TW200936148A

TW200936148A - Methods for co-culturing cord blood derived cells with menstrual stem cells

Info

Publication number: TW200936148A
Application number: TW097142288A
Authority: TW
Inventors: Mercedes A Walton; Julie G Allickson
Original assignee: Cryo Cell Int
Priority date: 2007-10-31
Filing date: 2008-10-31
Publication date: 2009-09-01
Also published as: KR20100091192A; EP2212418A4; US20120208275A1; MX2010004914A; BRPI0818152A2; ECSP10010189A; AU2008319284A1; PA8802801A1; JP2011501960A; US20090191628A1; IL205470A0; WO2009058365A1; CN101952416A; AR069156A1; EP2212418A1; CA2714777A1; NI201000077A; CL2008003282A1; CR11409A

Description

200936148 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明大體而言係關於人類細胞培養及經由共同培養來增強經分離細胞群體之方法。更特定言之，本發明係關於共同培養臍帶jk衍生細胞與月經血幹細胞以獲得經擴增之 ' 表現CD3 4之臍帶jk衍生細胞的改良細胞群體。本申請案主張2007年10月31曰申請之標題為"Methods for Co-Culturing Cord Blood Derived Cells with Menstrual ❹ Stem Cells"的美國臨時專利申請案第61/001,456號之優先權，該案之全文係以引用的方式併入本文中。【先前技術】臍帶血為具有治療人體多種病症之能力的幹細胞之公認來源。臍帶血為包括含有CD34細胞之單核細胞的造血祖細胞之豐富來源。因為在兒童或家族成員有醫學需要之情況下’具有經儲存之幹細胞的豐富來源存在潛在益處，所以家族可決定收集臍帶血。 © 臍帶血（Cord blood，亦稱為umbilical cord blood)為在出生之時保留於臍帶及胎盤中之血液。此血液為幹細胞之豐 - 富來源，可將其收集、處理且低溫保藏以用於潛在之未來用途。臍帶血幹細胞為有益的，因為其具有高植入率，較能耐受組織失配，具有較低比率之嚴重移植物抗宿主疾病 (在幹細胞移植中之主要併發症）且極少經潛伏性病毒污染。可以臍帶血治療之人類缺乏症之數目在過去十年中已顯 135827.doc 200936148 著增長。舉例而言，已使用臍帶血細胞來治療各種形式之癌症、與骨髓衰竭（bone marrow failure)相關之症候群、血液病症、代謝病症、免疫缺乏病症及其他疾病病況中之至少70種形式。舉例而言，已使用臍帶血細胞來治療以下疾病：急性淋巴母細胞白企病（ALL)、急性骨髓白血·病 (AML)、伯基特氏淋巴瘤（Burkitt's lymphoma)、慢性骨髓 - 白血病（CML)、青少年骨髓單核細胞性白血病（JMML)、噬血細胞淋巴組織細胞增生症（Hemophagocy ti c ❿ lymphohistiocytosis)、非霍奇金氏淋巴瘤（Non-Hodgkin’s lymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤、郎格罕細胞（Langerhan's cell)組織細胞增生症、淋巴瘤樣肉芽腫病、骨髓發育不良症候群（MDS)、慢性骨髓單核細胞性白血病（CMML)、無巨核細胞性血小板減少症（Amegarakyocytic thrombocytopenia)、自體免疫嗜中性球減少症（嚴重）、先天性紅細胞生成不良性貧血、週期性嗜中性球減少症、戴布二氏（Diamond-Blackfan)貧血、埃文氏症候群（Evan's ❹ syndrome)、範可尼貧血（Fanconi anemia)、格蘭茨曼疾病 (Glanzmann’s disease)、青少年皮肌炎、科命特曼症候群 - (Kostmann's syndrome)、紅血球發育不全、斯沃奇曼症候 . 群（Schwachman syndrome)、嚴重再生不全性貧血、先天性含鐵胚血球貧血、橈骨缺失性血小板減少症（TAR症候群）、先天性角化不全、鐮狀細胞性貧血（血色素SS)、 HbSC疾病、鐮狀β -地中海貧血、嚴重α-地中海貧血（胎兒水腫）、嚴重β-地中海貧jk (庫利氏貧血（Cooley's 135827.doc 200936148 anemia))、中間型β-地中海貧血、Ε-β地中海貧血、Ε-β +地中海貧血、腎上腺腦白質營養不良、高雪氏病（Gaucher's disease)(嬰兒）、異染性腦白質營養不良、克拉貝疾病 (Krabbe disease)(球狀細胞腦白質營養不良）、貢特爾疾病 (Gunther disease)、哈布二氏症候群（Hermansky-Pudlak syndrome)、胡爾勒症候群（Hurler syndrome)、胡沙二氏症 • 候群（Hurler-Scheie syndrome)、亨特症候群（Hunter syndrome) > 山菲立普症候群（Sanfilippo syndrome)、馬拉〇二氏症候群（Maroteaux-Lamy syndrome)、II型、III型黏脂質症（Mucolipidosis)、α甘露糖症（Alpha mannosidosis)、A 型及B型紐匹二氏症候群（Neumann Pick Syndrome)、山朵夫症候群（Sandoff Syndrome)、泰薩二氏疾病（Tay Sachs Disease)、巴滕疾病（Batten disease)(遺傳性神經性類蝶脂褐質病）、萊·萘二氏疾病（Lesch-Nyhan disease)、共濟失調性毛細企管擴張症（Ataxia telangectasia)、慢性肉芽腫病、迪喬治症候群（DiGeorge syndrome)、IKK γ缺乏症、免疫 ® 調節異常多内分泌病X染色體相關（Immune dysregulation polyendocrineopathy X-linked)、II型黏脂質症、先天性資 - 趙粒細胞缺乏症（Myelokathesis)、X染色體相關之免疫缺 . 乏、嚴重聯合免疫缺乏、腺苷去胺酶缺乏症、維-奥二氏症候群、X染色體相關之無γ球蛋白血症、X染色體相關之淋巴增生性疾病、歐曼症候群（Omenn's syndrome)、網狀細胞發育異常（Reticular dysplasia)、胸腺發育異常（Thymic dysplasia)、白血球黏著性缺乏症及骨石化病。 135827.doc 200936148 存在關於臍帶血細胞收集及在人類病症治療中 π τ <用途的限制。首先’臍帶血細胞僅可在出生之後立即收集。此對臍帶血之可收集次數造成顯著限制。其次，以含有有限量之幹細胞的小體積收集臍帶血。某些病症需要輸注或移植大量幹細胞。少量可收集之臍帶血細胞使得將此等細胞用於需要大量細胞之療法並不可行。正進行研究來發展進步以克服臍帶血細胞之限制。已開發了組合多個臍帶血單位或在移植之前在單一臍帶血單位中擴增幹細胞之技術。開發此等技術以解決因具有過少幹細胞群體而無法治療病症之問題。即使存在發展，亦證明臍帶血幹細胞在細胞培養物中難以擴增。豐富但受限之幹細胞來源對病症治療而言仍具有限制。已開發活體外檢定系統以對紅血球、粒細胞、單核細胞-巨噬細胞及巨核細胞骨髓細胞系之多潛能祖細胞及系受限祖細胞定量。當在合適半固體基質中培養時，稱為群落形成細胞（CFC)之個別祖細胞增殖以形成離散細胞簇或群落。藉由將細胞懸浮液置於半固體培養基（諸如補充有營養素及細胞活素之曱基纖維素或膠原蛋白）中、接著培月來進行CFC檢定。接著，基於群落内之一或多類造血系細胞之形態學識別來對CFC分類且計數。可藉由光顯微術或藉由採集個別群落且接著使用細胞化學及免疫細胞化學方法將細胞染色來當場進行群落評估及計數。已將包括曱基纖維素之各種膠凝劑用於CFc檢定。甲基纖維素為形成具有良好光學透明度之穩定凝膠的相對惰性 135827.doc 200936148 之聚合物。其通常用於補充有包括胎牛血清（FBS)、牛血清白蛋白（BSA)、2-酼基乙醇、胰島素、運鐵蛋白及重組細胞活素之化合物的培養基中或作為群落刺激因子來源之改良性培養基（conditioned medium)中。與其他類型之半固體基質相比，基於曱基纖維素之培養基允許紅血球系細胞之較佳生長，因此允許在相同培養物内檢定紅金球、粒細 • 胞、單核細胞及多潛能CFC。此培養基允許偵測人類群落形成單位-紅血球（CFU-E)、爆式形成單位-紅血球（BFU-φ E)、CFU-粒細胞巨噬細胞（CFU-GM)及CFU-粒細胞、紅血球、巨噬細胞、巨核細胞（CFUGEMM)且對其計數。儘管已產生進步，但仍需要改良臍帶幹細胞擴增以製造較多用於治療人類病症之幹細胞的方法。本發明係關於滿足此需要。【發明内容】本發明係基於以下發現，即來自臍帶血之幹細胞在與月經血細胞群體共同培養時以足夠大之數目增殖。該發現已 ® 展示月經血幹細胞在具有臍帶血幹細胞之培養物中提供支持功能以增強臍帶血細胞增殖。根據用於收集、極冷保藏 - (cryopreservation)及儲存之目前行業標準來收集臍帶血細 . 胞。可根據美國專利公開案第20080241113號之教示來收集用於與臍帶血幹細胞共同培養之月經血幹細胞。臍帶血細胞與月經血細胞之共同培養產生促進表現CD34、SSEA4 及HLA-II之細胞擴增之培養環境。美國專利公開案第20080241113號之教示提供多種用於 135827.doc -10- 200936148 收集適用於本發明中之月經血幹細胞群體的方法。用於共同培養之月經血幹細胞可自新鮮或經極冷保藏之月經血幹細胞獲得。月經血幹細胞可關於CD117或其他細胞表面標圮經分離且亦可經由細胞培養來擴增。月經血幹細胞亦可關於某些細胞標記經分離且接著經培養以便擴增。美國專利公開案第20080241113號中所述之月經血幹細胞的任何 ' 群體均可用於本發明之共同培養方法中。因此’本發明提供共同培養臍帶血細胞與月經血細胞以 ® 改良臍帶也細胞之增殖的方法。在一相關態樣中，本發明提供表現CD34之人類細胞的群體，其係獲自人類臍帶血細胞在具有促進人類膪帶血細胞群體倍增之人類月經血細胞的合適培養條件中之擴增。細胞之群體表現SSEA4及HLA-II。本發明之細胞的群體可懸浮於冷凍保藏劑、培養基、生長培養基或分化培養基之任一者中。本發明之表現CD34之人類細胞的群體係由於至少兩次 ® 或兩次以上群體倍增而產生的。本發明之細胞的群體能夠產生以下任一者：群落形成單 - 位、群落形成單位粒細胞（CFU-GM)巨噬細胞、爆式形成 • 單位紅血球（BFU-E)及群落形成單位粒細胞紅血球巨嗤細胞巨核細胞（CFU-GEMM)血液系前驅體細胞。在另一態樣中’本發明亦提供藉由以下方法獲得的表現 CD3 4之人類腾帶血細胞的群體’該方法包含在適用於臍帶血細胞擴增之條件下共同培養足量臍帶血幹細胞與足量 135827.doc 200936148 月經血幹細胞，且接著經由至少兩次群體倍增使足量臍帶血細胞在培養物中增殖。使足量腾帶血細胞在培養物中增殖之步驟包含使臍帶血細胞生長以產生以下任一者：群落形成單位、群落形成單位粒細胞巨噬細胞（CFU-GM)、爆式形成單位紅血球（BFU-E)及群落形成單位粒細胞紅血球 ' 巨噬細胞巨核細胞血液系前驅體細胞（CFU-GEMM)。 • 在一實施例中，本發明之方法可包含使足量臍帶血細胞在培養物中生長以產生以下任一者之步驟：群落形成單位 ❹ （CFU)、群落形成單位粒細胞巨噬細胞（CFU-GM)、爆式形成單位紅血球（BFU-E)及群落形成單位粒細胞紅血球巨噬細胞巨核細胞血液系前驅體細胞（CFU-GEMM)。在又一實施例中，本發明之方法可包含在使足量臍帶企細胞在培養物中增殖之後分離表現CD34之臍帶血細胞的步驟。 . 在另一實施例中，本發明之方法可包含在使足量臍帶血細胞在培養物中增殖之後極冷保藏表現CD34之人類臍帶 ❹ 血細胞之群體的步驟。藉由本發明之方法獲得的表現CD34之人類臍帶血細胞 • 的群體在使足量臍帶血細胞在合適培養條件下增殖之後亦可表現CD34、SSEA4及HLA-II中之至少一者。在又一態樣中，本發明提供獲得經擴增之表現CD34之人類臍帶血細胞的方法。本發明之方法包含以下步驟：在適於促進臍帶血細胞擴增之共同培養條件下以足量月經血細胞接種足量臍帶血細胞，且在支持臍帶血細胞的至少兩 135827.doc -12· 200936148 次或兩次以上群體倍增之培養條件下共同培養臍帶血細胞與月經血細胞。在一實施例中，共同培養表現CD34之人類臍帶血細胞包含擴增臍帶血細胞以表現SSEA4及HLA-II中之至少一或多者。 ' 在另一實施例中，本發明之經擴增人類臍帶血細胞表現高含量之CD34。另外，本發明之臍帶血細胞之共同培養包含擴增臍帶血細胞以產生以下任一者：群落形成單位、 φ 群落形成單位粒細胞巨噬細胞（CFU-GM)、爆式形成單位紅血球（BFU-E)及群落形成單位粒細胞紅血球巨噬細胞巨核細胞血液系前驅體細胞（CFU-GEMM)。在替代性實施例中，本發明之方法可包含以下其他步驟中之至少一者：關於CD34免疫選擇經擴增人類臍帶血細胞，自培養物分離經擴增人類臍帶血細胞以便輸注於人類中，極冷保藏經擴增人類臍帶血細胞或使經擴增臍帶血細胞分化為細胞系。 ® 在又一實施例中，本發明之方法包含使經擴增人類臍帶血細胞生長以產生以下任一者之步驟：群落形成單位、群 • 落形成單位粒細胞巨噬細胞（CFU-GM)、爆式形成單位紅血球（BFU-E)及群落形成單位粒細胞紅血球巨噬細胞巨核細胞（CFU-GEMM)血液系前驅體細胞。【實施方式】參考圖1-6，本發明提供共同培養臍帶血細胞與月經血細胞以擴增表現CD34之細胞之數目的方法。亦提供藉由 135827.doc •13- 200936148 本發明之方法獲得的經擴增之表現CD34之人類細胞的組合物。全臍=血為包括含有CD34+細胞之單核細胞的造血祖細胞之豐田來源。臍帶企幹細胞包含包括細胞之單核細胞。臍帶血幹細胞係獲自在分娩嬰兒後但一般在已分挽胎盤之前自臍帶立即提取之全臍帶血。錢之時刻為收集新生兒幹細胞之唯—機會° ^收集對於陰道分挽及剖腹刀娩均為女全的。為收集臍帶血，將臍帶血自臍帶吸取至血液收集袋中。將臍帶血封裝於運送材料中且運送至實驗至中以便在收集之36至48小時内加以處理。在嬰兒出生之後，在夾掉臍帶後自臍帶收集全血。全臍帶血之體積可為約110 mle在行業標準下將所收集之臍帶血樣品運送至實驗室以進行處理。在無菌條件下使用密度梯度分離（Ficoll/Hypaque)來處理腾帶A以分離含有表現CD34之細胞群體的單核細胞。將臍帶血等分至無菌50 ml管中。在470 g下將管離心約15分鐘。在離心之後，壓緊細胞（packe(j ceii)應在每體積i :3比率下。可在離心之後自管移除血漿，或可將DpBS添加至管中以達成1:3之壓緊細胞與體積之比率。各管應具有不大於約35 ml之體積。各管下方置放有1〇 ml LSM。將各管在400 g下離心約30分鐘。移除血漿頂層。移除含有單核細胞及血漿之下一層且將其轉移至另一 50 ml管中。應使用含有L-麩胺醯胺之RPMI01640 IX使50 ml管中之細胞懸浮直至約45 ml之體積，其中RPMI與細胞混合物之 135827.doc • 14· 200936148 比率為約1:2。可在470 g下將具有細胞懸浮液之管離心約 15分鐘。在離心之後，移除上清液。添加少量rpmi以使小球再懸浮。將細胞懸浮液轉移至15 ml管中。在15 ml管中將細胞懸浮液在400 g下離心約15分鐘。傾析上清液且使用RPMI使小球再懸浮直至5 ml。逐滴添加5 ml DMSO/ 自體血漿（1 ml DMSO及4 ml自體血漿）。在控制速率冷凍器中將DMSO/自體血漿中之細胞懸浮液的溫度降至約 _85°C。將管置於在約_185°C或-185。(：以下之液氮槽中》 ® 參考根據美國專利公開案第20080241113號之任一方法自月經收集之細胞來使用短語"月經血細胞"。月經血細胞包含表現包括（但不限於）CD9、CD10、CD13、CD29、 CD44、CD49e、CD49f、CD59、CD81、CD105、CD166及 I類HLA之細胞標記或細胞内標記中的至少一者，同時以低含量表現或不表現CD3及MHC II的細胞《儘管將細胞之上述特徵提供為例示性特徵，但在美國專利公開案第 ❹ 200 8 0241113號之整個揭示案中提供月經血細胞之額外及替代性細胞表面特徵，包括（但不限於）其中任何表及圖中所k供的特徵（在極冷保藏之前及之後、在CD u 7選擇之前及之後、在細胞培養之前及之後）或美國專利公開案第 • 20080241113號中所揭示之任何組合。另外，美國專利公開案第20080241113號係以全文引用的方式併入本文中，且提供關於本發明之月經血細胞的其他揭示内容。根據美國專利公開案第20080241113號之教示，用於與臍帶血幹細胞共同培養之月經血細胞可自月經收集，濃縮且極冷保 135827.doc -15· 200936148 藏，且稍後根據本發明之方法來解來。或者，美國專利公開案第20〇8〇241113號之教示提供獲得適用於本發明中: 月經血細胞的多種方法。. 儘管術語"細胞"在本申請案中可以單數含義使肖，但術語••細胞"亦可用以指用於本發明之一個以上細胞。認識到由於某些細胞分化為多種獨特細胞類型之能力， • 該等細胞在本質上為多能的。多能細胞具有分化為多種不同哺乳動物細胞類型之能力。舉例而言，用於本發明中之 ^ 月經血細胞展示分化為各種細胞系之潛力，該等細胞系諸如神經系、心臟生成系、軟骨生成系、脂肪生成系及成骨系。本發明之方法及組合物出於多種原因，將經擴增CD34細胞用於治療用途可為有益的》詳言之，經擴增CD34細胞（a)與其他臍帶血細胞擴增方法相比需要使用較少臍帶血細胞來增殖，（b)在與月經血細胞之共同培養中增殖’（c)能夠自體應用，（d)能夠同種異體應用，及（e)可用作定製之再生保健溶液之來源。本發明提供表現CD34之人類細胞的群體，其係獲自人類臍帶血細胞在具有促進人類臍帶血細胞群體倍增之人類，月經血細胞之合適培養條件中之擴增。細胞之群體亦表現 SSEA4及 HLA-II。本發明之細胞的群體可懸浮於冷凍保藏劑、培養基、生長培養基或分化培養基之任一者中。本發明之表現CD34之人類細胞的群體係由於至少兩次 135827.doc -16- 200936148 或兩次以上群體倍增而產生的。本發明之細胞的群體能夠產生以下任一者：群落形成單位、群落形成單位粒細胞（CFU-GM)巨噬細胞、爆式形成單位紅血球（BFU-E)及群落形成單位粒細胞紅血球巨嗤細胞巨核細胞（CFU-GEMM)血液系前驅體細胞。 ' 本發明亦提供藉由以下方法獲得的表現CD34之人類臍帶血細胞的群體，該方法包含在適用於臍帶血細胞擴增之條件下共同培養足量臍帶血幹細胞與足量月經血細胞，且〇接著經由至少兩次群體倍增使足量臍帶血細胞在培養物中增殖。使足量臍帶企細胞在培養物中增殖之步驟包含使臍帶血細胞生長以產生以下任一者：群落形成單位、群落形成單位粒細胞巨噬細胞（CFU-GM)、爆式形成單位紅血球 (BFU-E)及群落形成單位粒細胞紅血球巨噬細胞巨核細胞血液系前驅體細胞（CFU-GEMM)。本發明之方法可包含使足量臍帶血細胞在培養物中生長以產生以下任一者之步驟：群落形成單位（CFU)、群落形 ® 成單位粒細胞巨噬細胞（CFU-GM)、爆式形成單位紅血球 (BFU-E)及群落形成單位粒細胞紅血球巨噬細胞巨核細胞血液系前驅體細胞（CFU-GEMM)。本發明之方法可包含在使足量臍帶血細胞在培養物中增殖之後分離表現CD34之臍帶血細胞的步驟。本發明之方法可包含在使足量臍帶血細胞在培養物中增殖之後極冷保藏表現CD34之人類臍帶血細胞之群體的步驟。 135827.doc -17· 200936148 藉由本發明之方法獲得的表現CD34之人類臍帶血細胞的群體在足量臍帶血細胞在合適培養條件下增殖之後亦可表現CD34、SSEA4及HLA-II中之至少一者。本發明提供獲得經擴增之表現CD34之人類臍帶血細胞的方法。本發明之方法包含以下步驟：在適於促進臍帶血 ' 細胞擴增之共同培養條件下以足量月經血細胞接種足量臍 • 帶企細胞，且在支持腾帶血細胞的至少兩次或兩次以上群體倍增之培養條件下共同培養臍帶血細胞與月經血細胞。〇共同培養表現CD34之人類臍帶血細胞包含擴增臍帶血細胞以表現SSEA4及HLA-II中之至少一或多者。本發明之經擴增人類臍帶血細胞表現高含量之CD34。本發明之臍帶血細胞之共同培養包含擴增臍帶血細胞以產生以下任一者：群落形成單位、群落形成單位粒細胞巨噬細胞（CFU-GM)、爆式形成單位紅血球（BFU-E)及群落形成單位粒細胞紅血球巨噬細胞巨核細胞血液系前驅體細胞 (CFU-GEMM)。 ® 本發明之方法可包含以下其他步驟中之至少一者：關於 CD34免疫選擇經擴增人類臍帶血細胞，自培養物分離經擴增人類臍帶血細胞以輸注於人類中，極冷保藏經擴增人類腾帶血細胞，或使經擴增臍帶血細胞分化為細胞系。本發明之方法包含使經擴增人類臍帶血細胞生長以產生以下任一者之步驟：群落形成單位、群落形成單位粒細胞巨噬細胞（CFU-GM)、爆式形成單位紅血球（BFU-E)及群落形成單位粒細胞紅血球巨嗤細胞巨核細胞（CFU-GEMM)血· 135827.doc -18- 200936148 液系前驅體細胞。製備用於培養之細跑臍帶血細胞樣品及月經血細胞樣品可在儲存中經極冷保藏。或者，臍帶血細胞樣品及月經血細胞樣品中任一者或兩者在自所收集之原始血液樣品處理之後可為新鮮的。在極冷保藏臍帶血細胞樣品及月經血細胞樣品中任一者或兩者之情況下’必須使經極冷保藏之臍帶血細胞及/或月經血細胞解凍以為培養作準備。在臍帶血細胞樣品及月經血細胞樣品中任一者或兩者新鮮之情況下，可製備細胞以進行培養。使經極冷保藏之細胞解凍的方法包含使經極冷保藏之細胞解凍且接著經由離心來洗滌該等細胞之步驟。自極冷保藏移除一小瓶細胞且在約37-4(TC水浴中攪拌該小瓶直至剩餘幾片冷束樣品’藉此使經極冷保藏之細胞解束。經極冷保藏之細胞不應完全解凍。將部分解凍之細胞轉移至具有DNase(每1〇〇 ml 10滴）之冷凍chang氏完全培養基中且藉由倒置使其輕微混合。Chang氏完全培養基應以5:1之比率與部分解凍細胞混合。舉例而言，使25 ml Chang氏完全培養基與5 ml解凍細胞組合。此時，可移除約1〇〇_2〇〇以之 Chang氏完全培養基及解柬細胞樣品以用於下文進一步詳細描述之流式細胞儀分析。懸浮解凍細胞之Chang氏完全培養基溶液可接著經受在約環境溫度下在約120 g下離心約5分鐘之第一步。一旦離心元成’即移除上清液且藉由溫和倒置使細胞小球及可能 135827.doc •19· 200936148 存在之其他碎片再懸浮於無DNase之Chang氏完全培養基中。懸浮於Chang氏完全培養基中之細胞可接著經受在約環境溫度下在約120 g下離心約5分鐘之第二步。一旦第二離心步驟完成，即移除上清液且使細胞小球再懸浮於7 ml 之15% FBS Chang氏生長培養基中。

Chang氏完全培養基包含MEM α培養基、Chang B、 Chang C、盤尼西林/鏈黴素（Penicillin/Streptomycin)、L-麩胺醯胺及ES-FBS。藉由組合650 ml MEM α培養基、180 ❿ ml Chang Β(基礎培養基）（1 8% ν/ν)、20 ml Chang C(2% v/v)、10 ml盤尼西林/鏈黴素（10,000單位/ml盤尼西林G鈉及10,000 pg/ml鏈黴素硫酸鹽）、10 ml L-麩胺醯胺200 mM (10〇χ)及 150 ml ES-FBS(19% ν/ν)來製備 Chang 氏完全培養基。可使用解凍及洗滌經極冷保藏之細胞之方法來製備經極冷保藏之臍帶企細胞及月經血細胞以進行培養。經由在燒瓶中培養來擴增細胞 ❹ 將經解凍或新鮮月經血細胞塗鋪於經解凍或新鮮臍帶血細胞上以在燒瓶中共同培養細胞。可在T-25非經組織培養物處理之燒瓶中共同培養臍帶血細胞與月經血細胞。細胞 . 不應超過每個燒瓶約10,000,000個細胞。將足夠數目之臍帶血細胞與足夠數目之月經血細胞在燒瓶中共同培養。在一實施例中，臍帶血細胞可介於約1，〇〇〇個細胞至約1 〇,〇〇〇個細胞之範圍内，而月經血細胞可介於約10,000個細胞至約50,000個細胞之範圍内。其他量之臍帶血細胞及月經血 135827.doc -20- 200936148 細胞亦可為足夠的，只要月經血細胞提供促進臍帶血細胞擴增之支持功能即可。先刖培養之臍帶血細胞及月經血細胞可以約2,〇〇〇個/cm2 經塗鋪，具有約48小時之繼代時間。若塗鋪更多細胞，則細胞可在約24小時内經歷繼代。臍帶血細胞及月經血細胞可塗鋪於分別具有約7 m卜約15 ml及約30 ml Chang氏完全培養基之T-25、T-75及T-175非經組織培養物處理之燒瓶中。〇臍帶企細胞與月經血細胞之共同培養可在C02培育箱中在約36 C至約38°C下培育，直至細胞以約7〇_8〇%融合。可藉由胰蛋白酶化（trypsinizing)步驟使臍帶血細胞與月經血細胞之共同培養物與燒瓶分離。當顯而易見共同培養之濟帶血與月經血細胞準備分離時，應吸出燒瓶中之培養基且接著以對於T-25燒瓶而言體積為約5 ml、對於T-75燒瓶而言體積為約10 ml或對於T-157燒瓶而言體積為約25 ml 之無鈣或鎂之DPB S洗滌非組織培養燒瓶。在洗滌之後，翁可以TrypLE酶在約36。(：至約38°C下對於T-25燒瓶而言以約 1.5 ml之體積、對於T-75燒瓶而言以約3 ml之體積且對於 175燒瓶而言以約6 ml之體積來塗佈細胞。TrypLE酶可與細胞一起在C〇2培育箱中在約36°C至約38。(：下培育約5分鐘。在培育之後’可移出細胞且可以相同體積之首先用於塗佈細胞之TrypLE酶來稀釋燒瓶之内容物。接著，可將含有懸浮細胞内容物之TrypLE酶之溶液轉移至50 ml離心管中。可使用無鈣或鎂之DPBS來洗滌燒瓶之内容物，對於 135827.doc •21 - 200936148 T-25燒瓶而言以約5 ml之體積、對於T-75燒瓶而言以約10 ml之體積且對於Τ-175燒瓶而言以約25 ml之體積進行洗滌。用於本發明實踐中之燒瓶可為非經組織培養物處理之燒瓶。可將約50 ml DPBS添加至含有TrypLE酶及懸浮細胞内容物之50 ml離心管中。 ' 可將50 ml離心管在環境溫度下在約120 g下離心約5分鐘。可移除小球之少量等分試樣（諸如20 μΐ)以用血球計手動地或用自動化裝置進行細胞計數。在離心之後，移除且〇丟棄上清液，且使剩餘小球懸浮於約7 ml Chang氏完全培養基中。懸浮於Chang氏完全培養基中之經共同培養且經擴增之細胞可為極冷保藏而作準備，經受關於CD34細胞之免疫選擇，為輸注於人類中而作準備或為沿任何數目之細胞路徑進行細胞分化而作準備。在細胞培養之過程期間，可獲得共同培養資訊。每隔約 3天或3天以上可更換培養基。若共同培養物含有 ® 10,000,000個以上細胞，則可移除共同培養物中之細胞以在相同培養條件下繼代培養或者根據本申請案中所述之極 - 冷保藏方法進行極冷保藏。經由在培養盤上培養來擴增細胞可在無菌條件下使用塗鋪技術來共同培養細胞。用於本發明之方法中的培養基可為含有118〇？、11〇]^-08?、1111^ 3、hG-CSF、hEPO 之 Methocult 4034 以偵測 CB tiBFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM。在約2-8°C下或在室溫下，使 135827.doc -22- 200936148 儲存在-80°C下之培養基（Meth〇Cult #4〇34)解凍。在塗鋪之前將用於共同培養之經解凍培養基及細胞置於冰上歷時約 15分鐘。將約0_3 ml細胞懸浮液添加至含有培養基之管中，渦動且使其在冰上培育約30分鐘。使用注射器將培養基均勻分布於四孔培養盤之三個孔中，每孔約丨ml。將約 1 ml DPBS添加至培養盤之第四孔中。應在無菌條件下在 - 約37C下將培養盤培育約μ至約21天。流式細胞儀分析〇可为析經共同培養之臍帶血細胞及月經血細胞之任何樣品（無論是否經擴增）的總細胞計數、細胞生存力（藉由錐蟲藍’經由染料排除）及細胞表面標記之表現。經擴增之共同培養的臍帶血細胞及月經血細胞的總細胞 a十數及細胞生存力可藉由用血球計進行之手動計數、流式細胞儀或其他適用於獲得細胞計數之構件（諸如 ViCell(Beckman Coulter)或適於計數顯示於顯微影像上之細胞的軟體）來定量。經擴增之共同培養的臍帶血細胞及月經血細胞可藉由流式細胞儀來進行分析。可根據StemKit藉由將約36 ml蒸館 " 水及4 ml 1 溶解溶液添加至50 ml管中來製備lx NH4CL· 溶解溶液。可將約50 μΐ細胞樣品添加至兩個管中以進行分析。一個管用於CD34+/生存力分析且第二個管用於等純系對照（isoclonic control)。可將約10 pL 7_AAD生存力染料添加至各管中。可將約1〇 CD45-FITC/CD34-PE添加至第一個管中。可將約10 CD45_fitc/Ctrl-PE添加至第 135827.doc •23· 200936148 二個管中。可將混合物渦動且接著在約15它至約3(rc下培月至少20分鐘，同時使其避光。接著，可將約1 ml lx NH4CL溶解溶液添加至各管中且渦動。可將混合物在約 15°C至約30。(：下培育約20分鐘。可將約100 之幹細胞計數螢光球（Stem-Count Fluorosphere)添加至各管中且渴動。接著’應使樣品在流式細胞儀上運行以進行分析。經擴增之共同培養的臍帶血細胞及月經血細胞亦可藉由流式細胞儀來進行分析以分析細胞表面標記、細胞生存力 ® 及其他細胞特徵。在細胞溶解之後亦可根據以下方案來分析細胞之新鮮樣品。可在約2000 rpm下將經擴增之共同培養的臍帶血細胞及月經血細胞之樣品離心約7分鐘。可移除上清液且使細胞再懸浮於約100 μΐ洗滌培養基（25% HSA、DNAse、肝素及 HBSS w/Ca+及 Mg+)中。接著’可在 B1〇〇d Bank Ser〇fuge 中將再懸浮細胞離心約1分鐘。可傾析上清液且使細胞再懸浮於約1.2 ml鞘液（Sheath fluid)中且渦動。 ® 可分析鞘液中之細胞的任何數目之細胞表面標記。舉例而5，且並非為限制，可將鞘液中的細胞之約丨〇〇 y樣品添加至含有以下試劑（在各管中每個試劑之體積為10…或 20 μ1)之各管中且接著將管渦動以混合如表a中所述之試劑與樣品。 135827.doc •24· 200936148 表A:流式細胞儀負載概略

管 FITC PE ECD PC5 1 IgG IgG IgG IgG 2 HLA-I CD133 HLA-II 7AAD 3 CD9 CD54 CD45 CD10 4 CD59 CD63 CD34 CD13 5 CD49e CD81 無 CD49f 6 CD44 CD117 無 CD38 7 CD29 CD 105 CD41 CD3 8 CD19 CD 166 無 CD90 9 NANOG SSEA3 無 7AAD 10 CD14 SSEA4 無 7AAD 11 無 CD56 無 7AAD 在室溫下（15-30°C)培育20分鐘。使其避光。若運行含有 RBC之新鮮樣品，則添加500 μΐ溶解溶液且在室溫下再培育10分鐘且使其避光。若運行密度梯度或解凍樣品，則不溶解。若樣品未溶解，則在20分鐘培育之後以1 ml洗滌培養基洗滌。離心1分鐘且接著傾析上清液。若樣品溶解，則將樣品離心1分鐘且傾析溶解液。添加1 ml洗滌培養基，渦動，再次離心，且接著再次傾析。將500 pL鞘液添 A 加至各管中，渦動且在FC500流式細胞儀上運行。 ❿ 在細胞標記分析之前，可對細胞樣品進行總細胞計數。可設置任何數目之正對照以使用Kasumi-3對照細胞或其他對照細胞進行流式細胞儀分析。 ' 用於細胞計數及細胞生存力分析之材料包括（但不限於）流式細胞儀、Isoflow賴液、Coulter Clenz清潔劑及包括 (但不限於）以下各物之試劑：CD45-FITC/CD34-PE、 CD45-FITC/等純系對照-PE、7-AAD生存力染料、幹細胞計數螢光球、l〇x濃縮氯化銨（NH4CL)溶解溶液及22%牛白 135827.doc -25- 200936148 蛋白溶液。參見Stem Kit™ CD34+HPC計數套組封裝插頁 -03 版（PNIM2390) ; Beckman Coulter產品校正作用，CXP 2.0 及 2.1 面板中斷-3/10/06、PCA-M-D-1013 ； 14.3

StemLab，構築號200706260856，3·2·1版。用於流式細胞儀之材料亦包括（但不限於）Isoflow勒液；Coulter Clenz清 • 潔劑；及以下試劑（使用之前在約20-25°C T):CD117-

PE、CD29-FITC、CD34-ECD、CD44-FITC、CD45-ECD、 CD90-PC5、CD105-PE、CD166-PE、IgG-FITC、IgG-PE、〇 IgG-ECD、IgGl-PC5、HLA-I-FITC、CD133-PE、HLA-II ECD、CD9-FITC、CD54-PE、CD10-PC5、CD59-FITC、 CD63-PE ' CD13-PC5 > CD49e-FITC ' CD81-PE > CD49f-PC5、CD44-FITC、CD38-PC5、CD29-FITC、CD105-PE、 CD41-ECD、CD3-PC5、CD19-FITC、NANOG-FITC、 SSEA3-PE、SSEA4-PE、CD14-FITC、CD56-PE、7-AAD生存力染料、l〇x濃縮氣化銨（NH4CL)溶解溶液、洗滌培養基（包含HBSS(具有Ca+及Mg+之漢克斯HBSS)500 m卜肝 ® 素5 ml、人血清白蛋白25% 50 ml、DNASE-1安瓿）、

Kasumi-3細胞株-CD34+細胞、計時器及渦動混合器。經擴增細胞之極冷保藏使共同培養之經擴增細胞懸浮於自燒瓶中的組織培養獲得之Chang氏完全培養基中以及可準備培養盤以用於極冷保藏。可使經擴增細胞再懸浮於Chang氏完全培養基中。在一實施例中，可使經擴增細胞與冷凍保藏劑以1:1比率組合。舉例而言，5 ml小瓶可包含約2.5 ml細胞及2.5 ml冷 135827.doc •26- 200936148 凍保藏劑。應將經擴增細胞之懸浮液置於冰上歷時至少約 1 5分鐘，隨後添加冷凍保藏劑。藉由以4:1之比率組合ES-FBS與DMSO(99%)來製備冷凍保藏劑。舉例而言，可將約2 ml ES-FBS添加至0.5 ml DMSO中。可使ES-FBS在冰上冷凍至少約15分鐘，隨後添加DMSO。一旦經冷凍，即將DMSO添加至ES-FBSt。可 •使ES-FBS及DMSO冷凍至少約15分鐘。在一替代性實施例中’可使用其他極冷保藏培養基。舉 ® 例而言，可使用冷凍保藏劑來保持解凍後高細胞生存力結果’諸如CryoStor CS10或CS5(Biolife)、補充有丙二醇及蔗糖之胚胎極冷保藏培養基（Vitr〇life)或SAGE培養基（庫珀外科（Cooper Surgical))。甘油可與諸如DMS〇之其他冷凍保藏劑一起使用，或可以約10%之濃度單獨用於具有合適蛋白質之培養基中。在冰上時，可將冷凍保藏劑逐滴添加至經擴增細胞之懸净液中。可輕微混合經擴增細胞之溶液與懸浮之經擴增細胞。可將溶液等分至所需體積之小瓶中以為極冷保藏作準備。小瓶可為極冷小瓶（cry〇via丨卜將小瓶保持在冰上直至準備將其置於受控速率冷凍器中。製備冷凍保藏劑中之經擴增細胞可經受利用受控速率冷凍器或其他合適冷;東器系統（經監測之堆存_冷滚或冷來: 器（Nalgene))進行之若干降溫步驟以將經擴增細胞之溫产降至約-90C之最終溫度。控制速率冷;東器之實例包括（但不限於）Cry0med Therm〇 F〇rma受控速率冷凍器 135827.doc •27· 200936148 7454(Thermo Electron，Corp.)、平面受控速率冷凍器 Kry〇 10/16(TS Scientific)、Gordinier、Bi〇-C〇〇I-FTS 系統及 Asymptote EF600、BIOSTOR CBS 2100系列。在受控速率冷凍器中，可使降溫步驟程式化。冷凍保藏劑及經擴增細胞可經受受控速率降溫以為最終儲存於冷凍器中作準備。可設計受控速率降低以保持細胞生存力。可 • 使用 Cryo-Med冷凍器（Thermo Electron Corp.)、液氮筒及攜帶型Cryo-Med冷凍器來進行受控速率降低以為最終儲存〇於冷凍器中作準備。可使細胞在極冷小瓶或極冷袋中經受受控速率降低以實現約-9(TC之溫度。對於收集於極冷袋中之經擴增細胞之樣品而言，經擴增細胞可經受以下受控速率降低概況：在約4〇c下等待， 1.0°(：/分鐘至_6.0°〔:（樣品）、25.0。〇/分鐘至-50.0。(:（腔室）、 10.0C/分鐘至-14.(TC (腔室）、l.trc/分鐘至·45.(Γ(：(腔室）、 10.〇°C/分鐘至-90.Ot(腔室）及終點（樣品等於或低於 -85.0〇C)。 ® 對於收集於極冷小瓶中之經擴增細胞之樣品而言，該等細胞可經受以下受控速率降低概況：在4。〇下等待，1 〇。〇 / 分鐘至-3.0C(腔室）、1〇.〇。〇/分鐘至-20_0°C(腔室）、1_〇。〇/ 分鐘至_4〇.(TC(腔室）、10.0口分鐘至_9〇 (rc(腔室）及終點。一旦冷凍保藏劑與經擴增細胞之混合物等於或低於約 -85°C ’即將極冷保藏小瓶轉移至低溫儲存單元中且將其儲存於等於或低於約_135°C2溫度下的液氮蒸氣中，或者可 135827.doc -28- 200936148 將小瓶儲存於液氮1之液相中。舉例而言，合適之低溫儲存單元包括（但不限於）LN2冷凍器MVE 1830(Chart Industries) 〇經擴增細胞之免疫選擇可關於至少一種所需細胞標記來選擇經由共同培養臍帶血細胞與月經血細胞而擴增之細胞。舉例而言，所需細胞標記可為CD34、HLA-II或SSEA-4。亦可使細胞經受負選擇步驟以移除非所需細胞。在整個細胞選擇過程中，可使 © 用無菌技術。細胞選擇可用於新鮮細胞或先前經極冷保藏之解凍細胞及經共同培養之細胞。可對僅25〇萬個細胞及至多1000萬個細胞進行細胞選擇。亦可自包含少於250萬個細胞之樣品或包含大於1 〇〇〇萬個細胞之樣品選擇細胞。用於細胞選擇之材料包括（但不限於）DNase、Pulm()zyme (Genentech. Inc.)-1安瓿、欲經負選擇或正選擇之任何抗細胞表面標記（例如抗CD34抗體、山羊抗小鼠IgG微珠）及磁場。〇在約4C下’將包含>=1·0χ106個經擴增之共同培養的臍帶血細胞與月經血細胞之細胞的細胞懸浮液在約3〇〇 g下離心約7分鐘。可在未擾亂細胞小球之情況下移除上清液。可用約1 00 μΐ洗滌培養基使小球再懸浮。在一實施例中，权《細胞表面體為抗C D 3 4抗體。可在冰上將溶液中之細胞培育約20分鐘至約25分鐘。在培育之後，可將約2 ml洗滌培養基添加至細胞中且使其輕微混合。可在約4〇c 下將混合物在約300 g下離心約1 〇分鐘。在離心之後，可 135827.doc -29- 200936148 在未擾亂小球之情況下吸出上清液。可使小球再懸浮於約 80 μΐ洗滌培養基中。可將約2〇口丨山羊抗小鼠IgG添加至細胞懸浮液中且使其輕微混合β可在冰上將混合物培育約分鐘。在培育之後，可藉由添加約2 ml洗滌培養基且接著混合該溶液來洗滌細胞。可在約4〇C下將細胞在約3〇〇 g下離心約10分鐘。可使用管柱以自未經選擇之細胞中分離所選細胞。可藉由在約500 μΐ工作緩衝液中潤濕管柱來製備管柱。在離心之後，可在未擾亂小球之情況下吸出上清液。可使小球再懸沣於約500 μΐ工作緩衝液中。為避免細胞黏著，可將額外DNase添加至細胞中。可使用吸移管將細胞懸浮液添加至管柱中。經抗體標記之細胞（陽性部分）應附著於經受 MACS分離器所提供之磁場的管柱上。未經標記細胞（陰性部分）應流經管柱且經收集。在細胞懸浮液流經管柱且作為陰性部分加以收集之後，可使用每次洗滌500 μΐ之工作緩衝液將管柱洗滌至少3次。各洗滌液可在下一洗滌之前完全流經管柱。可與陰性部分一起收集各洗滌液。可移除約1〇〇 μ1陰性部分以進行分析。可進行使用血球計之細胞計數及使用錐蟲藍之生存力或另一方法。可使用如先前所討論之流式細胞儀或使用另一流式細胞儀方法來進行表型分析。陰性部分可為極冷保藏作準備或可置於培養物中以用於進一步細胞生長及擴增及稍後處理。在收集陰性部分且洗滌管柱之後，可將另一管置於管柱 135827.doc -30_ 200936148 下方以收集陽性部分。可將約i ml工作緩衝液添加至管柱中且移除管柱内形成之磁場。應收集工作緩衝液及陽性部分。可使用活塞以自陽性部分之管柱移除儘可能多之經標記細胞。可移除約100 μ1陽性部分以使用錐蟲藍或流式細㈣來分析包括(但不限於)細胞計數及生存力。陽性部分了極冷保藏、培養或為用於治療用途作準備。 Τ根據如圖i中所示之本發明實施例而|生免疫選擇表現所需細胞標記之細胞的步驟。詳言之，選擇可至少在共〇同培養臍帶血細胞與月經血細胞之步驟後發生。選擇表現某些細胞標記之月 '經血幹細胞的步驟提供表現所選細胞標記之富集細胞的群體，其可用於進一步細胞培養、極冷保藏或治療用途。在一實施例中，自細胞群體選擇經擴増之表現cD34之細胞的步驟包含以抗人類c D 3 4抗體標記經擴增細胞且接著以此夠與抗人類CD34抗體結合之磁標記抗體標記CD34 幹細胞-抗人類CD34抗體複合物。另外，該方法包含以抗人類CD34抗體標記表現CD34之任何細胞且接著以能夠與抗人類CD34抗體結合之磁標記抗體標記CD34細胞-抗人類 CD34抗體複合物。選擇表現CD34之細胞的方法可包括選擇根據本發明實施或擴增之表現CD34之任何細胞。免疫選擇細胞之步驟包含將包含CD34細胞、抗人類CD3 4抗體及磁標記抗體之複合物暴露於磁場以將磁標記抗體及複合物之其餘部分吸引至管柱’且經由管柱洗務所有其他 CD34陰性細胞以進行分析。 135827.doc -31 - 200936148 在選擇表現CD34之細胞的整個步驟中，可將細胞之細胞懸浮液及工作緩衝液（具有DNase之MACS® Separation電泳緩衝液，Miltenyi)保持在冷溫度下。其他磁分離套組亦可適於使用（R&D Systems)。可在約300 g下將細胞懸浮液離心約1〇分鐘。可使小球懸浮於具有抗人類CD34抗體之工作緩衝液中。舉例而言，工作緩衝液可（例如）包含PBS(在約pH 72下）、牛血清白蛋白、EDTA及約0.09%疊氮化物（或合適溶液）(BD Biosciences) »舉例而言，可使小球懸浮於約1〇〇 μ1工作緩衝液與約5 pg對人類CD34具有親和性之經純化抗體中。抗體可為單株或多株抗體。抗體可為經純化IgG或能夠結合人類CD34之其他抗體。抗體可為小鼠抗CD34抗齄。培育包含細胞、工作緩衝液及抗CD34抗體之溶液，歷經一個培育期。舉例而言，培育期可包含在冰上約2〇分鐘至約25分鐘。或者，若溫度為至少約2°C至約8°C，則培育期可縮短至少於約20分鐘，或若至少在室溫下，則培育期可縮短至約5分鐘至約10分鐘。在培育期之後，可以工作緩衝液洗滌具有細胞之溶液以移除未結合之抗體且接著離心。舉例而言，離心可在約30〇 §下發生約10分鐘。在離心之後’吸出上清液且可保留以用於分析，且使小球懸浮於工作緩衝液中。舉例而言，卫作緩衝液之體積可為約⑼ μΐ。將第一批附著有微珠且對抗人類CD34抗體具有親和性的抗體添加至用以懸浮小球之工作緩衝液中。微珠可包含 135827.doc -32- 200936148 (例如）氧化鐵及多醣。微珠可為生物可降解的。可經由 Miltenyi Biotec獲得微珠。舉例而言，對於諸如山羊抗小鼠IgG抗體之對人類CD34具有親和性之抗體而言，第二批抗體具有特異性。抗體可為單株或多株抗體。抗體可能夠與小鼠抗體之輕鏈及/或重鏈結合。例如，抗體可為可作為產品130-048-401而經由Miltenyi Biotee獲得之山羊抗小鼠收微珠共輛物。2 mH、槪之上述山羊抗小鼠邮可用於共計約1.0X109個未分離細胞。 ❹ ❹ 培育細胞懸浮液，歷經第二培育期。舉例而言，培育期可在約30分鐘至約35分鐘之範圍内。或者，當培育在約沈至約代下發生時，培育期可少於約30分鐘，或當培育在約室溫下發生時，培育期可為約5至約ι〇分鐘。在培育期完成之彳m緩衝液（諸如約2 士作緩衝液）洗條細胞，且接著將細胞離心。舉例而言，離心可在約3〇〇 g 下發生約1 0分鐘。可吸屮μ、、本％ J及出上清液且保留以用於分析，且使含細胞之小球懸浮於T作經你子孓作緩衝液（諸如約500 μΐ工作緩衝液）中。細胞分離可使用MS管柱自工作结你^、* . 乍緩衝液中之細胞懸浮液分離CD34 細胞以分_4幹細胞。舉例而！，可使用⑽管柱 rriBi°tee)或其他合適管柱。或者，可使用分離細胞之其他合適方法。可將可經由臟enyi Biotec獲得之包含一單元、多支牟、。 s柱及微珠之MiniMACS套組用於 CD34細胞選擇。可準備以工作緩衝液進行沖洗。 135827.doc •33- 200936148 舉例而言’用以沖洗管柱之工作緩衝液的體積可為約5〇〇 μΐ。將管柱置於可經由Miltenyi Biotec獲得之MACS分離器或提供磁場之合適分離器的磁場中。

❹ 以吸移管或能夠轉移液體體積之其他器件將工作緩衝液中之細胞懸浮液添加至管柱中。由於macs分離器之磁场’將與連接微珠之抗體結合的以抗人類CD34抗體標記之CD34細胞保持在管柱中。任何未經標記細胞均應連同工作緩衝液一起流經管柱且可收集於無菌管中以用於細胞表型化及細胞計數。可將流經管柱之未經標記細胞識別為陰性部分。在添加細胞懸浮液之後，可以工作緩衝液洗滌管柱。舉例而言，可將管柱洗滌至少3次或任何次數，其使得所有或大體上所有未經標記細胞經過管柱。可收集洗滌步驟之流出物以用於細胞表型化及計數。亦可將流出物識別為陰性部分。在洗條管柱之後，可自管柱收集經標記CD34細胞。藉由將無菌管置於管柱下方且自磁場移除管柱來收集經標記 CD34細胞。一旦自磁場移除管柱，經標記CD34細胞即經過管柱且進入無菌管中。可藉由將工作緩衝液添加至管柱中以經由管柱洗滌細胞且視情況藉由以活塞汽提管柱以釋放細胞來洗出管柱中之殘餘經標記CD34細胞。可將所收集之經標記CD34細胞識別為陽性部分。為獲得經標記 CD34細胞之進一步純化群體，陽性部分可視情況在先前所揭不之洗滌程序後至少再一次經過管柱。可將陽性部分在約3〇〇 8下離心約10分鐘且吸出上清液。可使小球懸浮 135827.doc •34- 200936148 於約5 ml工作緩衝液中。以血球計分析陽性部分及陰性部分以獲得活細胞之總計數。藉由流式細胞儀來分析陰性部分以用於表型化。視情況’可使用流式細胞儀使陽性部分表型化。 . 可製備含有表現CD34或其他所需細胞標記之細胞的陽性部分以根據本發明之方法進行極冷保藏。將約i如人血清白蛋白、約3 ml DPBS及約1 ml DMS0添加至約5如陽性部分中。或者，其他培養基亦可用於製備細胞以進行極〇冷保藏之步驟中，諸如完全培養基、牛血清白蛋白、胎牛血清（fetal calf serum)、胎牛血清（feul b〇vine ' 蛋白質血漿部分或自體血清。將含有經擴增細胞之溶液混合且在冰上冷卻約10分鐘。添加約〗ml DMS〇作為冷凍保藏劑。或者，可將約6%HES羥乙基澱粉與約5%dms〇之約^ ml混合物用作冷凍保藏劑。將所得溶液等分至極冷小瓶中。或者，可將所得溶液等分至任何適用於極冷保藏之容器（諸如極冷保藏袋）中。接著，將極冷小瓶極冷保藏於根據本發明之受控速率冷凍器方案的受控速率冷凍器 (Cryomed)中》—旦含有經擴增細胞之溶液實現約_9〇它之目標溫度，即將極冷小瓶轉移至長期儲存冷凍器中且儲存 H135°C或·135°ε以下。或者，可將極冷小瓶或其他合適之極冷保藏容器置於經監測之堆存冷凍器中且冷凍至約-80〇C，且接著將其轉移至在約_135〇c或_135。〇以下的長期儲存冷床器中之液氮之氣相中。經擴增細胞之治療用途 135827.doc •35 ‘ 200936148 可製備藉由本發明獲得之表現CD34之經擴增細胞以用於治療人類病症之治療用途。在一實施例中，可製備經擴增細胞、來自經由共同培養進行之擴增的經免疫選擇 CD3 4細胞或在極冷保藏之後已解束之經擴增細胞以用於靜脈輸注於接受者中。靜脈輸注技術可根據可為細胞輸注於人類中所接受之規範而存在。靜脈輸注可包括經擴增CD34細胞之自體或同種異體輸注。〇經擴增細胞之分化本發明之經擴增CD34臍帶血細胞可能夠分化為體内260 種體細胞中之任一者。舉例而言，該等細胞可能夠分化為至少肝細胞、胰腺細胞、肌原細胞、成骨細胞、軟骨生成細胞、脂肪細胞、上皮細胞、神經細胞、角質細胞及心肌細胞。如在共同培養系統中所見，當與諸如肝細胞、胰腺細胞、肌原細胞、成骨細胞、軟骨生成細胞、脂肪細胞、上皮細胞、神經細胞、角質細胞及心肌細胞之其他易感染 w 細胞一起培養時，該等細胞亦可具有分化能力。自分化獲得之細胞及自共同培養獲得之細胞亦可具有用於以下治療之潛能：替代或再生療法、其他治療應用、藥妝品 (cosmeceutical)、器官排斥療法及其他應用。可製備藉由本發明獲得之表現CD34之經擴増臍帶血細胞以分化為特定細胞系。在一實施例中，可製備經擴增細胞、來自經由共同培養進行之擴增的經免疫選擇CD34細胞或在極冷保藏之後已解凍之經擴增細胞以用於細胞分 135827.doc • 36- 200936148 化。刀化技術可根據可為人類細胞分化所接受之規範而存在。以說明之方式而非限制之方式提供以下實例。尤其根據本文中引用之各種參考文獻的教示（其揭示内容係以全文引用的方式併入），熟習此項技術者將認識到可產生實例中所體現之本發明的變化。

實例1-培養膊帶871R ❹ 根據本申請案中所述且用於臍帶血收集行業中之方法來收集腾帶血細胞871R。臍帶871R細胞之臍帶血樣品在收集後約2天經處理且根據本申請案中所述的臍帶血之處理及極冷保藏方法經極冷保藏。使臍帶871R細胞保持極冷保藏歷時約兩年半。根據本申請案中所述之解凍方法使臍帶871R細胞解凍。培養-培養盤在至/皿下使約3 ml培養基（Methocult #4〇34-半固體培養 ® 基）解凍且接著連同臍帶細胞稀釋液（5〇〇〇〇〇個細胞/mL) 一起置於冰上歷時15分鐘。15分鐘之後’將約03 mi臍帶細胞稀釋液接種於培養基之管中。輕微渦動該管且接著在冰上培育約30分鐘《在培育之後，將培養基及臍帶871R細胞等分至4孔培養盤之前3個孔中。將丨毫升DPBs添加至第四孔中以有助於濕度且在3 7 °C下培育細胞。細胞培養之某此結果係概括於表B中。培養-燒瓶 135827.doc -37- 200936148 使臍帶87 1R細胞經受使經極冷保藏之細胞解凍且接著在 Chang氏完全培養基中經由本申請案中所揭示之離心來洗滌該等細胞之步驟。使細胞小球再懸浮於約7 ml 15% Chang氏完全培養基中。在T25非經組織處理之培養燒瓶中，以7 ml 15°/。Chang 氏完全培養基中約1,000,000個細胞來接種再懸浮之臍帶 871R細胞。在C02培育箱中在約36°C至約38°C下培育細胞。在第一繼代不存在黏附細胞。 ❹ 表 B-M28100RM、M28100RM、M28101R、M28101R+ 871R及871R之培養盤培養 M28100RM M28100RM+ 871R M28101R M28101R+ 871R 871R 每孔10,000 個 BFU-E平均值 2 0.67 0 0 0 CFU-GM 平均值 0.67 3.67 0.33 0 0 CFU- GEMM平均值 0 0 0 0 0 實例2-培養M28100RM月經血細胞根據美國專利公開案第20080241113號之方法，收集約9 ml月經且置於不含具有鈣及鎂之抗生素的DPBS與無防腐劑肝素之所得培養基中，並在約24小時至約48小時内運送至處理設備，藉此收集月經血幹細胞M28100RM。將月經樣品在抗生素中培育24小時，且隨後洗滌，經由離心來濃縮，與10% DMSO冷凍保藏劑混合，且根據美國專利申請 135827.doc •38- 200936148 公開案第20080241113號之教示來極冷保藏。處理M28 1 00RM月經血細胞之月經樣品且在收集之後約 2天將M28100RM月經血細胞極冷保藏。使細胞保持極冷保藏歷時約8個月且接著根據本申請案中所述之方法解凍以形成CFU。培養-培養盤 -在室溫下使培養基（MethoCult #4034-半固體培養基）之三個3 ml管解凍且接著以50,000個細胞/ml、100,000個細 ⑩ 胞/ml及21，600個細胞/ml之細胞稀釋液形式置於冰上歷時 15分鐘。15分鐘之後，將約0.3 ml之各月經血細胞稀釋液接種於Methocult #4034半固體培養基之管中。輕微渦動該等管且接著在冰上培育30分鐘。在培育之後，將培養基及月經血幹細胞等分至4孔培養盤之前3個孔中。將1 ml DPBS添加至第四孔中以有助於濕度，且在37°C下培育細胞。細胞培養之某些結果係概括於表B中。培養-燒瓶 ® 使M28 100RM月經血細胞經受使經極冷保藏之細胞解凍且接著在Chang氏完全培養基中經由本申請案中所揭示之離心來洗滌該等細胞之步驟。使細胞小球再懸浮於約25 ml 1 5% Chang氏完全培養基中。在T25非經組織培養物處理之燒瓶中，以7 ml 15% Chang氏完全培養基中約22 1,000個細胞來接種再懸浮之 M28100RM月經血細胞。在C02培育箱中在約36°C至約38°C 下培育細胞，直至細胞以約70-80%融合。細胞經歷表C中 135827.doc -39- 200936148 所展示之若干繼代。在約三或四天之後出現包含表c中所示之15% Chang氏完全培養基之完全改變的繼代。表C-M28100RM月經血細胞之培養繼代總計數流極冷培養物天數倍增 PD時間(hr) P1 722,656 722,656 0 P2 917,500 917,500 4 1.27 P3 1,136,000 1,136,000 2 1.24 38.77 P4 8,960,000 60,000 5 7.89 15.21 P5 1,060,000 1,060,000 6 17.67 8.15

實例3-培養M28101R 根據美國專利公開案第20080241113號之方法，收集約9 ml月經且在收集於不含具有鈣及鎂之抗生素的DPBS與無防腐劑肝素之所得培養基中約24小時至約48小時内將其運送至處理設備，藉此收集月經血幹細胞M28100RM。將月經樣品在抗生素中培育24小時，且隨後洗滌，經由離心來濃縮，與10% DMSO冷凍保藏劑混合，且根據美國專利申請公開案第20080241113號之教示來極冷保藏。用於M28101R月經血細胞之月經在收集之後經處理且根據本申請案中所述之月經血幹細胞處理及極冷保藏方法在收集之後約3天經極冷保藏。使細胞保持極冷保藏歷時約7 個月。根據本申請案中所述之解凍方法使M28 101R月經血細胞解;東。培養-培養盤在室溫下使培養基（MethoCult #4034-半固體培養基）之三個3 ml管解凍且接著連同M28 10 1R月經血細胞之細胞稀釋液（50,000個細胞/ml、100,000個細胞/1111及216,000個細 135827.doc -40- 200936148 胞/ml)—起置於冰上歷時15分鐘。15分鐘之後，將0.3 ml 之各月經血細胞稀釋液接種於培養基之管中。接著，輕微渦動該等管且接著在冰上培育30分鐘。在培育之後，將培養基中之月經血細胞等分至4孔培養盤之前3個孔中。將1 毫升DPBS添加至第四孔中以有助於濕度且在37°C下培育細胞。細胞培養之某些結果係概括於表B中。培養-燒瓶使M28101R月經血細胞經受使經極冷保藏之細胞解凍且 φ 接著在Chang氏完全培養基中經由本申請案中所揭示之離心來洗滌該等細胞之步驟。使細胞小球再懸浮於約25 ml 15% Chang氏完全培養基中。在T25非經組織培養物處理之燒瓶中，以7 ml 15% Chang氏完全培養基中約724,780個細胞來接種再懸浮之月經血細胞。在C02培育箱中在約36°C至約38°C下培育細胞，直至細胞以約70-80%融合。細胞經歷表D中所展示之若干繼代。在約三或四天之後出現包含表D中所示之15% © Chang氏完全培養基之完全改變的繼代。表D-M28101R月經血細胞之培養繼代總計數流極冷培養物天數倍增 PD時間(hr) P1 2,170,000 2,170,000 0 P2 18,200,000 17,800,000 456,000 4 4.76 20.17 P3 3,760,000 3,500,000 260,000 4 1.73 55.40 P4 1,619,940 1,619,940 5 6.23 19.26 P5 5,170,000 5,032,000 136,000 3 3.19 22.56

實例4-培養M28100RM月經血細胞及臍帶871R 根據美國專利公開案第20080241113號之方法，收集約 135827.doc 41 - 200936148 10 ml月經且在收集於不含具有鈣及鎂之抗生素的與 …、防腐劑肝素之所付培養基中約24小時至約48小時内將其運送至處理設備，藉此收集月經血幹細胞M28100RM。將月經樣品在抗生素中培育24小時，且隨後洗滌，經由離心來濃縮，與10% DMSO冷凍保藏劑混合，且根據美國專利 •申請公開案第20080241 113號之教示來極冷保藏。用於月經血幹細胞M28 100R之月經在收集之後經處理且根據本申請案中所述之月經血幹細胞處理及極冷保藏方法〇在收集後約2天經極冷保藏。使細胞保持極冷保藏歷時約6 個月。根據本申請案中所述之解凍方法使M281 00R細胞解凍。用於濟帶8 71R細胞之膪帶血樣品在收集之後約2天經處理且根據本申請案中所述的臍帶血之處理及極冷保藏方法經極冷保藏。使臍帶871R細胞保持極冷保藏歷時約兩年半。根據本申請案中所述之解凍方法使臍帶871R細胞解凍。 ® 培養-培養盤在室溫下使培養基（]\^111〇(：1111#4034-半固體培養基）之三個3 ml管解凍且接著連同細胞稀釋液（5〇,〇〇〇個M28100R 細胞/ml+500,000個臍帶 871R細胞/ml ; 100,000個 M28100R 細胞/ml + 500,000個臍帶871R細胞/ml ;及216,000個 M28100R細胞/ml+500,000個臍帶871R細胞/ml)—起置於冰上歷時15分鐘^ 15分鐘之後，將0.3 mL在培養基中之各細胞稀釋液接種於培養基之獨立管中。接著，輕微渦動該等 135827.doc -42· 200936148 管且接著在冰上培育30分鐘。在培育之後，將培養基中之各細胞稀釋液等分至獨立4孔培養盤之前3個孔中。將1 ml DPBS添加至各培養盤之第四孔中以有助於濕度，且在 3 7°C下培育細胞。細胞培養之某些結果係概括於表B中。培養-燒瓶使臍帶87 1R細胞及M28 101R月經血細胞獨立地經受使經極冷保藏之細胞解来且接著在Chang氏完全培養基中經由本申請案中所揭示之離心來洗滌該等細胞之步驟。使細胞〇小球再懸浮於約7 ml 15% Chang氏完全培養基中。在T25非經組織培養物處理之燒瓶中，以7 ml 15°/〇 Chang氏完全培養基中約221，400個細胞（具有約1,000,000 個臍帶871R細胞）來接種再懸浮之M28101R月經血細胞。在C02培育箱中在約36°C至約38°C下培育細胞，直至細胞以約70-80%融合。細胞經歷表E中所展示之若干繼代。在約三或四天之後出現包含表E中所示之15 % Chang氏完全培養基之完全改變的繼代。 ® 表E-M28101R月經血細胞及臍帶871R細胞之培養繼代總計數流極冷培養物天數倍增 PD時間(hr) P1 341,028 341,028 0 P2 478,275 478,275 4 1.40 68.45 P3 718,622 718,622 4 1.50 63.89 P4 1,700,037 1,700,037 5 2.37 50.73 P5 5,080,000 4,950,000 127,000 6 84.67 1.70

實例5-培養M28101R +臍帶871R 根據美國專利公開案第20080241113號之方法，收集約9 ml月經且在收集於不含具有鈣及鎂之抗生素的DPBS與無 135827.doc -43· 200936148 防腐劑肝素之所得培養基中約2 4小時至約4 8小時内將其運送至處理没備，藉此收集月經血幹細胞M2 8r。將月經樣品在抗生素中培育24小時，且隨後洗滌，經由離心來濃縮，與10% DMSO冷凍保藏劑混合，且根據美國專利申請公開案第20080241 113號之教示來極冷保藏。 • 用於月經血幹細胞M28101R之月經在收集之後經處理且根據本申請案中所述之月經血幹細胞處理及極冷保藏方法在收集之後約3天經極冷保藏。使細胞保持極冷保藏歷時 ❹ 約6個月。根據本申請案中所述之解凍方法使M281 〇 1R細胞解涞。用於臍帶871R細胞之臍帶血樣品在收集之後約2天經處理且根據本申請案中所述的臍帶血之處理及極冷保藏方法經極冷保藏。使臍帶871尺細胞保持極冷保藏歷時約兩年半。根據本申請案中所述之解凍方法使臍帶871R細胞解凉〇培養-培養盤在室溫下使培養基（MethoCuh #4034-半固體培養基）之三個3 1111管解凍且接著連同細胞稀釋液（5〇,〇〇〇個^1281〇11?_ 細胞/ml+500,000個臍帶 871R細胞/ml ; 1〇〇,〇〇〇個 M28101R 細胞/ml+500,000個臍帶87iR細胞/mi ;及216 〇〇〇個 M28101R細胞/ml+500,000個臍帶871R細胞/ml)—起置於冰上歷時15分鐘。15分鐘之後，將0.3 mi在培養基中之各細胞稀釋液接種於培養基之獨立管中。接著，輕微渦動該等管且接著在冰上培育30分鐘。在培育之後，將培養基中之 135827.doc .44- 200936148 各細胞稀釋液等分至獨立4孔培養盤之前3個孔中。將1 ml DPBS添加至各培養盤之第四孔中以有助於濕度，且在 3 7°C下培育細胞。細胞培養之某些結果係概括於表B中。培養-燒瓶使臍帶8 71R細胞及Μ 2 8 101R月經血細胞經受使經極冷保藏之細胞解柬且接著在Chang氏完全培養基中經由本申請案中所揭示之離心來洗滌該等細胞之步驟。使細胞小球再懸浮於約7 ml 15% Chang氏完全培養基中。 φ 在T25非經組織培養物處理之燒瓶中，以7 ml 15%

Chang氏完全培養基中約724,000個細胞（具有約1,000,000 個臍帶血幹細胞）來接種再懸浮之月經血細胞。在co2培育箱中在約36°C至約38°C下培育細胞，直至細胞以約70-80% 融合。細胞經歷表F中所展示之若干繼代。在約三或四天之後出現包含表F中所示之15% Chang氏完全培養基之完全改變的繼代。表F-M28101R月經血細胞+臍帶871R細胞之培養繼代總計數流極冷接種於培養物中天數倍增 PD時間(hr) P1 1,200,000 1,200,000 0 P2 18,430,000 17,800,000 576,000 4 15.36 6.25 P3 3,380,000 3,380,000 4 5.87 16.36 P4 12,430,000 12,000,000 430,000 3 36.78 1.96 P5 1,450,000 1,450,000 3 3.37 21.35

實例6-培養M2-048 根據美國專利公開案第20080241113號之方法，收集約 9.7 ml月經且在收集於不含具有鈣及鎂之抗生素的DPBS與無防腐劑肝素之所得培養基中約24小時至約48小時内將其 135827.doc -45- 200936148 運送至處理設備，藉此收集月經血幹細胞M2_〇48。將月經樣品在抗生素中培育24小時，且隨後洗條，經由離心來濃縮，與10% DMSO冷凍保藏劑混合，且根據美國專利申請公開案第20080241113號之教示來極冷保藏。用於月經血幹細胞M2-048之月經在收集之後經處理且根 . 據本申請案中所述之月經血幹細胞處理及極冷保藏方法在 -收集之後約3天經極冷保藏。使細胞保持極冷保藏歷時約3 個月。根據本申請案中所述之解凍方法使M2_〇48細胞解 ❹ 束。培養-培養盤在室溫下使培養基（MethoCult #4034-半固體培養基）之二個3 ml管解凍且接著以5〇,〇〇〇個細胞/mi、1〇〇〇〇〇個細胞/ml及216,000個細胞/mi之細胞稀釋液形式置於冰上歷時 15分鐘。15分鐘之後，將約0.3 ml之各M2細胞稀釋液接種於Methocult #4034半固體培養基之管中。輕微渦動該等管且接著在冰上培育30分鐘。在培育之後，將培養基及月經 ® 血幹細胞等分至4孔培養盤之前3個孔中。將1 ml DPBS添加至第四孔中以有助於濕度，且在37°C下培育細胞。培養-燒瓶 -使M2-048月經血細胞經受使經極冷保藏之細胞解凍且接著在Chang氏完全培養基中經由本申請案中所揭示之離心來洗務該等細胞之步驟。使細胞小球再懸浮於約7 m 1 1 5 % Chang氏完全培養基中。在T25非經組織培養物處理之燒瓶中，以7 mi丨5〇/。 135827.doc •46- 200936148

Chang氏完全培養基中約ι，〇〇0,0〇〇個細胞來接種再懸浮之月經血細胞。在C02培育箱中在約36°C至約38°C下培育細胞’直至細胞以約70-80%融合。細胞經歷表G中所展示之若干繼代。在約三或四天之後出現包含表G中所示之15% Chang氏完全培養基之完全改變的繼代。表G-M2-〇48月經血細跑之培養繼代總計數流極冷接種以用於下一繼代天數倍增 PD時間(hr) P7 1,100,000 1,030,000 64,500 3 P8 866,700 866,700 4 13.44 7.14 P9 6,640,000 4,180,000 2,340,000 123,000 3 7.66 9.40 P10 855,000 855,000 3 6.95 10.36 P11 12,620,000 4,780,000 7,610,000 217,500 4 14.76 6.50 P12 1,620,000 1,530,000 89,976 3 7.45 9.67 P13 110,200 110,200 4 1.22 78.38 P14 9,940,000 4,090,000 5,840,000 0 4 90.20 1.06

實例 7-培養M2-048 +混合臍帶（5006-2180舆 5013-2670) 根據美國專利公開案第200802411 13號之方法，收集月經且在收集於不含具有鈣及鎂之抗生素的DPBS與無防腐劑肝素之所得培養基中48小時内將其運送至處理設備，藉此收集月經血幹細胞M2-048。將月經樣品在抗生素中培育 24小時，且隨後洗滌，經由離心來濃縮，與10% DMSO冷凍保藏劑混合，且根據美國專利申請公開案第 20080241113號之教示來極冷保藏。用於月經血幹細胞M2-048之月經在收集之後經處理且根據本申請案中所述之月經血幹細胞處理及極冷保藏方法在收集之後約3天經極冷保藏。使細胞保持極冷保藏歷時約3 個月。根據本申請案中所述之解凍方法使M2-048細胞解 135827.doc -47· 200936148 凍。用於臍帶5006-2180細胞之臍帶血樣品在收集之後約1天經處理且根據本申請案中所述的臍帶血之處理及極冷保藏方法經極冷保藏。使臍帶5006-2180細胞保持極冷保藏歷時約二年。根據本申請案中所述之解凍方法使臍帶5 〇〇6_ • 21 80細胞解凍。用於臍帶50 13-2670細胞之臍帶血樣品在收集之後約i天經處理且根據本申請案中所述的臍帶血之處理及極冷保藏 ® 方法經極冷保藏。使臍帶5013-2670細胞保持極冷保藏歷時約二年《根據本申請案中所述之解凍方法使臍帶5〇〗3_ 2670細胞解凍。培養-培養盤在至溫下使培養基（MethoCult #4034-半固體培養基）之一個3 ml管解凍且接著與5〇〇〇〇個細胞/ml、i〇〇〇〇〇個細胞/ml及216,000個細胞/mi之臍帶5〇〇6_21 8〇細胞稀釋液一起置於冰上歷時15分鐘。15分鐘之後，將約〇 3 ml之各細胞稀釋液接種於Methocult #4034半固體培養基之管中。輕微渦動該等管且接著在冰上培育3〇分鐘。在培育之後，將培養基及月經血幹細胞等分至4孔培養盤之前3個孔中。將 1 ml DPBS添加至第四孔中以有助於濕度，且在3rc下培育細胞。培養-燒瓶在兩個T25非經組織培養物處理之燒瓶中，以7 15%

Chang氏完全培養基中約2 〇〇〇〇〇〇個細胞來接種再懸浮之 135827.doc -48 - 200936148 臍帶5006-2180細胞。在（：02培育箱中在約36°(：至約38°(：下培育細胞，直至細胞以約70-80%融合。細胞經歷若干繼代。在約三或四天之後出現包含15% Chang氏完全培養基之完全改變的繼代。培養-培養盤

在室溫下使培養基（MethoCult #4034-半固體培養基）之兩個3 ml管解凍且接著與50,000個細胞/mL、100,000個細胞/11^及216,000個細胞/111[之臍帶5013-2670細胞稀釋液一起置於冰上歷時15分鐘。15分鐘之後，將約0.3 ml之各M2 細胞稀釋液接種於Methocult #4034半固體培養基之管中。輕微渦動該等管且接著在冰上培育30分鐘。在培育之後，將培養基及月經血幹細胞等分至4孔培養盤之前3個孔中。將1 ml DPBS添加至第四孔中以有助於濕度，且在37°C下培育細胞。表I-臍帶5013-2670之培養盤培養象限1 象限2 象限3 象限4 總計孔 1 BFU-E 2 0 0 0 2 孔2 BFU-E 0 0 2 0 2 孔3 BFU-E 0 1 0 0 1 平均*BFU-E 1.6 孔1GM 0 0 1 0 1 孔2GM 0 0 0 0 0 孔3GM 0 0 0 0 0 平均*GM 0.3 孔 1 GEMM 5 0 1 5 11 孔 2 GEMM 0 3 3 7 13 孔 3GEMM 5 3 7 0 15 平均*GEMM 13 培養-燒瓶 135827.doc -49- 200936148 使臍帶501 3-2670細胞經受使經極冷保藏之細胞解凍且接著在Chang氏完全培養基中經由本申請案中所揭示之離心來洗滌該等細胞之步驟。使細胞小球再懸浮於約7 ml 15% Chang氏完全培養基中。在兩個T25非經組織培養物處理之燒瓶中，以7 ml 15% Chang氏完全培養基中約2,000,000個細胞來接種再懸浮之月經血細胞。在C02培育箱中在約36°C至約38°C下培育細胞，直至細胞以約70-80%融合。細胞經歷若干繼代。在約 ❹ 三或四天之後出現包含15% Chang氏完全培養基之完全改變的繼代。培養-培養盤在室溫下使培養基（MethoCult #4034-半固體培養基）之三個3 ml管解凍且接著連同細胞稀釋液（10,000個M2-048月經血細胞+250,000個臍帶5006-2180細胞/ml ; 10,000個M2-048月經血細胞+250,000個臍帶5013-2670細胞/ml ;及 10,000個M2-048月經血細胞+500,000個臍帶5013-2670細胞/ ® ml)—起置於冰上歷時15分鐘。15分鐘之後，將@0.3 ml之各細胞稀釋液接種於Methocult #4034半固體培養基之獨立 • 管中。輕微渦動該等管且接著在冰上培育30分鐘。在培育 . 之後，將培養基及月經血幹細胞等分至4孔培養盤之前3個孔中。將1 ml DPBS添加至第四孔中以有助於濕度，且在 3 7°C下培育細胞。 135827.doc -50- 200936148 表J-臍帶5013-2670+M2-048之培養盤培養象限1 象限2 象限3 象限4 總計孔 1BFU-E 1 5 1 0 7 孔 2 BFU-E 0 0 0 12 12 孔 3 BFU-E 0 0 0 0 0 平均nBFU-E 6.3 孔1GM 0 2 2 1 5 孔2GM 0 1 3 0 4 孔3GM 0 0 0 0 0 平均*GM 3 孔 1 GEMM 0 0 0 2 2 孔 2 GEMM 0 2 0 0 2 孔 3 GEMM 0 0 0 1 1 平均*GEMM 1.6 培養-燒瓶

在T25非經組織培養物處理之燒瓶中，將1,000,000個取自第4繼代之M2-048月經血細胞及100,000個臍帶5006-2180細胞接種於7 ml 15% Chang氏完全培養基中。將 1，000,000個M2-048月經血細胞及1,000,000個臍帶5013-2670細胞接種於7 ml 15% Chang氏完全培養基中》在胰蛋白酶化之後，將兩個細胞培養物混合為M2-048且混合臍帶 5006-21 80與臍帶5013-2670。在C02培育箱中在約36°C至約38°C下培育細胞，直至細胞以約70-80%融合。細胞經歷若干繼代。在約三或四天之後出現包含15% Chang氏完全培養基之完全改變的繼代。 135827.doc 51 200936148 表K-培養：M2-048_01 P4 +混合之臍帶5006-2180與臍帶5013-2670 繼代總計數流極冷接種以用於下一繼代天數倍增 PD時間(hr) 7 3,420,000 3,240,000 180,000 4 8 1,260,000 1,150,000 104,970 3 7.00 10.29 9 841,000 841,000 3 8.01 8.99 10 9,830,000 4,910,000 4,740,000 175,000 4 11.69 8.21 11 1,976,000 1,976,000 4 11.26 8.53 12 5,720,000 4,420,000 1,3〇〇,〇〇〇 2 2.89 16.58 13 12,110,000 4,540,000 7,190,000 378,000 4 9.32 10.31 14 4,349,000 3,624,000 725,000 5 11.49 10.44

實例6及7之表型分析根據本申請案中所述之方法，使包含第7繼代所收集之 M2-048、臍帶5006-2180及臍帶5013-2670之混合培養物及 M2-048月經血細胞培養物的3,240,000個細胞經受表型分析。表型分析之結果展示於表L中。 135827.doc 52· 200936148 表L-細胞培養物之流式細胞儀分析 M2-048+ 臍帶(混合)P7 曰期：02-05-08 M2-048+ 臍帶(混合)Pll 曰期：02-15-08 M2-048 Pll 曰期：02-15-08 M2-048 P14 曰期：02-26-08 M2-048+ 臍帶(混合)P19 曰期：03-21-08 %POS %POS %POS %POS %POS HLA-I 100 86.6 97.1 98.5 96.6 HLA-I CD133 0 0 0 0 0 CD133 HLA-II 18 70.8 0.2 0.4 0.7 HLA-II CD9 95 81.9 78.6 30.7 38.2 CD9 CD54 0 0 1.5 4 2.3 CD54 CD45 50 23.5 2 5.2 5.8 CD45 CD10 15 59 31.1 27.4 15.2 CD10 CD59 100 82.9 95 99.1 98.3 CD59 CD63 100 7.7 13.1 8 3.8 CD63 CD34 0 85.3 12.1 5.5 20.3 CD34 CD13 83 96.3 98.5 98.3 95.2 CD13 CD49e 88 86.5 94.4 90.4 69 CD49e CD49f 70 93 97.5 96 80.6 CD49f CD81 100 91.4 96.3 94.1 93.8 CD81 CD44 100 86.4 93.2 99.4 99 CD44 CD117 0 0 0 0 0 CD117 CD38 0 0 0 0 0 CD38 CD29 100 98.4 95 99.4 98.1 CD29 CD105 98 91.8 96.9 98.6 96.2 CD 105 CD90 98 93.1 95.6 94.1 92.4 CD90 CD166 99 91.7 97.3 98.8 98.8 CD 166 NANOG ND 1 0.1 ND 0.6 NANOG SSEA3 0 0 0 ND 0 SSEA3 SSEA4 0 43.9 44.9 ND 2.6 SSEA4 CD3 ND 0 0 0 0 CD3 CD19 ND 0 0 0 0 CD19 CD14 ND 0 0 0 0.2 CD14 CD56 ND 0 0 0 0 CD56 CD41 ND 85 97.8 98.7 95.6 CD41 實例8-培養各種濃度之M2-048月經血細胞、5006-2180 臍帶細胞及5013-2670細胞在室溫下使培養基（MethoCult #4034-半固體培養基）之七個3 ml管解凍且接著連同細胞稀釋液（25，000個細胞之 5006-2180臍帶細胞/ml ; 25,000個細胞之5013-2670臍帶細 135827.doc -53- 200936148 胞/ml ; 50,000個細胞之5013-2670臍帶細胞/ml ; 1，000個細胞之M2-048/ml ; 25,000個細胞之M2-048 + l，000個細胞之 5006-2180臍帶細胞/ml ; 25,000個細胞之M2-048+l,000個細胞之5013-2670臍帶細胞/1111;及50,000個細胞之1^2-048+1，000個細胞之5013-2670臍帶細胞/ml)—起置於冰上歷時15分鐘。15分鐘之後，將各細胞稀釋液接種於 Methocult #4034半固體培養基之獨立管中。輕微渦動該等管且接著在冰上培育30分鐘。在培育之後，將培養基及月經細胞、腑帶細胞及月經血及腾帶細胞組合各自等分至七個不同的4孔培養盤之孔中以進行培育。將1 ml DPBS添加至七個不同的4孔培養盤各自之第四孔中以有助於濕度，且在37°C下培育細胞。表 M-臍帶 5006-2180 細胞、臍帶 5013-2670 細胞、M2-048 月經血細胞、M2-048月經血細胞+臍帶5006_2180細胞、 M2-048月經血細胞+臍帶5013-2670細胞及M2-048月經血細胞+臍帶5013-2670細胞之培養盤培養樣品ID 每孔簖帶細胞/每孔M2細胞 BFU-E 平均值 CFU-GM 平均值 CFU-GEMM 平均值培養天數 5006-2180 25,000 52.7 14.3 0 16 5013-2670 25,000 0.3 1.6 0.6 16 5013-2670 50,000 1.6 0.3 13 16 M2-048 P4 1,000 0 0 0 23 M2-048 P4 及5006-2180 25,000/1,000 27 11.3 2 16 M2-048 P4 及5013-2670 25,000/1,000 5.6 4.3 1.6 16 M2-048 P4 及5013-2670 50,000/1,000 6.3 3 1.6 16 儘管已展示且描述了本發明之較佳實施例，但熟習此項 135827.doc -54- 200936148 技術者顯而易見在本發明之較廣泛態樣中在不脫離本發明的清況下了進行多種改變及修改。因此，隨附申請專利範圍意欲涵蓋所有屬於本發明之真實精神及範疇内的此等改變及修改。【圖式簡單說明】圖1展示本發明之示意性流程圖。圖2a及2b為對於實例所述之造血群落形成細胞而 & ’在解凉·之後經塗舖且在Methocult 4053半固體曱基纖維素培養基中培養的臍帶871R細胞之細胞培養物的相片。臍帶871R細胞係以每孔5〇〇〇〇個細胞塗鋪於每孔1 ml培養基中。圖2a為在細胞培養8天後之細胞相片（2〇〇x)。圖2b為在細胞培養9天後之細胞相片（4〇x)。圖2a及2b說明在無群落形成單位（CFU)生長之情況下在半固體培養基中存在游離細胞。圖3a-31為對於實例2中所述之CFU而言，在甲基纖維素培養基中培養之M28100RM月經血細胞的相片。圖3a為展示BFU-E之培養物中細胞之相片（i〇〇x)，其說明在每孔塗鋪10,000個細胞且細胞培養8天之後由於血色素產生而引起之紅色調。圖3b為對於群落形成單位而言，在培養8天之後甲基纖維素培養基中之游離細胞的相片（100χ) «»圖3c 及3d為展示BFU-E之培養物中細胞的相片（20〇χ)，其說明在以每孔21，600個細胞塗鋪細胞且在細胞培養物中8天之後由於血色素產生而引起之紅色調。圖3e為在以每孔 5,000個細胞塗鋪細胞且培養8天之後展示初始BFU-E產生 135827.doc •55· 200936148 之培養物中細胞的相片（4Gx)。圖3f、化及儿為展示酬_e 之培養物中細胞之相片（分別為100X、100X及4GX)，其說明在每孔塗鋪1〇,000個細胞且細胞培養9天之後由於血色素產生而引起之紅色調。圖3卜3j及3k為展示BFU-E之細胞。養物之相片（分別為1〇〇χ、1〇〇χ及4〇χ)，其說明在每孔塗鋪21，600個細胞且培養9天之後由於血色素產生而引起之紅色調。圖31為在此濃度下無群落形成可能之情況下’培養基中游離細胞之相片。圖4a-4d為每孔塗鋪5 〇〇〇、1〇〇〇〇及216〇〇個細胞之 M28101R月經血細胞的相片。圖钝為在以每孔1〇,〇〇〇個細胞塗鋪M28 101R月經血細胞且細胞培養8天之後，展示 CFU-GM之培養物中細胞之相片（4〇χ)。圖仆為在以每孔 10,000個細胞塗鋪細胞且培養9天之後展示CFu_gm產生之培養物中細胞的相片（4〇x)。圖4c為在以每孔21，6〇〇個細胞塗鋪細胞且細胞培養數天之後展示BFU-E產生之培養物中細胞的相片（10〇χ)。圖4d為在以每孔5,000個細胞塗鋪細胞且細胞培養9天之後游離細胞之相片（4〇X)。圖5a-5g為實例4中所述之M28100RM月經血細胞與臍帶 871R細胞之共同培養相片。圖5d為具有以每孔5,〇〇〇個細胞塗鋪之月經血細胞及以每孔50,000個細胞塗鋪之臍帶血細胞的部分CFU-GM在培養9天後之相片（4〇χ)。圖5a、5e 及5g展示以每孔10,000個細胞塗鋪之M28100RM月經血細胞及以每孔50,000個細胞塗鋪之臍帶871R細胞在培養8天 (圖5a及5e)及培養9天（圖5g)之後的相片（100x)。圖5a及5e 135827.doc -56- 200936148 說明CFU-GM群落形成。圖5g說明BFU-Ε群落形成。圖 5b、5c及5f為以每孔21，600個細胞塗鋪之M28100RM月經血細胞及以每孔50,000個細胞塗鋪之臍帶871R細胞在細胞培養8天（圖5b及5c)及培養9天（圖5f)之後的相片（分別為 20〇χ 、 10〇χ及10〇χ) 〇圖6a-6c為實例5中所述之M28101R月經血細胞與臍帶 > 871R細胞之共同培養相片。圖6a、6b及6c說明甲基纖維素半固體造血培養基中之游離細胞。單獨培養之M28 101R月 _ 經血細胞在以不同濃度塗鋪時能夠產生CFU-GM及BFU- E。 e 135827.doc -57-

Claims

200936148 十、申請專利範圍： 1. 一種表現CD34之人類細胞之群體，其係獲自人類臍帶血細胞在具有促進該等人類臍帶血細胞的群體倍增之人類月經血細胞之合適培養條件中的擴增。 2. 如請求項1之人類細胞之群體，其中該人類細胞之群體 •亦表現SSEA4。 . 3 ·如請求項1之人類細胞之群體，其中該人類細胞之群體亦表現HLA-II。 φ 4.如請求項1之人類細胞之群體，其中使該表現CD34之人類細胞之群體懸浮於冷凍保藏劑、培養基、生長培養基或分化培養基之任一者中。 5. 如請求項1之人類細胞之群體，其中該表現CD34之人類細胞之群體為至少兩次或兩次以上群體倍增之結果。 6. 如請求項1之人類細胞之群體，其中該人類細胞之群體能夠產生以下任一者：群落形成單位（colony forming units)、群落形成單位粒細胞（CFU-GM)巨噬細胞（colony 〇 forming unit granulocyte macrophages)、爆式形成單位紅血球（burst forming unit erythroids; BFU-E)及群落形成單 .位粒細胞紅血球巨噬細胞巨核細胞血液系前驅體細胞 (colony forming unit granulocyte erythrocyte macrophage megakaryocyte blood lineage precursor cells; CFU-GEMM)。 7. —種表現CD34之人類臍帶血細胞的群體，其係藉由包含以下之方法而獲得： 135827.doc 200936148 在適於臍帶血幹細胞擴增的條件下共同培養足量之該等臍帶血幹細胞與足量月經血幹細胞；及經由至少兩次群體倍增使該等足量臍帶血細胞在培養物中增殖。 8·如請求項7之方法，其中該方法進一步包含使該等足量臍帶jk細胞在培養物中生長以產生以下任一者之步驟： ' 群落形成單位（CFU)、群落形成單位粒細胞巨噬細胞 (CFU_GM)、爆式形成單位紅血球（BFU-E)及群落形成單 ® 位粒細胞紅血球巨噬細胞巨核細胞血液系前驅體細胞 (CFU-GEMM) 〇 9. 如請求項7之方法，其中該方法進一步包含在使該等足篁膊帶血細胞在培養物中增殖之後分離表現Cd34之臍帶血細胞的步驟。 10. 如請求項7之方法，其中該方法進一步包含在使該等足量臍帶血細胞在培養物中增殖之後冷凍保藏該表現CD34 之人類臍帶血細胞的群體之步驟。 ® 11.如請求項7之方法，其中該表現CD34之人類臍帶血細胞的群體在於合適培養條件下使該等足量臍帶血細胞增殖之後亦表現HLA-II。 12. 如請求項7之方法，其中該表現CD34之人類臍帶血細胞的群體在於合適培養條件下使該等足量臍帶血細胞增殖之後亦表現SSEA4。 13. 如請求項7之方法，其中該使該等足量臍帶血細胞在培養物中增殖包含使該等臍帶血細胞生長以產生以下任一 ° 135827.doc 200936148 者：群落形成單位、群落形成單位粒細胞巨噬細胞 (CFU-GM)、爆式形成單位紅血球（BFUE)及群落形成單位粒細胞紅企球巨噬細胞巨核細胞血液系前驅體細胞 (CFU-GEMM)。 14. 一種獲得經擴增之表現CD34之人類臍帶血細胞的方法， " 該方法包含： ’ 在適於促進臍帶金細胞擴增之共同培養條件下以足量月經血細胞接種足量之該等臍帶血細胞；及 ® 在支持該等濟帶血細胞的至少兩次或兩次以上群體倍增之培養條件下共同培養該等臍帶血細胞與該等月經血細胞。 15. 如請求項14之方法，其中該共同培養該等表現CD34之人類臍帶血細胞包含擴增臍帶血細胞以表現ssea_4及 HLA-II中之至少一或多者。 16. 如請求項15之方法，其中該等經擴增人類臍帶血細胞表現高含量之CD34 » ® 17·如請求項14之方法’其中該共同培養該等臍帶血細胞包含擴增臍帶血細胞以產生以下任一者：群落形成單位、群落形成單位粒細胞巨噬細胞（CFU_GM)、爆式形成單 . 位紅血球（BFU-E)及群落形成單位粒細胞紅血球巨噬細胞巨核細胞血液系前驅體細胞（CFU_GEMM)。 18.如叫求項14之方法，其中該方法進一步包含以下步驟中之至少一者：關於CD34免疫選擇經擴增人類臍帶血細胞，自培養物分離經擴增人類臍帶血細胞以用於輸注於 135827.doc , 200936148 人類中，極冷保藏經擴增人類臍帶血細胞，或將經擴增腾帶jk細胞分化為細胞系。 19·如請求項14之方法，其中該方法包含使經擴增人類臍帶血細胞生長以產生以下任一者的步驟：群落形成單位、群落形成單位粒細胞巨噬細胞（CFU-GM)、爆式形成單位紅企球（BFU-E)及群落形成單位粒細胞紅血球巨嗔細胞巨核細胞血液系前驅體細胞（CFU-GEMM)。

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