TW201032826A - Method and formulation for reducing aggregation of a macromolecule under physiological conditions - Google Patents

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201032826 六、發明說明： · 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種藉由減少生理條件下之聚集來使皮不 投與巨分子之注射部位處之發炎減至最低程度的方法。 【先前技術】 在過去二十年中’重組DNA技術已使得生物分子（尤其 蛋白質）醫藥的數目顯著增加。生物分子藥劑之增加已引 起藥物調配之新難題。高劑量之蛋白質治療劑（諸如抗體） 可藉由靜脈内輸注傳遞至患者，但此投藥途徑不方便且蛋 白質治療劑調配成供皮下注射（若可能）通常為較佳的。然 而’皮下注射之藥物溶液體積比靜脈内輸注之藥物溶液體 積小得多，因此蛋白質必須以較高濃度存在。治療性蛋白 質在每毫升數十毫克之高濃度下，使治療性蛋白質長時間 保持穩定溶解狀態至關重要。高濃度蛋白質溶液增加蛋白 質-蛋白質相互作用的可能性，促成聚集；防止聚集已成 為蛋白質藥物調配之主要問題。聚集導致許多問題，包括 活性蛋白質之生物可用性降低、藥物動力學改變及不當免 疫原性。（Frokjaer，S.及 〇tzen，d.E·’ Nat. Rev. Drug.

DisC〇V. 4: 298_306 (2005) ; Jisk〇〇t，w 及心〇職心， D.J.A.，EJHP Practice 12:20-21 (2006))。 由於聚集過程之詳細分子機制尚未大體瞭解’因此防止 聚集在很大程度上仍根據經驗。典型策略為向蛋白質溶液 中添加穩定劑。常用穩定劑包括糖、鹽、游離胺基酸（諸 如L精胺酸及L-麵胺酿胺）（G〇i〇van〇v，a p等人，了八瓜 144539.doc 201032826

Chem. Soc. 126:8933-8939 (2004))、多元醇（Singh，S.及 Singh, J·，AAPS Pharm. Sci. Tech 4: 1-9 (2003) ; Mishra, R. 等人，J. Biol· Chem. 280:15553-15560 (2005))、聚乙二醇 (PEG)及可減少蛋白質-蛋白質相互作用之其他聚合物，諸 如聚山梨醇醋或泊洛沙姆（p〇loxamer)(Frokjaer及Otzen，見 上；Lee，R.C.等人，Ann. Biomed. Eng. 34: 1190-1200 (2006) ; (Nema，S.等人，PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 51: 166-171 (1997)) ° 環糊精（CD)為具有藉由a-(l，4)醣苷鍵連接之d-葡萄哌喃 糖單元的環狀寡醣。玉米或其他澱粉經由澱粉酶、環糊精 轉葡萄糖苷酶之作用產生CD。最常見之天然產生之環糊 精為a-環糊精、β-環糊精及γ-環糊精，其分別由6個、7個 及8個葡萄哌喃糖單元組成。由於天然環糊精、尤其β-環 糊精具有低水溶性，因此已合成具有經改良之溶解性及其 他物理化學性質之許多衍生物。可購得之CD衍生物包括 甲基化CD、2-羥基丙基化CD、乙醯化CD、分支鏈CD及磺 酸基丁基CD。環糊精之同義名包括Cavitron、環狀寡聽、 大環糊精及環葡聚糖（cycloglucan)。（欲回顧，參見 Loftsson，T. &Brewster,M.E.,J.Pharm.Sci.85:101-(1996) ; Uekama，K.等人，Chem. Rev. 98:2045-2076 (1998) ; Irie，T.及 Uekama, K·，Advanced Drug Delivery Reviews 36:101-123 (1999);及 Szjetli, J·，Pure Appl. Chem. 76:1825-1845 (2004))。環糊精之分子量小於25,000 道爾頓（dalton)且因此可藉由腎絲球過濾自全身循環移除 144539.doc 201032826 且預期不會在體内積聚。已充分證明天然環糊精以及多種 醫藥相關衍生物（諸如羥基丙基-β-CD及磺酸基丁基-β-CD) 不存在毒性（Uekama等人，見上；Szjetli,見上）。 環糊精呈截錐體形狀，其中内部具疏水性且外部具親水 性。疏水性内腔提供適當大小之非極性化合物可包合於其 中且形成錯合物的環境。CD及其衍生物已用作不良水溶 性藥物之增溶劑。舉例而言，伊曲康峻（itraconazole) (SporanoxTM)藉由經丙基β-CD增溶且齊拉西嗣甲績酸鹽 (ziprasidone mesylate)(GeodonTM)藉由橫酸基 丁基醚 β-CD 增溶。CD之其他用途包括藥物穩定、遮味及香精油吸附 劑。當前可獲得之含有環糊精之藥物包括Sp〇ranoxTM (Janssen, Belgium) ' Prostavasin™(Ono, Japan ； Schwarz, Germany) ' Prostandin 500™(0no, Japan) ' Geodon™ (Pfizer, USA) ' VFEND™(Pfizer, USA) ' MitoExtra

MitozytrexTM(Novartis, Switzerland)及 VoltarenTM(Novartis, Switzer land)。亦參見Szjetli(見上）之表1。此等調配物皆 限於小分子化合物。 諸如肽及蛋白質之大分子藥物亦可與環糊精形成錯合 物。與CD錯合之肽藥物之生物可用性改良咸信部分地係 因CD對於細胞流出泵之抑制效果所引起（chaUa，R_等人， AAPS Pharm. Sci. Tech. 6:Ε329·357 (2005))。蛋白質及肽 之穩定機制在性質上亦不同於小分子藥物之情況。雖然 CD可與小分子藥物形成包合錯合物，但是CD似乎可與蛋 白質或肽之暴露於特定溶劑之胺基酸殘基結合（Aachmann， 144539.doc 201032826 F.L.等人，Protein Engineering 16:905-912 (2003))。通常在 低環糊精濃度下獲得最大益處，且益處通常僅部分地視濃 度而變。舉例而言，0.5% ΗΡ-β-環糊精可最佳地抑制IL-2 之聚集。（Loftsson及Brewster,見上）。人類生長激素之溶 解性可以約2-6%存在之CD改良，且發現β CD之有效性比α CD 及 γ CD 高數倍。（Otzen，D.E.等人，Protein Sci. 11:1779-1787 (2002))。 CD20抗原（亦稱為人類B-淋巴細胞限制之分化抗原， Βρ35)為位於前Β及成熟Β淋巴細胞上之約35 kD分子量之疏 水性跨膜蛋白質（Valentine等人，J. Biol. Chem.· 264(19)..11282-11287 (1989);及 Einfeld 等人，£^180】. 7(3):711-717 (1988))。該抗原亦表現於大於90%之B細胞非 霍奇金氏淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphomas)(NHL)上 (Anderson等人，Blood 63(6):1424-1433 (1984))，但造血幹 細胞、前B細胞、正常血漿細胞或其他正常組織上未發現 (Tedder 等人，J. Immunol. 135(2):973-979 (1985))。咸信 CD20可調控細胞週期啟始及分化之活化過程中之早期步 驟（Tedder等人，見上）且可能充當鈣離子通道（Tedder等人， J. Cell. Biochem. 14D:195 (1990))。 若CD20表現於B細胞淋巴瘤中，則此抗原為治療該等淋 巴瘤之適用治療靶。舉例而言，一種針對人類CD20抗原 之遺傳工程化嵌合鼠類/人類單株抗體利妥昔單抗 (rituximab)(RITUXAN®，MABTHERA®)抗體（可講自 Genentech, Inc., South San Francisco, California, U.S·及 144539.doc 201032826 F.Hoffmann-La Roche AG, Basel, Switzerland)係用於治療 患有復發性或難治性低度惡性或濾泡性、CD20陽性、B細 胞非霍奇金氏淋巴瘤的患者。利妥昔單抗抗體在1998年4 月7日頒布之美國專利第5,736，137號（Anderson等人）中及美 國專利第5,776,456號中稱為「C2B8」。指定用於治療NHL 之其他抗CD20抗體包括與放射性同位素釔-90連接之鼠類 抗體 ZevalinTM(IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA)，及 與1-131結合之另一種完全鼠類抗體BexxarTM(Corixa, WA) » CD20亦為適用於治療自體免疫疾病之把抗原。亦已在B 細胞及自體抗體似乎在疾病病理生理學中起作用之多種非 惡性自體免疫病症中研究利妥昔單抗，包括Edwards等人， *Soc. 7>α«5·. 30:824-828 (2002)。已報導利妥昔單 抗可潛在地減輕以下疾病之徵兆及症狀，例如類風濕性關 節炎（RA)(Leandro 等人，61:883-888 (2002); Edwards 等人，及办eww., 46 (增刊 9): S46 (2002) ; Stahl等人，3««· ehwm. 62 (增刊 1): OP004 (2003) ; Emery 等人，广，及心《w· 48(9): S439 (2003))、狼瘡（Eisenberg，Jri/zrzU. 5:157-159 (2003) ; Leandro 等人 Arthritis Rheum. Λ6: Ί6Ί3-26ΊΊ (2002) ; Gorman等人，ZwpML 13: 312-316 (2004))、免疫性 企小板減少性紫癒（D'Arena等人，ZewA：. (2003); Stasi 等人，別 98: 952-957 (2001); Saleh 等人，以所/”· 0«α/.，27 (Supp 12):99-103 (2000); Zaia等 144539.doc 201032826 A, Haematolgica, 87: 1 89-195 (2002) ; Ratanatharathorn等 人，133: 275-279 (2000))、單純紅血球形成 ^^(Auner^ A, Br. J. Haematol., 116: 725-728 (2002))； 自體免疫性貧企（Zaja 等人，Haematologica 87:1 89-195 (2002) (i/aemaio/og/ca 87:336 (2002)中出現勘誤表））、冷 凝集素疾病（Layios 等人，15: 187-8 (2001)； Berentsen 等人，Blood, 103: 2925-2928 (2004) ; Berentsen 等人，5厂.《7.//<3仨》2如〇/.，115:79-83 (2001);631101161·,^，··/· i/aewaio/·，112: 1083-1090 (2001) ; Damiani 等人，5/-.«/· /faewaio/.，114: 229-234 (2001))、重度抗胰島素症之 B 型 症候群（Coll 等人，iV. X Mei/.，350: 310-311 (2004)、 混合冷凝球蛋白血症（DeVita等人，46增刊 9:S206/S469 (2002))、重症肌無力（Zaja 等人，A^wr〇/〇幻;， 55: 1062-63 (2000) ； Wylam# A, J. Pediatr., 143: 674-677 (2003) )、華格納氏肉芽腫病（Wegener's granulomatosis) (Specks 等人，Jri/zrzD ά 44: 2836-2840 (2001))、難治尋常天范瘡（Dupuy 等人，Jrc/i Dermaio/·， 140:91-96 (2004))、皮肌炎（Levine，46 (增刊9):S1299 (2002))、休格連氏症候群（Sjogren's syndrome)(Somer 等人，Arthritis & Rheumatism, 49: 394-398 (2003))、活動性II型混合冷凝球蛋白血症（Zaja等人， 5/〇〇< 101: 3827-3834 (2003))、尋常天疱瘡（Dupay等人， Jrc/z. Derwaio/.，140: 91-95 (2004))、自體免疫性神經病變 (Pestronk 等人，·/. iVewro/· iVeMrosMrg· Ρί少74:485- 144539.doc -9- 201032826 489 (2003))、副腫瘤性眼陣攣-肌陣攣症候群（Pranzatelli等 人A^wro/οπ 60(增刊 1) P05.128:A395 (2003))及復發-緩解 型多發性硬化（RRMS)(Cross等人，（摘要）「Preliminary results from a phase II trial of Rituximab in MS」 美國多 發性硬化症研究及治療委員會第八次年會（Eighth Annual Meeting of the Americas Committees for Research and Treatment in Multiple Sclerosis)，20-21 (2003)) o 本發明提供防止諸如抗體之巨分子在生理條件下聚集之 方法及調配物。本發明之方法在製備治療性蛋白質（諸如 本說明書中描述之抗CD20抗體）之調配物方面具有優勢。 此等優勢包括能夠製備可增加治療性抗體之生物可用性及 減少注射部位處之發炎的皮下注射調配物，以及根據下文 實施方式顯而易知之其他優勢。 【發明内容】 環糊精已由生物化學藥劑師用作不良水溶性藥物之增溶 劑。本發明意外地發現，不同類型之環糊精（例如磺酸基 丁棊醚、羥基丙基γ、羥基丙基β)抑制蛋白質、尤其抗體 之聚集及絮凝，同時抗體具高度水溶性。因此，環糊精抑 制高濃度抗體之聚集及絮凝的發現代表環糊精之新穎用 途。本發明亦已開發新穎的活體外篩檢方法，其包括使用 具有確定截留分子量（MW)與定製釋放介質（均模擬注射部 位處之生理條件）的透析管。 本發明提供藉由添加2%至30%環糊精（CD)來減少諸如蛋 白質之巨分子在生理條件下之聚集且抑制諸如蛋白質之巨 144539.doc •10· 201032826 分子在生理條件下之絮凝的方法，其中環糊精係選自由羥 基丙基β(ΗΡ-β)、羥基丙基γ(ΗΡ-γ)及磺酸基丁基醚（SBE)環 糊精組成之群。在大鼠中，添加CD而顯著減少之聚集及 絮凝亦與皮下注射部位處之發炎顯著減少相關。本發明另 外提供藉由向皮下調配物中添加2%至30% ΗΡ-β環糊精、 ΗΡ-γ環糊精或SBE環糊精而在諸如蛋白質之巨分子之皮下 投與期間將注射部位處之發炎減至最低程度的方法。在本 發明之不同實施例中，巨分子為抗體。在本發明之其他實 施例中，抗體為治療性抗體或診斷性抗體。 在本發明之不同實施例中，巨分子為抗CD20抗體。在 本發明之某些實施例中，抗CD20抗體為人類化抗體。在 本發明之某些實施例中，抗CD20抗體包含來自表1之變異 體A、Β、C、D、F、G、Η或I之一。本發明另外提供抗 CD20抗體包含選自由SEQ ID ΝΟ:1-15組成之群之胺基酸 序列的方法及調配物。在本發明之其他實施例中，抗體包 含輕鏈可變域SEQ ID ΝΟ:1及重鏈可變域SEQ ID ΝΟ:2， 或輕鏈可變域8£(^10 1^0:3及重鏈可變域8£(^10>10:4, 或輕鏈可變域SEQ ID NO :3及重鏈可變域SEQ ID NO: 5。 本發明另外提供抗體包含全長輕鏈SEQ ID NO:6及全長重 鏈 SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 或 SEQ ID NO:15 之方法及 調配物。本發明另外提供抗體包含全長輕鏈SEQ ID ΝΟ·.9 及全長重鏈 SEQ ID ΝΟ:10、SEQ ID ΝΟ:11、SEQ ID NO:12、SEQIDNO:13或SEQIDNO:14之方法及調配物。 在其他態樣中，本發明提供皮下投與諸如蛋白質之巨分 144539.doc -11 - 201032826 子之醫藥調配物，其包含2%至30% ΗΡ-β環糊精、ΗΡ-γ環 糊精或SBE環糊精。在一些實施例中，本發明提供皮下投 與抗體之醫藥調配物，其包含10 mg/ml至200 mg/ml之濃 度範圍之抗體，及2%至30% ΗΡ-β環糊精、ΗΡ-γ環糊精或 SBE環糊精。在某些實施例中，抗體濃度範圍為30-150 mg/ml。在其他實施例中，抗體濃度範圍為100-150 mg/ml。在某些實施例中，醫藥調配物包含5%至30%濃度 之ΗΡ-β環糊精。在某些實施例中，醫藥調配物包含5%至 20%濃度之ΗΡ-γ環糊精。在某些實施例中，醫藥調配物另 外包含50 mM至200 mM濃度之精胺酸琥珀酸鹽。在某些實 施例中，醫藥調配物包含2%至9%濃度之SBE環糊精。在 某些實施例中，醫藥調配物包含約100 mg/ml濃度之抗體 及15%至30%濃度之ΗΡ-β環糊精。在某些實施例中，醫藥 調配物包含約150 mg/ml濃度之抗體及約30%濃度之ΗΡ-β 環糊精。在某些實施例中，醫藥調配物包含約1 50 mg/ml 濃度之抗體及約10%濃度之ΗΡ-γ環糊精。在某些實施例 中，醫藥調配物另外包含50 mM至200 mM濃度之精胺酸琥 珀酸鹽。在一特定實施例中，醫藥調配物包含100 mg/ml 至150 mg/ml濃度範圍之人類化2H7抗體、15%至30%濃度 之ΗΡ-γ環糊精及50 mM至100 mM濃度之精胺酸琥珀酸鹽。 在其他實施例中，醫藥組合物另外包含30 mM乙酸鈉；5°/〇 海藻糖二水合物；及0.03%聚山梨醇酯20(pH 5.3)。 本發明另外提供任何上述調配物，其包含由表1中所列 之任何抗體組成之人類化抗CD20抗體。本發明另外提供 144539.doc 12 201032826 抗CD20抗體包含選自由SEQ ID NO: 1-15組成之群之胺基 酸序列的調配物。在本發明之其他實施例中，抗體包含輕 鏈可變域SEQ ID ΝΟ:1及重鏈可變域SEQ ID NO:2，或輕 鏈可變域SEQ ID NO:3及重鏈可變域SEQ ID NO:4。本發 明另外提供抗體包含全長輕鏈SEQ ID NO:6及全長重鏈 SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 或 SEQ ID NO:15 之方法及調 配物。本發明另外提供抗體包含全長輕鏈SEQ ID NO:9及 全長重鏈 SEQ ID NO:10、SEQ ID ΝΟ:11、SEQ ID ]^0:12、8£卩10^[0:13或8£(^10]^〇:14之方法及調配物。 本發明另外提供治療表現CD20之B細胞癌症的方法，其 包含以包含2%至30% ΗΡ-β環糊精、ΗΡ-γ環糊精或SBE環糊 精之醫藥調配物投與表1之人類化抗CD20抗體中之任一 者。CD20陽性Β細胞癌症較佳為Β細胞淋巴瘤或白血病。 在特定實施例中，包含結合人類CD20(hCD20)之人類化 2H7抗體及其功能片段之調配物用於治療非霍奇金氏淋巴 瘤（NHL)、惰性NHL(包括復發惰性NHL及利妥昔單抗難治 性惰性NHL)、淋巴細胞為主型霍奇金氏疾病（LPHD)、小 淋巴細胞淋巴瘤（SLL)、慢性淋巴細胞白jk病（CLL)。在特 定實施例中，包含人類化CD20結合抗體，尤其來自表1之 變異體A、B、C、D或Η或其功能片段之調配物用於治療 上列CD20陽性Β細胞癌症。 本發明亦提供一種治療自體免疫疾病之方法，其包含以 包含2%至30% ΗΡ-β環糊精、ΗΡ-γ環糊精或SBE環糊精之醫 藥調配物向罹患自體免疫疾病之患者投與治療有效量之表 144539.doc -13- 201032826 1之人類化2H7抗體。在特定實施例中，自體免疫疾病係選 自由類風濕性關節炎（RA)及幼年型類風濕性關節炎組成之 群’且RA患者為甲胺喋呤（Mtx)反應不足者（inadequate responders)及TNFa-拮抗劑反應不足者、利妥昔單抗難治 或復發患者。在一個實施例中，RA患者係另一種抗CD20 治療性抗體難治或復發者。在其他實施例中，自體免疫疾 病係選自由以下組成之群：全身性紅斑性狼瘡（SLE)(包括 狼瘡腎炎）、多發性硬化（MS)(包括復發緩解型多發性硬化 (RRMS))、華格納氏疾病、發炎性腸道疾病、潰瘍性結腸 炎、特發性血小板減少性紫癜（ITp)、血栓性血小板減少性 紫癒（ΤΤΡ)、自體免疫性血小板減少症、多發性硬化、牛 皮癖、IgA腎病、IgM多發性神經病變、重症肌無力、 ANCA相關之血管炎、糖尿病、雷諾氏症候群 syndrome)、休格連氏症候群、視神經脊髓炎（NM〇)及絲球 體腎炎。在特定實施例中，包含人類化CD2〇結合抗體， 尤其表1之變異體A、B、C、D*H或其功能片段之調配物 用於治療上列自體免疫疾病。 在治療上述疾病之方法之某些實施例中，罹患疾病之個 體或患者為靈長類，較佳人類。 本發明另外提供-種使注射於患者注射部位之水性皮下 調配物中抗體之溶解改良或維持或沈殿最少的方法，其包 3向”亥水性皮下調配物中添加2%至3〇% 環糊精、 γ環糊精或随環糊精。在某些實施例中，㈣調配物包含 5%至鳩濃度之ΗΡ·β環糊精。在某些實施例中，醫藥調配 144539.doc 201032826 物包含5%至2〇%濃度之Ηρ_γ環糊精。在某些實施例中，醫 藥調配物另外包含50 mM至200 mM濃度之精胺酸琥珀酸 ^ 在某些實施例_，醫藥調配物包含2%至9%濃度之 SBE環糊精。 本發明另外提供增加待皮下投與之抗體之生物可用性的 方法’其包含向包含抗體之水性皮下調配物中添加2%至 30% ΗΡ-β環糊精、Ηρ_γ·糊精或SBE環糊精。在某些實施 參 例中’醫藥調配物包含5%至30%濃度之ΗΡ-β環糊精。在某 些實施例中，醫藥調配物包含5%至2〇%濃度之Ηρ_γ環糊 精。在某些實施例中，醫藥調配物另外包含5〇 2〇〇 mM濃度之精胺酸號轴酸鹽。在某些實施例中，醫藥調配 物包含2%至9%濃度之SBE環糊精。 本發明另外提供評估賦形劑減少抗體或其他巨分子在生 理條件下之聚集之能力的方法，其包含：在測試賦形劑存 在及不存在的情況下，在怪定授動下，相對於測試介質透 φ 析巨分子調配物以模擬37t下之生理條件；抽取經修飾之 之介質溶液樣品；及測量外觀，諸如樣品混濁度，且藉由 諸如UV光度掃描之方法測量釋放介質中之蛋白質含量， 其中與不具有賦形劑之對照相比，含有測試賦形劑之檢定 中之蛋白質濃度升高及釋放介質混濁度降低，表明測㈣ 形劑能夠減少巨分子聚集。在特定實施例中，介質與經修 飾之PBS溶液有關，諸如含有167 mM鈉、14〇 氯化 物、17遍鱗酸鹽、4賴钾。在該方法之特定實施例中， 透析管具有1百萬道爾頓戴留分子量。在該方法之其他特 144539.doc •15- 201032826 定實施例中，使用uv光譜測定法測量試樣中之蛋白質濃 度及混濁度。在該方法之其他實施例中，該方法包括目檢 經修娜之之釋放介質及透析管内之溶液之沈澱其中與不 具有賦形劑之對照相比，含有測試職形劑之透析管中之沈 殿減少’表明測試賦形劑能夠減少巨分子聚集。 【實施方式】 不同形式之動詞「聚集」係指個別蛋白質分子或錯合物 藉以結合而形成聚集物的過程。「聚集物」為包含蛋白質 分子或複合物之聚合物組裝體。聚集可進行至形成可見沈Θ 厥物之程度。該可見沈殿物之形成在本文中亦稱為「絮 凝」。 巨分子之沈澱之相對量可測定，例如藉由與目視對照比 較來測定。檢定沈敎其他方法在此項技術中已知且描述 於下文中，例如實例2中詳述之活體外透析方法，或實例3 中描述之活體内模型。 ❹ 術。纟物可用性」係指藥物或其他物質在投與之後於 生理活性部位處被㈣或變得可則_度或速率。巨分 子之生物可用性可藉由此項技術中已知之活體内藥物動力 學方法檢定。 10,000道爾頓之分 術語「巨分子」係指分子量為至少 子，且可包括蛋白質，諸如抗體。 醫藥賦形 集之化合物。賦形劑可包括糖 精胺酸及L-趟胺醯按）、多元醇 術；。賦形劑J或 係指可減少巨分子聚 游離胺基酸（諸如L-二醇（PEG)及其他聚 144539.doc -16- 201032826 合物，諸如聚山犁gjjst ^ 梨醇S曰、泊洛沙姆或聚乙烯吡咯啶酮。 術語「環糊精，H、 . 5 CD」）係指具有藉由α-(1，4)醣苷鍵 連接之d-葡萄派喊撼留- 南糖早凡的環狀寡醣。最常見之天然產生 之環糊精為α-環糊耧 Q s ^ 座生 、、β-%糊精及γ-環糊精，其分別 個、7個及8個葡萄哌喃 _ 』由6 南糖早7G組成。環糊精之同義名 Cavitron、環壯寘胁， 匕枯 、大環糊精及環葡聚糖。如本文中 用之術語「環細接· 精」可另外包括環糊精衍生物，包括 不限於）甲基化CD、2_羥美而其U~ &基丙基化CD、乙醯化CD、分去 CD及磺酸基丁基CD。 刀叉鏈 術浯「治療性抗體」係指用於治療疾病之抗體。治療性 抗體可具有不同作用機制。治療性抗體可結合標乾且中和 其正常功能。舉例而言，阻斷為癌細胞存活所需要之蛋白 質之活性的單株抗體可促使細胞死亡。另一種治療性單株 抗體可結合標乾且活化其正常功能。舉例而言’單株抗體 可與細胞上之蛋白質結合且引發細胞洞亡信號。最後，若 單株抗體與僅表現於病變组織上之標靶結合，則諸 或放射性藥劑之毒性有效負載（有效藥劑）與單株抗體之結 合可形成將毒性有效負載特定傳遞至病變組織的藥劑，從 而減少對健康組織之傷害。 術語「診斷性抗體」係指用作疾病之珍斷試劑的抗體。 診斷性抗雜可結合至尤其與特定疾病相關或在特定疾病中 顯不增加之表現的標乾。診斷性抗體可用於例如偵測患者 之生物樣本中之標㈣用於患者之疾病部位(諸如 之診斷成像。 144539.doc •17- 201032826 「CD20」抗原為具有約35 kD分子量之非糖基化、跨膜 磷蛋白，其存在於末梢血液或淋巴器官之90%以上B細胞 之表面上。CD20在早期前B細胞發育期間受到表現且保持 直至漿細胞分化為止；其不存在於人類幹細胞、淋巴祖細 胞或正常漿細胞中。CD20存在於正常B細胞以及惡性B細 胞上。文獻中之CD20之其他名稱包括「B-淋巴細胞限制 之分化抗原」及「Bp35」。CD20抗原描述於例如Clark及 Ledbetter, Jdv· 52:81-149 (1989)及 Valentine 等 人，J. 5/o/. C/zem. 264(19):11282-11287 (1989)中。 術語「抗體」以最廣泛含義使用且尤其涵蓋單株抗體 (包括全長單株抗體）、多特異性抗體（例如雙特異性抗體） 及抗體片段，只要其展現所需生物活性或功能即可。 本發明之人類化CD20結合抗體之生物活性至少包括抗 體結合至人類CD20，更佳結合至人類及其他靈長類 CD20(包括獼猴、恆河猴、黑猩猩）。抗體以不高於1 X 10_8 之1^值，較佳不高於約lxlO'9iKd值結合CD20，且能夠在 活體内殺死或消耗B細胞，與未經該抗體治療之適當陰性 對照相比，較佳在活體内殺死或消耗B細胞至少20%。B細 胞消耗可為ADCC、CDC、細胞凋亡或其他機制中之一或 多者之結果。在本文中之疾病治療之一些實施例中，相對 於其他效應功能或機制而言，可能需要特定效應功能或機 制，且較佳選擇人類化2H7之某些變異體以達成彼等生物 功能，諸如ADCC。 「抗體片段」包含全長抗體之一部分，通常為其抗原結 144539.doc •18- 201032826 合區或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、p(abi)2及 Fv片段；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及自抗 體片段形成之多特異性抗體。

Fv」為含有元整抗原識別位點及抗原結合位點之最小 抗體片段。此片段由一個重鏈可變區結構域與一個輕鍵可 * 變區結構域緊密非共價結合之二聚物組成^此等兩個結構 域之摺疊形成六個高變環（H鏈及L鏈各3個環），提供用於 抗原結合之胺基酸殘基且將抗原結合特異性賦予抗體。然 而，即使單一可變域（或僅包含三個對於抗原具有特異性 之CDR的Fv之一半）亦能夠識別且結合抗原，惟親和力低 於整個結合位點。 如本文中所用之術語「單株抗體」係指來自實質上均質 抗體之群體之抗體，亦即除可能在單株抗體產生期間出現 之可能變異體（該等變異體通常少量存在）以外構成群體 之個別抗體相同且/或結合相同抗原決定基。該單株抗體 * 通常包括包含結合標靶之多肽序列之抗體，其中藉由包括 自複數個多肽序列選擇結合單一標靶之多肽序列的方法來 獲得結合標靶之多肽序列。舉例而言，選擇方法可為自複 * 數個純系(諸如融合瘤純系、噬菌體純系或重組DNA純系 之庫）藝唯—㈣。應瞭解可進-步改㈣選結合標乾 之序列以例如改良對標乾之親和力、將結合縣之序列人 類化、改良其在細胞培養中之產量、降低其在活體内之免 疫原性、形成多特異性抗體等，且包含經改變之結合標輕 之序列之抗體亦為本發明之單株抗體。與通常包括針對不 144539.doc •19- 201032826 同決定子（抗原決定基）之不同抗體的多株抗體製劑相反， 單株抗體製劑中之各單株抗體係針對抗原上之單一決定 子。除其特異性之外，單株抗體製劑之有利之處在於其通 常不被其他免疫球蛋白污染。修飾語「單株」表示如自實 質上均質抗體群所獲得之抗體之性質，且不應理解為需要 藉由任何特定方法產生抗體。舉例而言，可根據本發明使 用之單株抗體可由各種技術製造，包括例如融合瘤方法 (例如 Kohler 等人，iVaiwre, 256:495 (1975) ; Harlow等人，

Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press,第 2 版 1988) ; Hammerling 等人，

Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681， (Elsevier，N.Y·，1981))、重組DNA方法（參見例如美國專利 第4,816,567號）、噬菌體呈現技術（參見例如Clackson等人， 352:624-628 (1991) ; Marks 等人，·/. Mo/·方/<9厂， 222:581-597 (1991) ； Sidhu# A, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004) ; Lee 等人，XMo/.扪〇/·340(5):1073-1093

(2004) ; Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004);及 Lee 等人，《/.

Methods 284(1-2): 119-132 (2004))，及在具有編碼人類免 疫球蛋白序列之部分或全部人類免疫球蛋白基因座或基因 之動物中產生人類或擬似人類抗體的技術（參見例如WO 1998/24893 ； WO 1996/34096 ； WO 1996/33735 ； WO 1991/10741 ; Jakobovits等人，Proc. iVai/. jcai/. Sci. 90:2551 (1993) ; Jakobovits 等人，Nature, 362:255-258 144539.doc -20- 201032826 (1993) ; Bruggemann等人，Year in Immuno., 7:33 (1993)； 美國專利第5,545,806號；第5,569,825號；第5,591,669號 (皆屬於 GenPharm);第 5,545,807號；WO 1997/17852;美 國專利第 5,545,807號；第 5,545,806號；第 5,569,825 號； 第 5,625,126號；第 5,633,425號；及第 5,661,016號；Marks 等人，灯，1〇: 779-783 (1992) ; Lonberg等人， Nature, 368: 856-859 (1994) ； Morrison, Nature^ 368: 812-813 (1994) ； Fishwild# A, Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996) ； Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996);及 Lonberg 及 Huszar, jRev. JiMwawo/·，13: 65-93 (1995)。 本發明之CD20結合抗體之「功能片段」為保持結合至 CD20的彼等片段，該等片段結合CD20的親和力與其所來 源之完整全長分子實質上相同且顯示生物活性，包括消耗 B細胞，如藉由活體外或活體内檢定（諸如本文中描述之彼 等檢定）所測量。 術語「可變」係指可變域之某些區段之序列在抗體之間 廣泛地不同。V域介導抗原結合且限定特定抗體對其特定 抗原之特異性。然而’可變性並非均勻分布於可變域之 110個胺基酸跨距中。實際上，V區域係由15_3 0個胺基酸 之相對恆定區段（稱為構架區（FR))組成，該等區段藉由各 9-12個胺基酸長之較短最大可變區（稱為「高變區」）分 隔。原生重鏈及輕鏈之可變域各自包含四個主要採用β-摺 疊構型的FR，其藉由三個高變區連接，從而形成連接β-摺 144539.doc -21- 201032826 疊結構的環且所形成的環在一些情況下形成β-摺疊結構之 一部分。各鏈中之高變區由FR緊密結合在一起且與另一鏈 之高變區一起促進抗體之抗原結合位點之形成（參見Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，MD. (1991))。恆定域不直接涉及抗體與抗原之 結合，但展現各種效應功能，諸如抗體參與抗體依賴性細 胞介導細胞毒性（ADCC)。 術語「高變區」在本文中使用時係指抗體中之負責結合 抗原之胺基酸殘基。高變區通常包含「互補決定區」或 「CDR」之胺基酸殘基（例如VL中之約殘基24-34(Ll)、50-56(L2)及 89-97(L3)及 VH 中之約 31-35B(H1)、50-65(H2)及 95-102(H3)(Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))及/或 「高變環」之彼等殘基（例如VL中之殘基26-32(Ll)、50-52(L2)及 91-96(L3)及 VH 中之 26-32(Η1)、52A-55(H2)及 96-101(H3))(Chothia 及 Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。 如本文中所提及，「共同序列」或共同V域序列為比較已 知人類免疫球蛋白可變區序列之胺基酸序列所獲得之人工 序列。根據此等比較，製備編碼V域胺基酸之重組核酸序 列，該等V域胺基酸為來源於人類κ及人類Η鏈亞群III V域 之共同序列。共同V序列不具有任何已知之抗體結合特異 144539.doc -22- 201032826 性或親和力。 「嵌合」抗體（免疫球蛋白）之重鏈及/或輕鏈之一部分與 來源於特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中之相 應序列相同或同源，而鏈之其餘部分與來源於另一物種或 屬於另一抗體類別或子類之抗體及該等抗體之片段中之相 應序列相同或同源，只要其展現所需生物活性。（美國專 利第 4,816,567號；及 Morrison等人，iVoc. iVa". Jcad 5^·. C/M 81:6851-6855 (1984))。如本文中所用之人類化抗體為 嵌合抗體之亞群。 非人類（例如鼠類）抗體之「人類化」形式為含有來源於 非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。人類化抗體多 半為其中受體之高變區殘基經來源於具有所需特異性、親 和力及/或能力之非人類物種（諸如小鼠、大鼠、兔或非人 類靈長類）(供體抗體）之高變區殘基置換的人類免疫球蛋白 (受體抗體）。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架區 (FR)殘基經相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包 含不存在於受體抗體或供體抗體中之殘基。此等修飾可進 一步改進抗體效能，諸如結合親和力。通常，人類化抗體 包含至少一個且通常兩個可變域之實質上全部，其中全部 或實質上全部高變環對應於非人類免疫球蛋白之彼等者， 且全部或實質上全部FR區為人類免疫球蛋白序列之彼等 者，惟FR區可包括一或多個改良結合親和力之胺基酸取 代。FR中之此等胺基酸取代之數目通常在Η鏈中不超過6 個，且在L鏈中不超過3個。人類化抗體視情況亦包含免疫 144539.doc •23· 201032826 球蛋白恆定區（Fc)(通常人類免疫球蛋白恆定區）之至少一 部分。詳情參見Jones 等人，iVaiwre 321:522-525 (1986); Reichmann 等人，iVaiMre 332:323-329 (1988);及 Presta， Cwrr. 5ζ·ο/. 2:593-596 (1992)。 「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指在補體存在下 溶解標靶細胞。傳統補體路徑之活化係藉由補體系統之第 一組份（C1 q)與結合至其同源抗原之（適當子類）抗體結合來 開始。為了評估補體活化，可執行CDC檢定，例如 Gazzano-Santoro等人，·/./讲wm«o/· 202:163 (1996) 中所述。 在整篇本說明書及申請專利範圍中，除非另外說明，否 則免疫球蛋白重鏈之恆定域中之殘基編號為EU索引之編 號，如 Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological /«iereii，第 5版 Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD (1991)中之 EU 索引，該文獻以引 用的方式明確併入本文中。「如Kabat中之EU索引」係指人 類IgGl EU抗體之殘基編號。除非特定說明序列或其他編 號系統，否則根據Kabat編號來對v區中之殘基編號。 CD20抗體包括：「C2B8」，現稱為「利妥昔單抗」 (「RITUXAN®」）（美國專利第5,736，137號）；可購自IDEC Pharmaceuticals，Inc.之標記釔_[9〇]之2B8鼠類抗體（稱為 「Y2B8」）或「替坦異貝莫單抗（ibritumomab Tiuxetan)」 (ZEVALIN®)(美國專利第 5,736,137 號；2B8 於 1993年 6月 22 曰以寄存編號HB11388寄存於ATcc);鼠類IgG2a「B1」， 144539.doc -24· 201032826 亦稱為「托西莫單抗（Tositumomab)」，其視情況標記131I以 產生「131I-B1」或「碘1131托西莫單抗」抗體 (BEXXAR™, GlaxoSmithKline，亦參見美國專利第 5,595,721號）；鼠類單株抗體「1F5」（Press等人B/od 69(2):584-591 (1987)及其變異體，包括「補綴之構架」或 人類化 1F5(W0 2003/002607, Leung，S. ; ATCC 寄存 HB-9645〇);鼠類2H7及嵌合2H7抗體（美國專利第5,677，180 號）；人類化2H7(WO 2004/056312(Lowman等人）且如以下 闡述）；HuMAX-CD20tm，一種完全人類抗體（Genmab， Denmark ；參見例如 Glennie 及 van de Winkel, Drug 少 8: 503-510 (2003)及 Cragg 等人， 101: 1045-1052 (2003)); WO 2004/035607(Teeling等人）中 闡述之人類單株抗體；US 2004/0093621(Shitara等人）中描 述之其中複雜N-醣苷連接之糖鏈與Fc區結合的抗體； CD20結合分子，諸如ΑΜΕ系列之抗體，例如AME-133tm 抗體，如 WO 2004/103404(Watkins等人，Applied Molecular Evolution)中闡述；A20抗體或其變異體，諸如嵌合或人類 化 A20 抗體（分別為 cA20、IMMU-106 a.k.a. hA20)(US 2003/0219433，US 2005/0025764; Immunomedics);及單株 抗體 L27、G28-2、93-1B3、B-Cl 或 NU-B2，可購自 International Leukocyte Typing Workshop(Valentine 等人， Tjphg· III (McMichael 編，第 440 頁，Oxford University Press (1987))。本文中之較佳CD20抗體為人類 化、嵌合或人類CD20抗體，更佳為人類化2H7抗體、利妥 144539.doc -25- 201032826 昔單抗、後合或人類化A20抗體（Immunomedics)及 HuMAX-CD20tm人類 CD20抗體（Genmab)。 「經分離之」抗體為已鑑別且自其天然環境之組份中分 離且/或回收之抗體。其天然環境之污染組份為干擾抗體 之診斷或治療使用的物質，且可包括酶、激素及其他蛋白 質或非蛋白質溶質。在較佳實施例中，抗體純化至（1)大於 95重量％之抗體，且最佳99重量％以上，如由洛瑞（Lowry) 方法所測定；（2)足以獲得N-末端或内部胺基酸序列之至 少15個殘基的程度，藉由使用旋杯式序列分析儀測定，或 (3)均質，如在還原或非還原性條件下、使用庫馬斯藍 (Coomassie blue)或較佳銀染色法、藉由SDS-PAGE所測 定。經分離之抗體包括重組細胞内之原位抗體，此歸因於 抗體天然環境之至少一種組份將不存在。然而，經分離之 抗體通常由至少一個純化步驟製備。 本發明之組合物及方法 本發明提供皮下投與諸如蛋白質之巨分子之醫藥組合 物，其包含2%至3 0% ΗΡ-β環糊精、ΗΡ-γ環糊精或SBE環糊 精。在一些實施例中，本發明提供皮下投與抗體之醫藥調 配物，其包含10 mg/ml至200 mg/ml濃度範圍之抗體及2% 至30% ΗΡ-β環糊精、ΗΡ-γ環糊精或SBE環糊精。在某些實 施例中，抗體濃度範圍為30-150 mg/ml。在其他實施例 中，抗體濃度範圍為100-150 mg/ml。在某些實施例中， 醫藥調配物包含5°/。至30%濃度之ΗΡ-β環糊精。在某些實施 例中，醫藥調配物包含5°/。至20%濃度之ΗΡ-γ環糊精。在某 144539.doc -26- 201032826

些實施例中，醫藥調配物另外包含50 mM至200 mM濃度之 精胺酸琥珀酸鹽。在某些實施例中，醫藥調配物包含2% 至9%濃度之SBE環糊精。在某些實施例中，醫藥調配物包 含約100 mg/ml濃度之抗體及15%至30%濃度之ΗΡ-β環糊 精。在某些實施例中，醫藥調配物包含約150 mg/ml濃度 之抗體及約30%濃度之ΗΡ-β環糊精。在某些實施例中，醫 藥調配物包含約150 mg/ml濃度之抗體及約10%濃度之ΗΡ-γ 環糊精。在某些實施例中，醫藥調配物另外包含50 mM至 200 mM濃度之精胺酸琥珀酸鹽。在一特定實施例中，醫 藥調配物包含100 mg/ml至150 mg/ml濃度範圍之人類化 2H7抗體、15%至30%濃度之ΗΡ-γ環糊精及50 mM至100 mM濃度之精胺酸琥珀酸鹽。在其他實施例中，醫藥組合 物另外包含30 mM乙酸鈉；5%海藻糖二水合物；及0.03% 聚山梨醇酯20(pH 5.3)。 在不同實施例中，本發明提供包含人類化2H7抗體（在本 文中亦稱為hu2H7)之醫藥組合物。在特定實施例中，人類 化2H7抗體為表1中所列之抗體。 表1 -人類化抗CD20抗體及其變異體 2H7變異體 VL SEQ ID NO. VH SEQ ID NO. 全長L鏈 SEQ ID NO. 全長H鏈 SEQ ID NO. A 1 2 6 7 B 1 2 6 8 C 3 4 9 10 D 3 4 9 11 F 3 4 9 12 G 3 4 9 13 Η 3 5 9 14 I 1 2 6 15 144539.doc -27· 201032826 表1之抗體變異體A、B及I各自包含輕鍵可變域序列 (VL)： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKA.PKPLIYAPSNLASGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQIDNO:l> ; 及 重鏈可變域序列（VH): EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSY NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQGTLVTV SS (SEQ Π) NO: 2) 〇 表1之抗體變異體C、D、F及G各自包含輕鏈可變域序列 ® (VL)： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ Π) NO： 3)， 及 重鏈可變域序列（VH): EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS'GYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSY NQKFKGRFT ISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSASYWYFDVWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 4) 。 翁 表1之抗體變異體H包含輕鏈可變域序列（VL)SEQ ID ¥ NO:3(上文）及重鏈可變域序列（VH): EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTPTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSY NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSYRYWYFDVWGQGTLVTV SS (SEQIDNO.5) 表1之抗體變異體A、B及I各自包含全長輕鏈序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSR

FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDPATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ Π) NO: 6) •28- 144539.doc 201032826 表1之變異體A包含全長重鏈序列： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSY ΝΟΚΡΙΟ^ΤΙβνΌΚεΚΝΊΊϋΥΙ^ΜΝΞΙ^ΗΑΕΟΤΑνΥΥαΑϊίννΥΥβΝΞΥΪίΥΡΟνΝαζ^ΤΙιντν SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKS LS LS PGK (SEQ Π) NO: 7) 表1之變異體B包含全長重鏈序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSY NQKFKGRFT 工 SVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP 工 AATISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ Π) NO: 8) 表1之變異體I包含全長重鏈序列： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSY NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ Π) NO: 15> 〇 表1之抗體變異體C、D、F、G及Η各自包含全長輕鏈序 列： ϋϋΌΜΤζ^ί^Ι^ΑβναΟΙίνΤΙΤαυ^βνίδΥΙιΗϊίΥΟΟΚΡαΚΛΡΚΡΙιΙΥΑΡβΝΙιΑΒανΕ^ FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO：9) 表1之變異體C包含全長重鏈序列： -29- 144539.doc 201032826 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSY NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSASYWyFDVWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ ΥΝΑΤΥΗννβνΐιΤνίιΗΟΒνίΙι^ΚΕΥΚασ^ΝΚΑΙίΡΑΡΙΑΑΤΙΒΚΑΚΟΟΡΚΕΡΟνΥΤΙιΡΕ^ EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQD)NO:10) 表1之變異體D包含全長重鏈序列： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSY NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSIiRAEDTAVYYCARWYYSASYWYFDVWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAIiGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEATISKAKGQPREPQVYTLPPSR ΕΕΜΤΚΝΟνβΙιΤΟ^νκσΡΥΕ^ΙΑνΕΝΕβΝσΟΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνυ^ΟβΡΡυ^ΚΙιΤνϋΚδ RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQIDNOrll) 表1之變異體F包含全長重鏈序列： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSY ΝΟΚΡΚΏΙ^ΤΙβνΌΚδΚΝΤΙϋΥΙιΟΜΝβΙίΗΑΕϋΤΑνΥΥαΆΕννΥΥΒΑεΥΝΥΡΌνν^ΟΤΙΛΓΓν SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSR ΕΕΜΤΚΝΟνβΒΤΟϋνΚΏΡΥΡβϋΙΑνΕν^ΝΟΟΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνί^ϋαβΡΓΙ^ΚΚΓνΌΚΒ RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:12) 表1之變異體G包含全長重鏈序列： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSY NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSASYWYFDVWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHWHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO： 13) 表1之變異體H包含全長重鏈序列： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSY NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSYRYWYFDVWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO 14) -30-

144539.doc 201032826 在某些實施例中，本發明之人類化2H7抗體另外在IgG Fc中包含胺基酸變異且與具有野生型IgG Fc之抗體相比， 針對人類FcRn展現的結合親和力增加至少60倍、至少70 倍、至少80倍、更佳至少100倍、較佳至少125倍、甚至更 佳至少150倍至約170倍。

IgG中之N-糖基化位點為CH2域中之Asn297。本發明之 人類化2H7抗體組合物包括具有Fc區之任何前述人類化 2H7抗體之組合物，其中組合物中之約80-100%(較佳約90-99%)抗體包含一個缺乏海藻糖之成熟核心碳水化合物結構 與醣蛋白之Fc區連接。本文中證明該等組合物在與 FcyRIIIA (F158)結合方面展現驚人改良，FcyRIIIA (F158) 在與人類4〇相互作用方面不如戶〇丫11111八（¥158)有效。在 正常、健康非洲裔美國人及白種人中，FcyRIIIA (F158)比 FcyRIIIA (VI58)常見。參見 Lehrnbecher 等人，5/ood 94:4220 (1999)。歷史上，中國倉鼠卵巢細胞（CHO)(最常 用之工業宿主之一）中所產生之抗體在該群體中含有約2% 至6%未海藻糖基化。然而，YB2/0及Lecl3可產生78%至 98%未海藻糖基化之抗體。Shinkawa等人，J Bio. Chem. 278 (5), 3466-347 (2003)報導，具有較少FUT8活性之 YB2/0及Lec 13細胞中所產生之抗體在活體外顯示顯著增加 之ADCC活性。具有低海藻糖含量的抗體之製造亦描述於 例如2006年1月22日Nature Biology線上出版物中Li等人， (GlycoFi) 「 Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris」；Niwa R.等人，Cancer 144539.doc -31 - 201032826

Res. 64(6):2127-2133 (2004) ； US 2003/ 0157108(Presta)； US 6,602,684及 US 2003/0175884(Glycart Biotechnology); US 2004/0093621 、 US 2004/ 0110704 ' US 2004/0132140 (皆屬於 Kyowa Hakko Kogyo)中 ° 本文中之調配物亦可含有治療特定適應症所需要之一種 以上活性化合物，較佳具有彼此無不利影響之互補活性 者。舉例而言，可能需要另外提供細胞毒性劑、化學治療 劑、細胞激素或免疫抑制劑（例如作用於T細胞之藥劑，諸 如環孢素，或結合T細胞之抗體，例如結合LFA-1之抗 體）。該等其他藥劑之有效量視調配物中之抗體含量、疾 病或病症或治療類型及上述其他因素而定。此等藥劑通常 以本文中所述相同之劑量及投藥途徑或以約1至99%之慣 用劑量使用。 用於活體内投與之調配物必須為無菌的。此容易經由無 菌過濾器過濾實現。 抗體產生 單株抗體 可使用最先由Kohler等人，256:495 (1975)描述 之融合瘤方法製造單株抗體或可藉由重組DNA方法（美國 專利第4,816,567號）製造單株抗體。 在融合瘤方法中，如上所述使小鼠或其他適當宿主動物 (諸如倉鼠）免疫以誘導淋巴細胞產生或能夠產生特異性結 合至用於免疫之蛋白質的抗體。或者，可在活體外使淋巴 細胞免疫。免疫之後，分離淋巴細胞且隨後使用合適融合 144539.doc •32· 201032826 劑（諸如聚乙二醇）使淋巴細胞與骨髓瘤細胞株融合以形成 蘇合瘤細胞（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,第 59-103 頁（Academic Press, 1986))。 將由此所製備之融合瘤細胞接種且生長於合適培養基 中，該培養基較佳含有一或多種抑制未融合之親本骨髓瘤 細胞（亦稱為融合搭配物）之生長或存活之物質。舉例而 言，若親本骨髓瘤細胞不具有酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖 轉移酶（HGPRT或HPRT)，則融合瘤之選擇性培養基通常包 括次黃嘌呤、胺基喋呤及胸苷（HAT培養基），該等物質防 止缺乏HGPRT之細胞之生長。 較佳融合搭配物骨髓瘤細胞為有效地融合、有助於所選 產生抗體之細胞穩定高量產生抗體且對選擇性抑制未融合 親本細胞之選擇性培養基敏感的骨髓瘤細胞。較佳骨髓瘤 細胞株為鼠類骨髓瘤細胞株，諸如來源於可自沙克生物研 究所細胞分配中心（Salk Institute Cell Distribution Center) (San Diego，California USA)獲得之 MOPC-21 及 MPC-11 小 鼠腫瘤之彼等細胞株及可自美國菌種保存中心（American Type Culture Collection)(Rockville，Maryland USA)獲得之 SP-2及衍生物，例如X63-Ag8-653細胞。亦已描述用於產 生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異骨艟瘤細胞 株（Kozbor，乂 133:3001 (1984);及 Brodeur等人，

Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第 5 1，63 頁（Marcel Dekker，Inc.，New York, 1987))。 144539.doc -33- 201032826 對融合瘤細胞生長於其中之培養基檢定針對該抗原之單 株抗體之產生<»較佳藉由免疫沈殿法或藉由活體外結合檢 疋（諸如放射免疫檢定（RIA)或酶聯免疫吸附檢定（ELISA)) 測定融合瘤細胞所產生之單株抗體之結合特異性。 了例如藉由 Munson等人，5，107:220 (1980) 中描述之史卡查（Scatchard)分析來測定單株抗體之結合親 和力。 產生具有所需特異性、親和力及/或活性之抗體的融合 瘤細胞一經鑑別，即可藉由限制稀釋程序次選殖純系且藉 由標準方法使該等純系生長（G〇ding，施⑽c/〇_ Antibodies: Principles and Practice, ^ 59-103 I (Academic Press，1986))。適於此目的之培養基包括例如DMEjv^t RPMI-164G培養基。另外，融合瘤細胞可以動物中之腹水 腫瘤形式活體内生長’例如藉由將細胞腹膜内注射至小鼠 中 〇 次純系所分泌之單株抗體可適當地藉由習知抗體純化程 序自培養基、腹水液或血清分離，該等程序諸如親和性層 析（例如使用蛋白質A或蛋白質G·瓊脂糖）或離子交換層 析、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析等。 編碼單株抗體之DNA可使用習知程序（例如藉由使用能 夠特異性結合至編碼鼠類抗體之重鏈及輕鏈之基因的募核 苦酸探針）輕易地分離及測序。融合瘤細胞充當該dna之 較佳來源。DNA-經分離便可安置於表現載體令，隨後轉 染於宿主細胞（諸如大腸桿菌細胞、猴c〇s細胞、中國倉鼠 144539.doc -34- 201032826 卵巢（CHO)細胞或骨髓瘤細胞）中（否則宿主細胞不產生抗 體蛋白質），以獲得單株抗體在重組宿主細胞中之合成。 關於編碼抗體之DNA在細菌中之重組表現之評述文章包括 Skerra等人，Cwrr OpWon in 5:256-262 (1993)及

Pluckthun, Immunol. Revs., 130:15 1-188 (1992)。 '在另一實施例中，可自抗體噬菌體庫中分離單株抗體或 抗體片段’抗體噬菌體庫係使用McCafferty等人，爪^«以， 348:552-554 (1990)中描述之技術產生。Clackson等人， ❿ 352:624-628 (1991)及 Marks 等人，《/. Mo/.价〇/_， 222:581-597 (1991)描述使用噬菌體庫分別分離鼠類及人 類抗體。後續出版物描述藉由鏈改組（Marks等人， 幻;，1〇:779_783 (1992))以及組合感染及活體内 重組作為構築極大噬菌體庫之策略（Waterh〇use等人， 1^· 21:2265-2266 (1993))來產生高親和力（nM範 圍）人類抗體。因此’此等技術為用於分離單株抗體之傳 φ 統單株抗體融合瘤技術之可行替代方案。 可修飾編碼抗體之DNA以產生嵌合或融合抗體多肽，例 如用人類重鏈及輕鏈恆定域（Ch及CL)序列取代同源鼠類序 列（美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，iVoc. #加/ 忒5W· 81:6851 (1984))’或使免疫球蛋白編碼序 列與非免疫球蛋白多肽（異源多肽）之全部或部分編碼序列 融合。非免疫球蛋白多肽序列可取代抗體之恆定域，或其 取代抗體之一抗原結合位點之可變域以形成嵌合二價抗 體，該抗體包含一個對於抗原具有特異性之抗原結合位點 144539.doc • 35· 201032826 及另一個對於不同抗原具有特異性之抗原結合位點。 人類化抗體 非人類抗體人類化之方法已描述於此項技術中。人類化 抗體中較佳引入一或多個非人類來源之胺基酸殘基。此等 非人類胺基酸殘基通常稱為「輸入」殘基，其通常獲自 「輸入」可變域。人類化可基本上依循Winter及同事之方 法（Jones 等人,321:522-525 (1986); Reichmann 等 人，332:323-327 (1988); Verhoeyen等人，Sciewe， 239:1534-1536 (1988))，藉由用高變區序列取代人類抗體 之相應序列來執行。因此’該等「人類化」抗體為嵌合抗 體（美國專利第4,816,567號），其中實質上少於完整人類可 變域已經來自非人類物種之相應序列取代。在實務上，人 類化抗體通常為一些高變區殘基及可能一些FR殘基經齧齒 動物抗體中之類似位點之殘基取代的人類抗體。 當抗體欲用於人類治療用途時，選擇用於製造人類化抗 體之人類可變域（輕鏈可變域與重鏈可變域）對於減少抗原 性及HAMA反應（人類抗小鼠抗體）極其重要。根據所謂 「最佳擬合」方法’相對於已知人類可變域序列之完整 庫，篩檢齧齒動物抗體之可變域之序列。鑑別與齧齒動物 之V域序列最接近之人類v域序列且採納其中之人類構架 £ (FR)用於人類化抗體（Sims 等人，《/· ，1 5 1:2296 (1993) ; Chothia等人，乂 196:901 (1987))。另一 方法係使用來源於特定輕鏈或重鏈亞群之所有人類抗體之 共同序列的特定構架區。多種不同人類化抗體可使用相同 144539.doc •36· 201032826 構架。（Carter 等人，尸r〇c. ΛΓα".89:4285 (1992) ; Presta等人，《/· /wmwwc»/.，151:2623 (1993))。 另外重要的是抗體在保留對抗原之高結合親和力及其他 有利生物學性質的情況下人類化。為達成此目標，根據一 較佳方法，使用親本及人類化序列之三維模型、藉由分析 親本序列及各種概念人類化產物的方法製備人類化抗體。 三維免疫球蛋白模型通常可獲得且為熟習此項技術者所熟 知。可獲得說明且顯示所選候選免疫球蛋白序列之可能三 維構形結構的電腦程式。檢查此等顯示可分析殘基在候選 免疫球蛋白序列之功能中的可能作用，亦即分析影響候選 免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘基。以此方式，可自受 體及輸入序列選擇且合併FR殘基以便達成所需抗體特徵， 諸如對標乾抗原之高親和力。一般而言，高變區殘基直接 且最實質性地與影響抗原結合有關。 人類化抗體可為抗體片段，諸如Fab，其視情況與一或 多種細胞毒性劑結合以便產生免疫結合物。或者，人類化 抗體可為全長抗體，諸如全長IgGl抗體。 人類抗體及噬菌體呈現方法 作為人類化之替代方案’可產生人類抗體。舉例而言， 現可產生轉殖基因動物（例如小鼠），其能夠在免疫後、在 不產生内源性免疫球蛋白的情況下產生人類抗體之完整譜 系。舉例而言’已描述嵌合及生殖系突變小鼠中抗體重鏈 接合區（Jh)基因之同型合子缺失導致内源性抗體產生被完 全抑制。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至該等生 144539.doc -37- 201032826 殖系突變小鼠中可在抗原攻毒後產生人類抗體。參見例如 Jakobovits 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993) ; Jakobovits 等人，Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann等人，Tear k /mmwwo·，7:33 (1993);美國專利 第 5,545,806 號、第 5,569,825 號、第 5,591,669 號（皆屬於 GenPharm)；第 5,545,807號；及 WO 97/1 7852。 或者，可使用嗟菌體呈現技術（McCafferty等人， 348:5 52-5 53 [1990])在活體外自來源於未免疫供體之免疫 球蛋白可變（V)域基因譜系產生人類抗體及抗體片段。根 據此技術，將抗體V域基因同框選殖於絲狀噬菌體（諸如 Ml3或fd)之主要或次要鞘蛋白基因中且以功能性抗體片段 形式呈現於噬菌體顆粒之表面上。因為絲狀顆粒含有噬菌 體基因體之單股DNA複本，所以基於抗體之功能性質進行 選擇亦導致選擇編碼展現彼等性質之抗體之基因。因此， 噬菌體模擬B細胞之一些性質。噬菌體呈現可以多種形式 執行（回顧於例如 Johnson, Kevin S.及 Chiswell, David J·， Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993) 中）。多種來源之V-基因區段可用於噬菌體呈現。Clackson 等人，iWziwre，352:624-628 (1991)自來源於經免疫小鼠之 脾臟的V基因之小型隨機組合庫分離大批不同抗噁唑酮抗 體。可構築來源於未免疫人類供體之V基因譜系且可基本 上依循 Marks等人，J. Mo/.出〇/. 222:581-597 (1991)或 〇1^行化等人，£从50·/· 12:725-734 (1993)描述之技術分離 針對大批不同抗原（包括自體抗原）之抗體。參見例如美國 144539.doc • 38 · 201032826 專利第5,565,332號及第5,573,905號。 如以上所討論，人類抗體亦可由活體外活化之B細胞產 生（參見美國專利5,567,610及5,229,275)。 抗體片段 在某些情況中，使用抗體片段優於使用完整抗體。較小 尺寸之片段容許快速清除，且可使近接實體腫瘤得到改 良。 已開發用於產生抗體片段之各種技術。此等片段傳統上 經由完整抗體之蛋白分解消化來獲得（參見例如M〇rim〇t〇 專尺，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992);及 Brennan 等人，229:81 (1985))。然而’此等片段現可藉由重組宿主細胞直接產 生。Fab、Fv及ScFv抗體片段皆可表現於大腸桿菌中且自 大腸桿菌中分泌’由此容許便利地產生大量的此等片段。 抗體片段可自上述抗體噬菌體庫中分離。或者，Fab，_SH 片段可直接自大腸桿菌中回收且以化學方式偶合以形成 F(ab )2 片段（Carter 等人，Bio/Technology 10:163-167 (1992))。根據另一方法，可直接自重組宿主細胞培養物分 離F(ab')2片段。包含補救受體結合抗原決定基殘基、活體 内半衰期延長的Fab及F(ab’)2片段描述於美國專利第 5,869,046號中》熟習此項技術者顯而易知產生抗體片段之 其他技術。在其他實施例中，所選抗體為單鏈Fv片段 (scFv)。參見 WO 93/16185 ;美國專利第 5,571,894號；及 美國專利第5,587,458號。Fv及sFv為具有不含恆定區之完 144539.doc •39· 201032826 整結合位點的唯一物質；因此，其適於在活體内使用期間 減少非特異性結合。可構築sFv融合蛋白以使效應蛋白在 sFv之胺基或叛基末端融合。參見Antib〇dy Engineering， Borrebaeck編，見上。抗體片段亦可為「線性抗體」，例如 美國專利5,641，870中所述。該等線性抗體片段可為單特異 性或雙特異性。 其他胺基酸序列修飾 涵蓋本文中描述之CD20結合抗體之胺基酸序列修飾。 舉例而言，可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生 物學性質。藉由將適當核苷酸變異引入抗CD20抗體核酸 中’或藉由肽合成來製備抗CD20抗體之胺基酸序列變異 體。該等修飾包括例如抗CD20抗體之胺基酸序列内之殘 基缺失及/或插入及/或取代。可將缺失、插入及取代任意 組合以獲得最終構築體，限制條件為最終構築體具有所需 特徵。胺基酸變異亦可改變抗CD20抗體之轉譯後過程， 諸如改變糖基化位點之數目或位置。 一種適用於鑑別抗CD20抗體中位於突變誘發較佳位置 之某些殘基或區域的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」， 如 Cunningham及 Wells在 似e，244:1081-1085 (1989)中 所描述。其中，鑑別一個殘基或一組靶殘基（例如帶電荷 之殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)且置換為中性或帶 負電荷之胺基酸（最佳丙胺酸或聚丙胺酸）以影響胺基酸與 CD20杬原之相互作用。隨後藉由在取代位點或針對取代 位點引入另外或其他變異體來改進對於取代作用顯示功能 144539.doc -40- 201032826 敏感性的彼等胺基酸位置。因此，雖然引入胺基酸序列變 異之位點係經預定，但是突變本身之性質無需預定。舉例 而言’為了分析指定位點之突變之效能，在靶密碼子或區 域進行ala掃描或隨機突變誘發且針對所需活性篩檢所表現 之抗CD20抗體變異體。

胺基酸序列插入包括長度範圍為一個殘基至含有一百個 或一百個以上殘基之多肽的胺基末端及/或羧基末端融 合，以及單個或多個胺基酸殘基之序列内插入。末端插入 之實例包括具有N·末端曱硫胺醯基殘基之抗CD2〇抗體或 與細胞毒性多肽融合之抗體。抗CD2〇抗體分子之其他插 入變異體包括抗CD20抗體之N_末端或C-末端與增加抗體 血清半衰期之酶（例如針對ADEPT)或多肽之融合。 另一類型之變異體為胺基酸取代變異體。此等變異體為 抗CD20抗體分子中之至少一個胺基酸殘基已經不同殘基 置換。最受關注之取代性突變誘發之位點包括高變區，但 亦涵蓋FR變異。保守性取代顯示於下表中 代」下。若該等取代導致生物活性變化， 質性變異（在該表中名為「例示性取代」 基酸類別進一步所述）且篩檢產物。 之標題「較佳取 則可引入更多實 或如下文參考胺 144539.doc -41 - 201032826 表2-胺基酸取代 初始殘基 例示性取代 較佳取代 Ala(A) val ; leu ; ile Val Arg(R) lys ； gin ； asn Lys Asn(N) gin ; his ·，asp, lys ; arg Gin Asp(D) glu ； asn Glu Cys(C) ser ; ala Ser Gln(Q) asn ； glu Asn Glu(E) asp ； gin Asp Gly(G) ala Ala His(H) asn，· gin ; lys ; arg Arg Ile(D leu ; val ; met ; ala ; phe ;正白胺酸 Leu Leu(L) 正白胺酸；ile ; val ; met ; ala ; phe lie Lys(K) arg ； gin ； asn Arg Met(M) leu ； phe ； ile Leu Phe(F) leu ； val ； ile ； ala ； tyr Tyr Pro(P) ala Ala Ser(S) thr Thr Thr(T) ser Ser Trp(W) tyr ； phe Tyr Tyr(Y) trp i phe ； thr ； ser Phe Val(V) ile ; leu ; met ; phe ; ala ;正白胺酸 Leu 可藉由選擇對於維持以下方面具有顯著不同之影響的取 代來實現抗體之生物學性質之實質性改變：（a)取代區域中 之多肽骨架之結構，例如呈摺疊或螺旋構形，（b)靶點處之 分子電荷或疏水性，或（c)側鏈之鬆密度。天然產生之殘基 可基於共同側鏈性質分類： (1) 疏水性：正白胺酸、met、ala、val、leu、ile ; (2) 中性親水性：cys、ser、thr ; -42- 144539.doc 201032826 (3) 酸性：asp、glu ; (4) 驗性：asn、gin、his、iyS、arg ; (5) 影響鍵取向之殘基：giy、ρΓ0;及 (6) 方族：trp、tyr、phe 0 非保守性取代要求將此等類別中之一成員交換成另一類 別。 任何不涉及維持抗CD20抗體之適當構形的半 ❹ 參 基通常亦可經絲胺酸取代以改良分子之氧化穩定性且防止 異常父聯。相反地，可將半胱胺酸鍵添加至抗體以改良其 穩疋性（尤其當抗體為諸如Fv片段之抗體片段時）。 尤其較佳類型之取代變異體涉及取代親本抗體（例如人 類化或人類抗體）之一或多個高變區殘基。通常，選用於 進步開發之所得變異體相對於其所來源之親本抗體，將 具有經改良之生物學性質。產生該等取代變異體之適宜方 f涉及使用”體呈現進行親和力錢1言之，使多個 尚變區位點（例如6_7個位點）突變以在各位點產生所有可能 之胺基酸取代°由此產生之抗體變異體以封裝於各顆粒内 ，與M13之基因m產物之融合形式自絲狀㈣體顆粒中以 單價方式呈現。隨後如本文中揭示針對生物活性(例如结 合親和力）對嗟菌體呈現之變異體進行篩檢。4 了鑑㈣ 選高變區位點，可執行丙胺酸掃描突變誘發以 :別』著有助於抗原結合之高變區殘基。或者或另外，分 傾抗體複合物之晶體結構以鑑別抗體與人類C⑽之 間之接觸點可能為有益的。該等接觸殘基及鄰近 144539.doc -43· 201032826 據在本文中詳述之技術進行取代之候選殘基。該等變異體 一經產生’便如本文中描述對該組變異體進行篩檢，且可 選擇在一或多個相關檢定中具有優良性質的抗體用於進一 步開發。 另一類型之抗體胺基酸變異體改變抗體之初始糖基化模 式。改變意謂使存在於抗體中之—或多個碳水化合物部分 缺失’及/或添加一或多個不存在於抗體中之糖基化位 點。 抗體之糖基化通常為N-連接或〇_連接。N_連接係指碳水 化合物部分附接至天冬醯胺殘基之側鏈。三肽序列天冬醯 fe -X-絲胺酸及天冬醯胺_χ_蘇胺酸（其中X為除脯胺酸以外 之任何胺基酸）為使碳水化合物部分酶促附接至天冬醯胺 側鍵之識別序列。因此’此等三肽序列中之任一者存在於 多肽中可形成潛在糖基化位點。〇_連接之糖基化係指將糖 Ν-乙醯基半乳胺糖、半乳糖或木糖之一附接至羥基胺基 酸’最通常為絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5 _經基脯胺酸 或5-經基離胺酸。 將糖基化位點添加至抗體中宜藉由使胺基酸序列變異以 使得其含有一或多個上述三肽序列來實現（針對Ν_連接之 糠基化位點）。亦可藉由向初始抗體序列中添加一或多個 絲胺酸或蘇胺酸殘基或使初始抗體序列經一或多個絲胺酸 或蘇胺酸殘基取代來產生變異（針對〇_連接之糖基化部 位）。 藉由此項技術中已知之多種方法製備編碼抗CD20抗體 144539.doc 201032826 之胺基酸序列變異體之核酸分子。此等方法包括（但不限 於）自天然來源分離（在天然產生之胺基酸序列變異體之情 況下）或藉由對早先製備之抗CD20抗體變異體或非變異體 型式之抗CD20抗體進行寡核苷酸介導（或定點）突變誘發、 PCR突變誘發及匣式突變誘發來製備。 可能需要針對效應功能來修飾本發明之抗體，以便例如 增強抗體之抗原依賴性細胞介導之細胞毒性（ADCC)及/或 補體依賴性細胞毒性（CDC)。此可藉由在抗體之Fc區中引 入一或多個胺基酸取代來達成。或者或另外，可在Fc區中 引入半胱胺酸殘基，由此容許在此區域中形成鏈間雙硫 鍵。由此產生之同型二聚抗體可具有改良之内化能力及/ 或增強之補體介導細胞殺傷力及抗體依賴性細胞介導細胞 毒性（ADCC)。參見 Caron等人，/·五;φ Med 176:1191-1195 (1992)及 Shopes，Β· «/. /wwmwo/. 148:2918-2922 (1992)。亦 可如 Wolff 等人，Cancer 53:2560-2565 (1993)中所 述’使用異型雙官能交聯子製備具有增強之抗腫瘤活性之 同型二聚抗體。或者，抗體可工程改造成具有雙Fc區且由 此可具有增強之補體介導之溶解及ADCC能力。參見

Stevenson 等人，Drwg Dehgw 3:219-230 (1989)。 治療用途 所揭示的包含本發明之人類化2H7 CD20結合抗體之方 法及組合物適用於治療許多惡性及非惡性疾病，其包括 CD20陽性B細胞癌症（諸如B細胞淋巴瘤及白血病）及自體 144539.doc •45- 201032826 免疫疾病。骨髓中之幹細胞（B細胞祖細胞）不具有CD20抗 原，容許健康B細胞在治療之後再生且在數月内恢復至正 常含量。 CD20陽性B細胞癌症為包含在細胞表面上表現CD20之B 細胞之異常增殖的彼等癌症。CD20陽性B細胞腫瘤包括 CD20陽性霍奇金氏疾病，包括淋巴細胞為主型霍奇金氏 疾病（LPHD);非霍奇金氏淋巴瘤（NHL);濾泡性中心細胞 (FCC)淋巴瘤；急性淋巴細胞白血病（ALL);慢性淋巴細胞 白血病（CLL);毛細胞白血病。 如本文中所用之術語「非霍奇金氏淋巴瘤」或「NHL」 係指除霍奇金氏淋巴瘤以外之淋巴系統癌症。霍奇金氏淋 巴瘤有別於非霍奇金氏淋巴瘤之處通常為霍奇金氏淋巴瘤 中存在里二氏細胞（Reed-Sternberg cell)，而非霍奇金 氏淋巴瘤中不存在該等細胞。如本文中所用之該術語所涵 蓋之非霍奇金氏淋巴瘤之實例包括熟習此項技術者（例如 腫瘤學家或病理學家）根據此項技術中已知之分類方案如 此所鑑別之任何非霍奇金氏淋巴瘤，該等分類方案諸如 Color Atlas of Clinical Hematology (第 3 版），A. Victor Hoffbrand及 John E. Pettit (編）（Harcourt Publishers Ltd·， 2000)中所述之經修訂之歐美淋巴瘤（Revised European-American Lymphoma ; REAL)方案。尤其參見圖 11.57、 11.58及11.59中之清單。更多特定實例包括（但不限於）復 發或難治性NHL、前線低度惡性NHL、III/IV期NHL、抗 化學療法NHL、前驅B淋巴母細胞白血病及/或淋巴瘤、小 144539.doc -46- 201032826 淋巴細胞淋巴瘤、B細胞慢性淋巴細胞白血病及/或前淋巴 細胞白血病及/或小淋巴細胞淋巴瘤、B細胞前淋巴細胞淋 巴瘤、免疫細胞瘤及/或淋巴漿細胞淋巴瘤、淋巴漿細胞 淋巴瘤、邊緣區B細胞淋巴瘤、脾臟邊緣區淋巴瘤、淋巴 結外邊緣區-MALT淋巴瘤、淋巴結邊緣區淋巴瘤、毛細胞 白血病、漿細胞瘤及/或漿細胞骨髓瘤、低度惡性/濾泡性 淋巴瘤、中度惡性/濾、泡性NHL、套細胞淋巴瘤、渡泡中 心淋巴瘤（濾泡性）、中度惡性擴散NHL、擴散性大B細胞 淋巴瘤、侵襲性NHL(包括侵襲性前線NHL及侵襲性復發 NHL)、自體幹細胞移植之後復發或自體幹細胞移植難治 之NHL、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴 瘤、高度惡性免疫母細胞NHL、高度惡性淋巴母細胞 NHL、高度惡性小非核裂細胞NHL、巨瘤症NHL、伯基特 氏淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma)、前驅（末梢）大粒狀淋巴細 胞白血症、蕈樣真菌病及/或西紮利症候群（Sezary syndrome)、皮膚淋巴瘤、多形性大細胞淋巴瘤、血管中 心性淋巴瘤。 在特定實施例中，包含人類化CD2〇結合抗體及其功能 片段之醫藥組合物用於治療非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、淋 巴細胞為主型霍奇金氏疾病（Lphd)、小淋巴細胞淋巴瘤 (SLL)及慢性淋巴細胞白血病（CLL)，包括此等病狀之復 發。 惰性淋巴瘤為生長緩慢、不可治癒之疾病，其中在多個 週期之緩解及復發之後，一般患者存活6年與1〇年之間。 144539.doc -47- 201032826 在一實施例中，人類化C D 2 0結合抗體或其功能片段用於 治療惰性NHL，包括復發惰性NHL及利妥昔單抗難治性惰 性NHL·。復發惰性NHL·患者可為先前已接受一個療程之利 妥昔單抗且反應時間大於6月的利妥昔單抗反應者。 本發明之人類化2H7抗體或其功能片段適用作單劑治療 (單一療法），例如復發或難治性低度惡性或濾泡性、CD20 陽性、B細胞NHL之單劑治療（單一療法），或可聯合其他 藥物依多藥方案投與患者。 本發明之人類化2H7抗體或功能片段可用作前線療法。 本發明亦涵蓋使用此等抗體治療患有CD20陽性B細胞腫瘤 之患者，該等患者對任一以下藥物之治療無反應或反應不 足：利妥昔單抗（Genentech);替坦異貝莫單抗（Zevalin™， Biogen Idee);托西莫單抗（Bexxar™，GlaxoSmithKline); HuMAX-CD20™(GenMab) ； IMMU-106(其為人類化抗 CD20 a.k.a. hA20 或 90Y-hLL2，Immunomedics) ; AME-133(Applied Molecular Evolution/Eli Lilly);吉妥珠單抗 奥0坐米星（gentuzumab ozogamicin)(MylotargTM，一 種人類 化抗 CD33 抗體，Wyeth/PDL);阿倫單抗（alemtuzumab) (Campath™，一種抗 CD52 抗體，Schering Plough/ Genzyme);依帕珠單抗（epratuzumab)(IMMU-103TM，一種 人類化抗CD22抗體，Immunomedics)，或在此等藥物治療 之後復發。 本發明另外提供藉由本發明之人類化2H7抗體治療CLL 患者（包括用氟達拉濱（fludarabine)治療失敗的CLL患者）的 144539.doc •48- 201032826 方法。 本文中之「自體免疫疾病」為個體自身組織所產生且針 對個體自身組織的疾病或病症或其共分離（⑺叫或 纟現形式或由其所引起之病狀。自體免疫疾病或病症之實 Γ包t(但不限於）關節炎（類風濕性關節炎，諸如急性關節 火、慢性類風濕性關節炎、痛風性關節炎、急性痛風性關 節炎：慢性發炎性關節炎、退化性關節炎、感染性關節 ❹ ^萊姆關節炎（Lyme arthritis)、增生性關節炎、牛皮癖 關節炎、脊椎關節炎及幼年發作型類風濕性關節炎、骨關 節炎、慢性漸進性關節炎、變形性關節炎、慢性原發性多 發丨關卽乂、反應性關郎炎及強直性脊椎炎）、發炎性過 度增生皮膚病、牛皮癖（斑狀牛皮癖、點狀牛皮癖、腹跑 性牛皮癬及指曱牛皮癣）、異位性皮膚炎（包括異位性疾 病諸如化叙病及約伯氏症候群（Job's syndrome))、皮炎 (包括接觸性皮炎、慢性接觸性皮炎、過敏性皮炎、過敏 φ 性接觸性皮炎、疱疹樣皮炎及異位性皮炎）、X-性聯高IgM 症候群、蓴麻疹（諸如慢性過敏性蓴麻疹及慢性特發性尊 麻疹，包括慢性自體免疫性蓴麻疹）、多發性肌炎/皮肌 炎、幼年型皮肌炎、中毒性表皮壞死溶解、硬皮病（包括 全身性硬皮病）、硬化症（諸如全身性硬化症）、多發性硬化 (Ms)(諸如脊椎-眼MS、原發性進行性MS(PPMS)及復發緩 解型MS(RRMS))、進行性全身性硬化症、動脈粥樣硬化、 動脈硬化、播散性硬化症及共濟失調硬化症、發炎性腸道 疾病（IBD)(例如克羅恩氏病（Crohn’s disease)、自體免疫介 144539.doc -49- 201032826 導之胃腸疾病、結腸炎，諸如潰瘍性結腸炎（Uleerative colitis)、>貝瘍性結腸炎（c〇iit；is ulcerosa)、微觀結腸炎、膠 原性結腸炎、息肉狀結腸炎、壞死性小腸結腸炎及透壁性 結腸炎及自體免疫性發炎性腸道疾病）、壞疽性膿皮病、 結節性紅斑、原發性硬化性膽管炎、上鞏膜炎）、呼吸窘 迫症候群（包括成人或急性呼吸窘迫症候群（ARDS))、腦膜 炎、全部或部分葡萄膜發炎、虹膜炎、脈絡膜炎、自體免 疫性血液病、類風濕性脊椎炎、突發性耳聾、IgE介導之 疾病（諸如過敏反應及過敏性及異位性鼻炎）、腦炎（拉斯馬 森氏如炎（Rasmussen s encephalitis)及邊緣及/或腦幹腦 炎）、葡萄膜炎（諸如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽 腫性葡萄膜炎、非肉芽腫性葡萄膜炎、晶狀體抗原性葡萄 膜炎、後葡萄膜炎或自體免疫性葡萄膜炎）、有及無腎病 症候群之絲球體腎炎（GN)(諸如慢性或急性絲球體腎炎， 諸如原發性GN、免疫介導之GN、膜性GN(膜性腎病）' 特 發性膜性GN或特發性膜性腎病、膜性增生性 GN(MPGN)(包括I型及II型）及迅速進行性GN)、過敏性病 狀及反應、過敏性反應、濕疹（包括過敏性或異位性濕 疹）、哮喘（諸如細支氣管哮喘、支氣管哮喘及自體免疫哮 喘）、涉及T細胞浸潤及慢性發炎反應之病狀、蛀娠期間針 對外來抗原（諸如胎兒Α-Β-0血型）之免疫反應、慢性肺發 炎疾病、自體免疫性心肌炎、白血球黏附缺乏症、全身性 紅斑狼瘡（SLE)(諸如皮膚SLE)、亞急性皮膚紅斑狼瘡、新 生兒狼瘡症候群（NLE)、播散性紅斑狼瘡、狼瘡（包括$ 144539.doc •50、 201032826 炎、大腦炎、兒科、非腎臟、腎臟外、盤狀、脫髮）、幼 年型發作（I型）糖尿病（包括兒科胰島素依賴性糖尿病 (IDDM)、成年發作糖尿病（Η型糖尿病）、自體免疫性糖尿 病）、特發性尿崩症、與細胞激素及T_淋巴細胞所介導之急 性及遲發過敏性相關之免疫反應、結核病、肉狀瘤病、肉 芽遽病（包括淋巴瘤樣肉芽腫病、華格納氏肉芽腫病）、無 顆粒性白血球症；血管病變，包括血管炎（包括大血管血 ❿ 管炎（包括風濕性多肌痛及巨細胞（高安氏（Takayasu's))動 脈炎）、中血管血管炎（包括川崎氏疾病（Kawasaki，s disease)及結節性多動脈炎/結節性動脈周炎）、微觀多動脈 炎、CNS血管炎、壞死性、皮膚性或過敏性血管炎、全身 性壞死性jk管炎，及ANCA相關之血管炎，諸如奇_斯二氏 血管炎或症候群（Churg-Strauss vasculitis or syndrome; CSS))、顳動脈炎、再生障礙性貧血、自體免疫性再生障 礙性貧丘、庫姆陽性貧血（Coombs positive anemia)、先天 ❹ 性單純紅血球再生障礙性貧血（Diamond Blackfan anemia)、溶血性貧血或免疫性溶血性貧血（包括自體免疫 性溶血性貧血（AIhA))、惡性貧血、阿狄森氏病（Addison，s disease)、單純紅血球貧金或發育不全（pRCA)、因子 缺乏症、A型血友病、自體免疫性嗜中性球減少症、全部 血球減少症、白血球減少症、涉及白血球滲出之疾病、 CNS發炎病症、多器官損傷症候群（諸如敗血症、創傷或出 血繼發之彼等症候群）、抗原_抗體複合物介導之疾病、抗 腎絲球基底膜疾病、抗磷脂抗體症候群、過敏性神經炎、 I44539.doc -51 - 201032826 白塞氏病（Bechet's or Behcet's disease)、凱瑟曼氏症候群 (Castleman’s syndrome)、古巴士德氏症候群（Goodpasture's syndrome)、雷諾氏症候群、休格連氏症候群、史蒂芬-壤 森症候群（Stevens-Johnson syndrome)、類天疮瘡（諸如大皰 類天疮瘡及皮膚類天癌瘡）、天疮瘡（包括尋常天疱瘡、葉 型天癌瘡、天癌瘡黏膜類天疮療及紅斑性天癌瘡）、自體 免疫性多内分泌病變、萊特爾氏病或症候群（Reiter，s disease or syndrome)、免疫複合物性腎炎、抗體介導之腎 炎、視神經脊髓炎、多發性神經病變、慢性神經病變（諸 © 如IgM多發性神經病變或IgM介導之神經病變）；血小板減 少症（例如心肌梗塞患者所患之血小板減少症），包括血栓 性血小板減少性紫癜（TTP)、輸血後紫癜（PTP)、肝素誘發 之血小板減少症及自體免疫性或免疫介導之血小板減少症 (諸如特發性血小板減少性紫癜（ITP)(包括慢性或急性 ΙΤΡ))，睪丸及卵巢之自體免疫疾病（包括自體免疫性睪丸 炎及卵巢炎）、原發性甲狀腺功能低下、副曱狀腺功能低 〇 下、自體免疫性内分泌疾病（包括甲狀腺炎，諸如自體免 疫性曱狀腺炎、橋本氏病（Hashimoto's disease)、慢性甲狀 腺炎（橋本氏甲狀腺炎）或亞急性甲狀腺炎、自體免疫性甲 狀腺病、特發性甲狀腺功能低下、格雷氏病（Grave，s disease))、多腺症候群（諸如自體免疫性多腺症候群（或多 腺内分泌病症候群））、副腫瘤症候群（包括神經副腫瘤症候 群’諸如朗伯-伊頓肌無力症候群（Lambert-Eaton myasthenic syndr〇me)或伊頓朗伯症候群（Eat〇n Lambert 144539.doc •52· 201032826 syndrome)、僵體症候群）、腦脊趙炎（諸如過敏性腦脊聽炎 及實驗性過敏性腦脊髓炎（EAE))、重症肌無力（諸如胸腺 瘤相關之重症肌無力）、小腦退化、神經肌強直、眼陣攣 或眼陣攣肌陣攣症候群（OMS)及感覺神經病變、多灶運動 神經病、席漢氏症候群（Sheehan’s syndrome)、自體免疫性 肝炎、慢性肝炎、狼瘡樣肝炎、巨細胞性肝炎、慢性活動 性肝炎或自體免疫性慢性活動性肝炎、淋巴間質肺炎 (LIP)、閉塞性細支氣管炎（非移植）伴NSIP、格-巴二氏症 候群（Guillain-Barr0 syndrome)、柏格氏疾病（Berger's diSeaSe)(IgA腎病）、特發性IgA腎病、線性IgA皮膚病、原 發性膽汁性肝硬化、肺硬變、自體免疫性腸病症候群、乳 糜瀉、腹腔病、口炎性腹瀉（麵質腸病）、難治性口炎性腹 瀉、特發性口炎性腹瀉、冷球蛋白血症、澱粉樣沉著側索 硬化（ALS ’盧伽雷氏疾病（l〇u Gehrig's disease))、冠狀動 脈疾病、自體免疫性耳病（諸如自體免疫性内耳疾病 (D))自體免疫性聽力損失、眼陣攣肌陣攣症候群 (OMS) '多軟骨炎（諸如難治性或復發多軟骨炎）、肺泡蛋 白沉著症、澱粉樣變性、鞏膜炎、非癌性淋巴球增多、原 發性淋巴球增多（其包括單株B細胞淋巴球增多，例如良性 單株γ球蛋白病及未明確意義之單株丫球蛋白病_us))、 末梢神經病變、副廬;庭、戌彳 走@ 眉症候群、離子通道疾病（諸如癲痛 症、偏頭痛、心律不整、肌肉性病症、耳聲、 =療及CNS之離子通道疾病）、自閉症、發炎性肌病= 部郎段型腎絲球硬娜SGS)、时泌眼病、㈣膜視網^ 144539.doc •53· 201032826 炎、脈絡膜視網膜炎、自體免疫性肝病症、肌肉纖維疼 痛、多内分泌衰竭、施密特氏症候群（Schmidt's syndrome)、腎上腺炎、胃萎縮、早老性癡呆、脫髓鞘疾 病（諸如自體免疫性脫髓鞘疾病及慢性發炎性脫髓鞘多神 經病）、糖尿病性腎病、爵斯勒氏症候群（Dressler's syndrome)、斑形脫髮、CREST症候群（鈣質沉著、雷諾氏 現象、食道蠕動異常、肢端皮膚硬化及毛細血管擴張）、 男性及女性自體免疫性不孕症、混合性結締組織病、恰加 斯氏病（Chagas’ disease)、風濕熱、復發性流產、農夫肺、 多形性紅斑、心臟切開後症候群、庫欣氏症候群 (CushingS syndrome)、愛鳥者肺、過敏性肉芽腫性血管 炎、良性淋巴球性血管炎、阿爾波特氏症候群（Alp〇rt's syndrome)、肺泡炎（諸如過敏性肺泡炎及纖維性肺泡炎）、 間質肺病、輸jk反應、麻風、瘧疾、利什曼病 (leishmaniasis)、錐蟲病、血吸蟲病、蛔蟲病、麯黴病、 阿司匹林哮喘三聯症候群（Sampter’s syndrome)、卡普蘭氏 症候群（Caplan's syndrome)、登革熱、心内膜炎、心内膜 心肌纖維化、擴散性間質性肺纖維化、間質性肺纖維化、 肺纖維化、特發性肺纖維化、囊性纖維化、内眼炎、持久 隆起性紅斑（erythema elevatum et diutinum)、胎兒紅血球 母細胞增多、嗜伊紅血球筋膜炎、舒爾曼氏症候群 (Shulman’s syndrome)、費爾提氏症候群（Felty，s syndrome)、絲蟲病、睫狀體炎（諸如慢性睫狀體炎、異時 睫狀體炎、虹膜睫狀體炎（急性或慢性）或富氏睫狀體炎 I44539.doc •54- 201032826 (Fuch’s cyclitis))、亨-舍二氏紫癜（Hen〇ch_Sch〇nlein purpura)、人類免疫缺乏病毒（HIV)感染、埃可病毒感染 (echovirus infection)、心肌病、阿茲海默氏病（Aizheimer,s disease)、細小病毒感染、風疹病毒感染、接種疫苗後症 候群、先天性風疹感染、埃-巴二氏病毒感染（Epstein_Barr virus infection)、腮腺炎、埃文斯氏症候群（Evan，s syndrome)、自體免疫性生殖腺衰竭、西登哈姆氏舞蹈病 (Sydenham's chorea)、鏈球菌感染後腎炎、閉塞性血栓血 管炎、甲狀腺中毋症、脊趙療、脈絡膜炎、巨細胞多肌 痛、内分泌眼病、慢性過敏性肺炎、乾燥性角膜結膜炎、 流行性角膜結膜炎、特發性腎臟症候群、微小病變性腎 病、良性家族性及缺血性再灌注損傷、視網膜自體免疫、 關節發炎、支氣管炎、慢性障礙性氣管疾病、矽粉沉著 病、口瘡、口瘡性口炎、動脈硬化症、不形成精子症、自 體免疫性溶血、伯克氏病（B〇eck，s disease)、冷球蛋白企 症、杜氏攣縮（Dupuytren’s contracture)、晶狀體過敏性眼 内炎、過敏性腸炎、麻風結節性紅斑、特發性面神經麻 痹、慢性疲勞症候群、風濕熱、哈麗二氏病（Hamman_ Rich's disease)、感覺神經性聽力損失、陣發性灰紅素尿、 性腺功能減退、局部回腸炎、白細胞減少症、感染性單核 白金球增多症、橫斷性脊髓炎、原發性特發性黏液水腫、 腎病、交感性眼炎、肉芽腫性睪丸炎、胰腺炎、急性多神 經根炎、壞疽性膿皮病、奎汶氏甲狀腺炎（Quervain，s thyreoiditis)、後天性脾萎縮、抗精蟲抗體所引起之不孕 144539.doc -55- 201032826 症、非惡性胸腺瘤、白斑症、SCID及埃-巴二氏病毒相關 之疾病、後天性免疫不全症候群（aids)、寄生蟲性疾病 (諸如利什曼蟲（Lesihmania))、中毒性休克症候群、食物中 毒、涉及T細胞浸潤之病狀、白血球黏附缺乏症、與由細 胞激素及T-淋巴細胞所介導之急性及遲發過敏性相關之免 疫反應、涉及白血球滲出之疾病、多器官損傷症候群、抗 原-抗體複合物介導之疾病、抗腎絲球基底膜疾病、過敏 性神經炎、自體免疫性多内分泌病變、卵巢炎、原發性黏 液水腫、自體免疫性萎縮性胃炎、交感性眼炎、風濕性疾 病、混合性結締組織病、腎病症候群、胰島炎、多内分泌 衰竭、末梢神經病變、自體免疫性多腺症候群I型、成人 發作特發性副甲狀腺低能症（AOIH)、全頭禿、擴張心肌 病、後天性大皰性表皮鬆解（EBA)、血色沉著病、心肌 炎、腎病症候群、原發性硬化性膽管炎、化膿性或非化膿 性竇炎、急性或慢性竇炎、篩骨、額骨、上頜骨或蝶骨竇 炎 s伊紅細胞相關之病症（諸如嗜伊紅血球過多症、肺 部浸潤嗜伊紅血球過多症、嗜伊紅血球過多症_肌痛症候 群、呂弗勒氏症候群（Loffler's syndrome)、慢性嗜伊紅血 球性肺炎、熱帶性肺部嗜伊紅血球過多症、支氣管肺炎麯 黴病、麯黴腫或含有嗜伊紅細胞之肉芽腫）、全身性過敏 反應、it清陰性脊椎關節炎、多内分泌自體免疫疾病、硬 化性膽管炎、鞏膜、外鞏膜、慢性皮膚黏膜念珠菌病、布 魯頓氏症候群（Bruton's syndrome)、嬰兒期短暫性低γ球蛋 白血症、維·奥二氏症候群（Wisk〇tt-Aldrich syndrome)、共 144539.doc -56· 201032826 濟失調毛細血管擴張、與膠職疾病相關之自體免疫性病 症、風濕病、神經病、淋巴腺炎、缺血性再灌注病症、血 壓反應減少、血管功能障礙、血管擴張、組織損傷、心血 管局部缺血、痛覺過敏、大腦局部缺血及伴隨血管生成之 疾病、過敏性過敏症、絲球體腎炎、再灌注損傷、心肌或 其他組織之再灌注損傷、具有急性發炎性組份之皮膚病、 急性化膿性腦膜炎或其他中栖神經系統發炎病症、眼及眼 ❹ 眶發炎病症、粒細胞輸注相關症候群、細胞激素誘發之毒 性、急性嚴重炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肺硬變、 糖尿病性視網膜病、糖尿病性大動脈病症、動脈内增生、 消化性潰瘍、瓣炎及子宮内膜異位。 在特定實施例中，包含人類化2H7抗體及其功能片段之 醫藥組合物用於治療類風濕性關節炎及幼年型類風濕性關 節炎、全身性紅斑狼瘡（SLE)(包括狼瘡腎炎）、華格納氏疾 病、發炎性腸道疾病、潰瘍性結腸炎、特發性血小板減少 • 性紫癜（ITP)、血栓性血小板減少性紫癜（TTP)、自體免疫 性血小板減少症、多發性硬化（包括復發緩解型MS)、牛皮 癖、IgA腎病、IgM多神經病變、重症肌無力、ANCA相關 之血管炎、糖尿病、雷諾氏症候群、休格連氏症候群、視 神經脊髓炎（NMO)及絲球體腎炎。 「處理」#「減輕」係指治療性處理，其中此目標係減 慢（減缓）（若非治癒）目標病理性病狀或病症或防止病狀復 發。若根據本發明之方法在接受治療量之本發明之人類化 CD20結合抗體後，個體顯示特定疾病之一或多個徵兆及 144539.doc •57- 201032826 症狀之可觀察及/或可測量之減少或不存在特定疾病之一 或多個徵兆及症狀，則成功地「治療」個體之自體免疫疾 病或CD20陽性B細胞惡性腫瘤。舉例而言，對於癌症而 言，癌細胞數目之顯著減少或不存在癌細胞；腫瘤尺寸之 減小；腫瘤轉移之抑制（亦即在某種程度上減緩且較佳終 止）；在某種程度上抑制腫瘤生長；延長緩解時間、減緩 疾病進程及/或在某種程度上緩解一或多個與特定癌症相 關之症狀；降低發病率及死亡率及改善生活品質問題。亦 可由患者感受到疾病之徵兆或症狀之減少。治療可達成完 φ 全反應（定義為癌症之所有徵兆消失）或部分反應，其中遽 瘤尺寸減小較佳50%以上，更佳75%。若患者病情穩定， 則该患者亦視為被治療。在一個標準中，本發明之抗 體達成>95°/。末梢血液b細胞消耗且B細胞恢復至25%之基 線。在較佳實施例中，本發明之抗體可有效治療以使得癌 症患者在治療後4個月癌症不發展、較佳在治療後6個月、 更k 年甚至更佳2年或2年以上癌症不發展。評估成功 治療及疾病改善之此等參數易由熟習此項技術之醫師依據 © 所熟知之常規程序測量。 癌細胞數目； 減小腫瘤尺寸；抑

腫瘤生長； 冶療有效量」係指有效「治療」個體疾病或病症之抗 體或藥物之量。在癌症情況下，治療有效量之藥物可減少 、 尺寸；抑制（亦即在某種程度上減 止）癌細胞於周邊器官中浸潤；抑制（亦即在某 慢且較佳終止）腫瘤轉移；在某種程度上抑制 且/或在某種程度上減輕一或多個與癌症相關 144539.doc -58- 201032826 之症狀。參見前述「治療」之定義。在自趙免疫疾病情況 下，治療有效量之抗體或其他藥物可有效減少疾病之徵兆 及症狀。 評估治療腫瘤之功效或成功之參數已為熟習適當疾病之 ' 醫師所知。通常，熟習醫師可檢查特定疾病之徵兆及症狀 • 之減少。參數可包括疾病進展中值時間、缓解時間、穩定 疾病。 以下參考文獻描述淋巴瘤及CLL、其診斷、治療及測量 治療功效之標準醫學程序。Canellos GP，Lister, TA，Sklar JL: The Lymphomas. W.B.Saunders Company, Philadelphia, 1998 ; van Besien K 及 Cabanillas， F: Clinical

Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma,第 70章，第 1293-1338 頁，Hematology，Basic Principles and Practice,第 3 版 Hoffman 等人（編者）. Churchill Livingstone, Philadelphia，2000 ;及 Rai，K 及 參 Patel, D:Chron.ic Lymphocytic Leukemia,第 72章，第 1350-\362 展，Hematology，’ Basic Principles and Practice,第 3 版 Hoffman 等人（編者）· Churchill Livingstone，Philadelphia, . 2000 *> 評估治療自體免疫疾病或自體免疫相關疾病之功效或成 功的參數已為熟習適當疾病之醫師所知。通常，熟習醫師 可檢查特定疾病之徵兆及症狀之減少。以下舉例說明。 在一實施例中，包含人類化2H7抗體之醫藥組合物用於 治療類風濕性關節炎。 144539.doc -59- 201032826 RA為影響兩百萬以上美國人且防礙患者曰常活動的虛 衰性自體免疫疾病。當身體自身免疫系統不適當地侵襲關 節組織且引起可摧毀健康組織之慢性炎症及關節内損傷 時，出現RA。症狀包括關節發炎、腫脹、僵硬及疼痛。 另外，因為RA為全身性疾病，所以其會影響諸如肺、眼 及月趙之其他組織。已知尚無治癒。治療包括各種類固醇 及非類固醇消炎藥物、免疫抑制劑、疾病緩解抗風濕病藥 物（DMARD)及生物製劑。然而，許多患者對治療之反應仍 不足。 抗體可用作早期RA患者（亦即未經甲胺嗓吟（Μτχ)治療） 之弟線療法且可用作單一療法’或聯合或後於例如MTX 或環磷醯胺使用。或者，抗體可作為第二線療法用於治療 DMARD及/或MTX難治性患者，且可作為單一療法或聯合 例如MTX使用。人類化CD20結合抗體適用於預防及控制 關節損傷、阻滞結構性損傷、減少與RA發炎相關之疼 痛’且一般可減少中度至重度RA之徵兆及症狀。人類化 CD20抗體可先於、後於或與用於治療ra之其他藥物一起 治療RA患者（參見以下組合療法）。在一實施例中，以本發 明之人類化CD20結合抗體治療先前經疾病緩解性抗風滿 病藥物治療無效且/或對單獨曱胺喋呤之反應不足的患 者。在此治療之一實施例中，患者在17天治療方案中接受 单獨人類化CD20結合抗體（第1天及第15天1 g靜脈内輸 注）；CD20結合抗體外加環雄醯胺（第3天及第17天75〇 靜脈内輸注）；或CD20結合抗體外加甲胺嗓+。 144539.doc -60- 201032826 因為在RA期間身體產生腫瘤壞死因子a(TNFa)，所以 TNFa抑制劑已用於治療彼疾病。然而，諸如依那西普 (Etanercept)(ENBREL®)、英利昔單抗（Infliximab) (REMICADE®)及阿達木單抗（Adalimumab)(HUMIRATM)之 TNFa抑制劑會產生消極副作用，諸如感染、心臟衰竭及 脫髓鞘。因此，在一實施例中，人類化CD20結合抗體或 其生物學功能片段可作為例如第一線療法用於治療RA患 者以減少使用TNFa抑制藥物所經歷之此等消極副作用之 風險或治療視為易中毒（例如心臟中毒）的患者。人類化 CD20結合抗體或其生物學功能片段亦適用於治療罹患RA 之個體的方法中，該等個體已以TNFa抑制劑治療但無反 應，對TNFa抑制劑之反應不足（TNF_IR患者）或反應一段時 間之後疾病復發，或判定為對TNFa抑制劑治療不能發生 反應。在一實施例中，在TNFa抑制劑治療之前，以諸如 100 mg以下之低劑量治療TNF-IR。 一種評估RA治療功效之方法係基於美國風濕病學會 (ACR)標準，其係測量疼痛及腫脹關節之改善百分率。與 無抗體治療（例如治療前之基線）或安慰劑治療相比，RA患 者可以例如ACR 20(20%改善）計分。評估抗體治療功效之 其他方法包括用於評價結構性損傷（諸如骨腐蝕及關節間 隙窄化）之X射線計分，諸如沙普X射線計分（Sharp X-ray score)。亦可在治療期間或之後基於健康評估問卷[HAQ] 計分、AIMS計分、SF-36評估患者之失能之預防或改善。 ACR 20標準可包括疼痛關節計數及腫脹關節計數之20%改 144539.doc -61 - 201032826 善外加5種其他度量中至少3者之20%改善。 1. 患者藉由視覺類比量表（VAS)進行之疼痛評估， 2. 患者對疾病活動度之整體評估（VAS)， 3. 醫師對疾病活動度之整體評估（VAS)， 4. 患者自我評估失能，藉由健康評定問卷測量，及 5. 急性期反應CRP或ESR。 ACR 50及ACR 70的定義類似。較佳向患者投與有效達 成至少ACR 20、較佳至少ACR 30、更佳至少ACR50、甚 至更佳至少ACR70、最佳至少ACR 75及高於ACR 75之量 的本發明之CD20結合抗體。 牛皮癬關節炎具有獨特且不同之射線照相特徵。對於牛 皮癖關節炎而言，亦可藉由沙普計分評估關節腐姓及關節 間隙窄化。本發明之人類化CD20結合抗體可用於預防關 節損傷以及減少病症之疾病徵兆及症狀。 本發明之另一態樣為藉由向罹患病症之個體投與包含治 療有效量之本發明之人類化CD20結合抗體的醫藥組合物 來治療SLE或狼瘡腎炎的方法。SLEDAI計分提供疾病活動 度之數值定量。SLEDAI為已知與疾病活動度相關之24種 臨床及實驗室參數的加權指數，其數值範圍為0-103。參 見 Current Opinion in Rheumatology 2002, 14:515-521 中之 Bryan Gescuk & John Davis, 「Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus」。其他計分方法包括 BILAG 計分。咸信雙股DNA之抗體可引起腎臟復發及其他狼瘡表 現。可監測經受抗體治療之患者之腎臟復發時間，其定義 144539.doc -62- 201032826 為尿中之企清肌酸針、尿奎白或血液的顯著可再現增加。 或者或另外’可監測患者之抗核抗體及雙股DNA之抗體之 含量。SLE治療包括高劑量皮質類固醇及/或環罐醯胺 (HDCC)。在本文中，狼瘡之成功治療可減少復發，亦即 降低嚴重程度及/或縮短下一次復發之時間。 脊椎關節病為一組關節病症，包括強直性脊椎炎、牛皮 癖關節炎及克羅恩氏病。藉由有效之患者及醫師整體評估 測量工具測定治療成功。 關於血管炎，約75%之全身性血管炎患者具有抗嗜中性 白血球細胞質抗體且於影響小/中血管之三種病狀之一中 群集：華格納氏肉芽腫病（WG)、微觀多血管炎（MPA)及 奇-斯二氏症候群（CSS)，統稱為ANCA相關血管炎（AAV)。 牛皮癖之治療功效係藉由監測疾病臨床徵兆及症狀之變 化（與基線狀況相比）來評估，該等變化包括醫師整體評估 (PGA)變化及牛皮癖面積及嚴重度指數（pASI)計分、牛皮 φ 癖症狀評估（PSA)。可在治療過程中根據用於說明在特定 時間點下經歷之發癢程度的視覺類比量表來定期測量以本 發明之人類化CD20結合抗體（諸如hu2H7 v511)治療之牛皮 癖患者。 患者可能在其首次輸注治療性抗體時經歷輸注反應或輸 庄相關之症狀。此等症狀在嚴重程度方面不同且通常可隨 著醫療介入而逆轉。此等症狀包括（但不限於）流感樣發 燒、寒戰/僵直、噁心、蓴麻疹、頭痛、支氣管痙攣、血 管性水腫。本發明之疾病治療方法可理想地將輸注反應減 144539.doc -63 - 201032826 至最低程度。為了減輕或最小化該等不利事件，患者初始 可接受調節或耐受劑量之抗體、繼之治療有效劑量之抗 體。調節劑量低於治療有效劑量以使患者適應以耐受更高 劑量。 給藥 視欲治療之適應症及熟習此領域之醫師所熟悉的給藥有 關因素而定，本發明之抗體可以有效治療彼適應症同時使 毒性及副作用減至最低程度的劑量來投與。所需劑量可視 疾病及疾病嚴重程度、疾病階段、所需B細胞調節量及熟 習此項技術之醫師所熟知之其他因素而定。 治療自體免疫疾病時’視個別患者之疾病及/或病狀嚴 重程度而定’可能需要藉由調節人類化2H7抗體之劑量來 調節B細胞消耗程度。B細胞消耗可（但不必定）為完全的。 或者，可能在初始治療中需要全部B細胞消耗，但在後續 治療中，可調節劑量以達成僅部分消耗。在一實施例中， B細胞消耗為至少20%，亦即與治療前之基線含量相比， 剩餘CD20陽性B細胞為80%或小於8〇%ο在其他實施例 中，Β 細胞消耗為 25%、30%、40%、50〇/〇、60%、7〇〇/0 或 70%以上。Β細胞消耗較佳足以中止疾病進程，更佳足以 減輕所治療之特定疾病之徵兆及症狀，甚至更佳足以治癒 疾病。 可以不同給藥頻率（例如每週、每兩週、每月等）投與本 發明之抗體。在一實例中，給藥頻率為每6個月一齊!，或 每6個月兩劑(間隔兩週)。抗體溶液之注射體積範圍可為每 144539.doc • 64 - 201032826 次注射約0.1至約3 ml，更佳每次注射約0.5 ml至約1.5 ml。一次注射中投與之人類化2H7抗體之總量可為每次注 射至多約150 mg。可使用多次注射達成所需劑量。 可使用本發明之任何給藥方案治療對一或多種當前療法 無效、耐受不良或禁忌之自體免疫疾病或B細胞惡性腫瘤 患者。舉例而言，本發明涵蓋用於RA患者之本發明治療 方法，該等RA患者對腫瘤壞死因子（TNF)抑制劑療法或對 疾病缓解性抗風濕病藥物（DMARD)療法之反應不足。 「長期」投與係指與短期模式相反，以持續模式投與藥 劑，以便使最初治療效果（活性）長期維持。「間斷」投與並 非為連續進行的治療（不中斷），而是在本質上循環進行的 治療。 組合療法 治療上述B細胞腫瘤時，可使用本發明之人類化2H7抗 體配合一或多種治療劑（諸如化學治療劑）、依多藥物方案 治療患者。人類化2H7抗體可與化學治療劑同時、依序或 交替投與或在對其他療法無反應之後投與。淋巴瘤治療之 標準化學療法可包括環填醯胺、阿糖胞苷（cytarabine)、美 法侖（melphalan)及米托蒽酿（mitoxantrone)外加美法余。 CHOP為治療非霍奇金氏淋巴瘤之最常見化學治療方案之 一。以下為用於CHOP方案中之藥物：環磷醯胺（商標名稱 cytoxan，neosar);阿德力黴素（adriamycin)(小紅莓 (doxorubicin)/ 經基小紅莓）；長春新驗（vincristine) (Oncovin);及潑尼龍（prednisolone)(有時稱為 Deltasone 或 144539.doc -65- 201032826

Orasone)。在特定實施例中，將CD20結合抗體與一或多種 以下化學治療劑組合投與有需要之患者：小紅莓、環磷醯 胺、長春新鹼及潑尼龍。在一特定實施例中，以本發明之 人類化2H7抗體配合CHOP(環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼 及潑尼松）療法來治療罹患淋巴瘤（諸如非霍奇金氏淋巴瘤） 之患者。在另一實施例中，可以本發明之人類化2H7 CD20結合抗體聯合CVP(環磷醯胺、長春新鹼及潑尼松）化 學療法來治療癌症患者。在一特定實施例中，將人類化 2H7.v5 11或v 11 4配合CVP投與罹患CD20陽性NHL之患者， 例如每3週一輪共8輪。在治療CLL之一特定實施例中，配 合氟達拉濱及環磷醯胺之一或兩者之化學療法投與 hu2H7.v511 抗體。 「化學治療劑」為適用於治療癌症之化合物。化學治療 劑之實例包括烧基化劑，諸如塞替派（thiotepa)及 CYTOXAN®環磷醯胺·，烷基磺酸鹽，諸如白消安 (busulfan)、英丙舒凡（improsulfan)及°辰泊舒凡 (piposulfan);氮丙咬，諸如苯。圭多巴（benzodopa)、卡波酉昆 (carboquone)、米特多巴（meturedopa)及尤利多巴 (uredopa);乙稀亞胺及甲基密胺，包括六曱密胺 (altretamine)、三伸乙基密胺（triethylenemelamine)、三伸 乙基磷醢胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三甲密胺 (trimethylolomelamine) ; TLK 286(TELCYTATM);多聚乙 醢（acetogenin)(尤其布拉他辛（bullatacin)及布拉他辛 酮（bullatacinone)) ; δ-9-四氫大麻盼（delta-9- 144539.doc •66· 201032826 tetrahydrocannabinol)(屈大麻齡（dronabinol)，MARINOL®); β-拉帕酮（beta-lapachone);拉帕醇（lapachol);秋水仙驗 (colchicine);樺木酸（betulinic acid)；喜樹驗 (camptothecin)(包括合成類似物拓朴替康（topotecan) (HYCAMTIN®) 、 CPT-11(伊立替康（kinotecan)， CAMPTOSAR®)、乙醯基喜樹驗（acetylcamptothecin)、斯 考普萊叮（scopolectin)及9-胺基喜樹驗）；苔蘚抑素 (bryostatin);卡利斯塔叮（callystatin); CC-1065(包括其阿 多來新（adozelesin)、卡折來新（carzelesin)及比折來新 (bizelesin)合成類似物）；足葉草毒素（podophyllotoxin); 足葉草酸（podophyllinic acid);替尼泊苦（teniposide);念 珠藻環肽（尤其念珠藻環肽1及念珠藻環肽8);海兔毒素 (dolastatin);多卡米辛（duocarmycin)(包括合成類似物KW-2189 及 CB1-TM1);艾榴素（eleutherobin);盤克斯塔叮 (pancratistatin);沙考的汀（sarcodictyin);海綿抑素；氮 芥（nitrogen mustard)，諸如苯丁 酸氮芬（chlorambucil)、萘 氮芬（chlornaphazine)、環填醯胺、雌莫司；丁 (estramustine)、異環雄醢胺（ifosfamide)、二氣甲基二乙胺 (mechlorethamine)、鹽酸二氣甲基二乙胺氧化物 (mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖、新氮芬 (novembichin)、膽固醇苯乙酸氮芥（phenesterine)、潑尼莫 司汀（prednimustine)、曲洛填胺（trofosfamide)、烏拉莫司 汀（uracil mustard); 亞硝基腺，諸如卡莫司汀 (carmustine)、氣腺黴素（chlorozotocin)、福莫司、;j 144539.doc •67· 201032826 (fotemustine)、洛莫司汀（lomustine)、尼莫司汀（nimustine) 及拉甯司灯（ranimnustine);雙膦酸鹽，諸如氣屈膦酸鹽 (clodronate);抗生素，諸如晞二炔抗生素（例如刺孢黴素 (calicheamicin)，尤其刺抱黴素γΐΐ及刺抱黴素ωΙ1(參見例 如 Agnew, C/zem /«i/_ jEc/. Ewg/., 33: 183-186 (1994))及蒽環 黴素（anthracycline)(諸如脂質體蒽環黴素（annamycin))、 AD 32、阿克拉黴素（alcarubicin)、道諾黴素 (daunorubicin)、右雷佐生（dexrazoxane)、DX-52-1、表柔 比星（epirubicin)、GPX-100、伊達比星（idarubicin)、 KRN5500、美諾立爾（menogaril)、達米辛（dynemicin)(包括 達米辛A)、艾斯帕米辛（esperamicin)、新制癌菌素發色團 及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團、阿克拉希黴素 (aclacinomysin)、放線菌素（actinomycin)、奥拉徽素 (authramycin)、重氮絲胺酸、博來黴素（bleomycin)、放線 菌素C(cactinomycin)、卡拉比辛（carabicin)、洋紅徽素 (carminomycin)、嗜癌菌素（carzinophilin)、色徽素 (chromomycinis)、放線菌素 D(dactinomycin)、地托比星 (detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、 ADRIAMYCIN®小紅莓（包括（N-嗎啉基）-小紅莓、氰基（N-嗎啉基）-小紅莓、2-吡咯啉基-小紅莓、脂質體小紅莓及去 氧小紅莓（deoxydoxorubicin))、依索比星（esorubicin)、麻 西羅黴素（marcellomycin)、絲裂黴素（mitomycin)(諸如絲 裂黴素C)、徽盼酸（mycophenolic acid)、諾拉黴素 (nogalamycin)、橄稅黴素（olivomycin)、培洛黴素 144539.doc -68- 201032826 (peplomycin)、潑非黴素（potHromycin)、嗓吟黴素 (puromycin)、奎那黴素（quelamycin)、羅多比星 (rodorubicin)、鏈黑黴素（streptonigrin)、鏈佐星 (streptozocin)、殺結核菌素（tubercidin)、烏苯美司 (ubenimex)、淨司他丁（zinostatin)及左柔比星（zorubicin); 葉酸類似物，諸如迪諾特寧（denopterin)、嗓羅吟 (pteropterin)及三甲曲沙（trimetrexate);嗓呤類似物，諸如 氟達拉濱、6-酿基嘌吟、°塞味嘌吟（thiamiprine)及硫鳥嘌 呤；嘴唆類似物，諸如安西他濱（ancitabine)、阿紮胞苦 (azacitidine)、6-氮雜尿普（6-azauridine)、卡莫氟 (carmofur)、阿糖胞苦、雙去氧尿普、去氧氟尿普、依諾 他濱（enocitabine)及氟尿去氧核普（floxuridine);雄激素， 諸如卡普睪酮（calusterone)、屈他雄酮丙酸鹽 (dromostanolone propionate)、環硫雄醇（epitiostanol)、美 雄炫（mepitiostane)及睪内醋（testolactone);抗腎上腺，諸 如胺魯米特（aminoglutethimide)、米托坦（mitotane)及曲洛 司坦（trilostane);葉酸補充劑，諸如路葉酸（folinic acid) (甲醯四氫葉酸（leucovorin));乙醯葡搭S旨（aceglatone);抗 葉酸抗贅生性藥劑，諸如ALIMTA®(LY231514培美曲唑 (pemetrexed))、二氫葉酸還原酶抑制劑（諸如甲胺嗓呤）、 抗代謝物（諸如5·氟尿嘧啶（5-FU)及其前藥，諸如UFT、S-1及卡培他濱（capecitabine))及胸普酸合成酶抑制劑及甘胺 醯胺核苷酸甲醯基轉移酶抑制劑，諸如雷替曲賽 (raltitrexed)(TOMUDEXRM，TDX);二氫嘧啶脫氫酶抑制 144539.doc -69- 201032826 劑，諸如伊利盧拉（eniluracil); 搭填酿胺酷苦 (aldophosphamide glycoside);胺基乙醯丙酸 (aminolevulinic acid);安 °丫淀（amsacrine);倍思塔布 (bestrabucil)；比生群（bisantrene);艾達曲克 (edatraxate)；得弗伐胺（defofamine);秋水仙胺 (demecolcine):地 11 丫酿（diaziquone);艾弗利散 (elfornithine);依利醋錄（elliptinium acetate);埃坡徽素 (epothilone);依託格.魯（etoglucid);硝酸鎵；經基脲；香 益多糖（lentinan);羅尼達寧（lonidainine);類美登素 (maytansinoi.d)，諸如美登素（maytansine)及胺沙托辛 (ansamitocin);米托胍月宗（mitoguazone);米托蒽酿 (mitoxantrone);莫比達摩（mopidanmol);確拉維林 (nitraerine);喷司他丁（pentostatin);凡那明（phenamet); 0比柔比星（pirarubicin);洛索蒽酿（losoxantrone) ; 2-乙酿 肼；丙卡巴肼（procarbazine) ; PSK®多聽錯合物（JHS Natural Products, Eugene, OR);雷佐生（razoxane);根瘤 菌素（rhizoxin); 西佐°南（sizofiran); 鍺螺胺 (spirogermanium);細交鏈孢菌 _ 酸（161111&2〇1^。acid);三 亞胺酿（triaziquone) ; 2,2',2"-三氣三乙胺；新月毒素 (trichothecene)(尤其 T-2毒素、黏液黴素A(verracurin A)、 桿抱菌素A(roridin A)及胺癸叮（anguidine));烏拉坦 (urethan); 長 春地辛（vindesine)(ELDISINE®， FILDESIN®);達卡巴嗪（dacarbazine);甘露莫司汀 (mannomustine);二漠甘露醇（mitobronitol);二演衛矛醇 144539.doc 70· 201032826 (mitolactol) ; n底泊溴炫（pipobroman)；甲托辛 (gacytosine);阿拉伯糖苷（arabinoside)(「Ara-C」）；環填 醯胺；塞替派；紫杉醇及紫杉烷，例如TAXOL®太平洋紫 杉醇（paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J.)、無十六醇聚氧乙烯醚且經白蛋白工程改造之太平洋 紫杉醇奈米顆粒調配物ABRAXANETM(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) 及 TAXOTERE® 多西他賽（doxetaxel)(Rh0ne-Poulenc Rorer, Antony, France);克羅南布（chloranbucil);吉西他濱 (gemcitabine)(GEMZAR®) ; 6-硫代鳥嗓吟；魏嗓吟；銘； 始類似物或以始為主之類似物，諸如順始（cisplatin)、奥 沙利銘（oxaliplatin)及卡始（carboplatin); 長春驗 (vinblastine)(VELBAN®);依託泊普（etoposide)(VP-16); 異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼（vincristine) (ONCOVIN®);長春花生物驗（vinca alkaloid);長春瑞賓 (vinorelbine)(NAVELBINE®);諾凡特龍（novantrone);依 達曲沙（edatrexate);道諾徽素（daunomycin);胺基嗓吟； 希羅達（xeloda);伊班膦酸鹽（ibandronate);拓撲異構酶抑 制劑RFS 2000 ;二氟甲基鳥胺酸（DMFO);類視黃素，諸 如視黃酸；上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生 物；以及上述兩者或兩者以上之組合，諸如CHOP(環礙醯 胺、小紅莓、長春新驗及潑尼龍之組合療法之縮寫）及 FOLFOX(奥沙利顧（ELOXATINtm)與5-FU及甲酿四氫葉酸 之組合治療方案之縮寫）。 144539.doc •71· 201032826 此定義中亦包括作用為調控或抑制激素對腫瘤之作用的 抗激素劑，諸如抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑 (SERM)， 包括例如他莫昔芬（tamoxifen)(包括 NOLVADEX®他莫昔芬）、雷洛昔芬（raloxifene)、曲洛昔芬 (droloxifene)、4-經基他莫昔芬、曲沃昔芬（trioxifene)、雷 洛昔芬鹽酸鹽（keoxifene)、LY117018、奥那司酮 (onapristone)及 FARESTON® 托瑞米芬（toremifene);抑制 芳香酶（其調控腎上腺中之雌激素產生）之芳香酶抑制劑， 諸如4(5)-咪唑、胺魯米特、MEGASE®乙酸曱地孕酮 (megestrol acetate)、AROMASIN®依西美坦（exemestane)、 弗米斯坦（formestanie)、法屈啥（fadrozole)、RIVISOR®伏 氣唾(vorozole) 、FEMARA® 來曲0坐（letrozole)及 ARIMIDEX®安美達錠（anastrozole);及抗雄激素，諸如氟 他胺（flutamide)、尼魯胺（nilutamide)、比卡魯胺 (bicalutamide)、亮丙立德（leuprolide)及戈舍瑞林 (goserelin);以及曲沙他濱（troxacitabine)(l，3-二氧戊環核 苷胞嘧啶類似物）；反義寡核苷酸，尤其抑制涉及異常細 胞增殖之信號傳導路徑中之基因（諸如PKC-(x、Raf、H-Ras 及表皮生長因子受體（EGF-R))表現的彼等反義寡核苷酸； 疫苗，諸如基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN®疫苗、 LEUVECTIN® 疫苗及 VAXID® 疫苗；PROLEUKIN® rlL-2 ; LURTOTECAN®拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX® rmRH ;及上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生 物。 144539.doc -72- 201032826 另外，hu2H7抗體及其功能片段可配合抗腫瘤血管生成 劑（諸如血管内皮生長因子（VEGF)拮抗劑）用於治療表現 CD2〇之B細胞腫瘤（例如NHL)°r抗血管生成劑」或「血管 生成抑制劑」係指直接或間接抑制血管生成、▲•管發生或 不當血管通透性之小分子量物質、聚核苷酸、多肽、經分 離之蛋白質、重組蛋白質、抗體或其結合物或融合蛋白。 舉例而言，抗血管生成劑如以上所定義為抗血管生成劑之 抗體或其他拮抗劑，例如VEGF之抗體、VEGF受體之抗 體、阻斷VEGF受體信號傳導之小分子（例如 PTK787/ZK2284，SU6668)。「VEGF拮抗劑」係指能夠中 和、阻斷、抑制、取消、減少或干擾VEGF活性（包括其與 一或多個VEGF受體之結合）的分子。在一實施例中，使用 2H7.v511 或 2H7.V114 配合 Avastin®(貝伐株單抗 (bevacizumab) ; Genentech)治療罹患該B細胞腫瘤之患 者。亦稱為「rhuMAb VEGF」或「Avastin®」之抗VEGF抗 體「貝伐株單抗（BV)」為根據Presta等人，Cancer…心 5 7:4593-4599 (1997)所產生之重組人類化抗VEGF單株抗 體。 hu2H7抗體及其功能片段可配合細胞激素之TNF家族之 成員（諸如Apo-2配位體（Apo2L)，亦稱為TRAIL)用於治療 表現CD20之B細胞腫瘤的方法中。全長原生序列人類Apo-2配位體為細胞激素之腫瘤壞死因子家族之281個胺基酸 長、II型跨膜蛋白質。已發現可溶性形式之Αρο-2配位體 (諸如包含細胞外域（ECD)或其一部分之彼等配位體）具有 144539.doc -73- 201032826 不同活性’包括哺乳動物癌細胞中之細胞凋亡活性。

Apo2L/TRAIL(描述於 WO 97/01633及 WO 97/25428 中）為可 溶性人類蛋白質，其為包含全長Apo-2L蛋白之胺基酸114_ 281的ECD片段。 治療上述自體免疫疾病或自體免疫相關病狀時，可使用 一或多種hu2H7抗體配合第二治療劑（諸如免疫抑制劑）治 療患者’諸如在多藥物方案中。hu2H7抗體可與免疫抑制 劑同時、依序或交替投與或在對其他療法無反應後投與。 免疫抑制劑之投與劑量可相同於或少於此項技術中所述之 投與劑量。較佳辅助免疫抑制劑視許多因素而定，包括所 治療之病症類型以及患者病史。 如本文中用於輔助療法之「免疫抑制劑」係指作用為抑 制或遮蔽患者之免疫系統的物質。該等藥劑包括抑制細胞 激素產生、下調或抑制自體抗原表現或遮蔽MHC抗原之物 質。該等藥劑之實例包括類固醇，諸如糖皮類固醇，例如 潑尼松、甲潑尼龍（methylprednisolone)及地塞米松 (dexamethasone);經2-胺基-6-芳基-5-取代之嘧咬（參見美 國專利第4,665,077號）、硫唑嘌呤（或環磷醯胺，若硫唑嘌 吟存在不良反應）；溴隱定（bromocryptine);戊二酸（如美 國專利第4，120,649號中所述，其遮蔽MHC抗原）；MHC抗 原及MHC片段之抗個體遺傳型抗體；環孢素A ;細胞激素 或細胞激素受體拮抗劑，包括抗干擾素_γ、抗干擾素_β或 抗干擾素-α抗體；抗腫瘤壞死因子—α抗體；抗腫瘤壞死因 子-β抗體；抗介白素-2抗體及抗IL-2受體抗體；抗L3T4抗 144539.doc -74· 201032826 體；異源抗淋巴細胞球蛋白；全T抗體，較佳抗CD3或抗 CD4/CD4a抗體；含有LFA-3結合域之可溶性肽（09年7月26 日公開之WO 90/08187);鏈激酶；TGF-β ;鏈球菌去氧核 糖核酸酶（streptodornase);來自宿主之RNA或DNA ; FK506 ; RS-61443 ;去氧斯伯格埃林（deoxyspergualin); 雷帕黴素（rapamycin) ; T細胞受體（美國專利第5，114,721 號）；T細胞受體片段（Offner 等人，251:430-432 (1991) ; WO 90/11294 ;及 WO 91/01133);及 T細胞受體抗 體（EP 340，109)，諸如 T10B9。 治療類風濕性關節炎時，可使用本發明之CD20結合抗 體配合以下藥物中之任一者或多者治療患者：DMARD(疾 病緩解性抗風濕病藥物）（例如曱胺喋呤）、NSAI或 NSAID(非類固醇消炎藥物）、免疫抑制劑（例如硫唑嘌呤； 徽紛酸嗎琳乙 S旨（mycophenolate mofetil)(CellCept® ; Roche))、止痛劑、糖皮類固醇、環磷醯胺、HUMIRA™ (阿達木單抗；Abbott Laboratories)、ARAVA®(來氟米特 (leflunomide))、REMICADE®(英利昔單抗；Centocor Inc.，（Malvern，Pa))、ENBREL®(依那西普；Immunex， WA)、ACTEMRA®(托西利單抗（tocilizumab) ; Roche, Switzerland)、COX-2抑制劑。常用於RA中之DMARD為經 基氯喧（hydroxycloroquine)、柳氮續胺 e比咬（sulfasalazine)、 甲胺喋呤、來氟米特、依那西普、英利昔單抗、硫唑嘌 呤、D-青徽胺、金（口服）、金（肌肉内）、二甲胺四環素 (minocycline)、環抱素、葡萄球菌蛋白A免疫吸附。 144539.doc -75- 201032826 阿達木單抗為可結合至TNFa之人類單株抗體。英利昔 單抗為可結合至TNFa之嵌合小鼠-人類單株抗體。其為治 療RA及克羅恩氏病之免疫抑制處方藥物。英利昔單抗與 致死反應（諸如心臟衰竭及感染（包括結核病）以及導致1^8 之脫髓鞘）有關。Actemra(托西利單抗）為人類化抗人類介 白素-6(IL-6)受體。 依那西普為「免疫黏附素」融合蛋白，其由人類75 kD(p75)腫瘤壞死因子受體（TNFR)之細胞外配位體結合部 分與人類IgGl之Fc部分連接所組成。依那西普（ENBREL®) 為在美國已批准用於治療活性RA之可注射藥物。依那西 普可結合至TNFa且用於自關節及血液中移除大部分 TNFa，由此防止TNFol引發炎症及類風濕性關節炎之其他 症狀。該藥物與消極副作用相關，該等副作用包括嚴重感 染及敗血症，神經系統病症，諸如多發性硬化（MS)。參見 例如www.remicade-infliximab.com/pages/enbrel一embrel.html。 關於RA之習知治療，參見例如「Guidelines for the management of rheumatoid arthritis 」 Arthritis & 及 Ziewmaibm 46(2): 328-346(2002年 2 月）〇 在一特定實施例 中，使用本發明之hu2H7 CD20抗體配合曱胺喋呤（MTX)抗 體治療RA患者。MTX之例示性劑量為約7.5-25毫克/公斤/ 週。MTX可經口及皮下投與。 在一實例中，患者同時亦接受MTX(口服（p.o.)或非經腸 10-25毫克/週）以及皮質類固酵療程，該皮質類固醇療程由 以下組成：30分鐘靜脈内輸注100 mg曱潑尼龍，隨後輸注 144539.doc -76- 201032826 CD20抗體，及第2-7天口服60 mg潑尼松，第8-14天口服30 mg，第16天恢復為基線劑量。患者亦可接受以單次劑量形 式或以每曰分次劑量形式給予之葉酸（5毫克/週）。患者在 整個治療期間視情況繼續接受任何本底皮質類固酵(10毫 克/天之潑尼松或等效物）。 治療強直性脊椎炎、牛皮癖關節炎及克羅恩氏病時，可 使用本發明之CD20結合抗體配合例如Remicade®(英利昔 單抗；來自 Centocor Inc.(Malvern，Pa·))、ENBREL(依那西 普；Immunex，WA)治療患者。 SLE之治療包括CD20抗體與高劑量皮質類固醇及/或環 磷醯胺（HDCC)之組合。可以本發明之2H7抗體與以下任意 者之組合治療罹患SLE、AAV及NMO之患者··皮質類固 醇、NSAID、止痛劑、COX-2抑制劑、糖皮類固醇、習知 DMARD(例如曱胺喋呤、柳氮磺吡啶、羥氣喹、來氟米 特）、生物DMARD(諸如抗Bly，例如貝利單抗 (belimumab))、抗IL6R(例如托西利單抗）；CTLA4-Ig(阿巴 西普（abatacept))、（抗CD22，例如依帕珠單抗）、免疫抑制 劑（例如硫唾嗓吟；黴盼酸嗎琳乙酯（CellCept® ; Roche)) 及細胞毒性劑（例如環磷醯胺）。 治療牛皮癖時，可將人類化2H7抗體配合表面治療劑投 與患者，表面治療劑諸如表面類固醇、蒽三酚 (anthralin)、鈣泊三醇（calcipotriene)、氣倍他索 (clobetasol)及他紮羅汀（tazarotene)，或配合曱胺喋呤、類 視黃素、環孢素、PUVA及UVB治療投與患者。在一實施 144539.doc -77- 201032826 例中，人類化2H7抗體與環孢素依序或同時治療牛皮癬患 者。 為了使毒性減至最低程度，可依循環、依序、組合或間 歇治療方案，或較低劑量組合方案（本發明之劑量下之 hu2H7 CD20結合抗體組合物）投與傳統全身性療法。 製品及套組 本發明之另一實施例為一種製品，其包含適用於治療自 體免疫疾病及相關病狀及CD20陽性癌症（諸如非霍奇金氏 淋巴瘤）之本發明調配物。製品包含容器及容器上或附於 谷器上之標籤或藥品說明書。適合容器包括例如瓶、小 瓶、注射器等。容器可自諸如玻璃或塑膠之各種物質形 成。調配物或組合物中之至少一種活性劑為本發明之 hu2H7抗體，容器（諸如注射器）中抗體的含量可傳遞上文 針對給藥所述之劑量。hu2H7之濃度在10 mg/ml至2〇〇 mg/ml之範圍内，可為30_150 mg/mU11〇〇_15〇 mg/ml。標 籤或藥品說明書說明組合物用於治療特定病狀。標籤或藥 品說明書另外包含向患者投與抗體組合物之說明書。 藥品說明書係指通常包括於治療性產品之商業包裝中之 說明書，其含有關於涉及該等治療性產品之使用的適應 症、用法、劑量、投與、禁忌症及/或警告之資訊。在— 實施例中，藥品說明書說明組合物用於治療非霍奇金氏淋 巴瘤。 另外，製品可進一步包含第二容器，其包含醫藥學上可 接受之緩衝液，諸如注射用水（WFI)、抑菌注射用水 144539.doc -78· 201032826 (BWFI)、磷酸鹽緩衝生理鹽水、林格爾氏溶液（Ringer,s solution)、氣化鈉（0.9%)及右旋糖溶液。其可另外包括自 商業及使用者觀點合乎需要的其他物質，包括其他緩衝 液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。 實驗性實例 實例1 rhuMab 2H7之初始皮下調配物 ❹ 開發rhuMAb 2H7之高濃度皮下調配物（15〇 mg/mL)。此 調配物包含150 mg/ml 2H7、30 mM乙酸鈉；7%海藻糖二 水合物；0.03%聚山梨醇酯20(ρΗ 5.3)β此調配物在推薦條 件下長期穩定地儲存於最終小瓶中。藉由皮下注射將此物 質投與獼猴引起注射部位之嚴重發炎及低生物可用性 (30/〇)在此等動物中觀察到皮下層中之輕度至中度巨嗟 細胞浸潤。發炎係因外來體物質（亦即2Η7測試物質）所 致在模擬該產物暴露於注射部位的條件下測試此調配物 ❹ 也月蛋白質在生理條件下顯著聚集（圖1)，證實獼猴中觀察 到之發炎結果。觀察到之沈澱符合ΡΗ轉變之後之鹽析效 應。 實例2 測試皮下注射之巨分子在生理條件下《聚集的活艘外透析 方法。 開發活體外透析方法以測試不同賦形劑減少2Η7在皮下 注射期間、在所遇到之生理條件下聚集的能力。針對此模 型開發經修飾之PBS溶液（「釋放介質」）以模擬間質液。 144539.doc -79- 201032826 此活體外系統用於評估糖、聚合物、界面活性劑及胺基酸 阻滯2H7聚集之影響。顯示產物活體外釋放改良的候選調 配物隨後在活體内測試（大鼠皮下模型；參見實例3)以判定 此改良是否與活體内發炎減少對應。 活體外透析模型之結構顯示於圖2中。在37°C下，以220 ml釋放介質（167 mM鈉、140 mM氣化物、17 mM磷酸鹽、 4 mM鉀）填充250 ml玻璃瓶。將6 cm長之透析管（12 mm直 徑之Spectra Por 1百萬截留分子量（MWCO)PVDF透析管）浸 沒於純水中。透析管之一端夾緊，且以約1 ml之試樣（2H7 及測試賦形劑）填充管。移除過量空氣，且管之另一端夾 緊於瓶之封口中。將經填充之袋添加至250 mL含有釋放介 質之玻璃瓶中，且將瓶置於37°C下恆定攪拌。在2.5、6、 12、24、33及48小時後移除500 μΐ釋放介質樣品。藉由UV 光度掃描測量樣品之混濁度及釋放介質中之蛋白質含量。 另外，目檢釋放介質及透析管内之溶液之沈澱。 若符合以下條件，則測試賦形劑在活體外聚集研究中視 為可接受的： • 2Η7及測試賦形劑之累積釋放大於陰性對照（初始 2Η7調配物-150 mg/ml 2Η7、30 mM乙酸鈉；7%海 藻糖二水合物；0.03%聚山梨醇酯20(pH 5.3))，說 明2H7特徵改良。 •陽性對照（rhuMAb抗 CDlla，亦稱為 RaptivaTM，一 種皮下投與之人類化抗CD 11 a抗體）顯示無沈澱且釋 放大於陰性對照。 144539.doc -80- 201032826 • 2H7之沈澱減少或消除。 •釋放介質之混濁度降低。 活體内大鼠模型中測試 内發炎減少相關。 符合可接受標準之候選物隨後在 以判定活體外阻滯聚集是否與活體 活體外結果： 活體外透析方法中之研究對照之典型釋 3中。針對此模型選擇對照可將不易聚、、’不；

取茱之蛋白質（rhuMAb CD 11 a)之釋放與在生理條件下通常 幂聚集之蛋白質（初始 2H7)之釋放相提並論。兩個釋放曲線 琛之間之面積可度量測 試賦形劑阻滯聚集之相對能力（相對於對照）。 初始2H7調配物之累積釋放較低（<3〇%)。當2H7自透析 袋釋入釋放介質中時，觀察到釋放介質之混濁胃度增加，說 明該物質在彼環境中聚集。在24小時内觀察到透析袋内廣 泛絮凝，且2H7濃度相應地自研究開始時之15〇瓜^^^顯 著降低至48小時研究結束時之4至5 mg/mL。所有此等觀察 結果說明2H7在生理條件下易聚集。當在37°c下將2H7初 始調配物儲存於玻璃小瓶中時，未發現此行為。 相比之下，rhuMAb CD 11a自透析袋快速釋入釋放介質 中。釋放介質在整個研究中保持澄清且在透析袋内未觀察 到絮凝，說明rhuMAb CDlla在生理條件下不聚集且可相 應地作為此模型之對照。表3概述所釋放之蛋白質百分 率、釋放介質混濁度及絮凝之存在。 144539.doc -81 - 201032826 表3 對照 時間(小時） 所釋放之累積蛋 白質％ 釋放介質之 混濁度 OD 350 nm 透析袋内 之絮凝 rhuMAb CDlla 0 0 0.001 否 48 83 0.03 否 2H7初始 0 0 0.02 否 48 28 0.37 是 實例3 測試巨分子聚集之活體内大鼠皮下模型 大鼠皮下模型為基於皮下發炎特徵具有相似性的相關模 型。接受初始2H7調配物之大鼠之發炎反應與在獼猴中觀 察到之發炎反應一致（參見實例1)。在用2H7注射之大鼠皮 膚之切片中’人類免疫球蛋白之免疫組織化學染色呈陽 性’說明抗體存在或保持於發炎區域中，論證了測試物品 之沈搬引起注射部位發炎。 如下執行活體内大鼠篩檢檢定： 皮下投與各測試或對照調配物（〇 25 ml)。給藥後72小時 對動物進行屍體剖檢。將注射部位處之皮膚切片橫切且固 疋於福馬林（formalln)中，且藉由組織學測定測試賦形劑 對降低發炎之影響。如下對組織學切片賦予發炎計分·· +/-:最少/輕微發炎 1 :輕度發炎 2 :中度 3 :重度 藉由病理學測定肉 片 〇穿腫之存在。將注射部位之組織切 在光學顯微鏡下檢視肉諸之存在或不存在。 144539.doc 201032826 活體内大鼠模型之接受標準為：（1)發炎與rhuMAb CD1 la(陰性對照）類似，及（2)注射部位處不存在肉芽腫。 實例4 界面活性劑及其他添加劑減少2H7聚集之能力 界面活性劑通常用於阻滯巨分子聚集。使用實例2中所 • 述之活體外模型評估界面活性劑減少2H7聚集及絮凝之能 力。所測試之界面活性劑涵蓋一系列親水-親脂平衡值 (HLB)。相對於初始2H7調配物，添加聚山梨醇酯20、泊 洛沙姆及斯潘（Span)20及80界面活性劑並未顯著改良2H7 釋放。對於聚山梨醇酯80，觀察到活體外2H7釋放之適度 改良，但對於所測試之任何其他界面活性劑，未觀察到 2H7釋放之顯著改良（參見表4)。然而，在所有情況下觀察 到透析袋内之絮凝（表4)。因此，雖然傳統上使用界面活性 劑來減少蛋白質聚集，但是顯示其在活體外模型中不能有 效阻滯2H7聚集。 ⑩ 表4 界面活性劑+2Η7 所釋放之蛋白質 0/〇(T=48 小時） HLB 透析袋中之絮凝 2Η7初始(對照） 31 Ν/Α 是 10%泊洛沙姆 15 >28 是 0.2%聚山梨醇酯80 59 15 是 0.05% 斯潘 20 24 8.6 是 0.02% 斯潘 20 24 8.6 是 0.05% 斯潘 80 33 4.3 是 0.02% 斯潘 80 33 4.3 是 rhuMAb CD 11 a(對照） 100 Ν/Α 否 亦評估添加葡聚糖（多醣）、PEG 4000(聚合物）、精胺酸 (胺基酸）及γ環糊精對阻滯聚集及絮凝之影響且結果概述於 144539.doc -83- 201032826 表5至7中。對於任何此等添加劑，均未觀察到顯著改良。 表5 測試物質+2H7 所釋玫之蛋白質％ (T=48小時） 2H7初始(對照） 58 10% 70 KD葡聚糖 47 ----不 /PO ___一一 Pfto τΤ 7¾ 10% 2,000 KD 葡聚糖 38 rhuMAb 0011&(對照） 89 --------- 本 _ — ----- ^ ---- 表6 測試物質+2H7 所釋放之蛋白質％ (Τ=48小時） 2H7初始(對照） 22 S—-- __ # 200 mM精胺酸麩胺酸鹽 35 ^------- 是（1/?Λ 一 100 mM精胺酸琥珀酸鹽 36 --—---- __^是 _ —— 100 mM精胺酸琥珀酸鹽 及 10%ΗΡγ 25 是 10% PEG 4000 28 —----- 县 rhuMAb CDlla(對照） 61 ------__—---- 表7 測試物質+2Η7 所釋放之蛋白質％ (Τ=48小時） 透析袋中之絮凝 2Η7初始(對照） 13 是 5%γ環糊精 20 是 10% γ環糊精 2 是 rhuMAb CD 11 a(對照） 76 否 . 實例5 環糊精對2H7聚集之影響 在活體外模型中測試環糊精對2H7聚集之影響。所用物 質為： •項酸基丁基謎β環糊精納鹽（Cydex，Inc.)，Captisol研究級 •經基丙基-γ 環糊精（Cyclodextrin Technologies Development, Inc·)，Trappsol醫藥級 144539.doc •84- 201032826 •經基丙基-β 環糊精（Cyclodextrin Technologies

Development, Inc.) ’ Trappsol醫藥級 使用2%至9%磺酸基丁基醚（SBE)及5%至20%羥基丙基γ (ΗΡ-γ)環糊精進行初始研究。相對於初始2Η7調配物對照 (圖3，表3)，添加SBE(圖4)與ΗΡ-γ(圖5)環糊精可顯著改良 100 mg/mL 2Η7之活體外釋放。對於SBE調配物，觀察到 透析袋中之絮凝較少，但當蛋白質釋入介質中時，袋外部 之溶液變得愈來愈混濁。ΗΡ-γ調配物更有效地減少聚集。 透析袋内僅存在少量絮凝且袋外部之溶液在整個研究中保 持澄清。總之，添加環糊精可有助於抑制2Η7在生理條件 下聚集。 基於此等滿意結果，在活體外透析模型中評估羥基丙基 β(ΗΡ-β)環糊精以測定不同取代基對2Η7之聚集行為之影 響。評估5%至20%濃度範圍之ΗΡ-β環糊精（圖6)。蛋白質 之釋放百分率較初始2Η7調配物改良，但小於rhuMAb CD1 la對照之彼百分率。當蛋白質釋入釋放介質中時，釋 放介質變為乳白色且在37°C下培育24小時之後，透析袋内 出現絮凝。添加ΗΡ-β環糊精可有效地減少2H7聚集，但在 性質上似乎不如ΗΡ-γ環糊精有效（圖5)。 評估ΗΡ-γ環糊精與精胺酸琥珀酸鹽之組合以測定在減少 2Η7聚集上是否存在累加效應。對於1 00 mg/mL 2Η7，測 試四種不同比率之精胺酸琥珀酸鹽與ΗΡ-γ環糊精（圖7)。 相對於初始2Η7調配物對照，在所有測試組中觀察到2Η7 釋放改良。100 mM精胺酸琥珀酸鹽/10% ΗΡ-γ環糊精及50 144539.doc •85- 201032826 mM精胺酸琥珀酸鹽/15% ΗΡ_γ環糊精調配物具有最低混濁 度（釋入介質中之後）及透析袋内之絮凝少於初始2Η7調配 物對照。 實例6 環糊精在活體内大鼠皮下模型中對發炎的影響 在活體外研究中顯示顯著改良之含有ΗΡ_γ及ΗΡ-β環糊精 之抗體調配物隨後在活體内大鼠皮下模型中測試。此研究 之目標為判定消除2Η7在活體外生理條件下聚集是否會轉 化為注射部位處之發炎減少。動物模型之成功標準為： 相對於rhuMAb CD1 la研究對照，測試調配物可類似地減 少發炎’及（2)注射部位處無肉芽腫。 ΗΡ-β環糊精調配物之組織病理學結果之概述呈現於表8 中。陰性對照rhuM Ab CDlla誘發最少皮下發炎。初始15〇 mg/mL 2H7調配物用作陽性對照且在注射部位處引起中度 至重度（2-3+)發炎。添加ΗΡ-β環糊精可顯著減少注射部位 處之發炎。I5%或3〇。/。ΗΡ-β環糊精與1〇〇 mg/mL 2Η7之最 佳濃度可使注射部位處之發炎顯著減少至輕度（1+)。增加 環糊精濃度可減少在較高2Η7蛋白質濃度下所觀察到之增 加之發炎。將30% ΗΡ-β環糊精添加至較高濃度之2η7(ι5〇 mg/mL)2H7中可使所觀察到之中度至重度（2_3 + )發炎顯著 減少至輕度發炎（1+)。較低濃度之Hp_p環糊精（5%及15%) 不具有相同效果。 144539.doc -86 - 201032826 表8 參 調配物 動物 組織學計分 註解 150 mg/mL rhuMAb CDlla 1 +/- 2 +/- 濾泡毛囊炎 3 +/· 100 mg/mL 2H7 + 15% ΗΡ-β 1 1+ 2 3 1+ +/， 無註解 100 mg/mL 2H7 + 30% ΗΡ-β 1 1+ 2 1+ 病灶性廣泛發炎 3 1+ 150 mg/mL 2H7 + 5% ΗΡ-β 1 3+ 2 2-3+ 病灶性廣泛發炎伴隨壞死 3 2-3+ 150 mg/mL 2H7 + 15% ΗΡ-β 1 2+ 病灶性廣泛發炎伴隨嗜中 Δ 3 Z-J卞 2+ 性白血球退化 150 mg/mL 2H7 + 30% ΗΡ-β 1 1+ 2 1+ 病灶性廣泛發炎 3 1+ 30% ΗΡ-β 媒劑 1 2 +/- 1-2+ 病灶性廣泛發炎(動物2及 3 1+ 3) 150 mg/mL 2Η7初始調配物 1 2-3+ 2 2-3+ 病灶性廣泛發炎伴隨壞死 3 2-3+ 發炎評級計分： WNL=在正常限度内 +/-=最少/輕微 1+=輕度 2+=中度 3+=重度 ΗΡ-γ環糊精調配物之組織病理學結果概述於表9中。當 將1 0% ΗΡ-γ環糊精添加至2Η7中時，觀察到發炎自中度至 重度（2-3 + )減少至輕度至中度（<2 + ρ對於ΗΡ-γ媒劑，未觀 察到顯著發炎反應。 144539.doc -87- 201032826 表9 調配物 動物 組織學計分 註解 150 mg/mL rhuMAb CD 11a 1 +/ 2 +/_ 遽泡毛囊炎 3 +/- 100 mg/mL 2H7 + 10% ΗΡ-γ 1 1-2+ 2 +/- 無註解 3 2+ 100 mg/mL 2H7 + 10% ΗΡ-γ 4 1-2+ 5 1+ 病灶性廣泛發炎 6 1+ 125 mg/mL 2H7 + 10% ΗΡ-γ 1 2+ 2 1-2+ 無註解 3 2+ 150 mg/mL 2H7 + 10% ΗΡ-γ 1 2+ 2 1-2+ 病灶性廣泛發炎 3 2+ 10% ΗΡ-γ 媒劑 1 2 1+ +/· 病灶性廣泛發炎；血管周 3 +/- 圍發炎 10% ΗΡ-γ 媒劑 4 WNL 5 +/- 無註解 6 WNL 150 mg/mL 2Η7初始調配物 1 2-3+ 2 2-3+ 病灶性廣泛發炎伴隨壞死 3 2-3+ 發炎評級計分： WNL=在正常限度内 +/-=最少/輕微 1+=輕度 2+=中度 3+=重度 結論： 總而言之，添加磺酸基丁基醚（SBE)、羥基丙基β(ΗΡ-β) 及羥基丙基γ(ΗΡ-γ)環糊精可有效地在生理條件下顯著減少 2Η7聚集且減少2Η7絮凝。基於環糊精之歷史使用，環糊 144539.doc -88- 201032826

酸），但亦不能顯著減少蛋白質聚集。 在此環境中減少2H7聚集最終可使經2H7注射之動物之 注射部位處之發炎減少。包括Ηρ^Ηρ_γ環糊精之肋調 配物可將重度（初始2Η7)發炎減少至輕度至中度。減少蛋 白質在此等條件下聚集之能力可潛在地轉化為生物可用性 增加。最後，本發明人已成功地開發且證明活體外透析模 型測量賦形劑減少蛋白質聚集之能力的效用。 參考文獻 本申明案中所引用之參考文獻（包括專利、公開申請案 及其他公開案）以引用的方式併入本文中。

除非另外說明，否則可採用此項技術之技能範圍内的習 知分子生物學技術及其類似技術實施本發明。該等技術已 充刀說明於參考文獻中。參見例如]yj〇丨ecular C丨oning: A

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Lane, Antibodies A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988 ； Antibody Engineering,第 2版（C. Borrebaeck編，Oxford University Press, 1995);及系列叢書 Annual Review of Immunology ；系歹丨J 叢書 Advances in Immunology 0 【圖式簡單說明】 圖1顯示2H7在生理條件下之聚集。在37°C下，150 mg/ml之2H7於PBS中透析兩天。 圖2顯示用於評估賦形劑對2H7在生理條件下之聚集之影 響的活體外透析模型。在37°C下，將220 ml經修飾之PBS 溶液（167 mM鈉、140 mM氣化物、17 mM填酸鹽、4 mM 鉀）填充於250 ml玻璃瓶中。將6 cm長度之12 mm透析管在 一端夾緊’以約1 ml試樣填充，移除過量空氣，且管之另 一端夾緊於封口中。將瓶置於37°C下恆定攪拌。瓶之要素 如下： 1為2H7溶液；2為透析膜（1 Μ道爾頓MWCO) ; 3為夹緊 裝置；4為經修飾之PB S溶液；5為攪拌棒。 圖3顯示活體外透析模型中之對照物之行為。2Η7與 1*1111]^^130〇11&均於圖2中所示之模型中測試。在25、6、 12、24、33及48小時時點測量釋入PBS溶液中之蛋白質之 累積百分數。 圖4顯示活體外模型中2-9% SBE-環糊精對釋放2Η7之影 響。 144539.doc -91· 201032826 圖5顯示活體外模型中5-20% ΗΡ-γ-環糊精對釋放2H7之 影響。 圖6顯示活體外模型中5-20% ΗΡ-β-環糊精對釋放2Η7之 影響。 圖7顯示活體外模型中ΗΡ-γ-環糊精及精胺酸琥珀酸鹽對 釋放2Η7之影響。 【主要元件符號說明】 1 2Η7溶液 2 透析膜（1 Μ道爾頓MWCO) 3 夾緊裝置 4 經修飾之PBS溶液 5 攪拌棒 144539.doc -92- 201032826 序列表 <11 〇>美商建南德克公司 <120>減少巨分子於生理條件下聚集之方法及調配物 <130>P2391R13 <140 098138926 <141>2009-11-16 <150> US 61/115,441 <151〉 2008-11-17 <160> 15 <210> 1 <211〉 107 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉

<223〉序列係合成 <400> 1

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30

Tyx* Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro 35 40 45

Leu lie Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 65 70 75

Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 80 85 90

Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 95 100 105

Lys Arg

<210> 2 <211> 122 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉序列係合成 <400> 2

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr 50 55 60

Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Val Asp Lys Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 144539-序列表.doc 201032826

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser 95 100 105

Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 110 115 120

Ser Ser 〈210〉 3 <211> 107 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉序列係合成 <400> 3

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro 35 40 45

Leu lie Tyi' Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 65 TO 75

Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 80 85 90

Ala Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 95 100 105

Lys Arg <210〉 4 <211〉 122 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉序列係合成 <400> 4

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Ser Tyi' Asn Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr 50 55 60

Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Val Asp Lys Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Ala Ser 95 100 105

Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 110 115 120 -2- 144539-序列表.doc 201032826

Ser Ser <210> 5 <211〉 122 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>序列係合成 <400〉 5

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr 50 55 60

Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Val Asp Lys Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg 95 100 105

Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 110 115 120

Ser Ser <210〉 6 <211> 213 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉序列係合成 <400> 6

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val φ 1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30

Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro 35 40 45

Leu lie Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 65 70 75

Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 80 85 90

Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 95 100 105

Lys Arg Thr Val Ala Ala Ρϊό Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser 110 115 120

Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 125 130 135 144539-序列表.doc 201032826

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp 140 145 150

Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin 155 160 165

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu 170 175 180

Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val 185 190 195

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Gly Glu Cys <210> 7 <211> 452 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉序列係合成 <400〉 7

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr 50 55 60

Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Val Asp Lys Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser 95 100 105

Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 110 115 120

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 125 130 135

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 140 145 150

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 155 160 165

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 170 175 180

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 185 190 195

Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys 200 205 210

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 2Ϊ5 220 225

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 230 235 240 -4- 144539·序列表.doc 201032826

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255

Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285

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Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Ai-g 350 355 360

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Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 425 430 435

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 440 445 450

Gly Lys <210> 8 <211> 452 <212〉 PRT <213〉人工序列 參 <220〉 <223〉序列係合成 <400> 8

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr 50 55 60

Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Val Asp Lys Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser 95 100 105 -5- 144539·序列表.doc 201032826

Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 110 115 120

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 125 130 135

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 140 145 150

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 155 160 165

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pio Ala Val Leu Gin 170 175 180

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 185 190 195

Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys 200 205 210

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Gly Gin Pro Ai'g Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 350 355 360

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Gly Lys

<210> 9 <211> 213 <212> PRT 6- 144539-序列表.doc 201032826 <213〉人工序列 <220〉 〈223>序列係合成 <400> 9

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Gly A.sp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30

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Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr 50 55 60

Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Val Asp Lys Ser 65 70 75 144539·序列表.doc 201032826

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Ala Ser 95 100 105

Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 110 115 120

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 125 130 135

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Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 185 190 195

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Gly Lys <210〉 11 <211> 452 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉序列係合成 <400〉 11

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

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Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 305 310 315 144539-序列表.doc 201032826

Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn 320 325 330

Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Ala Thr lie Ser Lys Ala Lys 335 340 345

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 350 355 360

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Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

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Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 140 145 150

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Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 170 175 180 •10- 144539-序列表.doc 201032826

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 185 190 195

Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys 200 205 210

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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255

Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 290 295 300

Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val "Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 305 310 315

Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 320 325 330

Ala Ala Leu Pro Ala Pro lie Ala Ala Thr lie Ser Lys Ala Lys 335 340 345

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 350 355 360

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Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 -11 - 144539-序列表.doc 201032826

Glu Trp Val Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr 50 55 60

Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Val Asp Lys Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Ala Ser 95 100 105

Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 110 115 120

Ser Ser Ala Ser Thi' Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 125 130 135

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 140 145 150

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 155 160 165

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 170 175 180

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 185 190 195

Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys 200 205 210

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 215 220 225

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255

Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 290 295 300

Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 305 310 315

Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 320 325 330

Ala Ala Leu Pro Ala Pro lie Ala Ala Thr lie Ser Lys Ala Lys 335 340 345

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Ai'g 350 355 360

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 365 370 375

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 380 385 390

Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 395 400 405

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 410 415 420 •12· 144539-序列表.d〇c 201032826

Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 425 430 435

Ala Leu His Trp His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 440 445 450

Gly Lys <210〉 14 <211〉 452 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>序列係合成 <400> 14

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

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Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

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Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 110 115 120

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 125 130 135

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 140 145 150

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 155 160 165

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 170 175 180

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 185 190 195

Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys 200 205 210

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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255

Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285 -13- 144539-序列表.doc 201032826

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pxo Arg Glu Glu Gin 290 295 300

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Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 320 325 330

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Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyi' Thr Leu Pro Pro Ser Arg 350 355 360

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Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 125 130 135

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Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 155 160 165

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Yal His Thr Phe Pro Ala Yal Leu Gin 170 175 180

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 185 190 195

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Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 350 355 360

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Gly Lys 15· 144539-序列表.doc

Claims (1)

1. 201032826 七、申請專利範圍： 1. 一種用於皮下投與巨分子之醫藥調配物，其包含1〇111§/ ml至200 mg/mi濃度範圍之巨分子及2%至3〇%環糊精。 2. 如明求項1之調配物，其中該環糊精係選自由環糊 精、ΗΡ-γ環糊精及SBE_環糊精組成之群。 3·如明求項2之調配物，其中該調配物含有5%至3〇% 環糊精或ΗΡ-γ環糊精。 4. 如請求項3之調配物，其中該調配物含有5%至3〇% Ηρβ ® 環糊精。 5. 如請求項3之調配物，其中該調配物含有5%至2〇% jjp-γ 環糊精。 6. 如請求項5之調配物’其中該調配物另外包含5〇 mM至 200 mM精胺酸琥珀酸鹽。 7·如請求項2之調配物’其中該調配物含有2%至9% SBE· 環糊精。 參 8.如請求項1之調配物，其中該巨分子為蛋白質。 9. 如請求項8之調配物，其中該蛋白質為抗體。 10. 如請求項9之調配物，其中該抗體為治療性抗體。 11. 如請求項9之調配物，其中該抗體為診斷性抗體。 12. 如請求項9之調配物，其中該抗體為抗CD20抗體。 13·如請求項12之調配物，其中該抗體包含如表1中所示之 變異體A、B、C、D、F、G、Η或 I。 14.如請求項12之調配物，其中該抗體包含選自由SEq m ΝΟ:1-15組成之群之胺基酸序列。 144539.doc 201032826 15. 如請求項12之調配物，其中該抗體包含輕鏈可變域SEQ ID ΝΟ:1及重鏈可變域SEQ ID NO:2。 16. 如請求項12之調配物，其中該抗體包含輕鏈可變域SEQ ID NO:3及重鏈可變域SEQ ID NO:4。 17. 如請求項12之調配物，其中該抗體包含輕鏈可變域SEQ ID NO:3及重鏈可變域SEQ ID NO:5。 18. 如請求項12之調配物，其中該抗體包含全長輕鏈SEQ ID NO:6及全長重鏈SEQ ID NO:7。 19. 如請求項12之調配物，其中該抗體包含全長輕鏈SEQ ID NO:6及全長重鏈SEQ ID NO:15。 20. 如請求項12之調配物，其中該抗體包含全長輕鏈SEQ ID NO:9及全長重鏈SEQ ID NO:10。 21. 如請求項12之調配物，其中該抗體包含全長輕鏈SEQ ID NO:9及全長重鏈SEQ ID ΝΟ:11。 22. 如請求項12之調配物，其中該抗體包含全長輕鏈SEQ ID NO:9及全長重鏈SEQ ID NO:12。 23. 如請求項12之調配物，其中該抗體包含全長輕鏈SEQ ID NO:9及全長重鏈SEQ ID NO:13。 24. 如請求項12之調配物，其中該抗體包含全長輕鏈SEQ ID NO:9及全長重鏈SEQ ID NO: 14。 25. 如請求項9之調配物，其中該抗體以30 mg/ml至150 mg/ml之濃度範圍存在。 26. 如請求項9之調配物，其中該抗體以100 mg/ml至150 mg/ml之濃度範圍存在。 144539.doc 201032826 27. 如請求項9之調配物，其包含100 mg/ml之人類化2H7抗 體及15%至30% ΗΡ-β環糊精。 28. 如請求項9之調配物，其包含150 mg/ml之人類化2Η7抗 體及30% ΗΡ-β環糊精。 29. 如請求項9之調配物，其包含150 mg/ml之人類化2Η7抗 體及10% ΗΡ-γ環糊精。 30. 如請求項29之調配物，其中該調配物另外包含50 mM至 200 mM精胺酸琥珀酸鹽。 31. 如請求項30之調配物，其中該人類化2H7抗體包含如表1 中所示之變異體入、6、（：、0、尸、0、11或1。 32. 如請求項30之調配物，其另外包含3 0 mM乙酸鈉；5%海 藻糖二水合物；及0.03%聚山梨醇酯20，pH 5.3。 33. 如請求項32之調配物，其中該人類化2H7抗體包含如表1 中所示之變異體A、B、C、D、F、G、H或I。 34. 如請求項9之調配物，其中該調配物包含100 mg/ml至150 mg/ml濃度範圍之如表1中所示之人類化2H7抗體變異體 A、15%至30% ΗΡ-γ環糊精及50 mM至100 mM精胺酸琥 珀酸鹽。 3 5.如請求項1之調配物，其在皮下投與該巨分子期間可將 注射部位之發炎減至最小。 36. —種醫藥調配物用於製造供治療CD20陽性B細胞癌症之 藥物的用途，其中該調配物包含表1之人類化2H7抗體及 2%至30%環糊精，其中該環糊精係選自由ΗΡ-β環糊精、 ΗΡ-γ環糊精及SBE-環糊精組成之群。 144539.doc 201032826 37. 如請求項36之用途，其中該CD20陽性B細胞癌症為B細 胞淋巴瘤或白血病。 38. 如請求項37之用途，其中該CD20陽性B細胞癌症係選自 由以下組成之群：非霍奇金氏淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma ; NHL)、復發惰性（indolent) NHL及利妥昔單 抗（rituximab)難治性惰性NHL、淋巴細胞為主型 (predominant)霍奇金氏疾病（LPHD)、小淋巴細胞淋巴瘤 (SLL)及慢性淋巴細胞白血病（CLL)。 39. 如請求項36之用途，其中該人類化2H7抗體為表1之變異 體 A、B、C、D或 Η。 40. —種醫藥調配物用於製造供治療自體免疫疾病之藥物的 用途，其中該調配物包含表1之人類化2Η7抗體及2%至 30%環糊精，其中該環糊精係選自由ΗΡ-β環糊精、ΗΡ-γ 環糊精及SBE-環糊精組成之群。 41. 如請求項40之用途，其中該自體免疫疾病係選自由以下 組成之群：類風濕性關節炎（RA)及幼年型類風濕性關節 炎，包括甲胺嗓呤（Mtx)反應不足者（inadequate responders)及TNFa拮抗劑反應不足者；全身性紅斑狼瘡 (SLE)，包括狼瘡腎炎；多發性硬化（MS)，包括復發緩 解型多發性硬化（RRMS);華格納氏疾病（Wegener's disease);發炎性腸道疾病；潰瘍性結腸炎；特發性血小 板減少性紫癜（ITP);血栓性血小板減少性紫癜（TTP); 自體免疫性血小板減少症；多發性硬化；牛皮癬；IgA 腎病；IgM多神經病變；重症肌無力；ANCA相關血管 144539.doc 201032826 炎，糖尿病，雷諾氏症候群（Reynaud，S Syndr〇me);休格 連氏症候群（Sjogren's syndrome);視神經脊髓炎 (NMO);及絲球體腎炎。 42. 如請求項40之用途，其中該人類化2H7抗體為表1之變異 體 A、B、C、D或 Η。 43. —種使注射於患者注射部位之水性皮下調配物中抗體之 溶解改良或維持或沈澱最少的方法，其包含向該水性皮 下調配物中添加2%至30%環糊精，其中該環糊精係選自 由ΗΡ-β環糊精、ΗΡ-γ環糊精及SBE_環糊精組成之群。 44·如請求項43之方法，其中該抗體為如表丄中所示之人類 化抗CD20抗體變異體a、b、C、D、F、G、Η或I。 45_ —種增加皮下投與之抗體之生物可用性的方法，其包含 向包含該抗體之水性皮下調配物中添加2%至3〇%環糊 精，其中該環糊精係選自由ΗΡ_β環糊精、111>_丫環糊精及 SBE-環糊精組成之群。

   46. 如請求項45之方法，其中該抗體為如表i中所示之人類 化抗CD20抗體變異體A、；B、C、D、F、G、H或I 47. —種評估賦形劑減少抗體或其他巨分子在生理條件下聚 集之能力的活體外透析方法，其包含： (a)在37 C ’在怪定㈣下，有及無測試賦形劑之巨分 子之調配物相對於經修飾之pBS溶液（167爪从納 mM氯化物、17 mM鱗酸鹽、4 mM鉀）透析. (b) 移除該經修飾之PBS溶液之試樣；及 其中與缺乏 (c) 測量該等試樣之混濁度及蛋白質含量 144539.doc 201032826 賦形劑之對照相比，在含有該測試賦形劑之檢定中，該 等试樣之蛋白質；辰度提南及混渴度降低，說明該測試職 形劑能夠減少該巨分子聚集。 48. 如請求項47之方法，其中該調配物在具有i百萬道爾頓 (Dalt〇n)截留分子量（molecular weight cut-off)之透析管 中透析。 49. 如請求項47之方法，其中該等試樣之蛋白質濃度及混濁 度係使用UV光譜測定法測量。 50·如請求項47之方法，其另外包含目檢該經修飾之pBs溶 液及該透析管内溶液之沈澱，其中與缺乏賦形劑之對照 相比，含有該測試賦形劑之透析管中之沈澱減少，說明 該測試賦形劑能夠減少該巨分子聚隼。 144539.doc