TW201138810A - Treatment of inflammatory bowel diseases with mammal beta defensins - Google Patents

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201138810 六、發明說明： 序列表之參日g 〆 t w\ 申月案3有呈電腦可讀形式之序列表。該電腦可讀 形式以引用之方式併入本文中。 了^ 發明之背景 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於藉由投予哺乳類動物沒防紫素而預防盘 治療發炎性腸疾病。 .' 【先前技術】 人類防禦素 *在許多其他元件中，先天免疫之關鍵組分為個別顯示 相當大選擇性但集體能夠快速殺死寬範圍之細菌、病毒及 真菌之抗微生物肽（AMP)。AMp之生物重要性因其在自然 界中之普遍分布而更為突出，且其有可能由所有多細胞生 物體產生。在人類中，優勢AMp為防禦素。人類防禦素為 陽離子小肽，基於其三個分子内半胱胺酸雙硫鍵之拓撲 干’可分為Q：-防禦素及冷-防禦素。α -防禦素可進一步細 分為最早自嗜中性球顆粒分離之α _防禦素（ΗΝΡ 1-4)及由 潘納斯細胞（Paneth cell )表現於小腸隱窩中之α _防禦素 (HD5及HD6)。防禦素主要由多種組織及器官之上皮 細胞產生，該等組織及器官包括皮膚、氣管、胃腸道、泌 尿生殖系統、腎、胰及乳腺。/5 -防禦素家族最佳特性化之 201138810 成員為hBD 1 ·3。然而’藉由使用多種生物資訊學工具，已 在人類基因組中註解幾乎40個編碼推定/5 -防禦素同源物 之開放閲讀框架《—些人類防禦素係組成性產生，而其他 係由促發炎性細胞介素或外源微生物產物誘發。 已變得越來越清楚’除直接抗微生物活性外，人類防 禦素亦具有多種免疫調節/替代性質。該等性質包括誘發多 種趨化因子及細胞介素、趨化性及細胞凋亡活性、誘發前 列腺素、組織胺及白三烯之釋放、抑制補體、經由類鐸受 體h號轉導刺激樹狀細胞成熟及由嗜中性球刺激病原體清 除。此外，人類防紫.素亦在傷口癒合、上皮及纖維母細胞 增殖、血管生成及血管發生中起作用。 '有越來越多的證據證明人類防禦素在許多感染性及發 炎性疾病中發揮重要作用。*炎及/或感染皮膚中通常觀察 到人類防禦素之過表現，此报可能是因為由微生物組分或 内源性促發炎性細胞介素局部誘發。在牛皮癖中，_2及 咖3過多，且在患有尋常痤瘡或淺表性毛囊炎之患者之病 變性上皮t，觀察到hBD2之顯著上調。另_方面，異位性 皮膚炎與hBD2及hBD3之下調相關。迴腸克羅恩氏病 (Cr〇hn’s dlsease )與刪及刪之不足表現相關，且在 結腸克羅恩氏病中，hBD2-4之表現下調。 細胞介素 細胞介素為高級真核生物 響其他細胞之生長、分裂及功 之多效性多肽，其例如經由相 之負貝細胞間信號轉導且影 能的小分泌多肽。其為有效 應受體充當局部或全身性細 4 201138810 胞間調控因子，且因此在諸如 物過程中起關鍵作用。細胞介 等細胞類型包括纖維母細胞、 細胞/單核細胞及淋巴細胞。 免疫、發炎及造血之許多生 素由多樣細胞類型產生，該 内皮細胞、上皮細胞、巨噬 TNF- α涉及多種生理病原性過程且可如在宿主防禦中 具有保護性或如在自體免疫中具有有害性。τΝ]ρ_α為關鍵 細胞介素之一，其引發且維持發炎反應，且已證明TNF_a 失活在下調與自體免疫疾病相關之發炎性反應中很重要。 感染後’巨噬細胞大量分泌TNF_a且TNF_a藉由刺激内皮 細胞產生黏附分子及藉由產生為趨化細胞因子之趨化因子 來"導嗜中性球及巨兔細胞募集至感染部位。α有助 於活化白血球及其他發炎性細胞且增加損傷組織内之血管 滲透性。TNF-α主要由巨噬細胞、單核細胞及樹狀細胞產 生，而且可由多種其他細胞類型產生，該等細胞類型包括 淋巴細胞、肥大細胞、内皮細胞、心臟肌細胞、脂肪組織、 纖維母細胞及神經元組織。 當刖的抗炎藥藉由與TNF- α結合且因此阻止TNF- α 向細胞表面上TNF-α之受體發送信號來阻斷TNF_a之作 用。s亥類型之阻斷具有某些嚴重的副作用，其中一 ‘為感 染，諸如肺結核、敗血症及真菌感染且可能使癌症發病率 增加。 IL-10，亦稱為人類細胞介素合成抑制因子（csIF )，亦 作為抗炎細胞介素主要積極參與免疫調控。該細胞介素由 數種細胞類型產生’該等細胞類型包括單核細胞、巨嗤細 201138810 胞' T細胞、B細胞、樹狀細胞及肥大細胞。該細胞介素在 免疫調控及發炎作用中具有多效性效應。其下調促發炎性 細胞介素、Thl/Thl7細胞分泌之細胞介素、MHC第II類 Ag及共刺激分子於抗原呈現細胞上的表現。IL-10亦由稱 為調控T細胞（Tregs )之T細胞群體分泌。該等細胞不阻 止最初T細胞活化.；相反，其抑制持續反應且阻止慢性且 潛在破壞性反應。在周邊中，某些T細胞被抗原及IL-10 或TGF-冷誘發成為Tregs。IL-10誘發之Tregs為 CD4 + /CD25+/Foxp3-且稱為Trl細胞。該等細胞藉由分泌 IL-10抑制免疫反應。最近研究已揭示在鑑別Thl7細胞時T 細胞效應子譜系之多樣化大於Thl/Tii2/Treg。已顯示該亞群 在先前歸因於Th 1系之數種自體免疫疾病（諸如克羅恩氏 病、潰瘍性結腸炎 '牛皮癬及多發性硬化）中呈病原性。 Th 1 7分泌之細胞介素亦被IL-1 〇下調，且阻斷TNF藉由使 Thl 7細胞失活而預防牛皮癬。IL_丨〇之總體活性為抗炎性， 且已在數個動物研究中顯示預防發炎及損傷，然而因為 IL-10投藥途徑及其生物半衰期方面存在之困難，所以臨床 IL-10治療仍不適當。 發炎性腸疾病 發炎（'生腸疾病（Inflammat〇ry b〇wel disease，IBD )之 特色為來源模糊的慢性、復發性腸發炎。IBD指兩種不同的 病症：克羅恩氏病與潰瘍性結腸炎（ulcerative c〇mis，uc )。 兩種疾病似乎皆導因於在腸中的發炎性反應之過度活化。 此發炎性級聯被認、為透過前纟炎性細胞介素之⑦性與淋巴 201138810 求人、、且之選擇性活化而永存。在具有IBD的患者中，腸之 内襯之凊癌與發炎導致腹痛、腹渴、與直腸出血之症狀。 /貝癌性結腸炎在大腸中發生，而在克羅恩氏病中，疾病可 捲入整個GI道以及小腸與大腸。對於大多數的患者而言， 為^性病況，其症狀持續數月至數年。其在年輕成人最 常見’但可於任何年齡發生。其在世界各地發現，但於工 業化國家（例如美國、英國、與北歐）最常見。其在猶太 裔人口中特別常見且在發生率亦有種族差異。㈣之臨床症 狀為間歇性直腸出血、狹窄性腹痛、體重喪失_。_ 之診斷係基於臨床症狀’使用鋇灌腸，但直接形象化（乙 狀結腸鏡或結腸鏡）為最精確的測試。長期㈣為結腸癌 之風險因+，幻台療⑽可涉及藥物治療與手術。 有些具有UC的患者僅在直腸具有疾病（直腸炎）。其 他具有UC的患者具有限於直腸與鄰近的左結腸的疾病（直 腸乙狀結腸炎）。又其他者具有整個結腸《叫普遍性 IB D ) 。U C之症狀—般在且右ρ库，名— 隹，、有更廣泛疾病（較大部分的結 腸捲入疾病）者更嚴重。 對於具有限於直腸的疾病（直腸炎）或限於左結腸之 末端的UC (直腸乙狀結腸炎）的患者’預後比具有完整結 腸UC者佳。使用口服藥物治療或灌腸的短暫週期性治療可 能已足夠。在該等具有更廣泛疾病者，來自發炎腸的血液 喪失可導致負血，且可能需要以鐵補給或甚至輸血治療。 罕見地，當發炎變得非常嚴重時，結腸可劇烈地膨脹成較 大尺寸。此病況稱為毒性巨結腸。具有毒性巨結腸的患者 7 201138810 有發燒、腹痛與膨脹、脫水與營養失調而極端不健康。r 非患者因藥物治療而快速改善 示 破裂。 贫需要手病以預防結腸 S'氏病可於胃腸道之所有區域發生。在此疾病 中，胃腸道由於發炎阻塞且纖維化在大多數患者中發生。 肉芽腫與療管形成為克羅恩氏病之常見併發症。疾病進展 結果包括靜脈内出血、手術與結腸造口術。 >励可藉由藥物而治療。最常用以治療㈣的藥物為 杬發炎樂物，諸如水揚酸鹽。水楊酸鹽製劑已有效治療輕 度至中度疾病。㈣物長期使㈣，其等亦可減少疾病爆 發之頻率。水揚酸鹽之實例包括柳氮磺胺吡啶、奥沙拉秦、 與間-氨基水揚酸。所有此等藥物皆以口服以高劑量給予以 達成最大治療利益。此等藥物並非沒有副作用。當以高劑 量服用時，Azulfidine可造成胃不適，且-些水楊酸鹽製劑 已被報導會罕見地造成輕度腎臟發炎。 皮質類固醇在治療IBD中比水楊酸鹽更有潛力且更快 速起作用’但潛在地副作用對將皮質類固醇用於具有更嚴 重疾病的患者造成限制。皮質類固醇之副作用通常於長期 使用發生。其等包括使骨骼變細且使皮膚變薄、感染、糠 尿病、肌肉消耗、使臉變圓、精神病混亂、與（罕見發生） 髖關節破壞。 在不對水楊酸鹽或皮質類固醇反應的IBD患者中，則 使用抑制免疫系統的藥物。免疫抑制劑之實例包括硫唑嘌 呤與6-疏嘌呤。用於此情況的免疫抑制劑幫助控制ibd且 201138810 允許逐漸減少或排除皮質類固醇。然而，免疫抑制劑使患 者免疫缺損且易受許多其他疾病影響。 用於研究IBD的廣為認可的模型之一為DSS結腸炎小 鼠模型，如於 Kawada 等人 “ Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease” > World J. Gastroenterol. 1 Vol. 13 (42)，pp. 5581-5593 (2007);以及 Wirtz 與 Neurath “Mouse models of inflammatory bowel disease” ，Advanced Drug Delivery Reviews，Vol. 59 (11)，1073-1083 (2007)中 所述者^ 明顯地，有對於能夠預防與治療ibd的劑之巨大需要。 使用人類防禦素治療發炎性腸疾病 引人關注的是，小腸克羅恩氏病與潘納斯細胞（paneth cell) α -防禦素HD5及HD6之含量降低相關，而結腸克羅 恩氏病與/5 -防禦素hBD2及hBD3之產生減少相關 (Gersemann 等人，2008 ; Wehkamp 等人，2005 )。此外，已 強有力地證明克羅恩氏病之發病機制中涉及腸溶微生物區 (Swidsinski等人，2002 )。該等研究人員藉由使用螢光原位 雜交顯示在活性克羅恩氏病中，觀察到黏膜相關且具侵襲 性之細菌之急劇增加，而正常小腸上皮及大腸上皮中無該 等細菌。綜合該等觀察結果總結得出一個假設，該假設表 明在健康人中，沿腸上皮障壁之適當含量之防禦素作用於 控制魯米那（luminal )細菌之組成及數目且使其不黏附及 入侵黏膜而引發發炎（Wang等人，2007 )。另一方面’在能 201138810 力不足以產生保護性含量之分泌防禦素的人中，抗微生物 防紫與魯米那細菌之間的平衡會改變。結果，此使得細菌 入侵基礎腸組織，從而誘發發炎性狀態，此又可能發展成 克羅恩氏病。 基於該假設，WO 2007/081486揭示數種人類防禦素在 發炎性腸疾病之治療中之用途。發明者提出以允許防禦素 在腸腔中之適當位置釋放之調配物形式經口向克羅恩氏病 患者投予的防禦素將減少入侵細菌之數目，重建正常上皮 障壁功能且因此降低發炎性疾病之嚴重性。 根據WO 2007/081486，防禦素之功能在於直接靶向且 殺死内腔令之細菌，從而阻止其入侵上皮組織。即，防禦 素凡全起抗感染化合物作用。關於w〇/2〇〇7/〇81486，令人 驚訝的是非經腸投予之hBD2能夠降低小鼠之DSS誘發之 結腸炎的嚴重性，因為藉由使用該投藥途徑，肽從未遇到 魯米那細g。另外，吾人此處顯示獅2之效應為減小pBMc 分泌之促發炎性細胞介素TNFa、IL1沒及IL 23之含量。 已知該等細胞介素主要參與到許多包括發炎性腸疾病之發 炎性疾病中中。十年多來一直已知，除抗微生物功能外， 防禦素亦具有多種免疫調節功能。然而，大部分關於人類 防禦素之免疫調節性質之著作描述其主要具有促發炎性或 免疫增強功忐（參見例如Niy〇nsaba等人，2〇〇7 ; B〇wdi讣 等人，2006 ; Lehrer，2004)。 因此，非經腸投予之hBD2應能夠降低IBD患者之疾 病嚴重性確實出乎意料。首先，當非經腸投予時，hBD2決

10 201138810 不會到達腸腔從而遇到參與誘發疾病之有害細菌。此外’ 基於大部分公開之文獻，如此處所提供之著作中所觀察 到’將預期進入血流之防禦素將誘發促發炎性而非抗炎性 反應。 【發明内容】· 定義 防禦素：如本文所用之術語「防禦素」係指熟習此項 技術者公認屬於抗微生物肽之防禦素類別之多肽。為確定 多狀疋否為根據本發明之防禦素，可藉由使用免費可用之 HMMER套裝軟體將胺基酸序列與pFAM資料庫之隱馬爾可 夫模型特徵（hidden markov model profile )( ΗΜΜ 特徵） 比較。 PFAM防禦素家族例如包括防禦素_丨或「哺乳類動物防 禦素」（存取號碼PF00323 )及防禦素-2或防禦素或「冷 防禦素」（存取號碼ρρ>〇〇7ΐι)。 本發明之防禦素屬於万防禦素類別。万防禦素類別之 防禦素旱有共同的結構特徵，諸如半胱胺酸模式。 根據本發明之防禦素之實例包括人類沒防禦素i (hBD1;參見SEqIDn〇: 1}、人類$防紫素2(沾〇2; 參見SEQ ID NO: 2 )、人類石防禦素3 ( hBD3 ;參見卿① N〇: 3)、人類石防禦素4 ( hBD4 ;參見seq ι〇 4)及 小鼠点防禦素3 ( mBD3 ;參見SEQ ID N〇: 6)。 一致性：兩個胺基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間 11 201138810 的相關性由參數「一致性」描述。 出於本發明之目的，如EMBOSS套裝軟體（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 荨人，2000， Trends in Genetics 16: 276-277 ； http://emb〇ss.org)、較佳3.0.0版或更新版本之尼德爾程式 (Needle program )中所實施，藉由使用尼德曼-文施算法 (Needleman-Wunsch algorithm )(Needleman 及 Wunsch， 1970,又48: 443-453 )確定兩個胺基酸序列之間 的一致性程度^視情況使用之參數為空隙開放罰分（1 〇 )、 空隙擴展罰分（0.5 )及 EBLOSUM62( BLOSUM62 之 EMBOSS 版本）替代矩陣。使用尼德爾標記之「最長一致性」（使用 非簡明選項（nobrief option)獲得）之輸出作為一致性百分 比且如下計算： (相同殘基X1 00 )/(比對長度-比對中之空隙總數）。 出於本發明之目的，如EMBOSS套裝軟體（EMBOSS: The European Molecular Biology 〇pen Software Suite, Rice 等人，2000，同上；http://emboss 〇rg)、較佳3 〇 〇版或更新 版本之尼德曼程式中所實施，藉由使用尼德曼-文施算法 (Needleman及Wunsch，丨970，同上）確定兩個去氧核糖核 苷酸序列之間的一致性程度。視情況使用之參數為空隙開

放罰分（10)、空隙擴展罰分（0·5)及EDNAFULL (NCBI NUC4.4之EMB0SS版本）替代矩陣。使用尼德爾標記之「最 長一致性」（使用非簡明選項獲得）之輸出作為一致性百分 比且如下計算：

12 201138810 (相同.去氧核糖核苷酸x 10 0 ) / (比對長度-比對中之空 隙總數）。 經分離多肽：如本文所用之術語「經分離變異體」或 「經分離多肽」係指自來源分離之變異體或多肽。在一方 面中，如SDS-PAGE所測定，變異體或多肽至少1%純，較 佳至少5%純’更佳至少1〇%純，更佳至少2〇%純，更佳至 少40%純，更佳至少60%純，甚至更佳至少8〇%純，且最 佳至少90%純。 實質上純的多肽：術語「實質上純的多肽」在本文中 表示含有至多10重量％、較佳至多8重量％、更佳至多（ 重量％、更佳至多5重量％、更佳至多4重量％、更佳至多 2重量％、最佳至多1重量％且甚

3重量％、甚至更佳至多 至最佳至多0_5重量％與 的多肽製劑。因此，軔, 哺乳類動物yS防紫素

病’諸如潰瘍性結腸炎及/或克羅恩 防禦素及/或小鼠沒防禦素之 途，其用於治療發炎性腸疾 ‘羅恩氏病。治療較佳與降低 13 201138810 所治療組織中之TNF_ α活性相關。

在一具體態樣中，本發明之哺乳類動物冷防禦素與SEQ ID NO. 1 ' SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5及/或SEQ ID NO: ό中之任一胺基酸序列具有 至少80%、較佳至少85% '更佳至少9〇%且最佳至少％% 的致丨生知度在一較佳具體態樣中，本發明之哺乳類動 物石防禦素與 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3 及/或SEQ ID NO: 4中之任一胺基酸序列具有至少8〇%、較 佳至少85%、更佳至少90%且最佳至少95%的一致性程度。 在一更佳具體態樣中，本發明之哺乳類動物石防禦素由人 類石防紫素1( SEQ IDNO: 1 )、人類召防禦素2( SEq IDN〇: 2 )、人類/5防禦素3 ( SEQ IDN〇: 3 )、人類万防禦素4 ( seq IDNO: 4)、人類石防禦素4之變異體（SEQ IDNO: 5 )及/ 或小鼠冷防禦素3 ( SEQ IDNO: 6)組成。在一甚至更佳具 體態樣中’本發明之哺乳類動物yj防禦素由人類万防禦素1 (SEQ IDNO: 1 )、人類々防禦素 2 ( SEQ IDN〇: 2 )、人類 冷防禦素3( SEQ IDNO: 3)及/或人類/5防禦素4( SEQ IDNO: 4 )組成。 在另一具體態樣中，本發明之哺乳類動物石防紫素與 呂£(^1〇]^0:2之胺基酸序列具有至少8〇%、較佳至少85%、 更佳至少90%且最佳至少95%的一致性程度。在一較佳具 體態樣中’本發明之哺乳類動物点防禦素由人類万防紫素2 (SEQ IDNO: 2)組成。 在又一具體態樣中，本發明之哺乳類動物万防紫素由 14 201138810 人類β防禦素及/或小氣万防禦素及其功能等效變異體組 成。本發明之哺乳類動物万防禦素較佳由人類万防禦素1、 人類/5防禦素2、人類万防禦素3、人類石防禦素*及小鼠 Θ防紫素3及其功能等效變異體組成。本發明之哺乳類動 4"防禦素更佳由人類"方禦素2及其功能等效變異體組 成。 、 本發明之喝乳類動物々肖f素亦稱為較佳具體態樣之 化合物。 在本發明之前後文中，哺乳類動物（例如人類）石防 禦素之「功能等效變異體（functi〇nally e — val⑽馆iaiu )」 為對發炎性腸疾病展現與親本哺乳類動物（例如人類）/ 防禦素大致相同之功效的經修飾哺乳類動物（例如人類） Θ防禦素。較佳，纟亦展現與哺乳類動物（例如人類^ 防禦素大致相同之對TNF- α活性之功效。 根據本發明，哺乳類動物（例如人類）/5防禦素之功 能等效變異體與哺乳類動物（例如人類）万防紫:胺基酸 序列相比可包含w個胺基酸修飾，較佳η個胺基酸修 飾，更佳1-3個胺基酸修飾，最佳丨_2個胺基酸修飾且 1個胺基酸修飾。 八 術語「修飾」在本文中意謂哺乳類動物（例如人類） 石防紫素之任何化學修飾。㈣可為胺基酸之取代、缺失 及/或插入以及胺基酸側鏈之置換；或在胺基酸序列中使用 具有類似特性之非天然胺基酸。詳言之.，修飾可為醯胺化， 諸如C-末端醯胺化。 15 201138810 胺基酸修飾性較佳較小，即不顯著影響多肽之摺疊及/ 或活眭之保寸性胺基酸取代或插入；單一缺失；胺基末端 或羧基末端小延伸；至多約20_25個殘基之小連接子肽；或 藉由改變淨電荷或另一功能而有利於純化之小延伸，諸如 聚組胺酸標記、抗原性抗原決定基或結合功能域。 保守性取代之實例在以下胺基酸之群範圍内：鹼性胺 基酸（精胺酸、離胺酸及組胺酸）、酸性胺基酸（麩胺酸及 天冬胺酸）' 極性胺基酸（麩醯胺酸及天冬醯胺）、疏水性 胺基酸（白胺酸、異白胺酸及纈胺酸）、芳族胺基酸（苯丙 胺酸'色胺酸及酪胺酸）及小胺基酸（甘胺酸'丙胺酸、 絲胺酸、蘇胺酸及曱硫胺酸）。一般不改變比活性之胺基酸 取代為此項技術所知且描述於例如H，Neurath及R丄H⑴， 1979, The Proteins, Academic Press，New York 中。最常發生 之交換為 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、 Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、 Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Va卜 Ala/Glu 及 Asp/Gly。 除2 0種標準胺基酸以外’亦可用非標準胺基酸（諸如 4-經基脯胺酸、6-TV-甲基離胺酸、2·胺基異丁酸、異纈胺酸 及α -曱基絲胺酸）取代野生型多肽之胺基酸殘基。可用有 限數目之非保守性胺基酸、不由遺傳密碼編碼之胺基酸及 非天然胺基酸取代胺基酸殘基。「非天然胺基酸」在蛋白質 合成後已經修飾及/或在其側鏈中具有不同於標準胺基酸之 化學結構》非天然辟基酸可化學合成且較佳自市面上購 得’且包括六氫於驗酸（pipecolic acid )、°塞哇。定〒酸、去 16 201138810 氫脯胺酸、3-甲基脯胺酸及4_甲基脯胺酸及3,3_二甲基脯胺 酸。 可根據諸如定點突變誘發或丙胺酸掃描突變誘發 (Cunningham 及 Wells，1989，iScz'ewce 244: 1081-1085) 4, 此項技術已知之.程序鑑別哺乳類動物冷防禦素中之必需胺 基酸。在後一技術中，在分子中之每一殘基處引入單一丙 胺酸突變’且測試所得突變分子之生物活性（亦即，對抗 發k·性知疾病的活性及/或T N F - α活性之抑制）以鑑別對分 子活性至關重要之胺基酸殘基。亦參見Hilton等人，1996,丄 CAem· 271: 4699-4708。必需胺基酸之一致性亦可藉由 分析與相關於哺乳類動物0防禦素之多肽之一致性來推 斷。 可使用已知突變誘發、重組及/或改組方法，繼之以相 關篩選程序來進行一或多處胺基酸取代且對其進行測試， 諸如 Reidhaar-Olson 及 Sauer，1988，Scz.ewce 241: 53-57; Bowie 及 Sauer，1989，J°roc. ΛΓα". JcacL Scz·. tASyl 86: 2152-2156 ; WO 95/17413 或 WO 95/22625 中所揭示之方法 及程序。其他可使用之方法包括易錯PCR、噬菌體呈現（例 如 ’ Lowman 等人，1991，5z’〇c/zem. 30:10832-10837 ;美國專 利第5,223,409號；WO 92/06204 )及定區突變誘發 (Derbyshire 等人，1986，Gene 46:145 ;Ner 等人，1988, 7:127)。 本發明之多肽之Ν-末端延伸宜由1至50個胺基酸、較 佳2-20個胺基酸、尤其3-1 5個胺基酸組成。在一具體態樣 17 201138810 中，N-末端肽延伸不纟Arg(R)。在另一具體態樣中，N-末端延伸包含下文將進一步定義之kex2或kex2樣裂解位 點。在-較佳具體態樣中’ N_末端延伸為包含至少兩個⑴u (E )及/或Asp ( D )胺基酸殘基之肽，諸如包含一個以下 序列之N-末端延伸：EAE、EE、DE及DD。 方法及用途 已發現人類/3防紫素2在小鼠中於1G天右旋糖聚糖硫 酸納（DSS)誘發性結腸炎模型顯著地減輕疾病參數之嚴重 性；因此展現作為供治療發炎性腸疾病（諸如潰癌性結腸 炎與克羅恩氏病）之用的醫藥品的潛在活性。 本發明因此提供治療發炎性腸疾病的方法，該治療包 含向需要該治，療之個體非經腸地投予有效量之例如呈醫藥 組成物形式之哺乳類動物"方紫素，諸如人類"方紫素2: 亦提供者為哺乳類動物—紫素（諸如人類占防紫素2)， 其用於製造供非經腸投予之用的醫藥品；及哺乳類動物万 防紫素（諸如人類石防f素2)之用途，其用於製造供非經 腸投予以治療發炎性腸疾病之用的醫藥品，例如醫藥組成 物。治療包括、冶療已有疾病或病症以及預防（prGphyiaxis 或prevention)疾病或病症。 社-㈣純t，治療使得所治餘誘發之tn α活性降低’較佳TNF_a活性降低且α ι〇活性增加。 哺乳類動物/3防禦素可治療性用於組成物中，該等 成物經調配用於經由任何習知途徑投藥，習知途徑包括 内（例如經頻、經口、經鼻、經直腸）、非經腸（例如， 18 201138810 :内、顱内、腹膜内、皮τ或肌肉 皮、鼻内或氣管内）。在Α 3局部（例如，表 ^ ^ ^；在其他具體態樣中’士 成物可作為持續釋放植入物之ν 本文中描述之組 •w —邵分投予。 在又其他具體態樣中，可利 之適當賦形劑將較佳具體態樣之：：乾燥物穩定性 物，且接著復水。 、成物§周配為冷凍乾燥 —含有哺乳類動物万防紫素（諸如人類 樂組成物可根據習知Μ，例如 -素）之醫 解或康乾過程製造。 見口、造粒、包覆、溶 (諸=具體態樣之醫藥組成物包含哺乳類動物⑽素 劑：”防禦素)及醫藥學上可接受之載劑及/或稀釋 寧=!動物'防紫f (諸如人類…幻較佳在醫 療、，.，ϋ 效治療發炎性腸疾病之量使用。對於該治 柚*二劑量當然應視例如所使用之本發明化合物之化學 ’質及藥物動力學資料、個體宿主、投藥模式及接受治療 如病狀之性質及嚴重性而變化。然而，-般而t·，為在例 人類之較大哺乳類動物中獲得令人滿意的結果，指示每 量較佳為約。遍g至約1.5g、更佳約〇.〇1§至丄〇g; f j每公斤體重0·001毫克至約每公斤體重20毫克，較佳 =每a斤體重〇 〇1毫克至約每公斤體重2〇毫克更佳約每 a斤體重〇.1毫克至約每公斤體重10毫克，例如以至多達 · — —- 一 —、二、或四次之分開的劑投予。較佳具體態樣 之化。物可以.通常使用之類似投藥模式及類似劑量向例如 19 201138810 人類之較大哺乳類動物投予。在某些具體態樣中，較佳具 體態樣之醫藥組成物可包括哺乳類動物石防禦素（諸如人 類泠防禦素）’其量視投藥途徑而定為每單位劑型約〇 5 或低於0.5 mg至約1500 mg或超過1500 mg，較佳約〇 5、 0.6、0.7、〇·8 或 〇.9 mg 至約 150 ' 200、250、300、350、 4〇〇、450、500、600、700、800、900 或 1〇00 mg，且更佳 約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20 或 25 mg 至 約 30 、 35 、 40 、 45 、 50 、 55 、 60 、 65 、 70 、 75 、 80 、 85 、 9〇、95或1〇〇 mg。然而，在某些具體態樣中，低於或高於 以上所提及之劑量的劑量有可能較佳。熟習此項技術者可 容易地決定適當的濃度及劑量。 熟習此項技術者熟知醫藥學上可接受之載劑及/或稀釋 劑。對於調配成液體溶液之組成物，可接受之載劑及/或稀 釋劑包括生理食鹽水及無菌水，且可視情況包括抗氧化 劑、緩衝劑、抑菌劑及其他常見添加劑。組成物亦可調配 成丸劑、膠囊、顆粒劑、錠劑（包覆或未包覆）、（可注射） 溶液、固體溶液、懸浮液、分散液、固態分散液（例如呈 安瓿、小瓶、乳膏、凝膠、糊狀物、吸入劑粉末、發泡體、 酊劑、唇膏、液滴、噴霧劑或栓劑形式）。調配物可含有（除 哺乳類動物β防禦素、及其他視情況選用之活性成分外） 載劑、填充劑、崩解劑、流動調節劑、糖及甜味劑、芳香 劑、防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、増溶劑、調節渗 透壓之鹽、緩衝劑、稀釋劑、分散劑及表面活性劑、黏= 劑、潤滑劑及/或此項技術已知之其他醫藥賦形劑。熟習此 20 201138810 項技術者可進一步以摘去古斗· Ώ · #以適田方式且根據公認操作法（諸如

Remington 's Pharmaceutical Sciences Γ π nces，Gennaro 編，Mack

Pubhshlng 公司，Easton，PA 1990 ψ 扣、+. ^ . Λ 〇中缸述之刼作法）調配哺 礼類動物/3防紫素。 甫礼類動物/?防禦素（諸如人類冷防禦素）可單獨使 用或以與-種、兩種或超過兩種其他醫藥化合物或藥物及/ 或-或多種醫藥學上可接受之賦形劑之組合療法使用。 試管內合成 哺乳類動物占防舉音* ^ P万尔京了使用此項技術已知之習知方法 由試管内合成製備。可利用多種 又裡冏茶合成裝置，例如Applied

Biosystems 公司、Beckman 等 哥<自動合成儀。藉由使用合成 儀，可用非天然胺基酸、尤# D_異構物（或D•形式）（例 如D-丙胺酸及D-異白胺酸）、非對映異構物、具有不同長 度或官能基之側鏈及其類似物取代天然存在之胺基酸。特 定序列及製備方式將由適宜性、經濟、所需純度及其類似 因素決定。. 可提供與包含適宜鍵結官能基之多種狀或蛋白質之化 學·鍵聯，該等官能基對於醯胺或經取代胺形成（例如還原 胺基化）巾言為胺基，對於硫驗或二硫化物形成而言為碗 醇基，對於醯胺形成而言為羧基及其類似物。 必要時，合成期間或表現期間可向肽中引入多個允許 與其他分子或表面鍵聯之基團。因此，可使用半胱胺酸製 得硫醚，組胺酸用於鍵聯金屬離子錯合物，羧基用於形成 醯胺或醋’胺基用於形成醯胺及其類似物。 21 201138810 亦可根據重組合成之習知方法分雜日紐儿 哺乳類動物

或其他純化技術純化》

解為限制本發明之範疇。 【實施方式】 實施例 意外地觀察到 在測試hBD2之免疫調節功效的期間， hBD2具有巨大的抗發炎潛力。 此處’吾人已顯示hBD2在小鼠中於治療由口服投予右 旋糖聚糖硫酸鈉（DSS)所誘發的發炎性腸疾病（結腸炎） 具有顯著的功效。吾人亦已顯示hBD2具有向下調節TNF_ α的潛力。 實施例1 人類；5防禦素2之產生 重組產生hBD2。將編碼hBD2之合成DNA片段（DNA 2.〇)選殖於pET-32(+)表現載體（Novagen)中。所得質體 編碼轉譯融合肽，該轉譯融合肽含有N_末端硫氧還蛋白部 分’繼之以his-標記、腸激酶裂解位點且最後為hBD2肽。 將表現質體轉型於大腸桿菌（五.菌株BL21中。 在含有100微克/毫升胺苄青黴素之TB-甘油中稀釋該 菌株之隔夜培養物1〇〇倍且在37°C下生長至OD600為約8 22 201138810 且用0_5 mM IPTG誘發3小時，此後藉由離心收集細胞。 使用標準方案在Ni-NTA珠粒（QIAGEN)上純化his標記 之trx-hBD2融合肽。接著將his-標記純化融合肽透析於腸 激酶緩衝劑（50 mM tris-HCl (pH 7.5) 、i mM CaCl2)令 隔夜’且用腸激酶裂解以釋放成熟hBD2。使用Source 15 S 基質（Amersham Biosciences)由陽離子交換層析進一步純 化hBD2肽。使用MALDI-TOF質譜驗證hBD2之修正分子 量。 使用相同方案產生mBD3 (參見實施例7 )。 接著使用與LC-MS及NMR光譜學聯結之胰蛋白酶分 解驗證hBD2分子之適當摺疊及二硫橋拓撲學。 由製備型RP-HPLC在低pH值下移除内毒素，且由lal 檢疋（Endosafe KTA2 )測定内毒素含量且發現含量低於檢 定之偵測極限（0.05 EU/mg)。為確定低於内毒素檢定之偵 測極限之含量不能刺激PBMC，作極有效脂多醣（大腸桿 菌’ 〇lll:B4 ’ Sigma L4391 )之刺激滴定曲線。極低含量 之該LPS ( 0_06 ng/ml )能夠刺激PBMC產生可偵測之細胞 介素。 實施例2 10天右旋糖聚糖硫酸納（dextran sodium sulphate» DSS)誘發之結腸炎小鼠模型 .以下研究之目的在於確定人類沒防禦素2在經口投予 右旋糖聚糖硫酸鈉（DSS )而誘發之急性（1 〇天）發炎性 腸疾病（結腸炎）小鼠模型中的抗炎活性。 23 201138810 DSS結腸炎小鼠模型為研究發炎性腸疾病之公認模 型，如以下文獻中所述：Kawada等人，「Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease」，World J. Gastroenterol·，第 13 卷（42)，第 5581-5593 頁（2007);及 Wirtz 及 Neurath， 「Mouse models of inflammatory bowel disease」，Advanced Drug Delivery Reviews，第 59 卷（11), 1073-1083 (2007)。 材料 測試項目 人類夂防禦素2 ( hBD2 );參見以上實施例1。 甲普賴蘇穠2 1 -半丁二酸鹽（「普賴蘇穠」） PBS 緩衝劑（GIBCO) 實驗動物 研究中使用雄性C57BL/6小鼠（Harlan Interfauna Ib6nca ’ Barcelona，Spain)，因為其為已證明當經10天投 予2% DSS之飲用水溶液時罹患顯著結腸發炎的物種及性 別。 鑑別 由尾巴上的數字及字母代碼鑑別動物。另外，由指示 動物數目及性別、測試項目代碼或名稱、劑量濃度、投藥 途徑、處理時間、組編號、研究代碼及研究指導者之名字 的顏色編碼卡鑑別各籠。 體重 24 201138810 22·4±0· 16 g ° 研究起始當天’動物之平均體重為 適應（檢疫）

研究起始之前最少7天 到達時，隨機分開動物且安置於具有不鏽鋼蓋之 之聚碳 酸醋籠（E 型，Charles River 255x405x197 mm)中。 根據性別以每籠5隻動物將動物分組安置於具有控制 之溫度（22±2°C )、光照 (1 2/1 2小時光照/黑暗）、空氣麗 力、空氣更新次數及相對濕度（3〇_7〇% )之動物房中。 所有籠底面上均具有鋸屑（Llgn〇cel 3_4 ; Harlan Interfauna Ib6rica，Spain)作為褥草。 食物及水 讓所有小鼠自由取食乾燥粒狀標準齧齒動物膳食 (Teklad Global 2014，Harlan Interfauna Iberica，Spain)。 於瓶中提供可自由取得的水。週期性分析供應至動物 房内之自來水以檢查其組成且偵測可能的污染物（化學物 質及微生物）。 設備及材料 設備 •賽多利斯（Sartorius ) BP 2100型動物天平 •手術解剖設備 •艾本德（Eppendorf) 5415C離心機 •尼康（Nikon) Eclipse E600FN 顯微鏡 •胡克-圖克（Hook & Tucker )儀器旋轉混合器 25 201138810 • IKA UltraTurrax 均質機 •賽多利斯BP 221S型分析天平 • ELISA 微板讀取器（Labsystems Multiskan EX ) 材料及試劑： •無菌拋棄式注射器（1 ml) •無菌蝴蝶型25G輸液器 •麻醉劑（開他敏.（Ketamine ) /曱苯噻嗪（Xylazine )) •局部麻醉乳膏（EMLA，Astra Zeneca) •右旋糖聚糖硫酸鈉 30.000-50.000 Da ( MP Biomedicals ) •磷酸鹽緩衝生理食鹽水（PBS ; sigma) •中性緩衝福馬林（VWR) 牛血清白蛋白（Sigma) 蛋白轉抑制劑混合物（Sigma ) •小鼠 TNF- α ELISA 套組（GE Healthcare ) 實驗方案 研究設計 將動物分成5個實驗組。各組由10隻雄性動物組成： A組：用對照組媒劑（PBS ) ( i.v.)處理 B、·且·用 hBD2 ( 〇. 1 mg/kg，i·V.)處理 C ’、且·用 hBD2 ( 1 mg/kg，i.v.)處理 、且.用 hBD2 ( l〇 mg/kg，i.v.)處理 用甲普賴蘇穠（1 mg/kg，p.〇_ )處理 以隨機方式將動物分配至所有實驗組中。各籠中最多

26 201138810 安置5隻小鼠（根據指令86/609/EEC )。在到達實驗室時 及投予測試項目之前稱重所有動物。 測試物質之投予 藉由使用無菌針（25G)以每公斤體重5毫升之給藥體 積以緩慢推注形式經由尾巴靜脈靜脈内投予對照組媒劑及 hBD2。動物連續1 〇天每天（每24小時）接受一次劑量之 相應測試項目（hBD2、普賴蘇禮或對照組媒劑）。 以每公斤體重5毫升之給藥體積經口給予劑量為}毫 克/公斤之普賴蘇穠，給藥攝生法與hBD2相同。 實驗程序 誘發結腸炎 藉由用2〇/〇 DSS補充飲用水7天在小鼠中誘發結腸炎。 第1天，稱重所有小鼠且根據其實驗組加以標記。使 各籠之飲用瓶裝滿Dss溶液，確保所有瓶蓋適當安裝且沒 有一個堵塞。 第3天，排空瓶中之任何剩餘溶液且再用新鮮溶 液裝滿。 第5天，再次重複該程序。 第8天，捨棄任何剩餘溶液且用高壓滅菌水更換。 2天後，即第1 〇天，犧牲動物。 ‘冰汗夂（疾病活性指數） ^每$木°平弋DSS處理動物，根據以下參數計算驗键 臨床疾病活性指數（D Δ τ、. C DAI) ·糞便稠度 '直腸出血存在與夺 及體重減輕，該指盤* Λ Ε Λ… 攻守日數在0至4範圍内： 27 201138810 參數 體重之變化 直腸出血 糞便稠度 <1% 1-5% 5-10% ^-15% ^15% 陰性 稀便 腹瀉 DAJ評分 0 1 2 3 4 0 4 0 2 4 以最初體重（筮！ I、 里、第1天）與實驗每天（第 際體重之間的差里百八J <貫 /、百刀比計算體重減輕。 腹4之出現係定義為黏液/糞便物質黏附於肛毛 出血係定義為含有可目‘ — 3韦τ見血液/黏液之腹瀉或大體直腸出血。 母天之DAI之最高評分為12。 取血樣

研究期間在兩個不同的時間自各動物獲得兩個血樣： 第 1天及筮 si . Λ L ^ °在各時間，在投予測試項目後2小時， 二由穿刺隱靜脈獲得血樣於Micr〇vette 微管中。該 血液抽取法不需要麻醉劑或止痛劑且在動物中產生最小應 力（Hem等人，丨998 )。另外，在研究之最後一天，亦在測 試項目投予接 9 | 0± , 依* 2小時’自所有動物之腹部腔靜脈獲得最終 ik樣。 使血樣凝結’且隨後在3000 rpm下離心1 〇分鐘且在-80 C下冷凍所得血清以便儲存。 安樂死及收集結腸樣本 第10天’最後一次投予對照組媒劑、hBD2或普賴蘇 28 201138810 穠後兩小時，以過劑量麻醉劑殺死動物。移出其結腸，且 在切除盲腸後量測結腸之長度及重量。 自各動物獲取結腸之兩部分（近端及遠端）且於中性 缓衝福馬林中防腐保存以用於根據以下料系統進行後續 組4予为析（蘇木精（haemat〇xyHn)及伊紅（)染芭 劑）： ’、* 性狀 評分 0 1 2 3 5 未觀察到變化 黏膜發炎性細胞浸潤物，極少上皮 或無上皮細胞增生。 日王 輕度分散成彌漫性發炎性細胞浸潤物，有時延 與磨蝕相關，極小至輕度上皮細胞増生及極 小至輕度之杯狀細胞之黏蛋白消耗。 發炎性細胞浸㈣，有時透壁，通常與潰 湯相關，中度上皮細胞增生及黏蛋白消耗。 明顯的發炎性細胞浸潤物，$常透壁 明顯的上皮細胞增生及黏蛋白消耗。一々相關 』|_顯的透竺_g^，嚴重潰瘍且賸臉作 結腸組織樣本中TNF- 〇：濃度之測定 再自各動物獲得結腸樣本且於含有1%牛企清白蛋白 (BSA)及蛋白酶抑制劑混合物（1毫升/2〇公克組幻之 PBSUOO毫克組織/毫升pBS)中均質化。隨後在刚啊 下離心勻質物1Θ分鐘，且將上清液儲存在·2(η：下以接著由 特異性酶免疫檢定（EUSA)測定TNF a濃度。 結果 .又 疾病活性指數評分 29 201138810 表1 ;第1天至第10天期間，疾病活性指數（DAI )評 分進展。特定日期之與對照（媒劑）組值之顯著差異顯示 為*p<0.05 ; **p<0.01 (非參數數據使用克魯斯凱-沃利斯檢 驗（Kruskal-Wallis Test))。 測試項目 數據 DAI評分 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 A組 平均值 0.00 1.10 1.30 3.20 2.90 對照組媒劑i.v. S.E.M. 0.00 0.31 0.37 0.36 0.31 B組 平均值 0.00 0.20 0.80 2.90 2.80 hBD2 0.1 mg/kg i.v. S.E.M. 0.00 0.13 0.20 0.10 0.13 C組 平均值 0.00 0.00 0.22 2.22 2.44 hBD2 1 mg/kg i.v. S.E.M. 0.00 0.00 0.22 0.15 0.18 D組 平均值 0.00 0.60 1.00 3.67 3.11 hBD2 10 mg/kg i.v. S.E.M. 0.00 0.22 0.44 0.24 0.26 E組 平均值 0.00 0.10 0.00 2.60 2.50 普賴蘇穠 1 mg/kg p.o. S.E.M. 0.00 0.10 0.00 0.22 0.22 表1 (續） 測試項目 數據 DAI評分 第6天 第7天 第8天 第9天 第9天 A組 平均值 3.10 4.10 5.90 8.90 10.90 對照組媒劑i.v. S.E.M. 0.31 0.69 1.26 1.02 0.62 B組 平均值 3.20 1.44** 2.11* 3.89** 6.44* hBD2 0.1 mg/kg i.v. S.E.M. 0.20 0.38 0.20 0.35 0.85 C組 平均值 2.89 2.22 3.67 5.22 6.44* hBD2 1 mg/kg i.v. S.E.M. 0.20 0.43 0.80 0.83 1.08 D組 平均值 3.22 2.11 4.11 6.78 7.33 hBD2 10 mg/kg i.v. S.E.M. 0.28 0.31 0.93 1.20 1.33 E组 普賴 1 mg/kg p.o. 平均值 2.60 3.10 2.50* 3.80* 4.90** S.E.M. 0.27 0.96 0.43 0.98 0.91 30 201138810 組織學評估 ,彳义取結腸之兩部分（近端及遠端），處理以 用於組織學分析（蘇木精及伊紅染色劑）且根據上述組織 學評分系統由不知情之觀察者評分。 結腸組織樣本中TNF_a濃度之測定 再自各動物獲得結腸樣本且於含有1 %牛血清白蛋白 (BSA)及蛋白酶抑制劑混合物（1毫升/2〇公克組織）之 雨（100毫克組織/毫升pBS )中均質化。隨後在_ 下離心勻質物10分鐘，且將上清液儲存在_2〇。。下以接著由 特異性酶免疫檢定（ELISA)測定TNF_ α濃度。 — $ 3:組織學評分、結腸重量及長度及結腸TNF-“農 度。與對照（媒劑）組值之組織學評分差異顯示為Μ : **Ρ<0_01 (非參數數據使用克魯斯凱_沃利斯檢驗）。， 測試項目 數據 組織學評分 近端結腸 組織學評分 遠端結腸 結腸TNF-α濃 度 (pg/g组敏、 Α組 平均值 4.20 4.50 1664 227 對照組媒劑i.v. S.E.M. 0.25 0.22 B組 hBD2 平均值 2.22** 3.67 1185 0.1 mg/kg i.v. S.E.M. 0.43 0.47 205 C組 平均值 2.89* 4.13 '—-~-- hBD2 * 1457 1 mg/kg i.v. S.E.M. 0.35 0.35 211 D組 hBD2 平均值 2.89* 4.78 1212 10 mg/kg i.v. S.E.M. 0.39 0.15 211 E組 普賴蘇穠 平均值 S.E.M. 2.80* 3.70 1833 1 mg/kg p.〇. 0.51 0.42 414 — -----~~~-_ 31 201138810 統計分析 使用統計程式Graphpad Instat 3評估結果之統計顯著 性》由用於不成對數據之克魯斯凱-沃利斯檢驗加允許多重 比較之杜氏事後檢驗（post-test Dunn )評估各組疾病活性 才曰數及組織學s平分之間的差異。p < 〇 · 〇 5之值視為顯著。 結論 結果證明’第7天（1_44±0.38測試項目對41±〇 69媒 劑’ ρ<0·01 )、第8天（2.11±0·2測試項目對5 9±1 ·26媒劑； Ρ<〇.〇5).、第9天（3.89±0.35測試項目對8 9+1〇2媒劑； ρ<0.01 )及第10天（6.44±0.85測試項目對1〇 9 + 〇 62媒劑； Ρ<〇,〇5)，所測試之最低劑量（0.lmg/kgi v )之沾⑴顯 著降低DSS投予所誘發之疾病活性指數的增加。 用中劑量hBD2 (1 mg/kg i.v·)連續處理1〇天使得疾 病活性指數評分明顯減小，但此僅在第1〇天較顯著（6料 ±1.08 測試項目對 ι〇·9±〇.62 媒劑；p<〇 〇5)。 與第1〇天關於疾病活性指數獲得之結果類似，各動物 .之近端結腸之組織學分析揭示低劑量_2處理使組織學 破壞評分極顯著地減小（2.22±().43測試項請4 2±〇义媒 劑；PIGU。此外，中劑量及高劑量之_2以及普賴蘇 穠亦觀察到組織學損傷之顯著減輕（分料2.89±〇·35、 2.89 + 0.39及2.8±〇·5;ρ<(Μ)5)。相比之下，在遠端結腸中， 雖然在經低劑量及中劑4 hBD2以及普賴蘇穠處理之動物 中可觀察到組織學損傷明顯減輕，但此在統計上並不續 著。在經高劑量则處理之動物中，未能觀察到減輕。 32 201138810 類似地’雖然用低劑量及中劑量hBD2處理使得結腸 TNF - α含直明顯減小，但該明顯減小在統計上並不顯著。 本研究中所獲得之結果證明hBD2在1 0天處理期後於 誘發之DSS結腸炎小鼠模型中的抗炎活性。然而，該抗炎 活性似乎在所使用之較低劑量之hBD2(每天0.1 mg/kg， i.v_ )下較明顯且隨著劑量遞增至研究中所使用之最高劑量 (每天10mg/kg，i.V.)而逐步損失。此外，最低劑量之❿的 之抗炎效應可與劑量為母天1 mg/kg之普賴蘇穠（p 〇 )的 抗炎效應相當或甚至高於（例如，組織學評分）劑量為每 天1 mg/kg之普賴蘇穠（P.O·)的抗炎效應。 實施例3 10天右旋糖聚糖硫酸鈉（DSS)誘發之結腸炎小鼠模 型 基本上如實施例2中所述進行實施例3<J差異如下所示。 體重 研究起始當天，動物之平均體重為i 9.74±〇,〇9 g (平均 值土SEM)。 研究設計 將動物为成9個貫驗組。各組由1 〇隻雄性動物組成. A組：用對照組媒劑（PBS，i v·)處理 B組·用hBD2 ( 1 mg/kg，i.v·)處理，每天—次 C 組.用 hBD2 ( 〇· 1 mg/kg，i.v )處理，每天一次 D 組.用 hBD2 ( 〇.〇 1 mg/kg ’ i v )處理，每天一次 E 組.用 hBD2 ( o.ooi mg/kg，i v )處理，每天一次 33 201138810 F 組：用 hBD2 ( 0.1 mg/kg，i.v. + s.c.)處理，每天兩 次 G 组：用 hBD2 ( 0·1 mg/kg，i.v.)處理，每隔—天一 次 Η組：用曱普賴蘇穠（1 mg/kg，ρ·〇·)處理 J組：用曱普賴蘇穠（1 〇 mg/kg，ρ.ο.)處理 以隨機方式將動物分配至所有實驗組中。各籠中最多 安置5隻小鼠（根據指令86/609/EEC) ^在到達實驗室時 及投予測試化合物及參考化合物之前稱重所有動物。 測試項目之投予 藉由使用無菌針（25G)以每公斤體重5毫升之給藥體 積以緩慢推注形式（經15秒之時間）經由尾巴靜脈靜脈内 投予對照組媒劑及hBD2。 A組至E組中之動物連續1〇天每天（每24小時）接 受一次劑量之相應測試項目（hBD2、普賴蘇穠或對照組媒 劑）。 F組中之動物接受一次靜脈内劑量及另—皮下劑量（靜 脈内劑量後12小時）之相應測試項目，連續i 〇天。 G組中之動物連續10天每隔—天接受—次劑量之相應 測試項目。 以每公斤體重5毫升之給藥體積經口給予劑量為ι mg/kg ( Η組）及1〇 mg/kg ( J組）甲普賴蘇穠，每天一次’ 連續10天。 取血樣 34 201138810 在研究之最後一天，在測試項目投予後2小時，自所 有動物之腹部腔靜脈獲得最終血樣。 使jk樣凝結，且隨後在3000 rpm下離心10分鐘，且在 -80°C下冷凍所得血清以用於後續分析。 結果 疾病活性指數評分 表4 :第1天至第10天期間，疾病活性指數（D AI )評 分進展。特定日期之與對照（媒劑）組值之顯著差異顯示 為*ρ<0.05 ; **ρ<0·01 (非參數數據使用克魯斯凱-沃利斯檢 驗）。第6天至第10天顯示於下一頁中。 測試項目 數據 DAI評分 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 Α組 平均值 0.00 0.00 0.10 0.10 0.20 對照組癌劑i.v. S.E.M. 0.00 0.00 0.10 0.10 0.13 B組 hBD2 1 mg/kg i.v. 平均值 0.00 0.10 0.20 0.40 0.30 S.E.M. 0.00 0.10 0.13 0.16 0.21 C組 hBD2 平均值 0.00 0.44 0.89 0.56 0.78 0.1 mg/kg i.v. S.E.M. 0.00 0.18 0.42 0.29 0.28 D組 hBD2 0.01 mg/kg i.v. 平均值 0.00 0.00 0.30 0.40 1.60 S.E.M. 0.00 0.00 0.15 0.16 0.43 E組 hBD2 0.001 mg/kg i.v. 平均值 0.00 0.00 0.10 0.20 0.40 S.E.M. 0.00 0.00 0.10 0.13 0.16 F組 hBD2 Q，1 mg% 母天兩次 平均值 0.00 0.30 0.70 0.70 0.60 S.E.M. 0.00 0.21 0.30 0.34 0.16 l.V.+S.C. G組 平均值 0.00 0.20 0.40 0.50 0.50 hBD2 0.1 ^ig/kg i.v. 母兩天 S.E.M. 0.00 0.13 0.22 0.17 0.17 普賴;蠢穠 平均值 0.00 0.50 0.50 0.40 1.10 1 mg/kg p.o. S.E.M. 0.00 0.17 0.17 0.16 0.18 1Λ普綠穠 10 mg/kg p.o. 平均值 0.00 0.30 0.70 0.80 1.30 S.E.M. 0.00 0.15 0.21 0.20 0.21 35 201138810 表4 (續） 測試項目 數據 DAI評分 第6天 第7天 第8天 第9天 第10天 A組 平均值 6.90 9.67 11.11 11.67 11.00 對照組媒劑i.v. S.E.M. 1.02 0.33 0.31 0.17 0.65 B組 hBD2 平均值 2.30* 4.40* 6.89 5.00* 5.78* 1 mg/kg i.v. S.E.M. 1.00 1.03 1.41 0.60 0.70 C組 hBD2 平均值 1.56** 4.13* 5.43* 6.29* 6.86 0.1 mg/kg i.v. S.E.M. 0.73 0.83 1.13 1.64 1.14 D組 hRD2 平均值 2.70 6.50 6.20* 4.60*** 5.20** 0.01 mg/kg i.v. S.E.M. 1.08 1.28 1.06 0.98 0.87 E組 hBD2 平均值 3.40 7.11 8.56 5.89** 6.67 0.001 mg/kg i.v. S.E.M. 1.32 1.38 1.06 1.63 1.30 F組 hBD2 平均值 0.70*** 3.50** 4.00*** 2·9〇*** 4.50*** 0.1 mg/kg 每天兩次 S.E.M. 0.30 0.89 1.17 0.55 0.62 i.v.+s.c. G組 hBD2 平均值 2.90 6.50 8.70 7.50 6.56 0.1 mg/kg i.v. 每兩天 S.E.M. 1.12 1.11 1.25 0.93 0.99 H組 普賴蘇穠 平均值 3.80 5.90 6.40 5.60* 5.60* 1 mg/kg p.〇. S.E.M. 0.98 1.16 0.88 0.88 0.65 J組 普賴蘇穠 平均值 2.00 3.20** 4.80** 5.20* 4.00*** 10 mg/kg p.o. S.E.M. 0.30 0.73 0.53 0.61 0.00 組織學評估 自各動物獲取結腸之兩部分（近端及遠端）’處理以 ^於、.且織予分蘇木精及伊紅染色劑），且根據上述評 分系統由不知情之觀察者評分。

36 201138810 表5 :組織學評分、結腸重量及長度及結腸TNF- α濃 度。與對照（媒劑）組值之組織學評分差異顯示為*ρ<0.05 ; **ρ<0.01 (非參數數據使用克魯斯凱-沃利斯檢驗）。 測試項目 數據 組織學評分 近端結腸 組織學評分 遠端結腸 A組 平均值 2.44 4.67 對照組媒劑i.v. S.E.M. 0.34 0.17 .B組 hBD2 平均值 1.78 3.56 1 mg/kg i.v. S.E.M. 0.36 0.38 C組 hBD2 平均值 1.71 3.14* 0.1 mg/kg i.v. S.E.M. 0.18 0.40 D組 hBD2 平均值 1.70 3.10** 0.01 mg/kg i.v. S.E.M. 0.26 0.23 E組 hBD2 平均值 1.44 3.56 0.001 mg/kg i.v. S.E.M. 0.24 0.18 F組 hBD2 平均值 1.30* 2.90*** 0.1 mg/kg 每天兩次i.v.+s.c. S.E.M. 0.21 0.23 G組 hBD2 平均值 1.56 3.56 0.1 mg/kg i.v. 每兩天 S.E.M. 0.24 0.29 H組 普賴蘇穠 平均值 1.40 3.00*** 1 mg/kg p.o. S.E.M. 0.22 0.00 J組 普賴\蘇穠 平均值 1.40 2.70*** 10 mg/kg p.o. S.E.M. 0.16 0.21 統計分析 使用統計程式Graphpad Instat 3評估結果之統計顯著 37 201138810 性。由用於不成對數據之克魯 f斯虮_沃利斯檢驗+用於多曹屮 較之杜氏事後檢驗評估各6且应由、 合、、且疾病活性指數及組織學 間的差異。Ρ<0·05之值視如^ ，飞千。平刀之 优马顯者。在上表中，與相應 (媒劑）組比較之顯著差異表 α … 石左共表不為：*ρ<〇 〇5，*

*" ρ<0·001。 P 結論 本研究之目的在於確定+ 足hBD2在經口投予右旋糖聚糖 硫酸鈉（DSS，2% )誘發之各村r】Λ工、饮欠t 心性（10天）發炎性腸疾病（結 腸炎）小鼠模型中的抗炎活性。 本研究中所獲得之結果進一步證明hBD2在〗〇天處理 期後於誘發之DSS結腸炎小鼠模型中的抗炎活性.。該抗炎 活性似乎在每天兩次（每12小時）靜脈内與皮下投予〇1 mg/kg劑量之hBD2後較明顯。此外，該劑量之hBD2所觀 察到之抗炎效應可與經口給予之1 mg/kg或1 〇 mg/kg劑量 之普賴蘇穠的抗炎效應相當或甚至高於（疾病活性指數與 組織學評分兩方面）經口給予之1 mg/kg或1 〇 mg/kg劑量 之普賴蘇穠的抗炎效應。 實施例4 人類；S防禦素2 ( hBD2 )之抗炎活性 在人類PBMC培養物中，可觀察到用 hBD2治療對 LPS、LTA或肽聚糖刺激培養物之細胞介素分布產生重大影· 響。先前已觀察到hBD2能夠誘發促發炎性細胞介素及趨化 因子 IL-6、IL-1 冷、RANTES、IP-10 及 IL-8 ( Niyonsaba 等 人，2007 ; Boniotto M.等人，2006 )。 201138810 此處’吾人顯示hBD2對兩種促發炎性細胞介素tnf 及1 L-1召具有下調潛能；且hBD2在酯多酿（lp@ )、脂石舞 壁酸（LTA)或肽聚糠（PGN)誘發發炎性刺激後亦誘發 IL-1(^ IL-10為潛在抗炎細胞介素且因此所得hBD2之效應 為抗炎效應。人類PBMC、單核細胞細胞株及類樹狀細胞株 (dendritoid cell line )已觀察到該結果。 hBD係如於實施例1中所述製備。

分離及刺激PBMC 自健康志願者（經丹麥相關倫理委員會批准）抽取末 梢血液。用RPMI 1/1 (v/v)稀釋肝素化血液且在抽取後2 小時内，使之進行Ficoll密度離心。自個別供體之上層收集 灰漿且保持在冰上直至其以2〇/〇用於培養基中（自體培養 基）。將經分離PBMC再懸浮於自體培養基中且接種於％ 孔培養板中’每孔255,000個細胞’總體積為2〇〇微升。以 1〇〇、10 或 1/ig/ml hBD2 單獨刺激或與 〇 6 ng/mL 或 2〇 ng/mL LPS (大腸桿菌，〇lli:B4，Sigma.L4391) 、1 25" g/ml脂磷壁酸（LTA )(來自枯草桿菌（5肩⑽…），抑邮 L3265 )或40/zg/ml肽聚糖（PGN)(來自金黃色葡萄球菌 (⑽rew )，Sigma 77140) —起刺激相同供體之pBMc。 在最初貫驗中針對3種不同供體優化用於刺激之濃度，對 於LPS，使用兩種不同濃度以確保其處於有可能調節之細胞 介素含量。在一些實驗中，用地塞松及吲哚美辛單獨以及 與LPS或LTA —起處理PBMC作為下調發炎性細胞介素之 對照組。在37 C下培育24小時後收集上清液，且儲存在 39 201138810 °C下直至量測細胞介素。在所有實驗中由阿拉馬藍（Aiamar Blue )( Biosource ’ DALL 11〇〇)量測生存力，且在一些狀 況下亦根據製造商之說明書由MTS ( Promega )量測生存 力’且在一些貫驗中’亦藉由以Nucleocounter計數細胞來 判斷。 培養及刺激MUTZ-3 將衍生自人類骨髓白血病之細胞株MUTZ-3 ( DSMZ， Braunschweig, Germany )維持在補充有 20%〔體積/體積 (v/v)〕胎牛血清（SigmaF6178)及 40 ng/ml rhGM-CSF (R&D Systems 215-GM-050 )的 a-MEM ( Sigma M4526 ) 中。該等祖細胞位於以下說明之單核細胞細胞株中且該等 單核細胞經1 00、1 0或1 // g/ml hBD2單獨刺激或與LPS或 L T A —起刺激。 樹狀細胞分化 為產生類樹狀細胞株’使人類骨髓白企病細胞株 MUTZ-3 ( lxlO5 個細胞/毫升）在 rhGM-CSF ( 150 ng/ml) 及rhlL-4 ( 50 ng/ml )存在下分化成不成熟DC歷時7天。 每2-3天更換培養基。進一步在hBD2存在或不存在下用 LPS或LTA刺激分化之細胞株以探索hBD2對樹狀細胞之 效應。 細胞介素量測 在FACS array流式細胞計數儀上根據製造商之說明書 (BD )用人類發炎細胞計數珠粒陣列（CBA )由流式細胞 計數量測上清液中細胞介素之產生。量測以下細胞介素： 40 201138810 IL-8、IL-l /3、IL-l〇、TNF、 中，根據製造商之說明書由 (IL-10 ' TNF- a > IL-1 β ) 數據分析 IL-12P70、IL-6。在—些實驗 R&D SyStems 之 Eusa 套組 量測細胞介素。 所有實驗執行至少兩：欠’顯*代表性結果。所呈現之 數據可以平均值仏標準偏差（SD)表示。由變異數為治： (動2、地塞松等）及刺激（Lps、LTA、肽聚糖等）之雙 因子（2-^ )AN〇VA，接著由邦弗朗尼事後檢驗（Bonferroni post-test)確定統計顯著性，如表圖例中所報導。p < 視為差異顯著。 ‘ .結果 測試hBD2對經或未經LPS及LTA治療之人類 之效應（表6、7、及8)。hBD2之治療使得所有三個測試 濃度之刺激培養物中之TNF顯著下調（表6)，該下調對 0.6 ng/ml之LPS而言及對LTA而言係呈劑量依賴型。對於 IL-1 /3，主要在最高劑量下觀察到下調（表7 )。引人關注 的是IL-10劑量依賴性顯著上調（表8 ) ^促發炎性細胞介 素之下調及抗炎細胞介素之誘發顯示hBD2之極強抗炎潛 能。由兩種不同檢定量測生存力以排除hBD2歸因於細胞毒 性效應之抗炎效應。在表9及表1 〇中，.可見hBD2不對細 胞產生細胞毒性效應’所觀察到之效應為歸因於導致細胞 增殖之LPS或LTA之刺激的刺激效應。因此，hBD2不對 該等細胞產生細胞毒性效應。 在表11、12、及13中’由ELISA而不是由流式細胞 41 201138810 計數以細胞計數珠粒陣列八 介素，此處觀察到相同結^斤另—供體之上清液.中之細胞 極限高得多，且因此效’但檢定之靈敏度較低且偵測 A應不顯著。 為測s式另—類録香辦 之PBMC的效應（表14及位體’研究咖2對肽聚糖刺激

劊吾栌紹从丁 1 5 )。觀察到相同結果：TNF 劑量依賴性下調且α·1()劑量依賴性誘發。 作為TNF下調之陽性 ^ ^ ^ ^ '、、、、’且，在檢定中測試兩種抗炎 化合物，地塞松及吲啐盖 、。選擇濃度以使化合物無毒且 為由於培養基中之溶解度 X j達成之濃度。經LTA刺激後， 僅吲哚美辛抑制TNF (表]、 6 )’而地塞松有效下調TNF產 生，比_1/5亦觀察到相同結果（表18) “弓卜朵美辛為c购 及COX-2抑制劑且為用於治療輕度至中度疼痛之非類固醇 抗炎藥（NS AID )且有助於減輕關節炎之症狀，且地塞松為 主要用於治療發炎性病症之合成糖皮質激素^其在極低劑 量下對促發炎性細胞介素具有極有效的下調效應（R〇wland 等人，1998 )，對於TNF- α及il-1冷，吾人亦觀察到相同 結果。hBD2與該兩種抗炎化合物一樣有效或比其有效。 在表19及20中’顯示hBD2.對單核細胞細胞株中之下 調TNF及樹狀細胞的效應，對pbmC亦觀察到相同結果。 經hBD2及LPS或hBD2及LTA刺激之樹狀細胞亦誘發 IL-10 (結果表中未示）。 為排除hBD2與LPS或LTA之結合引起TNF及IL-1召 之下調，測試hBD2對合成配位體（Pam3CSK4( TLR2-TLR1 配位體），InvivoGen tlrt-pms )所致之PBMC刺激的效應。 42 201138810 在經該配位體刺激後，hBD2亦能夠下調TNF，表明LPS或 LTA之中和不會引起所觀察到的效應（結果表中未示）。 此外，含有TNF- α及IL- α之細胞介素混合物以及hBD2對 樹狀細胞之刺激與僅細胞介素混合物之刺激相比對1L-1 /3 及IL-8及IL-6具有下調效應。顯然，未分析到歸因於TNF-α之刺激之對TNF的效應（結果表中未示）。 表6 :在hBD2存在及不存在下經LPS或LTA處理後， 自人類末稍血液單核細胞（PBMC )產生TNF，所有樣本針 對相同供體測試，出自5種供體之代表性實驗。在FACSarray 上由細胞計數珠粒陣列（CBA )量測TNF，***指由雙因子 ANOVA分析（各數據集之N =約200 )，與各自對照組（粗 體）相比，p<0_001。 TNF，pg/ml 對照組 hBD2 hBD2 hBD2 (SD) 100 pg/ml 10 pg/ml 1 pg/ml 培養基 7.3 (5.9) 2.9 (5.1) 2.6 (6.6) 4.2 (10.7) LPS 1708.6 634.2 (226.1)** * 1076.4 944.8 0.6 ng/ml (428.3) (278.0)*** (326.6)*** LPS 2572.1 1733.9 (461.3)** 氺 1306.6 1526.9 20 ng/ml (581.1) (375.0)*** (444.2)*** LTA 1097.4 375.2 (114.2)** * 494.7 711.5 1.25 /xg/ml (293.8) (158.1)*** (282.5)*** 表7 :在hBD2存在及不存在下經LPS或LTA處理後， 自人類末稍血液單核細胞（PBMC )產生IL-1 /3，所有樣本 針對相同供體測試，出自5種供體之代表性實驗。在 43 201138810 FACSarray上由細胞計數珠粒陣列（CB A )量測IL-1冷，* * * 指由雙因子ANOVA分析（各數據集之N =約200 )，p<0.001。 IL-1/3, pg/ml (SD) 對照組 hBD2 100 pg/ml hBD2 10 pg/ml hBD2 1 pg/ml 培養基 4.2 5.3 3.8 4.1 (4.7) (7.1) (5.8) (51.0) LPS 1734.3 811.0 1949.8 1436.2 0.6 ng/ml (347.0) (454.4)*** (396.4)*** (429.7)*** LPS 2629.5 1502.1 2273.9 1889.3 20 ng/ml (533.7) (407.5)*** (486.5)*** (504.8)*** LTA 748.5 538.3 935.3 986.7 1.25 jug/ml (172.4) (137.3)*** (238.0)*** (738.7)兩 表8 :在hBD2存在及不存在下經LPS或LTA處理後， 自人類末梢血液單核細胞（PBMC )產生IL-1 0，所有樣本 針對相同供體測試，出自5種供體之代表性實驗。在 FACSarray上由細胞計數珠粒陣歹ij ( CBA)量測IL-10，*** 指由雙因子ANOVA分析（各數據集之N =約200 )， ρ<0·001 ， **指 ρ<0·01 ， *指 ρ<0.5 。 IL-10, pg/ml (SD) 對照組 hBD2 100 pg/ml hBD2 10 pg/ml hBD2 1 pg/ml 培養基 2.09 2.9 1.6 2.09 (8.65) (4.6) (4.1) (4.3) LPS 63.15 232.7 325.7 97.2 0.6 ng/ml (302.5) (61.5)*** (88.2)*** (31.1)* LPS 70.4 383.3 355.8 111.3 20 ng/ml (22.8) (133.6)*** (99.5)*** (38.8)** LTA 14.0 175.6 136.6 39.9 1.25 /ig/ml (226.1) (57.0)*** (44.7)*** (16.9) 44 201138810 表9 :由MTS檢定量測之24小時刺激後PBMC之生存 力。由雙因子ANOVA，接著由邦弗朗尼事後檢驗檢驗，各 列中具有不同下標字母之值差異顯著。 生存力，MTS (Abs 490 nm (SD)) 對照組 hBD2 100 pg/ml hBD2 10 pg/ml hBD2 1 j^g/ml 培養基 1.4 1.2 1.5 1.3 (0.2) (0.05)3 (0.2)3 (0.2) LPS 1.6 1.6 2.0 1.5 0.6 ng/ml (0.02) (0.1 )ab (0.2)b (0.2) LPS 1.5 1.9 1.8 1.6 20 ng/ml (0.1) (0.2)b (0.3)ab (0.3) 表10:由阿拉馬藍（Alamar Blue)量測之PBMC生存 力，出自5種不同供體之5個實驗中之一個代表性實驗。 由雙因子ANOVA，接著由邦弗朗尼事後檢驗檢驗，各列中 具有.不同上標字母之值及各行中具有不同上標數字之值差 異顯著。 生存力，阿拉馬藍 (RFU (SD)) 對照組 hBD2 100 pg/ml hBD2 10 gg/ml hBD2 1 /zg/ml 培養基 4097130 (166631) 3950053 (34466)3 3683369 (355296)3 4064143 (104634) LPS 0.6 ng/ml 4279424 (336188) 4831188 (67646)b 4664362 (147776)b 4230588 (139745) LPS 20 ng/ml 4604671 (125840) 4765256 (41383)b 4623818 (56643)b 4561739 (138852) LTA 1.25 pg/rr^l 4018914 (632833)1 4664185 (154023)b,2 4677870 (10199)b,2 4148294 (182730)12 201138810 表11 :經hBD2、LTA、LPS或其組合刺激後PBMC之 TNF- α分泌。由ELISA量測TNF- a，nd :未偵測到，檢定 之偵測極限為〇.〇 1 ng/ml，*指與各自對照組相比’ p<0.05， **指與各自對照組相比，ρ<〇.〇1。 TNF-ce, ng/ml (SD) 對照組 hBD2 100 jU.g/ml hBD2 10 pg/ml hBD2 1 jitg/ml 培養基 nd nd nd nd LPS 0.99 0.41 0.59 0.70 0.6 ng/ml (0.27) (0.03)** (0.08)* (0.18) LPS 1.44 0.53 0.49 1.18 20 ng/ml (0.31) (0.01)** (0.05)** (0.42) LTA 0.90 0.21 0.27 0.65 1.25 pg/ml (0.32) (0.05)* (0.04)* (0.29) 表12 :經hBD2、LTA、LPS或其組合刺激後，PBMC 之IL-10分泌，由ELISA量測TNF- a，nd :未偵測到，檢 定之4貞測極限為0.03 ng/mL。 IL-10, ng/ml 對照組 hBD2 hBD2 hBD2 (SD) 100 Mg/ml 10 pg/ml 1 μ@/ιη1 培養基 nd nd nd nd LPS nd 0.14 0.04 nd 0.6 ng/ml (0.04) (0.0) LPS nd 0.46 0.34 nd 20 ng/ml (0.04) (0.04) LTA 1.25 pg/ml nd nd nd nd 46 201138810 表13 :經hBD2、LTA、LPS或其組合刺激後，PBMC 之IL-1召分泌，由ELISA量測TNF- a，nd :未偵測到，檢 定之偵測極限為0.016 ng/mL，**指與各自對照組相比， ρ<0 · 0 1 ° IL-1/3, ng/ml (SD) 對照組 hBD2 100 /xg/ml hBD2 10 pg/ml hBD2 1 "g/ml 培養基 nd nd nd nd LPS 0.6 ng/ml 0.318 (0.087) 0.275 (0.015) 0.268 (0.039) 0.237 (0.007) LPS 20 ng/ml 0.920 (0.267) 0.395 (0.033)** 0.354 (0.013)** 0.638 (0.159) LTA 1.25 pg/ml 0.291 (0.092) 0.281 (0.059) 0.193 (0.019) 0.224 (0.030) 表14 :在hBD2存在及不存在下，經PGN處理後，自 人類末稍血液單核細胞（PBMC )產生TNF，所有樣本針對 相同供體測試。在FACS array上由細胞計數珠粒陣列（CB A ) 量測TNF，***指由雙因子ANOVA分析（各數據集之N = 約200 )，與各自對照組相比，ρ<0·001。

TNF, pg/ml 對照組 hBD2 hBD2 hBD2 (SD) 100 pg/ml 10 pg/ml 1 pg/ml 培養基 0.0 3.6 3.7 3.4 (4.0) (5.3) (6.2) (5.2) PGN 1099.1 274.9 362.0 809.9 40 pg/ml (251.6) (71.6)*** (97.7)*** (246.7)*** 47 201138810 表15 :在hBD2存在及不存在下，經PGN處理後，自 人類末稍血液單核細胞（PBMC )產生IL-1 0，所有樣本針 對相同供體測試。在FACSarray上由細胞計數珠粒陣列 (CBA)量測TNF，***指由雙因子ANOVA分析（各數據 集之N =約200 )，與各自對照組相比，ρ<0·001。 IL-10, pg/ml 對照組 hBD2 hBD2 hBD2 (SD) 100 pg/ml 10 pg/ml 1 pg/ml 培養基 0.0 (4.1) 3.0 (9.6) 3.6 (13.1) 3.0 (4.8) PGN 381.3 1054.2 523.4 337.8 40 pg/ml (92.3) (179.3)*** (111.5)*** (89.1) 表16 :在hBD2或抑制TNF之兩種不同對照組（地塞 松及吲哚美辛）存在及不存在下，經LPS或LTA處理後， 自人類末稍血液單核細胞（PBMC )產生TNF ;所有樣本針 對相同供體測試。在FACSarray上由細胞計數珠粒陣列 (CBA )量測TNF，由雙因子ANOVA分析（各數據集之N =約200 )，與各自對照組（粗體）相比，加下劃線之值顯 著減小。 TNF, ng/ml 培養基 LPS LPS LTA (SD) 0.6 ng/ml 20 ng/ml 1.25 pg/ml 對照組 0.0 1.43 2.84 6.72 (0.0) (0.05) (0.07) (0.14) 地塞松 0.0 0.038 1.69 1.75 35 ng/ml (〇·〇) (0.004) (0.05) (0.05) 地塞松 0.0 '0.30 0.91 2.05 3.5 ng/ml (〇.〇) (0.01) (0.03) (0.06) 地塞松 0.0 0.61 6.04 4.73 0.35 ng/ml (〇·〇) (0.02) (0.14) (0.10) 48 201138810 吲哚美辛 0.0 1.71 2.70 5.80 7.2 ug/ml (〇·〇) (0.07) (0.07) (0.13) 吲哚美辛 0.0 1.56 7.54 5.50 0.72 ug/ml (0.0) (0.04) (0.17) (0.13) hBD2 0.0 0.003 0.000 0.11 1000 pg/ml (0_0) (0.002) (0.002) (0.01) hBD2 0.0 0.000 0.038 1.15 100 jUg/ml (0·0) (0.002) (0.003) (0.04) hBD2 0.0 0.20 0.35 2.33 10 pg/ml (0·0) (0.01) (0.01) (0.06) hBD2 0.0 0.17 6.24 3.90 1 "g/ml (0·0) (0.01) (0.14) (0.10) 表17 :在hBD2或抗炎效應之兩種不同對照組（地塞 松及吲°朵美辛）存在及不存在下，經LPS或LTA處理後， 自人類末稍血液單核細胞（PBMC )產生IL-1 0 ;所有樣本 針對相同供體測試。在FACS array上由細胞細胞珠粒陣列 (CBA)量測IL-10，由雙因子ANOVA分析（各數據集之 N =約200 )，與各自對照組（粗體）相比，加下劃線之值 顯著增加。 IL-10, pg/ml (SD) 培養基 LPS 0.6 ng/ml LPS 20 ng/ml LTA 1.25 pg/ml 對照組 0.0 53.9 123.4 170.1 (218.8) (3.1) (4.6) (5.5) 地塞松 0.0 100.4 152.5 175.2 35 ng/ml (1.4) (3.8) (5.2) (6.6) 地塞松 2.7 64.6 122.8 112.5 3.5 ng/ml (1.9) (3.3) (4.7) (3.9) 地塞松 3.9 46.8 197.1 126.6 0.35 ng/ml (1.9) (2.8) (7.2) (4.7) 49 201138810 吲哚美辛 0.0 45.7 77.9 90.4 7.2 ug/ml (1.5) (2.5) (3.6) (4.9) 吲哚美辛 0.0 37.3 108.0 84.9 0.72 ug/ml (1.4) (19.6) (4.4) (3.5) hBD2 0.0 30.8 50.5 465.2 1000 pg/ml (1.6) (2.6) (3.2) (16.3) hBD2 0.0 173.5 885.2 766.0 100 iiglm\ (4.9) (5.7) (22.2) (21.7) hBD2 3.9 165.1 497.5 . 355.8 10 pg/ml (1.7) (5.6) (13.5) (9.4) hBD2 0.0 42.7 207.0 142.1 1 /ig/ml (1.9) (2.8) (6.9) (4.9) 表1 8 :在hBD2或抗炎效應之兩種不同對照組（地塞 松及吲哚美辛）存在及不存在下，經LPS或LTA處理後， 自人類末稍血液單核細胞（PBMC )產生IL-1 /3 ;所有樣本 針對相同供體測試。在FACSarray上由細胞計數珠粒陣列 (CBA)量測IL-1召，由雙因子ANOVA分析（各數據集之 N =約200 )，與各自對照組（粗體）相比，加下劃線之值 顯著減小。 IL-ljS, ng/ml 培養基 LPS LPS LTA (SD) 0.6 ng/ml 20 ng/ml 1.25 pg/ml 對照組 0.00 3.96 6.58 11.47 (0.06) (0.18) (0.23) (0.38) 地塞松 0.00 1.00 2.32 3.98 35 ng/ml (0.00) (0.03) (0.07) (0.14) 地塞松 0.00 1.90 3.58 5.22 3.5 ng/ml (0.00) (0.06) (0.12) (0.19) 50 201138810 地塞松 0.01 23 5.56 7.91 0.35 ng/ml (0.00) (0.09) (0.18) (0.28) 吲哚美辛 0.04 4.1 6.12 8.91 7.2 ug/ml (0.00) (0.13) (0.23) (0.30) 吲哚美辛 0.01 . 3.1 6.46 7.53 0.72 ug/ml (0.00) (0.18) (0.22) (0.31) hBD2 0.01 0.53 1.19 4.43 1000 pg/ml (0.00) (0.02) (0.08) (0.14) hBD2 0.00 0.38 1.67 9.12 100 /ig/ml (0.00) (0.01) (0.05) (0.32) hBD2 0.06 1.13 3.58 11.0 10 pg/ml (0.00) (0.04) (0.12) (0.37) hBD2 0.01 1.83 4.91 8.87 1 pig/ml (0.00) (0.06) (0.19) (0.29) 表19 :在hBD2存在及不存在下，經LPS或LTA處理 後自人類單核細胞細胞株（MUTZ-3 )之上清液中產生TNF。 在FACSarray上由細胞計數珠粒陣列（CBA )量測TNF，* 指由雙因子ANOVA分析（各數據集之N =約200 )，與各 自對照組相比，p<0.05，**指與各自對照組相比，p<0.01。 TNF, pg/ml 對照組 hBD2 hBD2 hBD2 (SD) 100 pg/ml 10 pg/ml 1 pg/ml 培養基 0.00 0.00 2.60 2.21 (5.56) (5.47) (7.17) 〇7.88) LPS 6.38 3.93 3.93 6.61 1_5 pg/ml (9.28) (6.63)* (6.93)* (9.17) LTA 5.28 2.64 3.76 1.75 1.5 pg/ml (9.75) (29.19)* (7.72) (6.96)** 51 201138810 表20 :在hBD2存在及不存在下，經LPS或LTA (產 生成熟樹狀細胞（D C ))刺激之不成熟樹狀細胞之上清液 中產生TNF。在FACSarray上由細胞計數珠粒陣列（CBA ) 量測TNF，*指由雙因子ANOVA分析（各數據集之N =約 200 )，與各自對照組相比，顯著減小之p<0.05，**指與各 自對照組相比，顯著減小之.p<0.01。 TNF, pg/ml (SD) 對照組 hBD2 100 pg/ml hBD2 10 pg/ml hBD2 1 (ig/ml 培養基 0.00 0.00 1.89 4.64 (1·74) (1.83) (2.15) (10.26) LPS 23.73 7.66 13.8 18.04 1.5 pg/ml (3.28) (2.51)*** (2.33)*** (2.89)*** LTA 3.78 5.22 2.76 0.00 1.5 pg/ml (2.26) (2.25) (2.27)* (1.98)*** 實施例5 hBDl、hBD2、hBD3及hBD4變異體之抗炎活性 基本上如實施例4中所述進行實施例5。下表中所示之 化合物rhBD2為重組hBD2,其與實施例4中所使用之hBD2 一致。 下表中所示之化合物hBDl、hBD2、hBD3及hBD4變 異體係利用化學合成製備及自Peptide institute公司獲得。 重組hBD2 ( rhBD2 )之胺基酸序列與化學合成製備之 hBD2之胺基酸序列一致。 下表中所示之hBD4變異體由hBD4之胺基酸3-39組 成，且胺基酸序列以SEQ ID NO: 5顯示。 在各表中，所有樣本針對對相同供體測試。SD意謂標 52 201138810 準偏差。 結果 . 表2 1 :在人類沒防禦素、地塞松或英利昔單抗存在及 不存在下，經LPS治療後，自人類末稍血液單核細胞 (PBMC)產生TNF。在FACSarray上由細胞計數珠粒陣列 (CBA)量測TNF，*指由雙因子ANOVA分析且由邦弗朗 尼事後檢驗與未處理細胞相比，p<〇.〇5，**指p<0.01，*" 指 p<0.001° 測試化合物 培養基 LPS 20 ng/ml LPS 0.6 ng/ml TNF pg/ml (SD) 對照組之％ TNF Pg/ml (SD) TNF Pg/ml (SD) 對照組之％ 培養基 (未處理） 1 (i) 100% 2164 (632) 100% 728 (156) 100% rhBD2 40 pg/ml 0 (0) - 167 (17)*** 8% 74 (5)*** 10% rhBD2 10 p^g/ml 0 (〇) - 260 (29)*** 12% 125 (20)** 17% rhBD2 1 pg/ml 1 (0) - 918 (373)*** 42% 196 (104)** 27% hBDl 40 pg/ml 0 ⑼ - 999 (116)*** 46% 91 (8)** 13% hBDl 10 pg/ml 0 (1) - 1311 (417)*** 61% 203 (20)** 28% 53 201138810 hBDl 1 pg/ml 1 (i) - 1395 (201)*** 64% 474 (187) 65% hBD2 40 pg/ml 0 (0) - 52 2% 176 (103)** 24% hBD2 10 pg/ml 0 (〇) - 132 (179)*** 6% 304 (108)* 42% hBD2 1 pg/ml 0 (0) - 411 (581)*** 19% 242 (30)* 33% HBD-3 1 pg/ml 0 (〇) - 451 (24)*** 21% 528 (98) 73% hBD4變異體 10 pg/ml 0 (〇) - 139 (6)*** 6% 211 (22)** 29% hBD4變異體 1 pg/ml 0 ⑼ - 778 (27)*** 36% 468 (59) 64% 地塞松 0 (0) - 635 (163)*** 29% 47 ⑻*** 6% 英利昔單抗 0 (0) - 0 (〇)*** 0% 0 (〇)*** 0% 表22 :在人類yS防禦素、地塞松或英利昔單抗存在及 不存在下，經LPS治療後，自人類末稍血液單核細胞 (PBMC)產生IL-10。在FACSarray上由細胞計數珠粒陣 列（CBA)量測IL-10，*指由雙因子ANOVA分析且由邦弗 朗尼事後檢驗與未處理細胞相比，P<〇.〇5，**指ρ<0.(Η，*** 指 p<0.001°

54 201138810 測試化合物 培養基 LPS 20 ng/ml LPS 0.6 ng/ml IL-10 pg/ml (SD) 對照組之％ IL-10 pg/ml (SD) IL-10 pg/ml (SD) 對照組之％ 培養基 (未處理） 0 ⑼ 100% 111 (3) 100% 66 (5) 100% rhBD2 40 pg/ml 0 (0) - 281 252% 108 (4)* 162% rhBD2 10 pg/ml 0 ⑼ - 243 (38)*** 218% 103 (14)* 155% rhBD2 1 pg/ml 0 (0) - 126 (14) 113% 72 (9) 108% hBDl 40 pg/ml 0 (0) - 113 (5) 102% 69 ⑷ 104% hBDl 10 pg/ml 0 (〇) - 100 (1) 90% 76 (13) 114% hBDl· 1 pg/ml 0 (0) - 95 (17) 85% 71 (6) 108% hBD2 40 pg/ml 0 (0) - 323 (〇)料 * 290% 131 (13)*** 197% hBD2 10 pg/ml 0 (〇) - 240 (〇)*** 215% 86 (6) 130% hBD2 1 pg/ml 0 ⑼ - 123 ⑼ 110% 53 (5) 80% hBD3 1 μξ/ηύ 0 (0) - 152 (72)* 137% 71 P) 107% _hBD4變異體 10 pg/ml 0 (0) 琴 187 168% 92 (17) 139% hBD4變異體 1 pg/ml 0 (0) - 175 ⑻料* 157% 90 (14) 136% 地塞松 0 (0) - 75 ⑹* 67% 47 (3) 70% 英利昔單抗 0 (〇) - 63 . ⑺料 56% 46 (9) 69% 55 201138810 表23 :在人類防禦素、地塞松或英利昔單抗存在及 不存在下，經LPS治療後，自人類末稍血液單核細胞 (PBMC )產生IL-1卢。在FACSarray上由細胞計數珠粒陣 歹4 ( CBA)量測IL-1冷，***指由雙因子ANOVA分析且由 邦弗朗尼事後檢驗與未處理細胞相比，p<〇.00 1。 測試化合物 培養基 LPS 20 ng/ml LPS 0.6 ng/ml IL-1/3 pg/ml (SD) 對照組之％ IL-1/3 pg/ml (SD) IL-1/3 pg/ml (SD) 對照組之％ 培養基 (未處理） 0 (〇) 100% 2544 (226) 100% 741 (93) 100% rhBD2 40 pg/ml 0 ⑼ - 395 (25)*** 16% 124 (11)*** 17% rhBD2 10 pg/ml 0 (0) - 624 (37)*** 25% 214 29% rhBD2 1 pg/ml 0 (0) - 1480 (154)*** 58% 284 (15)*** 38% hBDl 40 pg/ml 0 (〇) - 1599 (14)*** 63% 302 41% hBDl 10 pg/ml 0 (〇) - 1913 (53)*** 75% 401 (17)*** 54% hBDl 1 pg/ml 0 (〇) - 2087 (157)*** 82% 512 (45)** 69% - hBD2 40 pg/ml 1 (i) - 316 (〇)*** 12% 159 21% hBD2 10 pg/ml 0 (0) - 589 (〇)*** 23% 238 (124)*** 32% hBD2 1 pg/ml 0 (0) - 1569 (〇)*** .62% 312 (28)*** 42% 56 201138810 hBD3 1 pg/ml 0 (〇) - 568 (126)*** 22% 331 (23)*** 45% hBD4變異體 10 pg/ml 0 (〇) - 463 (40)*** 18% 163 (5)*** 22% hBD4變異體 1 pg/ml 0 ⑼ - 1004 (24)*** 40% 286 (11)*** 39% 地塞松 0 (〇) - 1120 (220)*** 44% 104 ⑻*** 14% 英利昔單抗 0 (〇) - 2704 (〇) 106% 636 (81) 86% 測試hBDl、hBD2、hBD3及hBD4變異體對經或未經 LPS治療之人類PBMC之效應（表21、22及23 )。為進行 比較，在各情況中包括rhBD2。 對所有防禦素而言，TNF下調。IL-1 /3分泌之減小可與 TNF相當，但不如TNF明顯。對hBD2及hBD4變異體而言， IL-10之分泌劑量依賴性顯著增強。 亦測試10 // g/ml及40 /z g/ml之hBD3，且亦測試40 # g/ml之hB.D4變異體；然而，因為兩種分子在該等濃度下 對細胞有毒，所以不可能區分毒性效應與抗炎效應。 作為TNF下調之陽性對照組，在該情況中包括兩種抗 炎化合物，地塞松及英利昔單抗。 結論 所有所測試之人類；8防禦素均顯示抗炎潛能。 實施例6 衍生自人類單核細胞之樹狀細胞及人類PBMC之 IL-23的減少 57 201138810 基本上如關於人類PBMC之實施例4中所述進行實施 例6，然而’讀數為IL_23，而不是TNF、H万及n 此外’亦研究rhBD2對衍生自人類單核細胞之樹狀細胞之 效應。 衍生自單核細胞之樹狀細胞（DC )之產生 根據Romani等人最初描述之修改方案製備DC。簡言 之，藉由FiC〇ll-pagUe ( GE_heahhcare )梯度離心自健康供 體之白血球層純化末稍血液單核細胞（pBMC ) ^根據製造 商之說月書藉由經磁性珠粒（Dynai，invjtr〇gen )陽性選擇 CD14 +細胞自PBMC分離單核細胞。在6孔板之RpMi/2% 人類AB血清重組人類重組顆粒球巨噬細胞群落刺激因子 (GM-CSF，20 ng/ml)及 IL_4 ( 2〇 ng/ml) ( pepr〇Tech) 中培養CD14+單核細胞6纟，2天及5天後補給培養基/細 胞介素。培養6天後，於96孔板中再培養不成熟Dc，濃 度為lxl 06個細胞/毫升’且不予處理或用混合物及/或hBD2 再處理24小時。以四種濃度一式四份測試hBD2。使用含 有LPS ( 100ng/ml)及wn-t (2〇ng/ml)之促發炎混合物 分析hBD2之抑制hDC成熟變為促發炎表型之能力。在混 合物之前20小時，添加地塞松作為具有已驗證之臨床抗炎 活性之化合物的陽性對照組。在添加混合物之前4小時， 與hBD2 —起培育。

細胞介素ELISA 收集細胞培養物上清液且儲存在_ 8 〇 〇c下。由標準夾心 ELIS A使用可自市面上購得之抗體及標準物根據製造商之

58 201138810 方案（eBioscience)量測 IL-23 之量。 MTT檢定 使用基於MTT之細胞生長測定套組作為48小時後、名 胞存活之手段以評估是否有細胞嚴重受媒劑、遇合物炎 hBD2處理影響’且根據製造商之方案.（sigma)進行。 統計分析 所有實驗執行至少兩次’顯示代表性結果《所呈現+ 數據可以平均值+/-標準偏差（SEM )表示。由變異數為户 療（hBD2、地塞松等）及刺激（LPS、LTA、肽聚糖等）之 雙因子ANOVA，接著由邦弗朗尼事後檢驗確定統計顯著 性’如表圖例中所報導^ p < 〇.05視為差異顯著。 結果 表24 :經培養基（未刺激）或LPS及IFN- r刺激且經 培養基（未處理）、hBD2或地塞松處理之衍生自人類CD 14 + 單核細胞之樹狀細胞上清液中的IL-23 ( pg/ml )，平均值 (SEM ) ，N = 4，出自三個中之一個代表性供體。*指由雙 因子AN0VA分析且由邦弗朗尼事後檢驗與未處理細胞相 此 ’ ρ<0·05 ’ 指 p<〇 〇1，***指 p<〇 〇〇1。nd :未偵測到 (低於偵測極限）。 IL-23 pg/ml (SEM) 未刺激 LPS (100 ng/ml)及 IFN-7(20 ng/ml) 未處理 375 3569 (96) (130) hBD2 3833 1 (ig/ml nd (88) 59 201138810 hBD2 451 3308 10 pg/ml (121) (169)* hBD2 30 pg/ml nd 3042 (46)*** hBD2 100 pg/ml nd 2145 (202)*** 地塞松 424 1147 1 μΜ (38) (268)*** 表 25 :經培養基（對照組）、0.6 ng/ml LPS、20 ng/ml LPS或5 v g/ml LTA刺激且經hBD2、地塞松或英利昔單 抗處理之人類PBMC上清液中的IL-23 ( pg/ml )，平均值 (SEM ) 。*指由單因子ANOVA分析且由杜氏多重比較 (Dunnett's Multiple Comparison)事後檢驗與未處理細胞 相比，ρ<0·05 ， **指 ρ<0·01 ， ***指 ρ<0·001 。

S IL-23 pg/ml (SEM) 對照組 LPS 0.6 ng/ml LPS 20 ng/ml LTA 5 pg/ml 對照組 257 553 510 762 (未處理） ⑺ ⑹ (5) (20) hBD2 218 338 263 383 1 pg/ml (5). (10)** (5)** (20)** hBD2 211 462 295 438 10 pg/ml (4) (2)* (1)** hBD2 207 484 488 810 100 pg/ml (4) ⑺ ⑻ (30) 地塞松 222 202 192 223 3.5 ng/ml (5) (5)** (1)** (1)** 英利昔單抗 227 356 373 349 1 pg/ml (10) (10)** (2)** (1)** 60 201138810 如表24中所示，hBD2劑量佑赭^ s ★ ό ψ j里依賴性顯著抑制IL-23自衍 生自人類CD 14 +單核細胞之樹狀細胞之分泌。 對於人類PBMC，IL-23分泌亦顯英 4者侍到抑制（表25 )。 對该#細胞，存在相反劑量依賴性 1 $測試較低劑量之hBD2 時’發現其為鐘形劑量·反應抑制曲線（資料圖中未示）。 此顯示hBD2可藉由抑帝UL_23分泌在慢性自體免疫病 狀中具有抑制效應’因》IL_23為發炎反應之重要部分。 TM7細胞之存活及增殖係視江_23而定且已顯示丁^了細 胞在數種諸如克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、牛皮癬及多發 性硬化之自體免疫疾病中呈病原性。 實施例7 小鼠沒防禦素3 ( mBD3 )使TNF自PBMC之分泌減少 基本上如關於人類PBMC之實施例4中所述進行實施 例7。使用與實施例1中hBD2之產生所使用之相同方案製 備小鼠/?防禦素3. ( mBD3 ) 。mBD3之胺基酸序列顯示於 SEQ ID NO: 6中。如下所述製備小鼠pbmC。 分離及刺激小鼠末稍血液單核細胞（PBMC ) 自十隻NMRI小鼠之血液中分離小鼠末稍血_液單核細 胞。簡.言之，用RPMI 1/1 ( v/v )稀釋肝素化血液且在抽取 後2小時内’使之進行Fic〇11密度離心。自上層收集企漿且 捨棄。將經分離PBMC再懸浮於培養基（具有1%青黴素及 鍵黴素及1% L-麩醯胺酸之RPMI 1640 ( Gibco，42401 )) 中’且接種於96孔培養板中，每孔1 15.500個細胞，總計 2〇〇 /^。用 100、10 或 1 V g/ml hBD2 或 mBD3 (小鼠 y?防 61 201138810 禦素3)單獨刺激或與20ng/ml LPS (大腸桿菌，0111:B4， Sigma L4391 ) —起刺激相同供體之PBMC。向經或未經LPS 刺激之培養物中添加3.5 ng/ml地塞松。在37°C下培育24 小時後收集上清液，且儲存在-80°C下直至量測細胞介素。 在FACSarray流式細胞計數儀上根據製造商之說明書 (BD )用小鼠發炎細胞計數珠粒陣列（CBA )由流式細胞 計數量測上清液中細胞介素之產生。 收集上清液後’由阿拉馬藍（Biosource DALL 1100) 量測生存力。 結果 表26 :在hBD2存在及不存在下，經[PS處理後，自 人類末稍血液單核細胞（PBMC )產生TNF，所有樣本針對 相同供體測試’出自兩種供體中之代表性實驗。在 FACSan^y上由細胞計數珠粒陣列（CBA)量測TNF ’ *** 指由雙因子ANOVA分析（N=2 )，與各自對照組相比， Ρ<0·001。 TNF pg/ml (SEM) ---------- 培養基 -"~~----- LPS 20 ng/ml 培養基 5 - (1) 1353—~~^〜 (140、 mBD3 2 384 ~' 1 pg/ml (〇) (11)*** mBD3 2 51 '~~~— —_ 10 pg/ml ⑼ ⑴*** mBD3 39 166 -- 100 pg/ml 09) .(17)*** hBD2 3 633 '— 1 pg/ml (〇) (110)*** 5^ 62 201138810 hBD2 2 359 10 pg/ml (〇) (10)*** hBD2 2 342 100 pg/ml (〇) (34)*** 地塞松 1 460 3.5 ng/ml (〇) (29)*** 英利昔單抗 0 1 1 pg/ml (0) (〇)*** 表27 :在mBD3存在及不存在下，經LPS處理後，自 小鼠末稍血液單核細胞（PBMC )產生TNF，所有樣本針對 相同供體測試，出自兩種供體中之代表性實驗。在 FACSarray上由細胞計數珠粒陣列（CBA)量測TNF，*** 指由雙因子ANOVA分析（N = 2 )，與各自對照組相比， ρ<0·001 〇 TNF pg/ml (SEM) 培養基 LPS 20 ng/ml 培養基 578 2063 (3) (77) mBD3 347 1600 1 pg/ml (32) (47)*** mBD3 180 297 10 pg/ml (〇) mBD3 182 195 100 pg/ml (5) 地塞松 94 328 3.5 ng/ml (3) 英利昔單抗 530 2119 1 pg/ml (4) (31) 63 201138810 如表26中所示，小鼠冷防禦素3 ( mBD3 )以與hBD2 及地塞松相同之程度下調TNF自人類PBMC之分泌。mBD3 亦下調TNF自小鼠PBMC之分泌（表27 )。 因此’在該情況中，mBD3展現極佳抗炎活性。 參考文獻

Bonoiotto M.、WJ Jordan、J. Eskdale、A. Tossi、N. Antcheva、S· Crovella、ND Connell 與 G Gallagher。Human β -Defensin 2 Induces a Vigorous Cytokine Response in Peripheral Blood Mononuclear Cells 〇 and Chemotherapy (2006) > 50 ， 1433-.1441 。

Bowdish 等人，Immunomodulatory properties of defensins and cathelicidins。 Cwrr. Top. Microbiol. Immunol. (2006) 306 ， 27-66 〇

Gersemann 等人，Crohn's disease--defect in innate defence ° World J. Gastroenterol. (2Q08) 14，5499-5503 0

Lehrer R.I. > Primate defensins。#(3/. Rev. Microbiol. (2004) 2 ， 727-738 °

Swidsinski 等人，Mucosal flora in inflammatory bowel disease。(200,2) 122，44-54。

Niyonsaba F_、H. Ushio、N. Nakano、W_ Ng、K. Sayama、 K. Hashimoto、I. Nagaoka、K. Okumura 與 H. Ogawa。 Antimicrobial peptides human β -defensins stimulate epidermal keratinocyte migration, proliferation and

64 201138810 production of proinflammatory cytokines and chemokines ° Jowrwa/ o/Jwveiii.gaiz.ve Dermaio/ogj (2007)，127，594-604 o Rowland TL、SM McHugh、J Deighton、RJ Dearman、 PW Ewan 與 I Kimber。Differential regulation by thalidomide and dexamethasone of cytokine expression in human peripheral blood mononuclear cells。Immunopharmacology (1998) ， 40 ， 11-20 °

Wang 等人，Host-microbe interaction: mechanisms of defensin deficiency in Crohn’s disease 〇 五xperi. Rev. Anti. Jn/eci. 77ier. (2007) 5，1049-1057。

Wehkamp 等人，Reduced Paneth cell alpha-defensins in ileal Crohn’s disease。Proc. iV^aW· jcac/. <Scz·· t/. iS1· d (2005) 102 ， 18129-18134 。 【圖式簡單說明】 無 【主要元件符號說明】 無 65 201138810 ( J 序列表 <11 〇>諾佛酵素公司 .

<120〉使用哺乳類動物邮方禦素的發炎性腸疾病的治療 <130> 11514.204-WO <160> 6 <170> Patentln 3.5版 <210> 1 <211> 36 <212> PRT <213〉智慧人 <220> <221> <222> (1)7.(36) <400> 1

Asp His Tyr Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gin Cys Leu Tyr Ser Ala 15 10 15

Cys Pro lie Phe Thr Lys He Gin Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys Ala 20 25 30

Lys Cys Cys Lys 35 <210> 2 <211> 41 <2X2> PRT <213>智慧人 <220> <221> mat—肽 <222> (1)7.(41) <400> 2

Gly lie Gly Asp Pro Val Thr Cys Leu Lys Ser Gly Ala lie Cys His 15 10 15

Pro Val Phe Cys Pro Arg Arg Tyr Lys Gin He Gly Thr Cys Gly Leu 20 25 30

Pro Gly Thr Lys Cys Cys Lys Lys Pro 35 40 <210> 3 <211> 45 <212> PRT <213>智慧人 <220> <221> <222> (1)7.(45) 3 <400> 1 201138810

Gly lie lie Asn Thr Leu Gin Lys Tyr Tyr Cys Arg Val Arg Gly Gly 1 5 10 15

Arg Cys Ala Val Leu Ser Cys Leu Pro Lys Glu Glu Gin Thr Gly Lys 20 25 30

Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Cys Arg Arg Lys Lys 35 40 45 <210> 4 <211> 50 <212> PRT <213> 智慈人 <220> <221> mat一狀 <222> (1)7. (50) <400> 4

Glu Phe Glu Leu Asp Arg lie Cys Gly Tyr Gly Thr Ala Arg Cys Arg 15 10 15

Lys Lys Cys Arg Ser Gin Glu Tyr Arg lie Gly Arg Cys Pro Asn Thr 20 25 30

Tyr Ala Cys Cys Leu Arg Lys Trp Asp Glu Ser Leu Leu Asn Arg Thr 35 40 45

Lys Pro 50 <210> 5 <211> 37 <212> PRT •<213>人造 <220> <223> *SEQ ID 1^0:4之胺基酸3-39所組成的1^0-4變異體 <220〉 <221> mat 一肽 <222> (1)7. (37) <400> 5

Glu Leu Asp Arg lie Cys Gly Tyr Gly Thr Ala Arg Cys Arg Lys Lys 15 10 15

Cys Arg Ser Gin Glu Tyr Arg lie Gly Arg Cys Pro Asn Thr Tyr Ala 20 25 30

Cys Cys Leu Arg Lys 35 <210> 6 <211> 40

<212> PRT 201138810 <213> 小鼠（Mus musculus) <220> <221> mat 一肽 <222> (1)7.(40) <400> 6

Lys lie Asn Asn Pro Val Ser Cys Leu Arg Lys Gly Gly Arg Cys Trp 15 10 15

Asn Arg Cys lie Gly Asn Thr Arg Gin lie Gly Ser Cys Gly Val Pro 20 25 30

Phe Leu Lys Cys Cys Lys Arg Lys 35 40 3

Claims (1)

1. 201138810 七、申請專利範圍： 1. 種哺乳類動物万防禦素之用途，其係用於製造供 在治療發炎性腸疾病中口服之用的醫藥品。 2·如申請專利範圍第1項的用途，其中該哺乳類動物 /3防索素係以約每公斤體重〇.〇〇1毫克至約每公斤體重】〇 毫克，較佳約每公斤體重〇·〇1毫克至約每公斤體重10毫克 之每日劑量投予。 士申明專利範圍第1至2項任一項的用途，其中該 哺乳類動物万防禦素為人類/3防禦素。 4·如申請專利範圍第1至3項任一項的用途，其中該 哺礼類動物万防禦素與SEq Id N〇: j、SEq ID no: 2、SEQ ID NO. 3或SEQ ID N〇: 4之胺基酸序列具有至少8〇%之一 致性。 5. 如申睛專利範圍第1至4項任一項的用途，其中該 人類"防禦素為人類々防禦素】、人類0防禦素2、人類0 防禦素3、或人類召防禦素4。 6. 如申請專利範圍第i至5項任一項的用途，其中該 甫礼類動物冷防禦素與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列具有至 少80%之一致性。 7. 如申請專利範圍第〖至6項任一項的用途，其中該 哺礼類動物召防禦素為人類召防禦素2。 8. 如申請專利範圍第i至7項任一項的用冑，其中在 所治療之組織中TNF_a活性降低。 種/α療务炎性腸疾病的方法，該方法包含向需要 201138810 如此治療之個體口服投予有效量之哺乳類動物沒防禦素。 1〇·如申請專利範圍第9項的方法，其中該有效量有效 降低所治療組織中之Tnf- α活性。 U.如申請專利範圍帛9項的方法，其中該哺乳類動物 沒防紫素係以約每公斤體重0.001毫克至約每公斤體重10 毫克，較佳約每公斤體重0.01毫克至約每公斤體重1〇毫克 之每日劑量投予。 12. 如申請專利範圍第9項的方法，其中該哺乳類動物 召防禦素為人類召防禦素。 13. 如申請專利範圍第9項的方法，其中該哺乳類動物 /5 防禦素與 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3 或SEQ ID NO: 4之胺基酸序列具有至少8〇%之一致性。 14. 如申請專利範圍第9項的方法，其中該哺乳類動物 石防禦素與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列具有至少80%之一 致性。 15·如申請專利範圍第9項的方法，其中該人類/3防禦 素為人類々防禦素1、人類0防禦素2、人類石防禦素3、 或人類/5防禦素4。 八、圖式： 無 2