JP7397000B2 - 凍結乾燥変異ジフテリア毒素のジメチルスルホキシド中均一溶液を提供する方法 - Google Patents

Description

本発明は、肺炎球菌莢膜多糖体：ｍＤＴ複合体の製造で使用される、凍結乾燥変異ジフテリア毒素（ｍＤＴ）を無水ジメチルスルホキシド中で再構成する方法に関するものである。

被包性細菌の一例である肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、世界的に重大な疾患の重要な原因である。１９９７年に、疾病対策予防センター（ＣＤＣ）は、米国において年間で、肺炎球菌性髄膜炎３，０００例、肺炎球菌菌血症５０，０００例、肺炎球菌性中耳炎７，０００，０００例及び肺炎球菌性肺炎５００，０００例があると推算している。Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ， ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ １９９７， ４６（ＲＲ－８）： １－１３を参照のこと。さらに、これらの疾患の合併症は重大であり得るもので、いくつかの研究によって、肺炎球菌性髄膜炎で最大８％の死亡率及び最大２５％の神経学的続発症が報告されている。Ａｒｄｉｔｉ ｅｔ ａｌ.， １９９８， Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １０２：１０８７－９７を参照のこと。
長年にわたって認可されてきた多価肺炎球菌多糖体ワクチンは、成人、特には高齢者及び高リスク者で肺炎球菌疾患を予防するのに計り知れない価値のあるものであった。しかしながら、幼児及び小児は、複合化していない肺炎球菌多糖類にはあまり応答しない。細菌多糖類はＴ細胞非依存性免疫原であり、幼児では引き起こす応答は弱いか全くない。細菌多糖類免疫原のキャリアタンパク質への化学的複合化によって、幼児において、免疫応答をＴ細胞依存性のものに変換される。ジフテリア毒素（ＤＴｘ、ジフテリア毒素（ＤＴ）の化学的解毒版）及びＤＴは、それらのアミノ酸配列にＴ細胞刺激エピトープが存在するために、細菌多糖類免疫原のキャリアタンパク質であると報告されている。

Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ， ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ １９９７， ４６（ＲＲ－８）： １－１３ Ａｒｄｉｔｉ ｅｔ ａｌ.， １９９８， Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １０２：１０８７－９７

従って、キャリアタンパク質に複合化した細菌莢膜多糖類を含む多糖類－タンパク質複合体ワクチンが開発されており、さらなるワクチンも開発中である。開発された複合体ワクチンの例には、ヘモフィルスインフルエンザＢ型（Ｈｉｂ）複合体ワクチン（例えば、ＨＩＢＴＩＴＥＲ（登録商標））並びに肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（例えば、ＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）及びＰＲＥＶＮＡＲ１３（登録商標））及び髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（例えば、ＭＥＮＪＵＧＡＴＥ（登録商標））に対する複合体ワクチンなどがある。

本発明は、均一溶液調製後最長６時間にわたってフーリエ変換赤外分光法又は動的光散乱によって測定されるｍＤＴの検出可能なβシート介在凝集が全くない、変異ジフテリア毒素（ｍＤＴ）の無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中均一溶液の調製方法を提供する。その均一溶液は、複数の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類－ｍＤＴ複合体であって、各複合体が特定の血清型の多糖類を含み、ワクチンで使用される複合体の特定の組み合わせを有する複数の肺炎球菌免疫原性組成物を製造するのに用いることができる複合体の製造において有用である。

本発明は、変異ジフテリア毒素（ｍＤＴ）の無水ＤＭＳＯ中均一溶液の製造方法であって、（ａ）ｍＤＴの乾燥組成物を提供すること；及び（ｂ）２分以下の期間をかけて前記乾燥組成物に無水ＤＭＳＯを加えることで前記乾燥組成物を無水ＤＭＳＯ中で再構成し、少なくとも１０秒間混和してｍＤＴを含む均一溶液を提供することを含む方法を提供する。

当該方法の特定の実施形態において、ｍＤＴの乾燥組成物は、凍結乾燥及びｍＤＴの水溶液からの輻射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水から選択される昇華乾燥プロセスによって調製される。さらなる実施形態において、前記昇華乾燥プロセスは、前記水溶液をケーキ又はリオスフィアビーズの形態で冷凍することを含む。別の実施形態において、昇華乾燥は、金属トレイ、プラスチックトレイ、プラスチック袋、及びクラスＩチュービングバイアルからなる群から選択される容器中で行われるバルク乾燥である。

特定の実施形態において、乾燥組成物は、ｍＤＴを含む水溶液の昇華乾燥によって乾燥組成物を製造することで調製され、その水溶液はさらにショ糖及び緩衝剤を含み、前記昇華乾燥は、凍結乾燥及び輻射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水から選択される。

特定の実施形態において、緩衝剤は、５．０～７．０のｐＨ範囲でのヒスチジン、コハク酸、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、又は酢酸緩衝剤である。特定の実施形態において、緩衝剤は、５．０～７．０のｐＨ範囲でのリン酸又はクエン酸緩衝剤である。

特定の実施形態において、水溶液は、約０．５％(重量／体積）以上のショ糖を含む。特定の実施形態において、水溶液は、約４％～８％(重量／体積）のショ糖を含む。

特定の実施形態において、乾燥組成物は約６％以下の最終含水率を有する。特定の実施形態において、乾燥組成物は約５％以下の最終含水率を有する。特定の実施形態において、乾燥組成物は約４％以下の最終含水率を有する。特定の実施形態において、乾燥組成物は約３％以下の最終含水率を有する。特定の実施形態において、乾燥組成物は約２％以下の最終含水率を有する。

特定の実施形態において、水溶液は、約６～１２ｍｇ／ｍＬの濃度でｍＤＴを含む。特定の実施形態において、水溶液は、約６、９、１０又は１２ｍｇ／ｍＬの濃度でｍＤＴを含む。

当該方法の特定の実施形態において、段階（ｂ）における再構成の実施は８分以内とする。特定の実施形態において、再構成の実施は６分とする。特定の実施形態において、再構成の実施は４分以内とする。特定の実施形態において、再構成の実施は２分以内とする。特定の実施形態において、再構成の実施は２分とする。特定の実施形態において、再構成の実施は１分以内とする。

特定の実施形態において、代わりに段階（ｂ）における混和の実施は１２０分以内とする。特定の実施形態において、代わりに混和の実施は９０分以内とする。特定の実施形態において、代わりに混和の実施は６０分以内とする。特定の実施形態において、代わりに混和の実施は３０分以内とする。特定の実施形態において、代わりに混和の実施は１０分以内とする。特定の実施形態において、ｍＤＴを含む均一溶液を、再構成後６時間以内に、活性化多糖類への複合化に用いる。

本発明はさらに、検出可能なβシート介在凝集が全くない変異ジフテリア毒素（ｍＤＴ）の無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中均一溶液を提供する方法であって、（ａ）ｍＤＴの乾燥組成物を提供すること；及び（ｂ）２分以内の期間をかけて無水ＤＭＳＯを乾燥組成物に加えて乾燥組成物を無水ＤＭＳＯ中で再構成し、混和して、ｍＤＴを含む均一溶液を提供することを含み、当該均一溶液がフーリエ変換赤外分光法又は動的光散乱による測定で検出可能なβシート介在凝集を全く含まない方法を提供する。

さらなる実施形態において、当該均一溶液は、再構成後最大１時間にわたって検出可能なβシート介在凝集を全く含まない。さらなる実施形態において、当該均一溶液は、再構成後最大２時間にわたって検出可能なβシート介在凝集を全く含まない。さらなる実施形態において、当該均一溶液は、再構成後最大３時間にわたって検出可能なβシート介在凝集を全く含まない。さらなる実施形態において、当該均一溶液は、再構成後最大４時間にわたって検出可能なβシート介在凝集を全く含まない。さらなる実施形態において、当該均一溶液は、再構成後最大５時間にわたって検出可能なβシート介在凝集を全く含まない。さらなる実施形態において、当該均一溶液は、再構成後最大６時間にわたって検出可能なβシート介在凝集を全く含まない。

当該方法の特定の実施形態において、ｍＤＴの乾燥組成物は、凍結乾燥及びｍＤＴの水溶液からの輻射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水から選択される昇華乾燥によって調製される。さらなる実施形態において、昇華乾燥プロセスは、昇華乾燥プロセスの前に水溶液をケーキ又はリオスフィアビーズの形で冷凍することを含む。別の実施形態において、昇華乾燥は、金属トレイ、プラスチックトレイ、プラスチック袋、及びクラスＩチュービングバイアルからなる群から選択される容器中で行われるバルク乾燥を含む。

特定の実施形態において、当該乾燥組成物は約６％以下の最終含水率を有する。特定の実施形態において、当該乾燥組成物は約５％以下の最終含水率を有する。特定の実施形態において、当該乾燥組成物は約４％以下の最終含水率を有する。特定の実施形態において、当該乾燥組成物は約３％以下の最終含水率を有する。特定の実施形態において、当該乾燥組成物は約２％以下の最終含水率を有する。

特定の実施形態において、当該乾燥組成物は、ｍＤＴを含む水溶液を昇華乾燥することで乾燥組成物を製造することで調製され、当該水溶液はさらにショ糖及び緩衝剤を含み、昇華乾燥は、凍結乾燥及び輻射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水から選択される。

特定の実施形態において、当該水溶液は、約０．５％(重量／体積）以上のショ糖を含む。特定の実施形態において、当該水溶液は、約４％～８％(重量／体積）のショ糖を含む。

特定の実施形態において、緩衝剤は、５．０～７．０のｐＨ範囲でのヒスチジン、コハク酸、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、又は酢酸緩衝剤である。

特定の実施形態において、緩衝剤は、５．０～７．０のｐＨ範囲でのリン酸又はクエン酸緩衝剤である。

特定の実施形態において、当該水溶液は、約６～１２ｍｇ／ｍＬの濃度でｍＤＴを含む。特定の実施形態において、水溶液は、約６、９、１０又は１２ｍｇ／ｍＬの濃度でｍＤＴを含む。

当該方法の特定の実施形態において、代わりに段階（ｂ）における再構成の実施は８分以内とする。特定の実施形態において、代わりに再構成の実施は６分以内とする。特定の実施形態において、代わりに再構成の実施は４分以内とする。特定の実施形態において、代わりに再構成の実施は２分以内とする。特定の実施形態において、代わりに再構成の実施は約２分とする。特定の実施形態において、代わりに再構成の実施は１分以内とする。

特定の実施形態において、段階（ｂ）における混和の実施は１２０分以内とする。特定の実施形態において、混和の実施は９０分以内とする。特定の実施形態において、混和の実施は６０分以内とする。特定の実施形態において、混和の実施は３０分以内とする。特定の実施形態において、混和の実施は１０分以内とする。特定の実施形態において、ｍＤＴを含む均一溶液を、再構成後６時間以内に、活性化多糖類への複合化に用いる。

本発明はさらに、変異ジフテリア毒素（ｍＤＴ）に共有結合的に連結された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類を含む組成物の製造方法であって、（ａ）１以上の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型からの活性化肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類を含む第１の乾燥組成物及びｍＤＴを含む第２の乾燥組成物を提供する段階；（ｂ）前記第１の乾燥組成物及び前記第２の乾燥組成物を別個にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で再構成し、混和して、前記１以上の活性化多糖類を含む第１の均一溶液及び前記ｍＤＴを含む第２の均一溶液を提供する段階；（ｃ）前記第１の均一溶液と前記第２の均一溶液を合わせて、混合物を製造する段階；及び（ｄ）前記混合物に還元剤を加えて、１以上の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の１以上の多糖類に複合化したｍＤＴを含む複合体溶液を製造する段階を含み、前記第１の乾燥組成物を無水ＤＭＳＯ中で再構成し、前記第２の乾燥組成物に前記無水ＤＭＳＯを２分以下の期間をかけて加え、混和することで前記第２の乾燥組成物を無水ＤＭＳＯ中で再構成して、前記ｍＤＴを含む前記均一溶液を提供することを特徴とする、又は改善点が、前記第１の乾燥組成物を無水ＤＭＳＯ中で再構成し、前記第２の乾燥組成物に前記無水ＤＭＳＯを２分以下の期間をかけて加え、混和することで前記第２の乾燥組成物を無水ＤＭＳＯ中で再構成して、前記ｍＤＴを含む前記均一溶液を提供することである方法を提供する。

当該方法の特定の実施形態において、前記第１及び第２の乾燥組成物は、凍結乾燥及び輻射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水から選択される昇華乾燥プロセスによって調製される。さらなる実施形態において、前記昇華乾燥プロセスは、当該昇華乾燥プロセスの前に前記第１及び第２の水溶液をケーキ又はリオスフィアビーズの形態で冷凍することを含む。別の実施形態において、前記昇華乾燥プロセスは、金属トレイ、プラスチックトレイ、プラスチック袋、及びクラスＩチュービングバイアルからなる群から選択される容器中で行われるバルク乾燥を含む。

特定の実施形態において、前記第１及び第２の乾燥組成物のそれぞれは、約６％以下の最終含水率を有する。特定の実施形態において、前記第１及び第２の乾燥組成物のそれぞれは、約５％以下の最終含水率を有する。特定の実施形態において、前記第１及び第２の乾燥組成物のそれぞれは、約４％以下の最終含水率を有する。特定の実施形態において、前記第１及び第２の乾燥組成物のそれぞれは、約３％以下の最終含水率を有する。特定の実施形態において、前記第１及び第２の乾燥組成物のそれぞれは、約２％以下の最終含水率を有する。

特定の実施形態において、前記第１及び第２の乾燥組成物は、１、２若しくはそれより多い肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型からの活性化肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類を含む第１の水溶液及び前記ｍＤＴを含む第２の水溶液の昇華乾燥によって前記第１及び第２の乾燥組成物を製造することで調製され、前記第１及び第２の水溶液は約０．５％(重量／体積）以上のショ糖及び緩衝剤をさらに含み、前記昇華乾燥は凍結乾燥又は輻射エネルギー真空（ＲＥＶ）無水から選択される。

特定の実施形態において、前記緩衝剤は、５．０～７．０のｐＨ範囲でのヒスチジン、コハク酸、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、又は酢酸緩衝剤である。

特定の実施形態において、前記緩衝剤は、５．０～７．０のｐＨ範囲でのリン酸又はクエン酸緩衝剤である。

特定の実施形態において、前記第１及び第２の水溶液は、約０．５％(重量／体積）以上のショ糖を含む。特定の実施形態において、前記第１の水溶液は約４％～６％(重量／体積）のショ糖を含み、前記第２の水溶液は約４％～８％(重量／体積）のショ糖を含む。

特定の実施形態において、前記第１の水溶液は約６～９ｍｇ／ｍＬの濃度で前記多糖類を含み、前記第２の水溶液は約６～１２ｍｇ／ｍＬの濃度で前記ｍＤＴを含む。特定の実施形態において、前記第１の水溶液は約６若しくは９ｍｇ／ｍＬの濃度で前記多糖類を含み、前記第２の水溶液は約６、９、１０若しくは１２ｍｇ／ｍＬの濃度で前記ｍＤＴを含む。

当該方法の特定の実施形態において、代わりに段階（ｂ）における再構成の実施は、８分以内とする。特定の実施形態において、代わりに再構成の実施は、６分以内とする。特定の実施形態において、代わりに再構成の実施は、４分以内とする。特定の実施形態において、代わりに再構成の実施は、２分以内とする。特定の実施形態において、代わりに再構成の実施は、約２分とする。特定の実施形態において、代わりに再構成の実施は、１分以内とする。

特定の実施形態において、段階（ｂ）における混和の実施は１２０分以内とする。特定の実施形態において、混和の実施は９０分以内とする。特定の実施形態において、混和の実施は６０分以内とする。特定の実施形態において、混和の実施は３０分以内とする。特定の実施形態において、混和の実施は１０分以内とする。

特定の実施形態において、各複合体溶液は、重量基準で多糖類：ｍＤＴの比約０．６：約１．３でｍＤＴに複合化した多糖類を含む。特定の実施形態において、各複合体溶液は、重量基準で多糖類：ｍＤＴの比約０．９：約１．５で前記ｍＤＴに複合化した多糖類を含む。特定の実施形態において、各複合体溶液は、重量基準で多糖類：ｍＤＴの比約０．６：約１．５で前記ｍＤＴに複合化した多糖類を含む。

特定の実施形態において、前記複合体溶液は、溶液中、多糖類合計の約１５％未満である遊離多糖類濃度を含む。特定の実施形態において、前記複合体溶液は、溶液中、多糖類合計の約１０％未満である遊離多糖類濃度を含む。

特定の実施形態において、前記複合体は、５（モル／モル）より大きいｍＤＴリジン損失値を有する。

特定の実施形態において、各複合体溶液は、重量基準で多糖類：ｍＤＴの比約０．６：約１．３で前記ｍＤＴに複合化した多糖類を含み、溶液中、多糖類合計の約１５％未満である遊離多糖類濃度を含み、前記複合体は、５（モル／モル）より大きいｍＤＴリジン損失値を有する。

特定の実施形態において、前記１以上の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｇ、６Ｈ、７Ｆ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ｆ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１１Ｆ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１２Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１３、１４、１５Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１６Ａ、１７Ｆ、１７Ａ，１８Ｆ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ｆ、２２Ａ、２３Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２５Ｆ、２５Ａ、２７、２８Ｆ、２８Ａ、２９、３１、３２Ｆ、３２Ａ、３３Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ，３４、３５Ｆ、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ｆ、４１Ａ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ｆ、４７Ａ、４８、ＣＷＰＳ１、ＣＷＰＳ２、及びＣＷＰＳ３からなる群から選択される。

特定の実施形態において、前記１以上の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類を、酸化剤と反応させることによって活性化して、段階（ａ）での活性化多糖類を提供する。

本明細書における実施形態のいずれか一つにおいて、前記変異ジフテリア毒素はＣＲＭ_１９７である。特定の実施形態において、前記複合体溶液は無菌濾過される。

無水ＤＭＳＯ中での急速（２分）再構成と低速（８分）再構成を行ったＣＲＭ_１９７のＦＴＩＲスペクトラムを示す図である。 無水ＤＭＳＯ中での中間速度再構成（４分）を行い、次に保持時間を増やした（３０分；６０分；１２０分；１８０分；２４０分；３００分）ＣＲＭ_１９７のＦＴＩＲスペクトラムを示す図である。 異なる濃度（１０ｍｇ／ｍＬ；３０ｍｇ／ｍＬ；５０ｍｇ／ｍＬ）で、無水ＤＭＳＯ中での急速再構成（２分）を行ったＣＲＭ_１９７のＦＴＩＲスペクトラムを示す図である。 １０ｍｇ／ｍＬ（図４Ａ）及び３０ｍｇ／ｍＬ（図４Ｂ）で、無水ＤＭＳＯ中での急速再構成（２分）を行ったＣＲＭ_１９７の動的光散乱（ＤＬＳ）プロファイルを示す図である。各サンプルについて、３回の測定値を集めた（３トレース）。 １０ｍｇ／ｍＬ（図４Ａ）及び３０ｍｇ／ｍＬ（図４Ｂ）で、無水ＤＭＳＯ中での急速再構成（２分）を行ったＣＲＭ_１９７の動的光散乱（ＤＬＳ）プロファイルを示す図である。各サンプルについて、３回の測定値を集めた（３トレース）。 異なるレベルの水を含むＤＭＳＯ（無水ＤＭＳＯ；９９％ＤＭＳＯ／水；９７％ＤＭＳＯ／水；９５％ＤＭＳＯ／水）中での急速再構成（２分）を行ったＣＲＭ_１９７のＦＴＩＲスペクトラムを示す図である。 無水ＤＭＳＯ中での急速再構成（２分）と低速再構成（８分）を行った強力乾燥凍結乾燥ＣＲＭ_１９７のＦＴＩＲスペクトラムを示す図である。 多糖類６Ｂ複合化前にＣＲＭ_１９７が急速（２分）又は低速（８分）で再構成されているＣＲＭ_１９７：多糖類血清型６Ｂ（ＣＲＭ１９７－６Ｂ）複合体のＦＴＩＲスペクトラムを示す図である。水系条件下で多糖類６Ｂに複合化したＣＲＭ_１９７も示している。 変異ジフテリア毒素（ｍＤＴ）多糖類（Ｐｓ）複合体製造についての一般的計画を示す図である。 大きさを増加させた多糖類を用いる反応から得られた複合体の大きさを示す図である。このグラフは、無水ＤＭＳＯをゆっくり加えることで、無水ＤＭＳＯの急速添加より、同じ大きさの多糖類からかなり大きい複合体が得られることを示している。

Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「多糖類」（Ｐｓ）という用語は、免疫学分野及び細菌ワクチン分野で一般的に使用される抗原性サッカリド要素（又は抗原性単位）、例えば「サッカリド」、「オリゴ糖」、「多糖類」、「リポサッカリド」、「リポオリゴ糖（ＬＯＳ）」、「リポ多糖類（ＬＰＳ）」、「グリコシレート」、「複合糖質」など（これらに限定されるものではない）を含むものである。文脈に応じて、Ｐｓは単数でも複数であっても良い。

本明細書で使用される場合、本発明の免疫原性組成物で使用する場合の「含む」という用語は、補助剤及び賦形剤などのいずれか他の成分の包含を指す（抗原混合物についての「からなる」という言語の制限を受ける）。多価多糖類－タンパク質複合体混合物で使用する場合の「からなる」という用語は、特定のＳ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質複合体を有し、異なる血清型からの他のＳ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質複合体を全く持たない混合物を指す。

本明細書で定義される場合、「沈殿」、「沈殿する」、「微粒子形成」、「白濁」、及び「凝集」という用語は、互換的に使用することができ、多糖類－タンパク質複合体の凝集を生じる物理的相互作用又は化学反応を指すものである。凝集（例えば、タンパク質凝集）のプロセスは、多くの物理化学的応力、例えば熱、圧力、ｐＨ、攪拌、剪断力、凍結－解凍、脱水、重金属、フェノール系化合物、シリコンオイル、変性剤などによって誘発することができる。

本明細書で使用される場合、「再構成すること」又は「再構成」という用語は、液体を乾燥物に加えて、その乾燥物を溶かして、その材料が溶けた溶液を提供することを指す。しかしながら、その再構成によって提供される溶液は、それに溶解した材料の濃度勾配又は層を有することができる。従って、再構成後、その溶液を物理的に攪拌して、再構成材料の均一溶液を提供する。

本明細書で使用される場合、「混和」という用語は、振盪、攪拌、揺動、回転などによって溶液を物理的に攪拌することを指すのに用いられる。

本明細書で使用される場合、「均一溶液」という用語は、全ての成分が十分に混和されていることで、その溶液中の成分間で濃度勾配も層もない溶液を指す。

本明細書で使用される場合、「リオスフィア」は、凍結乾燥材料の離散粒子であり、例えば、ビーズ若しくは球形その他の形状を取る。リオスフィアは、リオ粒子スフィアオン（ｌｙｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｐｈｅｒｅｏｎ）、又はリオビーズ（ｌｙｏｂｅａｄ）とも称することができる。一部の実施形態において、リオスフィア直径は約２～約１２ｍｍ、好ましくは２～８ｍｍ、例えば２．５～６ｍｍ又は２．５～５ｍｍである。一部の実施形態において、リオスフィアの体積は約２０～５５０μＬ、好ましくは２０～１００μＬ、例えば２０～５０μＬである。リオスフィアがほとんど球形ではない実施形態では、リオスフィアの大きさは、長い方の寸法の短い方の寸法に対する比である、それのアスペクト比に関して記述することができる。リオスフィアのアスペクト比は、０．５～２．５、好ましくは０．７５～２、例えば１～１．５であることができる。

本明細書で使用される場合、「免疫原性組成物」は、１以上のｍＤＴ、例えば、ＣＲＭ_１９７に複合化した１以上の抗原を含む多価組成物であることができる。本発明のある種の実施形態において、抗原は、被包性細菌からのサッカリドである。そのような組成物において、サッカリドは、ある種類の細菌の表面に似る長鎖の糖分子からなる。被包性細菌には、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ネイッセリア・メニンギチデス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）及びヘモフィルスインフルエンザＢ型などがあるが、これらに限定されるものではない。その抗原は、同一生物からものであることができるか、異なる生物からのものであることができる。本発明の好ましい実施形態において、抗原は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖類である。

本明細書で使用される場合、「輻射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水」という用語は、マイクロ波真空乾燥（ＭＶＤ）も指す。

ＩＩ．プロセス
本発明は、抗肺炎球菌ワクチンとして使用可能な多価肺炎球菌多糖類－タンパク質複合体を製造する方法又はプロセスであって、変異ジフテリア毒素（ｍＤＴ）を２分以内の急速な期間で無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で再構成して均一溶液を提供し、その均一溶液を、検出可能なβシート介在凝集が全くない、遊離多糖類のレベルが低い（例えば、１５％未満の遊離多糖類）複合体組成物を形成する条件下で無水ＤＭＳＯ中で再構成した活性化多糖類の均一溶液と合わせる方法を提供する。

本発明者らは、ｍＤＴの再構成時に、ＤＭＳＯなどの有機溶媒を乾燥ｍＤＴに加える時間の長さ及び次に、再構成したｍＤＴを複合化に先立って保存若しくは維持する時間の長さがｍＤＴの二次構造に影響を与えることで、所望の分子量を有する複合体の収量及びｍＤＴのそれに複合化した多糖類に対する比率に影響することを発見した。本発明は、本明細書において、ジフテリア毒素の無毒性変異体（即ち毒素）であるＣＲＭ_１９７によって例示される。図１～７に示したように、急速添加条件下で、例えば８分未満又は約２分以内で無水ＤＭＳＯを乾燥ｍＤＴに添加する場合に乾燥ｍＤＴを無水ＤＭＳＯ中で再構成するのに要する時間によって、ｍＤＴが完全に変性しており、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）又は動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される検出可能なβシート形成が全くない再構成ｍＤＴ溶液が提供される。ＤＭＳＯ中に存在する検出可能な水を有すること、及び／又は１２ｍｇ／ｍＬより大きいｍＤＴの最終濃度でｍＤＴを有することで、βシート介在凝集が生じることも発見された。従って、本発明の好ましい実施形態において、無水ＤＭＳＯは、８分未満、好ましくは５分未満、より好ましくは２分未満の期間をかけて乾燥ｍＤＴに添加され；ｍＤＴは１０ｍｇ／ｍＬ未満又は１２ｍｇ／ｍＬ以下の濃度に、特定の実施形態では約６ｍｇ／ｍＬに維持される。

特定の実施形態において、乾燥ｍＤＴ及び多糖類の完全溶解を確保するため、ｍＤＴを含む第１の均一溶液及び活性化多糖類を含む第２の均一溶液を１２０分以内の間混和することができる。特定の実施形態において、混和は９０分以内とすることができる。特定の実施形態において、混和は６０分以内とすることができる。特定の実施形態において、混和は３０分以内とすることができる。特定の実施形態において、混和は１０分以内とすることができる。特定の実施形態において、ｍＤＴを含む第２の均一溶液を約６時間以内にわたりＤＭＳＯ溶液中としてから、多糖類を含む第１の均一溶液との組み合わせに供した。本発明者らは、６時間超にわたりｍＤＴをＤＭＳＯ中に維持することでｍＤＴの検出可能なβシート介在凝集が生じることを発見した。従って、特定の実施形態において、ｍＤＴは６時間以内にわたってＤＭＳＯ中に維持する。

図８は、ｍＤＴを本明細書に記載の方法によって製造する、ｍＤＴ多糖類複合体製造についての一般的計画を示す図である。

概して、各血清型についての精製肺炎球菌莢膜多糖体（Ｐｓ）粉末を別個に水に溶かして溶液を得て、血清型１９ＡからのＰｓを含む溶液を除いてそれを０．４５ミクロン濾過する。血清型１９Ａを除く、本明細書に開示の血清型のいずれかからのＰｓを含む全ての溶液を均質化して、Ｐｓの分子量を低下させる。血清型１８Ｃは、９０℃以上での酸加水分解によってサイズ低下する。血清型１９Ａは、相対的に最初のサイズが小さいためにサイズ低下しない。均質化圧力及びホモジナイザー通過数を血清型特有所期値に制御して、血清型特有分子量を達成する。多糖類をそれぞれ０．２２ミクロン濾過し、次に濃縮し、開口チャネルを有する１０ｋＤ限外濾過膜（５型）を用いて限外濾過段階１で水に対してダイアフィルトレーションして、ダイアフィルトレーション液１を製造する。

次に、ダイアフィルトレーション液１を血清型特有温度（４～２２℃）に調節し、緩衝剤、例えば酢酸ナトリウムでｐＨ（４～５）に調節して、活性化段階時に多糖類のサイズ低下を最小とすることができる。多糖類活性化を、過ヨード酸酸化によって行う。血清型４の場合、活性化の前に、溶液を約５０℃及びｐＨ４でインキュベートして、多糖類を部分的に脱ケタール化する。メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を加えることで、多糖類活性化を開始する。加えるメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は血清型特有であり、多糖類反復単位１モル当たりメタ過ヨウ素酸ナトリウム約０．１～０．５モルの範囲である。メタ過ヨウ素酸ナトリウムの血清型特有負荷量を選択して、所期レベルの多糖類活性化を達成する（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドモル数）。

限外濾過段階２では、全ての血清型溶液について、血清型５及び７Ｆを含む血液を除き、活性化多糖類を、ダイアフィルトレーションし、次に開口チャネルを有する１０ｋＤ限外濾過膜（５型）を用いるタンジェント流限外濾過によって濃縮して、ダイアフィルトレーション液２を製造することができる。ダイアフィルトレーション終了後、ダイアフィルトレーション液２を濃縮して、所期の１５ｇ Ｐｓ／Ｌとすることができる。血清型５及び７Ｆを含む溶液を、緩衝剤、例えば１０ｍＭ酢酸ナトリウムに対してダイアフィルトレーションすることができる。好ましくは、全ての血清型溶液についての限外濾過は２～８℃で行う。

次に、ダイアフィルトレーション液２を、ショ糖を加えた水で希釈して、最終濃度約４～１２ｍｇ／ｍＬ多糖類及び０．５％～６％(重量／体積）ショ糖を有する溶液を作り、昇華乾燥プロセスを行って、好ましくは６％以下の最終含水量を有する乾燥多糖類を製造する。特定の実施形態において、組成物は約５％以下の最終含水率を有する。特定の実施形態において、組成物は約４％以下の最終含水率を有する。特定の実施形態において、組成物は約３％以下の最終含水率を有する。特定の実施形態において、組成物は約２％以下の最終含水率有する。凍結乾燥前に溶液に加えるショ糖の量は血清型特有であり、凍結乾燥前で３．０～５．０％(重量／体積）の範囲であることができる。特定の実施形態において、２以上の多糖類を一緒に乾燥させて、乾燥多糖類混合物を製造することができる。

精製ｍＤＴを含む溶液を、５ｋＤａタンジェント流限外濾過膜を用いて、２ｍＭリン酸、ｐＨ７．０緩衝剤に対してダイアフィルトレーションし、次に、０．２２ミクロンフィルターで濾過する。濾過した溶液をショ糖を含む水で希釈して最終濃度約６～１２ｍｇ／ｍＬ ｍＤＴ及び４～１０％(重量／体積）ショ糖とし、昇華乾燥プロセスを行って、好ましくは６％以下の最終含水率を有する乾燥ｍＤＴを製造する。特定の実施形態において、組成物は約５％以下の最終含水率を有する。特定の実施形態において、組成物は約４％以下の最終含水率を有する。特定の実施形態において、組成物は約３％以下の最終含水率を有する。特定の実施形態において、組成物は約２％以下の最終含水率を有する。

多糖類及びｍＤＴ溶液の昇華乾燥プロセスには、凍結乾燥又は輻射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水などがあり得る。

乾燥多糖類又は乾燥多糖類混合物及び乾燥ｍＤＴを別個に、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で再構成又は再溶解して、それぞれの均一溶液を得る。特定の実施形態において、ｍＤＴを約１０～２０ｍｇ／ｍＬ又は約１０ｍｇ／ｍＬの濃度で再構成する。本発明者らは、モデルとしてＣＲＭ_１９７を用いて、ＤＭＳＯ中の１％（体積比）以上の水分によりβシート形成を生じることを発見した（図５参照）。従って、本発明は、ＤＭＳＯの含水率が１％（体積比）未満である、又はＤＭＳＯが検出可能な水分を含まない、例えば、無水ＤＭＳＯ又は１００％（体積比）ＤＭＳＯである実施形態を提供する。８分未満、好ましくは６分未満若しくは４分未満、又は最も好ましくは２分以内、又は１分以内の期間をかけてＤＭＳＯを乾燥ｍＤＴに加えることで、乾燥ｍＤＴを再構成する。

本発明者らは、ＣＲＭ_１９７をモデルとして用いて、ＤＭＳＯを乾燥ｍＤＴに加える添加時間が短いほど、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）及び動的光散乱（ＤＬＳ）分析に基づく不可逆的βシート介在凝集の形成が少ないことも発見した。図１に示したように、２分間の無水ＤＭＳＯ添加時間では、βシート介在凝集の検出可能な形成は生じない。従って、特定の実施形態において、本発明は、１％未満の水分を含むＤＭＳＯ又は検出可能な水分を含まないＤＭＳＯ、例えば無水若しくは１００％（体積比）ＤＭＳＯ中でのｍＤＴの再構成を提供し、その場合に、前記ＤＭＳＯの乾燥ｍＤＴへの添加を２分又は２分未満の期間をかけて行って、２０ｍｇ／ｍＬ以下又は約１０ｍｇ／ｍＬ以下の濃度の再構成ｍＤＴを提供する。特定の実施形態において、再構成後、混合物を最長３０分間混和して、ｍＤＴの均一溶液を得ることができる。しかしながら、特定の実施形態において、混和は、１２０分以内、９０分以内、６０分以内、３０分以内、又は１０分以内の期間をかけて行うことができる。特定の実施形態において、５００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２緩衝剤を、ｍＤＴを含む均一溶液に加えて、最終濃度１．０ｍＭリン酸ナトリウムとする。

ｍＤＴの均一溶液及び多糖類若しくは２以上の異なる多糖類の均一溶液を合わせて、ｍＤＴ及び多糖類若しくは２以上の異なる多糖類の両方を含む複合化溶液が得られる。ＤＭＳＯ中での再構成又は再溶解後に、多糖類及びｍＤＴ均一溶液を合わせて、血清型特有最終多糖類濃度及び多糖類／ｍＤＴ比とする。概して、ｍＤＴ及び多糖類を、最終複合化多糖類／ｍＤＴ比が約０．６～１．３（重量基準）となるような量で合わせる。

複合化反応を行うためには、水素化シアノホウ素ナトリウムの水溶液を調製し、１．０ｍｅｑの水素化シアノホウ素ナトリウム（水素化シアノホウ素ナトリウム１．０ｍｏｌ／多糖類反復単位１ｍｏｌ）を複合化溶液に加える。水素化シアノホウ素ナトリウム溶液のモル濃度は、複合化時の溶液の約０．５％合計含水率の所期量に基づくものである。その複合化溶液を、血清型に特定の温度で血清型に特定の期間にわたって反応させて、ｍＤＴ：多糖類複合体中間体を製造する。

次に、水素化ホウ素ナトリウムの水溶液を調製し、２．０ｍｅｑの水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位に対して）を複合化溶液に加える。水素化ホウ素ナトリウム溶液のモル濃度は、水素化ホウ素化合物添加後の約１．０％合計含水率の所期量に基づくものである。その複合化溶液を、環境温度で３時間にわたって反応させて（反応時間が２時間である、血清型７Ｆなどのある種の血清型を除く）、ｍＤＴ：多糖類複合体を製造する。

複合化反応を反応停止するため、複合化溶液を、希釈段階で、特定の血清型からの多糖類を含む複合体の場合に、複合化溶液を１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液（０．０２５％(重量／体積）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ塩化ナトリウム）にゆっくり加えることで２０％（体積比）以下のＤＭＳＯに希釈することで、反応停止複合体溶液を製造する。特定の実施形態において、希釈段階中は、温度を１５℃以下に維持する。約１時間後、１．５Ｍリン酸カリウム、ｐＨ６．０溶液をその溶液に加えて最終濃度２５ｍＭリン酸カリウムとすることができる。全体的な多糖類及びｍＤＴ消費、複合体多糖類／ｍＤＴ比、及び複合体分子量によって、複合化成績を評価することができる。

限外濾過段階３において、反応停止複合体溶液を濃縮して約２．５ｇ／Ｌとし、３０ｋＤａタンジェント流限外濾過膜を用いて、２～８℃で最大約１０ダイアボリュームの１５０ｍＭ塩化ナトリウム又は２５ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウムに対してダイアフィルトレーションして、ダイアフィルトレーション液３を製造することができる。限外濾過段階３からのダイアフィルトレーション液３中の多糖類濃度は、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）紫外線多角度光散乱屈折率（ＵＶ－ＭＡＬＳ－ＲＩ）によって求めることができる。血清型１９Ｆなどの一部の血清型からの多糖類を含む複合体の場合、ダイアフィルトレーション液３を０．２２ミクロンフィルターで濾過して濾液を製造することができ、それを次に２２℃で約１２０時間にわたってインキュベートする。

限外濾過段階４において、限外濾過段階３からのダイアフィルトレーション液３又は濾液を濃縮して多糖類濃度約２．５ｇ／Ｌとし、３００ｋＤａタンジェント流限外濾過膜を用いて２～８℃で２０ダイアボリュームの１０ｍＭＬ－ヒスチジンの１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中溶液に対してダイアフィルトレーションして、ダイアフィルトレーション液４を製造することができる。ある種の血清型、例えば血清型７Ｆからの多糖類を含む複合体の場合、その複合体を、１００ｋＤａタンジェント流限外濾過膜に対してダイアフィルトレーションすることができ；例えば、血清型６Ａ、６Ｂ、及び１８Ｃ多糖類を含む複合体を、約３．５ｇ／Ｌに濃縮し、３００ｋＤａタンジェント流限外濾過膜を用いて２～８℃で１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び０．０３％(重量／体積）ポリソルベート２０、ｐＨ７．０を含む緩衝剤に対してダイアフィルトレーションして、ダイアフィルトレーション液４を製造することができる。血清型７Ｆ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆ多糖類を含む複合体を、濃縮して約２．０ｇ／Ｌとし、３００ｋＤａ再生セルロースタンジェント流限外濾過膜を用いて２～８℃で１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び０．０１５％(重量／体積）ポリソルベート２０、ｐＨ７．０を含む緩衝剤に対してダイアフィルトレーションして、ダイアフィルトレーション液４を製造することができる。ダイアフィルトレーション液２中の多糖類濃度は、ＨＰＳＥＣ ＵＶ－ＭＡＬＳ－ＲＩによって求めることができる。緩衝剤は、１０～５０ｍＭアセテート、リン酸、トリス、ＨＥＰＥＳ又はアミノ酸緩衝剤、例えばヒスチジンであることができる。特定の実施形態において、緩衝剤は１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンである。

限外濾過段階４からのダイアフィルトレーション液４を２２ミクロンフィルターで濾過して、第２の濾液を製造することができる。第２の濾液の多糖類濃度は、ＨＰＳＥＣ ＥＴＶ－ＭＡＬＳ－ＲＩによって求めることができる。第２の濾液の多糖類濃度が１．０ｇ／Ｌより大きい場合、第２の濾液を、追加の１０ｍＭＬ－ヒスチジン／１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０で希釈して多糖類濃度１．０ｇ／Ｌとすることができる。これによって、一価バルク複合体中間体（ＭＢＣ）又は一価薬剤物質が得られる。そのＭＢＣを少量ずつディスペンスし、－６０℃～－８０℃で冷凍することができる。

血清型６Ａ、６Ｂ、及び１８Ｃ多糖類を含む複合体についての限外濾過段階４からのダイアフィルトレーション液４を、二重膜０．５／０．２ミクロンフィルターで濾過して、第２の濾液を製造することができる。第２の濾液の多糖類濃度は、ＨＰＳＥＣ ＥＴＶ－ＭＡＬＳ－ＲＩによって求めることができる。第２の濾液の多糖類濃度が１．０ｇ／Ｌより大きい場合、その第２の濾液を、追加の１０ｍＭＬ－ヒスチジン／１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０３％(重量／体積）ポリソルベート２０、ｐＨ７．０で希釈して多糖類濃度１．０ｇ／Ｌとすることができる。これによって、ＭＢＣ又は一価薬剤物質が得られる。そのＭＢＣを少量ずつディスペンスし、－６０℃～－８０℃で冷凍することができる。

血清型７Ｆ、１９Ａ、１９Ｆ、及び２３Ｆ多糖類を含む複合体についてのダイアフィルトレーション液４を０．２２ミクロンフィルターで濾過して、第２の濾液を製造することができる。第２の濾液の多糖類濃度は、ＨＰＳＥＣ ＵＶ－ＭＡＬＳ－ＲＩによって求めることができる。第２の濾液の多糖類濃度が１．０ｇ／Ｌより大きい場合、第２の濾液を、追加の１０ｍＭＬ－ヒスチジン／１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１５％(重量／体積）ポリソルベート２０、ｐＨ７．０で希釈して、多糖類濃度１．０ｇ／Ｌとすることができる。これによって、ＭＢＣ又は一価薬剤物質が得られる。そのＭＢＣを少量ずつディスペンスし、－６０℃～－８０℃で冷凍することができる。

ＩＩＩ．多糖類
肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からの莢膜多糖類は、当業者に公知の標準的な技術によって製造することができる。例えば、多糖類を細菌から単離することができ、公知の方法によって（例えば欧州特許番号ＥＰ４９７５２４及びＥＰ４９７５２５を参照）；及び特定の実施形態では、モホジナイザーを用いて行われる顕微溶液化又は化学的加水分解によって、ある程度までサイズ調整しても良い。１実施形態において、Ｓ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株を大豆系培地で増殖させる。次に、個々の多糖類を、遠心、沈殿及び限外濾過などの標準的な段階によって精製する。例えば、米国特許出願公開第２００８／０２８６８３８号及び米国特許第５，８４７，１１２号を参照する。多糖類をサイズ調整して、粘度を下げたり、及び／又はその後の複合化生成物の濾過性を高めることができる。本発明において、莢膜多糖類は、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆ、及び３８の１以上から調製される。

ＩＶ．変異ジフテリア毒素
本発明の特定の実施形態において、ＣＲＭ_１９７をｍＤＴとして用いる。ＣＲＭ１９７はジフテリア毒素（ＤＴ）の無毒性変異体（即ち、毒素）である。１実施形態において、それは、カザミノ酸類及び酵母抽出物系培地で増殖させたジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）株Ｃ７（β１９７）の培養液から単離する。別の実施形態において、ＣＲＭ_１９７は米国特許第５，６１４，３８２号に記載の方法に従って組換え的に製造される。代表的には、ＣＲＭ_１９７は、限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿及びイオン交換クロマトグラフィーの組み合わせによって精製される。一部の実施形態において、ＣＲＭ_１９７は、ＰＦＥＮＥＸ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｐｆｅｎｅｘ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を用いて蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）で製造される。

ＣＲＭ_１７６、ＣＲＭ_２２８、ＣＲＭ_４５（Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， １９７３， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２１８：３８３８－３８４４）；ＣＲＭ_９、ＣＲＭ_４５、ＣＲＭ_１０２、ＣＲＭ_１０３及びＣＲＭ_１０７並びにＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔｏｘｉｎｓ， Ｅｄ： Ｆｒａｎｋｅｌ， Ｍａｅｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ， １９９２でＮｉｃｈｏｌｌｓ及びＹｏｕｌｅによって記載された他の変異体；欠失又はＧｌｕ－１４８のＡｓｐ、Ｇｌｎ若しくはＳｅｒへの及び／又はＡｌａ１５８のＧｌｙへの突然変異及び米国特許第４，７０９，０１７号又は米国特許第４，９５０，７４０号に開示の他の突然変異；少なくとも１以上の残基Ｌｙｓ５１６、Ｌｙｓ５２６、Ｐｈｅ５３０及び／又はＬｙｓ５３４の突然変異及び米国特許第５，９１７，０１７号又は米国特許第６，４５５，６７３号に開示の他の突然変異；又は米国特許第５，８４３，７１１号に開示の断片などの他のｍＤＴを用いることができる。

Ｖ．昇華乾燥
特定の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含む水系組成物及びｍＤＴを含む組成物は、昇華プロセスを用いて別個に乾燥させて、６％以下の最終含水率を有する乾燥ｍＤＴを含む組成物及び約６％以下の最終含水率を有する特定の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の乾燥多糖類を含む組成物を得ることができる。乾燥組成物は、例えば、連続モード又は半連続モードでの、凍結乾燥又は進行波様式での輻射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水（マイクロ波真空乾燥）、スプレー凍結乾燥、真空乾燥、ＲＦ乾燥などの昇華プロセスによって調製することができる。例えば、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｆｏｏｄ， ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ又はＸｕ ＆ Ｓｕｎａｄａ， Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ （Ｔｏｋｙｏ） ５５（１１）： １５４５－５０ （２００７）を参照する。凍結乾燥製剤成分は、凍結乾燥材料、例えばリオスフィアのケーキ又は粒子、例えばペレット、ビーズ又は球の形態であることができる。例えば、Ａ． Ｓ． Ｍｕｊｕｍｄａｒ （２００７）． Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｄｒｙｉｎｇ． ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓを参照する。
リオスフィアは、例えば、液滴が完全なままであるような形で固体平坦表面上に液滴（例えば、約２０、５０、１００又は２５０μＬ）の形で１以上の多糖類血清型を含む水溶液の少量サンプルを負荷することで作ることができる。本発明の１実施形態において、表面は、例えば約－１８０℃～約－１９６℃又は約－１８０℃～約－２７３℃の温度のプレート、例えば金属プレートである。例えば、本発明の１実施形態において、水溶液は、分注チップによって表面上に負荷する。本発明の１実施形態において、水溶液は、約３ｍＬ／分～約７５ｍＬ／分、約５ｍＬ／分～約７５ｍＬ／分；約３ｍＬ／分～約６０ｍＬ／分、約２０ｍＬ／分～約７５ｍＬ／分；及び約２０ｍＬ／分～約６０ｍＬ／分の分注速度で分注する。本発明の１実施形態において、分注される水溶液は２５０μＬであり、分注速度は約５ｍＬ／分～約７５ｍＬ／分であるか、小分けサンプルが１００μＬであり、分注速度は約３ｍＬ／分～約６０ｍＬ／分である。本発明の１実施形態において、分注チップと水溶液を分注する表面の間の隙間は約０．１ｃｍ以上である（例えば、約０．５ｃｍ又は０．１ｃｍ～１ｃｍ又は０．１ｃｍ～０．７５ｃｍ）。表面上に乗ると、水溶液は凍結され、凍結乾燥によって昇華乾燥される。リオスフィアの製造方法は、当業界では公知である。例えば、ＵＳ５６５６５９７；ＷＯ ２０１３０６６７６９；ＷＯ ２０１４０９３２０６；ＷＯ ２０１５０５７５４０；ＷＯ ２０１５０５７５４１又はＷＯ ２０１５０５７５４８を参照する。

本発明の１実施形態において、水溶液は、輻射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水（マイクロ波真空乾燥）によって凍結乾燥される。ＲＥＶ脱水は、減圧下に行われる乾燥方法であり、水の沸点及び雰囲気の酸素含有率が比較的低い。例えば、本発明の１実施形態において、水溶液の小分け量を、それが接触した時に単一の液滴として液滴を維持し、凍結ペレットとして表面上で凍結するような形で、表面温度が約－９０℃以下である固体表面上に単一液滴として乗せ；大気圧以下の圧力下で凍結ペレットにマイクロ波照射を行って、球などの乾燥ペレットを製造する。別の例では、当該水溶液をトレイ上で提供し、大気圧以下の圧力下でマイクロ波照射して、乾燥ケーキを製造する。例えば、米国特許第４，３８９，７９４号；同４，６６４，９２４号；同４，８０９，５９６号；同４，８８２，８５１号を参照する。

ＶＩ．多糖類－タンパク質複合化
精製多糖類を化学的に活性化して、ｍＤＴと反応することができる官能基を導入する。活性化すると、各莢膜多糖類を別個にｍＤＴに複合化して、本発明の方法に従って複合糖質を形成する。

１実施形態において、多糖類の化学的活性化は、米国特許第４，３６５，１７０号；同４，６７３，５７４号；及び同４，９０２，５０６号に記載の手段によって達成することができる。即ち、肺炎球菌多糖類を、酸化剤、例えば過ヨウ素酸系酸化剤、例えば過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム又は過ヨウ素酸と反応させて、隣接ヒドロキシル基のランダム酸化的開裂を生じて、反応性アルデヒド基を生じる。酸化された多糖類のｍＤＴ上の一級アミン基（主として、リジン残基）への直接アミノカップリングを、還元的アミノ化によって行うことができる。例えば、複合化は、水溶液中で、又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの有機溶媒中で行うことができる。例えば、ＵＳ２０１５／０２３１２７０Ａ１、ＥＲ０４７１１７７Ｂ１、ＵＳ２０１１／０１９５０８６Ａ１を参照する。複合化反応が終わると、水素化ホウ素ナトリウムなどの強い還元剤を加えることで、未反応アルデヒドをキャッピングする。

１実施形態において、多糖類の化学的活性化及びその後のｍＤＴへの複合化を、米国特許第４，３６５，１７０号、同４，６７３，５７４号及び同４，９０２，５０６号に記載の手段によって行う。即ち、多糖類を過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム又は過ヨウ素酸などの過ヨウ素酸系酸化剤と反応させて、隣接ヒドロキシル基のランダムな酸化的開裂を生じさせて、反応性アルデヒド基を発生させる。次に、酸化された多糖類のｍＤＴ上の一級アミン基（主としてリジン残基）への直接アミノカップリングを、還元的アミノ化によって行うことができる。例えば、活性化多糖類及びｍＤＴの混合物を、ニッケルの存在下に水素化シアノホウ素ナトリウムなどの還元剤と反応させることによって複合化を行う。その複合化反応は、水溶液又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの有機溶媒中で行うことができる。例えば、ＵＳ２０１５／０２３１２７０Ａ１、ＥＰ０４７１１７７Ｂ１、ＵＳ２０１１／０１９５０８６Ａ１を参照する。複合化反応が終了したら、水素化ホウ素ナトリウムなどの強い還元剤を加えることで、未反応のアルデヒドを還元しても良い。

１実施形態において、製剤に先だって、各肺炎球菌莢膜多糖体を個別にＳ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から精製し、活性化して反応性アルデヒドを形成し、次に、ニッケルの存在下に水素化シアノホウ素ナトリウムによる還元的アミノ化を用いてｍＤＴに共有結合的に複合化させる。ニッケルは、還元的アミノ化に使用される水素化シアノホウ素ナトリウム還元剤からの残留する妨害性のシアン化物と錯体を形成する。従って、複合化反応効率を高くするために本明細書の方法においてニッケルを用い、遊離シアン化物の除去を助けることができる。

遷移金属は、シアン化物と安定な錯体を形成することが知られており、水素化シアノホウ素ナトリウムによるタンパク質アミノ基及びホルムアルデヒドの還元的メチル化を改善することが知られている。Ｇｉｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ １９８２， ２０３ ： ３３１－３３４； Ｊｅｎｔｏｆｔ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９８０， １０６： １８６－１９０を参照する。しかしながら、本願人は驚くべきことに、残留する妨害性のシアン化物を錯形成することにより、ニッケル添加が複合化時のタンパク質の消費を増加させ、より大きい免疫原性がより高い可能性がある複合体を形成させることを見出した。

市販の水素化シアノホウ素ナトリウム試薬ロット中の遊離シアン化物レベルは変動するために、複合化成績に一貫性がなくなって、分子量及び多糖類／タンパク質の比などの複合体の属性が変動し得る。複合化反応にニッケルを加えることで、遊離シアン化物のレベルが低下し、それによってロット間の複合体の一貫性の程度が改善される。

別の実施形態において、当該複合化方法は、１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウム・テトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）による多糖類の活性化によるシアン酸エステルの形成を用いることができる。活性化されたサッカリドを、ｍＤＴ上のアミノ基に直接カップリングさせることができる。

別の実施形態において、シアン酸エステルを、いくつかの利用可能な形態のいずれかと反応させることで、反応性のホモ二官能性又はヘテロ二官能性基を活性化多糖類に導入することができる。例えば、シスタミン又はシステアミンを用いてチオール化多糖類を製造することができ、それを、マレイミド活性化ｍＤＴ（例えば、ＧＭＢＳを使用）又はハロアセチル化ｍＤＴ（例えば、ヨードアセトイミド［例えばエチルヨードアセトイミドＨＣｌ］又はＮ－スクシニミジルブロモアセテート又はＳＩＡＢ、又はＳＩＡ、又はＳＢＡＰを使用）との反応後に得られるチオエーテル連結を介してｍＤＴにカップリングさせることができると考えられる。そのような複合体は、国際特許出願公開番号ＷＯ ９３／１５７６０、ＷＯ ９５／０８３４８及びＷＯ ９６／２９０９４；及びＣｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４０：２４５－２５６に記載されている。

他の好適な複合化方法は、カルボジイミド類、ヒドラジド類、活性エステル類、ノルボラン（ｎｏｒｂｏｒａｎｅ）、ｐ－ニトロ安息香酸、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド、Ｓ－ＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを用いるものである。多くのものが、国際特許出願公開番号ＷＯ ９８／４２７２１に記載されている。複合化には、カルボニル連結基が関与していることができ、それはサッカリドの遊離ヒドロキシル基のＣＤＩとの反応（Ｂｅｔｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９７９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５４：２５７２－４； Ｈｅａｒｎ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ２１８：５０９－１８参照）と、次にｍＤＴとの反応によるカーバメート連結の形成によって形成することができる。この化学は、炭水化物のアノマー末端の還元による一級ヒドロキシル基の形成と、次に前記一級ヒドロキシルのＣＤＩとの反応によるカーバメート中間体の形成及びその後のｍＤＴアミノ基へのカップリングからなる。その反応では、サッカリド上の他の一級ヒドロキシル基の任意の保護／脱保護が必要となる可能性がある。

以下の例は、本発明についての理解をさらに深めるためのものである。

実施例１
Ｓ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖類６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、及び２３Ｆの製造
肺炎球菌の培養方法は、当業界で公知である。例えば、Ｃｈａｓｅ， １９６７， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １ ：５２を参照する。肺炎球菌莢膜多糖体の製造方法も当業界では公知である。例えば、欧州特許番号ＥＰ０４９７５２４を参照する。肺炎球菌サブタイプの単離物が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から入手可能である。細菌は、血液－寒天でアルファ溶血性である被包性、非運動性、グラム陽性、槍形双球菌と確認される。サブタイプは、特異的血清を用いる膨張反応に基づいて識別することができる。例えば、米国特許第５，８４７，１１２号を参照する。

存在するＳ．ニューモコッカス（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）血清型のそれぞれを代表する細胞バンクは、冷凍バイアルでＭｅｒｃｋ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒａｈｗａｙ， ＮＪ）から得られる。解凍種子培養物を、Ｓ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に適した前滅菌増殖培地が入った種子発酵槽に移す。その培養物を、温度及びｐＨ制御しながら種子発酵槽で増殖させる。種子発酵槽の全体積を、前滅菌増殖培地の入った製造発酵槽に移す。その製造発酵は、当プロセスの最終細胞増殖段階である。温度、ｐＨ、及び攪拌速度を制御する。
発酵プロセスは、不活化剤を加えることで終了させる。不活性化後、溶液を不活性化槽に移し、その溶液を制御された温度及び攪拌下に保持する。遠心及び濾過の組み合わせを用いて細胞残屑を除去する。溶液を限外濾過し、ダイアフィルトレーションする。次に、その溶液について、溶媒に基づく分別を行って、不純物を除去し、多糖類を回収する。

実施例２
多糖類のサイズ低下及び活性化を次のように行う。
精製肺炎球菌莢膜多糖体（Ｐｓ）粉末約６ｇを、室温で注射用水（ＷＦＩ）に溶かした所望の濃度である約４ｇ／Ｌとする。次に、その溶液を０．４５ミクロン濾過して、バイオバーデンを減らす。濾過したＰｓ溶液のＰｓ濃度を、ＨＰＳＥＣ ＵＶ－ＭＡＬＳ－ＲＩによって求める。

血清型１８Ｃ及び１９Ａを除く本明細書で開示の全ての血清型について、Ｐｓを含む溶液を希釈して約２．５ｇ／Ｌとし、ＧＥＡ－Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ Ｐａｎｄａ ２Ｋホモジナイザーを用いて均質化して、Ｐｓの分子量を低下させる。ホモジナイザー圧及びホモジナイザー通過回数を、血清型特有値に制御する（表１）。均質化中、ホモジナイザー出口での熱交換器への冷水の供給を用いて温度を制御する。

均質化に代えて、酸加水分解を用いて、血清型１８Ｃ Ｐｓの分子量を低下させる。濾過した血清型１８Ｃ Ｐｓ溶液の温度を、ロットＡについては約９６℃、ロットＢについては約９０℃に上昇させる。次に、溶液を氷酢酸（１７．４Ｍ）で調節して０．２Ｍの最終濃度とし、ロットＡについては約１８０分間、ロットＢについては約１６０分間保持する。１．５Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７．０を０．４６Ｍの最終濃度まで加えて、溶液ｐＨを上昇させることで酸加水分解を停止し、次に、溶液を冷却して室温とする。

血清型１９Ａを含む溶液は０．４５ミクロン濾過もサイズ低下も行わない。その初期サイズが相対的に小さいため、サイズ低下は必要ない。溶解後、血清型１９Ａを、次の段落に記載のように０．２２ミクロン濾過する。

次に、各溶液を、０．２２ミクロンフィルターを用いて濾過して、バイオバーデンを減らしてから、限外濾過１段階を行う。濾過したＰｓを、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を用いて約１０ｇ／Ｌに濃縮し、次に環境温度で６ダイアボリュームのＷＦＩに対してダイアフィルトレーションして、限外濾過１プロセス中間体（ＵＦ１－ＦＲ）を得る。血清型１８Ｃでは、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ膜に代えて５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ膜を用いて、酸加水分解によって生じる低分子量Ｐｓを保持することでＰｓ回収を向上させる。ＵＦ１－ＦＲのＰｓ濃度を、ＨＰＳＥＣ ＵＶ－ＭＡＬＳ－ＲＩによって求める。ＷＦＩをＵＦ１－ＦＲに加えてＰｓ活性化の前に約１０ｇ／ＬのＰｓ濃度を達成する。

次に、２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝剤を加えて、活性化反応段階のｐＨを制御する。Ｐｓ活性化反応時の酢酸ナトリウム濃度及びｐＨ、及び温度を、各血清型に特有の値に制御する（表２）。

ＰｎＰｓ反復単位（ＲＵ）１モル当たりの過ヨウ素酸のモル数に基づいて溶液に１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を加えることで、過ヨウ素酸活性化を開始する。

活性化の際、血清型特有反応時間をかけて隣接ジオールを酸化して反応性アルデヒドとする。この反応によって、活性化生成物（ＡＰ）プロセス中間体を生じる。入れたメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量及び反応時間を、各血清型に固有の値に制御する（表２）。

Ｐｓ活性化後、溶液を、２～８℃で１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を用いて、６ダイアボリュームの１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４、次に追加の６ダイアボリュームのＷＦＩに対してダイアフィルトレーションする。血清型１８Ｃでは、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ膜に代えて５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ膜を用いて、酸加水分解によって生じる低分子量Ｐｓを保持することでＰｓ回収を向上させる。次に、溶液を濃縮して、限外濾過２プロセス中間体（ＵＦ２－ＦＲ）を得る。ＵＦ２－ＦＲのＰｓ濃度を、ＨＰＳＥＣ ＵＶ－ＭＡＬＳ－ＲＩによって求める。ＵＦ２－ＦＲサンプルをチオセミカルバジドで誘導体化し、次にチオセミカルバゾンをＵＶ検出を行うＨＰＳＥＣによって検出することで、活性化の程度を測定する。

実施例３
ＣＲＭ_１９７の製造を次のように行うことができる。

前記の方法（国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１７３８７６を参照する）に従って蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現によって得られた冷凍の精製ＣＲＭ_１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を用いて１０ダイアボリュームの２ｍＭリン酸、ｐＨ７．２緩衝剤に対してダイアフィルトレーションし、０．２２ミクロン濾過する。特定の実施形態において、５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４（血清型１８Ｃに複合化させたい場合は、５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を用いる。）。ダイアフィルトレーションした溶液を、ショ糖含有水で希釈して１．０～５．３％(重量／体積）の最終濃度とし、凍結乾燥して、６％以下の最終含水率を有する乾燥ＣＲＭ_１９７を製造する。下記の表３は、特定の血清型多糖類に対する複合化のためのＣＲＭ_１９７についての代表的ショ糖濃度を提供する。

実施例４
多糖類（Ｐｓ）及びＣＲＭ_１９７（Ｐｒ）の凍結乾燥は以下の通りである。

凍結乾燥に先だって、ＣＲＭ_１９７及びＰｓ溶液を下記に記載のように希釈する。
一部の実施形態において、ＷＦＩ、５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．４（血清型１８Ｃの場合はｐＨ７．０）、及び調製したばかりの３０％(重量／体積）ショ糖のＷＦＩ中溶液を用いて、ＣＲＭ_１９７溶液を希釈して、６．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度とする。ＷＦＩ及び調製したばかりの３０重量／体積％ショ糖のＷＦＩ中溶液を用いて、ＥＩＦ２－ＦＲ Ｐｓ溶液を希釈して、６．０ｍｇ／ｍＬのＰｓ濃度とする。

一部の実施形態において、ＷＦＩ、２ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、及び調製したばかりの５０％(重量／体積）ショ糖のＷＦＩ中溶液を用いて、ＣＲＭ_１９７溶液を希釈して、６．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度とする。ＷＦＩ及び調製したばかりの５０％(重量／体積）ショ糖のＷＦＩ中溶液を用いて、ＥＩＦ２－ＦＲ Ｐｓ溶液を希釈して、６．０ｍｇ／ｍＬのＰｓ濃度とする。

血清型特有のショ糖及びリン酸濃度を用いる（例えば表３を参照する）。希釈したＣＲＭ_１９７及びＥＩＦ２－ＦＲ溶液を、Ｖｉｒｔｉｓ Ｇｅｎｅｓｉｓ Ｆｒｅｅｚｅ Ｄｒｙｅｒを用いて凍結乾燥する。

実施例５
本実施例は、ＤＭＳＯ中でのＣＲＭ_１９７の再構成時間がフーリエ変換赤外線分光法（ＦＴＩＲ）によって測定される二次構造に影響することを示すものである。

６ｍｇ／ｍＬ、５％(重量／体積）ショ糖、１．２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２で凍結乾燥された凍結乾燥ＣＲＭ_１９７を、低速（８分）又は急速再構成（２分）を用いて、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈからの無水ＤＭＳＯ、２７６５５－１００ｍＬ）中で再構成して１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度とし、次に混和して均一溶液を製造する。再構成は、時間点に達するまで３０秒ごとに適切な容量のＤＭＳＯを加えることで行う。５０ｍｍ ＣａＦ_２ウィンドウでの伝送モードを用い、制御温度（２５℃）で、ＢｉｏＴｏｏｌｓ ＰＲＯＴＡ－３Ｓによって、ＦＴＩＲスペクトラムを得る。５０回の走査を４ｃｍ^－１の分解能で取得し、平均を求め、緩衝剤を減算し、水蒸気補正をすることができる。

急速添加（２分）によるＤＭＳＯ中で再構成した凍結乾燥ＣＲＭ_１９７は、１６６０ｃｍ^－１の予想遊離カルボニルアミドＩピークを示し、それは、ＤＭＳＯ中でのＣＲＭ_１９７の完全な変性を示すものである（図１）。ＣＲＭ_１９７を低速添加時間（８分）でＤＭＳＯ中で再構成する場合、アミドＩ領域中に第２のピーク（１６２６ｃｍ^－１）が存在する。この第２のピークは、分子内βシート形成に帰因される。

実施例６
本実施例は、ＣＲＭ_１９７を中間再構成時間（４分）で再構成し、最長３００分間保持することで、保持時間が増えるに連れて分子内βシートの割合が増えることを示すものである。

６ｍｇ／ｍＬ、５％(重量／体積）ショ糖、１．２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２で凍結乾燥された凍結乾燥ＣＲＭ_１９７を、４分間の期間をかけてＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈからの無水ＤＭＳＯ、２７６５５－１００ｍＬ）中で再構成して１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度とする。再構成は、時間点に達するまで３０秒ごとに適切な容量のＤＭＳＯを加えることで行う。初期時点で取得を行った後（Ｔ０）、サンプルをＦＴＩＲ中で保持し、さらなる時点での取得を行う（３０、６０、１２０，１８０、２４０、３００分）。５０ｍｍ ＣａＦ_２ウィンドウでの伝送モードを用い、制御温度（２５℃）で、ＢｉｏＴｏｏｌｓ ＰＲＯＴＡ－３Ｓによって、ＦＴＩＲスペクトラムを得る。５０回の走査を４ｃｍ^－１の分解能で取得し、平均を求め、緩衝剤を減算し、水蒸気補正をすることができる。

中間時間（４分）でＤＭＳＯ中にてＣＲＭ_１９７を再構成することで、分子間βシートアミドＩピークの存在によって示されるタンパク質凝集が生じる（図２）。保持時間を最大３００分まで増やすことで、それに比例して、分子間βシートの量が増加し、遊離カルボニルアミドＩピークの量が低下する（図２）。

実施例７
本実施例は、分子間βシートの形成が濃度依存性であることを示すものである。

６ｍｇ／ｍＬ、５％(重量／体積）ショ糖、１．２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２で凍結乾燥された凍結乾燥ＣＲＭ_１９７を、２分間の期間をかけてＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈからの無水ＤＭＳＯ、２７６５５－１００ｍＬ）中で再構成して１０、３０、又は５０ｍｇ／ｍＬの最終濃度とする。再構成は、時間点に達するまで３０秒ごとに適切な容量のＤＭＳＯを加えることで行う。

５０ｍｍ ＣａＦ_２ウィンドウでの伝送モードを用い、制御温度（２５℃）で、ＢｉｏＴｏｏｌｓ ＰＲＯＴＡ－３Ｓによって、ＦＴＩＲスペクトラムを得る。５０回の走査を４ｃｍ^－１の分解能で取得し、平均を求め、緩衝剤を減算し、水蒸気補正をすることができる。粘度１．９９６ｃＰを用いる、制御温度（２５℃）で、準備された濃度で、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＺＳを用いて、動的光散乱（ＤＬＳ）測定値を得る。

ＣＲＭ_１９７を１０ｍｇ／ｍＬで急速再構成する場合（図３、２分）、分子間βシート形成の証拠は全くなく、当初の所見を裏付けるものである（図１）。より高い濃度（３０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ）では、急速再構成時間（２分）であっても分子間βシートが形成される。これは、低速再構成時に存在するＣＲＭ_１９７濃度が高いと、分子間βシートが形成されるという仮説を裏付けるものである。タンパク質凝集と一致して、相対的に低い濃度（図４Ａ）と比較して相対的に高い濃度（図４Ｂ）で再構成したＣＲＭ_１９７中の相対的に大きい粒子の割合増加を示すＤＬＳデータも、この濃度仮説を裏付けるものである。

実施例８
ＣＲＭ_１９７の再構成に用いられるＤＭＳＯ中の水濃度が高くなると、分子間βシートの形成が増加する。

６ｍｇ／ｍＬ、５％(重量／体積）ショ糖、１．２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２で凍結乾燥された凍結乾燥ＣＲＭ_１９７を、９５％、９７％、９９％（体積比）のＤＭＳＯ／水中又は無水ＤＭＳＯ中、２分間の期間をかけてＤＭＳＯ（無水ＤＭＳＯは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈからのものであることができる。２７６５５－１００ｍＬ）中で再構成して、１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度とする。無水ＤＭＳＯは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｄ２４３８－５０ｍＬであっても良い。再構成は、時間点に達するまで３０秒ごとに適切な容量のＤＭＳＯを加えることで行う。５０ｍｍ ＣａＦ_２ウィンドウでの伝送モードを用い、制御温度（２５℃）で、ＢｉｏＴｏｏｌｓ ＰＲＯＴＡ－３Ｓによって、ＦＴＩＲスペクトラムを得る。５０回の走査を４ｃｍ^－１の分解能で取得し、平均を求め、緩衝剤を減算し、水蒸気補正をすることができる。

ＣＲＭ_１９７を無水ＤＭＳＯ中、１０ｍｇ／ｍＬで再構成する場合（図５）、分子間βシート形成の証拠は全くなく、当初の所見を裏付けるものである（図１、図３）。非常に少量の水（９９％ＤＭＳＯ／水）は、分子間βシートの小さいショルダーを示し、水が増えると（９７％、９５％ＤＭＳＯ／水）その量が増える。これは、再構成における水の量が増えると分子間βシート形成量が増えるという仮説を裏付けるものである。

実施例９
凍結乾燥ＣＲＭ_１９７中の水分レベルが低下しても、低速再構成に対する感受性は下がらない。

ケーキ中に存在する水分を減らすようにしてＣＲＭ_１９７を凍結乾燥する（乾燥サイクルを延長し、充填体積を減らす）（１．２５ｍＭリン酸、ｐＨ７．２含有１％(重量／体積）ショ糖中、約６ｍｇ／ｍＬ）。凍結乾燥ＣＭＲ_１９７を、ＤＭＳＯ（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈからの無水ＤＭＳＯ、Ｄ２４３８－５０ｍＬ）中、２分若しくは８分の期間をかけて再構成して、１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度とする。再構成は、時間点に達するまで３０秒ごとに適切な容量のＤＭＳＯを加えることで行う。５０ｍｍ ＣａＦ_２ウィンドウでの伝送モードを用い、制御温度（２５℃）で、ＢｉｏＴｏｏｌｓ ＰＲＯＴＡ－３Ｓによって、ＦＴＩＲスペクトラムを得る。５０回の走査を４ｃｍ^－１の分解能で取得し、平均を求め、緩衝剤を減算し、水蒸気補正をすることができる。

ＣＲＭ_１９７のＤＭＳＯ再構成における水が増えることで、分子間βシート形成の割合が増える（図５）。含水率を減らすように凍結乾燥したＣＲＭ_１９７を、二つの異なる速度、急速（２分）及び低速（８分）で、無水ＤＭＳＯ中で再構成する。凍結乾燥ＣＲＭ_１９７の含水量低下は、再構成時間にわたる分子間βシート形成に対するＣＲＭ_１９７の感受性を低下させるものではない（図６）。

実施例１１
凍結乾燥Ｐｓ及びＣＲＭ_１９７（Ｐｒ）を、等体積の無水ＤＭＳＯを用いて環境温度で再溶解して、Ｐｓ及びＰｒ均一溶液を調製する。ＣＲＭ_１９７を、２分という急速度で再溶解させる。一部の実施形態において、５００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２緩衝剤を、ＤＭＳＯ再溶解タンパク質溶液に加えて、１．０ｍＭリン酸ナトリウムの最終濃度とする。ＤＭＳＯ中での再溶解後、Ｐｓ溶液及びＣＲＭ_１９７溶液を、血清型特有最終Ｐｓ濃度及びＰｓ：ＣＲＭ_１９７比とするように上記のように合わせる（表４）。

水素化シアノホウ素ナトリウムのＷＦＩ中溶液を調製し、１．０ｍｅｑの水素化シアノホウ素ナトリウム（水素化シアノホウ素ナトリウム１．０ｍｏｌ／Ｐｓ反復単位１モル）を溶液に加える。水素化シアノホウ素ナトリウム溶液のモル濃度（表５）は、目標とする複合化時の溶液の約０．５％合計含水率に基づくものである。その溶液を血清型特有の温度で血清型に特有の期間にわたって反応させて（表５）、複合化生成物中間体（ＣＰ）を得る。

水素化ホウ素ナトリウムのＷＦＩ中溶液を調製し、２．０ｍｅｑの水素化ホウ素ナトリウム（Ｐｓ反復単位に対して）を溶液に加える。水素化ホウ素ナトリウム溶液のモル濃度（表５）は、ホウ水素化物添加後の溶液中の約１．０％合計含水率の所期値に基づくものである。その溶液を環境温度で２～３時間にわたって反応させて、複合体生成物クエンチされた中間体（ＣＰＱ）を得る。

次に、複合化溶液を１５０ｍＭ塩化ナトリウム（一部の実施形態での複合体については、０．０２５重量／体積％ポリソルベート２０含有１５０ｍＭ塩化ナトリウム）にゆっくり加えることで、その溶液を２０％以下（体積比）無水ＤＭＳＯまで希釈する。その希釈段階中、溶液温度は１５℃より低く維持する。約１時間後、１．５Ｍリン酸カリウム、ｐＨ６．０を、溶液に加えて、２５ｍＭリン酸カリウムの最終濃度とする。全体的なＰｓ及びＣＲＭ_１９７消費、複合体Ｐｓ／ＣＲＭ_１９７比、及び複合体分子量によって、複合化成績を評価する。

複合化溶液を濃縮して約２．５ｇ／Ｌとし、３０ｋＤ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を用いて２～８℃で、１５０ｍＭ塩化ナトリウム中１５０ｍＭ塩化ナトリウム又は２５ｍＭリン酸カリウム１０ダイアボリュームに対してダイアフィルトレーションする。これによって、限外濾過３プロセス中間体（ＵＦ３－ＦＲ）が得られる。ＵＦ３－ＦＲのＰｓ濃度は、ＩＴＰＳＥＣ ＵＶ－ＭＡＬＳ－ＲＩによって求められる。

一部の実施形態における１９Ｆについては、ＵＦ３－ＦＲを０．２２ミクロン濾過し、次に２２℃で約１２０時間インキュベートする。

次に、ＵＦ３－ＦＲ溶液を、限外濾過４段階で処理する。一部の実施形態における限外濾過４段階中、溶液を濃縮して約２．５ｇ／ＬのＰｓ濃度とし、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ Ｂｉｏｍａｓ ＰＥＳタンジェント流限外濾過膜を用いて、２～８℃で１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中の１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン２０ダイアボリュームに対してダイアフィルトレーションする。血清型７Ｆには、限外濾過４段階に１００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ膜を用いる。血清型６Ａ、６Ｂ、及び１８Ｃについては、ＵＦ３－ＦＲ溶液を濃縮して約３．５ｇ／Ｌとし、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ Ｕｌｔｒａｃｅｌ再生セルロースタンジェント流限外濾過膜を用いて、２～８℃で１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０３重量／体積％ＰＳ－２０、ｐＨ７．０中の１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンに対してダイアフィルトレーションする。これによって限外濾過４プロセス中間体（ＵＦ４－ＦＲ）を得る。ＵＦ４－ＦＲのＰｓ濃度は、ＨＰＳＥＣ ＵＶ－ＭＡＬＳ－ＲＩによって求める。

ＵＦ４－ＦＲをＰＶＤＦフィルターで０．２２ミクロン濾過する。濾液のＰｓ濃度は、ＨＰＳＥＣ ＵＶ－ＭＡＬＳ－ＲＩによって求める。濾液のＰｓ濃度が１．０ｇ／Ｌより大きい場合、濾液を追加の１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンで希釈して、１．０ｇ／ＬのＰｓ濃度とする。これによって、一価バルク複合体中間体（ＭＢＣ）を得る。ＭＢＣを少量ずつ分注し、－６０℃～－８０℃で冷凍する。

血清型６Ａ、６Ｂ、及び１８ＣにおけるＵＦ４－ＦＲを二重膜ＰＥＳフィルターによって０．５／０．２ミクロン濾過する。濾液のＰｓ濃度を、ＨＰＳＥＣ ＵＶ－ＭＡＬＳ－ＲＩによって求める。濾液のＰｓ濃度が１．０ｇ／Ｌより大きい場合、濾液を、追加の１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０３重量／体積％ＰＳ－２０、ｐＨ７．０中の１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンで希釈して１．０ｇ／ＬのＰｓ濃度とする。これによって、一価バルク複合体中間体（ＭＢＣ）を得る。ＭＢＣを少量ずつ分注し、－６０℃～－８０℃で冷凍する。

血清型７Ｆ、１９Ａ、１９Ｆ、及び２３ＦにおけるＵＦ４－ＦＲをＰＶＤＦフィルターで０．２２ミクロン濾過する。濾液のＰｓ濃度を、ＨＰＳＥＣ ＵＶ－ＭＡＬＳ－ＲＩによって求める。濾液のＰｓ濃度が１．０ｇ／Ｌより大きい場合、濾液を、追加の１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１５重量／体積％ＰＳ－２０、ｐＨ７．０中の１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンで希釈して１．０ｇ／ＬのＰｓ濃度とする。これによって、一価バルク複合体中間体（ＭＢＣ）を得る。ＭＢＣを少量ずつ分注し、－６０℃～－８０℃で冷凍する。

実施例１２
ＣＲＭ_１９７を無水ＤＭＳＯ中でゆっくり（８分）再構成し、次に６Ｂ多糖類に複合化する場合、複合化後に分子間βシートが存在する。

ＣＲＭ_１９７を急速（２分）又は低速（８分）でＤＭＳＯ中で再構成し、次に、前述のように６Ｂ多糖類に複合化し、前述のように精製し、及び（１０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７）中約１ｍｇ／ｍＬの濃度にダイアフィルトレーションする。次に、サンプルをＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １１Ｋ ＭＷＣＯフィルターによって濃縮して、ＦＴＩＲ測定できるようにする。５０ｍｍ ＣａＦ_２ウィンドウでの伝送モードを用い、制御温度（２５℃）で、ＢｉｏＴｏｏｌｓ ＰＲＯＴＡ－３Ｓによって、ＦＴＩＲスペクトラムを得る。５０回の走査を４ｃｍ^－１の分解能で取得し、平均を求め、緩衝剤を減算し、水蒸気補正をすることができる。次に、Ｏｍｉｃソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてデータを解析する。

ＤＭＳＯ中でゆっくり再構成されたＣＲＭ_１９７で作られたＣＲＭ_１９７－６Ｂ複合体（図７）は、分子間βシート形成の証拠を示しており、再構成後であってもＣＲＭ_１９７凝集が存在することを示している。急速再構成したＣＲＭ_１９７で作られたＣＲＭ_１９７－６Ｂ複合体（図７）は予想される遊離Ｃ＝Ｏアミドを示し、見かけのβシート形成を全く示さない。

実施例１３
本実施例は、無水ＤＭＳＯ中での還元的アミノ化を用いる、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆ、又は３８からのＰｓのＣＲＭ_１９７（Ｐｒ）への複合化方法を示すものである。共通のプロセスフローを用いて、異なる血清型多糖類を、精製ＣＲＭ_１９７に個々に複合化する。

前述の方法に従って製造した乾燥ＣＲＭ_１９７を、２分間かけて乾燥ＣＲＭ_１９７に無水ＤＭＳＯを急速添加することで無水ＤＭＳＯ中で再構成し、Ｐｓをそれぞれ別個に無水ＤＭＳＯ中で再構成して、Ｐｒ及びＰｓ均一溶液を得る。Ｐｓ及びＰｒをそれぞれ、合計複合化反応体積の半量で再構成する。従って、ＤＭＳＯ再構成後のＰｓ濃度は、表４から計算される２．２～７．６ｇ／Ｌの複合化範囲時２倍Ｐｓ濃度である。ＤＭＳＯ再構成後のＰｒ濃度は、１．５～５．７ｇ／Ｌの２倍（複合化時Ｐｓ濃度／Ｐｓ：Ｐｒ比）範囲である。次に、Ｐｒ均一溶液及びＰｓ均一溶液を合わせる。次に、水素化シアノホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を混合物に加え、血清型特有の期間（１～４８時間）にわたって複合化を進行させて、目標の複合体サイズとする。

水素化ホウ素ナトリウムによる還元
複合化反応後に水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）を加え、溶液を２２℃で１時間インキュベートする。その溶液を、約４℃で１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２５％(重量／体積）ポリソルベート２０で希釈する。次に、リン酸カリウム緩衝剤を加えてｐＨを中和する。溶液を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を用いて１５０ｍＭ塩化ナトリウムに対して約４℃でダイアフィルトレーションする。

最終濾過及び生成物保存
次に、各溶液を濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を用いて４℃で１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションする。残った溶液を０．２２ミクロン濾過する。

血清型１９Ｆを約５日間インキュベートし、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を用いて約４℃で１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションし、０．２２ミクロン濾過する。血清型１８Ｃを、３００ｋＤａ ＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を用いて約４℃で１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中の１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションし、０．２２ミクロン濾過する。

溶液を、追加の１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンで希釈し、少量ずつ分注し、≦－６０℃で冷凍する。

実施例１４
本実施例は、異なる界面活性剤及び安定剤を含む１５価肺炎球菌複合体ワクチンの製剤を示す。

上記の方法に従って製造された肺炎球菌多糖類－タンパク質複合体を、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆを有する１５価肺炎球菌複合体ワクチン（ＰＣＶ１５）の製剤に用いる。

前記の方法による無水ＤＭＳＯ中での還元的アミノ化によって得られた肺炎球菌多糖類－ＣＲＭ１９７複合体を用いて、製剤を調製する。個々の血清型の所期の最終濃度を得るのに必要なバルク複合体の必要な体積を、溶液体積及びバルク多糖類濃度に基づいて計算する。１５の複合体を、塩化ナトリウム、Ｌ－ヒスチジン、ポリソルベート（ＰＳ）－２０含有ｐＨ５．８緩衝剤、ＰＳ－８０、又はポロキサマー（Ｐ）１８８から選択される賦形剤と組み合わせる。

無菌製剤バルクを、プロピレングリコール（ＰＧ）及びポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）を含む若しくは含まないバルクリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）とそれとの組み合わせ時及びその後にゆっくり混和する。複合体及びＡＰＡの二つの濃度を、各種製剤で調べる。一つは、８μｇ／ｍＬ血清型６Ｂ多糖類、他の全ての血清型について４μｇ／ｍＬ多糖類、及び２５０μｇ／ｍＬＡＰＡを含むものであった。他方は、１６μｇ／ｍＬ血清型６Ｂ多糖類、他の全ての血清型について８μｇ／ｍＬ多糖類、及び５００μｇ／ｍＬＡＰＡを含むものであった。製剤されたワクチンは、２～８℃で保存する。

ＡＰＡはヒドロキシリン酸アルミニウムの水系懸濁液である。ＡＰＡは、塩化アルミニウム及びリン酸ナトリウムを１：１体積比を組み合わせてヒドロキシリン酸アルミニウムを沈殿させることによって製造する。その組み合わせプロセス後、高剪断ミキサーによって取得物をサイズ低下させて、単分散粒径分布を達成する。次に、生成物を生理食塩水に対してダイアフィルトレーションし、蒸気滅菌する。

実施例１５
本実施例では、上記の方法に従って製造した６Ｂ多糖類（Ｐｓ）及びＣＲＭ１９７（Ｐｒ）を、ＲＥＶによって個別に凍結乾燥して、乾燥ケーキを形成する。その乾燥ケーキを、本明細書に記載の方法に従って、無水ＤＭＳＯ中で再構成し、複合化する。

所期のＰｓ：Ｐｒ比（重量比）は０．９～１．５であり、複合体の所期の分子量（ＭＷ）は１５００～３５００ｋＤである。所期の遊離Ｐｓは１５％以下であり、遊離リジン損失は５モル／モルである。結果を表５に示してある。本発明に従って製造したＲＥＶ乾燥物は、所期の範囲内の複合体ＭＷ、所期の範囲内のＰｓ：Ｐｒ比、所期の範囲内の遊離Ｐｓ、及び所期の範囲内の遊離リジンを有する。

表５中の複合体ＭＷ、複合体Ｍｎ、複合体Ｐｓ：Ｐｒについてのアッセイ
複合体の分子量及び濃度分析を、ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩアッセイを用いて行う。複合体サンプルを注入し、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）によって分離する。検出は、順次に紫外線（ＵＶ）検出器、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）検出器及び屈折率（ＲＩ）検出器で行う。タンパク質濃度を、減衰係数を用いてＵＶ_２８０から計算する。ｍＬ／ｇで報告される溶出濃度における変化に伴う溶液の屈折率における変化であるｄｎ／ｄｃ因子を用いて、多糖類濃度をＲＩシグナル（タンパク質及び多糖類の両方による寄与）から求める。サンプルの平均分子量を、測定濃度及びサンプルピーク全体にわたる光散乱データを用いて、Ａｓｔｒａソフトウェア（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ， ＣＡ）によって計算する。

表５中のリジン喪失についてのアッセイ
多糖類とｍＤＴの間の共有結合数の尺度としての複合化タンパク質におけるリジン消費の測定は、下記の通りである。

Ｗａｔｅｒｓ ＡｃｃＱ－Ｔａｇアミノ酸分析（ＡＡＡ）を用いて、複合体サンプルにおける複合化の程度を測定する。Ｅｌｄｅｘワークステーションでの気相酸加水分解を用いてサンプルを加水分解して、ｍＤＴｓを分解してそれらの成分アミノ酸とする。遊離アミノ酸を、６－アミノキノリル－Ｎ－ヒドロキシスクシミジルカーバメート（ＡＱＣ）を用いて誘導体化する。次に、誘導体化サンプルを、Ｃ１８ カラムでのＵＶ検出を行うＵＰＬＣを用いて分析する。リジン以外の代表的なアミノ酸を用いて、平均タンパク質濃度を得る。複合化時のリジン消費（即ち、リジン損失）を、複合体におけるリジンの平均測定量と出発タンパク質におけるリジンの予想量の間の差によって求める。

表５中の遊離Ｐｓについてのアッセイ
遊離多糖類（ＣＲＭ１９７と複合化していない多糖類）を、最初に遊離タンパク質及び複合体をデオキシコール酸（ＤＯＣ）及び塩酸で沈殿させることによって測定される。次に、沈殿を濾去し、ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩによって、遊離多糖類濃度について濾液を分析する。遊離多糖類を、ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩによって測定される総多糖類のパーセントとして計算する。

表５中の遊離Ｐｒについてのアッセイ
複合体サンプル中の遊離多糖類、多糖類－ＣＲＭ_１９７複合体、及び遊離ＣＲＭ_１９７を、ミセル運動電位クロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）モードのキャピラリー電気泳動によって分離する。即ち、サンプルを、２５ｍＭホウ酸、１００ｍＭ ＳＤＳ、ｐＨ９．３を含む緩衝剤を流すＭＥＫＣで混和し、前コンディショニングしたベア溶融２０シリカキャピラリーで分離する。分離を２００ｎｍでモニタリングし、遊離ＣＲＭ_１９７を、ＣＲＭ_１９７標準曲線を用いて定量する。遊離タンパク質結果を、ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩ手順によって求めた総タンパク質含有率パーセントとして報告する。

実施例１６
本実施例では、２３Ｆ多糖類（Ｐｓ）及びＣＲＭ_１９７（Ｐｒ）サンプルを調製し、本発明に従って別個に（又は個別に）凍結乾燥するか、合わせて凍結乾燥する。次に、凍結乾燥サンプルを、本明細書で既述の方法に従って、無水ＤＭＳＯ中で再構成し、複合化する。

所期のＰｓ：Ｐｒ比（体積比）は０．９～１．５であり、複合体の所期の分子量（ＭＷ）は１５００～３５００ｋＤである。結果を表６に示してあり、その表では、Ｐｓ及びＰｒは平均すると、２．４の比を有していたサンプルＢ２を除く別個に凍結乾燥したサンプルについて予想所期値であったことが示されている。

実施例１７
本実施例は、６Ａ多糖類（Ｐｓ）を用いる複合体サイズに対する凍結乾燥ＣＲＭ_１９７（Ｐｒ）への無水ＤＭＳＯ添加時間の影響を示している。前述のように、無水ＤＭＳＯを急速（２分）及び低速（８分）で凍結乾燥Ｐｒに加え、混和し、次に、無水ＤＭＳＯ中で再構成した活性化Ｐｓに複合化させる。

図９は、サイズを大きくしながらの多糖類を用いる複合化反応から得られる複合体のサイズを示している。通常の関係は、複合化反応に使用される多糖類（ＵＦ２サイズ）が大きいほど、それから得られる複合体が大きいというものである。各多糖類サイズについて、凍結乾燥後のＰｒへの低速及び高速無水ＤＭＳＯ添加速度を比較した。そのグラフは、無水ＤＭＳＯの緩徐な添加により、無水ＤＭＳＯの急速な添加よりも、同サイズの多糖類からさらに大きい複合体となることを示している。

実施例５
本実施例は、多糖類（Ｐｓ）及びＣＲＭ_１９７（Ｐｒ；ＣＲＭ）リオスフィアを製造するための凍結乾燥機条件の開発を示す。

血清型６Ａ及び２３ＦからのＣＲＭ及び活性化多糖類の個別溶液を、実施例３及び４に記載の方法に従って調製し、本実施例の表で示したＰｓ、ＣＲＭ、及びショ糖濃度を有するものである。

改良型Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸピペットロボット（Ｃｒｙｏｍｅｋ）を用いて、Ｃｒｙｏｍｅｋの平坦な冷凍表面に溶液５０μＬずつを分注する。シャベル機構を用いて、破壊を起こすことなく小型低温容器にビーズを分配しても良い。各異なる溶液についてのサイクルが完了した後、ビーズを中間保存容器に移し入れ、凍結乾燥機での又はマイクロ波真空乾燥による昇華乾燥まで－７０℃で維持する。凍結乾燥機乾燥のため、ビーズを、乾燥トレイに単一層で分配する。キャビネット圧、棚温度及びサイクル時間を設定する。ビーズの乾燥後、リオスフィアを２～８℃で保存する。（具体的なパラメータについては、実施例５を参照する。）。

表７．１に示したように、予備乾燥サイクル（Ｌｙｏ１）には１８時間を要した。カールフィッシャー滴定によって求めたリオスフィアの残留含水率を表７．２に示した。

結果は、リオスフィア中の高い含水率を示している。さらに、リオスフィアは非常に脆く、吸湿性である。表８．２に示したように、多糖類、タンパク質、及びショ糖濃度を増やすことで、固体含有率を増やした。表８．１に示したように、二次乾燥サイクルを加え、一次乾燥時間を増やすことで、乾燥サイクルに修正を加えた（Ｌｙｏ２）。

Ｌｙｏ２からの残留含水率は、改善された乾燥サイクルの故に、Ｌｙｏ１からのものより有意に低かった。二次乾燥は、全ての氷が昇華した後であっても生成物中にまだ存在する結合水分の除去を改善するものである。二次乾燥には、一次乾燥（１５℃）より高い温度（３０℃）が必要であった。
この時点で、凍結乾燥機合計乾燥サイクル時間は４５時間であった。圧力及び温度などのいくつかのパラメータを変えて、さらに大きく乾燥サイクル時間を短縮した（方法：Ｌｙｏ３）。表９．１及び９．２。

実施例６
本実施例は、多糖類（Ｐｓ）及びＣＲＭ_１９７（Ｐｒ；ＣＲＭ）リオスフィアを製造するための輻射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水（マイクロ波真空乾燥（ＭＶＤ））条件の開発を示すものである。

血清型６Ａ及び２３ＦからのＣＲＭ及び活性化多糖類の溶液を、実施例３及び４に記載の方法に従って調製し、表１０．１及び１０．２で示したＰｓ、ＣＲＭ、及びショ糖濃度を有するものであった。

改良型Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸピペットロボット（Ｃｒｙｏｍｅｋ）を用いて、Ｃｒｙｏｍｅｋの平坦な冷凍表面に溶液５０μＬずつを分注する。シャベル機構を用いて、破壊を起こすことなく小型低温容器にビーズを分配しても良い。各異なる溶液についてのサイクルが完了した後、ビーズを中間保存容器に移し入れ、凍結乾燥機での又はマイクロ波真空乾燥による昇華乾燥まで－７０℃で維持する。マイクロ波乾燥のため、ビーズを、乾燥トレイに単一層で分配した。パワー、圧力及びサイクル時間を設定した。ビーズの乾燥後、リオスフィアを２～８℃で保存した。（具体的なパラメータについては、実施例６を参照する。）。

二つの異なるＭＶＤサイクルの試験を行って、ビーズを乾燥させた。両方のサイクルに関して、圧力は５０～６０ｍＴｏｒｒの範囲に維持した。温度は、印加したパワーの大きさに依存しており、２５～３０℃の範囲に留まった。

ＭＶＤ１サイクルは４時間３０分を要したが、それは、残留含水率を２％以下に低下させるには十分ではなかった。ＭＶＤ２サイクルは、それより高いパワーで長い時間を要したことから、有意に低い残留含水率を提供した。

本明細書においては、例示の実施形態を参照して本発明について説明しているが、本発明はそれに限定されるものではないことは理解すべきである。当業界における通常の技術を有し、本明細書における記述にアクセスする者は、本発明の範囲内の追加の改変及び実施形態を認識するであろう。従って、本発明は、本明細書に添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものである。

Claims (20)

1. 変異ジフテリア毒素（ｍＤＴ）の無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中均一溶液の製造方法であって、
   （ａ）ｍＤＴの乾燥組成物を提供すること；及び
   （ｂ）２分以下の期間をかけて前記乾燥組成物に無水ＤＭＳＯを加えることで前記乾燥組成物を無水ＤＭＳＯ中で１０ｍｇ／ｍＬ以下の最終濃度に再構成し、少なくとも１０秒間混和して前記ｍＤＴを含む均一溶液を提供すること
   を含む方法。
2. 前記乾燥組成物を前記ｍＤＴを含む水溶液の昇華乾燥によって調製し、
   前記昇華乾燥が、凍結乾燥及び輻射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記昇華乾燥が、前記水溶液をケーキ又はリオスフィアビーズの形態で凍結することを含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記昇華乾燥プロセスが、金属トレイ、プラスチックトレイ、プラスチック袋、及びクラスＩチュービングバイアルからなる群から選択される容器中で行われるバルク乾燥を含む、請求項２に記載の方法。
5. 前記乾燥組成物を、ｍＤＴを含む水溶液の昇華乾燥によって前記乾燥組成物を製造することで調製し、
   前記水溶液が約０．５％(重量／体積）以上のショ糖及び緩衝剤をさらに含み、
   前記昇華乾燥が凍結乾燥及び輻射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水から選択される、請求項１に記載の方法。
6. 前記緩衝剤が、５．０～７．０のｐＨ範囲のヒスチジン、コハク酸、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、又は酢酸緩衝剤である、請求項５に記載の方法。
7. 前記緩衝剤が５．０～７．０のｐＨ範囲のリン酸又はクエン酸緩衝剤である、請求項５に記載の方法。
8. 前記乾燥組成物が６％未満の含水率を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 段階（ｂ）での前記混和を１２０分以内で行う、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記ｍＤＴを含む前記均一溶液を、再構成後６時間以内に活性化多糖類に複合化させる、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 検出可能なβシート介在凝集が全くない変異ジフテリア毒素（ｍＤＴ）の無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中均一溶液を提供する方法であって、
    （ａ）ｍＤＴの乾燥組成物を提供すること；及び
    （ｂ）２分以内の期間をかけて無水ＤＭＳＯを乾燥組成物に加えて当該乾燥組成物を前記無水ＤＭＳＯ中で１０ｍｇ／ｍＬ以下の最終濃度に再構成し、混和して、前記ｍＤＴを含む均一溶液を提供すること
    を含み、
    当該均一溶液がフーリエ変換赤外分光法又は動的光散乱による測定で検出可能な凝集を全く含まない方法。
12. 前記乾燥組成物を、凍結乾燥及び輻射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水から選択される昇華乾燥プロセスによって調製する、請求項１１に記載の方法。
13. 前記昇華乾燥が、前記昇華乾燥プロセスの前に、前記ｍＤＴの水溶液をケーキ又はリオスフィアビーズの形態で凍結することを含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記昇華乾燥プロセスが、金属トレイ、プラスチックトレイ、プラスチック袋、及びクラスＩチュービングバイアルからなる群から選択される容器中で行われるバルク乾燥である、請求項１２に記載の方法。
15. 前記乾燥組成物を、ｍＤＴを含む水溶液の昇華乾燥によって前記乾燥組成物を製造することで調製し、
    前記水溶液が約０．５％(重量／体積）以上のショ糖及び緩衝剤をさらに含み、
    前記昇華乾燥が凍結乾燥及び輻射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水から選択される、請求項１１に記載の方法。
16. 前記緩衝剤が、５．０～７．０のｐＨ範囲のヒスチジン、コハク酸、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、又は酢酸緩衝剤である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記緩衝剤が５．０～７．０のｐＨ範囲のリン酸又はクエン酸緩衝剤である、請求項１５に記載の方法。
18. 前記乾燥組成物が６％未満の含水率を有する、請求項１１～１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 段階（ｂ）での前記混和を１２０分以内行う、請求項１１～１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記ｍＤＴを含む前記均一溶液を、再構成後６時間以内に活性化多糖類に複合化させる、請求項１１～１９のいずれか１項に記載の方法。

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