CN104017887A - 人类braf基因突变检测引物对和探针及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人类BRAF基因突变检测引物对和探针，该引物对和探针的序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:7所示。本发明还公开了一种人类BRAF基因突变检测试剂盒，用于荧光PCR检测发生在BRAF基因外显子15的1799位核苷酸上的T→A碱基突变。本发明的试剂盒操作简单快捷、特异性高、漏检率低，适用于辅助临床甲状腺癌诊断、分型，或对黑色素瘤、结直肠癌的酪氨酸激酶抑制剂和BRAF基因突变靶向药物选用提供临床参考。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物检测试剂，更具体的说，本发明涉及一种人类BRAF基因突变检测引物对和探针及采用该引物对和探针的检测试剂盒。
背景技术
BRAF基因，全名鼠类肉瘤滤过性毒菌(V-Raf)致癌同源体B1，是RAF基因家族成员，编码丝/苏氨酸蛋白激酶，是癌基因RAS的效应器，也是MAPK级联信号转导组件，涉及多个生理过程，参与调控细胞内细胞生长、分化和凋亡等过程。在多种人类恶性肿瘤中，BRAF基因突变引起的持续激活可使MEK/ERK信号转导紊乱，导致细胞过度增殖，出现恶性转化，如黑色素瘤、结直肠癌、甲状腺癌均存在不同比例的BRAF突变。约80-90％的BRAF基因突变发生在外显子15的1799位核苷酸上，T突变为A，导致缬氨酸被谷氨酸取代(V600E)。
BRAF基因体细胞突变在乳头状甲状腺癌中比较多见，BRAF V600E突变被认为是PTC最常见的可遗传变异，癌症数据库(COSMIC)在其网站上发表报告显示，78000例存在BRAF基因突变的样本中超过95％为V600E突变。BRAF基因突变作为乳头状甲状腺癌(PTC)发生的驱动性突变，已经成为PTC细针穿刺细胞学标本诊断和病情预后的一个重要指标。BRAF基因突变率在PTC中高达44％，具有很好的诊断意义。BRAF基因突变阳性的甲状腺癌病人较突变阴性病人预后不良。
在黑色素瘤的研究中发现，约50％的晚期黑色素瘤患者中发生了BRAFV600E突变，在一些研究中其突变率甚至高于60％。2011年，首个新型BRAFV600E靶向抑制剂威罗菲尼(Vemurafenib)被FDA批准上市，它能选择阻断RAF/MEK/ERK通道，抑制BRAF突变的黑色素瘤细胞增殖，疗效显著，与放化疗相比能够明显延长无进展生存期和总生存期。
在结直肠癌研究中，BRAF基因突变是结直肠肿瘤预后较差的一个生物标志物，以及区分散发性结直肠癌与Lynch综合征的分子指标。此外，BRAF基因突变的患者对EGFR靶向药物可能存在原发耐药，因此，美国国家癌症综合治疗联盟(NCCN)《结直肠癌临床实践指南》(2013)建议，在使用爱必妥(Cetuximab)或帕尼单抗(Panitumumab)等靶向药物时，对KRAS基因野生型患者进一步检测BRAF基因状态。
目前，对基因突变的检测分析技术方法主要包括：测序、限制性片段长度多态性方法(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、变性高效液相色谱(DHPLC)、基因芯片、液相芯片等方法。这些方法都有各自的优点和缺陷，尚有待改进和标准化。
1.直接测序：Sanger测序法因为可以读到DNA每个碱基的变化，目前被认为是检测基因突变的金标准方法。但是，因为灵敏度低(检测突变灵敏度约为20％)，检测异质性较高的临床肿瘤组织样本时假阴性率高。同时，测序步骤繁琐、耗时长，对设备和操作人员的要求较高，检测周期长，多限于在科研单位进行，大多数医院都无法独立完成检测，不易于形成标准化操作、适合临床单位应用的体外诊断产品。
2.限制性片段长度多态性方法(RFLP)：该方法成本低，对检测设备要求低，突变基因的检出限在5～10％。但是，劳动强度稍大、需专业的技术人员、不适于高通量检测和大规模临床应用。
3.SSCP、DHPLC、基因芯片、液相芯片等方法操作复杂、对设备要求高，仅在科研单位实验室应用，不适合大范围推广使用。
发明内容
有鉴于此，本发明的所解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种检测效果更好、特异性高、漏检率低的人类BRAF基因突变的检测引物对和探针。
本发明的所解决的技术问题还在于提供一种操作简单快捷、特异性高、漏检率低的人类BRAF基因突变的检测试剂盒。
为了解决上述技术问题，一方面，本发明提供了一种人类BRAF基因突变检测引物对和探针，用于荧光PCR检测，所述引物对和探针的序列如下：
所述引物对包括针对涵盖BRAF基因突变位点的特异性引物对和监控样本DNA质量的内控引物对，所述特异性引物对为：
B-AR-F：GTGATTTTGGTCTAGCTACACA<SEQ ID：1>，
B-AR-R：CTAGTAACTCAGCAGCATCTCA<SEQ ID：2>；
所述内控引物对为：
B-IC-F：ATTGTTACCCAGTGGTGTGA<SEQ ID：4>，
B-IC-R：TCGTGCAATATCTATAAGTTTGA<SEQ ID：5>；
所述探针包括针对BRAF基因突变位点的特异性探针和监控样本DNA质量的内控探针，特异性探针序列为如SEQ ID：3所示的序列或者该序列的互补序列，内控探针序列为如SEQ ID：6和SEQ ID：7所示的序列或者与SEQ ID：6和SEQ ID：7所示的序列互补的序列。
优选地，所述BRAF基因突变位点为发生在BRAF基因外显子15的1799位核苷酸上的T→A碱基突变。
优选地，所述探针为荧光标记探针，经荧光标记后的特异性探针为：
B-AR-P：6-FAM-ACCCTGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGGG-BHQ1<SEQID：3>；
经荧光标记后的内控探针为：
B-IC-P1：HEX-CAGCTTGTATCACCATCTCCATAT-NH2<SEQ ID：6>
B-IC-P2：GATATGGAGATGGTGATACAAGCT-Dabcyl<SEQ ID：7>。
另一方面，本发明还提供了一种人类BRAF基因突变检测的试剂盒，用于荧光PCR检测，所述试剂盒包括本发明上述方案中揭示的引物对和探针。
优选的，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
优选的，所述试剂盒包括反应液，反应液中溶解有所述引物对及探针，反应液还包括PCR缓冲液、dNTP混合液、MgCl2、Taq酶和去DNA酶蒸馏水。
更优选的，所述反应液中各组分的反应浓度为：所述Taq酶0.1-0.5U/μL，引物对中各引物0.1-0.5μM、各探针0.1-0.5μM、PCR缓冲液1×、dNTP混合液0.5-1mM、MgCl22.0-5.0mM、去DNA酶蒸馏水加至配置1×反应体系总体积。
本发明采用的是结合了ARMS(Amplification refractory mutation system，扩增阻碍突变系统)特异性引物和荧光探针两种技术的荧光PCR法。检测原理是以特异性引物富集突变基因片段，提高待检样本中突变基因的信号，继而用荧光探针检测靶扩增子，保证试剂盒检测的灵敏度和特异性。同管设置的内控引物、探针，用以监控样本DNA质量，避免检测结果出现假阴性。根据荧光PCR检测结果，即荧光PCR仪计算的Ct值判断样本中BRAF基因V600E突变状态，用于辅助临床甲状腺癌诊断、分型，或对黑色素瘤、结直肠癌的酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)和BRAF基因突变靶向药物选用提供临床参考。
本发明的有益效果在于：
(1)采用特异性的引物、荧光探针及优化的检测体系，可检测肿瘤患者体细胞的BRAF基因V600E的突变状态。
(2)灵敏度高，以25μL检测体系检测50ng人基因组DNA，可检出所含低至1％的突变序列。
(3)特异性好，50ng人野生型基因组DNA无非特异扩增信号。
(4)检测速度快，检测过程只需90分钟即可完成。
(5)检测结果可辅助临床甲状腺癌诊断、分型，或对黑色素瘤、结直肠癌的酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)和BRAF基因突变靶向药物选用提供临床参考。
附图说明
图1(A)-图1(D)为实施例1中BRAF基因V600野生型临床样本和50ng人野生型基因组DNA背景下含有突变质粒的标准品的PCR结果图，其中：
图1(A)：BRAF基因V600野生型临床样本的FAM通道信号，
图1(B)：BRAF基因V600野生型临床样本的VIC通道信号，
图1(C)：50ng人野生型基因组DNA背景下含有突变质粒的标准品的FAM通道信号，
图1(D)：50ng人野生型基因组DNA背景下含有突变质粒的标准品的VIC通道信号。
图2(A)和图2(B)为实施例3中甲状腺癌样本的PCR结果图，其中：
图2(A)：FAM通道信号，
图2(B)：VIC通道信号。
图3(A)和图3(B)为实施例4中黑色素瘤样本的PCR结果图，其中：
图3(A)：FAM通道信号，
图3(B)：VIC通道信号。
图4(A)和图4(B)为实施例5中结直肠癌样本的PCR结果图，其中：
图4(A)：FAM通道信号，
图4(B)：VIC通道信号。
具体实施方式
本发明针对《美国国立癌症综合网络(NCCN)临床实践指南》中对甲状腺癌、黑色素瘤、结直肠癌患者检测BRAF基因V600E突变状态的需求，根据Cosmic数据公布的人类BRAF基因野生型序列，以1799突变位点(V600E)为功能性突变点为基础，设计了特异性引物和探针，及含有特异性引物和特异性探针的试剂盒。
本发明检测方法陈述如下：
1.样本处理和DNA提取：检测样本为中性福尔马林固定石蜡包埋肿瘤组织切片提取的DNA。肿瘤组织的采集以最大限度地剔除正常组织为宜。石蜡切片厚度为6μm～10μm，制成常规病理切片(普通载玻片上)或直接将数片组织切片置于离心管中。推荐使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit或同性能的商业化DNA提取试剂盒提取DNA。以分光光度计对提取后的DNA储备液进行浓度测定，应至少达10ng/μL，且OD260nm/OD280nm比值应在1.6-2.0范围。将DNA稀释至10ng/μL的工作液备用。
2.反应体系配制和扩增：
a)配制混合液(Mix)，按下表所示比例配制。
| 每反应体积(μL) | N个反应体积(μL) | |
| 检测反应液 | 20 | 20×N |
| Taq酶 | 1 | 1×N |
b)混合液分装，按反应数每孔/管加入20μL Mix。
c)加模板，按顺序分别在阳性对照反应孔/管、阴性对照反应孔/管、样本反应孔/管中依次加入5μL阳性对照、阴性对照、样本DNA(石蜡切片提取的样本DNA建议稀释至10ng/μL的工作液使用)。其中，阳性对照是指在BRAF基因外显子15的1799位核苷酸发生了T→A碱基突变的对照标准品，而阴性对照是指野生型对照标准品。
d)反应体系中各组分终浓度如下：
其中，反应体系的组分包括如SEQ ID：1～SEQ ID：7所示的引物和探针，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
e)实时PCR反应条件如下：
反应体积：25μL；预变性阶段：95℃10分钟，1个循环；扩增阶段：95℃30秒，61℃1分钟，50个循环；信号收集：在扩增阶段61℃时收集FAM和HEX(或VIC)信号。
3.检测FAM和HEX通道荧光信号Ct值，根据Ct值判断结果：检测FAM和HEX通道扩增曲线，以HEX信号达到设定阈值(Ct小于30)是表明DNA有效含量在允许范围内，FAM通道信号结果可信；以FAM通道信号达到设定的阈值时所需要的Ct值作为阴阳性判定标准：Ct＜48，样本检测为阳性；Ct≥48或无扩增，样本检测为阴性或突变序列拷贝数低于试剂盒的检测下限。为了使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。
实施例1
本例以BRAF基因V600野生型临床样本、混有突变质粒的BRAF基因V600野生型细胞系DNA(企业标准品)为例阐述本发明的检测性能。
实验用BRAF基因V600野生型临床石蜡包埋组织样本验证本发明的特异性；分别用高突变率和低突变率的企业标准品验证本发明的重复性，以1％的标准品验证本发明的灵敏度。
检测包括以下步骤：
1.DNA提取
对于临床石蜡包埋组织样本，取厚度为6μm～10μm的石蜡切片约4片，使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit或同性能的商业化DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体操作步骤按试剂盒说明书。以分光光度计对提取后的DNA储备液进行浓度测定，应至少达10ng/μL，且OD260nm/OD280nm比值应在1.6-2.0范围。将DNA稀释至10ng/μL的工作液备用。
2.检测BRAF基因突变
将上述所制备样本DNA和企业标准品进行如下反应体系配制：
a)配制混合液(Mix)，按下表所示比例配制。
| 每反应体积(μL) | N个反应体积(μL) | |
| 检测反应液 | 20 | 20×N |
| Taq酶 | 1 | 1×N |
b)混合液分装，按反应数每孔/管加入20μL Mix。
c)加模板，按顺序分别在阳性对照反应孔/管、阴性对照反应孔/管、样本反应孔/管中依次加入5μL阳性对照、阴性对照、样本DNA(石蜡切片提取的样本DNA建议稀释至10ng/μL的工作液使用)。
d)反应体系中各组分终浓度如下：
其中，反应体系的组分包括如SEQ ID：1～SEQ ID：7所示的引物和探针，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
e)实时PCR反应条件如下：
反应体积：25μL；预变性阶段：95℃10分钟，1个循环；扩增阶段：95℃30秒，61℃1分钟，50个循环；信号收集：在扩增阶段61℃时收集FAM和HEX(或VIC)信号。
3.检测结果判断
检测FAM和HEX通道荧光信号Ct值，根据Ct值判断结果：检测FAM和HEX通道扩增曲线，以HEX信号达到设定阈值(Ct小于30)是表明DNA有效含量在允许范围内，FAM通道信号结果可信；以FAM通道信号达到设定的阈值时所需要的Ct值作为阴阳性判定标准：Ct＜48，样本检测为阳性；Ct≥48或无扩增，样本检测为阴性或突变序列拷贝数低于试剂盒的检测下限。
特异性试验：BRAF基因V600野生型临床样本均无FAM通道扩增信号，只有含突变质粒的模板FAM通道才有扩增信号，证明了本发明的特异性(见图1(A)-图1(D))。
重复性试验：检测同一份高突变率或低突变率标准品，重复20次，不精密度CV≤5％。
灵敏度试验：检测50ng人野生型基因组DNA背景下突变率为1％的标准品，可达到95％阳性检出率。
实施例2
在3家三甲医院开展临床试验，采用目前基因突变金标准检测方法——Sanger法基因测序作为对照，对本发明试剂盒(即实施例1的试剂盒)进行了临床试验研究。
临床试验共检测临床标本逾千例，肿瘤类型包含甲状腺癌、黑色素瘤和结直肠癌。本发明试剂盒的灵敏度(阳性符合率)为97.4％，特异度(阴性符合率)为90.6％。正确率(总一致率)为93.5％。经Kappa检验，两种方法一致性为优。综上分析,本发明人类BRAF基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)在检测临床石蜡包埋肿瘤组织是否存在BRAF基因突变上与金标准Sanger基因测序法检测具有很高的一致性,本发明试剂盒可满足临床检测需要。
实施例3
取2013年1月收集的临床石蜡包埋甲状腺癌样本1例，应用本发明对其进行BRAF基因突变检测。
1.DNA提取
取厚度为6μm～10μm的石蜡切片约4片，使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit或同性能的商业化DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体操作步骤按试剂盒说明书。以分光光度计对提取后的DNA储备液进行浓度测定，应至少达10ng/μL，且OD260nm/OD280nm比值应在1.6-2.0范围。将DNA稀释至10ng/μL的工作液备用。
2.检测BRAF基因突变
将上述所制备样本DNA进行如下反应体系配制：
a)配制混合液(Mix)，按下表所示比例配制。
| 每反应体积(μL) | N个反应体积(μL) | |
| 检测反应液 | 20 | 20×N |
| Taq酶 | 1 | 1×N |
b)混合液分装，按反应数每孔/管加入20μL Mix。
c)加模板，按顺序分别在阳性对照反应孔/管、阴性对照反应孔/管、样本反应孔/管中依次加入5μL阳性对照、阴性对照、样本DNA(石蜡切片提取的样本DNA建议稀释至10ng/μL的工作液使用)。
d)反应体系中各组分终浓度如下：
其中，反应体系的组分包括如SEQ ID：1～SEQ ID：7所示的引物和探针，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
e)实时PCR反应条件如下：
反应体积：25μL；预变性阶段：95℃10分钟，1个循环；扩增阶段：95℃30秒，61℃1分钟，50个循环；信号收集：在扩增阶段61℃时收集FAM和HEX(或VIC)信号。
3.检测结果判断
检测FAM和HEX通道荧光信号Ct值，根据Ct值判断结果：检测FAM和HEX通道扩增曲线，以HEX信号达到设定阈值(Ct小于30)是表明DNA有效含量在允许范围内，FAM通道信号结果可信；以FAM通道信号达到设定的阈值时所需要的Ct值作为阴阳性判定标准：Ct＜48，样本检测为阳性；Ct≥48或无扩增，样本检测为阴性或突变序列拷贝数低于试剂盒的检测下限。
检测结果表明，该甲状腺癌患者BRAF基因V600E突变阳性(见图2(A)和图2(B))。基于以上结果，预测该患者的癌组织侵袭力高，容易侵润甲状腺周围组织，化疗效果差，应进行手术治疗，但术后癌组织残留和复发风险高。
实施例4
取2013年1月收集的临床石蜡包埋黑色素瘤样本1例，应用本发明对其进行BRAF基因突变检测。
1.DNA提取
取厚度为6μm～10μm的石蜡切片约4片，使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit或同性能的商业化DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体操作步骤按试剂盒说明书。以分光光度计对提取后的DNA储备液进行浓度测定，应至少达10ng/μL，且OD260nm/OD280nm比值应在1.6-2.0范围。将DNA稀释至10ng/μL的工作液备用。
2.检测BRAF基因突变
将上述所制备样本DNA进行如下反应体系配制：
a)配制混合液(Mix)，按下表所示比例配制。
| 每反应体积(μL) | N个反应体积(μL) | |
| 检测反应液 | 20 | 20×N |
| Taq酶 | 1 | 1×N |
b)混合液分装，按反应数每孔/管加入20μL Mix。
c)加模板，按顺序分别在阳性对照反应孔/管、阴性对照反应孔/管、样本反应孔/管中依次加入5μL阳性对照、阴性对照、样本DNA(石蜡切片提取的样本DNA建议稀释至10ng/μL的工作液使用)。
d)反应体系中各组分终浓度如下：
其中，反应体系的组分包括权利要求1-3中任意一项所述的引物对和探针，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
e)实时PCR反应条件如下：
反应体积：25μL；预变性阶段：95℃10分钟，1个循环；扩增阶段：95℃30秒，61℃1分钟，50个循环；信号收集：在扩增阶段61℃时收集FAM和HEX(或VIC)信号。
3.检测结果判断
检测FAM和HEX通道荧光信号Ct值，根据Ct值判断结果：检测FAM和HEX通道扩增曲线，以HEX信号达到设定阈值(Ct小于30)是表明DNA有效含量在允许范围内，FAM通道信号结果可信；以FAM通道信号达到设定的阈值时所需要的Ct值作为阴阳性判定标准：Ct＜48，样本检测为阳性；Ct≥48或无扩增，样本检测为阴性或突变序列拷贝数低于试剂盒的检测下限。
检测结果表明，该黑色素瘤患者BRAF基因V600E突变阳性(见图3(A)和图3(B))。基于以上结果，该患者宜选用Vemurafenib此类针对BRAF基因V600E的突变抑制剂。
实施例5
取2013年1月收集的临床石蜡包埋结直肠癌样本1例，应用本发明对其进行BRAF基因突变检测。
1.DNA提取
取厚度为6μm～10μm的石蜡切片约4片，使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit或同性能的商业化DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体操作步骤按试剂盒说明书。以分光光度计对提取后的DNA储备液进行浓度测定，应至少达10ng/μL，且OD260nm/OD280nm比值应在1.6-2.0范围。将DNA稀释至10ng/μL的工作液备用。
2.检测BRAF基因突变
将上述所制备样本DNA进行如下反应体系配制：
a)配制混合液(Mix)，按下表所示比例配制。
| 每反应体积(μL) | N个反应体积(μL) | |
| 检测反应液 | 20 | 20×N |
| Taq酶 | 1 | 1×N |
b)混合液分装，按反应数每孔/管加入20μL Mix。
c)加模板，按顺序分别在阳性对照反应孔/管、阴性对照反应孔/管、样本反应孔/管中依次加入5μL阳性对照、阴性对照、样本DNA(石蜡切片提取的样本DNA建议稀释至10ng/μL的工作液使用)。
d)反应体系中各组分终浓度如下：
其中，反应体系的组分包括如SEQ ID：1～SEQ ID：7所示的引物和探针，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
e)实时PCR反应条件如下：
反应体积：25μL；预变性阶段：95℃10分钟，1个循环；扩增阶段：95℃30秒，61℃1分钟，50个循环；信号收集：在扩增阶段61℃时收集FAM和HEX(或VIC)信号。
3.检测结果判断
检测FAM和HEX通道荧光信号Ct值，根据Ct值判断结果：检测FAM和HEX通道扩增曲线，以HEX信号达到设定阈值(Ct小于30)是表明DNA有效含量在允许范围内，FAM通道信号结果可信；以FAM通道信号达到设定的阈值时所需要的Ct值作为阴阳性判定标准：Ct＜48，样本检测为阳性；Ct≥48或无扩增，样本检测为阴性或突变序列拷贝数低于试剂盒的检测下限。
检测结果表明，该结直肠癌患者BRAF基因V600E突变阳性(见图4(A)和图4(B))。基于以上结果，提示该患者对EGFR靶向药物可能存在原发耐药，使用必妥(Cetuximab)或帕尼单抗(Panitumumab)等靶向药物的疗效较差。
应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (7)
1.一种人类BRAF基因突变检测引物对和探针，用于荧光PCR检测，其特征在于，所述引物包括针对涵盖BRAF基因突变位点的特异性引物对和监控样本DNA质量的内控引物对，所述特异性引物对为：
B-AR-F：GTGATTTTGGTCTAGCTACACA，
B-AR-R：CTAGTAACTCAGCAGCATCTCA；
所述内控引物对为：
B-IC-F：ATTGTTACCCAGTGGTGTGA，
B-IC-R：TCGTGCAATATCTATAAGTTTGA；
所述探针包括针对BRAF基因突变位点的特异性探针和监控样本DNA质量的内控探针，特异性探针序列为如SEQ ID：3所示的序列或者该序列的互补序列，内控探针序列为如SEQ ID：6和SEQ ID：7所示的序列或者与SEQ ID：6和SEQ ID：7所示的序列互补的序列。
2.根据权利要求1所述的人类BRAF基因突变检测引物对和探针，其特征在于：所述BRAF基因突变位点为发生在BRAF基因外显子15的1799位核苷酸上的T→A碱基突变。
3.根据权利要求1所述的人类BRAF基因突变检测引物对和探针，其特征在于，所述探针为荧光标记探针，经荧光标记后的特异性探针为：
B-AR-P：6-FAM-ACCCTGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGGG-BHQ1；
经荧光标记后的内控探针为：
B-IC-P1：HEX-CAGCTTGTATCACCATCTCCATAT-NH2
B-IC-P2：GATATGGAGATGGTGATACAAGCT-Dabcyl。
4.一种人类BRAF基因突变检测试剂盒，用于荧光PCR检测，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1-3中任意一项所述的引物对和探针。
5.根据权利要求4所述的人类BRAF基因突变检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
6.根据权利要求4所述的人类BRAF基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括反应液，反应液中溶解有所述引物对及探针，反应液还包括PCR缓冲液、dNTP混合液、MgCl2、Taq酶和去DNA酶蒸馏水。
7.根据权利要求6所述的人类BRAF基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述反应液中各组分的反应浓度为：所述Taq酶0.1-0.5U/μL，引物对中各引物0.1-0.5μM、各探针0.1-0.5μM、PCR缓冲液1×、dNTP混合液0.5-1mM、MgCl22.0-5.0mM、去DNA酶蒸馏水加至配置1×反应体系总体积。
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