TW201111517A - Methods, primers, probes and kits useful for the detection of BRAF mutations - Google Patents

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201111517 六、發明說明： c發明戶斤屬之技術領域3 相關申請案 此申請案請求第61/233,054號(2009年8月11日提申）；第 61/237,078號（2009年8月26日提申）以及第61/301,790號 (2010年2月5日提申）之優先權。 發明領域 本發明有關用於偵測樣本中存在之突變BRAF序列，特 別是用於偵測存在之BRAF V600E、V600D、V600K、V600M 以及V600A突變之方法、引子以及探針。 C Ί 發明背景 癌在正常細胞經歷腫瘤轉形且變成惡性細胞時形成。 轉形的（惡性）細胞跳脫了指定細胞表型以及限制細胞增瘦 之正常的生理控制。在個體身體内之轉形的細胞因此増 殖，形成腫瘤。當發現腫瘤時，臨床目的係選擇性地摧毁 惡性細胞，然而減輕對進行治療之個體内任何正常細胞之 傷害。 B-raf (或BRAF)編碼一種屬於絲胺酸/醉胺酸蛋白激酶 之蛋白質。BRAF係Ras/Raf/MEK/MAP訊號傳導路徑之—部 分’參與調節MAP激酶/ERK訊號路徑。此基因中之突變與 各種癌症有關聯，諸如結腸直腸癌（CRC)、非小細胞肺癌 (NSCLC)、惡性黑色素瘤以及腺癌。BRAF中致癌基因的突 變’將近全部係V600E突變，已在結腸癌中報告(Davies H，et 201111517 al. Nature 2002;417:949-54; Rajagopalan H, et al., Nature 2002;418:934.)。在所有的微衛星不穩定癌中超過一半以及 穩定的結腸腫瘤中很少的亞型中，觀察到V6〇〇e突變(Wang L，et al” Cancer Res 2003;63:5209-12)。V600E (以前 V599E) 突變位於B-raf基因之外顯子15上（登錄號NM_〇4333 4)位置 1860處（編碼序列之1799)。在該編碼序列之位置】799處，胸 腺°密°定改變成腺苷酸，其導致野生型/無突變B_rag基因中之 纈胺酸(V)變成突變基因中之麩胺醯胺(E)。此外，極少數的

(<1%) V600K (1798-1799 GT>AA)突變亦存在。此外，該 V600D突變占案例的4.6% ’ V600A突變占<1%的案例，而 V600M突變占<1%的案例。此外，存在v6〇〇R以及K601E BRAF突變。 V600E BRAF突變可在許多組織/膛瘤類型中發現，包 括： 神經系統、曱狀腺、皮膚、胃腸道、大腸、膽道、卵 巢、眼睛、前列腺、中樞神經系統、肝、小腸、乳房、胰 臟、軟組織、上呼吸消化道、腎上腺、自律神經節、造血 組織以及淋巴組織、肺、食道、腦垂體以及胃。從此等類 型之組織任一種中萃取而得之DNA或RNA，可被用於本發 明之分析。 在穩定與不穩定癌二者中，>90%具BRAF突變之腫瘤 具廣泛的曱基化CpG島或所謂的CpG島曱基化表型 (CIMP)。己有報導與偶發性結腸癌中微衛星不穩定性(msi) 有關聯之改善的存活率（Samowitz WS，et al.，Cancer 201111517

Epidemiol Biomarkers Prev 2001;10:917-23; Hailing KC, et al.，J Natl Cancer Inst 1999;91:1295-303)，因為偶發性不穩 定腫瘤通常顯示出 CIMP (Toyota M，et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:8681-6; Toyota M, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97:710-5)以及BRAF突變二者(Kambara 丁， et al., Gut 2004;53:1137-44; Nagasaka T, et al., J Clin Oncol 2004;22:4584-94)，吾人認為此等特徵亦可能顯示出與不穩 定腫瘤中改善的存活率之關係。Samowitz研究過CIMP與微 衛星穩定腫瘤之存活率間之關係，以及評估BRAF突變與微 衛星穩定結腸癌之存活率間之關係。見Samowitz, Wade S.， et al.，Cancer Research 65, 6063-6069，July 15, 2005。

Samowitz已評估一大群具有結腸癌個體之樣本，決定其與 存活率以及其它臨床病理變量之關係。5%之微衛星穩定腫 瘤以及51.8%之微衛星不穩定腫瘤中可見到V6〇〇E BRAF突 變。在微衛星穩定腫瘤方面’此突變與較差的存活率、CIMP 高、美國聯合癌症委員會(AJCC)分期較高以及結腸直腸癌 之家族史有關。在5年存活率之單變量分析（16,7%對60.0%) 中；在對年齡、期數以及腫瘤位置調整之分析中；在針對 AJCC第2至4期之特異階段、調整年齡的分析中（分別為HRR 4.88、3.60以及2.04)中；以及對AJCC第2至4階段之 Kaplan-Meier存活率評估中，觀察到差的存活率。微衛星不 穩定腫瘤與極佳的5年存活率有關聯，不管乂6〇〇£突變存在 與否（为別為76.2%以及75.0%)。Samowitz總結，微衛星穩 定結腸癌中BRAF V600E突變與第2至4期結腸癌之顯著較 201111517 佳的存活率有關聯，但對微衛星不穩定腫瘤之極佳的預後 沒有影響。 此外，在具有MMR基因MLH1與MSH2生殖細胞突變之 遺傳性非息肉性结直腸癌症候群(HNPCC)家族之腫瘤中， 證實無BRAF突變。此等數據顯示，BRAF致癌基因活化僅 涉及偶發的結腸直腸腫瘤發生。在結腸直腸癌中偵測到 BRAF-V600E突變陽性，暗示偶發起源的疾病以及無 MLH1、MSH2以及MSH6生殖細胞改變。此等發現在HNPCC 診斷之基因測試方面具有潛在的衝擊，且建議可使用BRAF 作為HNPCC之排除標準，或作為偶發癌症之分子標記之可 能性。見Domingo et al·，Oncogene (2005) 24, 3995-3998。

Solit’s研究群使用MEK之小分子抑制劑以及整合基因 以及藥理分析發現，當與'野生型’細胞或帶有RAS突變之細 胞相比，BRAF之突變與對MEK抑制作用之提高以及選擇敏 感性有關聯。不管組織之世系，在BRAF突變細胞中觀察到 此MEK依賴，且此與向下調節週期素D1蛋白表現以及誘導 G1停滯有關聯。藥理學的MEK抑制作用完全地廢止braf 突變異種移植中之腫瘤生長，然而RAS突變腫瘤僅部分被 抑制。此等數據顯示BRAF突變腫瘤中MEK活性強烈的依賴 性’為此基因鑑定的腫瘤亞型提供合理的治療策略。見s〇lit David B., et al., Nature 439, 358-362 (19 January 2006) 〇 此外’根據基因研究、細胞生物學、分子病理學以及 老鼠模型之結果，已顯現出人類黑色素細胞轉型之模型。 研究已鑑定出涉及各種因子’包括黑色素瘤組織中驗性纖 6 201111517 維母細胞生長因子產生、ERK活化以及頻繁的BRAF突變。 BRAF之作用在RAS的下游，且研究證實11八3與811八17同時 發生突變在黑色素瘤中極端少見，顯示BRAF突變代替至少 一些突變RAS之致癌功能。 能提供病人’針對其發展轉移之風險作更好的分級之 腫瘤標記的發展’正在積極的研究當中。雖然腫瘤標記之 評估且㈣此結«擇㈣料，為㈣癌以及乳癌管理 之標準照護之-部分已有許多年了，但並無針對黑色素瘤 之標S己存在。許多研究已g員千山 ·‘、貝不出希望，但還沒有一個已進 展通過初級階段的發展進入臨床使用八析 儘管進來在黑色素瘤生物段 物千上的研究有進展，但用於 診斷和/或監控患有黑色素 ^ 、喝之病人的分子工具之發展仍 相對的新穎。在設計用於κ & ..^ ^ 掀控病人之疾病復發的操作程 序’或選擇處於會發展成轉 /β , ^ 尤高風險之病人方面的進展 很少。腫瘤期數，黑色素瘤 加认故d:产敬佳的存活預測法，係以一 般的臨床病理魏，諸如初 ΛF^ , 腫瘤之厚度以及潰瘍，以及 在&域中或退處的淋巴結 -加*士 +β 得移疾病之出現為基礎。然而 一個患有在顯微鏡上顯示出— 、由人-, 致的中等厚度的初級腫瘤之 病人，戲劇性地具有相異的 田私仏垃β/丄 子/舌率。缺少改良的診斷工具 用於此心f估，使臨床醫師 .^ a 恨難決定更好的治療策略。 在超過80%的黑色素瘤 夕办傲旦織中己發現BRAF治癌基因 之犬變，頻率顯著地高於此 ^ 疾病中任何其它的分子改變》 實驗研九證貫，數種BRaf .t17qaanju 犬良’特別是ΤΠ99Α(以前的命 名T1796A)熱點突變（占黑 色素瘤中BRAF突變之90%)，在培 201111517 養中可轉換成纖維母細胞。最近，精黑色素瘤細胞培養 中突變BRAF之表現之實驗，顯示出抑制細胞的成長以及促 進細胞的死亡，顯示BRAF抑制劑可能可顯著的提高黑色素 瘤^的治療。 【考务明内穷】 發明概要 本發明揭示一種偵測樣本中BRAF V600E、V600D、 V600K、V600M以及V600A突變之方法。本發明揭示一種 組成物’其包含用於擴增以及偵測樣本中所存在之 V600E、V600D、V600K、v6〇〇M4V6〇〇A突變 BRAF序列 之引子以及探針序列。在此所揭露之特別的引子組合係用 於擴增特別的BRAF突變。熟悉此技藝之人士應能理解，吾 人亦可設計對1798-1799 GT>AA雙突變具專一性之引子。 圖式簡單說明 第1圖顯示用於擴增以及偵測BRAF突變之引子以及探 針。 C實方包方式；j 較佳實施例之詳細說明 本發明提供用於偵測BRAF突變之方法、引子、探針以 及套組。本發明之方法、引子、探針以及套組可用於偵測 許多不同細胞型中之BRAF V600E、V600D、V600K、V600M 以及V600A突變’因此可用於診斷許多不同的癌症，像是， 但不限於’黑色素瘤、結腸直腸癌、肺癌以及曱狀腺癌。 本發明之方法可用作為癌症病人結果的預測。幫助改善患 201111517 有任一種的疾病，特別是癌症（由於其進行性及侵略性的本 貝）之病人的職之—主要因素為早期以及精_的診斷。本 發明之方法滿足快速、非侵人性以及精销選分析積測突 變B R A F序列（其之存在係1病轉移之陽性指標）之急迫性 的需求。其較出料需要更積極進行治療之病人。此外， 因為本發明可用於DNA或RNA，樣本易於製備，所以降低 了在樣本製備方面’因實驗室技術人貢之專制度的差異 所產生之分析變化。 舉非限制性之範例，本發明之方法可用於監控後 期、轉移性黑色素瘤之病人（第III/IV期）。此等病人正處於 疾病進展之最高風險，而早期制到疾病活性的增加可 早期治療，改善結果。本發明之方法亦可針對於試驗具早 期疾病（第I/II期），其疾病有轉移擴散之風險的病人。再者， 額外診斷試驗以及治療之早期介人，可改善病人的存活率。 本發明提供一種用於偵測樣本中存在之BRAF突變之 方法’該方法包含：⑷從該樣本中分離出核酸其中該樣 本包含核酸序列；（b)騎職权㈣序狀擴增反應， 其中該擴增反應包含-能夠在BRAF序列之第—位置處專 -性黏合BRAF突變序列之第—引子’其中該第_引子係序 列辨識編號：1、序列辨識編號：2 '序列辨識編號：3、序 列辨識編號：4、序列辨識編號：5、序列辨識編號：6、序 列辨識編?虎：7、序列辨識編號：8或序列辨識編號：9，以 及-能夠在BRAF序列之第二位置處專—性黏纟之第二引 子，其中該第二引子係序列辨識編號：丨〇，其中該第一與 201111517 第二引子黏合至雙股BRAF序列之不同的股，其中當樣本之 序列包含在該BRAF序列之第一位置處含有突變序列之 BRAF序列時，該擴增反應能夠產生BRAF突變專一性擴增 產物；以及(c)使該擴增反應產生之擴增產物顯像，其中侦 測到BRAF突變專一性擴增產物，係該樣本中存在braf突 變之陽性指標。 本發明亦提供一種用於偵測樣本中存在之轉移性黑色 素瘤之方法’該方法包含：（a)從該樣本中分離出核酸，其 中該樣本包含核酸序列；（b)進行該樣本之核酸序列之擴增 反應，其中該擴增反應包含一能夠在BRAF序列之第一位 鞏處專一性黏合BRAF突變序列之第一引子，其中該第一 引子係序列辨識編號：1、序列辨識編號：2、序列辨識編 號：3、序列辨識編號：4、序列辨識編號：5、序列辨識 編號：6、序列辨識編號：7、序列辨識編號：8或序列辨 識編號：9，以及一能夠在BRAF序列之第二位置處專一性 難合之第二引子，其中該第二引子係序列辨識編號：1〇， 其中該第一與第二引子黏合至雙股BRAF序列之不同的 股，其中當該樣本之序列包含在該BRAF序列之第一位置 處含有突變序列之BRAF序列時，該擴增反應能夠產生 BRAF突變專一性擴增產物；以及(c)使該擴增反應產生之 擴增產物顯像，其中偵測到BRAF突變專一性擴增產物， 係該樣本中存在轉移性黑色素瘤之陽性指標。

本發明之具體例包含BRAF V600E、V600D、V600K、 V600M以及V600A突變專一性引子。例示性BRAF V600 E 201111517 突變專一性引子對包括序列辨識編號：1、序列辨識編號： 2或序列辨識編號：9以及序列辨識編號：10。例示性BRAF V600D突變專一性引子對包括序列辨識編號：1、序列辨識 編號：2、序列辨識編號：4或序列辨識編號：7以及序列辨 識編號：10。例示性BRAF V600K突變專一性引子對包括序 列辨識編號：1、序列辨識編號：4、序列辨識編號：5或序 列辨識編號：6以及序列辨識編號：1 〇。例示性B RAF V60 0Μ 突變專一性引子對包括序列辨識編號：6或序列辨識編號： 8以及序列辨識編號：1〇。例示性BRAF V600A專一性引子 包括序列辨識編號：3以及序列辨識編號：10。此等引子係 設計用於避免任何已知的BRAF多形性。如在此所述，此募 核苷酸可用可偵測之標籤標記。 BRAF V6〇0突變專一性引子(序列辨識編號：1、序列 辨識編號·· 2、序列辨識編號·· 3、序列辨識編號：4 '序列 辨識編號：5、序列辨識編號：6、序列辨識編號：7、序列 辨識編號：8、序列辨識編號：9、序列辨識編號：1〇)或適 當的BRAF突變專一性引子對’可為包含生物相容性鹽溶液 和/或其它緩衝液或組份之組成物之組份。 本發明之具體例包含寡核苷酸探針序列，序列辨識編 號：11以及序列辨識編號：12，其中該寡核苷酸用作為用 於偵測B RAF突變序列之探針。此探針係設計用於避免任何 已知的BRAF多形性。任擇地，該寡核苷酸係用可偵测之標 籤標記。 本發明亦提供~種包含序列辨識編號：1-12中至少— 11 201111517 個之套組。 本發明之具體例可用於偵測V600E、V600D、V600K、 V600M 以及 V600ABRAF突變。 樣本 方法包含從一個體(如，哺乳動物）中取得組織或體液樣 本’其中該樣本含有核酸。可使用之組織或體液之非限制 例子包括血液、血漿、淋巴、腫瘤切片以及身體組織。於 一具體例中’該組織樣本包含石蠟包埋的組織檢體。於一 些具體例中’該核酸係去氧核醣核酸(DNA)。於一些具體 例中’該核酸係核醣核酸(RNA)。 本發明可應用於從病人上取得之任何類型的组織。此 組織之來源包括，但不限於，神經系統、甲狀腺、皮膚、 胃腸道、大腸、膽道、卵巢、眼睛、前列腺、中樞神經系 統、肝、小腸、乳房、姨臟、軟組織、上呼吸消化道、腎 上腺、自律神經節、造血組織以及淋巴組織、肺、食道、 躍垂體以及胃。在檢驗腫瘤組織抗性方面，最好係檢驗腫 瘤組織。於較佳具體例中，亦檢驗從取得腫瘤之病人身上 之正常組織部分。

本發明之方法可應用於廣泛的腫瘤類型。此容許製備 個別的“腫瘤表現曲線，，，藉此測定個別病人樣本十之BRAF V600E、V600D、V600K、V600M或 V600A突變序列的表現 位準，以及預測對各種化療之反應。於某些具體例中，本 發明之方法可應用於結腸癌或黑色素腫瘤。 分離核酸 12 201111517 本發明之具體例使用熟悉此技藝之人士已知之〇1^八分 離方法。一般而言，目的係將在細胞核中之0]^八與其它細 胞組份分開。DNA之分離通常從水解或分解組織或細胞開 始。此是破壞蛋白質結構’使從細胞核中釋出核酸的必須 方法。水解係在含有使蛋白質變性之清潔劑或蛋白酶（消化 蛋白質之酵素，諸如蛋白酶K)之鹽溶液中進行，於一些情 況下二者均使用。此導致細胞分解以及細胞膜溶解。dna 分離方法包括’但不限於’苯酚：氣仿萃取法、高鹽沈殿 法、鹼變性法、離子交換管柱色層分析法、樹脂結合法以 及順磁性珠結合法。 本發明之具體例使用熟悉此技藝之人士已知之尺1^八分 離方法。RNA可藉由使用下列各種方法予以分離以及製備 以供雜交使用，包括，但不限於，Triz〇1®以及硫氰酸胍-酚 -虱仿萃取法。RNA分離之原理係建立在細胞/組織水解、接 著萃取、沈澱以及清洗之基礎上。熟悉此技藝之人士應能 了解，RNA分離方法之選擇取決於樣本類型。12/144,388 在此併入本案以為參考’其針對一種從石蠟包埋之組織（致 癌基因標記測試之常見來源）中分離^^八之方法。 擴增反應 本發明之具體例使用熱以及等溫擴增方法，包括，但 不限於’聚合酶鏈反應（PCR)、逆轉錄酶聚合酶鏈反應 (RT-PCR)、連接酶鏈反應(LCR)、依賴解旋酶擴增法(HDA) 以及依賴核酸序列擴增法(NASBA)以及擴增受阻突變系統 (ARMS)。於較佳具體例中，引子以及探針用於ARMS中。 13 201111517 偵測 本發明之具體例中使用包括下列，但不限於下列之偵 測方法：在擴增步驟期間使用標籤引子，使得該擴增產物 被可偵測標記標上標籤，以及使該擴增產物與以可偵測標 記標上標籤之寡核苷酸探針雜交。可偵測標記包括，但不 限於，化學冷光標籤、螢光標籤以及放射活性標籤。可使 用與根據熟悉此技藝之人士已知之方法所使用之標籤類型 相同之方法，直接測量標上標籤之擴增產物。可根據熟悉 此技藝之人士已知之方法，使標上標籤之探針與該擴增產 物雜交。 在進行本發明之方法方面，分析病人腫瘤樣本中BRAF V600E突變之表現位準，以便預先斷定治療方案之效力。 在進行本發明之方法方面，分析病人腫瘤樣本中BRAF V600E突變之表現位準，以便預測治療方案之效力。在進 行本發明之方法方面，分析病人腫瘤樣本中BRAF V600 D 突變之表現位準，以便預測治療方案之效力。在進行本發 明之方法方面，分析病人腫瘤樣本中BRAF V600 K突變之 表現位準，以便預測治療方案之效力。在進行本發明之方 法方面，分析病人腫瘤樣本中BRAF V600 Μ突變之表現位 準，以便預測治療方案之效力。在進行本發明之方法方面， 分析病人腫瘤樣本中BRAF V600 Α突變之表現位準，以便 預測治療方案之效力。 在進行本發明之此具體例之方法方面，較佳地從病人 身上分離出腫瘤細胞。從病人身上手術切除固體或淋巴腫 14 201111517 瘤或其部分，或利用常規的外科手術取得。從冷凍或新鮮 樣本中分離出之RNA ’係利用任一種在此技藝中典型的方 法從細胞中萃取出來的，例如，Sambrook，Fischer and Maniatis, Molecular Cloning, a laboratory manual, (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York，（1989)。較 佳地，小心地避免RNA在萃取過程期間分解。 表1

引子名稱 序列 預測的突變偵測 Braf_1799A_lGT-F AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACATA 600E、600D 以及600K Braf_1799A—2AT-F AATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACTGA 600E 以及600D

Braf_V600A_2AT-F AGGTGATTTTGGTCTAGCTAC TGC 僅600A Braf_V600D_2GA-F AATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAAM 600D以及600K (弱） Braf_V600K_2AT-F AAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACTAA 僅600K Braf—V600M—2CG-F AAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTAGAA 600K 以及600M

Braf_V600D_2GC-F3 AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACATAT 僅600D Braf_V600M_2GT-F2 AAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACTAT 僅600M Braf_1799A 2GC-F AATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACACAG V600E 共同的反向引子(與以上全部的正向引子一起使用)_

2Braf_C600-R GATCCAGACAACTGTTCAAACTGA 共同的探針(與全部的引子組合一起使用）

Braf_C600-Mc2 6FAM-TCCATCGAGATTTC Braf—C600-Mc3 6FAM-ACCCACTCCATCGAGA X鹼基=次要突變 XX鹼基=有興趣的突變 範例 測試本發明之引子以及探 範例1 :本發明之引子之測試 製造合成V600E建構體 15 201111517 針，專一性擴增含有BRAF V600E突變之核酸之能力。二組 針對BRAF V600E突變之引子/探針用於確認。將該V6〇〇E 合成建構體在gDNA背景(〇.67ng/uL，5ng/PCR)中依序稀釋 (1: 2) 17倍。突變濃度範圍從1 OfM至0.15aM。針對對照組(外 顯子13)以及V600E突變之各稀釋樣本，一次雙份，分析6 次（共12份）。 範例2 : V600KBRAF突變之债測 少見的V600K BRAF突變可使用與設計用於V600E突 變相同的引子對偵測。V600K突變係1798-1799 GT> AA雙 突變。序列辨識編號：2包含高度專一性引子，其僅在單一 1799 T>A突變之存在下擴增產物。因此，當使用引子對序 列辨識編號：1以及序列辨識編號：10進行擴增反應以及使 用引子對序列辨識編號：2以及序列辨識編號：10在相同樣 本上進行另一反應時，第一個反應可產生擴增反應（陽性）， 而第二個反應不會產生產物（陰性）。此陽性與陰性之組合之 結果指示存在V600K突變。 範例3 : BRAF T1799A/GT1798-1799AA/TG1799 -1800AT突 變專屬性測試 A)測試材料 1.產生含有BRAF V600 D、E以及K突變之DNA合成片段 a. BRAF V600D ：

AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGATAAATCTCGAT

GGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTT

b. BRAFV600E 16 201111517 C. BRAF V600K ： acagtaaaaataggtgattttggtctagctacaaagaaatctc

GATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATT

TT 2.針對BRAF突變V600 D ' E以及K突變之序列專一性引 子/探針（列於表1中之序列） a. H99A—1GT (對1799 T變成A鹼基對具專一性 (V600E、V600D 以及 V600K) b. V600D—2GA (對V600D具專一性） c· V600K_2AT (對V600K具專一性） B. 步驟程序 1. 在0_667 ng/ul基因組DNA中稀釋三種合成片段中每一 個至濃度200 aM (Promega Corp.—人類基因組DNA， 100ug) 2. 用全部三種引子組（對各突變具專一性），以pCR擴增 每一突變之合成專一性片段 3·分析專屬性 C. 專屬性分析 下列二個引子/探針組係設計用於擴增專—性突變。用 母一個合成片段測試此等引子之專屬性 a. ^A—iGT (擴增勵呢、v娜以及％叫此引 子/探針組已錢分析發展節段⑺巾，驗騎在驗基1799 處之T變A之改變。 b. V_D_2GA (對侧时專一性）此引子/探針組已 17 201111517 述於分析發展節段(7)中，用於擴增在鹼基Π99-1800處之 TG變AT之改變。 c. V600K—2AT (對V600K具專一性）此引子/探針組已 述於分析發展節段(7)中，用於擴增在鹼基1798-1799處之 CT變A A之改變。 於專屬性測試中使用全部的引子以及探針 結果：下表描述用專一性引子探針組成功地擴增之片 段。加號(+)表示被擴增之專一性片段。 表2:用於界定各突變類型之引子之組合如下 1799A_1GT V600K_2AT V600D一2GA 突變 + V600E + + V600D + + - V600K - - - 野生型 - - 無效 結果： 吾人收集每一個合成以及引子/探針組合之Ct數據 V600D 合成 Ct V600E 合4 Ct V600K 合成 Ct V600D 2GA (僅擴增Ϋ600ϋ) 30.39 36.87 33.79 1799Α 1GT (擴增 V6l)0D、 V600E以及 V600K) 30.34 30.65 29.61 V600K 2AT (僅擴增V600K) 39.06 38.72 29.67 專屬性之測定係經由減去各樣板之PCR擴增的Ct而得 (使用設計為對各樣板具專一性以及非專一性之引子/探 針組）。 18 201111517 V600D 合成 δα V600E 合成 δα V600K 合成 δα V600D 2GA (僅擴增Ϋ600ϋ) 0 6.22 4.12 1799Α 1GT (擴增V600D、 V600E以及 V600K) -0.05 0 -0.06 V600K 2ΑΤ (僅擴增ΫΪ500Κ) 8.67 8.07 0 δ Ct測定如下： 範例： V600D-2GA對V600D合成片段之專屬性=0 使用V600 D片段作為樣板，用V600D_2GA引子/探針 進行擴增 dCt = 30.39 - 30.39 = 0 (專屬性） 使用V600 D片段作為樣板，用1799A_1GT引子/探針進 行擴增 dCT = 30.34 - 30.39 = - 0.05 (專屬性） 使用V600 〇片段作為樣板，用V600K_2AT引子/探針進 行擴增 dCT = 39.06 - 30.39 = 8.67 (非專一性） 接受標準 dCT (使用對片段具專一性之引子之Ct -使用對片段 不具專一性之引子之Ct) S 4 在第7節中所述之目前接受的標準（分析發展-見T 表）’引子/探針1799JGT可偵測在1799處T變A鹼基對之改 變，因此可偵測所有的突變。 19 201111517 結果： V600K_2AT專屬於V600K突變 V600D_2GA專屬於V600D突變 1799A_1GT專屬於1799 T變A之改變，其含於全部三種 突變中（V600E、V600E 以及 V600K) 表3:用以界定各突變類型之引子的組合

BrafExl3 1799A_1GT 1799A-2AT V600K_2AT V600D_2GA 突變 + + + - - V600E + + - - + V600D + + - + - V600K + - - - - 野生型 >30 Ct - - - - 無效 【圖式簡單說明】 第1圖顯示用於擴增以及偵測BRAF突變之引子以及探 針。 【主要元件符號說明】 (無） 20

Claims (1)

1. 201111517 七、申請專利範圍： L 一種用於偵測樣本中BRAF突變之存在的方法，該方法 包含：（a)從該樣本中分離出核酸，其中該樣本包含dna 序列；（b)進行該樣本之DNA序列之擴增反應，其中該 擴增反應包含一能夠在BRAF DNA序列之第一位置處 專一性黏合BRAF突變序列之第一引子，其中該第一引 子係序列辨識編號：1、序列辨識編號：2、序列辨識編 號：3、序列辨識編號：4、序列辨識編號·· 5、序列辨 識編號：6、序列辨識編號：7、序列辨識編號：8或序 列辨識編號：9 ’以及一能夠在BRAF DNA序列之第二 位置處專一性黏合之第二引子，其中該第一與第二引子 係黏合至雙股BRAF DNA序列之不同股，其中當該樣本 之DNA序列包含在該BRAF DNA序列之第一位置處含 有突變序列之BRAF DNA序列時，該擴增反應能夠產生 BRAF突變專一性擴增產物；以及使該擴增反應產生 之擴增產物顯像，其中偵測到BRAF突變專一性擴增產 物，係該樣本中BRAF突變之陽性指標。 2. —種用於偵測樣本中BRAF突變之存在的方法，該方法 包含：（a)從該樣本中分離出核酸，其中該樣本包含RNa 序列；（b)進行該樣本之該RNA序列之擴增反應，其中該 擴增反應包含一能夠在BRAF RNA序列之第一位置處 專一性黏合BRAF突變序列之第一引子，其中該第一引 子係序列辨識編號：1、序列辨識編號：2、序列辨識編 號：3、序列辨識編號：4、序列辨識編號：$、序列辨 201111517 識編號：6、序列辨識編號：7、序列辨識編號：8或序 列辨識編號：9，以及一能夠在BRAF RNA序列之第二 位置處專一性黏合之第二引子，其中該第一與第二叼子 係黏合至雙股BRAFRNA序列之不同股，其中當樣本之 RNA序列包含在該BRAF RNA序列之第一位置處含有 突變序列之BRAF RNA序列時，該擴增反應能夠產生 BRAF突變專一性擴增產物；以及(c)使該擴增反應產生 之擴增產物顯像，其中偵測到BRAF突變專一性擴增產 物，係s亥樣本中BRAF突變之陽性指標。 3. 如申請專利範圍第丨項之方法，其中BRAF突變之存在， 係該樣本中轉移性黑色素瘤之陽性指標。 4. 如申請專利範圍第2項之方法，其中BRAF突變之存在， 係該樣本中轉移性黑色素瘤之陽性指標。 5. 如申睛專利fe圍第i項或第2項之方法其中該服^突 ’兔係擇自於由下列所構成之群組：braf v6〇〇e、braf V600D BRAF V6GGK、Braf V6GGM以及BRAF V6〇〇A 突變。 6. 如申明專利fe圍第i項或第2項之方法其中該樣本係擇 自於由下賴構成之群組：血液、組織或細胞。 7. 如申請專利範圍第iΛ 力1貝或第2項之方法，其中該組織樣本 係經福馬林固定的石織包埋組織。 8. 如申。月專利範圍第i項或第2項之方法其中該能夠在 BRAF核酸序列之第-# 乐一位置處專一性黏合之第二引子係 序列辨識編號：10。 201111517 9. 一種決定用於治療病人之腫瘤之化療方案之方法，包 含：（a)取得該腫瘤之組織樣本，然後固定該樣本，以獲 得一經固定的腫瘤樣本；（b)從該經固定的腫瘤樣本中分 離出mRNA ; (c)使用能夠擴增該BRAF基因區域之寡核 苷酸引子對，使該mRNA進行擴增反應，以獲得braf 擴增樣本；⑷測定該擴增樣本中BRAF mRNA之量；（e) 比較步驟（d)之BRAF mRNA之量與内部對照基因之 mRNA之量；以及(e)根據該擴增樣本中BRAF mRNA之 量以及BRAF基因表現之閾值位準，決定化療方案。 10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該寡核苷酸引子係 由下列寡核苷酸引子對構成：序列辨識編號：1以及序 列辨識編號10、或序列辨識編號：2以及序列辨識編號： 10、序列辨識編號：3以及序列辨識編號：10、序列辨 識編號：4以及序列辨識編號：1 〇、序列辨識編號：5以 及序列辨識編號：10、序列辨識編號：6以及序列辨識 編號：1 〇、序列辨識編號：7以及序列辨識編號：1 〇、 序列辨識編號：8以及序列辨識編號：1 〇、序列辨識編 號：9以及序列辨識編號：10，或與其等有至少8〇% — 致之寡核苷酸引子對。 11. 一種用於偵測BRAF基因之表現之套組，包含寡核势酸 對序列辨識編號：1以及序列辨識編號：1 〇、或序列辨 識編5虎· 2以及序列辨識編號：1 〇、序列辨識編號：3以 及序列辨識編號：10、序列辨識編號：4以及序列辨識 編號.1 〇、序列辨識編號：5以及序列辨識編號：1 〇、 201111517 序列辨識編號：6以及序列辨識編號：10 '序列辨識編 號：7以及序列辨識編號：1〇、序列辨識編號：8以及序 列辨識編號：10、序列辨識編號：9以及序列辨識編號： 10，或與其等有至少80%—致之寡核苷酸引子對。 12· —種對BRAF V600E、V600D、V600K、V600M以及 V600A突變具專一性之核酸探針，其中該探針包含序列 辨識編號：11。 13. —種對BRAF V600E、V600D、V600K、V600M以及 V600A突變具專一性之核酸探針，其中該探針包含序列 辨識編號：12。 14. 一種用於偵測突變BRAF核酸序列之存在的方法，包含 加入一探針，其中該探針包含序列辨識編號：11或序列 辨識編號：12之寡核苷酸序列。 15. —種用於偵測樣本中BRAF V600K突變之存在的方 法，該方法包含：（a)從該樣本中分離出核酸，其中該樣 本包含DNA序列；（b)進行該樣本之DNA序列之第一擴 增反應，其中該擴增反應包含一能夠在BRAF DNA序列 之第一位置處專一性黏合BRAF突變序列之第一引子， 其中該第一引子係序列辨識編號：1，以及一能夠在 BRAF DNA序列之第二位置處專一性黏合之第二引 子，其中該第一與第二引子黏合至雙股BRAFDNA序列 之不同的股，其中當該樣本之DNA序列包含在該BRAF DNA序列之第一位置處含有突變序列之BRAF DNA序 列時，該擴增反應能夠產生BRAF突變專一性擴增產 201111517 物；（c)進行該樣本之DNA序列之第二擴增反應，其中該 擴增反應包含一第一引子，其中該第一引子係序列辨識 編號：2，以及一能夠在BRAF DNA序列之第二位置處 專一性黏合之第二引子，其中由於該第一引子之嚴苛度 (stringency)，該擴增反應將無法產生BRAF突變專一性 擴增產物；以及(d)使該第一擴增反應產生之擴增產物顯 像’其中於一樣本中偵測到BRAF突變專一性擴增產物 以及從第二反應中沒有偵測到擴增產物，係該樣本中 BRAFV600K突變之陽性指標。 16. —種用於偵測樣本中BRAF V600K突變之存在的方 法，該方法包含：（a)從該樣本中分離出核酸，其中該樣 本包含RNA序列；（b)進行該樣本之RNA序列之擴增反 應，其中該擴增反應包含一能夠在BRAFRNA序列之第 一位置處專一性黏合BRAF突變序列之第一引子，其中 該第一引子係序列辨識編號：1，以及一能夠在BRAF RNA序列之第二位置處專一性黏合之第二引子，其中該 第一與第二引子黏合至雙股BRAF RNA序列之不同 股，其中當該樣本之RNA序列包含在該BRAF RNA序列 之第一位置處含有突變序列之BRAF RNA序列時，該擴 增反應能夠產生BRAF突變專一性擴增產物；（c)進行該 樣本之RNA序列之第二擴增反應，其中該擴增反應包含 —第一引子，其中該第一引子係序列辨識編號：2，以 及一能夠在BRAF RNA序列之第二位置處專一性黏合 之第二引子，其中由於該第一引子之嚴苛度，該擴增反 5 201111517 應將無法產生BRAF突變專一性擴增產物；以及(d)使該 第一擴增反應產生之擴增產物顯像，其中於一樣本中偵 測到BRAF突變專一性擴增產物以及從第二反應中沒有 偵測到擴增產物，係該樣本中BRAF V600K突變之陽性 指標。 6