TW201136603A - 15-valent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine composition - Google Patents

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201136603 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明提供具有15種不同多醣·蛋白質接合物之多價免 疫原性組合物。每一接合物皆由自不同肺炎鏈球菌血清型 (1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、 22F、23F或33F)製得的莢膜多醣接合至載體蛋白（較佳 CRM!97)而組成。免疫原性組合物較佳調配成存於基於鋁 之佐劑中之疫苗形式’其尤其可在嬰兒及幼兒中提供針對 肺炎球菌疾病之較寬涵蓋範圍。 【先前技術】 肺炎鏈球菌係在全世界範圍内造成嚴重疾病之主要原 因。在 1997年’疾病防製中心（centers for Disease Control and Preventi〇n)(CDC)估計在美國每年有3,000例肺炎球菌 性腦膜炎病例、50,000例肺炎球菌性菌血症病例、 7,000,000例肺炎球菌性中耳炎病例及5〇〇 〇〇〇例肺炎球菌 性肺炎病例。參見：疾病防製中心，MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1997，46(RR-8):1-13。另外，該等疾病可具有明 顯併發症’其中一些研究報導肺炎球菌性腦膜炎具有高達 ' 8%之死亡率及25%之神經病學後遺症。參見：Arditi等 • 人，1998, Pediatrics 102:1087-97。 多價肺炎球菌多酿疫苗得到許可已有許多年，且已證明 其在預防成年人、尤其老年人及彼等高危患者之肺炎球菌 疾病方面頗具價值。然而’嬰兒及幼兒對於未接合肺炎球 菌多醣之反應較差。肺炎球菌接合物疫苗Prevnar®(含有在 153623.doc 201136603 幼兒及嬰兒時會引起侵襲性肺炎球菌疾病之7種最常分離 之血清型（4、6B、9V、14、18C、19F及23F))在美國於 2000年2月首次獲得許可。在美國普遍應用Prevnar®後，兒 童中之侵襲性肺炎球菌疾病因Prevnar®中存在之血清型而 顯著減少。參見：疾病防製中心，MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2005，54(36):893-7。然而，在世界上某些地 區，Prevnar®之血清型涵蓋範圍具有限制性，且在美國存 在某些新出現血清型（例如，19 A及其他）之一些證據。參 見：O'Brien等人，2004，Am J Epidemiol 159:634-44 ; Whitney等人，2003，N Engl J Med 348:1737-46 ; Kyaw等 人，2006, N Engl J Med 354:1455-63 ; Hicks等人，2007, J Infect Dis 196:1346-54 ; Traore等人，2009，Clin Infect Dis 48:S181-S189 。 美國專利申請公開案第US 2006/0228380 A1號闡述了包 含血清型 1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、 19A、19F及23F之13價肺炎球菌多醣-蛋白質接合物疫苗。 中國專利申請公開案第CN 101590224 A號闡述了包含血清 型 1、2、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、 19F及23F之14價肺炎球菌多醣-蛋白質接合物疫苗。 其他PCV涵蓋PCV-15中所含血清型中之7、1〇、11、或 13種，但已觀察到對於一些血清型具有免疫干預（例如， 對於GSK之PCV-11中之血清型3具有較低保護）且對於 Pfizer之PCV-13中之血清型6B具有較低反應速率。參見： Prymula等人，2006，Lancet 367:740-48及Kieninger等人， 153623.doc 201136603

Safety and Immunologic Non-inferiority of 13-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Compared to 7-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Given as a 4-Dose Series in Healthy Infants and Toddlers，見於第 48 屆 Annual ICAAC/ISDA 第 46屆 Annual Meeting 中，Washington DC， ' 2008年 10月 25-28 曰。 【發明内容】 本發明提供免疫原性組合物，其包括〇)由來自15種接 合至載體蛋白之不同肺炎鏈球菌血清型之莢膜多醣組成的 多價多醣-蛋白質接合物混合物，及（2)醫藥上可接受之載 劑。更具體而言，本發明提供15價肺炎球菌接合物疫苗 (PCV-1 5)組合物，其包括由來自接合至載體蛋白之肺炎鏈 球菌血清型 1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、 19A、19F、22F、23F、及33F之莢膜多醣組成的多價多醣_ 蛋白質接合物混合物；及醫藥上可接受之載劑。在一具體 實施例中，免疫原性組合物含有來自血清型丨、3、4、5、 6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23ρ及 3邗 之莢膜多醣且載體蛋白係crm197。 在某些實施例中’組合物進-步包括佐劑。在某些實施 • 射，佐劑係基独之佐劑，例如魏銘、硫酸lg或氫氧 化鋁。在本發明之-特定實施例中，佐劑係磷酸鋁。 本發明亦提供料針對肺炎鏈球菌莢膜多醣之免疫應答 的方法，其包括向人類投與免疫有效量之上述免疫原性組 合物。 153623.doc 201136603 本發明進一步提供以經調配含有以下物質之單一 〇·5 mL 劑量形式投與的免疫原性組合物：2 gg之每種多醣，6B除 外’其為4 pg，約32 pg CRMi97載體蛋白；0.125 mg元素 鋁（0.5 mg鱗酸鋁）佐劑；150 mM氣化鈉及20 mM L-組胺酸 緩衝液。 【實施方式】 本發明供包括15種不同多醣-蛋白質接合物以及醫藥 上可接受之載劑、基本上由其組成、或（另一選擇為）由其 組成的多價免疫原性組合物，其中該等接合物中之每一者 皆含有接合至載體蛋白之不同莢膜多醣，且其中該等莢膜 多醣係自肺炎鍵球菌之血清型1、3、4、5、6A、6B、 7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F 及 33F 製得。在 某些實施例中，載體蛋白係CRMl97。免疫原性組合物可進 一步包括佐劑，例如，基於鋁之佐劑，例如磷酸鋁、硫酸 鋁及氫氧化鋁。本發明亦提供誘導針對肺炎鏈球菌莢膜多 醣接合物之免疫應答的方法，其包括向人類投與免疫有效 量之上述多價免疫原性組合物。 如實例中所述（見下文），幼小恒河猴中之臨床前研究展 示了對於PCV-U中所有15種血清型之強烈抗體反應，該等 反應與對於Prevnar®中7種常見血清型之反應相當。申請者 發現，包含所添加含有血清型22F及33F之新穎多醣-蛋白 質接合物的15價肺炎球菌接合物疫苗會提供強烈抗體反 應’此證實了擴大現有肺炎球菌疫苗未涵蓋之肺炎球菌血 清型涵蓋範圍的可行性。 153623.doc 201136603 術語「包括」在與本發明免疫原性組合物一起使用時係 指包含任一其他組份（服從對於抗原混合物之「由......組 成」語言的限制）’例如佐劑及賦形劑。術語「由......組 成」在與多價多醣-蛋白質接合物混合物一起使用時係指 具有彼等15種特定肺炎鏈球菌多醣蛋白質接合物且不含來 自不同血清型之其他肺炎鏈球菌多醣蛋白質接合物的混合 物。 摩义趣嫌磨英膜多酶·蛋白質接合物 來自肺炎鏈球菌之莢膜多醣可藉由彼等熟習此項技術者 已知之標準技術製得。舉例而言，多醣可自細菌分離且可 藉由已知方法（參見（例如）歐洲專利第Ep497524號及第 EP497525號）且較佳藉由微流化來設定至一定尺寸。可設 疋多醣之尺寸以減小多醣試樣之黏度及/或改進接合產物 之濾過率。在本發明中，莢膜多醣係自肺炎鏈球菌之血清 型 1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、 19F、22F、23F 及 33F 製得。 在一實施例中，使每一肺炎球菌多醣血清型在基於大豆 . 之培養基中生長。然後經由標準步驟來純化個別多醣，包 3離 '冗炎、及超濾。參見（例如）美國專利申請公開案 第2008/0286838號及美國專利第5,847，m號。 載體蛋白較佳係無毒且不具反應原性並可以（夠量及足 夠‘屯度獲得之蛋白質。載體蛋白可與肺炎鏈球菌多膽接合 或連接以增強多聽之免疫原性。載體蛋白應能夠經受標準 接σ程序在本發明之一特定實施例中’使用CRM197作為 153623.doc 201136603 載體蛋白。在一實施例中’每一莢膜多醣皆接合至相同載 體蛋白（每一莢膜多醣分子皆接合至單一載體蛋白）。在另 一實施例中’莢膜多醣接合至兩個或更多個載體蛋白（每 一英膜多酿分子皆接合至單一載體蛋白）。在此一實施例 中’具有相同血清型之每一莢膜多醣通常接合至相同載體 蛋白。 CRM197係白喉毒素之非毒性變化形式（亦即，類毒素）。 在一實施例中’其係自在酪蛋白胺基酸及酵母提取物基培 養基中生長之白喉棒狀桿菌（Corynebacterium diphtheria) 菌株C7 (β 197)培養物分離而來。在另一實施例中， CRMm係根據美國專利第5,614,382號中所述之方法以重組 方式製得。通常’經由超濾、硫酸銨沉澱、及離子交換層 析之組合來純化CRM〗”。在一些實施例中，CRM,97係使 用 Pfenex Expression TechnologyTM(Pfenex 公司，San Diego，CA)在螢光假單胞菌（pseud〇monas fluorescens)中製 得。 其他適宜載體蛋白包含額外經滅活之細菌毒素，例如 DT(白喉類毒素（Diphtheria toxoid))、TT(破傷風類毒素）或 TT之片段C、百曰咳類毒素、霍亂類毒素（例如，國際專利 申請公開案第W0 2004/083251號中所述者）、大腸桿菌（E c〇li)LT、大腸桿菌ST及來自綠膿桿菌（Pseud〇m〇nas aeruginosa)之外毒素A。亦可使用細菌外膜蛋白，例如外 膜複合物c (OMPC)、孔蛋白、轉鐵結合蛋白、肺炎球菌表 面蛋白A (PspA ;參見國際申請案專利公開案第w〇 153623.doc 201136603 02/091998號）、肺炎球菌黏者蛋白（p s a a)、來自A組或B組 鏈球菌之C5a肽酶、或流感嗜血菌（Haemophilus influenzae)蛋白D、肺炎球菌溶血素（Kuo等人，1995， Infect Immun 63 ; 2706-13)(包含以某些方式去毒之ply， 例如dPLY-GMBS(參見國際專利申請公開案第w〇 04/081515 號）或€1?1^-【〇〇11〇1)、？1^又（包含？1^八、？1118' PhtD、PhtE及Pht蛋白融合體，例如phtDE融合體、PhtBE 融合體（參見國際專利申請公開案第WO 01/98334號及第 WO 03/54007號））。亦可使用其他蛋白質作為載體蛋白， 例如卵白蛋白、釘形貝血藍蛋白（KLH)、牛血清白蛋白 (BSA)或結核菌素之純化蛋白質衍生物（PPD)、PorB(來自 腦膜炎雙球菌（N_ meningitides))、PD(流感嗜血菌蛋白D ; 參見（例如）歐洲專利第EP 0 594 610 B號）、或其免疫功能 等效物、合成肽（參見歐洲專利第EP0378881號及第 EP0427347號）、熱激蛋白（參見國際專利申請公開案第WO 93/1 7712號及第WO 94/03208號）、百日咳蛋白（參見國際專 利申請公開案第WO 98/58668號及歐洲專利第EP0471177 號）、細胞因子、淋巴因子、生長因子或激素（參見國際專 利申請公開案第WO 91/01146號）、人工蛋白（包括來自各 種病原體衍生性抗原之多種人類CD4+ T細胞表位（參見 Falugi 等人，2001，Eur J Immunol 31:3816-3824)，例如 N19蛋白（參見 Baraldoi等人，2004，Infect Immun 72:4884-7))、鐵攝取蛋白（參見國際專利申請公開案第WO 01/7233 7號）、難辨梭狀芽孢桿菌（C. difficile)之毒素A或 153623.doc 201136603 B(參見國際專利公開案第w〇 00/61761號）、及鞭毛蛋白 (參見 Ben-Yedidia等人，1998，Immunol Lett 64:9) 〇 可使用其他DT突變體，例如CRM176、CRM228、CRM 45(Uchida等人 ’ 1973，J Biol Chem 218:3838-3844); CRM9、CRM45、CRM102、CRM103 及 CRM107 及由 Nicholls及 Youle在 Genetically Engineered Toxins，Frankel， Maecel Dekker公司編輯，1992中所述之其他突變；Glu_ 148至Asp、Gin或Ser及/或Ala 158至Gly之缺失或突變及美 國專利第4,709,017號或美國專利第4,95〇,74〇號中所揭示之 其他突變；至少一或多個殘基LyS 516、Lys 526、Phe 530 及/或Lys 534之突變及美國專利第5,917,〇17號或美國專利 第6,45 5,673號中所揭示之其他突變；或美國專利第 5,843,71 1號中所揭示之片段。 對經純化多醣實施化學活化以使該等醣類能夠與載體蛋 白發生反應。一旦活化，則每一莢膜多醣會分別與載體蛋 白接合以形成醣接合物。多醣接合物可藉由已知偶合技術 製得。 在一實施例中，多醣之化學活化及隨後與載體蛋白之結 合係藉由美國專利第4,365，170號、第4,673,574號及第 4,902,506號中所述之方式來達成。簡言之，該化學方式藉 由使肺炎球菌多與將末端經基氧化成路之任一氧化劑進 行反應來將其活化’該氧化劑係(例如)高碘酸鹽(包含高碘 酸納、南蛾酸卸、或高峨酸）。該反應使得可隨機氧化性 裂解碳水化合物之鄰位歸，同時形成反應性路基團。 153623.doc -10- 201136603 可經由對蛋白質之離胺醯基實施直接胺化藉由還原胺化 來與載體蛋白（例如crm197)進行偶合。舉例而言，藉由使 經活化多醣及載體蛋白之混合物與諸如氰基硼氫化鈉等還 原劑進行反應來實施接合。然後藉由添加諸如硼氫化鈉等 強還原劑來對未反應之醛進行封蓋。 在另一實施例中，接合方法可依賴於使用卜氰基-4-二曱 基胺基四氟硼酸吡啶鑌（CDAP)來活化醣以形成氰酸酯。 由此可使經活化醣直接或經由間隔體（連接體）基團偶合至 載體蛋白上之胺基。舉例而言，間隔體可為胱胺或半胱胺 以得到硫醇化多醣，該硫醇化多醣可在與馬來醯亞胺活化 之載體蛋白（例如使用GMBS)或鹵代乙醯化載體蛋白（例如 使用碘代乙醯亞胺[例如，乙基碘代乙醯亞胺HC1]或溴乙 酸N-琥珀醯亞胺基酯或SIAB、或SIA、或SBAP)反應後經 由所獲得之硫醚鍵與載劑偶合。較佳地，使氰酸酯（視需 要藉由CDAP化學物質製得）與己二胺或己二酸二醯肼 (ADH)進行偶合，且使用碳化二亞胺（例如EDAC或EDC)化 學物質經由載體蛋白上之羧基使胺基衍生之醣與載體蛋白 接合。該等接合物闡述於國際專利申請公開案第WO 93/15760號、第 WO 95/08348 號及第 WO 96/29094號、及 Chu等人，1983，Infect Immunity 40:245-256 中。 其他適宜技術使用碳化二亞胺、醯肼、活性酯、降莰 烷、對-硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S-NHS、EDC、 TSTU。許多技術闡述於國際專利申請公開案第WO 98/42721號中。接合可涉及羰基連接體，該羰基連接體可 153623.doc 201136603 藉由使醣之游離羥基與CDI進行反應（參見Bethell等人， 1979，J. Biol. Chem. 254:2572-4 ; Hearn 等人，1981，J.

Chromatogr. 218:5〇9-18)隨後與蛋白質進行反應以形成胺 基甲酸酯連接來形成。此可涉及將變旋異構末端還原成一 級羥基，對一級羥基實施可選保護/去保護，使一級經基 與CDI進行反應以形成CDI胺基甲酸醋中間體及使CDI胺基 甲酸酯中間體與蛋白質上之胺基進行偶合。 在一實施例中’在調配之前’自肺炎鏈球菌單獨純化每 一肺炎球菌莢膜多醣抗原’實施活化以形成反應性醛，且 然後使用還原胺化共價接合至載體蛋白CRM,97。 使莢膜多醣與載體蛋白接合後，可藉由多種技術中之一 或多者來純化多醣-蛋白質接合物（相對於多醣_蛋白質接合 物之量進行富集）。該等技術之實例對於熟習此項技術者 而言已眾所周知且包含濃縮/透析作業、超濾、沉澱/洗 脫 '管柱層析、及深層過濾。參見（例如）美國專利第 6，146,902 號。 醫藥/疫苗組合物 本發明進-步提供包含醫藥、免疫原性及疫苗組合物在 内的組合物，其包括15種不同多醣·蛋白質接合物以及醫 藥上可接受之載劑及佐劑、基本上由其組成、或（另一選 擇為)由其組成’纟中接合物中之每一者皆含有接合至載 體蛋白之不同英膜多酿’且其中該等莢膜多醣係自肺炎鍵 球菌之血清型 1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、i8C、 19八、19卜22卜抓及331?製得。該等肺炎球菌接合物可 153623.doc •12· 201136603 藉由分開之方法製得並可將其整體調配成單劑量調配物。 本文所定義之「佐劑」係用於增強本發明免疫原性組合 物之免疫原性的物質。免疫性佐劑可增強對於抗原之免疫 應答（在單獨投與時之免疫原性較弱，例如並不誘導或誘 導較弱之抗體效價或細胞調介之免疫應答），增加對於抗 原之抗體效價’及/或降低在個體中有效達成免疫應答之 抗原劑量。因此，佐劑常用於加強免疫應答且為熟習此項 技術者所熟知。可增強組合物效力之適宜佐劑包含但不限 於： (1) 鋁鹽（明礬），例如，氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等； (2) 水包油型乳液調配物（含有或不含其他特定免疫刺激 劑’例如胞壁醯肽（如下文所定義）或細菌細胞壁組份），例 如’（a) MF59(國際專利申請公開案第WO 90/14837號），含 有5%角鯊烯、〇·5% Tween 80、及0.5% Span 85(視需要含 有不同量之MTP-PE)，其係使用微射流機（例如ιιογ型微 射流機（Microfluidics，Newton，MA))調配成亞微米顆粒， (b) SAF ’含有1 〇%角鯊稀、0.4% Tween 80、5%普流尼克 (pluronic)封阻之組合物L121、及thr-MDP，其係微流化成 亞微米乳液或經渦旋以產生較大粒徑之乳液，（c) RibiTM佐 劑系統（RAS)，（Corixa，Hamilton，MT)，含有 2% 角鯊烯、 0.2% Tween 80、及一或多種細菌細胞壁組份（來自由美國 專利第4,912,094號中所述之3-0-脫醯基單磷醯脂質A (MPL™)、海藻糖二黴菌酸酯（TDM)、及細胞壁支架（CWS) 組成之群，較佳為 MPL + CWS (Detox™));及（d) Montanide 153623.doc •13- 201136603 ISA ； (3) 皂苷佐劑，例如可使用QUH a或STIMULONtm qS_21 (Antigenics，Framingham, MA) (參見（例如）美國專利第 5,057,540號）或自其產生之顆粒，例如18(：〇1^(由膽固醇、 皂苷、磷脂、及兩親性蛋白之組合形成之免疫刺激性複合 物）及Iscomatrix®(與ISCOM具有大致相同之結構但不含蛋 白質）； (4) 細菌脂多醣、合成脂質a類似物’例如胺基烷基葡糖 胺磷酸酯化合物（AGP)、或其衍生物或類似物，其可購自 Corixa且闡述於美國專利第6，113,918號中；一種此類AGp 係2-[(R)-3-十四醯基氧基十四醯基胺基]乙基2·去氧_4_〇_ 磷醯基-3-0-[(R)-3-十四醯基氧基十四醯基]·2_[(κ)_3__十四 醯基氧基十四醯基胺基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其亦稱作 529(先則稱作RC529)，其係調配成水溶液形式或穩定乳液 (5) 合成多核苷酸’例如含有CpG基元之募核苷酸（美國 專利第6,207,646號）；及 (6) 細胞因子’例如’介白素（例如，IL-1、IL_2、IL_4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18等）、干擾素（例 如，γ干擾素）、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM_CSF)、 巨嗔細胞集落刺激因子（M-CSF)、腫瘤壞死因子（tnF)、協 同刺激分子B7-1及B7-2等；及 (7) 補體’例如補體組份C3d之三聚體。 在另一實施例中，佐劑係2種、3種、或更多種上述佐劑 之混合物，例如，SB AS2(亦含有3-脫醯基單磷醯脂質八及 153623.doc 14 201136603 QS21之水包油型乳液）。 胞壁醯肽包含但不限於N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇胺醯基 -D-異麩胺醯胺（thr-MDP)、N-乙醯基-降胞壁醯基-L-丙胺 酸-2-(Γ-2’二棕櫚醯基-sn-甘油-3-羥基磷醯基氧基）-乙胺 (MTP-PE)等。 在某些實施例中，佐劑係鋁鹽。鋁鹽佐劑可為明礬沉澱 性疫苗或明礬吸附性疫苗。鋁鹽佐劑在業内已眾所周知且 闡述於（例如）Harlow，E.及 D· Lane (1988 ; Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory)及 Nicklas, W. (1992 ; Aluminum salts. Research in

Immunology 143 :489-493)中。#呂鹽包含但不限於水合氧化 鋁、氧化鋁水合物、氧化鋁三水合物（ATH)、鋁水合物、 紹三水合物、銘膠、Superfos、Amphogel、氫氧化在呂 (III)、羥基磷酸硫酸鋁（磷酸鋁佐劑（APA))、非晶型氧化 鋁、三水合氧化鋁、或三羥基鋁。 APA係羥基磷酸鋁之水性懸浮液。APA係藉由摻和體積 比為1:1之氣化鋁與磷酸鈉以使羥基磷酸鋁沉澱來製得。 摻和過程後，使用高剪切混合器來減小材料之尺寸以達成 2-8 μιη範圍之目標聚集體粒徑。然後針對生理鹽水將產物 透析並實施蒸汽滅菌。 在某些實施例中，使用市售Α1(ΟΗ)3(例如，Alhydrogel 或 Superfos，Denmark/Accurate Chemical and Scientific公 司，Westbury, NY)以50-200 g蛋白質/mg氫氧化I呂之比率 來吸附蛋白質。在另一實施例中，蛋白質吸附取決於蛋白 153623.doc 15 201136603 質之pl(等電點pH)及培養基之pH。具有較低pi之蛋白質在 帶正電鋁離子上之吸附強於具有較高pi之蛋白質。鋁鹽可 建立Ag儲積物’其經2-3週時間緩慢釋放，參與巨噬細胞 之非特異性活化及補體活化，及/或刺激先天性免疫機制 (可能經由尿酸刺激來達成）。參見（例如）Lambrecht等人， 2009，Curr Opin Immunol 21:23。 通常將單價本體水性接合物摻和至一起並稀釋至8 gg/mL之目標濃度（對於所有血清型而言，但6B除外，其係 稀釋至16 pg/mL之目標濃度）。稀釋後，立即對批料實施 過/慮滅菌，且以無菌方式添加等體積之填酸|呂佐劑以獲得 250 pg/mL之最終目標銘濃度。將佐劑化之經調配批料填 充至一次性0.5 mL/劑量小瓶中。 在某些實施例中，佐劑係含CpG之核苷酸序列，例如， 含CpG之券核苷酸，特定而言係含CpG之寡脫氧核苷酸 (CpG ODN)。在另一實施例中’佐劑係〇dn 1826，其可自 Coley Pharmaceutical Group獲得。 「含CpG之核苷酸」、「含CpG之寡核苷酸」、「CpG募核 苦酸j及相似術語係指長度為6_50個核苷酸且含有未曱基 化CpG部分的核苷酸分子。參見（例如）Wang等人，2〇〇3， Vaccine 21:4297。在另一實施例中’意欲涵蓋術語在業内 可接受之任一其他定義。含CpG之寡核苷酸包含使用任— 合成核苷間連接、經修飾鹼基及/或經修飾糖之經修飾募 核苷酸。 使用CpG寡核苷酸之方法在業内已眾所周知，且闡述於 153623.doc .16· 201136603 (例如）Sur等人，1999，J Immunol. 162:6284-93 ; Verthelyi 2006, Methods Mol Med. 127:139-58 ;及 Yasuda 等人， 2006，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 23:89-110 中。 投與/劑量 本發明之組合物及調配物可用於藉助經由全身或黏膜途 徑投與疫苗來保護或治療易受肺炎球菌感染之人類。在— 實施例中，本發明提供用於誘導針對肺炎鏈球菌莢膜多酶 接合物之免疫應答的方法，該方法包括向人類投與免疫有 效量之本發明免疫原性組合物《在另一實施例中，本發明 提供向人類接種疫苗以抵抗肺炎球菌感染之方法，其包括 向人類投與免疫有效量之本發明免疫原性組合物的步驟。 本發明組合物之「有效量」係指可誘發在隨後攻擊期間 可顯著減小肺炎鏈球菌感染之可能性或嚴重程度之抗體的 所需劑量。 本發明方法可用於預防及/或減輕由肺炎鏈球菌引起的 主要臨床症狀，包含侵襲性感染（髓膜炎、肺炎、及菌血 症）、及非侵襲性感染（急性中耳炎、及竇炎）。 本發明組合物之投與可包含以下方式中之一或多者：經 由肌内 '腹膜腔内、皮内或皮下途徑注射；或經由黏膜向 口腔/ &道、呼吸道或泌尿生殖道投與。在一實施例中， 使用鼻内投與來治療肺炎或中耳炎（此乃因可更有效地防 止肺炎雙球菌的鼻咽運輸，從而減弱早期階段之感染” 對每一疫苗劑量中接合物之量應加以選擇，該量應能夠 誘導免疫保護反應且無明顯副作用。該量可端視肺炎球菌 I53623.doc 201136603 血清型而有所變化。通常，每_劊 劑重I括0·1至1〇〇 pg之母 一多醣、尤其0.1至1〇 Rg、且承屮甘 μδ見更尤其而έ 1至5 pg 〇舉例而 言，每一劑量可包括 100、150、200、250、300、400、 500、或 750 ng或 1、h5、2、3、4、5、6、7、7 5、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、25、 30、40、5〇、60、70、80、9〇、或 1〇〇μ§。 特疋疫苗中各組份的最佳量可藉由標準研究來確定其 中涉及觀察個體之適當免疫應答。舉例而言，在另一實施 例中，藉由自動物研究外推至人類數據來確定用於人類疫 苗接種之劑量。在另一實施例中，根據經驗來確定劑量。 在一實施例中’鋁鹽之劑量為10、15、20、25、30、 50 、 70 、 100 、 125 、 150 、 200 、 300 、 500 、或700 、或 1、1.2、1.5、2、3、5 mg或更高。在又一實施例中，上述 明馨鹽之劑量係以每pg重組蛋白計。 在本發明之一特定實施例中，PC V-1 5疫苗係單獨接合至 CRM197之血清型 1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、 18C、19A、19F、22F、23F及33F肺炎球菌莢膜多醣的無 菌液體調配物。將每一 0.5 mL劑量調配成含有：2 pg之每 種醣類，6B除外，其係4 gg ;約32 pg CRM197載體蛋白（例 如 32 pg±5 pg、土3 pg、±2 pg、或 ±1 pg) ; 0.125 mg 元素铭 (0.5 mg磷酸鋁）佐劑；及氣化鈉與L-組胺酸緩衝液。氣化 鈉濃度為約 150 mM(例如 150 mM±25 mM、±20 mM、±15 mM、±10 mM、或 ±5 mM)及約 20 mM(例如 20 mM±5 mM、 ±2.5 mM、±2 mM、土1 mM、或 ±〇.5 mM)之 L-組胺酸 153623.doc • 18 - 201136603 緩衝液。 根據本發明任一方法且在一實施例中，個體係人類。在 某些實施例中，人類患者係嬰兒（小於i歲年齡）、幼童（約 12至24個月）、或幼兒（約2至5歲）。在其他實施例中，人類 心者係老年患者（>65歲）。本發明組合物亦適用於大齡兒 童、青少年及成人（例如18至45歲或18至65歲年齡）。 在本發明方法之一實施例中，以單次接種方式來投與本 發明組合物。在另一實施例中，以適當間隔來投與疫苗2 次、3次或4次或更多次。舉例而言，可以1、2 ' 3、4、 5、或6個月之間隔或其任一組合來投與組合物。免疫時間 表可遵循指定用於肺炎球菌疫苗者。舉例而言，針對由肺 炎鏈球菌引起之侵襲性疾病用於嬰兒及幼童的常規方案為 2 4、6及12-15個月年齡。因此，在一較佳實施例中，以 4-劑量系列形式在2、4、6、及12-1 5個月年齡時投與組合 物。 本發明組合物亦可包含一或多種來自肺炎鏈球菌之蛋白 質。適於納入之肺炎鏈球菌蛋白質的實例包含彼等在國際 專利申請公開案第WO 02/083855號及第WO 〇2/〇53761號 中所識別者。 調配物 可藉由一或多種熟習此項技術者已知之方法將本發明組 合物投與個體並由此進行調配，該投與方法係（例如）非經 腸、經黏膜、經皮、肌内、靜脈内、皮内、鼻内、皮下、 腹膜腔内。 153623.doc •19· 201136603 在一實施例中，經由表皮注射、肌内注射、靜脈内、動 脈内、皮下注射、或呼吸黏膜内注射液體製劑來投與本發 明組合物。注射用液體調配物包含溶液及諸如此類。 可將本發明組合物調配成單一劑量小瓶、多劑量小瓶或 預填充注射器。 在另一實施例中，經口投與本發明組合物，且由此調配 成適於經口投與之形式，亦即，固體或液體製劑。固體口 服調配物包含錠劑、膠囊、丸劑、顆粒、丸粒及諸如此 類。液體口服調配物包含溶液、懸浮液、分散液、乳液、 油及諸如此類。 ---^ 、外片Ί/丁、小，「王驭非水十生 溶液、懸浮液、乳液或油。非水性溶劑之實例係丙二醇、 聚乙二醇、及可注射之有機醋(例如油酸乙醋”水性載劑 包含水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包含鹽水及經緩衝 之介質^之實例係動物、植物、或合成來源之彼等油， 化生油 '大豆油、撤揽油、向曰婆油、魚肝油、另 產油、或來自牛奶或雞蛋之脂質。 醫藥組合物可具有等滲、 ^ ^^ 戍问滲性。然而，通常用 :或注射之醫藥組合物在投與時，基本上呈等滲性較 佳。因此，為進行儲存 1寻芩I·生較 佳。#,、、 α物呈等滲或高滲性較 住右醫樂組合物呈高渗性以用於 釋，變成等滲溶液。 、，1丨在投與前其稀 等滲劑可為離子型等渗劑（例如 如碳水化合物）。離子 「或非離子型等滲劑(例 4渗劑之實例包含但不限於 153623.doc 201136603

Naa、CaCl2、仍及MgCl2。非離子型等滲劑之實例包含 但不限於甘露醇、山梨醇及甘油。 亦較佳地’至少一種醫藥上可接受之添加劑係緩衝劑。 出於-些目的’舉例而言，纟醫藥組合物意欲用於輸注或 /主射時’通常期望組合物包括緩衝劑，該緩衝劑能夠將溶 液緩衝至pH介於4至10之間，例如5至9，例如6至8。 緩衝劑可（例如）選自由以下組成之群：TRIS、乙酸鹽、 麩胺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、磷酸鹽、檸樣 酸鹽、碳酸鹽、甘胺酸鹽、組胺酸、甘胺酸、琥珀酸鹽： 二乙醇胺緩衝劑。 緩衝劑可進一步（例如）選自用於非經腸用途之usp相容 緩衝劑，特定而言，在醫藥調配物用於非經腸用途時。舉 例而言，緩衝劑可選自由以下組成之群：一元酸，例如乙 酸、苯甲酸、葡萄糖酸 '甘油酸及乳酸；二元酸，例如烏 頭酸、己二酸、抗壞血酸、碳酸、麵胺酸、蘋果酸、琥珀 酸及酒石酸；多元酸，例如檸檬酸及磷酸；及鹼，例如 氣、一乙醇胺、甘胺酸、三乙醇胺、及tris。 非經腸媒劑（用於皮下、靜脈内、動脈内、或肌内注射） 包含氯化鈉溶液、林格氏（Ringer，s)右旋糖、右旋糖及氯化 鈉、乳酸林格氏液及不揮發油。靜脈内媒劑包含流體及營 養素補充劑、電解質補充劑（例如彼等基於林格氏右旋糖 者）、及諸如此類。實例係無菌液體，例如水及油，其中 添加或不添加表面活性劑及其他醫藥上可接受之佐劑。一 般而言’水、鹽水、水性右旋糖及相關糖溶液、二醇（例 I53623.doc 201136603 如丙二醇？^取7 ^ 不乙二醇）、及聚山梨醇酯80係較佳液體載 齊J尤其用於可注射溶液。油之實例係動物〇 成來源之彼等油，例如，花生油、大豆油、撖榄油、向二 葵油”:、肝’由、另一海產油、或來自牛奶或雞蛋之脂質。 本發明調配物亦可含有表面活性劑。較佳表面活性劑包 含但不限於：聚氧乙烯山梨醇Sf S旨表面活性劑（統稱為 TWeen)，尤其聚山梨醇酯20及聚山梨醇酯80 ;環氧乙烷 (EO)、環氧丙院（P〇)、及/或環氧丁烧（B〇)之共聚物以 DOWFAXtm商品名出售，例如線性E〇/p〇嵌段共聚物；辛 本曰醇八重複乙氧基（氧基-1,2 -乙烧二基）基團之數量可 有所k化，其中辛苯昔醇^彳丁士⑽χ_1〇〇、或第三辛基苯 氧基聚乙氧基乙醇）尤其令人感興趣；（辛基苯氧基）聚乙氧 基乙醇（IGEPAL CA_63G/Np肩）；峨脂，例如碟脂酿膽驗 (卵破月曰），乙氧基壬基苯酌·，例如TergitolTM NP系列；衍 生自月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇及油醇之聚氧乙烯脂肪醚 (稱作Brij表面活性劑），例如三乙二醇單月桂基醚⑺4 30)，及山梨醇酐酯（統稱為SPAN)，例如山梨醇酐三油酸 酯（Span 85)及山梨醇酐單月桂酸酯。乳液中所包含之較佳 表面活性劑係Tween 80(聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯）。 可使用表面活性劑之混合物，例如Tweeil 80/Span 85混 合物。聚氧乙稀山梨醇酐醋（例如聚氧乙烯山梨醇野單油 酸酯（Tween 80))與辛苯昔醇（例如第三·辛基苯氧基聚乙氧 基乙醇（Triton X-100))之組合亦適宜。另一有用組合包括 月桂醇聚醚（laureth)9加聚氧乙烯山梨醇酐酯及/或辛苯昔 I53623.doc •22· 201136603 醇。 表面活性劑之較佳量（重量％)為：聚氧乙烯山梨醇針醋 (例如Tween 80)為0.01_1%，尤其為約〇1 %;辛基或壬基 苯氧基聚氧基乙醇(例如Trit〇n χ_1〇〇,或T—n系列中之 其他洗務劑）為0.001_0.1%，尤其為〇〇〇5〇〇2%;聚氧乙 稀驗（例如月桂醇聚，）狀㈣％、較佳“Μ %且尤其 為 0.1 -1 °/。或約 〇. 5 〇/〇。 在另-實施例中’以受控釋放系統來遞送醫藥組合物。 舉例而言，可使用靜脈内輸注、經皮貼片、脂質體、或其 他投與模式來投與藥劑。在另-實施例中，使用聚合材 料；例如，存於微球體或植入體中。 發月亦/函蓋藉由共價連接水溶性聚合物來進行修飾之 口物°亥等水'容性聚合物係（例如）聚乙二醇、聚乙二醇 二醇之共聚物、羧曱基纖維素、右旋糖酐、聚乙烯 户聚乙烯基也咯啶酮或聚脯胺酸。該等修飾可增加化合 物=水=液中之溶解度，消除聚集，增強化合物之物理及 化子穩疋性，且大大減小化合物之致反應力。在另一實施 彳中藉由與未經修飾化合物相比以較小頻率或較低劑量 投與該等聚合物化合物加合物來達成期望之活體内生物 ， 活性。 在一較佳實施例中，使用氯化納將疫苗組合物調配於L- 組胺酸緩衝液中。 、、隨附之說明及圖式闡述本發明之各個實施例後，應 解本發明it不限於彼等確切之實施例，i B習此項技 153623.doc -23- 201136603 術者可在本文中實施各種改變及修改，此並不背離如隨附 申請專利範圍所定義之本發明的範圍或精神。 下列實例闡釋但並不限制本發明。 實例 實例1 :肺炎鏈球菌莢膜多醣之製備 培養肺炎球菌之方法在業内已眾所周知。參見（例如） Chase, 1967, Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52。製備肺炎球菌莢膜多醣之方法在業内亦已眾所周 知。參見（例如）歐洲專利第EP0497524號。肺炎球菌亞型 分離物可自ATCC獲得。 細菌識別為在血瓊脂上為α溶血性之包膜性、非運動 性、革蘭氏陽性（Gram-positive)柳葉刀型雙球菌。基於 Quelling反應使用特異性抗血清使亞型進行分化。參見（例 如）美國專利第5,847,112號。 細胞庫 自 Merck Culture Collection (Rahway, NJ)在冷凍小瓶中 獲得代表PC V-15中所存在每一肺炎鍵球菌血清型的細胞庫 接種 將解凍之晶種培養物轉移至含有適當經預滅菌生長培養 基之晶種發酵器中。 晶種發酵 在受控溫度及pH下於晶種發酵器中生長培養物。將晶種 發酵器之全部體積轉移至含有經預滅菌生長培養基之生產 發酵器中。 153623.doc 24· 201136603 生產發酵

控制溫度、pH 生產發酵係該過程之最終細胞生長階段 及攪動速率》 鈍化 耘。鈍化後，將批料轉移 於受控之溫度及搜動下。 經由添加鈍化劑來終止發酵過 至鈍化箱中，在此將該批料保持 純化 使用離心與過濾之組合去除 « ....妙a主 …I碎片。對批料實施超濾 及透析。；·，後使批料經受溶劑基㈣^除雜質並回 酶。 實例2 :肺炎球菌多醣_CRM]97接合物之製備 活化方法 使用常見製程流程將不同血清型醜單獨接合至經純化 CRM197載體蛋白上。在此製 ’ 你此I紅中，將醣溶解，將尺寸設定 為目標分子質量，以化學方式活化並藉由超濾更換緩衝 液。然後使經純化CRM197與經活化醣接合且藉由超遽純化 所得接合物，然後實施最終之0.2 μιη膜過濾。每一步驟内 之若干製程參數（例如ρΗ、溫度、濃度、及時間）具有血清 型特異性，如此實例中所述。 步驟1 :溶解 將經純化多醣溶於水中直至濃度為2_3 mg/mL。使溶解 之多醣流經壓力預設為0_1000巴之機械均質器。減小尺寸 後’濃縮醣並使用無菌水在1〇 kDa MWCO超據機上透析。 棄去滲透物且使用乙酸鈉緩衝液將滯留物調節至ρΗ為 153623.doc -25· 201136603 4.1 ’最終濃度為50 mM。對於血清型4及5，使用pH為5.0 之100 mM乙酸鈉。對於血清型4，在50°C ±2t下培育溶 液。藉由冷卻至20-24°C來停止水解。 步驟2 :高碘酸鹽反應 使用總醣含量來確定肺炎球菌醣活化所需之高碘酸鈉的 莫耳當量°在充分混合下’在20-24t下（對於所有血清 型，血清型5、7F、及19F除外，其溫度為2_6°c )實施3_2〇 個小時之氧化。 步驟3 :超濾 濃縮經氧化酿並使用pH為6.4之1 〇 mM填酸钾（對於血清 型5，使用pH為4_3之10 mM乙酸鈉）在1〇 kDa MWC〇超濾 機上貫施透析。棄去滲透物且藉由添加3 M磷酸鉀緩衝液 將滯留物調節至pH為6.3-8.4。 接合方法 步驟1 :接合反應 以0.2-2對1之投料配比使經濃縮醣與CRM…載體蛋白混 合。經由0·2μπι過濾器過濾摻和之醣_CRM】97混合物。 藉由添加氰基硼氫化鈉溶液達成每莫耳醣含有18_2 〇莫 耳氰基硼氫化鈉來引發接合反應。胳 、 八你。將反應混合物在2〇_ 24。(：下（對於血清型3、5、6A、7F、1QA u…以 19A、及 19F為 8-12t：) 培育48-120小時》 步驟2:硼氫化物反應 在接合培育結束時，將反應現合物調節至4_代，且使 用1.2 Μ碳酸氫納緩衝液或3 _酸鉀緩衝液將pH調節至^ 153623.doc •26· 201136603 1〇(血清型5除外）。藉由添加硼氫化鈉溶液達成每莫耳醣含 有0.6-1.0莫耳硼氫化鈉（對於血清型5，添加〇莫耳硼氫化 物）來停止接合反應。將反應混合物培育45_6〇分鐘。 步驟3 :超濾步驟 使用最少20體積之1〇〇 mM磷酸鉀（pH 8·4)緩衝液在100 kDa MWCO超濾機上對反應混合物進行透析。在 下，在300 kDa MWCO超濾機上使用最少20透析體積之15〇 mM氣化鈉對來自1〇〇 kDa超濾機之滞留物進行透析。棄去 滲透物。 步驟4 :無菌過濾 經由0.2 μηι過濾器過濾來自300 kDa MWCO透析之滯留 物，且以適宜體積填充至硼矽酸鹽玻璃容器中以供進行釋 放測试、過程控制及調配（血清型19F除外）。使血清型19F 接合物經過〇·2 μηι過濾器進入儲料箱中並在2〇-24°C下培 育。培育後，在20-24°C下，在3 00 kDa MWCO超濾機上使 用最少20透析體積之150 mM氣化鈉對接合物進行透析。 棄去滲透物，且經由0.2 μιη過濾器過濾滞留物並以適宜體 積填充至硼矽酸鹽玻璃容器中以供進行釋放測試、過程控 制、及調配。在2-8°C下儲存最終本體濃縮物。 實例3 : 1 5價肺炎球菌接合物疫苗之調配 根據批料體積及本體醣濃度來計算所需本體濃縮物之體 積。藉由添加含有氯化鈉及L-組胺酸（PH為5.8)之緩衝液將 合併之15種接合物進一步稀釋至目標吸附濃度。充分混合 後，經由0.2 μιη膜對摻合物實施無菌過滤。在與本體磷酸 153623.doc -27- 201136603 鋁摻和期間及之後輕輕地混合經調配之無菌本體。在2-8°C下儲存經調配疫苗。 在一替代性方法中，藉由添加含有氣化鈉及L-組胺酸 (pH為5.8)之緩衝液將合併之15種接合物進一步稀釋至目標 濃度。向經稀釋之緩衝接合物混合物中添加聚山梨醇酯80 直至最終濃度為0.005%，然後實施無菌過濾。無菌過濾 後，在2-8°C下儲存經調配疫苗。 表1展示佐劑化及非佐劑化形式PC V-1 5之最終組成。 表1 :佐劑化及非佐劑化15-價肺炎球菌接合物疫苗調配 物之組成 化學調配物，單位/0.5 mL劑量 成份闡述 佐劑化PCV-15 非佐劑化PCV-15 總共32 pg多_ 總共32 pg多聽 (各2pg下列多 醋血清型：1、 (各2pg下列多 醣血清型： 卜 3、4、5、 6A、7F、 9V、14、 18C、19A、 19F、22F、 3、4、5、6A、 活性成份 肺炎球菌多醣 抗原 7F、9V、14、 18C、19A、 19F、22F、 23F、33F ; 23F、33F ; 4 pg血清型6B 多醣） 4 pg血清型6B 多耱） 載體蛋白crm197 約 32 約 32μ§ 153623.doc -28· 201136603 其他成份 鋁〜g)a 125 0 聚山梨醇酯-80 ㈣） 0 2.5 L-組胺酸(mM) 20 20 氣化鈉(mM) 150 150 注射用水 Q.S.b Q.S.b aAPA中元素鋁之量。b定量補足至0.5mL。 實例4 :免疫原性研究 設計實驗以在幼小恒河猴（IRM)及新西蘭白兔（New Zealand White Rabbits)(NZWR)動物模型中評估多種肺炎 球菌接合物疫苗調配物之免疫原性。將幼小恒河猴中之實 驗設計為密切匹配在美國針對肺炎球菌接合物疫苗所推薦 之時間表，其中所給定之幼小恒河猴系列為2、4、及6個 月年齡。因此，在2-3個月年齡時對幼小恒河猴進行免疫 並以2個月之間隔投與疫苗。並不投與亦係推薦用於美國 兒童之時間表之一部分的第4劑量。使用成年兔（NZWR)來 評估多種疫苗調配物。使用在加速（2週間隔）免疫方案中給 出之兩個疫苗劑量來實施NZWR研究。對於免疫應答之臨 床前評估，向兔遞送全人類劑量，而使幼小猴接受半人類 劑量。選擇半人類劑量用於幼小猴之原因在於在單一肌内 位點可投與幼小恒河猴之體積受限。 血清型-特異性IgG反應之評估 使用利用在電化學刺激時會發光之SULFO-TAG™標記的 153623.doc -29- 201136603

Meso Scale Discovery (MSD)技術，根據人類分析法來研 發多工電致化學發光（ECL)分析，用於兔及恒河猴血清。 參見 Marchese 等人，2009，Clin Vaccine Immunol 16:387-96。使用專用ECL板讀數儀，將電流施加於與板連接之電 極兩端，從而產生可引起發光信號之一系列電誘導反應。 研發及驗證中所用之多斑點構造係96孔板模式中之1 〇斑點/ 孔’且每一孔皆塗覆有5 ng肺炎球菌（Pn)多醣（Ps)/斑點。 使用雙板模式來確保在分開之板中測試多醣之交叉反應 (亦即，6A與6B、及19A與19F)。板模式1含有血清型3、 4、6B、9V、14、18C、19F、及23F，而板模式2含有血清 型1、5、6A、7F、19A、22F及33F。每一孔亦含有兩個牛 血清白蛋白（BSA)斑點，使用該等斑點來評估分析之背景 反應性（亦即’在不存在PnPs時，與企清及經標記二級抗 體有關之反應）。將分析標準（89SF-2)、對照及測試血清在 磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)(含有0.05% Tween 20、1% BSA、5 gg/ml C-多醣（CPs)、10 gg/ml血清型 25 多醣（PnPs25)及 10 pg/ml血清型72多醣（PnPs72))中稀釋至適當含量，且在 4°C (2-8°C )下培育過夜或在環境溫度下培育45分鐘。在測 試幼小猴試樣時，使用人類抗體試劑及標準，而在測試兔 血清試樣時，使用SULFO-TAGTM標記之抗兔igG作為二級 抗體。每一經抗原塗覆板在環境溫度下於振盪器平臺上， 與封阻劑培育1小時。使用0.05% pbs_t洗滌板，且向每孔 添加2 5 pL預吸附且稀釋之測試血清，並在環境溫度下於 振盪器平臺上培育45 min。使用〇_〇5% PBS-Τ洗滌板，且然 153623.doc •30- 201136603 後向各孔中添加MSD SULFO-TAGTM標記-山羊抗人類IgG 二級抗體（針對恒河猴血清）及經標記之山羊抗兔IgG二級 抗體（針對兔血清），並在環境溫度下於振盪器平臺上培育】 小時。使用0.05〇/。PBS-T洗滌板，且向各孔中添加15〇吣依 1:4稀釋於水中之MSD Read Buffer_T 4X(含有表面活性 劑）。使用第2400或6000號型MSD Sector Imager對板進行 讀數。兔之研究結果係以幾何平均效價（Gmt)或GMT比率 表示。幼小恒河猴之研究結果係以自使用指定給人類參考 才示準（89 SF-2)之血清型特異性IgG濃度之標準曲線讀取的 幾何平均濃度表示。 功能（調理呑噬）反應之評估 在4-工ΜΟΡΑ分析（MOPA-4)中測試來自幼小恒河猴研究 2之試樣。參見Burton等人，2006，Clin Vaccine lmmun〇i 13:1004-9。該分析使用經選擇抵抗4種抗生素中之一者之 細菌菌株，從而使分析之第一部分（調理並攝取至分化之 HL-60細胞中）每次可使用多達4種血清型來實施。在抵抗 相應菌株之4種抗生素中之每一者存在下，並行讀出細菌 殺傷以測定每一特異性血清型之殺傷效價。將結果表示為 觀察到50%殺傷之稀釋度的倒數（内插後）。 臨床前研究之統計學方法 兩種動物模型皆具有樣本量限制。一般而言，每個研究 組（study arm)使用8只幼小猴或8只兔。在每組具有8只動 物時，若治療組間幾何平均效價之臨界倍數差值為25倍 即可視為顯著反應閾值。基於以下假設來確定2.5倍差 153623.doc -31 · 201136603 值：對於每一血清型，治療組内自然對數轉換效價之標準 偏差為ln(2)。使巧表示第丨治療組中ιη轉換效價之平均值， 〜係第1治療組内動物之數量，aj2係第丨治療組内各動物中 In轉換效價之已知方差，且設定對於所有i而言ni=8且 σ^=(^η(2))2 ’則藉由對求解來獲得25之值，其中

，且Z〇_995表示標準正態累積分佈之倒數，其 中概率為0.995(亦即，Ζ0·995=2·576)。應注意，將2·44之計 算值舍入為2_5，此乃因2·5亦可方便地作為〇.4之倒數。 幼小恒河猴（IRM)對於PCV-15之血清型特異性反應 實施試驗性免疫原性研究（IRM-1)以確定幼小恒河猴 (IRM)是否係評估pn多醣CRMw接合物疫苗之良好模型。 貫驗之主要目標係確定IRM(如同人類嬰兒）是否對游離pn 多醣無反應但對接合物疫苗反應良好。在2-3個月年齡時 開始向5只IRM之組注射Pn多聽、Prevnar®或PCV-1 5。以2 個月間隔經肌内（IM)投與3個疫苗劑量，且在第一劑量之 前及在第2劑量後1個月時及第3劑量後1個月時使用多陣列 電致化學發光（ECL)分析來量測血清型特異性igG反應（數 據未顯示）。 結果表明，IRM對游離Pn多膽反應較差（若存在）但對接 合物疫苗反應相當良好。結果表明’在幼小恒河猴中對於 Pn多醣之IgG反應的誘導取決於多醣與載體蛋白之接合， 且由此係典型之T-細胞依賴性反應。因此，irm模型經測 定適用於評估PCV-15調配物。 153623.doc • 32· 201136603 實施第二研究（IRM-2)以評估PCV-15之調配物，其使用 本體接合過程以將游離（未接合）多醣及未接合CRM197減至 最少。圖1展示針對PCV-1 5與Prevnar®(針對Prevnar®中所 含之 7種血清型（4、6B、9V、14、18C、19F、23F))之第 2 劑量後（PD-2)及第3劑量後（PD-3) IgG反應。對於幾乎所有 血清型，對於PC V-15之PD-2反應等效於或略低於對於 Prevnar®之相應反應，而對於PCV-15之PD-3反應稍高於彼 等由Prevnar®引起者。 對於PCV-1 5中之非Prevnar血清型之IRM反應示於圖2 中。對於PCV-1 5中之非Prevnar血清型之PD-2反應皆至少 為基線（疫苗接種前）IgG濃度的10倍，且效價在PD-3時繼 續升南。 結果表明，對於7種共同血清型而言，針對PC V-1 5及 Prevnar®之抗體反應相當，且對於8種額外血清型而言，針 對PCV-15之疫苗接種後反應係基線之10倍以上。 IRM對於PCV-15之功能（調理吞噬）免疫應答

為確定PC V-1 5是否會在幼小猴中誘導功能抗體反應，在 來自IRM-2之血清上實施調理吞噬殺傷（OPA)分析。對於 ?(：¥-15及？代乂仙，之疫苗接種前、？0-2、及？0-3反應示於 表2中。所示結果係在一式雙份所分析之每個時間點時來 自7-8只猴中血清試樣之GMT。亦展示在PD-3時間點時之 反應者百分比（亦即，彼等OPA效價>8者）。對於除1及33F 型外之所有血清型，PCV-15會誘導較高PD-2 GMT。投與3 個疫苗劑量後，PC V-15對於每一血清型皆誘導較高OPA 153623.doc -33- 201136603 GMT且對於疫苗中所含之所有15種血清型皆誘導100%之 OPA反應速率。應注意，PCV-15亦對於疫苗中不存在之血 清型6C誘導良好之交叉反應性OPA反應。對於疫苗中所含 之所有血清型，Prevnar®可誘導較高OPA效價及100%反應 速率，但其在一部分猴中對於血清型6A及6C誘導僅較弱 之交叉反應性反應。

表2 :使用PCV-15或Prevnar®接種疫苗後幼小恒河猴中 之血清型特異性OPA GMT (疫苗接種前、PD-2、及PD-3幾何平均效價及效價28之 PD-3反應者百分比）

Prevnar PCV-15 疫苗 PD-3反應者 疫苗 PD-3反應 血清型 接種前 PD-2 PD-3 (效價> 8) 接種前 PD-2 PD-3 者(效償2 8) 1 n_d. n.d. n.d. n.d. 4 65 340 100% 3 n.d. n.d. n.d. n.d. 5 1442 1548 100% 4 4 11459 5004 100% 4 5280 3453 100% 5 4 4 4 0% 4 1879 1719 100% 6A 4 21 113 57% 4 1188 7807 100% 6B δ 8294 6043 100% 4 2477 9601 100% 6C 4 11 16 29% 4 1038 5134 100% 7F 4 4 71 43% 4 7541 10092 100% 9V 4 1779 748 100% 4 625 1297 100% 14 8 12395 7782 100% 4 11366 9891 100% 18C 4 5571 1718 100% 4 1934 1701 100% 19A 4 15 4 0% 4 2210 1895 100% 19F 4 1365 432 100% 4 2555 4021 100% 22F n.d· n.d. n.d. n.d. 4 2489 7298 100% • 34· 153623.doc 201136603 23F 4 1789 2126 100% 4 3093 2465 100% 33F n.d. n.d. n.d. n.d· 4 14 11548 100% 注意：Prevnar之所含之血清型為黑體。關於血清型6C之結果以斜體示出， PCV-15 中。 n.d.未測定 此乃因該血清型並不含於 PCV-15調配物在新西蘭白兔中之評估 使用簡潔免疫方案在成年新西蘭白兔（NZWR)之4組研究 中評估PCV-15調配物，其中使該等兔在第0天及第14天接 受全人類劑量之疫苗，且在第0、14及28天收集血清用於 分析。所有研究皆以Prevnar®作為基準，且如表3(NZWR 實驗1-4)中所匯總。 關於新西蘭白兔之第2劑量後反應之結果示於表3中，其 表示為對於各疫苗中之共有血清型關於Merck PC V-1 5及 Prevnar®之幾何平均IgG反應的比率。 表3 在NZWR中測試之主要PCV-1 5調配物之第2劑量後IgG反 應比率（PCV-15 : Prevnar™) 血清型 NZWR-1 NZWR-2 NZWR-3 NZWR-4 4 0.70 0.59 0.63 1.06 6B 1.35 0.49 1.53 0.45 9V 2.07 1.79 1.70 1.31 14 2.37 0.58 2.32 2.55 18C 0.87 0.6 0.52 0.27 19F 0.66 0.76 2.70 1.25 23F 0.36 0.30 1.22 0.41 153623.doc •35- 201136603 血清型特異性IgG反應通常在相應Prevnar®反應之2.5倍 内。血清型（23F)除外，其在4個實驗中有2個實驗的反應 低於Prevnar®反應之四分之一。在第0天至第28天（第2劑量 後，PD-2)針對非Prevnar®血清型之抗體含量的增加倍數匯 總於表4中。 表4 針對在NZWR中測試之PCV-1 5主要調配物之非Prevnar™ 血清型之IgG反應的增加倍數（第2劑量後：第1劑量前） 血清型 NZWR-1 NZWR-2 NZWR-3 NZWR-4 1 14.9 30.5 55.1 59.9 3 33.6 16.2 61.5 28.5 5 12.8 70.2 112.0 134.0 6A 21.3 77.8 143.0 123.0 7F 42.0 83.8 194.0 108.0 19A 40.5 79.1 450.0 314.0 22F 45.7 87.8 243.0 135.0 33F 21.7 47.9 98.8 69.4 多醣接合物疫苗劑量對於NZWR中之免疫原性之效應 亦評估對於PCV-15中所含所有血清型與預定人類劑量 (1X)之疫苗相比增加劑量（雙倍劑量，2x)多_接合物的免 疫原性。對於2x多醣接合物調配物，使APA濃度增至1.5x 以確保大部分接合物結合至鋁佐劑。如表5中所示，增加 疫苗中之多醣接合物量似乎並不顯著受益。所有血清型之 差值在2倍以内，且幾何平均倍數比（lx PCV-15/2X PCV-15 153623.doc -36- 201136603 + 1.5X APA)為 1.1。 表5 在NZWR中使用Prevnar®、lx人類劑量之？0^-15*或2乂人 類劑量之PCV-15t的第2劑量後幾何平均IgG效價（95%置信 區間） 治療組 倍數差 血清型 Prevnar™ (n=8) lx PCV-15 (n=8) 2x PCV-15 (n=8) 2x PCV-15/lx PCV-15之比率 4 736,400 436,000 472,100 1.1 (483200， 1122400) (199700, 951700) (246800, 902900) 6B 363,600 176,500 196,900 1.1 (205000， 644800) (72800, 427800) (85900, 451400) 9V 298,200 534,700 §80,600 1.1 (173800， 511700) (362800, 788100) (366300, 920200) 14 345,200 198,900 273,600 1.4 (200200, 595000) (94500, 418700) (229500, 326100) 18C 954,500 573,000 455,900 0.8 (815700, 1116800) (396900, 827400) (245100， 848000) 19F 720,100 548,000 544,300 1.0 (475700， 1090200) (367700, 816800) (269000， 1101400) 23F 816,300 246,200 188,500 0.8 (565100, 1179100) (117200, 517100) (78100, 454800) 153623.doc -37- 201136603 1 5,3〇〇 91,500 72,200 0.8 (3100, 9200) (62600， 133600) (46700, 111600) 3 12,000 32,300 23,600 0.7 (8600, 16800) (19600， 53000) (14100, 39400) 5 5,700 245,600 224,600 0.9 (4100, 7900) (114200， 528200) (136700, 369100) 6A 525,900 186,700 251,800 1.3 (275000, (71300， (102300, 1005600) 488600) 620100) 7F 4,600 326,900 212,200 0.6 (4000, 5200) (238000， 449000) (134200, 335500) 19A 432,800 260,900 276,100 1.1 (237800, (145500, (153200, 787800) 468000) 497600) 22Γ 6,000 359,800 345,300 1.0 (4400, 8100) (239000, 541700) (221200, 539000) 33F 6,600 177,400 138,500 0.8 (4700, 9300) (118300, 266200) (68300， 280900) *與1 x鋁佐劑（APA) —起調配 卞與1.5x APA —起調配 鋁佐劑對於NZWR中PCV-15之免疫原性的效應 在一兔研究中評估鋁佐劑（APA)對於抗體反應之影響。 測試與以下物質一起調配之PC V-1 5 :預定人類劑量之APA (PCV-15 lx APA)、雙倍預定人類劑量之APA (PCV-15 2x 153623.doc -38 - 201136603 APA)、及不含任一鋁佐劑（pcv-15 Ox APA)。Prevnar® 組亦 包含於該研究中。 PD-2結果表明’使APA濃度加倍對於針對pc V-15之血清 型特異性1gG反應的影響較小。效價之倍數差（1X APA/2x APA)介於〇.6(血清型6B)至2.3(血清型22F)之間，且15種血 清型中之幾何平均倍數比為丨1。在不存在鋁佐劑時，許 多血清型之抗體效價似乎低於具有丨χ Apa之PCV-1 5。效價 之倍數差（lx/Οχ)介於〇.5(金清型5)至2.9(血清型23F)之間， 且15種血清型中之幾何平均倍數比為14。總之，使鋁佐 劑含量加倍似乎並不具有實質性優點且在此動物模型中去 除佐劑似乎不利（表6)。 PD-2結果表明，與含有磷酸鋁佐劑（ApA)之pcv_i5相 比，不含APA之組中之許多血清型的抗體效價有所降低（圖 3)此表明给要納入結佐劑以在&中產生最佳pcv_ ι 5免疫 原性。此外，發現使疫苗中所含之ApA量加倍並無益處（數 據未顯示）。 153623.doc •39· 201136603 (s£H 鸪鲥。/056)蛱^0&01^屮^皴忘'## i#<N浓 Wgl-Aud wtogw(vdv) i#c^t>ofxo^xtN, M 铼缶'aAVZJSL·^ w举 W(VJV XI) sl-ΛυΡΗ食葙要

VdV X02 WV 32 (9=a) VdV*0 Sl-Aud (8=e) vdn siaupm (8=a) VdV 沁一 Si-Aud

(8=a) SHJ—J 5 Ο.Ι ΟΤ

91—I 9·ϊ ττϊ §9Tt0Tr 00n96t (OOAOSSroossI) (οοοοοος 寸000寸8) 9.0 6.0 Ι.ί 00.0 (00Αε9'00Ιςε) ΚΙ(000寸ΓηεοοοοΙ6)oonsa(00ZJcn'00IS9) 009Κ91—I(οοιηοιηειο'οόόεζο oonss(00A6oor00e9s 00S6 (0099/,90^09 卜 8) oo'm (00061εooz/繫 (001717900 do寸卜s eoofos 芍 (006806 ^001^ §9vr6s (00 Is 《oiol) oons dosl) 008ΟΓ6Ι (i8Ae do 寸013)oozrisz (006K9 .000? c οο9βε£ (00 寸 stNoo do 卜(Ns 000<s9lri(οοε^ζο'ΟΑΟό) οοεΓΟΗ (00s ε dolsos) 00'89z coosz)oosfiofn ί;00ς91—h寸 00 寸 ostN)00®εζε (OOASCS O'OCNSZJ eosrrTrl—I (SZ^I 寸 00寸AAI)(,卜81 0086S) 006VTS (000I寸9 oOI9CN<N) 00 卜o8€

Tr s Λ6 υ8ι 153623.doc • 40· 201136603 ΓΙ s 6·Ι ΟΙ 9·ϊso 2 L.I 2 寸一ετ ΓΙ 000 S Γϊ 2 2 s-ϊ eooTrs (009Ι6Γ008Η) OJS (00609 ΓΟΟΙ Ο I) §sTr OOZ/SSI(ΟΟΙοοίΓοοδε) 00»卜9 (00£36二00£1£) 009·卜卜 (0000寸3000$) (ΟΟΝΖΖεο'οερ) (008£6εοΟΙ5<ΝΙ) 00®日 (OOB^OOCSI寸81) 00°ο9ε£ (00199'ΟΟΟΗ) OOZ/SZI (00610//003寸 9) Elfs (ooos^oocxioos 00£oc6 (ooeorn'OOIrsl卜) 003 卜一 00°®9S (00 寸 93.00163) 00卜爱 009*ε9Ι(oournrooooos) 00Ζ/Ι8 (0§ε(Ν 00Γ9»ΛΪ (00s6I>r0089s 00Ζ/Ι6 (00卜/^°100£09) 0¾ 卜 ΤΙ(oolsrn (oo(N9sooln(N6) (006寸 εζο^οο寸 11) (008〇〇8300|>36) 009ro9t (009A 寸Z00I06) 00气63 (00651900869)0¾ 卜oz(00<Nss di^} ootsis (ooels O'OSOI) 009ΙΛεζ (oosss寸 00600芝(οοδε 500191)οοεΟΓεΓ(ο_εε SOSI 寸 I) 00»9ίζ ~~S10I0I ooos) OOIe to££ (00^00006 寸) oosvosz (00A991 •00s) 0〇Γ56 V6i (0017°°.00εε) oons s (0061 寸I 0^0¾ 00STT8 苫 (OOASOOO 寸) ooxTrS (00180^000寸) 00s £ (oopcro 寸寸) 009VT一 (00εκ}9 o'·卜 I) ooszfnδ {0§6e 153623.doc 41 201136603 討論及結論 臨床前數據顯示，PCV-15調配物（在APA中調配）在兩種 物種（幼小恒河猴及兔）中具有高度免疫原性。對於兩種疫 苗之間共有之7種血清型而言，針對PCV-15之血清型特異 性反應與彼等由prevnar®引起者相當。對於PC v_ 1 5中之8 種新穎血清型，在幼小恒河猴及兔二者令會引起強烈反 應’其中在兩種物種中投與2個疫苗劑量後所有血清型之 IgG反應皆增加10倍以上。劑量範圍受限之實驗表明，使 多醣接合物量增加2倍並不會使抗體反應增加。類似地， 使鋁佐劑濃度增加2倍似乎並不顯著改進pC v_丨5之免疫原 性特徵。然而，去除佐劑會降低一些血清型之反應，此表 明人類對佐劑具有潛在需求。藉由1>(：¥_15可引起對於疫苗 中所有15種血清型、以及血清型6C之功能（〇pA)抗體反 應’其中血清型6C並非PCV-15之組份。 【圖式簡單說明】 圖1 .對比PCV-1 5相對於prevnar®在幼小恒河猴中之 GMC(Prevnar血清型，pD_2&pD 3)。誤差條表示2個標準 誤差。 圖2 ·在使用pcv-15免疫之幼小恒河猴中針對非 Prevnar血清型之血清型特異性^誤差條表示2個標 準誤差。 圖3 . NZWR·1 :對比使用不含APA (OxA)或含有APA (B1)之PCV-15免疫之兔之幾何平均效價（第2劑量後p誤差 條表示對於幾何平均倍數差之95% (不含ApA之 含有 APA之PCV-15)。 153623.doc •42·

Claims (1)

1. 201136603 七、申請專利範圍： 1. 一種免疫原性組合物，其包括： (1) 多價多醣-蛋白質接合物混合物，其由來自肺炎鏈 球菌（Streptococcus pneum〇niae)之血清型 i34、5 ' . 6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F、 ' 及331?的莢膜多醣接合至載體蛋白而組成；及 (2) 醫藥上可接受之載劑。 2. 如。月求項1之免疫原性組合物，其中該載體蛋白係 CRM 1 97 0 3. 如請求項1之免疫原性組合物，其進_步包括佐劑。 4_如明求項3之免疫原性組合物，其中該佐劑係基於鋁之 佐劑。 5. 如請求項4之免疫原性組合物，其中該佐劑選自由磷酸 紹、硫酸鋁及氫氧化鋁組成之群。 6. 如請求項5之免疫原性組合物，其中該佐劑係磷酸鋁。 7， 一種如請求項1之免疫原性組合物之用途，其用於製備 誘導針對肺炎鏈球菌莢膜多醣之免疫應答之藥物。 8.如凊求項7之用途，其中該免疫原性組合物係經調配而 • 含有以下物質之〇·5 mL單一劑量：2 pg之每種醣類，6B : 除外’其係4 gg ;約32 pg CRM197載體蛋白；0.125 mg 元素紹（0.5 mg磷酸鋁）佐劑；150 mM氣化鈉及20 mM L-組胺酸緩衝液。 153623.doc