KR102676517B1

KR102676517B1 - 생리혈로부터 줄기세포를 수득하는 방법

Info

Publication number: KR102676517B1
Application number: KR1020210089848A
Authority: KR
Inventors: 박정원
Original assignee: 박정원
Priority date: 2021-07-08
Filing date: 2021-07-08
Publication date: 2024-06-20
Anticipated expiration: 2041-07-08
Also published as: KR20230009167A

Abstract

본 발명은 생리혈로부터 줄기세포를 수득하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 말초혈액을 원심분리하여 혈장층과 버피코트층을 수득하는 단계와, 상기 수득된 혈장층과 버피코트층을 생리혈과 혼합하는 단계와, 상기 혼합된 혼합혈을 피콜(Ficoll) 처리하고 원심분리하여 단핵세포를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 의하면, 소량의 생리혈과 말초혈만으로 줄기세포를 용이하게 수득할 수 있으며, 세포에 가해지는 손상이 없고 증식률이 높아 줄기세포의 퀄리티를 향상시킬 수 있다는 장점이 있다.

Description

생리혈로부터 줄기세포를 수득하는 방법{METHOD FOR OBTAINING STEM CELL FROM PERIOD BLOOD}

본 발명은 생리혈로부터 줄기세포를 수득하는 방법에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 일반적으로 줄기세포는 세포의 기원에 따라 배아줄기세포(Embryonic stem cells, ESCs)와 성체줄기세포(Adult Stem Cells, ASCs)로 분류할 수 있다.

성체줄기세포는 태아조직에서 분리된 줄기세포가 진정한 성체에서 분리된 줄기세포와 다른 특성이 있다는 것이 확인되면서 조직줄기세포(Somatic Stem Cells, SSCs) 라는 용어로 대체되는 경향이 있다. 그러나 태아 혹은 성체에서 분리된 줄기세포는 모두 간엽줄기세포(Mesenchymal stem cells, MSCs)를 정의하는 기준에 부합하므로 최근에는 배아줄기세포에 반대되는 개념으로 MSCs를 분류하여 정의하고 있다.

이러한 간엽줄기세포는 생리혈로부터 수득할 수도 있는바, 생리혈로부터 줄기세포를 수득하는 방법은 여성의 질에 2~3시간 동안 생리컵을 장착하고, 상기 생리컵에 받아진 생리혈을 수집하여 Ficoll 처리하여 단핵세포를 수득하고, 이를 배양하는 방법이다. 생리혈에서 떨어져 나온 자궁내막조직 유래 줄기세포는 여성이 매달 월경시 자궁내막에서 탈락되어 나오는 조직으로 수술적인 방법이 필요치 않다.

그러나 이러한 방법은 생리혈을 수집하는 데 장시간이 소요되고, 생리혈의 오염 가능성 역시 크다는 단점이 있었다. 또한, 장시간에 걸쳐 생리혈을 수집하더라도 수집된 생리혈의 양이 적고, 이로부터 다시 조직을 분리하고 나면 그 양이 현저히 적어 피콜-하이팩 용액(Ficoll-Hypaque)을 이용하여 단핵세포를 수득하는데 어려움이 있었다.

또한, 말초혈로부터 줄기세포를 수득하는 방법 역시 제안되었다. 이러한 말초혈의 줄기세포는 말초혈 내에 미량 존재하는바, 말초혈액만으로는 분리할 수 있는 중간엽 줄기세포의 수가 너무 적고, 증식이 원활하지 않은 경우가 대부분이기 때문에 이용이 어렵다는 단점이 있었다.

따라서, 수득이 용이하며, 세포 손상률이 낮고 증식률이 우수한 줄기세포 수득방법이 요구되고 있다.

KR

10-2018-0012223

A

Fukuchi Y et al, Stem Cells 22:649~658, 2004 Wulf GG et al, Tissue Eng 10:1136~1147, 2004 Dominnici M et al, Cytotherapy 8:315~317, 2006 Science 276, 71-74, 1997; Science 284, 143-147, 1999;Science 287, 1442-1446, 2000 Proc Natl Acad Sci USA 96, 14482-14486,1999; Nature 401, 390-394, 1999 Tissue Eng 7, 211-228, 2001

따라서, 본 발명의 목적은 생리혈과 말초혈장을 혼합하고, 이로부터 단핵세포를 분리함으로써, 소량의 생리혈과 말초혈장만으로 줄기세포를 용이하게 수득할 수 있는 것은 물론, 세포 손상률이 낮고 증식률이 우수한 줄기세포 수득방법을 제공하는 데 있다.

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상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 생리혈로부터 줄기세포를 수득하는 방법은, 말초혈을 원심분리하여 혈장층과 버피코티층을 수득하는 단계와, 상기 수득된 혈장층과 버피코티층을 생리혈과 혼합하는 단계와, 상기 혼합된 혼합혈을 피콜(ficoll) 처리하고 원심분리하여 단핵세포를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 수득된 혈장층과 버피코티층을 생리혈과 혼합하는 단계는, 상기 혈장층과 버피코트층 및 생리혈을 1:0.3~1.0 부피비로 혼합하는 것을 특징으로 한다.

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본 발명에 의한 생리혈로부터 줄기세포를 수득하는 방법은, 소량의 생리혈과 말초혈만으로 줄기세포를 용이하게 수득할 수 있으며, 세포에 가해지는 손상이 없고 증식률이 높아 줄기세포의 퀄리티를 향상시킬 수 있다는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1에 의해 분리된 간엽줄기세포의 특성을 나타낸 그래프.
도 2는 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1에 의해 분리된 간엽줄기세포의 모양을 나타낸 사진.
도 3은 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1에 의해 분리된 간엽줄기세포의 증식능 평가 결과를 나타낸 그래프.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서의 줄기세포란 생리혈 및 말초혈 유래의 간엽줄기세포임을 밝혀둔다.

본 발명에 의한 생리혈로부터 줄기세포를 수득하는 방법에 대해 상세히 설명한다.

본 발명에 의한 줄기세포의 수득방법은, 말초혈을 원심분리하여 혈장층과 버피코티층을 수득하는 단계와, 상기 수득된 혈장층과 버피코티층을 생리혈과 혼합하는 단계와, 상기 혼합된 혼합혈을 피콜(ficoll) 처리하고 원심분리하여 단핵세포를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

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말초혈을 원심분리하여 혈장층과 버피코트층을 수득하는 단계

말초혈액을 원심분리하여 혈장층과 버피코트(Buffy coat)층을 함께 수집한다. 이러한 수집방법은 종래기술에 의한다.

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상기 수득된 혈장층과 버피코트층을 생리혈과 혼합하는 단계

상기 수득된 혈장층과 버피코트층을 생리혈과 혼합한다. 즉, 본 발명은 말초혈로부터 분리된 자가세포를 이용하여 적은 양의 생리혈로부터 양질의 줄기세포를 수득하는 것으로, 혈장층과 버피코트층 및 생리혈과 혼합한 혼합혈을 이용하여 ficoll로 단핵세포를 분리할 경우 층 분리의 어려움이 없고, 공정 중 세포에 가해지는 손상이 적으며, 생존율이 현저히 높아져 생리혈 및 말초혈 유래의 줄기세포 퀄리티를 향상시킬 수 있게 된다. 이때, 동일인의 말초혈액과 생리혈을 이용함은 당연하다.

이때, 그 혼합비는 혈장층과 버피코트층 및 생리혈이 1:0.3~1.0 부피비 정도임이 바람직한바, 생리혈이 상기한 비율보다 낮을 경우 증식능이 낮아지게 되고, 상기한 비율보다 높을 경우 세포 손상률이 높아지기 때문이다.

상기 혼합된 혼합혈을 피콜(ficoll) 처리하고 원심분리하여 단핵세포를 분리하는 단계

다음으로, 상기 혼합된 혼합혈에 PBS(Phosphate-buffered saline) 및 피콜(ficoll)을 넣어 혼합한 후, 원심분리한다. 상기 원심분리를 통해 혈청층, 단핵구충, 피콜층, 적혈구 및 다핵구층으로 분리되는바, 이 중 단핵구층, 즉 단핵세포만을 분리한다.

그리고 이 단핵세포를 통상 이 기술이 속하는 분야에서 공지된 방법으로 배양함으로써, 줄기세포를 수득한다.

상기와 같은 방법을 이용하면 소량의 생리혈 및 말초혈만으로 세포의 손상 없이 증식률이 우수한 단핵세포를 손쉽게 분리할 수 있어, 양질의 줄기세포를 수득할 수 있다는 장점이 있다.

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이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다.

(실시예 1)

동일한 환자의 말초혈액과 생리혈을 준비하였다. 그리고 상기 말초혈액을 원심분리하여 버피코트층과 혈장층을 수득하였다.

다음으로, 상기 버피코트층과 혈장층 및 생리혈을 1:0.5 부피비로 혼합하고, 이 혼합혈 10ml에 PBS(Phosphate-buffered saline) 30ml 및 Ficoll 10ml를 첨가한 후, 2,500rpm, 25℃ 조건에서 30분간 원심분리 하였다. 그리고 이로부터 단핵구층, 즉 단핵세포만을 분리하였다.

그리고 분리한 단핵세포를 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS), 0.1mM 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol), 1% 비필수 아미노산(nonessential amino acids) 및 항생제 (penicillin/streptomycin)가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle'sMedia) 배양액에서 세척하고, 부유하여 37℃ 및 5% CO₂의 가습 배양기(humidified chamber)에서 배양하였다. 세포들이 증식하여 배양 접시 표면에서 밀도가 높아져 거의 꽉 찼을 때(confluent) 계대 배양하고, 이때를 1계대로 정하였다. 계대배양 과정은 5회 반복하여 줄기세포를 수득하였다.

(비교예 1)

실시예 1과 동일하게 실시하되, 생리혈만을 이용하여 Ficoll 처리하고, 단핵세포를 분리하였다.

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(시험예 1)

형광 활성화 세포 분류 분석기(FACS)를 이용하여 hEnMSCs의 특성을 확인하였다. hEnMSCs의 표면 항원을 분석하기 위하여 세포를 2mM EDTA/5% FBS를 첨가한 PBS로 수거하고, PBS로 두 번 세척하였다. 그 후 세포를 2% FBS/PBS 완충액에 넣고, 적당한 비율로 희석된 fluorescein isothiocyanate(FITC) 또는 phycoerythrin(PE)가 결합된 항체(Becton, Dickinson and Company, CA, US)를 첨가하여 4℃에서 30 분간 처리하였다. FACS Canto™II (Becton, Dickinson and Company, NJ, US)로 세포의 형광발현을 측정하고, FlowJo(Becton, Dickinson and Company, NJ, US) 프로그램을 사용하여 결과를 분석하였다. 그리고 그 결과를 하기 표 1 및 도 1에 나타내었다.

실시예 1 및 비교예 1에서 중간엽 줄기세포의 표지마커를 확인한 결과, 표 1 및 도 1에서와 같이, 실시예 1 및 비교예 1 두 그룹에서 모두 97% 이상의 CD29(+), CD34(-), CD45(-), CD73(+), CD90(+), CD105(+) 양상을 보였다. 이러한 결과는 이미 보고된 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)의 대표적 표지인자의 발현 양상과 일치한다.

실시예 1 및 비교예 1에 의해 분리된 중간엽 줄기세포의 세포 특이적 표면마커 비교

구분	실시예 1(%)	비교예 1(%)
CD29-positive	100	100
CD34-negative	99.9	100
CD45-negative	97.8	99.7
CD73-positive	100	100
CD90-positive	98.3	97.1
CD105-positive	99.7	100

(시험예 2)

상기 실시예 1 및 비교예 1의 단핵세포를 배양하면서, 그 proliferation assay를 실시하여 형태를 관찰하였다. 그리고 그 사진을 첨부된 도 2에 나타내었다.

단핵세포 분리부착 후 1일째, 실시예 1 및 비교예 1에서 단핵세포의 콜로니화가 형성된 것을 관찰하였으며, 비교예 1에 비해 실시예 1에서 더 많은 콜로니를 관찰하였다. 동일한 조건으로 계대배양한 결과 실시예 1은 점차적으로 세포수가 증가되면서, 양호한 세포 형태가 관찰된 반면, 비교예 1은 다소 손상된 형태의 세포가 다수 발견되었다. 따라서, 본 발명에 의한 방법은 세포의 손상률을 떨어뜨리고 생존율을 높여 줌을 확인할 수 있었다.

(시험예 3)

상기 실시예 1 및 비교예 1의 세포를 10일간 배양하면서 증식률을 ELISA를 이용하여 평가하였다. Passage 2의 MSCs 세포를 96well plate에 2000cell/well로 분주한 후 동일한 조건의 배양배지에 5% CO₂, 37℃ 환경으로 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 24시간 후 CCK-8(10μL / well) 용액을 각 웰에 첨가하여 2시간동안 배양 후 세포 생존력을 측정하였다. 450nm 파장에서의 Optical density(O.D)는 Multiskan High(Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA)를 사용하여 측정하였으며, 동일한 방식으로 배양일로부터 1일, 3일, 4일, 7일, 10일 후 살아있는 세포의 수(생존율)를 측정하였다. 그리고 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 세포의 증식은 배양 후 4일까지는 실시예 1 및 비교예 1에서 비슷한 증식률을 보였으나 7일 이후부터는 비교예 1에 비해 실시예 1에서의 증식률이 유의하게(Mann-Whitney U test, p-value = 0.021) 높아짐을 확인할 수 있었다.

이상, 본 발명을 바람직한 실시예를 사용하여 상세히 설명하였으나, 본 발명의 범위는 특정 실시예에 한정되는 것은 아니며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 해석되어야 할 것이다. 또한, 이 기술분야에서 통상의 지식을 습득한 자라면, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서도 많은 수정과 변형이 가능함을 이해하여야 할 것이다.

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Claims

말초혈액을 원심분리하여 혈장층과 버피코트층을 수득하는 단계와,
상기 수득된 혈장층과 버피코트층을 생리혈과 혼합하는 단계와,
상기 혼합된 혼합혈을 피콜(Ficoll) 처리하고 원심분리하여 단핵세포를 분리하는 단계를 포함하며,
상기 수득된 혈장층과 버피코티층을 생리혈과 혼합하는 단계는,
상기 혈장층과 버피코트층 및 생리혈을 1:0.3~1.0 부피비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 생리혈로부터 줄기세포를 수득하는 방법.
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