽性⑻3圖，幻燈片F)及PSA-NCAM-陽性（第u圖，幻燈片⑺。如藉由免疫細胞化學法試驗（資料無顯示），CD44呈陰性（第13圖，幻燈片H)。第14圖闡明在含血清媒質中培養31天及以識別神經元 16 201237169 (βΙΙΙ微管蛋白（tublin)、神經絲-L及MAP2)、寡樹突膠質細胞(04、MBP)及星形細胞(GFAP)的抗體，接著螢光性二級抗體染色之已分化的HFSC細胞（殖株#3，繼代15)的免疫表現型。使用DAPI來對比染色細胞核。HFSC細胞可分化成對每種標識呈陽性的細胞。為了評估神經元轴索及髓鞠的共定位，細胞係以抗βΙΙΙ微管蛋白抗體與抗MBP抗體（第14 圖，幻燈片A-C)、抗神經絲-L抗體與抗ΜΒΡ抗體（第14圖’ 幻燈片D-F)、抗ΜΑΡ2抗體與抗ΜΒΡ抗體共染色（第14圖，幻燈片G -I)。似乎僅有少數神經元轴索及髓鞘經共定位。為了評估04抗原及ΜΒΡ之共定位，細胞係以04抗體與抗 ΜΒΡ抗體共染色（第14圖，幻燈片J-L)。大部分的ΜΒΡ訊號與04抗原的信號共定位。HFSC細胞亦可分化成對GFAP抗原呈陽性的星形細胞（第14圖，幻燈片Μ-Ο)。此外，許多細胞對中間絲蛋白（其表現在許多上皮細胞中，包括星形細胞及間葉細胞）呈陽性。再者，未分化的細胞亦對中間絲蛋白呈陽性（資料無顯示）。第15圖係以幻燈片Α-Ε闡明HFSC細胞（殖株#2b，繼代 15)的分化潛力。細胞在包含麩醯胺酸及HEPES的 DMEM/F12中分化，且以B27補充品、N2補充品及50 μΜ 1-硫甘油與10奈克/毫升PDGF-AA、100奈克/毫升IGF-1、10 奈克/毫升BDNF及100 μΜ pCPT-cAMP補充。在分化4天後，該等細胞以抗GD3抗體及04抗體接著螢光性二級抗體染色。未分化的細胞表現出比寡樹突膠質袓源細胞強的〇 GD3 ’及04反之亦然（第15圖的箭頭，幻燈片A、B及C顯示 17 201237169 出未分化的細胞）。大部分已分化的細胞顯示出具有弱的 GD3信號及強的〇4信號之多極性形態，此指示出它們係寡 Μ大膠質祖源細胞或原寡樹突膠質母細胞。其它細胞型式 (例如，星形細胞及神經元）定義為GD3-陰性及04-陰性細胞之族群。第15圖’幻燈片D顯示出來自10個已分化的細胞之不同影像之每個細胞族群的比率。多於總細胞的70%分化成寡樹突膠質袓源細胞(75.8%±2.G9%)。多於總細胞的2〇% 係仍然未分化的細胞(23.5%±2.03%)。其它細胞型式係少於，細胞的1%(〇,7%边41%)β計算寡樹突膠質袓源細胞與其匕細胞型式對已分化的細胞（寡樹突膠質祖源細胞加其它細胞型式)之比率，且顯示在第15圖幻燈片E中。寡樹突膠質祖源細胞係已分化的細胞之99.服咖，㈣其它細胞型式係已分化的細胞之〇 9%±〇 56%。 C實施方式3 較佳實施例之詳細說明歧供1在體外培養及擴展分離自哺乳類中框砷經系統的神經幹細胞或神經袓源細胞，以產生 =='轉質細胞或寡樹突膠質細胞-族系二的神經幹細胞或神經袓源細胞族群之方去。神經幹細胞及神經袓源細胞二者如’神經元祖源細胞或成熟神經元)或神經膠細:二:： :胞及寡樹突神經膠質細胞)的後裔。雖(二身可更新(即’咖限=( θ 不必需)能自身更新。本發明之培養妓可產 201237169 胞族群’其可分化成寡樹突膠質細胞-族系細胞（其係寡接t突膠質祖源細胞及寡樹突神經膠質細胞），其佔已分化的細胞之至少 70%、80%、90%或95%。遍及本申請案使用下列縮寫及定義：用語“HFSC細胞”或人類胎兒脊髓衍生出的細胞指為在本發明中所描述之擴展的哺乳類神經幹細胞及/或神經祖源細胞之純或增富族群。用語“HFSCM1媒質”指為包含麩醯胺酸及HEPES且以B27 補充品（因維錯俊TM)、非必需胺基酸(NEAA)(因維錯俊tm)、 1.5 mM丙酮酸鹽（因維錯俊™)、55 μΜ β-酼基乙醇（因維錯俊™)及1 mM Ν-乙醯基-L-半胱胺酸（西格瑪）之組合補充的 DMEM/F12。用語“神經膠細胞”指為中樞神經系統的非神經元細胞及包括成熟的寡樹突神經膠質細胞、星形細胞及用於這些細胞型式之任一種或二者之定向（committed)的祖源細胞。用語“多潛能（multipotent)祖源細胞”指為具有產生多重（但是有限數目）族系之細胞的潛力之神經祖源細胞。 “多能性（pluripotency)”（衍生自拉丁文“眾多 (plurimus)”或‘‘非常多”及“能力（potentia)’’或“動力”)指為具有分化成三種胚芽層之任何一種的潛力之幹細胞：内胚層 (内部胃黏膜、胃腸道、肺）、中胚層（肌肉、骨頭、血液、泌尿生殖器）或外胚層（表皮組織及神經系統）。神經幹細胞具多潛能性及不具多能性。胚胎幹細胞具多能性及不具多潛能性。 19 201237169 “定向祖源細胞”為經定向或指定而變成特定型式的成熟細胞之祖源細胞。此係與多潛能或多能性祖源細胞對照，其中該多潛能或多能性祖源細胞具有變成二或更多種成熟細胞型式之一的潛力（諸如0-2A祖源細胞，其可依時機及環境因素而變成寡樹突神經膠質細胞或型式-2星形細胞）。 “寡樹突膠質細胞”係一種神經膠質細胞型式，其主要功能係絕緣在某些脊椎動物的中樞神經系統中之神經細胞軸索。用語“寡樹突膠質細胞-族系細胞”指為寡樹突神經膠質細胞、原寡樹突膠質母細胞及寡樹突膠質祖源細胞（例如 02A祖源細胞）。此用語不包括神經膠限制性先驅細胞或神經幹細胞。用語“寡樹突膠質祖源細胞”及“寡樹突膠質祖源”遍及本申請案可互換地使用而指為經定向以形成更多寡樹突神經膠質細胞的祖源細胞及/或後裔之細胞，其係優先於神經元或非神經學組織。除非其它方面具體指定，否則它們可 (但是不必需）具有變成其它型式的神經膠細胞（諸如型式-2 星形細胞）之能力。如於此所使用，此用語不包括寡樹突膠質前祖源細胞或神經膠限制性先驅細胞（參見第1圖）。 “寡樹突膠質前祖源細胞”係寡樹突膠質祖源細胞的前期細胞。 “原寡樹突膠質母細胞”係至有絲分裂後寡樹突神經膠〇質細胞的前期細胞。 20 201237169 在培養令“擴展，，細胞意謂著於充品之培養媒質存在下，增力。細胞數胞增生的補細胞“擴展速率，，指為在特別培養開始時的初始細胞數量。、、㈣數量除以在如於此所使用，“已擴展的 _ 胞指為衍生自經分離的神經袓源二=細皰或神經幹細 . 斤、胞或神經幹細胞且P、主 b生而產生已擴展的細胞族群少、、 / 幹細胞。、神！袓源細胞或神經讓細胞能夠在實驗室培養條件)二二分裂Μ細胞)指為的時間之技術，其議讓細跑長酵-素段, ^梅或膠原酶），然後將小數目的細胞轉移至新的^ 益中。細胞若以規則的區間繼代時可培養較長的時間，: 為其避免歧長的高細胞密度相關之過早衰老。 “生長環境”係有興趣的細胞將活體外增生、分化及成熟的環境。該環境之特徵包括培養細胞的媒f、可存: 的任何生《子或分化引發因子、及讀結構(諸如在固體表面上的基材，若存在的話）。通用技術可於下列文獻中找到在細胞生物學、蛋白質化學及才二體技術中的通用方法：蛋白質科學的現代方法（Curre =

Protocols in pr〇tein Science)(J.E.寇立根（c〇lligan)等人編輯，威利桑斯（Wiley & Sons));細胞生物學的現代方隻 (Current Protocols in Cell Biology)(J.S.玻尼發辛 21 201237169 (Bonifacino)等人，威到桑斯）及免疫學的現代方法(Current Protocols in Immunology)(J.E.寇立根等人編輯，威利桑斯）。細胞培養方法普遍描述在下列文獻中：現行版動物細胞培養：基本技術手冊（current edition of Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique)(R.I.弗雷希尼（Freshney) 等人，威利桑斯）；細胞培養的通用技術(General Techniques of Cell Culture)(M.A.哈里森(Harrison)及I.F.瑞（Rae)，康橋大學出版社(Cambridge Univ. Press))。組織培養供應及試劑可從商業供應者購得，諸如佳美工(Chemicon)®、米立波 (Millipore)®、R&D系統(R&D Systems)®、因維錯俊™、奈爾基因囊克國際(Nalgene-NuncTM International)、西格瑪亞得富（Sigma-Aldrich)TM及科細（Sciencell)。與本揭示有關聯的特別參考書包括神經科學原理 (Principles of Neuroscience)，第4版，肯豆(Kandel)等人編輯，麥克葛羅希爾（McGraw-Hill)2000 ; CNS恢復：基本科學及臨床發展（CNS Regeneration: Basic Science and Clinical Advances)，Μ_Η·圖辛斯基(Tuszynski)及J_H寇多爾 (Kordower)編輯，學術出版社(Academic Press)，1999 ;神經元：細胞及分子生物學（The Neuron: Cell and Molecular Biology) ’第3版，Ι·Β_雷未坦(Levitan)及L.K.訊克茲馬瑞克 (Kaczmarek) ’ 牛津大學出版社(Oxford U. Press)，2001 ;神經膠細胞：其在行為中的角色(Glial Cells: Their Role in Behavior)，P.R.拉明（Laming)等人編輯，康橋大學出版社， 1998 ;神經膠細胞在健康及疾病令的功能性角色（The 22 201237169

Functional Roles of Glial Cells in Health and Disease)，馬薩斯（Matsas)及薩寇帕洛斯（Tsacopoulos)編輯，普立冷出版公司（Plenum Pub. Corp) ’ 1999 :神經膠質細胞發展（Glial Cell Development) ’ 傑森(Jessen)及理查得森(Richardson)編輯，牛津大學出版社，2001 ;及鋼鐵人(Man of Steel)，阿得里安希爾（Adrian Hill)，1996。在細胞個體發育（cell ontogeny)的上下文中，形容詞“分化的”係一種相對用語。已分化的細胞係一種已比欲比較的細胞沿著發展途徑進一步前進的細胞。因此，神經幹細胞可分化成族系限制的祖源細胞。依次，這些可進一步沿著該途徑分化成細胞或至終末期的分化細胞，諸如成熟的神經元或寡樹突神經膠質細胞。本發明之已分化的細胞可根據它們是否表現出寡樹突神經膠質細胞的顯型標識特徵而標出特徵。這些細胞其可依該細胞族群的成熟度而呈現出之典型免疫細胞化學標識如下：

Sox2 :用於多能性幹細胞及神經幹細胞之標識。巢蛋白：用於神經幹細胞的標識。 CD133 :用於神經幹細胞的細胞表面標識。 PDGF-受體oc(PDGF-Rcx):衍生性血小板生長因子受體的α鏈。一種用於寡樹突神經膠質細胞及其祖源細胞的標識。 CD140a:與PDGF-Ra相同。CDi4〇a抗體識別PDGF-Rot 的細胞外區域種用於募樹突神經膠質細胞及其祖源細 23 201237169 胞的細胞表面標識β CD9 種細胞表面糖蛋白’其已知與整合素（integrins) 及匕四穿膜超豕族蛋白質（transmembrane 4 superfamily protems)複合。—種用於胚源幹細胞、神經幹細胞、寡樹突膠質細胞及間葉幹細胞之細胞表面標識。 PSA NCAM ·多唾液酸化(p〇iySiaiyiated)的神經細胞黏附分子。一種用於神經元限制性先驅細胞(NRp)、神經元祖源細胞、神經母細胞及寡樹突膠質前祖源細胞的細胞表面標識。此標識在神經膠限制性先驅細胞(GRp)中呈陰性。 A2B5 :—種用於神經膠限制性先驅細胞(GRp)、神經膠祖源細胞及寡樹突膠質袓源細胞(Ο P C)及型式2星形細胞的細胞表面標識。此細胞表面標識在神經元限制性先驅細胞(NRP)中呈陰性。 NG2 :硫酸軟骨素蛋白糖。一種用於巨噬細胞及寡樹突膠質祖源細胞的細胞表面標識。 GD3 :神經節苷酯GD3。一種用於寡樹突膠質前祖源細胞及寡樹突膠質袓源細胞的標識。 04 : —種用於寡樹突神經膠質細胞及其祖源細胞的標識。半乳糖腦苦脂（galactocerebroside)C(GalC):—種用於未成熟的寡樹突神經膠質細胞之標識。人腦髓勒驗性蛋白（myelin basic protein)(MBP): —種用於成熟寡樹突膠質細胞的標識。 CD44 : —種關於細胞交互作用、細胞黏附及遷移的“ 24 201237169 胞表面糖蛋白及一種玻尿酸受體。一種用於某些上皮細胞及星形細胞族系細胞的細胞表面標識。神經膠纖維酸性蛋白質（GFAP): 一種用於星形細胞的標識。 βΙΙΙ微管蛋白：一種用於神經元祖源細胞及神經元的標識。神經絲-L : 一種用於成熟的神經元之標識。微管相關的蛋白質2(ΜΑΡ2): —種用於成熟神經元的標識。可使用任何合適的免疫學技術來偵測組織特定的標識’諸如用於細胞表面標識的流動式免疫細胞化學法、或用於細胞内或細胞表面標識的免疫組織化學法（例如，固定細胞或組織切片）。流動式細胞測量術分析的詳細方法在加拉雀（Gallacher)等人’血液(Bl〇〇d)，96 : 1740，2000 中有提供。若在標準免疫細胞化學法或流動式細胞測量試驗中虿明顯可偵測的抗體量將黏結至抗原（選擇性在細胞回疋後及選擇性使用經標記的二級抗體或其它軛合物來放大榍記）時，細胞表面抗原的表現性定義為陽性。為了容易使拜在研究或治療上，經常有益的是最大化在該族群中具有漠樹突神經膠質細胞或其祖源細胞特徵之細胞的比例。。— 得至少5G%、6G% ' 7G%、9G%或95。/。的特定族系細胞或多種此細胞的顯型標識特徵呈陽性來鑑別）之細巧 u 對關於神經功能恢復的治療應用來說，經常^ 化該細胞族群形成其它細胞型式（特別八最" 刀化的幹細皰 25 201237169 及非外胚層族系之細胞）的能力。依應用而定，亦可優良的是’最小化神經元族系細胞及其已定向的祖源細胞或星形細胞族系細胞及其已定向的祖源細胞之比例。根據本發明的族群之污染物具有少於30%、20%、1 〇%或5%含有這些其匕型式的細胞之污染物。本發明之方法無法導致人類有機體的整體發展。本發明之方法包括在准許細胞遍及多個繼代擴展之限定的媒質中培養來自哺乳類中樞神經系統之經分離的神經幹細胞及/或神經祖源細胞。使用本發明之方法培養的細胞遍及擴展保留其分化成寡樹突膠質細胞_族系細胞之能力。使用本發明之方法所培養的細胞可繼代多於6次及擴展超過1，000倍，同時保留其隨後分化成寡樹突膠質細胞-族系細胞的能力。在某些具體實例中，產生自本發明的培養方法之擴展的細胞族群包含或可分化成在無血清培養條件下具有已分化的細胞之至少3G%、5G%、观或8()%係寡樹突膠質細胞-族系細胞的細胞族群。在較佳的具體實例中，產生自本發明的培養方法之擴展的細胞培養族群包含已分化的細胞之至少9〇%的寡樹突„細胞_族系㈣卜在較佳的具體實例中，該擴展的細胞具多潛能性^在某些具體實例中，多數擴展的細胞能在培養後分化成寡樹突膠質細胞族系細胞，其中於改變媒質間減少叩队从媒質（即，2〇奈克 /毫升PDGF-AA，較佳含有1〇奈克/毫升奸沉，含或不含別 μΜ】-硫甘油及選擇性含有至少1〇奈克/毫升咖〗)且沒有再補充四-在某些具體實例令，多數擴展的細胞能在】〇 26 201237169 奈克/毫升PDGF-AA、100奈克/毫升IGF-1、100 μΜ pCPT-cAMP及10奈克/毫升BDNF中，在包含麩醯胺酸與 HEPES的DMEM/F12中培養且以B27補充品、N2補充品及50 μΜ 1-硫甘油補充後’分化成寡樹突膠質細胞-族系細胞。使用在本發明中之經分離的哺乳類神經幹細胞及/或神經祖源細胞可從哺乳類的中樞神經系統獲得，較佳為靈長類動物，諸如（但不限於）人類◎寡樹突膠質袓源細胞及前祖源細胞已知存在於中樞神經系統的血質中。就此而論，合適於分離出使用在本發明中的細胞之來源包括（但不限於)視神經、胼胝體及脊髓。此外，經分離的幹細胞可使用在技藝中已知之方法而來自哺乳類胎兒，較佳為靈長類動物胎兒，諸如（但不限於）人類胎兒。在某些具體實例中，該經分離的幹細胞係從人類胎兒脊柱獲得之人類胎兒脊髓組織製備。在較佳的具體實例中，使用在本發明中之經分離的細胞係從8-24週妊娠年齡（較佳為12-18週妊娠年齡）之人類胎兒脊髓獲得。人類胎兒脊柱可商業購得，例如，經由公司諸如先進生物科學資源有限公司（Advanced出的denee Resources, Inc.)(阿拉米達(Aiameda) , CA，美國），其具有 IRB允許及來自供應者的知情同意書。可從脊柱解剖出脊髓組織，其中腦脊髓臈及周圍神經已移除。然後，該組織可經解離、清洗及放置在包含准許細胞增生的生長媒質之培養容器中。 ' ° 合適的培養容器可包括（但不限於）具有培養表面的培養容器，其中該培養表面具有一種聚胺基酸或其組合（例 27 201237169 如，聚離胺酸及/或聚鳥胺酸）、組織捭養塑膠、連蛋白（vitronectin)或纖維結合素處理乂板素玻在密度範311G4至1〇5細胞/平方公分下平板^㈣胞通常可度大約3xl04至5xl04細胞/平方公公π 較佳在进下。可使用聚鳥胺酸或聚離胺酸來塗佈培養容器’如先前報導般（瑞夫等人，乂 —，3:1289,簡；瑞夫等人，自然，如：39〇，· 咖；神經細胞培養方法（Pr〇t〇c〇is如价㈣丨㈣ Culture)，第3版，胡瑪娜出版社公司（Hu_a p隨，⑹)）。培養容器可以1至40微克/毫升聚鳥胺酸塗佈，較佳為2至2〇微克/毫升’更佳為5至15微克/毫升。細胞附著強度可依供應商、表面改質、培養容器的形式及特定批號而變化。可使用在技藝中已知之方法對每種培養容器來源決定最理想的塗佈物質濃度。在某些具體實例中，以1〇微克/毫升聚鳥胺酸或聚離胺酸進行二小時育成來塗佈例如來自BD法空 (BD Falcon)(史帕克斯（Sparks)，MD，美國）的容器。在某些具體實例中，可以5微克/毫升聚鳥胺酸或聚離胺酸進行 3〇分鐘育成來塗佈例如來自奈爾基因囊克國際（羅雀斯特，NY，美國）之容器》在無血清化學限定的培養媒質（其准許細胞擴展沒有促進細胞分化(例如，成神經元、星形細胞或寡樹突神經膠質細胞)）中培養從哺乳類中樞神經系統獲得之經分離的神經幹細胞及/或神經祖源細胞。該培養媒質包含基底媒質，堵如（但不限於）杜爾貝科改質的鷹媒質（Dulbecco’s Modified Eagle Medium):營養品混合物 ρ·ΐ2，1 : 28 201237169 1(DMEM/F12)(因維錯俊®)(例如，艾斯科夫(iscove)改質的杜爾貝科媒質，RPMI-1640及紐若巴梭(Neurobasal))。該基底媒質可以多種組分補充來支樓細胞健康及存活。此等組分可包括（但不限於）至少0.25°/。非必需胺基酸[NEAA(因維錯俊®) ’ 1°/。溶液，其包含100 μΜ L-丙胺酸、L-天冬醯胺酸 H20、L-天冬胺酸、L-麩胺酸、甘胺酸、L-脯胺酸及L-絲胺酸]、至少1.0 mM麵醯胺酸、至少0.5 mM丙酮酸鹽、至少 1%B27補充品（因維錯俊®)、至少0.1 mM N-乙醯基-半胱胺酸及/或至少10 μΜ β-疏基乙醇。在某些具體實例中，該基底媒質可包含NS21(如揭示在Υ.陳(Chen)等人，乂 ’ 171 : 239，2008 中）取代B27補充品。B27補充品包括牛血清白蛋白、運鐵蛋白、胰島素、孕酮、皮質固酮、三碘-I-甲狀腺原胺酸、視黃醇醋酸鹽、DL生育酚、DL醋酸生酴酯、生物素、亞麻油酸、亞油稀酸、乙醇胺、亞晒酸 Na、L-肉毒鹼、還原的麩胱苷肽、觸酶、超氧物歧化酶、 D-半乳糖及腐肉鹼。因維錯俊已揭示出其成份，但是尚未揭示出其濃度。但是，其原始調配物(B18補充品）之每種成份的濃度已揭示出。NS21已根據此訊息發展且已揭示出每種梯度的濃度。其在神經元培養中的作用和B27補充品幾乎一樣。此外，可使用NS21來培養源自於人類胚胎幹細胞之神經幹細胞及寡樹突膠質祖源細胞。因此，此補充品已認為係置換B27補充品的好候選物。在較佳的具體實例中，該培養媒質包含以下列物質補充的DMEM/F12 : 1-4 mM，更佳為2.5 mM麩醯胺酸；10-25 mM，更佳為15 mM HEPES ; 29 201237169 0. 5-2.0 mM，更佳為！ _丙綱酸鹽，}至价更佳為腿補充品·’ 〇.25_3% ’更佳為1%酿八：i 2叫M，更佳為％ —1_硫甘油；〇·1-3 mM ’更佳為1 mM Ν-乙醯基_半胱胺酸；及/或10-100 μΜ，更佳為55 _p疏基乙醇。再者，氧可促進神經袓源細胞分化。因此，為了減少細胞分化，可在卜聰生長環境中培養鱗細胞。在較佳的具體實例巾，在培養燒瓶巾，於提供抓，丨_啊更佳為5%) 02，5% C02生長環境之培養器中培養該等細胞。在建立HFSC細胞後’ s平估氧濃度的效應，但是在擴展細胞之培養條件中，分化的細胞在2〇%〇2條件下無增加（與 5% 〇2條件比較）。HFSC細胞在5% 〇2條件中之生長比在2〇% 〇2條件下快少許。氧係氧化壓力的原因且已知在齧齒目動物細胞中引發P53突變。為了減低突變風險，我們在5% 〇2 條件下保持培養HFSC細胞。該神經幹細胞及/或神經祖源細胞在更包含生長因子的培養媒質中培養，以刺激分離的細胞增生。該培養媒質可包含至少5、10、20或40奈克/毫升之衍生性血小板生長因子-AA(PDGF-AA)、至少2.5、5或10奈克/毫升的鹼性 FGF(bFGF)、及/或至少1〇、25或50 μΜ 1-硫甘油來分離該等細胞。在某些具體實例中，該培養媒質進一步包含至少 1、 5或10奈克/毫升的類胰島素生長因子_i(IGIM)。在某些具體實例中，PDGF-AA 可以 PDGF-BB、PDGF-AB、 PDGF-CC或PDGF-DD置換。在某些具體實例中，bFGF可以其它纖維母細胞生長因子成員（例如FGF-4或FGF-9)置換。 30 201237169 在某些具體實例中，IGF-1可以IGF-2置換。在較佳的具體實例中，該培養媒質包含40-60 μΜ 1-硫甘油、40-200奈克/ 毫升PDGF-AA ' 5-100奈克/毫升bFGF及5-100奈克/毫升 IGF-1以分離該等細胞。在更包含生長因子的培養媒質中培養經分離的神經幹細胞及/或神經祖源細胞，以在分離該等細胞後刺激增生。該培養媒質可包含至少1、2或5奈克/毫升的衍生性血小板生長因子-AA(PDGF-AA)、至少0.5、1或5奈克/毫升的鹼性 FGF(bFGF)及/或至少10、25或50 μΜ 1-硫甘油，以擴展細胞。在某些具體實例中，該培養媒質進一步包含至少1、2 或5奈克/毫升的類騰島素生長因子-1 (IGF-1 在較佳的具體實例中，該培養媒質包含40-60 μΜ 1-硫甘油、5_1〇〇奈克 /毫升PDGF-AA、1-50奈克/毫升bFGF及5_1〇〇奈克/毫升 IGF-1，以便在HFSC細胞分離後擴展該等細胞。在本發明的培養條件下生長之經分離的神經幹細胞及 /或神經祖源細胞具有50-120小時的倍增時間。在較佳的具體實例中’該倍增時間係約60至100小時。該等細胞可遍及至少8、η、14或Π繼代繼續此增生速率。該等細胞可每月擴展至少100、250，或較佳至少500倍。在較佳的具體實例中，使用本發明之方法所培養的細胞具有擴展速率 >丨多於 18繼代。實施例實施例1-HFSC細胞培養及擴展；基底媒質及生長因子之鑑別在預備實驗中試驗數種媒質及補充品，其使用源自於 31 201237169 人類12週胎兒脊髓的HFSC細胞（其從先進生物科學資源有限公司（阿拉米達’ CA ’美國）購得，具有提供者的知情同意書）。細胞初始在DMEM : F-12(l : 1)(DMEM/F12)(因維錯俊TM，卡爾斯貝得(Carlsbad)，CA，美國）中培養，且以2 mM麵醯胺酸（因維錯俊™)、1 mM丙酮酸鹽（因維錯俊tm)及 2% B27補充品（因維錯俊tm)補充。檢驗多種生長因子其是否刺激HFSC細胞生長。最有效的生長因子係PDGF-AA與 bFGF之組合。該等細胞可於pDGF_AA及bFGF存在下生長’但是顯示出液泡及看起來不健康。測試數種補充品及觀察到除了 2 mM麵醯胺酸、1 mM丙酮酸鹽及2% B27補充品外’補充1% NEAA之DMEM/F12可減少液泡及稍微增加細胞數量（資料無顯示）。其它補充品包括1 mM N-乙醯基-半胱胺酸（西格瑪-亞得富tm，聖路易斯（St. Louis)，MO，美國）及55 μΜ β-酼基乙醇（因維錯俊TM)似乎改善細胞的狀況，但是改善不如NEAA顯著（資料無顯示）。因此，鑑別出以2 mM麵酿胺酸、1 mM丙酮酸鹽、2% B27補充品、1〇/〇 NEAA、1 mMN-乙醯基-半胱胺酸及55 μ]ν[ β-酼基乙醇補充的DMEM/F12作為最理想的基底媒質，且之後使用來培養 HFSC細胞。從脊柱解剖出人類15週胎兒脊髓，且腦脊髓膜及周圍神經·已移除。然後’以阿丘酶(Accutase)解離及清洗該組織’且將從人類胎兒脊髓獲得的細胞放置在包含下列生長媒質的培養容器中：包含2.5mM麩醯胺酸及15mMHEPES 的DMEM/F12、2% B27補充品（因維錯俊tm)、1% NEAA、 32 201237169 1.5 mM丙酮酸鹽（因維錯俊ΤΜ)、55 μΜ β-酼基乙醇（因維錯俊™)、1 mMN-乙醯基-L-半胱胺酸（西格瑪-亞得富1"1"1)、20 奈克/毫升PDGF-AA(R&D系統公司，明尼阿波里斯市 (Minneapolis) ’ MN，美國）及 10奈克/毫升bFGF(R&D 系統）。然後，將細胞放置在維持於37°C、5% 〇2及5% C02之培養器中。每曰將bFGF(10奈克/毫升)加入至培養媒質。在繼代期間，每2-3天改變媒質。根據預備實驗，於PDGF-AA及 b F GF存在下生長細胞不如此多且許多細胞在數週内停止增生或死亡。此結果似乎合理，因為PDGF-Rot表現細胞通常少於細胞的5%。為了移除未對PDGF-AA及bFGF反應的細胞，在超低黏附培養板(康寧公司（Corning Inc.)，康寧， NY ’美國）中培養細胞。對pdGF-AA及bFGF反應的細胞變成球形（參見第3圖’幻燈片A) ’同時未對其反應的細胞不形成球形。對媒質改變及繼代來說，在較低的離心速度下收集球狀物(300 rpm用於收集球狀物對1，〇〇〇卬爪用於收集單一細胞）。在9天後，採集細胞及繼代到塗佈聚鳥胺酸之培養容器上。在此時期後，細胞每7-14天繼代。細胞在這些早期階段顯示出不均勻的形態（參見第3圖，幻燈片b及 C) ’且許多細胞在一個月内停止增生。增生速率隨著時間變慢且細胞最終不擴展《此外，細胞開始顯示出不健康，在其細胞質中形成液泡。實施例2 -用於H S C F細胞擴展的最理想生長條件之鑑別如在實施例1中提及，在培養媒質中内含PDGF_AA及 bFGF初始支持HFSC細胞適當生長，但是在2繼代後增生速 33 201237169 率變慢。測試NT-3(R&D系統)及IGF-1(西格瑪-亞得富加)以決定它們是否可提高HFSC細胞之增生。20奈克/毫升 PDGF-AA與10奈克/毫升bFGF之存在不足以刺激細胞的增生速率（擴展速率係<1)(參見第4圖）。隨後加入5奈克/毫升 NT-3及/或10奈克/毫升IGF-1造成提高的增生速率（擴展速率變成>1)。NT-3與IGF-1之組合在繼代3時最有效。進—步繼代從每種條件所獲得的細胞來證實其效應。較早採集該等細胞，因為該等細胞開始形成球形。在繼代4時，藉由Nt_3 與IGF-1之組合恢復的增生速率減低，且在繼代4時單一加入IGF-1變成最有效。NT-3與IGF-1之組合可造成細胞分化或形成更多球狀物，且當改變媒質時失去。因此，加入鑑別為最有效的存活因子及之後使用來培養HFSC細胞。但是，HFSC細胞的增生速率在繼代4末端時再次開始減慢及細胞數量減少（與播種的細胞數量比較）。因此，檢驗另一種補充品（1-硫甘油）是否可在繼代5時提高HFSC細胞之增生。第5圖顯示出1 -硫甘油在HFSC細胞之增生上的效應。初始的生長因子組合(20奈克/毫升PDGF-AA+10奈克/毫升 bFGF)根本無法擴展細胞（資料未顯示在此圖形中，因為其在可計數的範圍下）。繼代3所使用的生長因子組合(20奈克/ 毫升PDGF-AA+10奈克/毫升bFGF+ΙΟ奈克/毫升IGF-1)比此組合(20奈克/毫升PDGF-AA+10奈克/毫升bFGF)更有效，但是無法在繼代4後良好地刺激HFSC細胞增生（第4圖）。許多輔因子與生物合成及脂肪酸與相關的長鏈烴特徵硫醇之降解相關。1-硫甘油係在HFSC細胞上的下一個試驗，因為其 34 201237169 係以硫醇為基底的抗氧化劑之一且已經報導在培養時會刺激某些細胞增生（即，老鼠胚胎皮質及海馬神經元、老鼠骨髓肥胖細胞、及人類B細胞株）。此外，亦測試較高的 PDGF-AA劑量（100奈克/毫升）是否可補償對生長因子的反應性減低。於2〇奈克/毫升PDGF-AA、10奈克/毫升bFGF及10奈克/ 毫升IGF-1存在下，加入50 μΜ 1-硫甘油稍微刺激增生，但是細胞數量仍然減少（擴展速率<1)。此結果類似於在缺乏 1-硫甘油下’當於10奈克/毫升bFGF+ΙΟ奈克/毫升IGF-1存在下，將PDGF-AA濃度增加至1〇〇奈克/毫升時所獲得者。但是，當在培養媒質中包含50 μΜ卜硫甘油及增加的 PDGF-AA(100奈克/毫升）二者（與10奈克/毫升bFGF及1〇奈克/毫升IGF-1—起）時，二種組分顯露出協同作用，明顯增加細胞數量（擴展速率>1)。當從此補充品混合劑中消除 IGF-1時（即’總補充物係1〇〇奈克/毫升PDGF_aa+10奈克/ 毫升bFGF+50 μΜ 1-硫甘油），擴展速率減低至<丨，此指示出IGF-1亦促進HFSC細胞增生及/或存活。但是，若HFSC 細胞在此條件下培養較久時，HFSC細胞可甚至在此條件下擴展。此資料指示出除了 1〇奈克/毫升bFGF+10奈克/毫升 IGF-1外’加入5〇 1-硫甘油並將pdGF-AA濃度增加至 100奈克/毫升對擴展細胞係重要。再者，加入IGF-1可不強制’但是甚至於5〇 μΜ 1-硫甘油及100奈克/毫升PDGF-AA 存在下仍然有效增加擴展速率。之後，除了 1〇奈克/毫升 bFGF+10奈克/毫升IGF-1外，使用50 μΜ 1-硫甘油與100奈 35 201237169 克/毫升PDGF-ΑΑ之組合來培養HFSC細胞。該等HF S C細胞在繼代6後於1 〇〇奈克/毫升pDGF_ a a、 10奈克/毫升Bfgf、l〇奈克/毫升沁卜丨及％ μΜ丨硫甘油存在下進一步擴展。細胞在繼代後於這些條件下開始更快速地增生且在一星期内擴展3-4倍。在此條件下，倍增時間大約 60-100小時。該等HFSC細胞能夠維持此增生狀態甚至在繼代8(參見第3圖，幻燈片D)、繼代11(參見第3圖，幻燈片E) 及繼代19(參見第3圖，幻燈片F)後。因此，已鑑別出所描繪包含100奈克/毫升PDGF-ΑΑ、10奈克/毫升bFGF、10奈克/ 毫升IGF-1及50 μΜ 1-硫甘油的媒質作為神經幹細胞及/或神經祖源細胞長時間擴展的最理想培養條件。實施例3-HSCF細胞的自發性分化技術雖然測試多種培養條件，已觀察到當培養HFSC細胞伴隨著從媒質中移除bFGF時，許多細胞似乎分化成雙極性或多極性細胞（寡樹突膠質細胞的象徵)且很快死亡。為了避免這些細胞死亡’已發展出自發性分化技術。培養媒質通常每2天改變用以擴展HFSC細胞，此認為對將HFSC細胞保持在增生狀態係非常重要。為了提高細胞分化’對此實驗每3或4天改變媒質。已認為鹼性fGF及高 PDGF-ΑΑ濃度會阻礙HFSC細胞分化，但是它們對HFSC細胞存活來說亦重要。因此，於10奈克/毫升bFGF、10奈克/ 毫升IGF-1存在下’含5〇 μΜ 1-硫甘油或不含硫甘油，將 PDGF-ΑΑ濃度從1〇〇減低至2〇奈克/毫升。若移除bFGF時， HFSC細胞無法良好地存活。通常來說，每天再補充 36 201237169 以將HFSC細胞保持在增生狀態。當停止再補充㈤证時，許多HFSC細胞從其團摸分離出及形成複雜的網狀突起（原寡樹突膠質母細胞及/或未成熟寡樹突神經膠質細胞的象徵）及良好地存活’如顯示在第7圖幻燈片a及B中。這些具有蜘蛛網狀形態的突起生育細胞對〇4抗原及/ 或GalC抗原呈陽性（如顯示在第7圖幻燈片C-F中），因此，已認為它們係原寡樹突膠質母細胞(04_陽性及Galc_陰性）或未成熟的寡樹突膠質細胞(04-陽性及GalC-陽性）。甚至於 1-硫甘油存在下，HFSC細胞可分化，但是當丨_硫甘油存在於培養媒質中時，突起的複雜性看起來較簡單，如顯示在第7圖幻燈片A及B中。此外，其它細胞型式（例如，星形細胞及神經元)很少觀察到，已認為HFSC細胞易於僅分化成寡樹突膠質細胞-族系細胞。此技術能夠觀察到呈健康狀態之分化的募樹突膠質細胞-族系細胞。這些資料進一步指示出本發明的培養條件對擴展易於分化成寡樹突神經膠質細胞之經分離的神經幹細胞及/或神經祖源細胞特別有用，因為大部分已分化的細胞顯示出寡樹突膠質細胞特徵及類似募樹突神經膠質細胞或原募樹突神經膠質細胞。實施例4-從習知的神經幹細胞誘發HFSC細胞如顯示在第1圖中’已認為習知的神經幹細胞係HFSC 細胞的前期細胞。為了證實此關係，檢驗HFSC細胞是否可從先前報導的習知神經幹細胞誘發。來自人類胎兒脊髓（u 週妊娠）的第一組織之細胞初始於10奈克/毫升EGF及10奈 37 201237169 克/毫升bFGF存在下，在包含25 mM麩醯胺酸、15 mM HEPES、2% B27補充品、1% NEAA、丨 5 mM丙嗣酸鹽、55 μΜ β- Μ基乙醇及i mM N_乙醯基心半胱胺酸的 DMEM/F12中培養15天’以擴展習知的神經幹細胞。初始顯現出許多不同細胞型式，但是在原始培養結束時獲得某些可擴展的細胞族群。在繼代〇第15天時，這些結果闡明在第8圖幻燈片A中。在第一繼代後，在與殖株#2b相同的條件下培養該等細胞（即，含有10奈克/毫升bFGF、1〇奈克/毫升 IGF-1、100奈克/毫升PDGF_AA及5〇 μΜ丨硫甘油的 HFSCM1媒質）遍及15繼代。在原始培養結束時所獲得來自該可擴展的細胞族群之細胞的形態在約繼代5時變均勻，及該等細胞趨向於形成團簇及球形，類似於由殖株#2b所形成的那些（參見第8圖幻燈片B-FP此外，此殖株可自發地分化成寡樹突膠質細胞_族系細胞（資料無顯示）’其藉由流動式細胞測量術(如在實施例7中描述般）顯示出與殖株#2b相同的免疫表現型（資料無顯示）及相同的標識表現模式。冷凍來自此殖株的細胞用於未來試驗(例如’第12圖）。此資料建議HFSC細胞可從習知的神經幹細胞誘發’及認為習知的神經幹細胞係HFSC細胞之前期細胞。已認為PDGF-AA透過PDGF受體α作用。此受體已知受全部 PDGF 家族成員（PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、 PDGF-CC及PDGF-DD)刺激。使用HFSC細胞殖株#2b及殖株 ο #3，使用PDGF-BB來檢驗PDGF-BB是否可置換PDGF-AA。 38 201237169 除了 PDGF-ΑΑ外，PDGF-ΒΒ可在相同條件下擴展二者殖株’及此証明PDGF-AA可成功地以其它PDGF家族成員置換。實施例5 -最理想的細胞培養組分之證實雖然發明家測試在HFSC細胞（殖株#2b)建立後的多種培養條件，發明家注意到對每種生長因子的劑量反應已經改變。為了分離HFSC細胞（殖株#2b)，除了50μΜ1-硫甘油外’需要較高濃度的PDGF-AA(100奈克/毫升）。在此殖株變成持續增生後，不再需要較高的PDGF-ΑΑ濃度（1〇〇奈克/毫升）來擴展此殖株。擴展速率在約10-20奈克/毫升PDGF-AA 處飽和及較高的PDGF-ΑΑ濃度（100奈克/毫升)在其生長上不具有額外效應。此可因為長時間培養或連續使用丨_硫甘油。為了建立HFSC細胞的殖株#2b及殖株#3，在數個繼代後使用1-硫甘油。為了檢驗較高的PDGF-AA濃度之效應，於1-硫甘油存在下從初始培養建立新殖株。此外，對bFGF 及IGF-1的反應似乎各別在2〇奈克/毫升及4〇奈克/毫升處飽和。當使用較高的IGF-1濃度(50-500奈克/毫升）時，可看見更多分化的細胞（其看起來如約1%)。因此，2〇奈克/毫升 IGF-1視為對擴展HFSC細胞較佳。使用20奈克/毫升bFGF及 20奈克/毫升IGF-1改善擴展速率5-10%(與使用10奈克/毫升 bFGF及10奈克/毫升IGF-1比較）。因此，對此實驗使用2〇奈克/毫升bFGF及20奈克/毫升IGF-卜

培養來自第三樣品（12週妊娠）的HFSC細胞，以觀看在已鑑別的最理想培養媒質組分中是否需要較高的PDgf-AA 39 201237169 濃度及是否它們將在另一批細胞中提供類似的生長特徵。在與殖株#2b及#3相同的培養媒質（即，HFSCM1媒質及5〇 μΜ 1·硫甘油）與2〇奈克/毫升（殖株#4A)或100奈克/毫升（殖株#4B)PDGF-AA(除了 20奈克/毫升bFGF及20奈克/毫升 IGF-1外）中培養該等細胞。在第一繼代結束時，殖株#4八的細胞數目少於殖株#4B的三分之一（參見第11圖幻燈片八及幻燈片B)。但是，殖株#4A在繼代1後開始以類似於殖株#4B 的速度增生，甚至使用比殖株#4B低的PDGF-AA濃度。細胞的形態在繼代3時變成均勻及該等細胞趨向於形成團鎮及球形’類似於以殖株#2b或#3形成的那些（參見第10圖幻燈片C-F)。此外，這些細胞可如殖株#215及#3般自發地分化成寡樹突膠質細胞-族系細胞。此結果建議較高的PDGF _ A a 濃度非強制性’但是對分離HFSC細胞較佳，及一旦HFSC 細胞建立’不需要較高的PDGF-AA濃度。再者，此培養方法可在另一批細胞中提供類似的生長特徵及此證實此方法可重覆。冷凍來自此殖株的細胞用於未來試驗。實施例6-擴展的HFSC細胞在冷凍-解凍循環後之恢復及生長能力細胞殖株#2b於8% DMSO存在下在繼代1〇、11及12時冷凍保存。在繼代11時冷凍的HFSC細胞（殖株#2b)已經寄存在

ATCC(登錄編號PTA-12291)。殖株#3的細胞亦於8%DMSO 存在下在繼代9及10時冷凍保存。細胞殖株#4A及#4B比殖株#2b或#3成長的較快，因此，它們m8%DmSO存在下在繼代4及5(殖株#4A)時或繼代3、4及5(殖株#4B)時，於相同條 40 201237169 件下冷凍保存。使用與培養HFSC細胞相同的媒質（HFSCM1 媒質及50 μΜ 1-硫甘油）用於冷凍該HFSC細胞。該等細胞晚後解凍，及在上述無血清HFSCM1媒質及50 μΜ 1-硫甘油與 10奈克/毫升bFGF、10奈克/毫升IGF-1、100奈克/毫升 PDGF-AA或20奈克/毫升bFGF、20奈克/毫升IGF-1、20奈克 /毫升PDGF-AA中培養。觀察這些細胞，其以類似於冷凍前的速率增生（參見第6圖、第9圖及第11圖將該經冷凍的細胞使用於晚後顯示在第12 -15圖中的實驗。實施例7-已擴展及未分化的HFSC細胞之特徵當於100奈克/毫升PDGF-AA、10奈克/毫升bFGF、10 奈克/毫升IGF-1及50 μΜ 1-硫甘油存在下培養實施例2的 HFSC細胞時，它們成長成團簇及/或球形，如顯示在第3圖幻燈片D-F中。與該團簇分離之散亂的細胞趨向於分化成募樹突神經膠質細胞，如顯示在第3圖幻燈片D及E中。甚至當細胞在單一細胞狀態下繼代時，它們最終開始聚集及再次形成團簇。其在此增生狀態下的形狀類似寡樹突膠質前祖源細胞（參見班-赫（Ben-Hur)等人，，18 : 5777 ’ 1998，加夠（Gago)等人，Mo/_ Ce//· TVewrosci.，22 : 162，2003)，但不像在沒有形成任何團簇的雙極性形態下生長之0-2A祖源細胞。甚至很久以前報導出大白鼠寡樹突膠質前祖源細胞，但人類對應物尚無報導。但是，不需要在擴展的細胞培養中鑑別募樹突膠質細胞前期細胞之精確階段’因為無論如何它們保留其分化成寡樹突神經膠質細胞的能力（如顯示在下列）。 41 201237169 為了標出未分化的HFSC細胞之免疫表現型特徵，使用阿丘酶（創新細胞技術(Innovative Cell Technologies)，聖地牙哥(San Diego)，CA，美國），將在繼代11-15處的細胞解離成單一細胞狀態且在塗佈聚鳥胺酸的24井培養板中生長，並於100奈克/毫升PDGF-AA、10奈克/毫升bFGF、10 奈克/毫升IGF-1及50 μΜ 1-硫甘油存在下培養3-7天。然後，以4%仲曱醛固定細胞，然後以PBS清洗。為了染色表面抗原（如 CD133、PDGF-Ra、NG2、Α2Β5、04、ΟΙ、GalC 及PSA-NCAM)，細胞以包含3%正常山羊血清(NGS)的PBS 阻斷及以抗體染色。為了染色細胞内抗原（如Sox2、巢蛋白、01ig2、人腦髓鞘鹼性蛋白（MBP)、中間絲蛋白、GFAP、 βΙΙΙ微管蛋白、神經絲-L及MAP2) ’細胞在阻斷前以0.1%崔通Χ-100於冰冷的PBS中滲透10分鐘。在包含3% NGS的PBS 中，使用 1: 300(CD133/1)、1: 300(PDGF-Ro〇、1: 600(NG2)、 1 : lOOO(PSA-NCAM)、1 : 1000(A2B5)、1 : 1〇〇〇(〇4)、1 : 1000(01)、1 : 1000(Sox2)、1 : 200(巢蛋白）、1 : 200(〇lig2)、 1 : 100(GalC)、1 : 50(MBP)、1 : 500(中間絲蛋白）、1 : 1000(GFAP)、1 : 100(βΙΙΙ微管蛋白）、1 : 200(神經絲-L)、1 : 1000(ΜΑΡ2，多株)或 1 : 200(ΜΑΡ2，單株)的CD133/1 老鼠 IgGl單株抗體（殖株AC133，美天旋生物科技（Miltenyi Biotec))、抗PDGF-Ra兔多株抗體（上州（Upstate))、抗NG2 兔多株抗體（米立波）、抗PSA-NCAM老鼠IgM單株抗體（米立波）、A2B5老鼠IgM單株抗體（米立波）、〇4老鼠igM單株抗體(R&D系統）、01老鼠IgM單株抗體（米立波）、抗s〇X2兔 42 201237169 多株抗體（米立波）、抗巢蛋白老鼠IgGl單株抗體（米立波）、抗01ig2老鼠單株IgG2a抗體、抗GalC單株IgG3抗體（米立波）、抗MBP大白鼠單株IgG2a抗體（米立波）、抗中間絲蛋白老鼠IgGl單株抗體（聖克魯茲（Santa Cruz))、抗GFAP兔多株抗體（米立波）、抗βΙΙΙ微管蛋白單株老鼠IgGl抗體（米立波）、抗神經絲-L老鼠單株IgGl抗體（細胞發信（Cell Signaling))、抗MAP2兔多株抗體（米立波）及抗MAP2老鼠 IgGl單株抗體（米立波）。在4°C下育成過夜後，以3次更替包含3% NGS的PBS清洗井。在某些情況中，對某些細胞表面抗原（NG2、A2B5'04、01及GD3)使用活細胞染色以減少非特異訊號。在此情況中，細胞在固定前沒有阻斷以每種一級抗體染色。在包含0.5%BSA的PBS中，使用1 : 150(NG2)、1 : l〇〇(A2B5)、1 : 200(04)、1 : 1〇〇(〇1)及 1 : 200(GD3)的抗NG2兔多株抗體、A2B5老鼠IgM單株抗體、 04老鼠IgM單株抗體、〇1老鼠lgM單株抗體及抗雙唾液酸神經節苷脂（disialoganglioside)GD3老鼠單株IgG3抗體（米立波）。在室溫下育成30分鐘後，以3次更替包含0.5% BSA 的PBS清洗井。在室溫下’在1 : 500之稀釋下使用二級抗體 1小時’其中該二級抗體係戴賴特(Dylight)488-結合阿芬尼漂爾（AffiniPure)山羊抗兔IgG(Fcy片段特定）、戴賴特488-結合阿务尼漂爾山羊抗老鼠IgG(Fcy片段特定）、戴賴特488_ 結合阿芬尼漂爾山羊抗兔IgG(H+L)、戴賴特488-結合阿芬尼漂爾山f抗大白鼠IgG(H+L)、戴賴特594-結合阿芬尼漂爾山羊抗老鼠IgG(H+L)及/或戴賴特594-結合阿芬尼漂爾山 43 201237169 羊抗-老鼠4Μ(μ鏈特定χ全部二級抗體皆從傑克森免疫研究貫驗室公司（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) 購買）。然後’以2次更替的PBS清洗細胞。使用DAPI來對比染色細胞核。然後，使用裝備用於表面螢光 (epifluorescence)的奥林帕斯（〇iympus)IX81 來觀察細胞。大部分HFSC細胞呈CD133-陽性（參見第12圖，幻燈片A 及B)、Sox2-陽性（參見第12圖，幻燈片c及D)及巢蛋白-陽性（參見第12圖，幻燈片e及F)，此係神經幹細胞的象徵。大部分HFSC細胞呈〇ng2-陽性（此經常係運動神經元及寡樹突膠質細胞的祖源細胞之象徵)(參見第12圖，幻燈片〇及 H)、PDGF-Ra-陽性（此經常係寡樹突膠質細胞·族系細胞的象徵)(參見第12圖’幻燈片I及j)、A2B5-陽性(A2B5通常在神經幹細胞中缺乏及在神經膠祖源細胞、寡樹突膠質权^ 細胞及型式-2星形細胞中發現)(參見第12圖，幻燈片“习 N) ’此係寡樹突膠質祖源細胞的象徵。大部分HFsc細胞呈 PSA-NCAM-陽性(參見第π圖，幻燈片〇及p)，但是在其名現性程度上有多種(PSA-NCAM通常在神經幹細胞中缺妾及在神經元祖源細胞及寡樹突膠質前祖源細胞中發現^ 1 看見無GFAP-陽性細胞，同時其大部分呈中間絲蛋白陽卜 (參見第12圖’幻燈片Q_s)。除了對GFAP外，至少9〇0/ ^ HFSC細胞似乎對上述標識呈陽性，但是精確的計數非常難，因為HFSC細胞趨向於結成團鎮，及在固定與染色期非常容易與培養容器分離。為了定量其純度，進行济動細胞測量術分析並顯示在第13圖中》 44 201237169 矣此外，未分化的HFSC細胞對04抗體（其係一種由免疫 L化予法，使用於原寡樹突膠質母細胞(04-陽性，GalC-二未成熟的寡樹突膠質細胞(04-陽性，GalC-陽性）的但是弱染色與非特異染色難以區別。可。養中看見某些顯示出強的04-陽性細胞與多極性形態之原寡樹突膠質母細胞，但是其顯露頻率少於總細胞的 1% 〇此外’未分化的HFSC細胞對抗MAP2抗體呈弱染色， 4疋/、开少態不似神經元。當於血清存在下使用該抗體與分化的細胞時’神經元經鑑別具有強的訊號及神經元形態（參見第14圖，幻燈片H)。此強的MAP2信號與神經元形態未在未分化的HFSC細胞中鑑別出。當該細胞分化時此弱信號消失’使彳于此染色似乎係特定及未分化的HFSC細胞可非為非特異染色。整體來說’ HFSC細胞表現出對神經幹細胞特定的標識 (CD133、Sox2及巢蛋白）及對寡樹突膠質細胞-族系細胞特定的標識(01ig2、NG2、A2B5及04)。這些資料建議HFSC 細胞可為在神經幹細胞與募樹突膠質袓源細胞間之中間細胞。再者，除了上述抗原外’ HFSC細胞表現出PSA-NCAM，其係大白鼠寡樹突膠質前祖源細胞的人類對應物之象徵。 PSA-NCAM的多唾液酸(P〇lysialic acid)(PSA)係一種長的負電荷細胞表面聚糖，其具有巨大的水合體積而提供來調整細胞間的距離。PSA係關於一些在成人CNS中之可塑性相關的反應，包括晝夜及荷爾蒙模式改變、對疼痛及壓力 45 201237169 的適應、及學習與記憶的觀點（魯替蕭瑟（Rutishauser)，iVai. /?伙^«厂仍<^.，9:26,2008)。？8八在新生兒神經系統中的角色之一係在寡樹突膠質祖源細胞之遷移上。當從遷移的 02A祖源細胞中移除PSA時，02A祖源在創傷模型中之遷移受抑制（巴洛莫忍（Barral-Moran)等人，/. ， 72 : 679 ’ 2003)。另一種角色係控制細胞的分化時機。PSA 表現在發展中軸索及寡樹突先驅膠質細胞二者上，及其在這些細胞上的向下調整與開始髓鞘化相互相關。PSA亦關於成人CNS之可塑性相關的反應。提供PSA調整發展及成人可塑性的能力，其遵循表現出PSA的細胞可在組織已經由損傷或疾病損害的狀況中具有治療值。透過在外傷模型中的結疤來觀察在表現出PSA的區域中之軸索再生長(在結疤中或在移植的許旺氏（Schwann)細胞上之經操縱的psa表現性）°HFSC細胞係一種内生性表現出PSA的細胞及將在處理外傷(如腦損傷或脊髓損傷）上具有相同效應。為了進一步標出HFSC細胞(殖株#2b)的特徵，解凍在繼代11時冷凍的細胞，在上述生長條件下培養及每7_9天繼代。在繼代13處培養該等細胞9天，然後使用下列抗體讓其接受流動式細胞測量術：PE_結合抗CD133/1老鼠IgG1單株抗體（殖株AC133，美天旎生物科技）；PE•結合CD14〇a老鼠 IgG2a單株抗體（殖株伙卜BD法明君(BD Pharmingen)); pE_ 結合CD9老鼠IgGl單株抗體（殖株m-L13，BD法明君）；PE_ 結合CD44老鼠IgG2b單株抗體（殖株G44-26，BD法明君）； PE-結合抗PSA-NCAM老鼠lgM單株抗體(2-2B，美天旎生物 46 201237169 科技）；PE-結合A2B5老鼠IgM單株抗體（殖株i〇5HB29，美天旋生物科技）；PE-結合〇4老鼠igM單株抗體（殖株04，美天旎生物科技）；及PE-結合抗NG2老鼠IgGl單株抗體(R&D 系統）。簡單地說，在以阿丘酶解離後，清洗細胞及將其再懸浮於含有2 mM EDTA及0.5% BSA的冰冷PBS中並保持在冰上。在計數細胞數量後，使用含有2 mM EDTA及0.5% BSA 的冰冷PBS將細胞數量調整至ΐχΐ〇7細胞/毫升。將25微升的細胞懸浮液(250,000細胞)轉移進每根1.5毫升管中。然後，遵循製造者的推薦將一級抗體加入每根管子。對每種抗體使用PE-結合的同型對照來設定適當限制。在冰上育成2〇分鐘後’以含有2mMEDTA及0.5%BSA的冰冷PBS清洗細胞及將其再懸浮於固定緩衝液(BD生物科學(BD Bioscience)) 中。在冰上固定20分鐘後，清洗細胞及將其再懸浮於含有2 mM EDTA及0.5% BSA的冰冷PBS。使用 FACS Canto II(BD 生物科學）測量細胞的螢光性，及使用蓋特羅技(Gatelogic) 軟體（因尼維技術Pty有限公司（Inivai Technologies Pty Ltd.)) 分析每筆資料。如顯示在第13圖中，全部或大部分的HFSC細胞（殖株 #2b)係呈CD133-陽性（100%的細胞）、CD9-陽性（100%的細胞）、CD140(X-陽性（98.8%的細胞）、NG2-陽性（89·8%的細胞）、A2B5-陽性(99.9%的細胞）、04-陽性(94_6%的細胞）、 PS A-NC AM-陽性（68.9%的細胞）及CD44-陰性（0.4%的細胞呈陽性）。藉由免疫細胞化學法，04信號幾乎無法與非特異性染色區別及比原募樹突膠質母細胞或寡樹突神經膠質細 47 201237169 胞的04彳s號更弱。來自流動式細胞測量術的結果，HFSC 細胞（殖株#2b)之04信號可與同型對照分開，及HFSC細胞 (殖株#2b)顯示出對〇4抗原呈弱陽性。藉由流動式細胞測量術’ HFSC細胞（殖株#3)顯示出幾乎相同表現型。它們係呈 CD133-陽性（98.4%的細胞）、CD9_陽性（99 4%的細胞）、 00140〇1-陽性（91.5%的細胞）、]^(32_陽性（63 4%的細胞）、 A2B5-陽性（99.8°/。的細胞）、04-陽性（71.6%的細胞）、 PSA-NCAM-陽性（74.7%的細胞）及CD44_陰性（〇 3%的細胞呈陽性）。實施例8-擴展的HFSC細胞在含血清媒質中之分化潛力為了測試擴展的細胞之分化潛力，將HFSC細胞（殖株 #3)繼代成分離/單一細胞階段，及在含血清媒質[寡樹突先驅膠質細胞分化媒質（OPCDM)](科細™研究實驗室）中培養以刺激分化。然後’以識別神經元（抗βΙΙΙ微管蛋白抗體、抗神經絲-L抗體及抗ΜΑΡ2抗體）、寡樹突膠質祖源細胞及寡樹突神經膠質細胞[04抗體、01抗體、抗GalC抗體及抗人腦髓鞘鹼性蛋白（MBP)抗體]、及星形細胞(抗GFAP抗體）的抗體來染色該等細胞，接著為結合螢光性染料的二級抗體(戴賴特488或戴賴特594，傑克森免疫研究）。使用DAPI 來對比染色細胞核。在處理以刺激HFSC細胞分化後，觀察全部三種主要的中樞神經系統（CNS)表現型。當在含血清媒質中培養該 HFSC細胞時，偵測到βΙΙΙ微管蛋白-陽性細胞、神經絲-L-陽性細胞及ΜΑΡ-2-陽性細胞(神經元的象徵）。有許多βΙΙΙ 48 201237169 微管蛋白-陽性細胞（第14圖，幻燈片B) ’然而小數目的細胞對神經絲-L(第14圖，幻燈片E)或MAP2(第14圖，幻燈片H) 呈陽性。此結果指示出其許多係未成熟的神經元。HFSC細胞亦可分化成MBP-陽性細胞。MBP係髓鞘的主要組分且僅在成熟的寡樹突膠質細胞中表現出。此資料指示出HFSC細胞具有分化成成熟的寡樹突神經膠質細胞的能力。評估 MBP與上述神經元標識之共定位，但是僅有少數共定位可看見（第14圖，幻燈片C、F、I)。此可由於神經元未成熟，因為髓鞘將不纏繞在未成熟神經元的軸索上。亦評估MBP 與04抗原之共定位（第14圖，幻燈片J-L)。大部分的MBP信號與04抗原的信號共定位，但是僅有一半的〇4抗原信號與 MBP之信號共定位。此結果合理，因為〇4抗原係表現在寡樹突膠質祖源細胞、未成熟寡樹突神經膠質細胞及成熟寡樹突神經膠質細胞中，同時MBP僅表現在成熟寡樹突膠質細胞中。這些細胞亦對Gale抗原（其係一種用於未成熟寡樹突神經膠質細胞的標識）呈陽性（資料無顯示）。亦偵測到 GFAP-陽性細胞（星形細胞）及中間絲蛋白_陽性細胞，如顯不在第14圖幻燈片M_〇中。這些資料指示出擴展的HFSC細胞具多潛能性’因此’它們很可能為神經幹細胞，因為它們此依環境而產生三種主要的中樞神經系統細胞表現型。亦在相同條件下測試HFSC細胞（殖株#2b)，及其顯示出與 HFSC細胞（殖株#3)相同的多潛能性。貫施例9 -擴展的HF s c細胞在無血清媒質中之分化潛力 HFSC細胞顯示出藉由減低PDGF-AA濃度沒有再補充 49 201237169 bFGF而具有好的分化成寡樹突膠質細胞之潛力，如顯示在第5圖中。但是，已分化的細胞少於總細胞的一半。若HFSC 細胞在非常低密度(<0·5χ 104細胞/平方公分）下播種而沒有 bFGF與10奈克/毫升PDGF-AA及100奈克/毫升IGF-1時，大部分細胞似乎分化但是它們會在一天内失去。為了進一步檢驗其分化成寡樹突膠質細胞的潛力，已認為誘導分化及長時間細胞存活係非常重要。環狀AMP(cAMP)已知會引發許多細胞型式分化。測試pCPT-cAMP(其係一種可滲透細胞的cAMP類似物）是否可在HFSC細胞中引發分化。1〇〇 μΜ pCPT-cAMP可引發在高密度（3 X104細胞/平方公分）下的 HFSC細胞分化，但是細胞無法良好地存活，甚至於1〇〇奈克/毫升IGF-1存在下。已報導BDNF提高寡樹突膠質祖源細胞之分化並支撐已分化的細胞之細胞存活。當HFSC細胞在包含麩醯胺酸及HEPES之DMEM/F12中且以B27補充品、N2 補充品及50 μΜ 1-硫甘油補充，於10奈克/毫升PDGF-AA、 1〇〇奈克/毫升IGF-1、100 μΜ pCPT-cAMP及10奈克/毫升 BDNF存在下分化時，至少多於一半的HFSC細胞分化成突起生育細胞。因為HFSC細胞表現出數種寡樹突膠質細胞標識(如04或NG2)，需要可區別HFSC細胞與寡樹突膠質細胞· 族系細胞的新方法。根據一些試驗，發明家注意到未分化的細胞表現出比寡樹突膠質祖源細胞強的GD3，及〇4反之亦然（箭頭第11圖，幻燈片A、幻燈片B及幻燈片〇。當細胞以GD3及〇4染色時，寡樹突神經膠質細胞可使用其染色模式及其形態區別。此外，亦可鑑別出其它細胞型式(如神經 50 201237169 元或星形細胞），因為它們不表現出GD3或〇4抗原。第15圖幻燈片D顯示出每種細胞型式之比率。未分化的細胞係總細胞之23.5°/。±2.0%。寡樹突膠質祖源細胞係總細胞的 75.8%±2.1%。其它細胞型式僅有0.9%士0.6%。如上述提及，寡樹突膠質祖源細胞對已分化的細胞（寡樹突膠質祖源細胞加上其它細胞型式）之比率係已分化的細胞之 99.1%±0.56%，然而其它細胞聖式係已分化的細胞之 0.9%±0.56〇/〇。此資料指示出HFSC細胞具有高潛力分化成寡樹突膠質細胞-族系細胞。實施例10 -藉由螢光活性細胞分類(F A C S)方法或磁性分類方法增富或選擇HF S C細胞本發明揭示出HFSC細胞之表現型，其係呈CD133-陽性、CD140a-陽性、CD9-陽性、CD44-陰性、PSA-NCAM-陽性、A2B5-陽性、04-陽性及NG2-陽性。此訊息能夠沒有培養而選擇或增富HFSC細胞。CD133係一種用於神經幹細胞的標識及不表現在祖源或先驅細胞中。CD9亦使用作為用於神經幹細胞的標識，但是某些寡樹突神經膠質細胞已知表現出CD9。使用PSA-NCAM及A2B5來偵測神經元限制性先驅細胞或神經膠限制性先驅細胞。已認為大部分神經先驅細胞及袓源細胞表現出PSA-NCAM及A2B5或 PSA-NCAM或A2B5任一種，其使用無法如此良好地增富 HFSC細胞，特別在第一及第二個三個月。使用CD140a、 NG2、A2B5及04作為用於寡樹突先驅膠質細胞、原寡樹突神經膠質細胞及寡樹突膠質細胞的標識。CD140a及NG2的 51 201237169 表現性程度在HFSC細胞中高於寡樹突先驅膠質細胞、原募樹突神經膠質細胞或寡樹突膠質細胞，然而A2B5及〇4的表現性程度在HFSC細胞中比寡樹突先驅膠質細胞、原寡樹突神經膠質細胞或寡樹突膠質細胞低。使用CD140cx及NG2已認為更合適於增富HFSC細胞。根據上述訊息及在本發明中所描述的資料’每種標識增富HFSC細胞的效率將為 CD140ot>NG2>CD9>CD133>A2B5>〇4 ’ PSA-NCAM，但是此順序將依其妊娠週數而變化。但是’單一標識將不足以選擇HFSC細胞及2種標識之組合可更特別地選擇HFSC細胞。神經幹細胞標識(CD133 或CD9)之一與寡樹突膠質細胞-族系標識(CD140oc，NG2) 之一的組合將非常有效來選擇HFSC細胞。根據上述知識，在這些組合當中，最有效率的選擇HFSC細胞之標識組合將為CD133與CD140a，但是其它組合應該亦比以單一標識選擇更有效。 CD133或CD140ct的顯露頻率通常低（少於5%)及 CD140a之顯露比CD133晚（表現性從妊娠週的約8週開始及最大在約18週）。因此，表現出CD133及CD140a二者的細胞將依其妊娠週而非常低（少於總細胞的1%)。若細胞係來自妊娠週15週或較早之人類胎兒組織時，大部分CD133-陽性細胞會不表現出CD140a。因為CD133-陽性及CD140a-陰性細胞將較晚表現出CD140a，在CD133-陽性細胞初始增富後，當於相同條件下培養該細胞用於HFSC細胞時，可獲得該HFSC細胞。 52 201237169 【圖式簡單說^月】第1圖描出神經幹細胞及神經祖源細胞發展成在腦中的二種主要細胞型式，神經元、星形細胞及寡樹突神經膠質細胞；第2圖顯示出多種CNS細胞的標識表現性之比較；第3圖係以幻燈片a-F描出人類胎兒幹細胞（殖株#2b) 的對比影像；第4圖闡明HFSC細胞（殖株#2b)於不同生長因子組合存在下之擴展速率；第5圖闡明高劑量PDGF_AA(i〇〇奈克/毫升）及丨_硫甘油在HFSC細胞（殖株#2b)之增生上的效應；第6圖闡明HFSC細胞（殖株#2b)的生長曲線；第7圖係以幻燈片A-F描出HFSC細胞於無血清媒質中之自發性分化；第8圖係以倒立式顯微鏡所擷取之相位對比影像，其顯示出HFSC細胞（殖株#3)在多種繼代時之形態；第9圖闡明HFSC細胞（殖株#3)之生長曲線；第10圖係以倒立式顯微鏡所擷取的相位對比影像，其在幻燈片A-F中顯示出HFSC細胞（殖株4A及4B)於多種繼代時之形態；第11圖闡明HFSC細胞（殖株#4A及#4B)的生長曲線；第12圖係以幻燈片A-S闡明未分化的HFSC細胞之免疫表現型；

第13圖顯示出流動式細胞測量術資料，其在幻燈片A-H 53 201237169 中闡明未分化的HFSC細胞（殖株#2b，繼代13)之比例；第14圖闡明已分化的HFSC細胞（殖株#3，繼代15)之免疫表現型；及第15圖係以幻燈片A-E闡明HFSC細胞（殖株#2b，繼代 15)的分化潛力。【主要元件符號說明】 (無） 54

Claims

201237169 七、申請專利範圍： 1. 一種經分離可擴展的人類神經細胞，其中該細胞係祖源細胞或幹細胞，其中該細胞維持其分化成神經元、星形細胞及寡樹突神經膠質細胞的能力， ' 其中該細胞有效率地遍及隨後的繼代維持其分化 • 成寡樹突膠質細胞族系細胞的能力，及其中該細胞表現出至少細胞表面抗原CD133及 CD140a。 2. 如申請專利範圍第1項之經分離可擴展的人類神經細胞，其中該細胞已經寄存如為ATCC登錄編號 PTA-12291。 . 3.如申請專利範圍第1項之可擴展的人類神經細胞，其中該細胞係來自選自於由下列所組成之群的人類胎兒神經組織：脊髓、大腦皮質、海馬、紋狀體、前腦基底、腹側中腦、藍斑核（locus ceruleus)、丘腦下部、小腦、胼胝體及視神經。 4. 如申請專利範圍第3項之可擴展的人類神經細胞，其中該神經組織係分離自8-24週妊娠的人類脊髓。 5. 如申請專利範圍第1項之可擴展的人類神經細胞，其中該細胞已經在有效增富該可擴展的神經細胞之條件下培養，該條件包括一培養媒質，其包含一種有效量的生長補充品、二種生長因子及一種存活因子。 6. 如申請專利範圍第5項之可擴展的人類神經細胞，其中 55 201237169 該生長補充品係1-硫甘油及在該培養媒質中之有效量的生長補充品係至少10 μΜ 1-硫甘油以分離HFSC細胞。 7. 如申請專利範圍第5項之可擴展的人類神經細胞，其中該二種生長因子係衍生性血小板生長因子（PDGF)及鹼性纖維組織母細胞生長因子(bFGF)，及其存在濃度係至少5奈克/毫升PDGF及至少2.5奈克/毫升bFGF以分離 HFSC細胞。 8. 如申請專利範圍第5項之可擴展的人類神經細胞，其中該二種生長因子係PDGF及bFGF ’及其存在濃度係約4〇奈克/毫升至約200奈克/毫升PDGF及約5奈克/毫升至約 40奈克/毫升bFGF以分離HFSC細胞。 9. 如申請專利範圍第5項之可擴展的人類神經細胞，其中 s亥二種生長因子係PDGF及bFGF，及其存在濃度係約 1 〇〇奈克/毫升PDGF及約20奈克/毫升bFGF以分離HFSC 細胞。 10. 如申請專利範圍第5項之可擴展的人類神經細胞，其中該二種生長因子係PDGF及bFGF，及其存在濃度係至少 1奈克/毫升PDGF及至少0.5奈克/毫升bFGF，以在細胞株建立後擴展HFSC細胞及維持該細胞。 11. 如申請專利範圍第5項之可擴展的人類神經細胞，其中該一種生長因子係PDGF及bFGF，及其存在濃度係約5 奈克/毫升至約100奈克/毫升PDGF及約丨奈克/毫升至約 5〇奈克/毫升bFGF以在建立後擴展HFSC細胞。 12. 如申請專利範圍第5項之可擴展的人類神經細胞，其中 56 201237169 該二種生長因子係PDGF及bFGF ,及其存在濃度係約20 奈克/毫升PDGF及約20奈克/毫升bFGF以在建立後擴展 HF S C細胞。 13. 如申睛專利範圍第5項之可擴展的人類神經細胞，其中該一種存活因子係類胰島素生長因子(〗GF)及其存在濃度係至少1奈克/毫升IGF。 14. 如申凊專利範圍第5項之可擴展的人類神經細胞，其中該一種存活因子係IGF及其存在濃度係約5奈克/毫升至約1〇〇奈克/毫升IGF。 15. 如申請專利範圍第5項之可擴展的人類神經細胞，其中該一種存活因子係IGF及其存在濃度係約2〇奈克/毫升 IGF。 16. 如申請專利範圍第丨項之可擴展的人類神經細胞，其中該細胞可經冷康及解束而沒有失去其遍及隨後的繼代分化成神經元、星形細胞及寡樹突神經膠質細胞之能力’及其表現出至少細胞表面抗原CD133及CDi4〇a的能力。 17_ —種活體外培養可擴展的神經細胞之方法，其中，、纟胞係分離自哺乳類中樞神經系統的袓源細胞或幹細^，其中該細胞維持其分化成神經元、星形細胞及寡樹^神經膠質細胞的能力及其有效率地分化成寡樹突膠質細胞_ 族系細胞的能力，該方法包括：胞， a)從人類胎兒神經組織分離及解離出至少一種細 57 201237169 b) 在溫度37°C下，於包含1-20°/。〇2及5%C02的環境中，及在化學限定的無血清培養媒質_培養該細胞，其中該媒質包含： -至少5奈克/毫升PDGF-AA， -至少0.5奈克/毫升bFGF，及 -至少10 μΜ 1-硫甘油， c) 繼代來自b)的細胞，以獲得該可擴展的人類神經細胞。 18. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該培養媒質更包含至少1.0奈克/毫升IGF-1。 19. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該神經組織係選自於由下列所組成之群：脊髓、大腦皮質、海馬、紋狀體、前腦基底、腹側中腦、藍斑核、丘腦下部、小腦、胼胝體及視神經。 20. 如申請專利範圍第17項之方法，其中在步驟a)中，該神經組織係來自8-24週妊娠的人類胎兒脊髓。 21. 如申請專利範圍第17項之方法，其中在步驟a)中，該分離係藉由使用螢光活化細胞分類（FACS)或免疫抗體包被篩選法(immunopanning)之至少一種的分離方法進行。 22. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該培養媒質包含： -40-200奈克/毫升PDGF-AA， -5-100奈克/毫升bFGF， -10-100 Ι_ιΜ 1-硫甘油，及〇 -5-100奈克/毫升IGF-1。 58 201237169 23. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該培養媒質包含： -約100奈克/毫升PDGF-AA， -約20奈克/毫升bFGF， -約50 μΜ 1-硫甘油，及 -約20奈克/毫升IGF-1。 24. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該培養媒質包含： -5-100奈克/毫升PDGF-AA， -1-50奈克/毫升bFGF， -10-100 μΜ 1-硫甘油，及 -5-100奈克/毫升IGF-卜 25. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該培養媒質包含： -約20奈克/毫升PDGF-AA， -約20奈克/毫升bFGF， -約50 μΜ 1-硫甘油，及 -約20奈克/毫升IGF-1。 26. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該培養步驟發生在塗佈以聚鳥胺酸或聚離胺酸之培養容器中。 27. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該化學限定的無血清培養媒質包含以非必需胺基酸、麩醯胺酸、丙酮酸鹽、Β27、Ν-乙醯基-半胱胺酸及β-锍基乙醇補充之 DMEM/F12。 28. —種活體外培養物，包含至少一種從哺乳類中枢神經系統獲得之經分離的神經細胞，其中將該經分離的細胞浸沒在化學限定的無血清培養媒質中，該培養媒質包含： 59 201237169 -至少5奈克/毫升PDGF-AA， -至少5奈克/毫升bFGF，及 -至少10 μΜ 1-硫甘油。 29·如申請專利範圍第28項之活體外培養物，更包含至少1.0 奈克/毫升IGF-1。 30. 如申請專利範圍第29項之活體外培養物，其中該細胞係從人類胎兒脊髓獲得。 31. 如申請專利範圍第3〇項之活體外培養物，其中該活體外培養物係在塗佈以聚鳥胺酸或聚離胺酸之培養容器中。 32. 如申請專利範圍第3〇項之活體外培養物，其中該化學限定的無血清培養媒質更包含以非必需胺基酸、麩醯胺酸、丙_酸鹽、Β27、Ν-乙醯基半胱胺酸及β_酼基乙醇補充的DMEM/F12。 33. 如申請專利範圍第3〇項之活體外培養物，其中該神經細胞呈CD133-陽性及CD140a-陽性。 34. —種治療由髓鞘喪失或寡樹突神經膠質細胞喪失所造成的症狀之方法，其包括：將一治療有效量之包含如申請專利範圍第丨項之經分離可擴展的人類神經細胞之組成物給藥至患者。 35. 如申晴專利範圍第34項之方法，其中該症狀係一種髓鞘脫失病或神經退化性疾病。 36. 如申4專利第35項之方法，其巾該麵脫失病係選自於由下列所組成之群：脊髓損傷（SCI)、多發性硬化 (MS)、遺傳性腦白質營養性障礙、瀰漫性脊髓病/骨髓 60 201237169 火進行性多部腦白質病及其它先天性髓鞘脫失病。 37·如申請專利範圍第35項之方法，其中該神經退化性疾病係選自於由下列所組成之群：阿茲海默氏（Alzheimer) 病、阿滋海默型老年癡呆（SDAT)、帕金森氏(Parkins〇n) 病、予丁頓氏(Huntington)病、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、局部缺血、失明及由對有髓鞘的神經元之損傷所造成的神經退化性疾病。 38.如申睛專利範圍第35項之方法其中該給藥步驟包括將 β玄可擴展的人類神經細胞注射進受髓鞘脫失病或神經退化性疾病影響之神經組織或側腦室中。 39·如申凊專利範圍第38項之方法，其中該神經組織係選自於由下列所組成之群：脊髓、室下區、胼胝體、小腦、底神經郎、下撖欖核（nucleusbasalis)及黑質。 4〇.如申清專利範圍第35項之方法，其中該給藥步驟包括藉由由下列所組成的方法將該可擴展的人類神經細胞注射進該患者中：經子宮的胎兒腦室内注射、腦室内注射' 服貫質内（intraparenchymal)注射、玻璃狀體内注射及血管内給藥。 41·如申睛專利範圍第35項之方法，更包括在該給藥步驟前为化该可擴展的人類神經細胞之步驟。 42.種邊藥用神經幹細胞組成物，其包含一如申請專利範圍第1項之經分離可擴展的人類神經細胞。 f3. —種醫藥用神經幹細胞組成物，其包含一已經藉由如申請專利範圍第17項之方法活體外培養之可擴展的神經 61 201237169 細胞。 44. 一種如申請專利範圍第42或43項之醫藥組合物於製備一藥劑的用途，該藥劑係用來治療由髓鞘喪失或寡樹突神經膠質細胞喪失所造成的症狀。 62