BRPI0915973A2

BRPI0915973A2 - uso de uma beta defensina humana

Info

Publication number: BRPI0915973A2
Application number: BRPI0915973-8A
Authority: BR
Inventors: Tanja Maria Rosenkilde Kjaer; Thomas Kruse; Per Holse Mygind; Karoline Sidelmann Brinch; Soeren Kjaerulff; Birgitte Andersen
Original assignee: Novozymes Adenium Biotech As
Priority date: 2008-07-18
Filing date: 2009-07-17
Publication date: 2013-05-07
Also published as: CN102247591A; JP2011528333A; US9279010B2; AP2011005538A0; JP2011225596A; KR20110092325A; IL213680A0; US8802621B2; PH12012501542A1; CL2011000099A1; EP2320930A2; EA201100910A1; EA201170219A1; WO2010007166A2; AR081948A2; US8232242B2; US20120309678A1; MX2011000568A; US20110251139A1; US20100016230A1

Abstract

USO DE UMA BETA DEFENSINA HUMANA. A presente invenção diz respeito ao tratamento de doenças instetinais inflamatórias com BETA defensina de mamíferos.

Description

"USO DE UMA BETA DEFENSINA HUMANA" Referência a uma listagem de seqüência

Este pedido contém uma Listagem de seqüência na forma legível em computador. A forma legível em computador é incorporada neste por referência.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Campo da invenção

A presente invenção diz respeito a prevenção e tratamento de Doenças intestinais inflamatórias pela administração de uma beta defensina de mamífero. Fundamentos Defensinas humanas

Entre muitos outros elementos, os componentes chave de imunidade inata são os peptídeos antimicrobianos (AMPs) que, individualmente, apresentam seletividade considerável, mas, coletivamente, são capazes de matar rapidamente um espectro amplo de bactérias, vírus e fungos. A significância biológica de AMPs é enfatizada por sua distribuição ubíqua em estado natural e estes são provavelmente produzidos por todos os organismos multicelulares. Nos humanos, os AMPs predominantes são as defensinas. As defensinas humanas são peptídeos catiônicos pequenos que podem ser divididos em a- e β-defensinas com base na topologia de suas três ligações de bissulfeto de cisteína intramolecular. As α-defensinas ainda podem ser subdivididas naqueles que foram primeiro isolados de grânulos de neutrófilos (HNP1-4) e aqueles que são expressados por células Paneth nos folículos do intestino delgado (HD5 e HD6). As β-defensinas são principalmente produzidas por células epiteliais em vários tecidos e órgãos incluindo a pele, traquéia, trato gastrointestinal, sistema urogenital, rins, pâncreas e glândulas mamárias. Os membros melhor caracterizados da família de β-defensina são hBDl-3. Entretanto, usando-se várias ferramentas bioinformáticas quase 40 estruturas de leitura abertas que codificam os homólogos de β-defensinas putativos foram anotadas no genoma humano. Algumas das defensinas humanas são produzidas constitutivamente, visto que outros são induzidos por citocinas inflamatórias ou produtos microbianos exógenos.

Tem se tornado claro que as defensinas humanas além de sua atividade antimicrobiana direta também têm uma ampla faixa de propriedades imunomoduladoras/alternativas. Estes incluem a indução de várias quimiocinas e citocinas, atividades quimiotáticas e apoptóticas, indução de prostaglandina, liberação de histamina e leucotrieno, inibição de complemento, estímulo de maturação de célula dendrítica através da sinalização do receptor semelhante a toll e estímulo de liberação de patogênio por neutrófilos. Além disso, as defensinas humanas também desempenham um papel na cura de ferimento, proliferação de células epiteliais e de fibroblasto, angiogênese e vasculogênese.

Existe evidência crescente que as defensinas humanas desempenham um papel importante em muitas doenças infecciosas e inflamatórias. A super-expressão de defensinas humanas é freqüentemente observada na pele inflamada e/ou infectada mais provavelmente por causa da indução local por componentes microbianos ou citocinas pró-inflamatórias endógenas. Na psoríase hBD2 e hBD3 são superabundantes e no epitélio lesional de pacientes com acne vulgar ou foliculite superficial uma super- regulação significante de hBD2 foi observada. Por outro lado, a sub-regulação de hBD2 e hBD3 foi associada com dermatite atópica. A Doença de Crohn Ileal foi associada com a expressão deficiente de HD5 e HD6 e na doença de Crohn na expressão do cólon de hBD2-4 são sub-regulados. Citocinas

As citocinas são polipeptídeos secretados pequenos de eucariotas superiores que são responsáveis pela transdução sinalizadora intercelular e que afeta o desenvolvimento, divisão e função de outras células. Estes são polipeptídeos pleiotrópicos potentes que, por exemplo, por intermédio de receptores correspondentes, atuam como fatores reguladores intercelulares locais e sistêmicos e, portanto, desempenham papéis cruciais em muitos processos biológicos, tais como imunidade, inflamação e hematopoiese. As citocinas são produzidas por diversos tipos celulares incluindo fibroblastos, células endoteliais, células epiteliais, macrófagos/monócitos e linfócitos.

O TNF-α está envolvido em vários processo patofisiológicos e podem ser protetores, como na defesa de hospedeiro, ou nocivo, como na autoimunidade. O TNF-α é uma das citocinas chave que disparam e sustentam a resposta da inflamação e a inativação de TNF-α mostrou ser importante na sub-regulação das reações inflamatórias associada com as doenças auto-imunes. Em uma infecção, o TNF-α é secretado em quantidades altas por macrófagos e isto media o recrutamento de neutrófilos e macrófagos a locais de infecção por estímulo de células endoteliais para a produção das moléculas de adesão e pela produção de quimiocinas, que são citocinas quimiotáticas. O TNF-α ajuda a ativar leucócitos e outras células inflamatórias e aumenta a permeabilidade vascular dentro de tecidos feridos. O TNF-α é principalmente produzido por macrófagos, monócitos ou células dendríticas, mas também por uma ampla variedade de outros tipos celulares incluindo células linfóides, mastócitos, células endoteliais, miócitos cardíacos, tecido adiposo, fibroblastos e tecido neuronal.

Os medicamentos anti-inflamatórios correntes bloqueiam a ação de TNF-α pela ligação a este e, desse modo, evita que este sinalize os receptores para TNF-α na superfície de células. Este tipo de bloqueio tem alguns efeitos colaterais sérios, dos quais alguns são infecções tais como tuberculose, sepse e infecções fungicas e possível incidência de câncer aumentada. O IL-10, também conhecido como fator inibidor da síntese de citocina humana (CSIF), também é um desempenhador chave na regulação imune como uma citocina anti-inflamatória. Esta citocina é produzida por diversos tipos celulares incluindo monócitos, macrófagos, células T, células B, células dendríticas e mastócitos. Estas citocinas tem efeitos pleiotrópicos na imuno-regulação e na inflamação. Isto sub-regula a expressão de citocinas pró-inflamatórias, citocinas secretadas por células Thl/Thl7, MHC classe II Ags e moléculas co-estimuladoras em células que apresentam antígenos. IL- também é secretado por uma população de células T denominadas células T reguladoras (Tregs). Estas células não evitam a ativação de célula T inicial; em vez disso, estes inibem uma resposta sustentada e evitam respostas crônicas e potencialmente danificadoras. Na periferia, algumas células T são induzidas para tornar-se Tregs por antígeno e IL-IO ou TGF-G3. Os Tregs induzidos por IL-IO são CD4+/CD25+/Foxp3- e são referidos como células Trl. Estas células suprimem as respostas imunes pela secreção de IL-10. Estudos recentes revelaram uma diversificação maior do repertório atuador de célula T do que o Thl/Th2/Treg com a identificação de células Thl7. Esta população mostrou-se ser patogênica em diversas doenças autoimunes, tais como doença de Crohn, colite ulcerativa, psoríase e esclerose múltipla, previamente atribuído à linhagem de Thl. As citocinas secretadas por Thl7 também são sub-reguladas por IL-IO e o bloqueio de TNF evita a psoríase pela inativação das células Th 17. A atividade total de IL-10 é anti- inflamatória e foi mostrada evitar inflamação e dano em diversos estudos animais, entretanto o tratamento clínico com IL-10 permanece insuficiente por causa de dificuldades na via de administração de IL-10 e sua vida média biológica.

Doenças intestinais inflamatórias

As doenças intestinais inflamatórias (IBD) são definidas por inflamação intestinal recorrente de origem obscura. O IBD refere-se a dois distúrbios distintos, doença de Crohn e colite ulcerativa (UC). Ambas as doenças parecem resultar da ativação irrestrita de uma resposta inflamatória no intestino. Esta cascata inflamatória é pensada ser perpetuada através das ações de citocinas pró-inflamatórias e ativação seletiva de sub-séries de linfócitos. Em pacientes com IBD5 úlceras e inflamação do revestimento interno dos intestinos levam a sintomas de dor abdominal, diarréia e sangramento retal. A colite ulcerativa ocorre no intestino grosso, enquanto em Crohn, a doença pode envolver o trato GI todo bem como os intestinos delgado e grosso. Para a maioria dos pacientes, o IBD é uma condição crônica com sintomas que duram de meses a anos. Isto é mais comum em adultos jovens, mas pode ocorrer em qualquer idade. Isto é observado no mundo todo, mas é mais comum em países industrializados, tais como os Estados Unidos, Inglaterra e norte da Europa. Isto é especialmente comum em pessoas de descendência judaica e que também tenha diferenças raciais na incidência. Os sintomas clínicos de IBD são sangramento retal intermitente, dor abdominal espasmódica, perda de peso e diarréia. O diagnóstico de IBD é fundamentado nos sintomas clínicos, o uso de um enema de bário, mas visualização direta (sigmoidoscopia ou colonoscopia) é o teste mais preciso. O IBD prolongado é um fator de risco para o câncer de cólon e o tratamento de IBD pode envolver medicações e cirurgia.

Alguns pacientes com UC apenas têm a doença no reto (protite). Outros com UC têm a doença limitada ao reto e ao cólon esquerdo adjacente (proctosigmoidite). Ainda, outros têm UC do cólon todo (IBD universal). Os sintomas de UC são, em geral, mais graves com doença mais extensiva (porção grande do cólon envolvida com a doença).

O prognóstico de pacientes com a doença limitada ao reto (protite) ou UC limitado ao final do cólon (proctosigmoidite) é melhor do que aquele do UC de cólon total. Tratamentos periódicos breves usando-se medicamentos orais ou enemas podem ser suficientes. Aqueles com a doença mais extensiva, a perda de sangue dos intestinos inflamados pode levar à anemia e pode requerer tratamento com suplementos de ferro ou ainda transfusões de sangue. Raramente, o cólon pode dilatar agudamente a um tamanho grande quando a inflamação torna-se muito grave. Esta condição é denominada megacólon tóxico. Pacientes com megacólon tóxico são extremamente doentes com febre, dor e distensão abdominal, desidratação e desnutrição. A não ser que o paciente melhore rapidamente com medicação, cirurgia é usualmente necessária para evitar a ruptura do cólon.

A doença de Crohn pode ocorrer em todas as regiões do trato gastrointestinal. Com esta doença, a obstrução intestinal devido à inflamação e à fibrose ocorre em um grande número de pacientes. Os granulomas e a formação de fístulas são complicações freqüentes da doença de Crohn. As conseqüências da progressão da doença incluem alimentação intravenosa, cirurgia e colostomia.

O IBD pode ser tratado medicinalmente. As medicações mais comumente usadas para tratar IBD são medicamentos anti-inflamatórios, tais como os salicilatos. As preparações de salicilato foram eficazes no tratamento de doença branda a moderada. Estes também podem diminuir a freqüência de piora súbita da doença quando as medicações são tomadas em uma base prolongada. Os exemplos de salicilatos incluem sulfasalazina, olsalazina e mesalamina. Todas estas medicações são dadas oralmente em doses altas para o benefício terapêutico máximo. Estes medicamentos não são sem efeitos colaterais. A Azulfidina pode causar estômago descontrolado quando tomado em altas doses e casos raros de inflação renal branda foram relatados com algumas preparações de salicilato.

Os corticoesteróides são mais potentes e de atuação mais rápida do que os salicilatos no tratamento de IBD, mas efeitos colaterais potencialmente sérios limitam o uso de corticoesteróides a pacientes com doença mais grave. Os efeitos colaterais de corticoesteróides usualmente ocorrem com o uso a longo prazo. Estes incluem o afinamento do osso e da pele, infecções, diabete, enfraquecimento muscular, arredondamento das faces, distúrbio psiquiátrico e, em ocasiões raras, destruição das juntas do quadril.

Em pacientes com IBD que não respondem a salicilatos ou corticoesteróides, as medicações que suprimem o sistema imune são usados. Os exemplos de imunossupressores incluem azatioprina e 6-mercaptopurina. Os imunossupressores usados nesta situação ajudam a controlar IBD e permitem a redução ou eliminação gradual de corticoesteróides. Entretanto, os imunossupressores tornam o paciente imuno-comprometido e suscetível a muitas outras doenças.

Um modelo bem reconhecido para o estudo de IBD é o modelo de camundongo com colite DSS, como descrito em Kawada et ai. "Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowl disease", World J. GastroenteroL, Vol. 13 (42), pp. 5581-5593 (2007); and Wirtz and Neurath "Mouse models of inflammatory bowl disease", Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 59 (11), 1073-1083 (2007).

Claramente, existe uma grande necessidade quanto a agentes capazes de evitar e tratar IBD.

Uso de Defensinas humanas para o Tratamento de Doenças Intestinais Inflamatórias

De maneira interessante, doença de Crohn no intestino delgado foi associada com níveis diminuídos das α-defensinas de célula paneth HD5 e HD6, visto que a doença de Crohn no cólon foi associada com a produção reduzida das β-defensinas hBD2 e hBD3 (Gersemann et al., 2008; Wehkamp et al, 2005). Além disso, o envolvimento do microbiota entérico na patogênese de Crohn foi convincentemente demonstrado (Swidsinski et al., 2002). Usando-se a hibridização por fluorescência in situ, estes pesquisadores mostraram que na doença de Crohn ativa um aumento drástico de bactérias associadas com a mucosa e invasivas foi observado, visto que estas bactérias estão ausentes do epitélio do intestino delgado e grosso. Juntas, estas observações fundiram-se em uma hipótese, sugerindo que, em pessoas saudáveis, um nível apropriado de defensinas junto com a barreira epiteüal intestinal atua para controlar a composição e o número de bactérias luminais e mantendo-as longe da aderência e invasão da mucosa para disparar uma inflamação (Wang et ai, 2007). Por outro lado, em pessoas com uma capacidade insuficiente para produzir um nível de proteção de defensinas secretadas, o equilíbrio é mudado entre a defesa antibacteriana e as bactérias luminais. Como um resultado, este permite uma invasão bacteriana nos tecidos intestinais subjacentes que induzem um estado inflamatório, que, por sua vez, pode se desenvolver em doença de Crohn.

Com base nesta hipótese, o WO 2007/081486 divulga o uso de diversas defensinas humanas no tratamento de doença intestinal inflamatória. Os inventores sugeriram que as defensinas administradas oralmente a pacientes com Crohn, em uma formulação que permita sua liberação em locais apropriados no lúmen intestinal, deve reduzir o número de bactérias invasoras, reestabelecer uma função de barreira epitelial normal e, desta maneira, reduzir a gravidade da doença inflamatória.

De acordo com o WO 2007/081486, a função das defensinas é alvejar e matar diretamente a bactéria no lúmen para evitar que esta invada o tecido epitelial. Isto é, a função das defensinas é puramente como um composto anti-infectivo. Com relação ao W0/2007/081486, é surpreendente que o hBD2 administrado parenteralmente seja capaz de reduzir a gravidade de colite induzida por DSS em camundongos, por causa do uso desta via de administração o peptídeo nunca encontra bactérias luminais. Adicionalmente, mostramos aqui que o efeito de hBD2 é uma redução do nível das citocinas pró-inflamatórias TNFaj IL-I β e IL-23 secretadas por PBMCs. Estas citocinas são conhecidas serem desempenhadores chave em muitas doenças inflamatórias incluindo doença intestinal inflamatória. Foi conhecido por mais de uma década que as defensinas além de suas funções anti-microbianas também possuem uma faixa de funções imunomoduladoras. Entretanto, a grande maioria de trabalho nas propriedades moduladoras imunes das defensinas humanas descreve estes como tendo primariamente funções intensificadoras pró-inflamatórias ou imunes (Ver, por exemplo, Niyonsaba et al., 2007; Bowdish et al., 2006; Lehrer, 2004).

Em conseqüência, é verdadeiramente inesperado que o hBD2 administrado parenteralmente deva ser capaz de reduzir a gravidade da doença em paciente com IBD. Primeiro de todos, quando administrado parenteralmente, o hBD2 nunca atingiria o lúmen intestinal para encontrar as bactérias nocivas envolvidas na indução da doença. Além disso, com base na grande maioria de literatura publicada, deve-se esperar que a defensina que entra na corrente sangüínea deve induzir uma resposta pró-inflamatória em vez de uma resposta anti-inflamatória, como observado no trabalho apresentado neste.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

Defensina: O termo "defensina" como usado neste refere-se a polipeptídeos reconhecidos por uma pessoa habilitada na técnica como pertencendo à classe de defensina de peptídeos antimicrobianos. Para determinar se um polipeptídeo é uma defensina de acordo com a invenção, a seqüência de aminoácido pode ser comparada com os perfis de modelo de markov escondido (perfis de HMM) do banco de dados PFAM usando-se o pacote de software HMMER livremente disponível.

As famílias de defensinas PFAM incluem, por exemplo, Defensina l ou "Defensina de mamífero" (acessão n° PF00323), and Defensina_2 ou Defensina_beta ou "Beta Defensina" (acessão n° PF00711).

As defensinas da invenção pertencem a uma classe de beta defensina. As defensinas de uma classe de beta defensina dividem características estruturais comuns, tais como o padrão de cisteína.

Os exemplos de defensinas, de acordo com a invenção, incluem beta defensina humana 1 (hBDl; ver SEQ ID N°: 1), beta defensina humana 2 (hBD2; ver SEQ ID N0: 2), beta defensina humana 3 (hBD3; ver SEQ ID N0: 3), beta defensina humana 4 (hBD4; ver SEQ ID N°: 4) e beta defensina de camundongo 3 (mBD3; ver SEQID N°: 6).

Identidade: A relação entre as duas seqüências de aminoácidos ou entre as duas seqüências de nucleotídeo é descrito pelo parâmetro "identidade".

Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre duas seqüências de aminoácido é determinado usando-se o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol Biol 48: 443- 453) como implementado no programa Needle da EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al, 2000, Trends in Genetics 16: 276-277; http//: emboss.org), preferivelmente versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade aberta de fenda de 10, penalidade de extensão de fenda de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (EMBOSS versão de BLOSUM62). A saída de "identidade mais longa" rotulada por Needle (obtido usando-se uma opção -nobrief) é usada como a identidade percentual e é calculada como segue:

(Resíduos Idênticos χ 100)/(Comprimento de Alinhamento - Número Total de Fendas em Alinhamento)

Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre duas seqüências de desoxirribonucleotídeo é determinado usando-se o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle da EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra; http://emboss.org), preferivelmente versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade aberta de fenda de 10, penalidade de extensão de fenda de 0,5 e a matriz de substituição EDNAFULL (EMBOSS versão de NCBI NUC4.4). A saída de "identidade mais longa" rotulada por Needle (obtido usando-se uma opção -nobrief) é usada como a identidade percentual e é calculada como segue: (Desoxirriblonucleotídeos Idênticos χ 100)/(Comprimento de Alinhamento - Número Total de Fendas em Alinhamento).

Polipeptídeos isolado: O termo "variante isolada" ou "polipeptídeos isolados" como usado neste refere-se a uma variante ou um polipeptídeo que é isolado de uma fonte. Em um aspecto, a variante ou polipeptídeo é pelo menos 1 % puro, preferivelmente pelo menos 5 % puro, mais preferivelmente pelo menos 10 % puro, mais preferivelmente pelo menos 20 % puro, mais preferivelmente pelo menos 40 % puro, mais preferivelmente pelo menos 60 % puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 80 % puro, e mais preferivelmente pelo menos 90 % puro, como determinado por SDS-PAGE.

Polipeptídeo substancialmente puro: O termo "polipeptídeo substancialmente puro" indica aqui, uma preparação de polipeptídeo que contém na maioria 10 %, preferivelmente na maioria 8 %, mais preferivelmente na maioria 6 %, mais preferivelmente na maioria 5 %, mais preferivelmente na maioria 4 %, mais preferivelmente na maioria 3 %, ainda mais preferivelmente na maioria 2 %, mais preferivelmente na maioria 1 % e ainda mais preferivelmente na maioria 0,5 % em peso do outro material de polipeptídeo com o qual este é natural ou recombinantemente associado. Portanto, é preferido que o polipeptídeo substancialmente puro é pelo menos 92 % puro, preferivelmente pelo menos 94 % puro, mais preferivelmente pelo menos 95 % puro, mais preferivelmente pelo menos 96 % puro, mais preferivelmente pelo menos 96 % puro, mais preferivelmente pelo menos 97 % puro, mais preferivelmente pelo menos 98 % puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 99 %, mais preferivelmente pelo menos 99,5 % puro e ainda mais preferivelmente 100 % puro em peso do material de polipeptídeo presente na preparação. Os polipeptídeos da presente invenção estão preferivelmente em uma forma substancialmente pura. Isto pode ser realizado, por exemplo, pela preparação do polipeptídeo pelos métodos recombinantes bem conhecidos ou pelos métodos de purificação clássicos.

Beta defensina de mamíferos

A presente invenção diz respeito a usos farmacêuticos de beta defensina de mamíferos, tais como defensinas humanas e/ou beta defensinas de camundongo, no tratamento de doenças intestinais inflamatórias, tais como colite ulcerativa e/ou doença de Crohn. O tratamento é preferivelmente associado com atividade reduzida de TNF-alfa em tecidos tratados.

Em uma forma de realização, a beta defensina de mamíferos da invenção tem um grau de identidade de pelo menos 80 %, preferivelmente pelo menos 85 %, mais preferivelmente pelo menos 90 %, e mais preferivelmente pelo menos 95 % a qualquer de uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID N°: 1, SEQ ID N0: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5 e/ou SEQ ID N°: 6. Em uma forma de realização preferida, a beta defensina de mamíferos da invenção tem um grau de identidade de pelo menos 80 %, preferivelmente pelo menos 85 %, mais preferivelmente pelo menos 90 %, e mais preferivelmente pelo menos 95 % a qualquer de uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID N0: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3 e/ou SEQ ID N0: 4. Em uma forma de realização mais preferida, a beta defensina de mamíferos da invenção consiste de beta defensina humana 1 (SEQ ID N°: 1), beta defensina humana 2 (SEQ ID N0: 2), beta defensina humana 3 (SEQ ID N°: 3), beta defensina humana 4 (SEQ ID N°: 4), uma variante de beta defensina humana 4 (SEQ ID N0: 5) e/ou beta defensina de camundongo 3 (SEQ ID N°: 6). Ainda, em uma forma de realização mais preferida, a beta defensina de mamíferos da invenção consiste de beta defensina humana 1 (SEQ ID N°: 1), beta defensina humana 2 (SEQ ID N°: 2), beta defensina humana 3 (SEQ ID N°: 3) e/ou beta defensina humana 4 (SEQ ID N°: 4).

Em uma outra forma de realização, a beta defensina de mamíferos da invenção tem um grau de identidade de pelo menos 80 %, preferivelmente pelo menos 85 %, mais preferivelmente pelo menos 90 %, e mais preferivelmente pelo menos 95 % à seqüência de aminoácido da SEQ ID N0: 2. Em uma forma de realização preferida, a beta defensina de mamíferos da invenção consiste de beta defensina humana 2 (SEQ ID N°: 2).

Ainda, em uma outra forma de realização, a beta defensina de mamíferos da invenção consiste de beta defensinas humanas e/ou beta defensinas de camundongo e suas variantes funcionalmente equivalentes. Preferivelmente, a beta defensina de mamíferos consiste de beta defensina humana 1, beta defensina humana 2, beta defensina humana 3, beta defensina humana 4 e beta defensina de camundongo 3, e suas variantes funcionalmente equivalentes. Mais preferivelmente, a beta defensina de mamíferos da invenção consiste de beta defensina humana 2, e suas variantes funcionalmente equivalentes.

As beta defensinas de mamífero também são referidas como compostos das formas de realização preferidas.

No contexto da presente invenção, uma "variante funcionalmente equivalente" de uma beta defensina de mamífero (por exemplo, humana) é uma beta defensina de mamífero modificada (por exemplo, humana) que apresenta aproximadamente o mesmo efeito em uma doença intestinal inflamatória como o mamífero precursor (por exemplo, humana) beta defensina. Preferivelmente, esta também apresenta aproximadamente o mesmo efeito na atividade de TNF-alfa como a beta defensina de mamífero (por exemplo, humana).

De acordo com a invenção, uma variante funcionalmente equivalente de uma beta defensina de mamífero (por exemplo, humana) pode compreender de 1 a 5 modificações de aminoácido, preferivelmente 1 a 4 modificações de aminoácido, mais preferivelmente 1 a 3 modificações de aminoácido, mais preferivelmente 1 a 2 modificações de aminoácido e, em particular, uma modificação de aminoácido, em comparação à seqüência de aminoácido de beta defensina de mamífero (por exemplo, humana).

O termo "modificação" significa, neste, qualquer modificação química de uma beta defensina de mamífero (por exemplo, humana). As modificações podem ser substituições, anulações e/ou inserções dos aminoácidos bem como substituições de cadeias secundárias de aminoácidos ou uso de aminoácidos não naturais com características similares na seqüência de aminoácido. Em particular, as modificações podem ser amidações, tal como a amidação do terminal C.

Preferivelmente, as modificações de aminoácido são de uma natureza menor, que são substituições ou inserções de aminoácido conservativas que não afetam significantemente a dobra e/ou a atividade do polipeptídeo; anulações simples; extensões de terminal amino ou carboxila pequenas; um peptídeo ligador pequeno de até cerca de 20 a 25 resíduos ou uma extensão pequena que facilita a purificação pela mudança na carga da rede ou uma outra função, tal como um rótulo de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

Os exemplos de substituições conservativas estão dentro do grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácido ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácido que, em geral, não alteram a atividade específica são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, In, The Proteinsi Academic Press, New York. As mudanças que ocorrem mais comumente são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Vai, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Vai, Ala/Glu e Asp/Gly.

Além dos 20 aminoácidos padrão, aminoácidos não padrão (tais como 4-hidroxiprolina, 6-N-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina e alfa-metil serina) podem ser substituídos por resíduos de aminoácidos de um polipeptídeo do tipo selvagem. Um número limitado de aminoácidos não conservativos, aminoácidos que não são codificados pelo código genético e aminoácidos não naturais podem ser substituídos por resíduos de aminoácidos. "Aminoácidos não naturais" foram modificados após a síntese de proteína, e/ou têm uma estrutura química em suas cadeias secundárias diferentes daqueles dos aminoácidos padrão. Os aminoácidos não naturais podem ser quimicamente sintetizados e, preferivelmente, estão comercialmente disponíveis e incluem ácido pipecólico, ácido tiazolidino carboxílico, desidroprolina, 3- e 4-metilprolina e 3,3-dimetilprolina.

Os aminoácidos essenciais em uma beta defensina de mamífero podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tal como a mutagênese direcionada ao local ou mutagênese de varredura de alanina (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081- 1085). Na última técnica, mutações de alanina simples são introduzidos em cada resíduo na molécula e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto à atividade biológica (isto é, atividade contra uma doença intestinal inflamatória e/ou supressão de atividade de TNF-alfa) para identificar os resíduos de aminoácido que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et ai, 1996, J. Biol Chem. 271: 4699-4708. As identidades de aminoácidos essenciais também podem ser inferidas a partir da análise de identidades com polipeptídeos que são relatados à beta defensina de mamíferos.

As substituições de aminoácido simples ou múltiplas podem ser realizadas e testadas usando-se métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou mistura, seguido por um procedimento de avaliação relevante, tal como aquele divulgado por Reidhaar-Olson and Sauer5 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl Acad ScL USA 86: 2152-2156; WO 95/17413 ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propenso ao erro, apresentação de fago (por exemplo, Lowman et ai, 1991, Biochem. 30:10832-10837; Patente U. S. N°. 5,223,409; WO 92/06204) e mutagênese direcionada à região (Derbyshire et ai, 1986, Gene 46:145; Ner et ai, 1988, DNA 7:127).

Uma extensão de terminal N dos polipeptídeos da invenção podem constituir adequadamente de 1 a 50 aminoácidos, preferivelmente 2 a aminoácidos, especialmente 3 a 15 aminoácidos. Em uma forma de realização, a extensão de peptídeo de terminal N não contém um Arg (R). Em uma outra forma de realização a extensão de terminal N compreende um kex2 ou local de clivagem semelhante a kex2 como ainda será definido abaixo. Em uma forma de realização preferida a extensão de terminal N é um peptídeo, que compreende pelo menos dois resíduos de aminoácido Glu (E) e/ou Asp (D), tal como uma extensão de terminal N que compreende uma das seguintes seqüências: EAE, EE, DE e DD. Métodos e Usos

A Beta defensina humana 2 foi observada reduzir significantemente a gravidade de parâmetros de doença em um modelo de colite induzido por Sulfato Sódico de Dextrano (DSS) no camundongo; desta maneira apresentando atividade potente como um medicamento para o tratamento de doenças intestinais inflamatórias, tais como colite ulcerativa e doença de Crohn.

A presente invenção portanto, fornece métodos para o tratamento de doenças intestinais inflamatórias, cujo tratamento compreende administrar parentericamente, a um indivíduo em necessidade de tal tratamento, uma quantidade eficaz de uma beta defensina de mamífero, tais como defensina humana 2, por exemplo, na forma de uma composição farmacêutica. Também são fornecidas beta defensina de mamíferos, tais como defensina humana 2, para a fabricação de um medicamento para a administração parenteral e o uso de beta defensina de mamíferos, tais como defensina humana 2, para a fabricação de um medicamento para a administração parenteral, por exemplo, uma composição farmacêutica, para o tratamento de doença intestinal inflamatória. O tratamento inclui tratamento de uma doença ou distúrbio existentes, bem como profilaxia (prevenção) de uma doença ou distúrbio.

Em uma forma de realização, o tratamento resulta em atividade reduzida de TNF-alfa em tecidos tratados, preferivelmente atividade reduzida de TNF-alfa e atividade aumentada de IL-10.

A Beta defensina de mamíferos pode ser utilizada terapeuticamente em composições formuladas pela administração por qualquer via convencional, incluindo entericamente (por exemplo, bucal, oral, nasal, retal), parentericamente (por exemplo, intravenosa, intracranial, intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular) ou topicamente (por exemplo, epicutânea, intranasal ou intratraqueal). Dentro de outras formas de realização, as composições descritas neste podem ser administradas como parte de um implante de liberação sustentada.

Ainda, dentro de outras formas de realização, as composições, de formas de realização preferidas podem ser formuladas como um liofilizado, utilizando-se excipientes apropriados que fornecem estabilidade como um liofilizado e subsequente à reidratação. As composições farmacêuticas contendo uma beta defensina de mamífero, tal como uma beta defensina humana, podem ser fabricadas de acordo com métodos convencionais, por exemplo, por processos de mistura, granulação, revestimento, dissolução ou liofilização.

As composições farmacêuticas de formas de realização preferidas compreendem uma beta defensina de mamífero, tal como uma beta defensina humana, e um carregador e/ou diluente farmaceuticamente aceitáveis.

A beta defensina de mamífero, tal como uma beta defensina humana, é preferivelmente utilizada nas composições farmacêuticas em uma quantidade que seja eficaz para o tratamento de uma doença intestinal inflamatória, preferivelmente com toxicidade aceitável ao paciente. Para tal tratamento, a dosagem apropriada, é claro, variar dependendo, por exemplo, da natureza química e dos dados farmacocinéticos de um composto da presente invenção usados, do hospedeiro individual, do modo de administração e da natureza e da gravidade das condições sendo tratadas. Entretanto, em geral, para resultados satisfatórios em mamíferos grandes, por exemplo humanos, uma dosagem diária indicada é preferivelmente de cerca de 0,001 g a cerca de 1,5 g, mais preferivelmente de cerca de 0,01 g a 1,0 g ou de cerca de 0,001 mg/kg de peso corporal a cerca de 20 mg/kg de peso corporal, preferivelmente de cerca de 0,01 mg/kg de peso corporal a cerca de mg/kg de peso corporal, mais preferivelmente de cerca de 0,1 mg/kg de peso corporal a cerca de 10 mg/kg de peso corporal, por exemplo, administrado em doses divididas de até um, dois, três ou quatro vezes por dia. Os compostos das formas de realização preferidas podem ser administrados a mamíferos grandes, por exemplo humanos, por modos similares de administração em dosagens similares àquelas convencionalmente usadas.

Em certas formas de realização, as composições farmacêuticas de formas de realização preferidas podem incluir uma beta defensina de mamífero, tal como uma beta defensina humana, em uma quantidade de cerca de 0,5 mg ou menos a cerca de 1500 mg ou mais por forma de unidade de dosagem dependendo da via de administração, preferivelmente de cerca de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 ou 0,9 mg a cerca de 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 mg e mais preferivelmente de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ou 25 mg a cerca de 30,35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 mg. Em certas formas de realização, entretanto, dosagens inferiores ou superiores do que aqueles mencionados acima podem ser preferidas. As concentrações e as dosagens apropriadas podem ser facilmente determinados por uma pessoa habilitada na técnica.

Os carregadores e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis são familiares àqueles habilitados na técnica. Para composições formuladas como soluções líquidas, carregadores e/ou diluentes aceitáveis incluem solução salina e água estéril pode, opcionalmente, incluir antioxidantes, tampões, bacteriostatos e outros aditivos comuns. As composições também podem ser formuladas como pílulas, cápsulas, grânulos, tabletes (revestidos ou não revestidos), soluções (inj etáveis), soluções sólidas, suspensões, dispersões, dispersões sólidas (por exemplo, na forma de ampolas, frascos, cremes, géis, pastas, pó inalador, espumas, tinturas, batons, gotas, pulverizações ou supositórios). A formulação pode conter (além de uma beta defensina de mamífero, e outros ingredientes ativos opcionais) carregadores, enchedores, desintegrantes, condicionadores de fluxo, açúcares e adoçantes, fragrâncias, conservantes, estabilizantes, agentes umectantes, emulsificantes, solubilizantes, sais para regular a pressão osmótica, tampões, diluentes dispersantes e agentes ativos de superfície, aglutinantes, lubrificantes e/ou outros excipientes farmacêuticos como são conhecidos na técnica. Uma pessoa habilitada nesta técnica ainda pode formular beta defensina de mamíferos de uma maneira apropriada e, de acordo com as práticas aceitas, tais como aquelas descritas em Remington 's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1990.

A beta defensina de mamífero, tal como uma beta defensina humana, podem ser usados sozinhos ou em terapias de combinação com um, dois ou mais outros compostos farmacêuticos ou substâncias de medicamento, e/ou com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Síntese In vitro

Beta defensina de mamíferos, tais como defensina humana 2, pode ser preparada pela síntese xn vitro, usando-se métodos convencionais como conhecido na técnica. Vários mecanismos sintéticos comerciais estão disponíveis, por exemplo, sintetizadores automatizados pela Applied Biosystems Inc., Beckman, etc. Usando-se os sintetizadores, os aminoácidos de ocorrência natural podem ser substituídos por aminoácidos não naturais, particularmente D-isômeros (ou D-formas) por exemplo, D-alanina e D- isoleucina, diastereoisômeros, cadeias secundárias tendo comprimentos ou funcionalidades diferentes e outros. A seqüência particular e maneira de preparação será determinada por conveniência, economia, pureza requerida e outros.

A ligação química pode ser fornecida a vários peptídeos ou proteínas que compreendem funcionalidades convenientes para a ligação, tais como grupos amino, tais como grupos amino para amida ou formação de amina substituída, por exemplo, aminação redutiva, grupos tiol para a formação de tioéter ou bissulfeto, grupos carboxila para a formação de amida e outros.

Se desejado, vários grupos podem ser introduzidos no peptídeo durante a síntese ou durante a expressão, que permite a ligação a outras moléculas ou a uma superfície. Desta maneira, as cisteínas podem ser usada para a fabricação de tioéteres, histidinas para a ligação a um complexo de íon metálico, grupos carboxila para a formação de amidas ou ésteres, grupos amino que formam amidas e outros. A beta defensina de mamíferos também pode ser isolada e purificada de acordo com métodos convencionais de síntese recombinante. Um lisado pode ser preparado a partir do hospedeiro de expressão e o lisado purificado usando-se HPLCi cromatografia de exclusão, eletroforese em gel, cromatografia de afinidade ou outra técnica de purificação.

A presente invenção ainda é descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser construídos como limitantes do escopo da invenção. EXEMPLOS

Durante o teste de hBD2 quanto a efeitos imunomoduladores, foi inesperadamente observado que o hBD2 teve potencial anti-inflamatório vasto.

Aqui5 mostramos que o hBD2 teve efeito significante no tratamento de doença intestinal inflamatória (colite) induzido pela administração de sulfato sódio de dextrano (DSS) no camundongo. Também observamos que hBD2 teve potencial de sub-regulação em TNF-alfa. EXEMPLO 1

Produção de beta defensina humana 2 (hBD2)

O hBD2 foi produzido recombinantemente. Um fragmento de DNA sintético (DNA 2.0) que codifica hBD2 foi clonado no vetor de expressão pET-32(+) (Novagen). O plasmídeo resultante codifica um peptídeo de fusão de tradução contendo uma parte de tioredoxina de terminal N seguido por um his-tag, um local de clivagem de enterocinase e finalmente o peptídeo hBD2. O plasmídeo de expressão foi transformado na cepa de E. coli BL21.

Uma cultura durante a noite desta cepa foi diluída 100 vezes em TB contendo glicerol 100 pg/ml de ampicilina e desenvolvido a um ODóOO de aproximadamente 8 a 37° C e induzido com 0,5 mM de IPTG por 3 horas após em que as células foram coletadas pela centrifugação. O peptídeo de fusão trx-hBD2 alvejado por his foi purificado em pérolas Ni- NTA (QIAGEN) usando protocolos padrão. O peptídeo de fusão purificado por his-tag foi subseqüentemente dializado durante a noite no tampão de enterocinase (50 mM de tris-HCl pH 7,5, 1 mM de CaCl2) e clivado com enterocinase para liberar hBD2 maduro. O peptídeo hBD2 ainda foi purificado pela cromatografia trocadora de cátion usando matriz Fonte 15 S (Amersham Biosciences). O peso molecular correto de hBD2 foi verificado usando espectrometria de massa MALDI-TOF.

A produção de mBD3 (ver Exemplo 7) foi realizada usando um protocolo idêntico.

A dobra apropriada e topologia de ponte de bissulfeto da molécula hBD2 foi subseqüentemente verificada usando digestão tríptica ligada com espectroscopia LC-MS e NMR.

Endotoxina foi removida pelo RP-HPLC preparativo em pH baixo e o conteúdo de endotoxina foi determinado por um ensaio LAL (Endosafe KTA2) e o nível foi observado estar abaixo do limite de detecção do ensaio (0,05 EU/mg). Para determinar que os níveis abaixo do limite de detecção do ensaio de endotoxina não foram capazes de estimular PBMC5 curvas de titulação do estímulo com um lipopolissacarídeo mais potente (E. coli, Olll:B4, Sigma L4391) foram realizados. Os níveis mais baixos de LPS (0,06 ng/ml) foram capazes de estimular PBMC a uma produção de citocina detectável. EXEMPLO 2

Modelo de colite induzida por sulfato de dextrano sódico (DSS) de 10 dias no camundongo

O propósito do seguinte estudo foi para determinar a atividade anti-inflamatória de beta defensina humana 2 em um modelo agudo (10 dias) da doença intestinal inflamatória (colite) induzida pela administração do sulfato de dextrano sódico oral no camundongo.

O modelo de camundongo DSS é um modelo bem reconhecido para o estudo da doença inflamatória do intestino, como descrito em Kawada et al. nInsights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease", World J. Gastroenterol., VoL 13 (42), pp. 5581-5593 (2007); e Wirtz and Neurath "Mouse models of inflammatory bowel disease", Advanced Drug Delivery Reviews, VoL 59 (11), 1073-1083 (2007). MATERIAIS Itens de teste

Beta defensina humana 2 (hBD2); ver Exemplo 1 acima tampão PBS de 21-hemisuccinato de metilprednisoiona ("prednisolona") (GIBCO)

Animais experimentais

Camundongos C57BL/6 machos (Harlan Interfauna Ibérica, Barcelona, Spain) foram usados no estudo, como este é uma espécie e sexo que foi demonstrado desenvolver inflamação significante do cólon quando administrado uma solução à 2 % de DSS na água de bebida em um período de dias. Identificação

Os animais foram identificados pelo número e códigos de letras em suas caldas. Adicionalmente, cada gaiola foi identificada por um cartão de código colorido indicando o número e sexo dos animais, o código ou nome do item de teste, nível de dosagem, via de administração, período do tratamento, número do grupo, código de estudo e nome dos diretores de estudo. Peso

O peso corporal médio dos animais no dia do início do estudo foi 22,4 ± 0,16 g Aclimatização (quarentena)

Mínimo de 7 dias antes do início do estudo, sob as mesmas condições como aquelas do estudo principal. Alojamento

Na chegada, os animais foram separados e alojados em aleatório nas gaiolas de policarbonato (E-Type5 Charles River, 255x405xl97mm) com tampas de aço inoxidável.

Os animais foram alojados em grupos de cinco animais por gaiola de acordo com seu sexo, em ambientes de animal em temperatura controlada (22 ± 2o C), iluminação (12/12 horas de luz/escuro), pressão de ar, número de renovações de ar e umidade relativa (30 a 70 %).

As gaiolas todas tem serragem (Lignocel 3-4; Harlan Interfauna Ibérica, Spain) no chão como cama de palha. Alimento e água

Todos os camundongos tem livre acesso a uma dieta de roedor padrão granulada seca (Teklad Global 2014; Harlan Interfauna Ibérica, Spain).

A água foi fornecida ad Hbitum em garrafas. O fornecimento da água de torneira aos ambientes dos animais é periodicamente analisada para checar sua composição e para detectar possíveis contaminantes (química e microbiológico). Equipamento e Materiais Equipamento:

• Balança de animal Sartorius Mod. BP 2100

• Equipamento de dissecação cirúrgica

• Centrífuga Eppendorf 5415C

• Microscópio Nikon Eclipse E600FN

• Rotamisturador Hook & Tucker instruments

• Homogenizador IKA UltraTunax

• Balança analítica Sartorius Mod. BP 22IS

• Leitor de microplaca de ELISA Labsystems Multiskan EX Materiais e reagentes:

• Seringas disponíveis estéreis (1 ml)

• Conjunto de infusão Sterile Butterfly 25G

• Anestésico (Quetamina/xiiazina)

• Creme anestésico tópico (EMLAj Astra Zeneca)

• Sulfato de dextrano sódico 30.000 a 50.000 Da (MP

Biomedicals)

• Solução salina tamponada de fosfato (PBS; Sigma)

• Formalina tamponada neutra (VWR)

• Albumina de soro bovino (Sigma)

• Coquetel inibidor de protease (Sigma)

• Mouse TNF-a ELISA kit (GE Healthcare) PROTOCOLO EXPERIMENTAL

Projeto de estudo

Os animais foram divididos em 5 grupos experimentais. Cada grupo consiste de 10 machos:

Grupo A: Tratado com Veículo de controle (PBS) i.v. Grupo B: Tratado com hBD2 (0,1 mg/kg i.v.) Grupo C: Tratado com hBD2 (1 mg/kg i.v.) Grupo D: Tratado com hBD2 (10 mg/kg i.v.) Grupo E: Tratado com metilprednisolona (1 mg/kg p.o.) A distribuição animal de todos os grupos experimentais foi feita em uma maneira aleatória. Um máximo de 5 camundongos foram alojados em cada gaiola (como pela diretiva 86/609/EEC). Todos os animais foram pesados em sua chegada no laboratório e antes da administração dos itens de teste.

Administração da substância testada

O veículo de controle e hBD2 foram administrados intravenosamente por intermédio da veia da calda com o uso de uma agulha estéril (25G) em um volume de dosagem de 5 ml/kg de peso corporal como um bolo lento. Os animais recebem uma dosagem diária (a cada 24 horas) do item de teste correspondente (hBD2, prednisolona ou veículo de controle) por dias consecutivos.

A prednisolona foi dada oralmente em uma dosagem de 1 mg/kg em um volume de dosagem de 5 ml/kg de peso corporal, no mesmo regime de dosagem como hBD2.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Indução de Colite

A colite foi induzida pelos camundongos pela suplementação de sua água de bebida com DSS 2 % por 7 dias.

No dia 1 todos os camundongos foram pesados e marcados de acordo com seus grupos experimentais. A garrafa de bebida de cada gaiola foi enchida com a solução DS S, certificando-se que todas as tampas da garrafa sejam propriamente montadas e que nenhuma seja congestionada.

No dia 3 qualquer solução remanescente nas garrafas foi esvaziada e enchida novamente com solução DSS fresca. Este procedimento foi repetido novamente no dia 5.

No dia 8 qualquer solução remanescente foi descartada e substituída com água submetida a autoclave. Os animais foram sacrificados 2 dias depois do dia 10.

Avaliação clínica (Índice de atividade da doença)

Avaliação clínica diária de animais tratados por DSS foi realizada, com o cálculo de um índice de atividade da doença clínico validado (DAI) que varia de O a 4 de acordo com os seguintes parâmetros: consistência das fezes, presença ou ausência e hemorragia retal e perda de peso: Mudança no peso corporal: <1 % 0 1 a 5 % 1 5 a 10 % 2 10 a 15% 3 >15% 4 Hemorragia retal: Negativo 0 Positivo 4 Consistência das fezes: Normal 0 Fezes moles 2 Diarréia 4

A perda do peso corporal foi calculada como o percentual da

diferença entre o peso corporal original (Dia 1) e o peso corporal atual em cada dia experimental (2-10).

A aparência da diarréia é definida como material muco/fecal aderente à pele anal. Hemorragia retal é definida como diarréia contendo sangue visível/muco ou hemorragia retal grossa. A contagem máxima de DAI cada dia é 12.

Amostragem de sangue

Duas amostras sangüíneas foram obtidas de cada animal em duas ocasiões separadas durante o curso do estudo: no dia 1 e no dia 5. Amostras sangüíneas foram obtidas em cada ocasião em microtubos Microvette CB-300 pela punctura da veia safena 2 horas após a administração do item de teste. Este método de extração de sangue não requer anestésico ou analgésicos e produz uma tensão mínima nos animais (Hem et al., 1998). Adicionalmente uma amostra sangüínea terminal foi de todos os animais no último dia do estudo a partir da veia cava abdominal também duas horas após a administração do item de teste.

As amostras sangüíneas foram deixadas coagular e então foram centrifugadas a 3000 rpm por 10 minutos e o soro resultante congelado a -80° C por armazenagem.

Eutanásia e coleta das amostras de cólon

No dia 10, duas horas após a última administração de veículo de controle, hBD2 ou prednisolona, os animais foram mortos por uma overdose de anestésico. Seus cólons foram removidos e seu comprimento e peso medidos após exclusão do ceco.

Duas seções (proximal e distai) do cólon foram retirados de cada animal e preservadas em formalina tamponada neutra para à análise histológica subsequente (tingimento de hematoxillina e eosina) de acordo com o seguinte sistema de contagem:

Descrição__Contagem

Nenhuma mudança observada 0

Infiltrados de célula inflamatória mucosal dispersada mínima, com ou sem 1 hiperplasia epitelial mínima.

Dispersado brando para difundir os infiltrados da célula inflamatória, algumas 2 vezes que estende-se na submucosa e associados com desgastes, com hiperplasia epitelial mínima a branda e depleção de mucina mínima a brando a partir das células cálice.

Infiltrados da célula inflamatória brando a moderado que foram algumas 3 vezes transmurais, freqüentemente associados com ulceração, com hiperplasia epitelial moderada e depleção de mucina.

Infiltrados da célula inflamatória marcados que foram freqüentemente 4 transmurais e associados com ulceração, com hiperplasia epitelial marcada e depleção de mucina.

Inflamação transmural marcada com diversa ulceração e perda de glândulas 5 intestinais._______

Determinação da concentração TNF-alfa nas amostras de tecidos colônicos

Uma amostra adicional do cólon foi obtida de cada animal e homogeneizada em PBS (100 mg de tecido/ml PBS) contendo 1 % de albumina de soro bovino (BSA) e um coquetel inibidor de protease (1 ml/20g de tecido). O homogenado foi então centrifugado a 1400 rpm por 10 minutos e o tensoativo foi armazenado a -20° C pela determinação subsequente da concentração TNF-a pelo imunoensaio de enzima específica (ELISA). RESULTADOS

índice de contagem da atividade da doença Tabela 1. índice de progressão de contagem da atividade da doença (DAI) durante dia 1 a Dia 10. As diferenças significantes a partir dos valores do grupo de controle (veículo) nos dados dado são mostradas como *ρ<0,05; **ρ<0,01 (Teste Kruskal-Wallis para os dados não paramétricos).

Item de teste Dados Contagem DAI Dial Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Grupo AVeiculo de controle i.v. Média S.E.M. 0,00 0,00 1,10 0,31 1,30 0,37 3,20 0,36 2,90 0,31 Grupo BhBD20,l mg/kg i.v. Média S.E.M. 0,00 0,00 0,20 0,13 0,80 0,20 2,90 0,10 2,80 0,13 Grupo ChBD21 mg/kg i.v. Média S.E.M. 0,00 0,00 0,00 0,00 0,22 0,22 2,22 0,15 2,44 0,18 Grupo DhBD210 mg/kg i.v. Média S.E.M. 0,00 0,00 0,60 0,22 1,00 0,44 3,67 0,24 3,11 0,26 Grupo EPrednisolonal mg/kg p.o. Média S.E.M. 0,00 0,00 0,10 0,10 0,00 0,00 2,60 0,22 2,50 0,22 Tabela 1 (continua). Item de teste Dados Contagem DAI Dia 6 Dia 7 Dia 8 Dia 9 DialO Grupo A Veículo de controle i.v. Média S.E.M. 3,10 0,31 4,10 0,69 5,90 1,26 8,90 1,02 10,90 0,62 Grupo B hBD20,l mg/kg i.v. Média S.E.M. 3,20 0,20 1,44** 0,38 2,11* 0,20 3,89** 0,35 6,44* 0,85 Grupo C hBD21 mg/kg i.v. Média S.E.M. 2,89 0,20 2,22 0,43 3,67 0,80 5,22 0,83 6,44* 1,08 Grupo D hBD210 mg/kg i.v. Média S.E.M. 3,22 0,28 2,11 0,31 4,11 0,93 6,78 1,20 7,33 1,33 Grupo E Prednisolonal mg/kg p.o. Média S.E.M. 2,60 0,27 3,10 0,96 2,50* 0,43 3,80* 0,98 4,90** 0,91

Avaliação histológica

Duas seções (proximal e distai) do cólon foram retirados de cada animal, processadas para à análise histológica (tingimento de hematoxillina e eosina) e armazenadas por um observador cego de acordo com o sistema de contagem histológica descrita acima.

Determinação da concentração TNF-a nas amostras de tecidos

colônicos

Uma amostra adicional do cólon foi obtida de cada animal e

homogeneizada em PBS (100 mg de tecido/ml PBS) contendo 1 % de albumina de soro bovino (BSA) e um coquetel inibidor de protease (1 ml/20g de tecido). O homogenado foi então centrifugado a 14000 rpm por 10 minutos e o tensoativo foi armazenado a -20° C pela determinação subsequente da concentração de TNF-α pelo imunoensaio de enzima específica (ELISA).

Tabela 3. Contagens histológicas, peso do cólon e comprimento e concentração TNF-a de cólon. Diferenças nas contagens histológicas a partir dos valores do grupo de controle (veículo) são mostradas como *p<0,05; **p<0,01 (Teste Kruskal-Wallis para os dados não

Daramétricos).

Item de teste Dados Contagem de histologiaCólon proximal Contagem de histologiaCólon distai Concentração de cólon TNF- a(pg/g de tecido) Grupo AVeiculo de controle i.v. Média S.E.M. 4,20 0,25 4,50 0,22 1664 227 Grupo BhBD20,l mg/kg i.v. Média S.E.M. 2,22** 0,43 3,67 0,47 1185 205 Grupo ChBD21 mg/kg i.v. Média S.E.M. 2,89* 0,35 4,13 0,35 1457 211 Grupo DhBD210 mg/kg i.v. Média S.E.M. 2,89* 0,39 4,78 0,15 1212 211 Grupo Média 2,80* 3,70 1833 EPrednisolonal mg/kg p.o. S.E.M. 0,51 0,42 414

ANÁLISE ESTATÍSTICA

A significância estatística dos resultados foi avaliada usando o programa estatístico Graphpad Instat 3. A diferença entre os grupos para o índice de atividade da doença e contagem histológica foi avaliada pelo teste Kruskal-Wallis para os dados não em par ou pós-teste Dunn permitindo pelas comparações múltiplas. Um valor de p<0,05 foi tomado como significante.

CONCLUSÕES

Os resultados demonstram que hBD2 na dosagem menor testada (0,1 mg/kg i.v.) significantemente reduz o aumento no índice de atividade da doença induzida pela administração DSS no dia 7 (1,44 ± 0,38 item de teste vs. 4,1 ± 0,69 veículo; p<0,01), dia 8 (2,11 ± 0,2 item de teste vs. 5,9 ± 1,26 veículo; p<0,05), dia 9 (3,89 ± 0,35 item de teste vs. 8,9 ± 1,02 veículo; p<0,01) e dia 10 (6,44 ± 0,85 item de teste vs. 10,9 ± 0,62 veículo;

p<0,05). O tratamento com a dosagem intermediária de hBD2 (1 mg/kg i.v.) por 10 dias consecutivos resultou em uma redução aparente da contagem do índice de atividade da doença mas este foi apenas significante no dia 10 (6,44 ± 1,08 item de teste vs. 10,9 ± 0,62 veículo; p<0,05).

Similarmente os resultados obtidos com o índice de atividade da doença no dia 10, análise histológica dos cólons proximais de cada animal revelou uma redução muito significante da contagem do dano histológico pelo tratamento com a dosagem inferior de hBD2 (2,22 ± 0,43 item de teste vs. 4,2 ± 0,25 veículo; p<0,01). Além disso, um dano histológico da redução significante também foi observado com o intermediário e as dosagens altas de hBD2, bem como com prednisolona (2,89 ± 0,35; 2,89 ± 0,39 e 2,8 ± 0,5 respectivamente; p<0,05). Em contraste, no cólon distai - embora uma redução aparente no dano histológico deve ser observado nos animais tratado com a dosagem intermediária e baixa de hBD2, bem como com prednisolona - este não foi estatisticamente significante. Nenhuma redução deve ser observado nos animais que foram tratados com a alta dosagem de hBD2. Similarmente, tratamento com a dosagem intermediária e baixa de hBD2 resultou em uma redução aparente nos níveis TNF-alfa colônicos, mas esta redução aparente não foi estatisticamente significante.

Os resultados obtidos no presente estudo demonstram uma atividade anti-inflamatória de hBD2 no modelo de DSS colite induzida no camundongo após um período de tratamento de 10 dias. Entretanto, esta atividade anti-inflamatória parece ser mais pronunciada na dosagem inferior de hBD2 usado (0,1 mg/kg/dia i.v.) e é gradualmente perdida com o aumento das dosagens até a dosagem mais alta usada neste estudo (10 mg/kg/dia i.v.). Além disso, o efeito anti-inflamatório da dosagem inferior de hBD2 é comparável ou ainda maior (por exemplo contagem histológica) do que aquela de prednisolona em uma dosagem de 1 mg/kg/dia p.o. EXEMPLO 3 Modelo de colite induzida por sulfato de dextrano sódico (DSS) de 10 dias no camundongo

O exemplo 3 foi essencialmente realizado como descrito no Exemplo 2. As diferenças são indicadas abaixo. Peso

O peso corporal médio dos animais no dia do início do estudo foi 19,74 ± 0,09 g (média ± SEM).

Projeto de estudo

Os animais foram divididos em 9 grupos experimentais. Cada grupo consiste de 10 machos:

Grupo A: Tratado com veículo de controle (PBS) i.v. Grupo B: Tratado com hBD2 (1 mg/kg i.v.) - uma vez

diariamente

Grupo C: Tratado com hBD2 (0,1 mg/kg i.v.) - uma vez

diariamente

Grupo D: Tratado com hBD2 (0,01 mg/kg i.v.) - uma vez

diariamente

Grupo E: Tratado com hBD2 (0,001 mg/kg i.v.) - uma vez

diariamente

Grupo F: Tratado com hBD2 (0,1 mg/kg i.v. + s.c.) - duas

vezes diariamente

Grupo G: Tratado com hBD2 (0,1 mg/kg i.v.) - a cada segundo

dia

Grupo H: Tratado com metilprednisolona (1 mg/kg p.o.) Grupo J: Tratado com metilprednisolona (10 mg/kg p.o.)

A distribuição animal de todos os grupos experimentais foi feita em uma maneira aleatória. Um máximo de 5 camundongos foram alojados em cada gaiola (como pela diretiva 86/609/EEC). Todos os animais foram pesados em sua chegada no laboratório e antes da administração dos compostos de referência e testados.

Administração dos itens de teste

O veículo de controle e hBD2 foram administrados intravenosamente por intermédio da veia da calda com o uso de uma agulha estéril (25G) em um volume de dosagem de 5 ml/kg de peso corporal como um bolo lento (em um período de 15 segundos).

Os animais nos grupos AaE receberam uma dosagem diária (a cada 24 horas) do item de teste correspondente (hBD2} prednisolona ou veículo de controle) por 10 dias consecutivos.

Os animais no grupo F receberam uma dosagem i.v. e outra dosagem s.c. (12 horas após a dosagem i.v.) do item de teste correspondente por 10 dias consecutivos.

Os animais no grupo G receberam uma dosagem a cada dois dias do item de teste correspondente por 10 dias consecutivos.

A metilprednisolona foi dada oralmente em uma dosagem de 1 mg/kg (grupo H) e 10 mg/kg (grupo J) em um volume de dosagem de 5 ml/kg de peso corporal, uma vez diariamente por 10 dias consecutivos.

Amostragem de sangue

Uma amostra sangüínea terminal foi de todos os animais no último dia do estudo a partir da veia cava abdominal 2 horas após a administração do item de teste.

As amostras sangüíneas foram deixadas coagular e então foram centrifugadas a 3000 rpm por 10 minutos e o soro resultante foi congelado a -80° C pela análise subsequente.

RESULTADOS

índice de contagem da atividade da doença

Tabela 4. índice de progressão de contagem da atividade da doença (DAI) durante dia 1 a Dia 10. As diferenças significantes a partir dos valores do grupo de controle (veículo) nos dados dado são mostradas como *ρ<0,05; **ρ<0,01 (Teste Kruskal-Wallis para os dados não paramétricos).

Dia 6 a Dia 10 é mostrado na próxima página.

Item de teste Dados Contagem DAI Dial Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Grupo AVeiculo Média 0,00 0,00 0,10 0,10 0,20 de controle i.v. S.E.M., 0,00 0,00 0,10 0,10 0,13 Grupo BhBD21 Média 0,00 0,10 0,20 0,40 0,30 mg/kg i.v. S.E.M., 0,00 0,10 0,13 0,16 0,21 Grupo ChBD20,l Média 0,00 0,44 0,89 0,56 0,78 mg/kg i.v. S.E.M., 0,00 0,18 0,42 0,29 0,28 Grupo Média 0,00 0,00 0,30 0,40 1,60 DhBD20,01 mg/kg i.v. S.E.M., 0,00 0,00 0,15 0,16 0,43 Grupo Média 0,00 0,00 0,10 0,20 0,40 EhBD20,001 mg/kg i.v. S.E.M., 0,00 0,00 0,10 0,13 0,16 Grupo FhBD20,l Média 0,00 0,30 0,70 0,70 0,60 mg/kg duas vezes diariamente S.E.M., 0,00 0,21 0,30 0,34 0,16 i.v.+s.c. Grupo GhBD20,l Média 0,00 0,20 0,40 0,50 0,50 mg/kg i.v.a cada 2 dias S.E.M., 0,00 0,13 0,22 0,17 0,17 Grupo Média 0,00 0,50 0,50 0,40 1,10 HPrednisolonal mg/kg p.o. S.E.M., 0,00 0,17 0,17 0,16 0,18 Grupo Média 0,00 0,30 0,70 0,80 1,30 JPrednisolonalO mg/kg p.o. S.E.M., 0,00 0,15 0,21 0,20 0,21

Item de teste Dados Contagem DAI Dia 6 Dia 7 Dia 8 Dia 9 DialO Grupo AVeiculo de controle i.v. Média S.E.M., 6,90 1,02 9,67 0,33 11,11 0,31 11,67 0,17 11,00 0,65 Grupo BhBD21 mg/kg i.v. Média S.E.M., 2,30* 1,00 4,40* 1,03 6,89 1,41 5,00* 0,60 5,78* 0,70 Grupo ChBD20,l mg/kg i.v. Média S.E.M., 1,56** 0,73 4,13* 0,83 5,43* 1,13 6,29* 1,64 6,86 1,14 Grupo DhBD20,01 mg/kg i.v. Média S.E.M., 2,70 1,08 6,50 1,28 6,20* 1,06 4,60*** 0,98 5,20** 0,87 Grupo EhBD20,001 mg/kg i.v. Média S.E.M., 3,40 1,32 7,11 1,38 8,56 1,06 5,89** 1,63 6,67 1,30 Grupo FhBD20,l mg/kgduas vezes diariamente i.v.+s.c. Média S.E.M., 0,70*** 0,30 3,50** 0,89 4,00*** 1,17 2,90*** 0,55 4,50*** 0,62 Grupo GhBD20,l Média 2,90 6,50 8,70 7,50 6,56 mg/kg i.v.a cada 2 dias S.E.M., 1,12 1,11 1,25 0,93 0,99 Grupo Média 3,80 5,90 6,40 5,60* 5,60* HPrednisolonal mg/kg p.o. S.E.M., 0,98 1,16 0,88 0,88 0,65 Grupo Média 2,00 3,20** 4,80** 5,20* 4,00*** JPrednisolonal O mg/kg p.o. S.E.M., 0,30 0,73 0,53 0,61 0,00

Avaliação histológica

Duas seções (proximal e distai) do cólon foram retirados de cada animal, processadas para à análise histológica (tingimento de hematoxillina e eosina) e armazenadas por um observador cego de acordo com o sistema de contagem descrito acima.

Tabela 5. Contagens histológicas, peso do cólon e comprimento e concentração TNF-a de cólon. Diferenças nas contagens histológicas a partir dos valores do grupo de controle (veículo) são mostradas como *p<0,05; **p<0,01 (Teste Kruskal-Wallis para os dados não

paramétricos).

Item de teste Dados Contagem de histologiaCólon proximal Contagem de histologiaCólon distai Grupo AVeiculo de controle i.v. Média S.E.M. 2,44 0,34 4,67 0,17 Grupo BhBD21 mg/kg i.v. Média S.E.M. 1,78 0,36 3,56 0,38 Grupo ChBD20,l mg/kg i.v. Média S.E.M. 1,71 0,18 3,14* 0,40 Grupo DhBD20,01 mg/kg i.v. Média S.E.M. 1,70 0,26 3,10** 0,23 Grupo EhBD20,001 mg/kg i.v. Média S.E.M. 1,44 0,24 3,56 0,18 Grupo FhBD20,l mg/kgduas vezes diariamente i.v.+s.c. Média S.E.M. 1,30* 0,21 2,90*** 0,23 Grupo GhBD20,l mg/kg i.v.a cada 2 dias Média S.E.M. 1,56 0,24 3,56 0,29 Grupo HPrednisolonal mg/kg p.o. Média S.E.M., 1,40 0,22 3,00*** 0,00 Grupo JPrednisolonalO mg/kg p.o. Média S.E.M., 1,40 0,16 2,70*** 0,21

ANÁLISE ESTATÍSTICA

A significância estatística dos resultados foi avaliada usando o

programa estatístico Graphpad Instat 3. A diferença entre os grupos para o índice de atividade da doença e contagem histológica foi avaliada pelo teste Kruskal-Wallis pelos dados não em par + pós-teste de Dunn para comparações múltiplas. Um valor de p<0,05 foi tomado como significante. Nas tabelas acima, diferenças significantes versus o grupo de controle (veículo) correspondente são indicados como: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. CONCLUSÕES

O propósito do presente estudo foi para determinar a atividade anti-inflamatória de hBD2 em um modelo agudo (10 dias) da doença intestinal inflamatória (colite) induzida pela administração de sulfato de dextrano sódico oral (DSS5 2 %) no camundongo. Os resultados obtidos no presente estudo ainda demonstra uma

atividade anti-inflamatória de hBD2 no modelo de DSS colite induzida no camundongo após um período de tratamento de 10 dias.

Esta atividade anti-inflamatória parece ser mais pronunciada após a administração de hBD2 duas vezes per dia (a cada 12 horas), tanto intravenosamente quanto subcutaneamente, em uma dosagem de 0,1 mg/kg. Além disso, o efeito anti-inflamatório observado com esta dosagem de hBD2 é comparável, ou ainda maior (ambos no índice de atividade da doença e contagem histológica), do que aquela de prednisolona em uma dosagem de 1 mg/kg ou 10 mg/kg dada oralmente. EXEMPLO 4

Atividade anti-inflamatória de beta defensina humana 2 (hBD2) Nas culturas PBMC humanas foi observado que tratamento com hBD2 tem grande influência no perfil de citocina de LPSj LTA ou culturas estimuladas por peptidoglicano. Foi previamente observado que hBD2 é capaz de induzir as citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas IL-6, IL-Iβ, RANTES, IP-IO e IL-8 (Niyonsaba et ai. 2007, Boniotto M. et ai. 2006).

Aqui, mostramos que hBD2 tem potencial de sub-regulação em TNF e IL-I β, duas citocinas pró-inflamatórias; e hBD2 também induz IL- na indução de um estímulo anti-inflamatório com lipopolissacarídeo (LPS), ácido lipoteicóico (LTA) ou peptidoglicano (PGN). IL-10 é uma citocina anti-inflamatória potencial e visto que o efeito resultante de hBD2 é anti-inflamatório. Este foi observado pelo PBMC humano, uma linha celular monocítica e uma linha celular dendritóide.

O hBD2 foi preparado como descrito em Exemplo 1. Isolamento e estímulo de PBMC.

O sangue periférico foi tirado dos voluntários saudáveis (com aprovação do comitê ético relevante em Denmark). O sangue heparinizado foi diluído 1/1 v/v com RPMI e foram submetidos a centrifugação de densidade dentro de 2 horas de retirada. O plasma foi coletado a partir da parte superior a partir dos doadores individuais e foi mantido em gelo até ser usado em 2 % no meio de cultura (meio de cultura autóloga). PBMC isolado foi recolocado em suspensão em meio de cultura autóloga e semeado nas placas de cultura de 96 reservatórios com 255.000 células por reservatório em um total de 200 μΐ. PBMC do mesmo doador foi estimulado com 100, 10 ou 1 μg/ml de hBD2 sozinho ou junto com LPS a 0,6 ng/ml ou 20 ng/ml (E. coli, Ol 11 :B4, Sigma L4391), Ácido lipoteicóico (LTA) a 1,25 pg/ml (de B. subtilis, Sigma L3265) ou peptidoglicano (PGN) a 40 pg/ml (de S. aureus, Sigma 77140). As concentrações usadas para o estímulo foram otimizadas em 3 doadores diferentes em experimentos iniciais, por duas concentrações diferentes LPS foram usadas a garantir a ser em um nível de citocina que é possível modular. Em alguns experimentos PBMC foram tratados com Dexametasona e indometacina sozinha ou junto com LPS ou LTA como um controle na sub- regulação das citocinas inflamatórias. Os tensoativos foram coletados após incubação a 37° C por 24 horas e armazenados a -80° C até a medição de citocina. A viabilidade foi medida por Alamar Blue (Biosource, DALL 1100) em todos os experimentos e em alguns casos também por MTS (Promega) de acordo com as instruções do fabricante e foi em alguns experimentos também julgado pela contagem das células por um Nucleocounter. Cultura e estímulo de MUTZ-3

A linha celular derivada de leucemia mielóide humana MUTZ- 3 (DSMZ, Braunschweig, Germany) foi mantida em um-MEM (Sigma M4526), suplementada com soro bovino fetal à 20 % [volume/volume (v/v)] (Sigma F6178) e 40 ng/ml de rhGM-CSF (R&D Systems 215-GM-050). Estas células progenitoras estão na seguinte linha celular de monócito denominada e estes monócitos foram estimulados com 100, 10 ou 1 μg/ml de hBD2 sozinho ou junto com LPS ou LTA. Diferenciação da célula dendrítica

Para gerar uma linha celular dendritóide, as linhas celulares de leucemia mielóide MUTZ-3 (1 χ IO5 células/ml) foi diferenciada por 7 dias na presença de rhGM-CSF (150 ng/ml) e MIL-4 (50 ng/ml) em DCs imaturos. O meio foi trocado a cada 2 a 3 dias. A linha celular diferenciada ainda foi estimulada com LPS ou LTA com ou sem hBD2 para explorar o efeito de hBD2 nas células dendríticas. Medições de citocina.

A produção de citocina nos tensoativos foi medida pela citometria de fluxo com um ensaio de pérola citométrico de inflamação humana (CBA) de acordo com as instruções do fabricante (BD) em uma citometria de fluxo FACSarray. As seguintes citocinas foram medidas: IL-8, IL-I β, IL-10, TNF, IL-12 ρ70, IL-6. Em alguns experimentos, as citocinas foram medidas pelos kits ELISA de sistemas R&D (IL-10, TNF-a, IL-I[3) de acordo com as instruções do fabricante. Análise de dados

Todos os experimentos foram realizados pelo menos duas

vezes, com os resultados representativos mostrados. Os dados apresentados são expressados como meio de desvio padrão menor/maior (SD). A importância estatística foi determinada por ANOVA de 2 vias com as variáveis sendo o tratamento (hBD2, dexametasona, etc.) e estímulo (LPS, LTA, peptidoglicano, etc.) seguido pelo pós-teste Bonferroni como relacionado nas legendas da tabela. As diferenças foram consideradas significantes por ρ < 0,05. RESULTADOS

O efeito de hBD2 foi testado em PBMC humano tratado com ou sem LPS e LTA (Tabelas 6, 7 and 8). Tratamento com hBD2 dá uma sub- regulação significante de TNF nas culturas estimuladas para todas as três concentrações testadas (Tabela 6), a sub-regulação é dependente da dosagem por LPS a 0,6 ng/ml e por LTA. Para IL-I β a sub-regulação foi observada mais nas dosagens maiores (Tabela 7). De maneira interessante, IL-IO foi significantemente e sub-regulado dependentemente da dosagem (Tabela 8). Sub-regulação das citocinas pró-inflamatórias e indução das citocinas anti- inflamatórias mostram um potencial anti-inflamatório muito forte de hBD2. A viabilidade foi medida por dois ensaios diferentes, a fim de excluir que os efeitos anti-inflamatórios de hBD2 é devido aos efeitos citotóxicos. Nas tabelas 9 and 10 pode ser visto que hBD2 não tem efeito citotóxico nas células, os efeitos observados são efeitos estimuladores devido a estimulação com LPS ou LTA que leva à proliferação das células. Portanto hBD2 não tem efeito citotóxico nestas células.

Nas tabelas 11, 12 e 13, tensoativos de outros doadores foram analisados pelas citocinas por ELISA em vez de um ensaio de pérola citométrico pela citometria de fluxo e visto que os mesmos foram observados, embora a sensibilidade do ensaio é menos e o limite de detecção muito maior e portanto os efeitos não foram como significantes.

A fim de já testar outro ligando receptor semelhante a Tolls o efeito de hBD2 no PBMC estimulado por peptidoglicano foi investigado (Tabelas 14 e 15). O mesmo foi observado: TNF é sub-regulado dependentemente da dosagem e IL-IO é induzido dependentemente da dosagem.

Como um controle positivo na sub-regulação das TNF, dois compostos anti-inflamatórios, dexametasona e indometacina, foram testados no ensaio. As concentrações são selecionadas de modo que os compostos não são tóxicos e concentração atingível devido à solubilidade no meio. Indometacina apenas inibiu TNF (Tabela 16) após estímulo com LTA, considerando a produção TNF efetivamente sub-regulada por dexametasona, o mesmo foi observado por IL-I β (Tabela 18). Indometacina é um inibidor COX-I e COX-2 e é um medicamento anti-inflamatório não esteroidal (NSAID) usado para tratar dor moderada ou branda e ajudar a aliviar os sintomas de artrite e dexametasona é um glucocorticóide principalmente usado no tratamento de distúrbios anti-inflamatórios e tem efeito de sub- regulação mais potente em citocinas pró-inflamatórias (Rowland et al. 1998) em dosagens mais baixas, que também observamos por TNF-a e IL-I β. O hBD2 é tão efetivo quanto ou melhor do que estes dois compostos anti- inflamatórios.

Nas tabelas 19 e 20, o efeito de hBD2 no TNF de sub- regulação em uma linha celular de monócito e nas células dendríticas são mostradas, o mesmo é observado como foi por PBMC. IL-IO também foi induzido pelas células dendríticas estimuladas com hBD2 e LPS ou hBD2 e LTA (resultados não mostrados). A fim de excluir que a ligação de hBD2 a LPS ou LTA causam a sub-regulação das HMF e IL-I β, o efeito de hBD2 no estímulo de PBMC com um ligando sintético (Pam3CSK4 (ligando TLR2-TLR1), InvivoGen tlrt- pms) foi testado. hBD2 foi capaz de sub-regular TNF após estímulo com este ligando também, indicando que a neutralização de LPS ou LTA não é responsável pelo efeito observado (resultados não mostrados). Além disso, estímulo das células dendríticas com um coquetel de citocina contendo TNF-a e IL-a junto com hBD2 tem efeito de sub-regulação em IL-Iβ e IL-8 e IL-6 comparado ao estímulo com um coquetel de citocina sozinho. Obviamente em efeito em TNF deve ser analisado, devido a estimulação com TNF-a (resultados não mostrados).

Tabela 6. Produção TNF a partir das células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) após tratamento com LPS ou LTA com ou sem hBD2, todas as amostras testadas no mesmo doador, experimento representativo de 5 doadores. TNF medido pelo ensaio de pérola citométrica (CBA) em um FACSarray5 *** p<0,001 comparado ao controle respectivo (negrito), analisado por ANOVA de 2 vias (N= app. 200 para cada série de dados). _

TNF5 pg/ml(SD) Controle hBD2 100 μ&'ηιΐ hBD210 μ^ιηΐ hBD21 μ^ιπί Meio 7,3 (5,9) 2,9 (5,1) 2,6 (6,6) 4,2 (10,7) LPS0,6 ng/ml 1708,6 (428,3) 634,2 (226,1)*** 1076,4 (278,0)*** 944,8 (326,6)*** LPS20 ng/ml 2572,1 (581,1) 1733,9 (461,3)*** 1306,6 (375,0)*** 1526,9 (444,2)*** LTAl ,25 Jig/ml 1097,4 (293,8) 375,2 (114,2)*** 494,7 (158,1)*** 711,5 (282,5)***

Tabela 7. Produção IL-I β das células mononucleares do

sangue periférico humano (PBMC) após tratamento com LPS ou LTA com ou sem hBD2, todas as amostras testadas no mesmo doador, experimento representativo de 5 doadores. IL-I β medido pelo ensaio de pérola citométrica (CBA) em um FACSarray, *** p<0,001 analisado por ANOVA de 2 vias (N= app. 200 para cada série de dados).

IL-I β, pg/ml (SD) Controle hBD2100 μ^ιηΐ hBD210 μζ/ml hBD21 μ^πιΐ Meio 4,2 (4,7) 5,3 (7,1) 3,8 (5,8) 4,1 (51,0) LPS 0,6 ng/ml 1734,3 (347,0) 811,0 (454,4)*** 1949,8 (396,4)*** 1436,2 (429,7)*** LPS 20 ng/ml 2629,5 (533,7) 1502,1 (407,5)*** 2273,9 (486,5)*** 1889,3 (504,8)*** LTA 1,25 Hg/ml 748,5 (172,4) 538,3 (137,3)*** 935,3 (238,0)*** 986,7 (738,7)***

Tabela 8. Produção IL-IO a partir das células mononucleares

do sangue periférico humano (PBMC) após tratamento com LPS ou LTA com ou sem hBD2, todas as amostras testadas no mesmo doador, experimento representativo de 5 doadores. IL-IO medido pelo ensaio de pérola citométrica (CBA) em um FACSarray, *** p<0,001, ** p<0,01, * p<0,5 analisado por

ANOVA de 2 vias (N= app. 200 para cada dado apresentado).

IL-10, pg/ml (SD) Controle hBD2 100 fJg/ml hBD2 ΙΟμ^πιΙ hBD2 1 μ^πιΐ Meio 2,09 (8,65) 2,9 (4,6) 1,6 (4,1) 2,09 (4,3) LPS 0,6 ng/ml 63,15 (302,5) 232,7 (61,5)*** 325,7 (88,2)*** 97,2 (31,1)* LPS 20 ng/ml 70,4 (22,8) 383,3 (133,6)*** 355,8 (99,5)*** 111,3 (38,8)** LTA 1,25 lig/ml 14,0 (226,1) 175,6 (57,0)*** 136,6 (44,7)*** 39,9 (16,9)

Tabela 9. Viabilidade PBMC após 24 horas de estímulo

medido por um ensaio MTS. Os valores tendo uma letra subscrita diferente nas linhas são significantemente testadas diferentes por ANOVA de 2 vias

seguido pelo pós-teste Bonferroni.

Viabilidade, MTS (Abs 490 nm (SD)) Controle hBD2 100 μ^πϋ hBD2 10 μ^πιΐ hBD2 1 μ^ιηΐ Meio 1,4 (0,2) 1,2 (0,05)a 1,5 (0,2 )a 1,3 (0,2) LPS 0,6 ng/ml 1,6 (0,02) 1,6 (0,l)ab 2,0 (0,2)b 1,5 (0,2) LPS 20 ng/ml 1,5 (0,1) 1,9 (0,2)b 1,8 (0,3 )ab 1,6 (0,3)

Tabela 10. Viabilidade PBMC medido por Alamar Blue, um experimento representativo de 5 de 5 doadores diferentes. Os valores tendo uma letra subscrita diferente nas linhas e os valores tendo número subscrito diferente nas colunas são significantemente diferentes testadas por ANOVA de 2 vias seguido pelo pós-teste Bonferroni.

5

Viabilidade, Alamar Blue Controle hBD2 100 (J-g/ml hBD2 10 μg/ml hBD2 1 μg/mI (RFU (SD)) Meio 4097130 3950053 3683369 4064143 (166631) (34466)a (355296)a (104634) LPS 0,6 ng/ml 4279424 4831188 4664362 4230588 (336188) (67646)b (147776)b (139745) LPS 20 ng/ml 4604671 4765256 4623818 4561739 (125840) (41383)b (56643)b (138852) LTA 1,25 4018914 4664185 4677870 4148294 μφύ (632833)1 (154023)b*2 (10199)b·2 (182730)12

Tabela 11. Secreção TNF-alfa de PBMC após estímulo com hBD2, LTA, LPS ou combinações destas. TNF-alfa medido por ELISA, nd: não detectável, limite de detecção no ensaio 0,01 ng/ml, * p< 0,05 comparado ao controle respectivo, ** p< 0,01 comparado ao controle respectivo.

TNF-α, ng/ml (SD) Controle hBD2 100 Hg/ml hBD2 10 μg/ml hBD2 1 μg/ml Meio nd nd nd nd LPS 0,6 ng/ml 0,99 (0,27) 0,41 (0,03)** 0,59 (0,08)* 0,70 (0,18) LPS 20 ng/ml 1,44 (0,31) 0,53 (0,01)** 0,49 (0,05)** 1,18 (0,42) LTA 1,25 0,90 0,21 0,27 0,65 f^g/ml (0,32) (0,05)* (0,04)* (0,29)

Tabela 12. Secreção IL-IO de PBMC após estímulo com

hBD2, LTA, LPS ou combinações destas, TNF-alfa medido por ELISA, nd: não detectável, limite de detecção no ensaio 0,03 ng/ml.

IL-10, ng/ml (SD) Controle hBD2 100 [ig/m\ hBD2 10 μg/ml hBD2 1 μg/ml Meio nd nd nd nd LPS 0,6 ng/ml nd 0,14 (0,04) 0,04 (0,0) nd LPS 20 ng/ml nd 0,46 (0,04) 0,34 (0,04) nd LTA 1,25 ^g/ml nd nd nd nd Tabela 13. Secreção IL-Iβ de PBMC após estímulo com

hBD2, LTA, LPS ou combinações destas, TNF-alfa medido por ELISA, nd: não detectável, limite de detecção no ensaio 0,016 ng/ml, ** p< 0,01 comparado ao controle respectivo.

IL-I β, ng/ml (SD) Controle hBD2 100 l^g/ml hBD2 10 μ^πιΐ hBD2 1 μ^ιηΐ Meio nd nd nd nd LPS 0,6 ng/ml 0,318 (0,087) 0,275 (0,015) 0,268 (0,039) 0,237 (0,007) LPS 20 ng/ml 0,920 (0,267) 0,395 (0,033)** 0,354 (0,013)** 0,638 (0,159) LTA 1,25 0,291 0,281 0,193 0,224 μ^πι! (0,092) (0,059) (0,019) (0,030)

Tabela 14. Produção TNF a partir das células mononucleares

do sangue periférico humano (PBMC) após tratamento com PGN, com ou sem hBD2; todas as amostras testadas no mesmo doador. TNF medido pelo ensaio de pérola citométrica (CBA) em um FACSarray, *** p<0,001 comparado ao controle respectivo, analisado por ANOVA de 2 vias (N= app.

200 para cada série de dados). ___________

TNF, pg/ml(SD) Controle hBD2 100 μβ/ιηΐ hBD2 10 μ^ιηΐ hBD2 1 μg/ml Meio 0,0 (4,0) 3,6 (5,3) 3,7 (6,2) 3,4 (5,2) PGN 40 μ^ιηΐ 1099,1 (251,6) 274,9 (71,6)*** 362,0 (97,7)*** 809,9 (246,7)***

Tabela 15. Produção IL-10 a partir das células mononucleares

do sangue periférico humano (PBMC) após tratamento com PGN5 com ou sem hBD2; todas as amostras testadas no mesmo doador. TNF medido pelo ensaio de pérola citométrica (CBA) em um FACSarray, *** p<0,001 comparado ao controle respectivo, analisado por ANOVA de 2 vias (N= app. 200 para cada série de dados).

IL-10, pg/ml(SD) Controle hBD2 100 μgZml hBD2 10 μgZml hBD2 1 μζ/ml Meio 0,0 (4,1) 3,0 (9,6) 3,6 (13,1) 3,0 (4,8) PGN 40 μ%/ηύ 381,3 (92,3) 1054,2 (179,3)*** 523,4 (111,5)*** 337,8 (89,1)

Tabela 16. Produção TNF a partir das células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) após tratamento com LPS ou LTA, com ou sem hBD2 ou dois controles diferentes para a inibição de TNF (Dexametasona e indometacina); todas as amostras testadas no mesmo doador. TNF medido pelo ensaio de pérola citométrica (CBA) em um FACSarray, os valores sublinhados são signifícantemente reduzidos comparados aos controles respectivos (negrito), analisados por ANOVA de 2

vias (N= app. 200 para cada série de dados).

TNF, ng/ml (SD) Meio LPS 0,6 ng/ml LPS 20 ng/ml LT A 1,25 μg/ml Controle 0,0 (0,0) 1,43 (0,05) 2,84 (0,07) 6,72 (0,14) Dexametasona 0,0 0,038 1,69 1,75 ng/ml (0,0) (0,004) (0,05) (0,05) Dexametasona 0,0 0,30 0,91 2,05 3,5 ng/ml (0,0) (0,01) (0,03) (0,06) Dexametasona 0,0 0,61 6,04 4,73 0,35 ng/ml (0,0) (0,02) (0,14) (0,10) Indometacina 0,0 IJl 2,70 5,80 7,2 ug/ml (0,0) (0,07) (0,07) (0,13) Indometacina 0,0 1,56 7,54 5,50 0,72 ug/ml (0,0) (0,04) (0,17) (0,13) hBD2 1000 0,0 0,003 0,000 0,11 l^g/ml (0,0) (0,002) (0,002) (0,01) hBD2 100 0,0 0,000 0,038 1,15 Ug/ml (0,0) (0,002) (0,003) (0,04) hBD2 10 0,0 0,20 0,35 2,33 I^g/ml (0,0) (0,01) (0,01) (0,06) hBD2 1 μg/ml 0,0 (0,0) 0,17 (0,01) 6,24 (0,14) 3,90 (0,10)

Tabela 17. Produção IL-IO a partir das células mononucleares

do sangue periférico humano (PBMC) após tratamento com LPS ou LTA, com ou sem hBD2 ou dois controles diferentes para os efeitos anti- inflamatórios (Dexametasona e indometacina); todas as amostras testadas no mesmo doador. IL-IO medido pelo ensaio de pérola citométrica (CBA) em um FACSarray, valores sublinhados são signifícantemente aumentados comparados aos controles respectivos (negrito), analisado por ANOVA de 2 vias (N= app. 200 para cada série de dados). IL-10, pg/ml (SD) Meio LPS 0,6 ng/ml LPS 20 ng/ml LTA 1,2 5 μ^πύ Controle 0,0 (218,8) 53,9 (3,1) 123,4 (4,6) 170,1 (5,5) Dexametasona 35 ng/ml 0,0 (1,4) 100,4 (3,8) 152,5 (5,2) 175,2 (6,6) Dexametasona 3,5 ng/ml 2,7 (1,9) 64,6 (3,3) 122,8 (4,7) 112,5 (3,9) Dexametasona 0,35 ng/ml 3,9 (1,9) 46,8 (2,8) 197,1 (7,2) 126,6 (4,7) Indometacina 7,2 ug/ml 0,0 (1,5) 45,7 (2,5) 77,9 (3,6) 90,4 (4,9) Indometacina 0,72 ug/ml 0,0 (1,4) 37,3 (19,6) 108,0 (4,4) 84,9 (3,5) hBD2 1000 μg/ml 0,0 (1,6) 30,8 (2,6) 50,5 (3,2) 465,2 (16,3) hBD2 100 Mg/ml 0,0 (4,9) 173,5 (5,7) 885,2 (22,2) 766,0 (21,7) hBD2 10 M-g/ml 3,9 (1,7) 165,1 (5,6) 497,5 (13,5) 355,8 (9,4) hBD2 1 μ^ιηΐ 0,0 (1,9) 42,7 (2,8) 207,0 (6,9) 142,1 (4,9)

Tabela 18. Produção IL-Iβ a partir das células mononucleares

do sangue periférico humano (PBMC) após tratamento com LPS ou LTA, com ou sem hBD2 ou dois controles diferentes para os efeitos anti- inflamatórios (Dexametasona e indometacina); todas as amostras testadas no mesmo doador. IL-I β medido pelo ensaio de pérola citométrica (CBA) em um FACSarrays os valores sublinhados são significantemente reduzidos comparados aos controles respectivos (negrito), analisados por ANOVA de 2

vias (N= app. 200 para cada série de dados).

IL-I β, ng/ml(SD) Meio LPS 0,6 ng/ml LPS 20 ng/ml LTA 1,25 μ^ιηΐ Controle 0,00 (0,06) 3,96 (0,18) 6,58 (0,23) 11,47 (0,38) Dexametasona 0,00 1,00 2,32 3,98 ng/ml (0,00) (0,03) (0,07) (0,14) Dexametasona 0,00 1,90 3,58 5,22 3,5 ng/ml (0,00) (0,06) (0,12) (0,19) Dexametasona 0,35 ng/ml 0,01 (0,00) 2,9 (0,09) 5,56 (0,18) 7,91 (0,28) Indometacina 7,2 ug/ml 0,04 (0,00) 4,1 (0,13) 6,12 (0,23) 8,91 (0,30) Indometacina 0,72 ug/ml 0,01 (0,00) 3,1 (0,18) 6,46 (0,22) 7,53 (0,31) hBD2 1000 μίξ/ml 0,01 (0,00) 0,53 (0,02) 1,19 (0,08) 4,43 (0,14) hBD2 100 Mg/ml 0,00 (0,00) 0,38 (0,01) 1,67 (0,05) 9,12 (0,32) hBD2 10 Ug/ml 0,06 (0,00) 1,13 (0,04) 3,58 (0,12) 11,0 (0,37) hBD2 1 μg/ml 0,01 (0,00) 1,83 (0,06) 4,91 (0,19) 8,87 (0,29)

Tabela 19. Produção TNF no tensoativo a partir da linha

celular de monócito humano (MUTZ-3) após tratamento com LPS ou LTAj com ou sem hBD2. TNF medido pelo ensaio de pérola citométrica (CBA) em um F ACSarray, * p< 0,05 comparado ao controle respectivo, ** p< 0,01 comparado ao controle respectivo, analisado por ANOVA de 2 vias (N= app.

200 para cada série de dados).

TNFj pg/ml (SD) Controle hBD2 100 μίξ/πύ hBD2 10 μ^πιΐ hBD2 1 μ^ιηΐ Meio 0,00 (5,56) 0,00 (5,47) 2,60 (7,17) 2,21 (7,88) LPS 1,5 μ^πύ 6,38 (9,28) 3,93 (6,63)* 3,93 (6,93)* 6,61 (9,17) LTA 1,5 μ^πύ 5,28 (9,75) 2,64 (29,19)* 3,76 (7,72) 1,75 (6,96)**

Tabela 20. Produção TNF nos tensoativos a partir das células

dendríticas imaturas estimuladas com LPS ou LTA (para gerar DC maduro), com ou sem hBD2. TNF medido pelo ensaio de pérola citométrica (CBA) em um FACSarray, * significantemente reduzido p< 0,05 comparado ao controle respectivo, *** significantemente reduzido p< 0,01 comparado ao controle respectivo, analisado por ANOVA de 2 vias (N= app. 200 para cada série de

dados).

TNF, pg/ml (SD) Controle hBD2 100 μίξ/ml hBD2 10 Ug/ml hBD2 1 μg/ml Meio 0,00 (1,74) 0,00 (1,83) 1,89 (2,15) 4,64 (10,26) LPS 1,5 μ^πύ 23,73 (3,28) 7,66 (2,51)*** 13,8 (2,33)*** 18,04 (2,89)*** LTA 1,5 μ^ιηΐ 3,78 (2,26) 5,22 (2,25) 2,76 (2,27)* 0,00 (1,98)***

EXEMPLO 5

Atividade anti-inflamatória de uma variante hBDl, hBD2, hBD3 e hBD4

O Exemplo 5 foi essencialmente realizado como descrito no Exemplo 4. O composto rhBD2, como mostrado nas tabelas abaixo, é hBD2 recombinante, que é idêntico ao hBD2 como usado no Exemplo 4.

Os compostos hBDl, hBD2, hBD3 e variante hBD4, como mostrado nas tabelas abaixo, foram preparadas usando síntese química e obtido de Peptide Institute Inc.

A seqüência do aminoácido de hBD2 recombinante (rhBD2) é idêntica à seqüência de aminoácido da hBD2 preparada pela síntese química.

A variante hBD4 mostrada nas tabelas abaixo consiste de 3 a 39 aminoácidos de hBD4 e a seqüência do aminoácido é mostrada como SEQ ID N0: 5.

Em cada tabela, todas as amostras foram testadas no mesmo doador. SD significa o desvio padrão.

RESULTADOS

Tabela 21. Produção TNF a partir das células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) após tratamento com LPS com ou sem beta defensina humana, dexametasona ou Infliximab. TNF medido pelo ensaio de pérola citométrica (CBA) em um FACSarray5 * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 analisado por ANOVA de 2 vias e comparados as células não tratadas pelos Pós-testes de Bonferroni._

Meio LPS 20 ng/ml LPS 0,6 ng/ml Composto testado TNFpg/ ml (SD) % de control e TNFpg/ ml (SD) % de controle TNFpg/ ml (SD) % de controle Meio (não tratado) 1 (D 100% 2164 (632) 100% 728 (156) 100% rhBD2 40 Hg/ml 0 (0) - 167 (17)*** 8% 74 10% rhBD2 ΙΟμ^ΓηΙ 0 (0) - 260 (29)*** 12% 125 (20)** 17% rhBD2 1 μ^ιηΐ 1 (0) - 918 (373)*** 42% 196 (104)** 27% hBDl 40 μ^ηιΐ 0 (0) - 999 (116)*** 46% 91 (8)** 13% hBDl ΙΟμ^ηύ 0 (1) - 1311 (417)*** 61 % 203 (20)** 28% hBDl 1 μ^ηιΐ 1 (1) - 1395 (201)*** 64% OO -o Φ- 65% hBD2 40 μ^πιΐ 0 (0) - 52 (71)*** 2% Ι 76 (103)** 24% hBD2 ΙΟμ^πύ 0 (0) - 132 (179)*** 6% 304 (108)* 42% hBD2 1 μg/ml 0 (0) - 411 (581)*** 19% 242 (30)* 33% HBD-3 1 μ^πιΐ 0 (0) - 451 (24)*** 21 % 528 (98) 73% variante hBD4 10 μ^ιηΐ 0 (0) - 139 (6)*** 6% 211 (22)** 29% variante hBD4 1 μ^ηιΐ 0 (0) - 778 (27)*** 36% 468 (59) 64% Dexametasona 0 (0) - 635 (163)*** 29% 47 6% Infliximab 0 (0) - 0 (Q)*** 0% 0 (0)* ** 0%

Tabela 22. Produção IL-IO a partir das células mononucleares

do sangue periférico humano (PBMC) após tratamento com LPS com ou sem beta defensina humana, dexametasona ou Infliximab. IL-IO medido pelo ensaio de pérola citométrica (CBA) em um FACSarray5 * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 analisado por ANOVA de 2 vias e comparados as células não tratadas pelos Pós-testes de Bonferroni._

Composto testado Meio (não tratado) LPS 20 ng/ml LPS 0,6 ng/ml IL- lOpg/ml (SD) % de controle IL- lOpg/ml (SD) % de controle IL- lOpg/ml (SD) % de controle Meio (não tratado) 0 (0) 100 % 111 (3) 100% 66 (5) 100% rhBD2 40 μ^πιΐ 0 (0) - 281 (9)*** 252 % 108 (4)* 162% rhBD2 10 μ^τηΐ 0 (0) - 243 (38)*** 218% 103 (14)* 155% rhBD2 1 μg/ml 0 (0) - 126 (14) 113% 72 (9) 108% hBDl 40 μg/ml 0 (0) - 113 (5) 102% 69 (4) 104% hBDl 10 ug/ml 0 (0) - 100 (1) 90% 76 (13) 114% hBDl 1 μ^ηιΐ 0 (0) - 95 (17) 85% 71 (6) 108% hBD2 40 μ^ηιΐ 0 (0) - 323 (Q)*** 290 % 131 (13)*** 197% hBD2 10 μ&ϊϊύ 0 (0) - 240 (Q)*** 215 % 86 (6) 130% hBD2 1 μ^πιΐ 0 (0) - 123 (0) 110% 53 (5) 80% hBD3 1 μ^ηιΐ 0 (0) - 152 (72)* 137% 71 (2) 107% variante hBD4 10 μ^πύ 0 (0) - 187 (9)*** 168% 92 (17) 139% variante hBD4 1 μίξ/πιΐ 0 (0) - 175 (8)*** 157% 90 (14) 136% Dexametasona 0 (0) - 75 (6)* 67% 47 (3) 70% Infliximab 0 (0) - 63 (7)** 56% 46 (9) 69%

Tabela 23. Produção IL-Iβ a partir das células mononucleares

do sangue periférico humano (PBMC) após tratamento com LPS com ou sem beta defensina humana, dexametasona ou Infliximab. IL-I β medido pelo ensaio de pérola citométrica (CBA) em um F ACSarray, *** p<0,001 analisado por ANOVA de 2 vias e comparados as células não tratadas pelos Pós-testes de Bonferroni.

Composto testado Meio (não tratado) LPS 20 ng/ml LPS 0,6 ng/ml IL- lppg/ml (SD) % de controle IL- lppg/ml (SD) % de controle IL- lppg/ml (SD) % de controle Meio (não tratado) 0 (0) 100% 2544 (226) 100% 741 (93) 100% rhBD2 40 μ^ηιΐ 0 (0) - 395 (25)*** 16% 124 (11)*** 17% rhBD2 10 μ^πιΐ 0 (0) - 624 (37)*** 25% 214 (7)*** 29% rhBD2 1 μg/ml 0 (0) - 1480 (154)*** 58% 284 (15)*** 38% hBDl 40 μg/ml 0 (0) - 1599 (14)*** 63% 302 (3)*** 41 % hBDl 10 μ^πύ 0 (0) - 1913 (53)*** 75% 401 (17)*** 54% hBDl 1 μg/ml 0 (0) - 2087 (157)*** 82% 512 (45)** 69% hBD2 40 μ^ηιΐ 1 (1) - 316 12% 159 (2)*** 21 % hBD2 10 μ^ηιΐ 0 (0) - 589 23% 238 (124)*** 32% hBD2 1 μg/ml 0 (0) - 1569 62% 312 (28)*** 42% hBD3 1 μg/ml 0 (0) - 568 (126)*** 22% 331 (23)*** 45% variante hBD4 10 μ^ηιΐ 0 (0) - 463 (40)*** 18% 163 ^ 22% variante hBD4 1 μ^ιηΐ 0 (0) - 1004 (24)*** 40% 286 ]·)*** 39% Dexametasona 0 (0) - 1120 (220)*** 44% 104 (gy*** 14% Infliximab 0 (0) - 2704 (0) 106% 636 (81) 86%

Os efeitos de hBDl, hBD2, hBD3 e uma variante hBD4 foram

testados em PBMC humano tratado com ou sem LPS (Tabelas 21, 22 e 23). Em comparação, rhBD2 foi incluído em cada apresentação.

O TNF foi subregulado para todas as defensinas. A redução na secreção IL-I β foi comparável ao TNF, embora não tão pronunciado quanto TNF. A secreção de IL-10 foi significantemente e intensificado dependentemente da dosagem por hBD2 e uma variante hBD4.

O hBD3 também foi testado a 10 μg/ml e 40 μg/ml e uma variante hBD4 também foi testado a 40 μ^/πύ; entretanto, visto que ambas moléculas foram tóxicas as células nestas concentrações, não foi possível discriminar entre efeitos tóxicos e anti-inflamatórios.

Como um controle positivo na sub-regulação das TNF, dois compostos anti-inflamatórios, dexametasona e Infliximab, foram incluídos na apresentação. CONCLUSÃO

Todas as betas defensinas humanas testadas mostraram potencial anti-inflamatório. EXEMPLO 6

Redução de IL-23 das células dendríticas derivadas de monócito humano e PBMC humanos

O Exemplo 6 foi essencialmente realizado como descrito no Exemplo 4 pelo PBMC humano; entretanto, a leitura foi IL-23 em vez de TNFs IL-Iβ e IL-10. Além disso, o efeito de rhBD2 nas células dendríticas derivadas de monócito humano também foi investigada.

Geração de células dendríticas derivadas de monócitos (DCs)

Os DCs foram preparados de acordo com um protocolo modificado originalmente descrito por Romani et ai. Brevemente, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram purificadas a partir da capa leucocitária de doadores saudáveis pela centrifugação em um gradiente Ficoll-pague (GE-healthcare). Os monócitos foram isolados de PBMC pela seleção positiva de células CD14+ pelas pérolas magnéticas (Dynal, Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Os monócitos CD14+ foram cultivados em placas de 6 reservatórios em RPMI/fator estimulador de colônia de macrófago-granulócito recombinante de soro AB humano a 2% (GM-CSF, 20 ng/ml) e IL-4 (20 ng/ml) (PeproTech) por 6 dias, suprindo o meio (não tratado)/citocinas após 2 e 5 dias. Após 6 dias de cultura de DCs imaturos são cultivados novamente em placas de 96 reservatórios em uma concentração de 1 χ IO6 células/ml e deixados tratados ou não tratados com um coquetel e/ou hBD2 por 24 horas adicionais. O hBD2 foi testado em quatro concentrações em quadruplicata. O hBD2 foi analisado por sua capacidade de suprimir a maturação hDC em um fenótipo pró-inflamatório usando um coquetel pró-inflamatório que contém LPS (100 ng/ml) e IFN-y (20 ng/ml). A dexametasona foi adicionada 20 horas antes do coquetel como controle positivo para um composto com atividade antiinflamatória clínica demonstrada. A incubação com hBD2 foi feita 4 horas antes da adição do coquetel.

ELISA de citocina

Os tensoativos de cultura foram coletados e armazenados a - 80° C. As quantidades de IL-23 foram medidas por ELISA de sanduíche padrão usando anticorpos comercialmente disponíveis e padrão de acordo com os protocolos dos fabricantes (eBioscience). Ensaio MTT

Um kit de determinação de desenvolvimento celular com base

em MTT foi usado como uma medida de sobrevivência celular após 48 horas a fim de avaliar se qualquer uma das células foram severamente afetadas pelo tratamento com veículos, coquetel ou hBD2 e foram feitos de acordo com o protocolos dos fabricantes (Sigma). Análise estatística

Todos os experimentos foram realizados pelo menos duas vezes, com os resultados representativos mostrados. Os dados apresentados são expressados como meio de desvio padrão menor/maior (SEM). A importância estatística foi determinada por ANOVA de 2 vias com as variáveis sendo o tratamento (hBD2, dexametasona, etc.) e estímulo (LPS, LTAi peptidoglicano, etc.) seguido pelo pós-teste Bonferroni como relacionado nas legendas da tabela. As diferenças foram consideradas significantes por ρ < 0,05.

RESULTADOS

Tabela 24. IL-23 (pg/ml) nos tensoativos de células dendríticas

derivadas de monócitos CD14+ humanos estimuladas com meio (não tratado) (não estimulado), ou LPS e IFN-y e tratadas com meio (não tratado), hBD2 ou dexametasona, média (SEM), N=4, um doador representativo fora de três. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 analisado por ANOVA de 2 vias e comparados as células não tratadas pelos pós-testes de Bonferroni. nd: não detectado (abaixo limite de detecção).

IL-23pg/ml (SEM) Não estimulado LPS (100 ng/ml) elFN- γ (20 ng/ml) Não tratado 375 (96) 3569 (130) hBD2 1 μ^ηιΐ nd 3833 (88) hBD2 451 3308 μ^πιΐ (121) (169)* hBD2 nd 3042 μ^ιπί (46)*** hBD2 nd 2145 100 \ig/ml (202)*** Dexametasona 424 1147 1 μΜ (38) (268)***

Tabela 25. IL-23 (pg/ml) nos tensoativos de PBMC humano estimulado com meio (não tratado) (controle), 0,6 ng/ml LPS5 20 ng/ml LPS ou 5 pg/ml LTA e hBD2 tratado, dexametasona ou Infliximab, média (SEM). * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 analisado por ANOVA de 1 via e comparados as células não tratadas pelo pós-teste de comparação múltipla de

Dunnett.

IL-23pg/ml (SEM) Controle LPS 0,6 ng/ml LPS 20 ng/ml LTA5 μg/ml Controle 257 553 510 762 (não tratado) (7) (6) (5) (20) hBD2 218 338 263 383 1 μg/ml (5) (10)** (5)** (20)** hBD2 211 462 295 438 μ^ηιΐ (4) (2)* (1)** (9)** hBD2 207 484 488 810 100 μg/ml (4) (7) (8) (30) Dexametasona 222 202 192 223 3,5 ng/ml (5) (5)** (1)** (1)** Infliximab 227 356 373 349 1 μg/ml (10) (10)** (2)** (1)**

Como mostrado na Tabela 24, hBD2 suprime

significantemente e secreção IL-23 dependentemente da dosagem a partir das células dendríticas CD14+ humanas derivadas de monócitos.

Pelo PBMC humano, secreção IL-23 também foi significantemente suprimida (Tabela 25). Nestas células existe uma dependência de dosagem inversa, que foi observada ser uma curva de inibição de resposta de dose em forma de cinto quando testada dosagens inferiores de hBD2 (dados não mostrados).

Este mostra que hBD2 deve ter um efeito supressivo em uma condição autoimune crônica pela supressão de secreção IL-23, como IL-23 é uma parte importante da resposta inflamatória. Células Th 17 são dependentes em 1L-23 para sua sobrevivência e expansão e Células Th 17 foram mostradas ser patogênicas em diversas doenças autoimunes, tal como doença de Crohnj colite ulcerativa, psoríase e esclerose múltipla.

EXEMPLO 7

Redução da secreção TNF de PBMCs com beta defensina 3 de camundongo (mBD3)

O Exemplo 7 foi essencialmente realizado como descrito no Exemplo 4 pelo PBMC humano. Beta defensina 3 de camundongo (mBD3) foi preparado usando o mesmo protocolo como foi usado pela produção de hBD2 no Exemplo 1. A seqüência do aminoácido de mBD3 é mostrado na SEQ ID N°: 6. PBMCs de camundongo foram preparados como descrito abaixo.

Isolamento e estímulo de células mononucleares do sangue periférico de camundongo (PBMC)

As células mononucleares do sangue periférico de camundongo foram isoladas a partir do sangue de dez camundongos NMRL Em resumo, sangue heparinizado foi diluído 1/1 v/v com RPMI e submetido à centrifugação de densidade dentro de 2 horas de retirada. O plasma foi coletado a partir da parte superior e descartado. PBMC isolado foi recolocado em suspensão em meio de cultura (não tratado) (RPMI 1640 (Gibco, 42401) w/ 1 % de penicilina e estreptomicina e 1 % de L-Glutamina) e semeados em placas de cultura de 96 reservatórios com 115.500 células por reservatório em um total de 200 μΐ. PBMC do mesmo doador foi estimulado com 100, 10 ou 1 pg/ml de hBD2 ou mBD3 (beta defensina 3 de camundongo); sozinho ou junto com 20 ng/ml LPS (E. coli, Ol 11 :B4, Sigma L4391). Dexametasona foi adicionada a 3,5 ng/ml às culturas com ou sem estímulo LPS. Os tensoativos foram coletados após incubação a 37° C por 24 horas e armazenados a -80° C até a medição de citocina. A produção de citocina nos tensoativos foi medida pela citometria de fluxo com um ensaio de pérola citométrico de inflamação de camundongo (CBA) de acordo com as instruções do fabricante (BD) em uma citometria de fluxo FACSarray.

A viabilidade foi medida por Alamar Blue (Biosource DALL 1100) após o tensoativo ser coletado.

RESULTADOS

Tabela 26. Produção TNF a partir das células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) após tratamento com LPS com ou sem hBD2, todas as amostras testadas no mesmo doador, experimento representativo foi de dois doadores. TNF medido pelo ensaio de pérola citométrica (CBA) em um FACSarray, *** p<0,001 comparado ao controle respectivo, analisado por ANQVA de 2 vias (N=2)._

TNFpg/ml (SEM) Meio (não tratado) LPS20 ng/ml Meio (não tratado) 5 (1) 1353 (140) mBD3 1 μg/ml 2 (0) 384 mBD3 10 μ^πιΐ 2 (0) 51 (1)*** mBD3 100 μζ/πύ 39 (19) 166 (17)*** hBD2 1 μ^ιηΐ 3 (0) 633 (110)*** hBD2 10 μ^ιηΐ 2 (0) 359 (10)*** hBD2 100 μ^ιηΐ 2 (0) 342 (34)*** Dexametasona 3,5 ng/ml 1 (0) 460 (29)*** Infliximab 1 μ^ιηΐ 0 (0) 1 (0)* * *

Tabela 27. Produção TNF a partir das células mononucleares do sangue periférico de camundongo (PBMC) após tratamento com LPS com ou sem mBD3, todas as amostras testadas no mesmo doador, experimento representativo foi de dois doadores. TNF medido pelo ensaio de pérola

5

10 citométrica (CBA) em um F ACSarray, *** p<0,001 comparado ao controle respectivo, analisado por ANOVA de 2 vias (N=2).

TNFpg/ml (SEM) Meio (não tratado) LPS20 ng/ml Meio (não tratado) 578 (3) 2063 (77) mBD3 347 1600 1 μ^ηιΐ (32) (47)*** mBD3 180 297 μ^ιηΐ (0) ^*** mBD3 182 195 100 μg/ml (5) (6)*** Dexametasona 94 328 3,5 ng/ml . (3) ^g)*** Infliximab 530 2119 1 μ^πιΐ (4) (31)

Como mostrado na Tabela 26, beta defensina 3 de camundongo (mBD3) é sub-regulada da secreção de TNF a partir do PBMC humano a mesma extensão como hBD2 e dexametasona. mBD3 também sub- regula a secreção de TNF a partir do PBMC de camundongo (Tabela 27).

Consequentemente, nesta apresentação, mBD3 apresenta atividade anti-inflamatória excelente. REFERÊNCIAS

Bonoiotto M., WJ Jordan, J. Eskdale, A. Tossi, N. Antcheva, S. Crovella, ND Connell and G Gallagher. Human 13-Defensin 2 Induces a Vigorous Cytokine Response in Peripheral Blood Mononuclear Cells. AntimicrobialAgents and Chemotherapy (2006), 50, 1433-1441.

Bowdish et al., Immunomodulatory properties of defensins and cathelicidins. Curr. Top. Microbiol Immunol (2006) 306, 27-66.

Gersemann et al., Crohn's disease—defect in innate defence. World J. Gastroenterol (2008) 14, 5499-5503.

Lehrer R.I., Primate defensins. Nat Rev. Mierobiol (2004) 2,

727-738.

Swidsinski et al., Mucosal flora in inflammatory bowel disease. Gastroenterology {2002) 122, 44-54. Niyonsaba F., Η. Ushio, Ν. Nakano5 W. Ng5 Κ. Sayama5 Κ. Hashimoto, I. Nagaoka, Κ. Okumura and Η. Ogawa. Antimicrobial peptides human 13-defensins stimulate epidermal keratinocyte migration, proliferation and production of proinflammatory cytokines and chemokines. Journal of InvestigativeDermatology(IOOl)i 127, 594-604.

Rowland TL, SM McHugh, J Deighton, RJ Dearman5 PW Ewan and I Kimber. Differential regulation by thalidomide e dexamethasone of cytokine expression in human peripheral blood mononuclear cells. Immunopharmacology (1998), 40, 11-20.

Wang et ai, Host-microbe interaction: mechanisms of defensin

deficiency in Crohn's disease. Expert Rev. Antl Infect. Ther. (2007) 5, 1049- 1057.

Wehkamp et al., Reduced Paneth cell alpha-defensins in ileal Crohn's disease. Proc. Natl Aead. Scl U. S. A (2005) 102, 18129-18134.

Claims

1. Uso de uma beta defensina humana, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para a administração parenteral no tratamento de uma doença intestinal inflamatória.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a beta defensina humana é administrada subcutânea ou intravenosamente.

3. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 2, caracterizado pelo fato de que a beta defensina humana é administrada em uma dosagem diária de 0,001 mg/kg de peso corporal a 10 mg/kg de peso corporal, preferivelmente de 0,01 mg/kg de peso corporal a 10 mg/kg de peso corporal.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a beta defensina humana tem pelo menos 80% de identidade às seqüências de aminoácido de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQID N0: 3 ou SEQID N°: 4.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a beta defensina humana é beta defensina humana 1, beta defensina humana 2, beta defensina humana 3 ou beta defensina humana 4.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a beta defensina humana tem pelo menos 80 % de identidade à seqüência de aminoácido da SEQID N°: 2.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a beta defensina humana é beta defensina humana 2 (SEQID NO: 2).

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a atividade de TNF-alfa é reduzida nos tecidos tratados.