MX2011000568A - Tratamiento de enfermedades intestinales inflamatorias con beta-defensinas de mamifero. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al tratamiento de enfermedades intestinales inflamatorias con beta-defensinas de mamífero.

Description

TAMIENTO DE ENFERMEDADES INTESTINALES INFLAMATORI BETA-DEFENSINAS DE MAMIFERO de la Invención La presente invención se refiere a la prev ratamiento de enfermedades intestinales inflamato de la administración de una beta-defensina de m edentes de la Invención sinas de humano Entre muchos otros elementos, los component a inmunidad innata son los péptidos antimic s , por sus siglas en inglés) que muestran individ selectividad considerable, pero colectivame ees de eliminar rápidamente un amplio espe erias, virus y hongos. La significación biológic es resaltada por su distribución ubicua en la na as del intestino delgado (HD5 y HD6) . Las ß-de producidas principalmente por las células epitel s tejidos y órganos incluyendo la piel, tráquea ointestinal , sistema urogenital, ríñones, pán ulas mamarias. Los miembros mejor caracterizad lia de las ß-defensinas son hBDl-3. Sin izando varias herramientas bioinformáticas casi 4 ectura abiertos que codifican homólogos putativ sinas han sido notados en el genoma humano. Al defensinas de humano son producidas tras que otras son inducidas por c flamatorias o productos microbianos exogenos.

Ha llegado a ser cada vez más claro sinas de humano además de su actividad antimi cta también tienen un amplio rango de pro nomoduladoras/alternativas . Estas incluyen la i Existe evidencia creciente de que las defen o desempañan un papel importante en muchas enfe ciosas e inflamatorias. La sobreexpresión de de mano se observa frecuentemente en. la piel inflat tada muy probablemente debido a la inducción l nentes microbianos o citocinas proinfla enas . En la psoriasis, la hBD2 y la h abundantes y en el epitelio lesional de pacie vulgar o foliculitis superficial se ha obser lación por incremento significativa de la hBD2. e, la regulación por decremento de la hBD2 y la asociada con la dermatitis atópica. La enfermed rohn ha sido asociada con la expresión deficient 6 y en la enfermedad de Crohn en la expresión en BD2-4 son reguladas por decremento. cinas opoyesis. Las citocinas son producidas por de células que incluyen fibroblastos, eliales, células epiteliales, macrófagos/mono citos .

El TNF- está implicado en varios isiológicos y puede ser ya sea protector, sa del hospedante, o perjudicial, como inmunidad. El TNF - oc es una de las citocinas e cadena y mantiene la respuesta de inflamaci ivación del TNF - ot ha resultado ser important lación por decremento de reacciones inflamato asociadas con enfermedades autoinmunes . cción, el TNF- a es secretado en altas cantid fagos y media el reclutamiento de neutró ófagos a sitios de infección por medio de la esti élulas endoteliales para producir moléculas de ad Los fármacos anti- inflamatorios actuales cción del TNF-a al enlazarse a éste y en cons ir la señalización de los receptores para el TNF uperficie de las células. Este tipo de bloqu os efectos colaterales serios, de los cuales alg ciones tales como tuberculosis, sepsis e inf les y una posible incidencia incrementada de cán La IL-10, también conocida como el factor i a síntesis de citocinas de humano (CSIF, por su inglés) , también es un protagonista principal lación inmune como una citocina anti - inflamator cina es producida por varios tipos de célu uyen monocitos, macrófagos, células T, células B, ríticas y mastocitos. Esta citocina tiene otrópicos en la inmunoregulación e inflamación decremento la expresión de citocinas pro- infla ídas por la IL-10 son CD4+/CD25+/Foxp3 - y son r células Trl . Estas células suprimen las re es por medio de la secreción de la IL-10. Los ntes han revelado una mayor diversificac rtorio de efectores de células T que las Thl/Th2/ dentificación de las células Thl7. Se ha most subpoblación es patógena en varias enfe inmunes, tal como la enfermedad de Crohn, rativa, psoriasis y esclerosis múltiple, at íamente al linaje de Thl . Las citocinas secret también son reguladas por decremento por la IL eo del TNF previene la psoriasis por medi tivación de las células Thl7. La actividad tot 0 es anti- inflamatoria y se ha mostrado que pre amación y lesión en varios estudios de anima rgo el tratamiento clínico con la IL-10 permanec matoria en el intestino. Se piensa que esta matoria es perpetuada a través de las acci iñas proinflamatorias y la activación selec njuntos de linfocitos. En los pacientes con as y la inflamación del recubrimiento interior tinos conducen a síntomas de dolor abdominal, d ado rectal. La colitis ulcerativa ocurre en el i o, mientras que en la enfermedad de Crohn, la en involucrar el tracto GI completo así como tam tinos delgado y grueso. Para la mayoría ntes, la IBD es una condición crónica con sínt desde meses hasta años. Es más común en los es, pero puede ocurrir a cualquier edad. Se desc el mundo, pero es más común en los trializados tales como los Estados Unidos, Ingl orte de Europa. Es especialmente común en per Algunos pacientes con UC sólo tienen la en i recto (proctitis) . Otros pacientes con UC ti medad limitada al recto y el colon izquierdo a tosigmoiditis) . Todavía otros pacientes tienen completo (IBD universal) . Los síntomas de la aímente más graves con una enfermedad más e ión más grande del colon involucrada con la enfe La prognosis para pacientes con una en ada al recto (proctitis) o UC limitada al ext izquierdo (proctosigmoiditis) es mejor que aq C de colon completo. Los tratamientos periódico izando medicaciones orales o enemas pue cientes. En aquellos pacientes con una enferm siva, la pérdida de sangre de los intestinos in e conducir a una anemia y puede requerir tratami lementos de hierro o aún transfusiones de sa nes del tracto gastrointestinal. Con esta enferm ucción intestinal debida a la inflamación y la e en un gran número de pacientes. Los granulo ción de fístulas son complicaciones frecuente medad de Crohn. Las consecuencias del progres medad incluyen alimentación intravenosa, ci tomía .

La IBD puede ser tratada medicinalmen aciones utilizadas más comúnmente para tratar la cos anti - inflamatorios tales como los salieila raciones de salicilato han sido efectivas amiento de una enfermedad de ligera a moderada, en disminuir la frecuencia inicios repentino rmedad cuando las medicaciones son tomadas en ongada. Los ejemplos de salicilatos asalazina, olsalazina y mesalamina. Todas de los corticosteroides a pacientes con una en grave. Los efectos colaterales de los corticos en usualmente con el uso a largo plazo. Estos elgazamiento del hueso y la piel, infecciones, d itamiento muscular, redondeo de las caras, alte iátricas y, en ocasiones raras, la destrucción ulaciones de la cadera.

En pacientes con IBD que no responden ilatos o corticosteroides, se utilizan medicaci imen el sistema inmune. Los ejemplos de inmunosu yen azatioprina y 6 -mercaptopurina . Los inmunosu izados en esta situación ayudan a controlar 1 iten la reducción gradual o eliminación icosteroides . Sin embargo, los inmunosupresores h aciente tenga deficiencias inmunitarias y sea sus has otras enfermedades . es de prevenir o tratar la IBD. de Defensinas de Humano para Tratar Enfe tinales Inflamatorias Es interesante que la enfermedad de Croh tino delgado ha sido asociada con niveles dismi -defensinas HD5 y HD6 de las células de Paneth, la enfermedad de Crohn en el colon ha sido asoc producción reducida de las ß-defensinas hBD2 semann y colaboradores, 2008; Wehkamp y eolab ) . Adicionalmente , la implicación de la mi rica en la patogénesis de la enfermedad de Crohn strada convincentemente (Swidsinski y colabo ) . Utilizando la hibridización in situ de fluore s investigadores mostraron que en la enfermedad a se observó un incremento drástico de las h sivas y asociadas con la mucosa, mientras q protector de defensinas secretadas, el bal na entre la defensa antimicrobiana y las b icas. Como resultado, esto permite una riana en los tejidos intestinales subyacentes qu stado inflamatorio, el cual a su vez puede desar fermedad de Crohn.

Con base en esta hipótesis, el docum /081486 da a conocer el uso de varias defen o en el tratamiento de la enfermedad in matoria. Los inventores sugirieron que las de istradas por la ruta oral a pacientes de la en rohn, en una formulación que permitía su liber ciones apropiadas en el lumen intestinal, redu ro de bacterias invasivas, restablecería una fu era epitelial normal y, de esta manera, redu edad de la enfermedad inflamatoria. ntra las bacterias lumínicas. Adicionalmente , se ste punto que el efecto de la hBD2 es una reduc de las citocinas pro- inflamatorias TNF-a, IL-?ß tadas por las PBMCs . Se sabe que estas citoc gonistas principales en muchas enfe matorias que incluyen la enfermedad in matoria. Se ha sabido durante más de una década sinas además de sus funciones antimicrobianas n un rango de funciones inmunomoduladoras . Sin gran mayoría del trabajo sobre las propied lación inmune de las defensinas de humano las que tienen principalmente funciones pro-inflama radoras del sistema inmune (Véase por ejemplo, N laboradores , 2007; Bowdish y colaboradores, 2006; Por lo tanto, es verdaderamente inesperad inflamatoria, como se observa en el trabajo pr te documento. ipción Detallada de la Invención iciones Defensina : El término "defensina" como se ste documento se refiere a polipéptidos reconoc persona experta en el campo como que pertenec de defensinas de péptidos antimicrobiano minar si un polipéptido es una defensina de acu nvención, la secuencia de aminoácidos se puede los perfiles del modelo oculto de Markov (perf de la base de datos PFAM por medio del uso del ftware HMMER gratuito.

Las familias de defensinas de PFAM incl lo la Defensina_l o "Defensina de mamífero" ( O PF00323) y la Defensina 2 o Defensina beta la SEC ID NO: 3), beta-defensina 4 de human la SEC ID NO: 4) y beta-defensina 3 de rató la SEC ID NO: 6) .

Identidad : La relación entre dos secuen ácidos o entre dos secuencias de nucleótidos es l parámetro "identidad" .

Para los propósitos de la presente inven de identidad entre dos secuencias de aminoá mina utilizando el algoritmo de Needlema leman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol . 48: 443-453) menta en el programa Needle del paquete EMBOSS European Molecular Biology Open Software Suite, oradores, 2000, Trends in Genetics 16: : //emboss . org) , preferiblemente la versión rior. Los parámetros opcionales que se utiliza lización por apertura de hueco de 10, penaliza irribonucleótidos se determina utilizando el a edleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) menta en el programa Needle del paquete EMBOSS European Molecular Biology Open Software Suite, oradores, 2000, supra; http : //emboss . org) , preferi ersión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcion tilizan son la penalización por apertura de huec lización por extensión de hueco de 0.5 y la m itución EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4 itado de la "identidad más larga" etiquetada d nida utilizando la opción -nobrief) se utiliza entaje de identidad y se calcula de la siguiente i oxirribonucleótidos Idénticos x 100)/(Longi eamiento-Número Total de Huecos en el Alineamient Polipéptido aislado: El término "variante olipéptido aislado" como se utiliza en este docu Polipéptido sustancialmente puro: El péptido sustancialmente puro" indica en este d preparación de polipéptido que contiene a lo s riblemente a lo sumo 8%, más preferiblemente a ás preferiblemente a lo sumo 5%, más preferibl umo 4%, más preferiblemente a lo sumo 3%, riblemente a lo sumo 2%, mucho más preferibleme 1% y aún mucho más preferiblemente a lo sumo de otro material de polipéptido con el cual se a a nativa o recombinante . Por lo tanto, se pref olipéptido sustancialmente puro sea por lo me , preferiblemente por lo menos 94% pur riblemente por lo menos 95% puro, más preferi lo menos 96% puro, más preferiblemente por lo m , más preferiblemente por lo menos 97% pu eriblemente por lo menos 98% ¦ puro, a defensinas de mamífero La presente invención se refiere a usos farmacé defensinas de mamífero, tales como beta-defensinas eta-defensinas de ratón, en el tratamiento de enf tinales inflamatorias, tales como colitis ulcera nedad de Crohn. El tratamiento está asociado prefer na actividad reducida del TNF-alfa en los tejidos tra En una modalidad, las beta-defensinas de t invención tienen un grado de identidad de por preferiblemente por lo menos 85%, más preferi o menos 90% y mucho más preferiblemente por lo m ualquiera de las secuencias de aminoácidos de l SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3 , SEC ID NO: 4, SEC ID D NO: 6. En una modalidad preferida, las beta-de mífero de la invención tienen un grado de iden lo menos 80%, preferiblemente por lo menos 8 sina 3 de ratón (SEC ID NO: 6) . En una modalidad erida, las beta-defensinas de mamífero de la i isten de la beta-defensina 1 de humano (SEC I -defensina 2 de humano (SEC ID NO: 2), beta-defens o (SEC ID NO: 3) y/o beta-defensina 4 de humano )¦.

En otra modalidad, las beta-defensinas de a invención tienen un grado de identidad de por preferiblemente por lo menos 85%, más preferi lo menos 90% y mucho más preferiblemente por lo m la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2. lidad preferida, las beta-defensinas de mamífe nción consisten de la beta-defensina 2 de humano ) .

En todavía otra modalidad, las beta-defen fero de la invención consisten de beta-defen Las beta-defensinas de mamífero de la i én son referidas como compuestos de las mod ridas .

En el contexto de la presente invenci ante funcionalmente equivalente" de una beta-d amífero (por ejemplo de humano) es una beta-d icada de mamífero (por ejemplo de humano) qu imadamente el mismo efecto sobre una en Stinal inflamatoria que la beta-defensina precu fero (por ejemplo de humano) . Preferiblemente, e aproximadamente el mismo efecto sobre la activ alfa que la beta-defensina de mamífero (por ej o) .

De acuerdo con la invención, una onalmente equivalente de una beta-defensina de ejemplo de humano) puede comprender 1-5 modifi icación(es) puede (n) ser sustitución (es) , supre inserción (es) del (los) aminoácido (s) así como lazo (s) de cadena (s) lateral (es) de aminoácido e aminoácidos no naturales con características s la secuencia de aminoácidos. En particular, icación(es) puede (n) ser amidaciones, tal como a C-terminal.

Preferiblemente, las modificaciones de ami de carácter menor, es decir que son sustituc ciones de aminoácidos conservadoras que no ficativamente el plegamiento y/o activid éptido; supresiones individuales; extensiones - o carboxilo-terminales ; un péptido conector pe aproximadamente 20-25 residuos; o una extensión facilita la purificación al cambiar la carga net ión, tal como una etiqueta de poli -histidin , un aímente la actividad específica son conocida y son descritas, por ejemplo, por H. Neurath , 1979, In, The Proteins, Academic Press, Nueva Y cambios que ocurren más comúnmente son Ala/Ser, lu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, ly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, al, Ala/Glu y Asp/Gly.

Además de los 20 aminoácidos estánd ácidos no estándar (tales como 4-hidroxiproli 1-lisina, ácido 2 -aminoisobutírico, isovalina 1-serina) pueden ser sustituidos por resi ácidos de un polipéptido de tipo silvestre. U tado de aminoácidos no conservadores, aminoácido codificados por el código genético y aminoá rales pueden ser sustituidos por residuos de amin "aminoácidos no naturales" han sido modificados dimientos conocidos en el campo, tal como la mut ida al sitio o mutagénesis de exploración de ingham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). a técnica, las mutaciones individuales de al ducen en cada residuo en la molécula y las m ites, resultantes se someten a prueba por la a gica (es decir, actividad contra una en Stinal inflamatoria y/o supresión de la activ lfa) para identificar los residuos de aminoác críticos para la actividad de la molécula. Véase n y colaboradores, 1996, J". Biol . Chem. 271: 46 identidades de los aminoácidos esenciales tambié deducidas a partir del análisis de identida éptidos los cuales están relacionados con l sinas de mamífero.

Las sustituciones de aminoácidos indivi 832-10837; Patente de los Estados Unidos No. 5, entó WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a l yshire y colaboradores, 1986, Gene 46:145; oradores, 1988, DNA 7:127).

Una extensión N-terminal de los polipéptid ción puede consistir adecuadamente de 1 ácidos, preferiblemente 2-20 aminoácidos, espec aminoácidos. En una modalidad, la extensión de minal no contiene una Arg (R) . En otra modal sión N-C-terminalomprende un sitio de escisión ar a kex2 como será definido adicionalme nte. En una modalidad preferida, la extensión N- ? péptido, que comprende por lo menos dos res ácidos de Glu (E) y/o Asp (D) , tal como una exte inal que comprende una de las siguientes secuenci E y DD. os para el tratamiento de enfermedades inte matorias, tratamiento el cual comprende adminis ta parenteral a un sujeto necesitado de este tra cantidad efectiva de una beta-defensina de mamíf la beta-defensina 2 de humano , por ejemplo, en na composición farmacéutica. También se prop -defensinas de mamífero, tal como la beta-defens o, para la manufactura de un medicamento istración parenteral y el uso de beta-defen fero, tal como la beta-defensina 2 de humano, factura de un medicamento para la admini teral, por ejemplo, una composición farmacéuti ratamiento de una enfermedad inflamatoria intest amiento incluye el tratamiento de una enfer torno existente, así como también la pr ención) de una enfermedad o trastorno. peritoneal , subcutánea o intramuscular) o tóp ??, epicutánea, intranasal o intratraqueal) . D S modalidades, las composiciones descritas ento se pueden administrar como parte de un imp ración sostenida .

Dentro de todavía otras modalidade osiciones de las modalidades preferidas se iar como una composición liofilizada, ut ientes apropiados que proporcionan estabilidad osición liofilizada y subsecuente a la rehidratac Las composiciones farmacéuticas que conti -defensina de mamífero, tal como una beta-defe no, se pueden . manufacturar de acuerdo con enciónales, por ejemplo, por medio de proc lado, granulación, recubrimiento, disolu ilización . este tratamiento, la dosificación apropiada vari sto, dependiendo de, por ejemplo, el carácter q datos farmacocinéticos de un compuesto de la ción utilizado, el hospedante individual, el istración y el carácter y gravedad de las con son tratadas. Sin embargo, en general, para re sfactorios en mamíferos más grandes, por ejer os, una dosificación diaria indicada es preferí proximadamente 0.001 g a aproximadamente 1.5 eriblemente de aproximadamente 0.01 g a 1.0 imadamente 0.001 mg/kg de pero corp imadamente 20 mg/kg de peso corporal, preferible imadamente 0.01 mg/kg de peso corporal a aproxim m9/kg de peso corporal, más preferiblem imadamente 0.1 mg/kg de peso corporal a aproxi g/kg de peso corporal, por ejemplo, administrada mano en una cantidad de aproximadamente 0.5 mg o imadamente 1500 mg o más por forma de dosi ria dependiendo de la ruta de adminis riblemente de aproximadamente 0.5, 0.6, 0.7, 0. aproximadamente 150, 200, 250, 300, 350, 400, 4 700, 800, 900 o 1000 mg y más preferiblem imadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 85, 90, 95 o 100 mg. Sin embargo, en ciertas mod ueden preferir dosificaciones más bajas o más a llas mencionadas anteriormente. Las concentrac ficaciones apropiadas pueden ser determinadas fá na persona experta en el campo.

Los portadores y/o diluyentes farmacéut tables son conocidos para aquellas personas exp ampo . Para las composiciones formuladas como so es labiales, gotas, pulverizaciones o supositor lación puede contener (además de una beta-defe ero y otros ingredientes activos, opc dores, materiales de relleno, desinteg icionadores de flujo, azúcares y edule ncias, conservadores, estabilizadores, age ecimiento, emulsionantes, solubilizadores , sal lar la presión osmótica, amortiguadores, dil es de dispersión y tensoactivos , su inantes, lubricantes y/u otros excipientes farma son conocidos en el campo. Una persona experta puede formular adicionalmente las beta-defen fero de una manera apropiada y de acuerdo ticas aceptadas, tales como aquellas descr gton' s Pharmaceutical Sciences, Gennaro, Ed ishing Co. , Easton, PA 1990. nibles varios aparatos sintéticos comercial lo sintetizadores automatizados de Applied Bi , Beckman, etcétera. Por medio del uso de sinteti aminoácidos de origen natural pueden ser sustitu ácidos no naturales, particularmente D- isómero s) por ejemplo D-alanina y D-iso ereoisómeros, cadenas laterales que tienen di tudes o funcionalidades y similares. La s cular y la manera de preparación serán determin niencia, economía, pureza requerida y similares.

Se puede proporcionar la unión química idos o proteínas que comprenden funcion nientes para el enlace, tales como grupos amino ción de amida o amina sustituida, por ejemplo a ctiva, grupos tiol para la formación de ti lfuro, grupos carboxilo para la formación de onales de las mismas, también se pueden a icar de acuerdo con métodos convencionales de binante . Un lisado se puede preparar del hospe sión y el lisado purificado utilizando l tografía de - exclusión, electroforesis d tografía de afinidad u otra técnica de purificac La presente invención se describe adicio los siguientes ejemplos que no deben interpreta tantes del alcance de la invención.

PLOS Durante la prueba de la hBD2 por los omoduladores se observó inesperadamente que la h norme potencial anti - inflamatorio .

En este punto, se mostró que la bBD2 to significativo en el tratamiento de una e Stinal inflamatoria (colitis) inducida cción que contenía una parte de tiorredoxina N-da por una etiqueta de his, un sitio de esc ocinasa y finalmente el peptido de hBD2. El plá sión se transformó en la cepa de E. coli BL21.

Un cultivo durante toda la noche de esta ó 100 veces en TB-glicerol que contenía 100 ilina y se desarrolló a una OD600 de aproximadam y se indujo con 0.5 mM de IPTG durante 3 horas o cual las células se recolectaron por medi ifugación. El péptido de fusión de trx-hBD2 et is se purificó en perlas de Ni-NTA (QIAGEN) ut colos estándar. El péptido de fusión purifi eta de his se dializó subsecuentemente durante en amortiguador de enterocinasa (tris-HCl 50 mM 1 mM) y se escindió con enterocinasa para li madura. El péptido de hBD2 se purificó adicio troscopía de NMR.

La endotoxina se retiró por medio de la rativa en un pH bajo y el contenido de endot rminó por medio de un ensayo de LAL (Endosafe descubrió que el nivel era inferior al lí cción del ensayo (0.05 EU/mg) . Para evaluar les inferiores al límite de detección del e toxina no fueran capaces de estimular las P izaron curvas de titulación de la estimulación olisacárido muy potente {E. coli, 0111 :B4 1) . Los niveles muy bajos de este LPS (0.06 on capaces de estimular las PBMC para una produ cina detectable .

PLO 2 lo de colitis inducida por Dextrano- Sulfato ) durante 10 Días en el ratón cally induced experimental models of human infl disease", World J. Gastroenterol . , Volumen as 5581-5593 (2007) ; y Wirtz y Neurath wMouse m mmatory bowel disease", Advanced Drug Delivery en 59 (11) , 1073-1083 (2007) .

IALES ulos de Prueba -defensina 2 de humano (hBD2) ; véase el Ej ior misuccinato de metilprednisolona ( "prednisolona" iguador de PBS (GIBCO) les Experimentales Los ratones macho C57BL/6 (Harían In ica, Barcelona, España) se utilizaron en el est ésta es una especie y sexo que se ha demost rrolla una inflamación significativa del colon c e del director del estudio.

El peso corporal promedio de los animales e nicio del estudio fue 22.4 ± 0.16 g atización (cuarentena) Un mínimo de 7 días antes del inicio del las mismas condiciones que aquellas del ipal . miento Con el arribo, los animales se separar aron de manera aleatoria en jaulas de polic ype, Charles River, 255x405xl97mm) con tapas idable . Los animales se alojaron en grupos ales por jaula de acuerdo con su sexo, en habi animales con temperatura controlada ( inación (12/12 horas de luz/oscuridad), pres aciones de los animales se analiza periódicame icar su composición y para detectar minantes (químicos y microbiológicos) . o y Materiales o : Báscula para animales SartoriusMR Modelo BP 210 Equipo de disección quirúrgica Centrífuga Eppendorf 5415CMR Microscopio Nikon Eclipse E600FNMR Agitador Hook & Tucker instrumentsMR Homogenizador IKA Ultra TurraxMR Báscula analítica SartoriusMR Modelo BP 221S Lector de microplacas de ELISA Labsystems M EXMR riales y Reactivos: Jeringas desechables estériles (1 mi) Kit de ELISA de TNF-a de ratón (GE Healthcare COLO EXPERIMENTAL ño del estudio Los animales se dividieron en 5 rimentales . Cada grupo consistía de 10 machos: o A: Tratado con control de vehículo (PBS) i.v. o B: Tratado con hBD2 (0.1 mg/kg i.v.) ? C: Tratado con hBD2 (1 mg/kg i.v.) o D: Tratado con hBD2 (10 mg/kg i.v.) o E: Tratado con meti lprednisolona (1 mg/kg p.o.

La asignación de los animales a todos lo rimentales se realizó de manera aleatoria. Un m atones se alojó en cada jaula (según la D 09/EEC) . Todos los animales se pesaron con su a ratorio y antes de la administración de los a rueba . en una dosis de 1 mg/kg en un volumen de dosificac de peso corporal, en el mismo régimen de dosifica D2.

DIMIENTO EXPERIMENTAL ción de Colitis La colitis se indujo en ratones al complem potable con DSS al 2% durante 7 días. En el Día atones se pesaron y se marcaron de acuerdo con SU imentales. La botella para beber de cada jaula a solución de DSS, teniendo la seguridad de que t de las botellas se montaron apropiadamente y que ngestionó. En el Día 3, cualquier solución restant ias se vació y se rellenó con solución nueva de dimiento se repitió nuevamente en el Día 5. En e uier solución restante se desechó y se reemplazó da en autoclave. Los animales se sacrificaron etro registro d io en el Peso Corporal: <1 % 1 -5% 5-10% 10-15% >15% rado rectal: Negativo Positivo istencia de las Heces: Normal Heces Flojas Diarrea La pérdida de peso corporal se calcu porcentaje de diferencia entre el peso c inal (Día 1) y el peso corporal real en c rimental (2-10) .

La aparición de diarrea se defin ovette CB-300 por medio de la punción de na 2 horas después de la admini s t rae i culo de prueba. Este método de extracc re no requiere anestésicos o analgés uce un estrés mínimo en los animales boradores, 1998) . Adic ionalment e , una mué re terminal se obtuvo de todos los animale mo día del estudio de la vena cava ab ién dos horas después de la administraci culo de prueba. Las muestras de sangre se uiar y luego se centrifugaron a 3000 rpm inutos y el suero resultante se congeló el almacenamiento. nasia y Recolección de Muestras de Colon En el día 10, dos horas después de la nistración del control de vehículo, ripción cambios observados ltrados de células inflamatorias de la mucosa, rcidos, mínimos, con o sin hiperplasia epitelial ma . ltrados de células inflamatorias esparcidos a sos, ligeros, algunas veces que se extienden ro de la submucosa y asociados con erosiones, con rplasia epitelial mínima a ligera y agotamiento ucina mínimo a ligero de células calciformes. ltrados de células inflamatorias de ligeros a rados que algunas veces fueron transmurales, iados frecuentemente con ulceración, con rplasia epitelial moderada y agotamiento de na . ltrados de células inflamatorias marcados que uentemente fueron transmurales y asociados con ración, con hiperplasia epitelial marcada y amiento de mucina. para la determinación subsecuente de la concentra por medio de un inmunoensayo de enzimas específico TADOS tro del Indice de Actividad de la Enfermedad 1. Progreso del registro del Indice de Activid medad (DAI) durante el Día 1 al Día 10. Las di ficativas de los valores del grupo de control (veh echa determinada se muestran como *p<0.05; **p<0.0 uskal-Wallis para datos no paramétricos) . registro del DAI culo de prueba Datos Dia l Día 2 Día 3 Día 4 Grupo A S.E.M. 0.00 1.10 1.30 3.20 ol de vehículo i.v. Media 0.00 0.31 0.37 0.36 Grupo B S.E.M. 0.00 0.20 0.80 2.90 hBD2 Media 0.00 0.13 0.20 0.10 (continuación) ación histológica Dos secciones (próxima y distal) de c ron de cada animal, se procesaron para el idor de proteasa (1 ml/20 g de tejido) . El ho se centrifugó a 14000 rpm durante 10 minut nadante se almacenó a -20 °C para la deter cuente de la concentración del TNF- por medi oensayo de enzimas específico (ELISA) . 3. Registros histológicos, peso y longitud del ntración del TNF-ot en el colon. Las diferencia tros hitológicos de los valores del grupo de ÍCUIO) se muestran como *p<0.05; **p<0.01 (P al- allis para datos no paramétricos) .

Registro de Registro de Conce tículo de prueba Datos Histología Histología TNF-ot Colon Próximo Colon Distal (pg/g Grupo A S.E.M. 4.20 4.50 rol de vehículo i.v. Media 0.25 0.22 Grupo B S.E.M. 2.22** 3.67 hBD2 Media 0.43 0.47 ó utilizando el programa estadístico Graphpa diferencia entre grupos para el índice de a a enfermedad y el registro histológico se ev o de la prueba de Kruskal -Wallis para d eados más la pos -prueba de Dunn para permitir m araciones. Un valor de p<0.05 se tom ificat ivo .

USIONES Los resultados demuestran que la hBD2 en baja sometida a prueba (0.1 mg/kg i.v.) ificat ivamente el incremento del Indice de Acti nfermedad inducido por la administración de DS 7 (1.44±0.38 artículo de prueba vs . 4.1±0.69 v 01) , día 8 (2.11±0.2 artículo de prueba vs . CUIO; p<0.05) , día 9 (3.89+0.35 artículo de pr 1.02 vehículo; p<0.01) y día 10 (6.44+0.85 art isis histológico de los colones próximos de cad ló una reducción muy significativa del registro lógico por medio del tratamiento con la dosis (2.22±0.43 artículo de prueba vs . 4.2±0.25 v 01). Además, una reducción significativa de l ológica también se observó con las dosis ínte de hBD2 , así como también con la pred 9±0.35; 2.89±0.39 y 2.8±0.5 respectivamente; ontraste, en el colon distal - aunque una r ente en la lesión histológica se pudo observa ales tratados con la dosis baja e intermedia como también con la prednisolona - ésta ificativa estadísticamente. No se pudo obse cción en los animales que fueron tratados con de hBD2. Similarmente , el tratamiento con l e intermedia de hBD2 dio por resultado una r osis más alta utilizada en el estudio (10 m ) . Además, el efecto anti - inflamatorio de la d de hBD2 es comparable o aún mayor (por stro histológico) que aquel de la prednisolona s de 1 mg/kg/día p.o.

PLO 3 lo de colitis inducida por Dextrano-Sulfato ) durante 10 días en el ratón El Ejemplo 3 se llevó a cabo esencialme escribe en el Ejemplo 2. Las diferencias se i inuación .

El peso corporal promedio de los animale del inicio del estudio fue 19.74 ± 0.09 g ( ? F: Tratado con hBD2 (0.1 mg/kg i.v. + s.c. S al día ? G: Tratado con hBD2 (0.1 mg/kg i.v.) - cada o H: Tratado con metilprednisolona (1 mg/kg p.o. o J: Tratado con metilprednisolona (10 mg/kg p.o La asignación de los animales en todos lo rimentales se realizó de manera aleatorizada . U ratones se alojaron en cada jaula (según la D 09/EEC) . Todos los animales se pesaron con su a ratorio y antes de la administración de los co rueba y de referencia. nistración de los artículos de prueba El control de vehículo y la hBD2 se admin la ruta intravenosa por vía de la vena de col artículo de prueba correspondiente durante cutivos .

Los animales en el grupo G recibieron u dos días del artículo de prueba corresp te 10 días consecutivos.

La metilprednisolona se administró por en una dosis de 1 mg/kg (grupo H) y 10 mg/kg ( n volumen de dosificación de 5 ml/kg de peso c vez al día durante 10 días consecutivos. de Muestras de Sangre Una muestra de sangre terminal se obtuvo animales en el último día del estudio de la v minal 2 horas después de la administración del rueba .

Las muestras de sangre se dejaron coa ó se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 rninu aramétricos ) . Del Día 6 al Dí a 10 se muestr íente página . registro del DAI ículo de prueba Datos Dia l Día 2 Día 3 Día 4 Grupo A S.E.M. 0.00 0.00 0.10 0.10 rol de vehículo i.v. Media 0.00 0.00 0.10 0.10 Grupo B S.E.M. 0.00 0.10 0.20 0.40 hBD2 Media 0.00 0.10 0.13 0.16 1 mg/kg i.v.

Grupo C S.E.M. 0.00 0.44 0.89 0.56 hBD2 Media 0.00 0.18 0.42 0.29 0.1 mg/kg i.v.

Grupo D S.E.M. 0.00 0.00 0.30 0.40 hBD2 Media 0.00 0.00 0.15 0.16 .01 mg/kg i.v.

Grupo E S.E.M. 0.00 0.00 0.10 0.20 hBD2 Media 0.00 0.00 0.10 0.13 .001 mg/kg i.v.

Grupo F hBD2 S.E.M. 0.00 0.30 0.70 0.70 4 ( cont inuac ión) registro del DAI ículo de prueba Datos Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Grupo A S.E. . 6.90 9.67 1 1 .1 1 1 1 .67 rol de vehículo i.v. Media 1.02 0.33 0.31 0.17 Grupo B S.E.M. 2.30* 4.40* 6.89 5.00* hBD2 Media 1.00 1.03 1.41 0.60 1 mg/kg i.v.

Grupo C S.E.M. 1 .56** 4.13* 5.43* 6.29* hBD2 Media 0.73 0.83 1.13 1 .64 0.1 mg/kg i.v.

Grupo D S.E.M. 2.70 6.50 6.20* 4.60*** hBD2 Media 1.08 1.28 1.06 0.98 .01 mg/kg i.v.

Grupo E S.E.M. 3.40 7.1 1 8.56 5.89** hBD2 Media 1.32 1.38 1.06 1 .63 .001 mg/kg i.v.

Grupo F hBD2 S.E.M. 0.70*** 3.50** 4.00*** 2.90*** 0.1 mg/kg Media 0.30 0.89 1.17 0.55 eces al día i.v.+s.c.

Grupo G hBD2 S.E.M. 2.90 6.50 8.70 7.50 lógico (tinción con hematoxilina y eosina) y tradas por un observador ciego de acuerdo con el gistro descrito anteriormente. 5. Registros histológicos, peso y longitud del ntración del TNF-a en el colon. Las diferencia tros histológicos de los valores del grupo de ÍCUIO) se muestran como *p<0.05; **p<0.01 (P al-Wallis para datos no paramétricos) .

Registro de Histología Registro de Histolo ículo de prueba . Datos Colon Próximo Colon Distal Grupo A S.E.M. 2.44 4.67 rol de vehículo i.v. Media 0.34 0.17 Grupo B S.E.M. 1.78 3.56 hBD2 Media 0.36 0.38 1 mg/kg i.v.

Grupo C S.E.M. 1.71 3.14* hBD2 Registro de Histología Registro de Histolo ículo de prueba Datos Colon Próximo Colon Distal Grupo H S.E. . 1.40 3.00*** Prednisolona Media 0.22 0.00 1 mg/kg p.o.

Grupo J S.E.M. 1.40 2.70*** Prednisolona Media 0.16 0.21 10 mg/kg p.o.

ESTADISTICO La significación estadística de los resul ó utilizando el programa estadístico Graphpad I iferencia entre los grupos para el índice de acti nfermedad y el registro histológico se evaluó p a prueba de Kruskal - allis para datos no apareado ba de Dunn para múltiples comparaciones. Un 05 se tomó como significativo. En las tablas ant diferencias significativas contra el grupo de ículo) correspondiente se indican como: D2 en el modelo de colitis por DSS inducida en és de un periodo de tratamiento de 10 día idad anti- inflamatoria parece ser más pro és de la administración de la hBD2 dos veces 12 horas) , tanto por la ruta intravenosa com subcutánea, en una dosis de 0.1 mg/kg. Además, e -inflamatorio observado con esta dosis de rable, o aún mayor (tanto sobre el Indice de A a Enfermedad como el registro histológico) , que prednisolona en una dosis de 1 mg/kg o 1 istrada por la ruta oral.

LO 4 idad anti -inflamatoria de la beta-defensina 2 d 2) En los cultivos de PB C humanas se observ amiento con hBD2 tuvo gran influencia sobre el p olisacárido (LPS) , ácido lipoteicoico ( doglicano (PGN) . La IL-10 es una citocin matoria potencial y por lo tanto el efecto resul a hBD2 es anti - inflamatorio . Esto se ha observ PBMC humanas, una línea de células monocítica de células dendritoides .

La hBD2 se preparó como se describe en el Ej miento y estimulación de PBMC La sangre periférica se extrajo de vol ables (con la aprobación del comité ético rele narca) . La sangre heparinizada se diluyó 1/1 v/v sujetó a la centrifugación de densidad Ficoll d s después de la extracción. El plasma se reco arte superior de donadores individuales y se hielo hasta que se utilizó al 2% en el medio de o de cultivo autólogo) . Las PBMC aisl imentos iniciales, para el LPS se utiliza ntraciones diferentes para asegurarse de est de citocina que sea posible modular. En imentos, las PBMC se trataron con Dexamet etacina solas y junto con LPS o LTA como contr egulación por decremento de citocinas inflamator nadantes se recolectaron después de la incubació te 24 horas y se almacenaron a -80 °C hasta la itocina. La viabilidad se midió por medio de Azu ource, DALL 1100) en todos los experimentos y en s también por medio de MTS (Promega) de acuerdo rucciones del fabricante y en algunos expe ién se juzgó por medio del conteo de las células ispositivo NucleocounterMR. ivo y estimulación de MUTZ-3 La línea de células derivadas de leucemia s de células de leucemia mieloide humanas UTZ élulas/ml) se diferenciaron durante 7 días en p GM-CSF (150 ng/ml) y rhIL-4 (50 ng/ml) en DCs in edio se intercambió cada 2-3 días. La línea de enciadas se estimuló adicionalmente con ya sea L y sin hBD2 para explorar el efecto de la hBD2 s as dendríticas. iones de citocinas La producción de citocinas en los sobrenad por medio de la citometría de flujo con una or erlas citométricas de inflamación humana (CBA) de las instrucciones del fabricante (BD) en un citó FACSarray^. Las siguientes citocinas se midiero , IL-10, TNF , IL-12, p70, IL-6. En algunos exper citocinas se midieron por medio de kits de ELIS ems (IL-10, TNF-a, IL-?ß) de acuerdo c s-prueba de Bonferroni como se reporta en las ley tablas. Las diferencias se consideraron signif p<0.05.

TADOS El efecto de la hBD2 se sometió a prueba as tratadas con y sin LPS y LTA (Tablas 6, 7 miento con la hBD2 proporcionó una regulac mento significativa del T F en cultivos estimula tres concentraciones sometidas a prueba (Tabla ación por decremento es dependiente de la dosis p ng/ml y para LTA. Para la IL-?ß, la regula mento se observó principalmente en las dosis m a 7) . Es interesante que la IL-10 fue regu mento significativamente y de manera dependient (.Tabla 8) . La regulación por decremento de flamatorias y la inducción de citocinas anti-infl En las Tablas 11, 12 y 13, los sobrenad donador se analizaron por las citocinas por med o ELISA en lugar de por medio de una orden I as citométricas mediante la citometría de flujo y o se observaron los mismos, aunque la sensibil o es más baja y el límite de detección es mucho r lo tanto los efectos no fueron tan significativ A fin de someter a prueba todavía otro li ptor tipo Toll, se investigó el efecto de la hB estimuladas con peptidoglicano (Tablas 14 y o se observó: el TNF es regulado por decremento d ndiente de la dosis y la IL-10 es inducida d ndiente de la dosis .

Como un control positivo sobre la regula emento del TNF, dos compuestos anti-infla metasona e indometacin , se sometieron a prueb r a aliviar síntomas de la artritis y la dexamet ucocorticoide sintético que se utiliza principal ratamiento de trastornos inflamatorios y tiene u egulacion por decremento muy potente sobre las c flamatorias (Rowland y colaboradores 1998) en d , lo cual también se observa para el TNF-ot y l D2 es tan efectiva o mejor que esos dos compuest matorios .

En las Tablas 19 y 20 se muestra el efec sobre la regulación por decremento del TNF en u élulas monocíticas y sobre células dendríticas, bserva para las PBMC. La IL-10 también fue indu as dendríticas estimuladas con hBD2 y LPS- o hB ltados no mostrados) .

A fin de excluir que el enlace de la hBD2 A causa la regulación por decremento del TNF y 1 decremento sobre la IL-?ß e IL- 8 e IL- 6 compa stimulación con un cóctel de citocina solo. Obv e pudo analizar un efecto sobre el TNF, debi ulación con TNF- (resultados no mostrados) . a 6 . Producción de TNF de células mononucle re periférica humanas (PBMC) después del tra LPS o LTA con y sin hBD2 , todas las mues tieron a prueba en el mismo donador, exp esentativo de 5 donadores. TNF medido por medi nación de Perlas Citométricas (CBA) en un citó o FACSarrayMR, *** p< 0 . 001 comparado con un ectivo (en negrita) , analizado por medio de AN (N= aproximadamente 200 para cada conjunto de F, pg/ml hBD2 hBD2 Control (SD) 100 µ?/G?? 10 µ?/G?? 1 7.3 2.9 2.6 LPS o LTA con y sin hBD2 , todas las mues tieron a prueba en el mismo donador, exp esentativo de 5 donadores. IL-?ß medida por Ordenación de perlas citométricas (CBA) en un c lujo FACSarrayMR, *** p< 0 . 001 analizado por AN (N= aproximadamente 200 para cada conjunto de d 9. Viabilidad de PBMC después de 24 h ulación medida por medio de un ensayo de es que tienen una letra subíndice diferente en l significativamente diferentes sometidos a pru de ANOVA de 2 vías seguido por la pos-p rroni . bilidad, MTS hBD2 hBD2 Control ente en las columnas son significativamente di idos a prueba por medio de ANOVA de 2 vías seg s-prueba de Bonferroni . a 11 . Secreción de TNF-alfa de PBMC después ulación con hBD2 , LTA, LPS o combinaciones os, TNF-alfa medido por medio de ELISA, ctable, límite de detección en el ensayo 0 . 0 0 . 05 comparado con el control respectivo, * arado con el control respectivo.

TNF-alfa medido por medio de ELISA, table, límite de detección en el ensayo 0 . 03 ng/ Secreción de IL-?ß de PBMC despu ulación con hBD2 , LTA, LPS o combinaciones s, TNF-alfa medido por medio de ELISA, table, límite de detección en el ensayo 0.01 O.01 comparado con el control respectivo. 1 . Producción de TNF de células mononucle e periférica humanas (PBMC) después del tratami con y sin hBD2; todas las muestras se some a en el mismo donador. TNF medido por medio ación de Perlas Citométricas (CBA) en un citó FACSarray^, *** p<0.001 comparado con el ctivo, analizado por medio de ANOVA de 2 v imadamente 200 para cada conjunto de datos) . 15. Producción de IL-10 de células mononucl e periférica humanas (PBMC) después del tratami con y sin hBD2 todas las muestras se some 16. Producción de T F de células mononucleares d érica humanas (PBMC) después del tratamiento con LP sin hBD2 p dos controles diferentes para la inhi (Dexametasona e Indometacina) ; todas las mues ieron a prueba en el mismo donador. TNF medido por Ordenación de Perlas Citomét icas (CBA) en un citó FACSarray", los valores subrayados están ficativamente comparados con el control respec ta) , analizados por medio de ANOVA de 2 imadamente 200 para cada conjunto de datos) .

NF, ng/ml LPS LPS Medio (SD) 0.6 ng/ml 20 ng/ml 1. 0.0 1.43 2.84 Control (0.0) (0.05) (0.07) ametasona 0.0 0.038 1.69 35 ng/ml (0.0) (0.004) (0.05) ametasona 0.0 0.30 091 .5 ng/ml (0.0) (0.01 ) (0.03) ametasona 0.0 0.61 6.04 .35 ng/ml (0.0) (0.02) (0.1 ) 17. Producción de IL-10 de células mononucleares érica humanas (PBMC) después del tratamiento con LP y sin hBD2 o dos controles diferentes para efect matorios (Dexametasona e Indometacina) ; todas las mu ieron a prueba en el mismo donador. IL-10 medida por Ordenación de Perlas Citométricas (CBA) en un cit FACSarray", los valores subrayados están incr ficativamente comparados con el control respec ta) , analizados por medio de ANOVA de 2 imadamente 200 para cada conjunto de datos) . -10, pg/ml LPS LPS Medio (SD) 0.6 ng/ml 20 ng/ml 1 . 0.0 53.9 123.4 Control (218.8) (3.1 ) (4.6) xametasona 0.0 100.4 152.5 35 ng/ml (1 .4) (3.8) (5.2) xametasona 2.7 64.6 122.8 3.5 ng/ml (1.9) (3.3) (4.7) xametasona 3.9 46.8 97.1 18. Producción de IL-?ß de células mononucleares érica humanas (PBMC) después del tratamiento con LP sin hBD2 o dos controles diferentes para los efec matorios (Dexametasona e Indometacina) ; todas las mu ieron a prueba en el mismo donador. IL-?ß medida por Ordenación de Perlas Citométricas (CBA) en un cit FACSarray1, los valores subrayados están ficativamente comparados con el control respec ta) , analizados por medio de ANOVA de 2 imadamente 200 para cada conjunto de datos) . -? ß, ng/ml LPS LPS Medio (SD) 0.6 ng/ml 20 ng/ml 1. 0.00 3.96 6.58 Control (0.06) (0.18) (0.23) ametasona 0.00 1.00 2.32 35 ng/ml (0.00) (0.03) (0.07) ametasona 0.00 1.90 3.58 .5 ng/ml (0.00) (0.06) (0.12) ametasona 0.01 2.9 5.56 19. Producción de TNF en el sobrenadante de u células monocíticas humanas (MUTZ-3) desp miento con LPS o LTA, con y sin hBD2. TNF me de una Ordenación de Perlas Citométricas (CB etro de flujo FACSarrayMR, * p<0.05 comparado ol respectivo, ** p<0.01 comparado con el ctivo, analizado por medio de ANOVA de 2 imadamente 200 para cada conjunto de datos) .

NF, pg/ml hBD2 hBD2 Control (SD) 100 µ9/?t?? 10 µ9/??? 1 0.00 0.00 2.60 Medio (5.56) (5.47) (7.17) LPS 6.38 3.93 3.93 .5 g/ml (9.28) (6.63)* (6.93)* LTA 5.28 2.64 3.76 .5 µ9/p?? (9.75) (29.19)* (7.72) NF, pg/ml hBD2 hBD2 Control (SD) 100 µ9/??? 10 g/ml 1 0.00 0.00 1.89 Medio (1 .74) (1.83) (2.15) ( LPS 23.73 7.66 13.8 .5 µ?/?t?? (3.28) (2.51 )*** (2.33)*** ( LTA 3.78 5.22 2.76 .5 µ9/??? (2.26) (2.25) (2.27)* (1 LO 5 idad anti- inflamatoria de hBDl, hBD2 , hBD3 nte de hBD4 El Ejemplo 5 se llevó a cabo esencialmente ribe en el Ejemplo 4. El compuesto rhBD2 , como se as tablas posteriores, es la hBD2 recombinante , déntica a la hBD2 utilizada en el Ejemplo 4.

Los compuestos hBDl, hBD2 , hBD3 y una var , como se muestra en las tablas posterio araron utilizando la síntesis química y se obtuv TADOS 21. Producción de TNF de células mononucl re periférica humanas (PBMC) después del tratami con y sin beta-defensinas de humano, dexame iximab. TNF medido por medio de una Ordenación d étricas (CBA) en un citómetro de flujo FACSa 05, ** p<0.01/ *** p<0.001 analizado por medio vías y comparado con células no tratadas por os -pruebas de Bonferroni.

LPS L Medio mpuesto de 20 ng/ml 0.6 n prueba TNF % de TNF % de TNF pg/ml (SD) control pg/ml (SD) control pg/ml (SD) Medio 1 2164 728 100% 100% o tratado) ) (632) (156) rhBD2 0 167 74 - 8% 40 µ?/?t?? (0) (17)*** (5)*** rhBD2 0 260 125 - 12% 10 µ9/??? (0) (29)*** (20)** mpuesto de LPS LPS Medio 242 prueba 20 ng/ml 0.6 ng/ml 19% (30)* TNF % de TNF % de TNF pg/ml (SD) control pg/ml (SD) control pg/ml (SD) nte de hBD4 0 139 21 1 - 6% 10 9/??? (0) (6)*** (22)** nte de hBD4 0 778 468 - 36% 1 µg/m\ (0) (27)*** (59) 0 635 47 ametasona - 29% (0) (163)*** (8)*** 0 0 0 nfliximab - 0% (0) (0)*** (0)*** Producción de IL-10 de células mononuc re periférica humanas (PBMC) después del tratami con y sin beta-defensinas de humano, dexame iximab. IL-10 medida por medio de una Orden as Citométricas (CBA) en un citómetro d array"*, * p<0.05, ** p<0.01/ *** p<0.001 a medio de A OVA de 2 vías y comparado con cé y comparado con células no tratadas por medio ruebas de Bonferroni .

LPS LP Medio puesto de 20 ng/ml 0.6 n prueba IL-? ß % de IL-1 P % de IL-? ß pg/ml (SD) control pg/ml (SD) control pg/ml (SD) Medio 0 2544 741 100% 100% o tratado) (0) (226) (93) rhBD2 0 395 124 - 16% 0 µg/ml (0) (25)*** rhBD2 0 624 214 - 25% 0 µ9/??? (0) (37)*** (7)*** rhBD2 0 1480 284 - 58% 1 µg/ml (0) (154)*** (15)*** hBD1 0 1599 302 - 63% 0 9/??? (0) (? .)*** (3)*** hBD1 0 1913 401 - 75% 0 µ?/??? (0) (53)*** ( ^)*** hBD1 0 2087 512 - 82% 1 µ?/pp? (0) (157)*** (45)** nte de hBD4 0 1004 286 - 40% 1 \iQ/m\ (0) (24)*** (11)*** 0 1120 104 ametasona - 44% (0) (220)*** (8)*** 0 2704 636 nfliximab - 106% (0) (0) (81) Los efectos de la hBDl, hBD2 , hBD3 ante de hBD4 se sometieron a prueba en PB C adas con y sin LPS (Tablas 21, 22 y 23 aración, la rhBD2 se incluyó en cada configura El TNF se reguló por decremento para t nsinas. La reducción en la secreción de IL arable al TNF, aunque no tan pronunciada como ecreción de IL-10 se mejoró signif icat ivamen ra dependiente de la dosis para la hBD2 y la BD4.

La hBD3 también se sometió a prueba en USION Todas las beta-defensinas de humano som a mostraron un potencial anti -inflamatorio.

LO 6 ción de IL-23 de células dendríticas deriv itos humanos y PBMCs humanas El Ejemplo 6 se llevó a cabo esencialmente ibe en el Ejemplo 4 para las PBMCs humanas; sin ectura fue IL-23 en lugar de TNF, IL-?ß e IL-10. fecto de la rhBD2 sobre células dendríticas itos humanos también se investigó . ación de células dendríticas derivadas de monocito Las DCs se prepararon de acuerdo con un p ficado que fue descrito originalmente por R oradores. En resumen, las células mononucle re periférica (PBMCs) se purificaron de (20 ng/ml) (Pepro Tech) durante 6 días, reabastec /citocinas después de 2 y 5 días. Después de 6 vo, las DCs inmaduras se cultivaron de nuevo e 6 pocilios en una concentración de 1x10s células on sin tratamiento o se trataron con un cóctel te 24 horas adicionales. La hBD2 se sometió a p o concentraciones por cuadruplicado. La hBD2 se su capacidad para suprimir la maduración de hD ipo proinflamatorio utilizando un cóctel proinfl contenía LPS (100 ng/ml) e IFN-? (20 ng/ etasona se agregó 20 horas antes' del cóctel como tivo para un compuesto con actividad anti- infla ica, comprobada. La incubación con hBD2 se r s antes de la adición del cóctel. de citocina Los sobrenadantes de cultivo de cél células fue afectada gravemente por el trat vehículos, cóctel o hBD2 y se realizó de los protocolos del fabricante (Sigma) . isis estadísticos Todos los experimentos se realizaron S dos veces, con los resultados represen rados. Los datos presentados se expresan c iación estándar más/menos de la media (S ificación estadística se determinó por m A de 2 vías con las variables que son trat 2 , dexametasona , etcétera) y estimulació pept idogl i cano , etcétera) seguido por ba de Bonferroni como se reporta en las l las tablas. Las diferencias se co ificativas para p < 0.05.

LTADOS límite de detección) . aración Múltiple de Dunnett.

Como se muestra en la Tabla 24, la hBD2 Esto muestra que la hBD2 podría tener u sor en una condición autoinmune crónica por med sión de la secreción de IL-23, ya que la IL-23 importante de la respuesta inflamatoria. Las son dependientes de IL-23 para su superviv sión y se ha mostrado que las células Thl7 son p arias enfermedades autoinmunes, tal como la enfe , colitis ulcerativa, psoriasis y esclerosis múl LO 7 ción de la secreción de TNF de PBMCs con beta-d ratón (mBD3) El Ejemplo 7 se llevó a cabo esencialmente ribe en el Ejemplo 4 para las PBMCs humanas. nsina 3 de ratón (mBD3) se preparó utilizando ocolo que aquel que se utilizó para la producción i Ejemplo 1. La secuencia de aminoácidos de la superior y se desechó. Las PBMC aisl pendieron en medio de cultivo (RPMI 1640 (Gibco icilina al 1% y estreptomicina y L-Glutamina al aron en placas de cultivo de 96 pocilios con ias por pocilio en un total de 200 µ? . Las PBMC d or se estimularon con 100, 10 o 1 9/t?1 de hBD -defensina 3 de ratón) ; ya sea sola o junto con PS (E. coli, 0111:64, Sigma L4391) . La dexamet ó en una dosis de 3.5 ng/ml a los cultivos c ulación con LPS . Los sobrenadantes se reco és de la incubación a 37 °C durante 24 hor cenaron a -80°C hasta la medición de la citocina.

La producción de citocina en los sobrenad 6 por medio de la citometría de flujo con una or erlas citométricas de inflamación de ratón ( rdo con las instrucciones del fabricante (BD) ores . TNF medido por medio de una Ordenación d iétricas (CBA) en un citómetro de flujo FACSarr 01 comparado con el control respectivo, anali de ANOVA de 2 vías (N= 2 ) .

TNF LPS Medio pg/ml (SEM) 20 ng/ml 5 1353 Medio (1 ) (140) mBD3 2 384 1 µg/m\ (0) mBD3 2 51 10 µ?/G??? (0) (1 )*** mBD3 39 166 100 µ9/Gp? (19) (17)*** hBD2 3 633 1 µ?/?t?? (0) (1 10)*** e periférica de ratón (PBMC) después del tratami con y sin mBD3 , todas las muestras se some a en el mismo donador, experimento representativ ores . TNF medido por medio de una Ordenación d étricas (CBA) en un citómetro de flujo FACSarr 01 comparado con el control respectivo, anali de A OVA de 2 vías (N= 2 ) .

TNF LPS Medio pg/ml (SEM) 20 ng/ml 578 2063 Medio (3) (77) mBD3 347 1600 1 g/ml (32) (47)*** mBD3 180 297 ??µ???? (0) (9)*** mBD3 182 195 tón (Tabla 27) .

Por consiguiente, en esta configuración, la mB xcelente actividad anti-inflamatoria.

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Se hace constar que con relación a esta fecha, o conocido por la solicitante para llevar a la pr a invención, es el que resulta claro de la ipción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como ante ma como propiedad lo contenido en las si ndicaciones : 1. El uso de una beta-defensina de mamífe actura de un medicamento para la admini teral en el tratamiento de una enfermedad in matoria . 2. El uso de conformidad con la reivindic onde la beta-defensina de mamífero se administr subcutánea o intravenosa. 3. El uso de conformidad con cualquiera indicaciones 1-2, en donde la beta-defensina de dministra en una dosificación diaria de aproxim I mg/kg de peso corporal a aproximadamente 10 :4. 6. El uso de conformidad con cualquiera ndicaciones 1-5, en donde la beta-defensina de h eta-defensina 1 de humano, beta-defensina 2 de -defensina 3 de humano o beta-defensina 4 de huma 7. El uso de conformidad con cualquiera indicaciones 1-6, en donde la beta-defensina de por lo menos 80% de identidad con la secu ácidos de la SEC ID NO : 2. 8. El uso de conformidad con cualquiera ndicaciones 1-7, en donde la beta-defensina de beta-defensina 2 de humano . 9. El uso de conformidad con cualquiera indicaciones 1-8, en donde la actividad del TNF ce en los tejidos tratados. 10. Un método para tratar una enfermedad i istra por la ruta subcutánea o intravenosa. 13. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque la beta-defensina de mam istra en una dosificación diaria de aproxim l mg/kg de peso corporal a aproximadamente 10 corporal, preferiblemente de aproximadamente 0. so corporal a aproximadamente 10 mg/kg de peso c 14. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque la beta-defensina de mamífer -defensina de humano. 15. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque la beta-defensina de mamífe lo menos 80% de identidad con las secuen oácidos de la SEC ID NO:l, SEC ID NO : 2 , SEC ID NO 0:4. 16. El método de conformidad con la reivi