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TW200844226A - Novel immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease - Google Patents

Novel immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease Download PDF

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TW200844226A
TW200844226A TW096149621A TW96149621A TW200844226A TW 200844226 A TW200844226 A TW 200844226A TW 096149621 A TW096149621 A TW 096149621A TW 96149621 A TW96149621 A TW 96149621A TW 200844226 A TW200844226 A TW 200844226A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
polypeptide
sequence
seq
composition
acid sequence
Prior art date
Application number
TW096149621A
Other languages
English (en)
Inventor
Gary W Zlotnick
Original Assignee
Wyeth Corp
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Filing date
Publication date
Application filed by Wyeth Corp filed Critical Wyeth Corp
Publication of TW200844226A publication Critical patent/TW200844226A/zh

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Description

200844226 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於奈虛磨ORF2086蛋白質（亞族A及亞族B)， 八了自諸如彼專奈遂琢禮之細菌菌株分 離’包括廣廣f奈层磨（血清群Α、β、C、D、W-135、 X、X、、淋病奈瑟菌、Neisseria gonorrhoeae、反乳
糖奈瑟菌{Neisseria lactamica)之亀铢，认反諫專蛋台嚷t 免疫原性部分及/或生物相等物。本發明亦係關於與該等 蛋白質、免疫原性部分及/或生物相等物免疫特異性結合 之抗體。此外，本發明係關於經分離之聚核苷酸，其包含 編碼上述蛋白質、免疫原性部分、生物相等物及/或抗體 之任一者之核酸序列。另外，本發明係關於免疫原性組合 物及其在預防、治療及/或診斷由廢廯爻奈茗磨（见 meW叹"油»引起之腦膜炎球菌感染及尤其由廢廯爻奈彥 磨血清群B引起之腦膜炎球菌疾病中的用途，以及用於製 備該等組合物之方法。本發明係關於重組形式及自天然來 源分離之形式兩者，以及脂質化及非脂質化形式兩者。 【先前技術】 腦膜炎球菌性腦膜炎係一種儘管可利用抗生素但仍可在 數小時内致兒童及年輕人死亡之致命性疾病。pizza等人， 2000»_ 287:1816-1820。腦膜炎之特徵為腦膜發炎， 從而產生劇烈頭痛、發熱、食慾不振、光聲不耐受、肌肉 僵硬、尤其在頸部，且在嚴重情況下為痙攣、嘔吐及譫 妄’導致死亡。腦膜炎球菌性腦膜炎之症狀突然出現且： 127230.doc 200844226 伴隨其特徵性出血性皮疹之腦膜炎球菌性敗血症時達到頂 點。若存在任何存活機會，則快速診斷及用大劑量抗生素 即日rr冶療至關重要。2000.万⑽仏所
Third Edition 302 〇 腦膜炎球菌性腦膜炎係由靥廯义奈荔磨（腦膜炎球菌）， 一種革蘭氏陰性（Gram-negative)有莢膜細菌引起，已將其 分為若干病原性血清群，包括A、b、c、D、W-135、X、 Y、Z及29E。在全世界，廢腐爻奈蘑磨之血清群B菌株為 腦膜炎球菌疾病之主要病因。舉例而言，據醫學文獻報 導’血清群B造成居住於美國及歐洲之嬰兒及兒童中約 50。/。之細菌性腦膜炎。目前不存在預防由腐廯芡奈瑟磨血 清群B引起之腦膜炎球菌疾病之疫苗。 自二十多年前Goldschneider等人之工作以來，開發用於 預防血清群B腦膜炎球菌疾病之免疫原性組合物已對研究 人員提出挑戰。Goldschneider等人，1969，《/·五;φ·撕j 129(6):1307-26 ; Goldschneider等人，1969，J· j 129(6):1327-48 ; Gotschlich 等人，1969，J•五；cp.从从 129(6):1385-95 ;及 Gotschlich 等人，1969，J•五;φ·施a 129(6):1367-84。不同於在二次大戰後實際上已自北美消 失之A清群A疾病，由血清群B&C生物體引起之疾病仍在 大部分經濟發達地區具有地方性，Achtman，M.，1995 Trends in Microbiology 3(5):186-92。疾病之發病率係在小 於1/100,000範圍内變化，其中地方性疾病在流行病流行期 間高危群體中之發病率較低，為200/100,000。 127230.doc 200844226 已開發對抗腐廯爻奈瑟磨血清群A及C之基於多醣結合 物之疫苗且似乎有效預防疾病。目前，可利用由來自血清 群A、C、Y及W-1 3 5之莢膜多醣製成之免疫原性組合物。
Ambrosch等人 ’ 1983，Immunogenicity and side-effects of a new tetravalent. Bulletin of the World Health Org·kaizen 61 (2):3 17-23。然而，此免疫原性組合物引起 T細胞非依賴性免疫反應，在幼兒中並不有效，且不覆蓋 血清群B菌株，其引起超過50%之腦膜炎球菌疾病。 其他人亦已試圖使用莢膜多醣開發免疫原性組合物。最 近，藉由將血清群C莢膜物質與蛋白質結合所製備之用於 血清群C疾病之免疫原性組合物已在歐洲許可使用。然 而’血清群B莢膜可能不適合作為疫苗候選物，因為莢膜 多at包含與使人類神經組織發育之碳水化合物部分具有相 似性之聚唾液酸。將此糖部分視作自體抗原且因此在人體 内具有弱免疫原性。 外膜蛋白（OMP)已開發作為用於血清群B疾病之替代疫 苗抗原。與PorA之兩個可變區結合之單株抗體定義用於腦 膜炎球菌之血清亞型分類方案。P〇rA蛋白質因此用作腦膜 炎球菌菌株之血清亞型分類抗原（Abdillahi等人，1988, Mz’erMk/ P4(1):27-32)且正在積極地研究作為 血清群B免疫原性組合物之組份（p〇〇iman，1996， 扪〇/_ 397:73-7)，因為其可引出殺菌性抗體 (Saukkonen，1987，Mz.croMa/ 3(4):261-7)。認 為殺菌性抗體為保護之指示物且任何新免疫原性組合物候 127230.doc 200844226 選物應引出此專功能性抗體。 對人類以及動物之研究表明血清亞型分類抗原p〇rA引出 殺菌性抗體。然而，對PorA之免疫反應通常具有血清亞型 特異性。詳言之，血清亞型分類資料表明由p〇rA製成之免 疫原性組合物可能需要用於由該免疫原性組合物所涵蓋之 各血清亞型的PorA，或許多達六至九種。因此，6_9種 PorA將需要涵蓋70-80%之血清群B菌株。因此，此蛋白質 之可變性質需要多價疫苗組合物以防止足夠多之腦膜炎球 菌血清亞型臨床分離株。 開發用於血清群B腦膜炎球菌之免疫原性組合物如此困 難，以致最近若干小組已對來自代表血清群八及8兩者之 菌株之基因組定序以幫助鑑別新免疫原性組合物候選物。 Tettelin，2000,讀，287(5459):18〇915 ; 等人， 2000, 287:1816-1820。甚至用奈瑟菌基因組之知識 鑑別新免疫原性組合物候選物為目前並不存在足夠數學算 法之挑戰性方法。事實上，最新報導表明儘管鑑別數百個 含有理論跨膜域之開放閱讀框架（，，〇RF，,），但表現、純化 及誘導表面反應性及功能活性抗體之問題已將研究者導向 僅七種用於血清群B腦膜炎球菌免疫原性組合物之候選 物。參見同前。此等之一者為先前已知。 因此，仍需要具有以下特徵之免疫原性組合物：〇)引 出多個奈瑟菌菌株之殺菌性抗體；〇與多個菌株之表面反 應，（3)賦予被動保護以防活攻毒；及/或防止定植 (colonization) 〇 127230.doc 200844226 【發明内容】 本發明之一實施例提供一種聚核苷酸’其包含：（a)與 SEQ ID ΝΟ:1-11之奇數序列之任一者具有至少約95%序列 一致性的核苷酸序列；或（b)編碼包含與SEQIDNO:2-12之 偶數多肽之任一者的胺基酸序列具有至少約95%序列一致 性之胺基酸序列之多肽的核苷酸序列。 本發明之另一實施例提供一種包含本發明之聚核苷酸之 載體。 ( 本發明之另一實施例提供一種包含本發明之載體之重組 細胞。 本發明之又一實施例提供一種多肽，其包含··（a)與SEq ID NO:2-12之偶數序列之任一者具有至少95%序列一致性 的胺基酸序列；（b)由與SEQ ID ΝΟ:1-11之奇數序列之任一 者具有至少9 5 %序列一致性的核苷酸序列編碼之胺基酸序 列；（c)(a)或（b)中所述之胺基酸序列之至少一個免疫原性 部分；或（d)U)或（b)中所述之胺基酸序列或（c)中所述之免 I 疫原性部分之至少一個生物相等物。 本發明之又一實施例提供一種抗體，其包含以下任一 者·⑷與包含偶數SEQ ID NO:L· 12之任一者之胺基酸序列 的多肽免疫特異性結合之多肽；或（b)至少一種（a)中所述 之蛋白質之至少一個免疫原性部分；或（c)至少一種（a)中 所述之蛋白質或（b)中所述之免疫原性片段之至少一個生物 相等物。 本發明$ γ 也 人一實施例提供一種組合物，其包含本發明之 127230.doc 200844226 聚核苷酸、載體、重組細胞、多肽或抗體。 本發明之又一實施例提供一種組合物，其包含：第一 聚核苷酸，其包含與SEQ ID NO: 1-5之奇數序列之任一者 具有至少約95%序列一致性或與編碼偶數序列SEq ID NO:2-6之任一者之胺基酸序列的核苷酸序列具有至少約 95%序列一致性的核苷酸序列；及（b)第二聚核苷酸，其包 含與SEQ ID ΝΟ:7-11之奇數序列之任一者具有至少約95〇/〇 序列一致性或與編碼SEQ ID N0:8-12之偶數序列之任一者 的胺基酸序列之核普酸序列具有至少9 5 %序列一致性的核 苷酸序列。 本發明又一實施例提供一種組合物，其包含： a) 第一多肽，其包含與SEQ ID NO:2-6之偶數序列之任一 者具有至少約95%序列一致性的胺基酸序列； b) 第二多肽，其包含與SEQ ID NO:8_12之偶數序列之任一 者具有至少約9 5 %序列一致性的胺基酸序列。 本發明之又一實施例提供一種藉由包含以下操作之方法 所製備之組合物：自奈瑟菌種分離及純化或重組製備以下 任一者··（a)包含偶數SEQ ID ΝΟ··2-12之任一者之胺基酸序 列的多肽；（b)由包含奇數SEQ ID NO: 1-11之任一者之核酸 序列的聚核苷酸編碼之多肽；（c)至少一種（“或…）中所述 之蛋白質之至少一個免疫原性部分；或（幻至少一種或 (b)中所述之蛋白質或（c)中所述之免疫原性片段之至少一 個生物相等物。 本發明之又一實施例提供本發明之組合物於製備用於誘 127230.doc -10- 200844226 發哺乳動物體内之免疫反應之藥劑的用途。 本發明之又一實施例提供本發明 ， 明之組合物於有效抵抗哺 乳動物之細菌性腦膜炎之藥劑中的用途。 本發明之又一實施例提供一種掣 裡ι備包含在宿主細胞中表 現編碼本文中所述之多肽之任一. 考的核酸序列之組合物之 方法。 本發明之又一實施例提供一種掣 裡表備抗體組合物之方法， 其包含將包含本文中所述之蛋白暂 ..^ t Γ 々 龙曰貝、免疫原性部分或生物 相等物之任一者之組合物引入叙从碰〜μ 動物體内後自該動物回收抗 體。 本發明之又一實施例提供_種誘發哺乳動物體内之免疫 反應之方法’纟包含向該哺乳動物投與有效量之一或多種 本發明之組合物。 本發明之又-實施例提供—種預防或治療哺乳動物之細 菌性腦膜炎之方法’其包含向該哺乳動物投與有效量之_ 或多種本發明之組合物。 【實施方式】 本毛明提供奈茗崴ORF2086蛋白質（”2086蛋白質”），包 括2086亞私Α蛋白質及2〇 86亞族β蛋白質。2086蛋白質之 母一者為可自原生奈瑟菌菌株分離之蛋白f，該等菌株包 括廣腐炎蒼遂磨（血清群A、B、c、D、W_135、X、γ、z 及29E)、满苈奈茗崴及藏潜菸遂磨之菌株。π”蛋白質亦 可使用重組技術製備。 根據各種實施例，本發明提供2〇86蛋白質、其免疫原性 127230.doc -11 - 200844226 部分及/或其生物相等物、與上述任一者免疫特異性結合 之抗體及包含編碼上述任一者之核酸序列的聚核苷酸。本 發明包括組合物、免疫原性組合物及其於預防、治療及/ 或診斷腦膜炎球菌感染及尤其由廢腐义奈茗崴引起之腦膜 炎球la疾病中之用途’以及用於製備該等組合物之方法。 本文中之2086蛋白質包括重組形式及自天然來源分離之形 式，以及脂質化及非脂質化形式兩者。 本發明出乎意料及有利地提供（1)引出多種奈瑟菌菌株 之殺菌性抗體，諸如嚴廯爻奈荔磨、满病奈蘑磨及/或莫 潜奈遂磨之菌株；（2)與多種菌株之表面反應；（3)賦予被 動保濩以防活功毒；及/或（4)防止定植之組合物，以及使 用該等組合物之方法及製備該等組合物之方法。下文描述 本發明之各種實施例。 如本文中所述，自腐廯义奈瑟磨分離之基於奈瑟菌種 ORF2086蛋白質（亦稱為”2〇86蛋白質，，或n〇RF2〇86"蛋白 質’在本文中可互換使用，或用於非脂質化蛋白質為 P208 6及用於蛋白質之脂質化形式為Lp2〇86)之新免疫原性 組合物候選物係藉由使細胞分級分離、差示清潔劑提取、 蛋白質純化與抗血清製備及利用多種菌株之殺菌活性檢定 組合來鑑別。作為上文引用之參考文獻中所揭示之可能免 疫原性組合物及診斷法的替代，本發明係關於經由使用蛋 白貝其免疫原性部分及其生物相等物來治療及/或預防 腦膜炎球菌感染之組合物及方法，以及編碼該等多肽、部 刀及相等物之基因，及與該等物質免疫特異性結合之抗 127230.doc -12- 200844226
如本文所使用，術語·,㈣株特異性”係指抗原激發有咬 =:了7遂磨之多於一種菌株(例如異源性腦膜炎球 囷国株）之免疫反應的抗原之特徵。如本文中所使用
語"交叉反應性”可與術語"㈣株特異性，，互換使用。如I =所使用’術語”免疫原性非菌株特異性輕Η還磨抗 原"描述可自廢廯义奈忍磨分離之抗原，儘管盆
一細菌(例如其他奈瑟菌菌株，諸如淋球菌菌株)分離或使 用重組技術製備。 飞便 本發明之2_蛋白f包括脂質化及非脂質化蛋白質。此 外，本發明亦涵㈣應於各蛋自f之未錢蛋自質或前蛋 白作為中間化合物/組合物之用途。 本發明亦提供根據本發明之實施例與上述免疫原性試劑 免疫特異性結合之抗體。此外，本發明係關於包含編碼上 述任一者之核酸序列的經分離之聚核苦酸。另外，本發明 提供組合物及/或免疫原性組合物及其於預防、治療及/或 診斷腦膜炎球菌性腦膜炎、尤其血清群㈣膜炎球菌疾病 中之用途，以及用於製備該等組合物之方法。 本發明之組合物具有高度免疫原性且能夠引發殺菌性抗 體之產生。此等抗體對血清群，異源性腦膜炎球菌菌株血 /月t及血β亞型有父叉反應性。因此，本發明組合物藉由 展現引出異源性奈瑟菌菌株之殺菌性抗體之能力而克服先 前I廯爻奈瑟磨疫苗嘗試之缺點。因此，本發明尤其提供 可與車乂少組份混合以引起與先前所用試劑相當之保護的免 127230.doc -13- 200844226 疫原性組合物。本文中之組合物或免疫原性試劑（例如（但 不限於）多肽、免疫原性部分或片段及生物相等物等）可單 獨或與其他抗原或試劑組合使用以引起防止腦膜炎球菌感 染及疾病之免疫性保護，以及引起防止由其他病原體引起 之感染及/或疾病的免疫性保護。此舉使用於藉由減少對 抗多種菌株所需之抗原數目來對抗腦膜炎球菌感染之免疫 原性組合物的设计簡單化。事實上，經純化之2 〇 8 6蛋白質 將顯著及出乎意料地減少提供造成腦膜炎球菌疾病之菌株 之足夠免疫原性覆蓋所需的蛋白質數目。2〇86蛋白質可在 乂廣#磨（五· 中以脂蛋白形式以比在原生腦膜炎球菌 中高得多之量重組表現，該脂蛋白為蛋白質之野生型形 式。 以下公開之國際專利申請案係以引用的方式全部併入本 文中.PCT/US02/32369(於 2003年 8月 7日以 WO 03/063766 公開）及卩0171；804/11901(於2004年11月4日以\\^0 04/094596 公開）。 儘管208 6蛋白質並不大量存在於野生型菌株中，但其為 殺菌性抗體之目標。不同於響應PorA所產生之彼等抗體， 此專抗體能夠殺死表現異源性血清亞型之菌株。 2086蛋白質之抗體亦被動保護幼年大鼠免受腦膜炎球菌 攻毒。2086蛋白質之重組表現能夠使用2〇86蛋白質作為預 防膜炎球菌疾病之免疫原性組合物。在臨床試驗中所有 最新腦膜炎球菌免疫原性組合物候選物為含有許多不同蛋 白質之複合物混合物或外膜蛋白製劑。提供血清亞型特異 127230.doc -14- 200844226 蛋白f將需要在免疫原性組合物 :體：提供f病相關血清亞型之約她覆蓋。相比之 文中/月楚地證明，在西歐及美國，單一2〇86蛋白質 :抗血清單獨能夠殺死造成約65%之疾病分離株的六種血 :亞=代表物。因&，經純化之2〇86蛋白質具有減少提供 :成細膜炎球菌疾病之血清亞型之足夠免疫原性組合物覆 蓋所需的蛋白質數目之潛力。
蛋白質、免疫原性部分及生物相等物 μ本發明提供之2_蛋白質為經分離之蛋白質或多狀。術 "° 、、呈刀離思謂自天然狀態藉由人工改變。若"經分離"之 組合物或物質在自然界中存在，則其已自其原始環境變化 或移除，< 兩者。舉例而言，天然存在於活的動物中之多 肽或聚核苷酸並非”經分離，，（如本文中使用該術語），但自 =天然狀態之共存物質分離之相同多肽或聚核苷酸係”經 刀離的。因此，如本文所使用，術語，，經分離之蛋白質” 包含自天然來源分離之蛋白質及使用重組技術製備之蛋白 貝，以及與其他抗原及/或諸如醫藥學上可接受之載劑、 緩衝劑、佐劑等之添加劑組合時的該等蛋白質。 根據本發明之一實施例，2086蛋白質之特徵為免疫原 ^生非病原性及非囷株特異性。2086蛋白質高度可變且因 此可能經歷胺基酸殘基之插入、取代及/或缺失而不損宝 蛋白質之免疫原性。2086蛋白質可分為兩種亞族，亞族Α 及亞族B。 來自亞族A之2086蛋白質包含SEq ID n〇:2-6之偶數序列 127230.doc -15- 200844226 之任一者的胺基酸序列或由包含SEQ ID NO: 1-5之奇數序 列之任一者的核苷酸序列之聚核苷酸編碼之胺基酸序列。 來自亞族B之2086蛋白質包含SEQ ID NO:8-12之偶數序列 之任一者的胺基酸序列或由包含SEQ ID NO:7-11之奇數序 列之任一者的核苷酸序列之聚核苷酸編碼之胺基酸序列。
本發明之多肽序列可與參考序列（例如偶數SEQ ID NO:2-12)—致，亦即100%一致，或與參考序列相比其可能 包括許多胺基酸變更以便一致性。/。小於i 〇〇%。該等變更包 括至少一個胺基酸缺失、包括保守及非保守取代之取代、 或插入。變更可存在於參考多肽序列之胺基或羧基末端位 置處或彼等末端位置之間的任何地方，個別地散布於參考 胺基酸序列之胺基酸中或以一或多個連續組散布於參考胺 基酸序列中。 口此本發明亦提供具有與序列表中所含之胺基酸序列 (亦即偶數SEQ ID NQ:2-12)-致之序列的蛋白f。根據本 發明之各種實施例，2〇86序列大於約95%、96%、97%、 8/〇 99/〇、99.9%或更多。此等包括（但不限於）突變體及 對偶基因變異體。 在本發明之較佳實施例中，雇蛋白f或其他2_多狀 (例如免疫性部分及生物相等物)產生腦膜炎球菌之同源菌 株及至少-種異源菌株之殺菌性抗體。具體而言，2〇86多 肽之抗體被動地保護幼年大鼠免受攻毒，諸如腦膜炎球菌 之鼻内攻毒。在其他較佳實施射，扇6多肽對於幼年大 鼠展現針對同源菌株及至少 種異源菌株之該保護。該多 127230.doc -16- 200844226 肽可選自上述序列概述，如偶數处卩ID NO: 2-12中所列 舉’或該多肽可為所列多肽之任何免疫性片段或生物相等 物。較佳地，多肽係選自上述序列概述中之偶數SEq ID NO: 2-12之任一者。 本發明亦係關於2086多肽之對偶基因或其他變異體，其 為生物相等物。合適之生物相等物將展現以下能力：（1)引 出同源菌株及至少一種異源性奈瑟菌菌株及/或淋球菌菌 株之殺菌性抗體；（2)與同源菌株及至少一種異源性奈瑟菌 及/或淋球菌菌株之表面反應；（3)賦予被動保護以防活攻 毒；及/或（4)防止定植。 合適之生物相等物與本文中所示之2〇86多肽（亦即，偶 數 SEQ ID NO: 2-12)之一者具有至少約 95%、96%、97%、 98%、99%或99.9%相似性，其限制條件為相等物能夠引發 與本發明之2086蛋白質之一者大體上相同之免疫原性特 性。 或者’生物相專物具有偶數SEQ id NO: 2-12之2086蛋 白質之一者的大體上相同之免疫原性特性。根據本發明之 實施例，生物相等物具有與偶數SEQ m N〇: 2_12相同之 免疫原性特性。 藉由產生本發明之蛋白質之變異體及修飾物來獲得生物 相等物。藉由經由一或多個胺基酸之插入、缺失或取代來 改k胺基酸序列而獲得蛋白質之此等變異體及修飾物。例 如，藉由取代來修飾胺基酸序列，以形成具有大體上相同 或改良品質之多肽。引入變更之較佳方法包含藉由定點突 127230.doc -17- 200844226 變誘發製造多肽之核酸序列之預定突變。 修飾及變化可在本發明之多肽之結構中作出且仍獲得具 有知腐义奈遂磨免疫原性之分子。舉例而言，但不限於， 特定胺基酸可在免疫原性無明顯損失之情況下取代其他胺 基酸’包括序列中之非保守及保守取代。因為多肽之相互 作用能力及性質定義多肽之生物學功能活性，所以許多胺 基酸序列取代可在多肽序列（或當然其基礎DNA編碼序列） 中進行且仍然獲得具有類似特性之多肽。本發明涵蓋本文 中之多肽之結構，以及編碼該等多肽之核酸序列的任何變 化其中夕狀保留免疫原性。因此，基於本文中提供之指 導，一般熟習此項技術者易能夠修飾所揭示之多肽及聚核 苷酸。 舉例而言，已鑑別可允許取代或缺失之特定可變區。根 據本發明之一實施例，如先前論述之2〇86 一致序列展示 2086家族蛋白質之保守及非保守區域。 在作出該等變化時，可利用熟習此項技術者已知之任何 技術。舉例而言，在不欲限制本發明之情況下，可考慮胺 基酸之親水性指數。親水性胺基酸指數在賦予多肽互相作 用生物功能中之重要性通常在此項技術中係已知的。κ抑 等人 1982· «/· Λ/W· 5化· 157:105-132。 類似胺基酸之取代亦可根據親水性進行，尤其當由此形 成之生物學功能等效多肽或肽意欲心免疫性實施例令 時。以引用的方式併人本文t之美國專利第4,554，⑻號陳 述，如取決於相鄰胺基酸之親水性的多肽之最大局部平均 127230.doc -18- 200844226 :水性與其免疫原性有關’亦即與多肽之生物學 關。 β 多肽之生物相等物亦可使用位點特異性突變誘發 備。位點特異性突變誘發為適用於經由特異性突變誘發^ ❹财來製備源自其序列之第二代多肽或生物學功能= 夕肽或肽的技術。當胺基酸取代合乎需要時，該等變化可 Γ 2合t需要的。該技術進—步提供藉由將—或多個核芽酸 列變化引入DNA中來製備及測試序列變異體（例如併有 上述考慮之一或多者）之預備能力。位點特異性突變誘發 允許經由使用編碼所需突變之職序列之特異性寡核脊酸 序列’以及足夠多之相鄰核普酸來產生突變體’以提供足 夠尺寸及序列複雜性之引子序列從而在橫越缺失接合點兩 側^成穩定雙鏈體。通常，約17至25個核普酸長度之引子 車乂么，其中在序列接合點之兩側有約5至1 〇個殘基變更。 身又而吕’位,點特異性突變誘發之技術在此項技術中係 熟知的。如應瞭解，該技術通常利用可以單股及雙股形式 兩者存在之嗤菌體載體。通常，藉由首先獲得在其序列中 包括編碼所選廢廯芡奈态磨多肽序列之全部或一部分之 DNA序列的單股載體來執行根據本文之定點突變誘發。製 備（例如合成）具有所需突變序列之寡核苷酸引子。接著將 引子U火為單股載體，且藉由使用諸如乂廣岸磨聚合酶 I Klenow片段之酶擴展，以便完成具有突變股之合成。因 形成異源雙鏈體，其中一股編碼原始非突變序列且第 二股具有所需突變。接著使用此異源雙鍵體載體以使諸如 127230.doc •19- 200844226
Ai##細胞之適當細胞轉型且選擇包括具有突變之重組 載體的純系。市售套組與所有必需試劑一起供給，募核苷 酸引子除外。
2086多狀包括任何蛋白質或多肽，其包含與具有來自偶 數SEQ ID NO 2-12之一者之胺基酸序列的2〇86蛋白質之大 體上序列相似性及/或生物等效性。另外，本發明之2〇86 多肽不限於特定來源。因此，本發明提供來自多種來源之 多肽之一般偵測及分離。又，如熟習此項技術者熟知， 2086多狀可基於本文中提供之指導或以此項技術中已知之 任何其他合成方式重組製備。 本發明預期2086多肽可有利地裂解為用於進一步結構或 功能分析，或用於產生諸如2〇86相關多肽及2〇86特異性抗 體之試劑的片段。此可藉由用諸如胞内蛋白酶* C(B〇ehringer5 Indianap〇Hs，IN)之肽酶處理經純化或未你 純化之而义奈還磨多肽來完成。用CNBr進行之處理為 另-種方法，藉此肽片段可自天然鑛义癸透磨繼多狀 產生。重組技術亦可用於產生2〇86蛋白質之特異性片段。 作為本文十所使用之術語，”變異體”為分別不同於喪考 聚核«或多肽但保留基本特性之聚核芽酸或多狀。聚核 二之=二異體在核*酸序列方面不同於另-參考聚核 找^異體之核苦酸序列變化可能或可能不改變由參考 ^核芽I編碼之多肽之胺基酸序列。如下所論述 變化可產生由參考序列所編碼之多狀令之胺基酸取代 加、缺失、融合及截短。多肽之典型變異體在胺基酸序;； 127230.doc -20- 200844226 不同於另一參考多肽。通常，差異為有限的以便參考 多肽及變異體之序列總體上極其類似且在許多區域二致 (亦即生物等效)。變異體及參考多肽可在胺基酸序列方面 因一或多個以任何組合形式之取代、添加、缺失而不同。 取代或插人之胺基酸殘基可能或可能不為由遺傳密碼所編 碼之胺基酸殘基。㈣普酸或多肽之變異體可天然存在， 諸如對偶基因變異體，或λ可為未知天然存在之變異體。 聚核苷酸及多肽之非天然存在變異體可藉由突變誘發技術 或藉由直接合成來製造。 如此項技術中已知，”一致性”為兩個或兩個以上多肽序 列或兩個或兩個以上聚核苷酸序列之間的關係，其係藉由 比較該等序列所測定。在此項技術中，” 一致性，，亦視情況 意謂多肽或聚核苷酸序列之間的序列相關程度，其係藉由 該等序列串之間的匹配所測定。” 一致性，，及，，相似性”可易 於藉由已知方法計异’該等方法包括（但不限於）以下文獻 中所述之彼等方法：Computational Molecular Biology， Lesk，A. Μ·’ 編輯，Oxford University Press，New York， 1988，Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith，D. W· ’ 編輯 ’ Academic Press，New York，1993 ; Computer Analysis of Sequence Data, Part I? Griffin, A. M.? 及 Griffin，H· G. ’ 編輯 ’ Humana Press, New Jersey, 1994，Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje，G·，Academic Press，1987 ;及 Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.及 Devereux，J·，編輯，M Stockton 127230.doc 21 200844226
Press，New York，1991 ;及 Carillo，Η·，及 Lipman，D.， SIAM J. 48:1073 (198 8)。測定一致性之較 佳方法經設計以得到所測試序列之間的最大匹配。測定一 致性及相似性之方法係以公開可利用之電腦程式編碼。測 定兩個序列之間的一致性及相似性之較佳電腦程式方法包 括（但不限於）GCG程式包（Devereux，J.，等人1984)、 BLASTP、BLASTN 及 FASTA(Altschul，S· F.，等人， 1990)。BLASTX程式可公開得自NCBI及其他來源（BLAST Manual，Altschul，S·，等人，NCBI NLM NIH Bethesda， Md· 20894; Altschul，S·，等人，199〇)。熟知 Smith
Waterman演算法亦可用於測定一致性。 舉例而言，在不欲受其限制之情況下，本發明之胺基酸 序列可與參考序列，偶數SEQ ID N0: 2_12一致；亦即 100%—致，或其可包括與參考序列相比之許多胺基酸變 。該等變更係選自由至少一個胺
ηα==Χα-(Χα·γ), 更以便一致性％小於1 00〇/〇 基酸缺失、包括保守及4 群’且其中該簟鑤承i六 127230.doc -22- 200844226 其中ηα為胺基酸變更之數目，Χα為偶數SEQ m n〇2 a 中胺基酸之總數，且7例如對於7〇%為〇7〇，對於8〇%為 〇·8〇，對於85%為0.85等，且苴中將γ^ , 。… 八甲將、與y之任何非整數乘 積捨至最接近整數，隨後將其自Χα減去。 在較佳實施例中，上述多肽係選自偶數seqidn〇2_i2 中所列舉之蛋白質，諸如2086蛋白質之成熟加工形式。 2086蛋白質或相等物等可為脂質化或非脂質化的。 ORF 2086可與原生0RF 2〇86信號序列一起在乂廣痒磨 中表現。然而，需要找出改良蛋白質表現之手段。根據本 發明之一實施例，前導序列產生脂質化形式之蛋白質。舉 例而言，下文描述使用未分型之浚减囔血#磨 ζ·«//μ«ζμ)Ρ4蛋白質之信號序列來增強表 細菌脂蛋白之加工自合成含有信號序列之前驅體或前脂 蛋白開始，而該信號序列含有一致脂蛋白加工/修飾位 點。此前脂蛋白最初穿過革蘭氏陰性細菌（Grani p〇sitive bacteria)之内膜上或革蘭氏陽性細菌（Gram p〇sitive bacteda)之膜上的常見Sec系統。一旦前脂蛋白由sec系統 置於膜中，則由一致位點處之信號肽酶^裂解前脂蛋白且 甘油酸化及醯化暴露之N末端半胱胺酸殘基。Hayashi等人 1990. Lipoproteins in bacteria. J. Bioenerg. Biomembr. Jun; 22(3):451-71，Oudega 等人 1993· Ac/zer/c/na SecB， SecA，and SecY proteins are required for expression and membrane insertion of the bacteriocin release protein, a 127230.doc -23- 200844226 small lipoprotein. J. Bacteriol. Mar; 175(5):1543-7 ； Sankaran等人 1995· M〇dificati〇I1 〇f bacterial Hp〇pr〇teins Methods Enzymol, 名?>-9Ί。
在革蘭氏陰性細菌中，脂質化蛋白質向外膜之轉運係由 具有膜特異性之獨特ABC轉運體系統介導，此視脂蛋白之 位置2處之分類信號而定。Yakushi等人2〇〇〇· a new ABC transporter mediating the detachment of lipid modified proteins from membranes· CW/ 5ζ·ο/· Apr; 2(4):212-8。 與細菌脂蛋白及其信號序列之融合已用於顯示位於細菌 表面上之重組蛋白質。美國專利第5,583,038及6，130,085號。 交換脂蛋白信號序列可增加脂蛋白之產生。De等人2〇〇〇. Purification and characterization of Streptococcus pneumoniae palmitoylatcd pneumococcal surface adhesin A expressed in 五％cro//· Kaceke. Mar 6;18(17):1811-21。 已知蛋白質之細菌脂質化作用增加或改良蛋白質之免疫 反應。Erdile 專人 1993. Role of attached lipid in immunogenicity of Borrelia burgdorferi OspA. Infect. Irnmun. Jan; 6 1 (1):8 1-90 ; Snapper 等人 1995· Bacterial lipoproteins may substitute for cytokines in the humoral immune response to T cell-independent type II antigens· J. /mm —〇/· Dec 15;155(12):5582-9。然而，細菌脂蛋白表現 可藉由加工之嚴格性而變複雜。Pollitt等人1986. Effect of amino acid substitutions at the signal peptide cleavage site of the Escherichia coli major outer membrane lipoprotein. 127230.doc -24- 200844226 J·价〇/· Chm· Feb 5; 261(4):1835_7 ; Lunn 等人 1987-
Effects of prolipoprotein signal peptide mutations on secretion of hybrid pro 1 ipo-beta-lactamase in Escherichia coli. J. C/zem· Jun 15;262(17):83 18-24 ; Klein 等人 1 988. Distinctive properties of signal sequences from bacterial lipoproteins. Protein Eng. Apr; 2(1):15-20。細菌 脂蛋白表現亦由諸如毒性及低表現量之其他問題而變複 雜。Gomez 等人 1994. Nucleotide The Bacillus subtilis lipoprotein Lpl A causes cell lysis when expressed in Escherichia coli. Microbiology. Aug; 140 (Pt 8): 1839-45 ； Hansson等人 1995. Expression of truncated and fulMength forms of the Lyme disease Borrelia outer surface protein A in Escherichia coli. Protein Expr, Purif. Feb; 6(1):15-24 ；
Yakushi 等人 1997· Lethality of the covalent linkage between mislocalized major outer membrane lipoprotein and the peptidoglycan of Escherichia coli. J. Bacteriol. May; 179(9):2857-62。 未分型之滿减f盖#磨細菌表現稱為P4之脂蛋白（亦稱 為蛋白質”en)。P4蛋白質之重組形式使用原生P4信號序列 在乂廣#磨中高度表現。美國專利第5,95 5，580號。當在原 生P4信號序列取代乂 |痒磨中之表現載體中之原生〇rf 2086信號序列時，ORF2086之表現量增加。 使用異源性P4信號序列增加表現之此概念可擴展至其他 細菌脂蛋白。詳言之，細菌基因組之分析導致許多可能受 127230.doc -25- 200844226 關注之ORF之鑑別。在諸如乂廣/f #之異源性宿主細胞中 表現具有原生信號序列之各ORF之嘗試引起使用多種信號 序列中固有之多種問題’包括穩定性、相容性等等。為將 此等問題減至最少，使用P4信號序列表現各相關〇rf。如 上文所述，P4信號序列改良異源性2086 ORF之表現。藉由 刪除相關ORF之原生信號序列，且將P4信號序列接合至 ORF來建構表現載體。接著使合適之宿主細胞轉型，用表 現載體轉染或感染，且ORF之表現與使用〇rf之原生信號 序列相比有所增加。 非脂質化形式係由缺乏原始前導序列之蛋白質或由經不 指定宿主細胞中之脂肪酸醯化位點之序列的一部分置換之 前導序列產生。 除非另外明確指出，否則本發明之各種形式之2〇86蛋白 質在本文中稱為，，2〇86，，蛋白質。又，除非另有指出，否則 π2〇86多肽”係指如上所述之2〇86蛋白質以及其免疫原性部 分或生物相等物。 如以10。/。至20%梯度SDS聚丙烯醯胺凝膠（SDS_PAGE)所 量測，全長經分離及經純化之廢廯爻奈彥磨2〇86蛋白質具 有約28至35 kDa之表觀分子量。更具體而言，如藉由質譜 法所置測’此蛋白質具有約26,000至30,000道爾頓之分子 量。 刀 較佳地，2086多肽及編碼該等多肽之核酸係用於預防或 改善由廢腐爻菸蘑磨及/或其他菌種引起之感染。 $ 抗體 127230.doc -26- 200844226 包括SEQ ID NO: 2-12之胺基酸序列的本發明之蛋白 貝、其片段及其類似物或表現其之細胞亦係用作免疫原以 產生對本發明之多肽具有免疫特異性之抗體。本發明包括 免疫特異性多肽之抗體及使用該等抗體偵測腐腐义菸忍磨 之存在，提供被動保護或量測多肽在細胞、細胞或組織提 取物或生物流體中之數量或濃度的用途。 本發明之抗體包括多株抗體、單株抗體、嵌合抗體及抗 獨特型抗體。多株抗體為源自用抗原免疫之動物之血清的 抗體分子之異質群體。單株抗體為特異性抗原之抗體之大 體上均質群體。單株抗體可藉由熟習此項技術者已知之方 法獲得，例如Kohler 及 Milstein，1975，256:495_497 and U.S· Patent Number 4,376，110。該等抗體可為任何免 疫球蛋白種類’包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD及其任 何亞類。 肷合抗體為不同部分源自不同動物物種之分子，諸如具 有源自鼠類單株抗體之可變區及人類免疫球蛋白恆定區之 彼等抗體。嵌合抗體及其製造方法在此項技術中已知 (Cabilly等人，1984, *SW. USA 81:3273-3277 ;
Morrison等人，1984，iVoc. Λ^ί/· Scz·, 8 1:685 1-6855 ; Boulianne等人，1984,胸，3 12:643-646 ; Cabilly 等人，歐洲專利申請案125023(於1984年11月14日公開）； Taniguchi等人，歐洲專利申請案171496(於1985年2月19曰 公開）；Morrison等人，歐洲專利申請案173494(於1986年3 月5日公開）；Neuberger等人，PCT申請案WO 86/ 01533(於 127230.doc >27- 200844226 1986年3月13曰公開）；Kudo等人，歐洲專利申請案 184187(於1986年6月11日公開）；Morrison等人，歐洲專利 申請案173494(於1986年5月5日公開）；Sahagan等人， 1986， J. /mm·。/. 137:1066-1074 ; Robinson 等人， PCT/US86/02269(於 1987年 5 月 7 曰公開）；Liu 等人，1987, Proc· Natl· Acad· Sci. USA 84:3439-3443 ； Sun# Λ » 1987, Proc. iVa"·84:214-218 ; Better等人，1988 Se/Mce 24〇:l〇4i-i〇43)。此等參考文獻係以引用的方式全 部併入本文中。 抗獨特型（抗Id)抗體為識別通常與抗體之抗原結合位點 相關之獨特決定子的抗體。抗W抗體係藉由用抗Id所製備 之單株抗體使作為單株抗體之來源之相同物種及遺傳型的 動物（例如小鼠菌株）免疫來製備。經免疫之動物將藉由產 生此等同型決定子之抗體（抗Id抗體）來識別及響應免疫抗 體之獨特型決定子。 因此，對抗本發明之多肽所產生之單株抗體可用於誘發 合適動物體内之抗Id抗體。來自該等經免疫小鼠之脾細胞 可用於產生分泌抗Id單株抗體之抗Id融合瘤。此外，抗Jd 抗體可與諸如匙孔螺血藍蛋白（KLH)之載體偶合且用於使 其他BALB/C小鼠免疫。來自此等小鼠之血清將含有具有 對R-PTPase抗原決定基有特異性之最終_之結合特性的 抗抗Id抗體。因此抗咖體具有其獨特型抗原決定基，或 在、、Ό構上類似於所評估之抗原決定基之"獨特位 { άΐ(Λο㈣’議如化膿性鍵球菌伽叫〇〇〇“似py零nes、多 127230.doc -28- 200844226 肽。 術語n抗體”亦欲包括完整分子以及片段兩者，該等片段 係諸如Fab、單鏈抗體及能夠結合抗原之抗體之其他抗原 識別片段。Fab片段缺乏完整抗體之Fc片段，自循環更快 速清除，且可具有比完整抗體少之非特異性組織結合 (Wahl等人，1983，J. Nucl. Med. 24:3 16-325)。應瞭解， Fab及適用於本發明之抗體之其他片段可用於根據用於完 整抗體分子之方法偵測及量化廢廯爻奈荔窗多肽。 諸如抗獨特型抗Idn)抗體之本發明抗體可用於治療或 預防哺乳動物宿主體内之奈态磨感染的方法，其包含投與 免疫有效量之對如上所述之多肽有特異性的抗體。抗1(1抗 體亦可用作”免疫原”以誘發另一動物體内之免疫反應，從 而產生所謂抗抗Id抗體。抗抗Id可與誘發抗id之原始mAb 在抗原決定基方面一致。因此，藉由使用mAb之獨特型決 定子之抗體，有可能鑑別表現一致特異性之抗體之其他純 系。 以多種方式使用抗體，例如用於證實蛋白質經表現，或 證實蛋白質在何處表現。經標記抗體（例如用於FACS之螢 光標記）可與完整細菌一起培養且細菌表面上標記之存在 證實例如蛋白質之位置。 對抗本發明之多肽所產生之抗體可藉由使用常規方案向 動物投與多1或具有抗原決定基之片&、類似物或細胞來 獲付。對於製備單株抗體而言，使用提供由連續細胞株培 養物所產生之抗體之任何技術。 127230.doc -29- 200844226 聚核替酉曼 如同本發明之蛋白f ’本發明之聚核㈣可包含與奇數 Q ID NO. Ι-ll之參考序列之任—者—致的核酸序列，亦 即100%致，或其可包括與參考序列相比高達許多核普 酸變更。肖等變更係選自由至少一個核苷酸缺失、包括轉 換及易位之取代或插入組成之群，且其中該等變更可存在 於參考核苦酸序列之5,或3,末端位置處或彼等末端位置之 間的任何地方，個別地散布於參考序列之核苷酸中或以一 或多個連續組散布於參考序列中。核苷酸變更之數目係藉 由將奇數SEQ ID咖⑴之任一者中核*酸總數乘以各； 一致性百分數之數值百分數（除以1〇〇)且自該序列中核苷酸 之該總數減去該乘積來測定。 舉例而言，在不欲受限於此之情況下，經分離之廢廯爻 奈荔磨聚核苷酸包含與奇數SEQ ID NO.hn之任何核酸序 列具有至少95%—致性之聚核苷酸序列；其簡併變異體或 其片段，其中該聚核苦酸序列可在奇數SEQ ID n〇:1_U2 核酸序列之整個聚核苷酸區中包括高達〜個核酸變更，其 中〜為變更之最大數目且由下式計算： n„=xw-(x，y)， 其中為奇數SEQ ID ΝΟ:1-11之任一者之核酸的總數且 y具有0.95之值，其中將x„與y之任何非整數乘積捨至最接 近整數，隨後自χ«減去該乘積。當然，y亦可具有對於9 5 〇/〇 為0·95之值等。編碼包含偶數SEQ ID NO:2-12之任一者之 胺基酸序列的多肽之聚核苷酸序列之變更可在此編碼序列 127230.doc -30- 200844226 中產生無義、錯義或讀框轉移突變且由此改變由該等變更 後之聚核苷酸編碼之多肽。 本發明之特定實施例係關於聚核苷酸（本文中稱為，， 聚核苷酸，，或"ORF2086聚核苷酸”），其編碼2〇86蛋白質及 對抗2086蛋白質所產生之抗體。在較佳實施例中，本發明 之經分離聚核苷酸為包含與選自奇數SEQ ID NO·· Mi之一 者之核苷酸序列具有至少約95%一致性之核苷酸序列的聚 核苷酸、其簡併變異體或其片段。如本文所定義，，，簡併 變異體"係定義為由於遺傳密碼之簡併而不同於以奇數紐卩 ID NO: 1 -11展示之核苷酸序列，但仍然編碼與由以奇數 SEQ ID NO. Ι-ll展示之核苦酸序列編碼相同之2嶋蛋白 質的聚核苷酸（例如偶數SEQ ID NO: 2-12)。 在其他實施例中，聚核苷酸為選自奇數SEQ m N〇:卜 Π之一者之核苦酸序列、其簡併變異體或其片段的互補序 列。在其他實施例中，聚核苷酸係選自由Dna、染色體 DNA、eDNA及RNA組成之群且可進—步包含異源性核苦 酸。 應瞭解，2086聚核苷酸可自天然、合成或半合成來源獲 得；此外，核苷酸序列可為天然存在之序列，或其可藉2 包括早一或多個鹼基取代、缺失、插入及顛倒之突變而與 該天然存在之序列有關，其限制條件為包含該序列之核酸 分子始終能夠表現為如上所述之2〇86免疫原性多肽。核酸 分子可為RNA、DNA、單股或雙股、直鏈或共價閉合環 形。核皆酸序列可具有相鄰於其之表現控制序列，該等控 127230.doc -31 - 200844226 制序列通常源自異源性來源。通常，本發明之核酸序列之 重組表現將在核酸序列之末端使用終止密碼子序列，諸如 TAA。 本發明亦包括能夠在低嚴格條件下、更佳嚴格條件且最 佳高度嚴格條件下與本文所述之聚核苷酸雜交之聚核苷 酸。嚴格條件之實例在以下嚴格條件表中展示：高度嚴格 條件為至少如例如條件A-F般嚴格之彼等；嚴格條件為至 少如例如條件G-L般嚴格；及低嚴格條件為至少如例如條 件M-R般嚴格。 表I 嚴格條件
嚴格 條件 聚核苷酸雜交 雜交長度(bPy 雜交溫度及緩衝劑H 洗滌溫度及 緩衝劑H A DNA:DNA >50 65EC ; lxSSC-或-42EC ; lxSSC， 50%甲醯胺 65EC ； 0.3xSSC B DNA:DNA <50 Tb ; 1XSSC ΤΒ ； lxSSC C DNAiRNA >50 67EC ; lxSSC-或-45EC ; lxSSC， 50%甲醯胺 67EC ； 0.3xSSC D DNA:RNA <50 TD ； lxSSC TD ； lxSSC E RNA:RNA >50 70EC ; lxSSC-或-50EC ; lxSSC ， 50%甲醯胺 70EC ； 0.3xSSC F RNA:RNA <50 Tf ; 1XSSC Tf； lxSSC G DNA:DNA >50 65EC ; 4xSSC -或-42EC ; 4xSSC ， 50%曱醯胺 65EC ； lxSSC Η DNA.DNA <50 Τη » 4XSSC Th ; 4XSSC I DNA:RNA >50 67EC ; 4xSSC -或-45EC ; 4xSSC， 50%甲醯胺 67EC ； lxSSC J DNA:RNA <50 Tj ； 4xSSC Tj ； 4xSSC 127230.doc -32- 200844226
嚴格 條件 聚核苷酸雜交 雜交長度(bP^ 雜父溫度及緩衝齊jH 洗滌溫度及 緩衝劑H Κ RNA:RNA >50 70EC ； 4xSSC^I— 50EC ; 4xSSC ， 50%甲醯胺 67EC ； lxSSC L RNA:RNA <50 TL ； 2xSSC~ TL ; 2xSSC Μ DNA:DNA >50 50EC ; 4xSSC-或_ 40EC ; 6xSSC ， 50%甲醯胺 50EC ； 2xSSC Ν DNA:DNA <50 TN ; 6xSSC Tn ! 6xSSC 0 DNA:RNA >50 55EC ; 4xSSC -或-42EC ; 6xSSC， 50%甲醯胺 55EC ； 2xSSC Ρ DNA:RNA <50 TP ； 6xSSC TP ； 6xSSC Q RNA:RNA >50 60EC ; 4xSSC -或-45EC ; 6xSSC ， 50%甲醯胺 60EC ; 2xSSC R RNA:RNA <50 TR ； 4xSSC TR ； 4xSSC bp1 :該雜交長度為對雜交聚核苷酸之雜交區預期之長 度。當將聚核苷酸與未知序列之目標聚核苷酸雜交時’雜 交長度假定為雜交聚核苷酸之長度。當雜交已知序列之聚 核苷酸時，雜交長度可藉由比對聚核普酸之序列及鑑別最 優序列互補之區域來測定。 缓衝劑H:在雜交及洗滌緩衝劑中’ SSPE(1XSSP^0·15 M NaCM、10 mM NaH2P〇4及 1.25 mM EDTA，pH 7.4)可取 代SSC(lxSSC為0.15 M NaCl及15 niM檸檬酸納）；完成雜 交後執行洗滌歷時1 5分鐘。 TB至TR :用於預期長度小於5〇個鹼基對之雜父物之雜父 溫度應比雜交物之熔融溫度（Tm)小5-10EC ’其中Tm係根據 下列方程式測定。對於長度小於18個鹼基對之雜交物而 言，Tm(EC)=2(A之#+T鹼基）+4(G之鹼基）。對於長度 介於18與49個鹼基對之間的雜父物而έ ’ -33 · 127230.doc 200844226
Tm(EC) = 81.5 + 16.6(logi〇[Na+]) + 0.41(%G+C) - (600/N)，其 中N為雜交物中鹼基之數目，且[Na+]為雜交緩衝劑中納離 子之濃度（對於lxSSC而言[Na+] = 0.165 M)。 用於聚核苷酸雜交之嚴格條件之其他實例係在
Sambrook，J·，E.F. Fritsch，及 T. Maniatis，1989,
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Current Protocols in Molecular Biology, 1995 p ^
Ausubel等人，編輯，j〇hn Wiley & Sons，第 2.10 及 6·3·6 4 小節中提供，該等文獻以引用的方式併入本文中。 本發明亦提供與此等聚核苷酸完全互補之聚核苷酸且亦 &供反義序列。亦稱為反義寡核苷酸之本發明之反義序列 包括阻斷編碼本發明之多肽之聚核苷酸的表現之内部產生 及外部投與之序列。本發明之反義序列包含（例如）約15_2〇 個鹼基對。反義序列可經設計（例如）以藉由防止啟動子與 上游非轉譯序列結纟或藉由經由防止核糖體結合而防止編 碼本發明之多肽之轉錄物轉譯來抑制轉錄。 本發明之聚核苷酸係以許多方式製備（例如藉由化學合 自職文庫、自生物體自身)且可採用各種形式(例如 早月又、雙股、載體、探針、引子）。術語"聚核苦酸"包括 職及RNA，以及其類似物，諸如含有經㈣主鍵之彼 專。 根據本發明之其他實施例，本發明之聚核㈣包含DM 文庫’諸如cDNA文庫。 127230.doc -34- 200844226 融合蛋白 本發明亦係關於融人疋 一 毗。蛋白。”融合蛋白"係指由兩個常當 無關之融合基因或其片與 、月奴編碼之蛋白質。舉例而言， 蛋白包含免疫球蛋白分早卜— 口 子之恆疋區之各種部分以及另一 疫原性蛋白質或其部分。在 兄 在许多情況下，利用免疫球蛋白 ㈣料為融合蛋白之-料對㈣於治療及診斷係有利
的’攸而產生（例如）改良之藥物動力學特性（參見例如，EP 0 232 262 A1)。另 _ 士 A 也， )另方面，對於一些用途而言，將需要能 夠在表現、價測及純化融合蛋白後刪訊部分。本發明之 20崎核苦酸係用於重組製造本發明之多肽，聚核聲酸可 匕括單獨之成^!多肽之編碼序列，或與其他編碼序列一起 在閱頃框架中之成熟多肽的編碼序列，該等其他編碼序列 係諸如編碼前導或分泌序列、前蛋白或原蛋白或前原蛋白 序列或其他融合肽部分之彼等序列。舉例而言，可編碼有 助於純化2086多狀或融合 人’ 1989,以引用的方式全部併入本文中）。因此，本發 明之-實施例涵蓋編碼允許表現產物之耶標籤純化之融 口夕肽的來核苷酸之製備。聚核苷酸亦可含有非編碼5,及 3'序列’諸如轉錄、非轉譯序列、拼接及多聚腺嗓吟信 號。該融合多肽可由用如下文所述之重組DNA選殖媒劑轉 3L /轉β木或感染之宿主細胞產生且其隨後可自宿主細胞分 離以提供大體上不含其他宿主細胞蛋白質之融合多肽。 免疫原性組合物 本發明之一態樣提供免疫原性組合物，其包含至少一種 127230.doc -35- 200844226 質或編碼該等蛋白質之核酸。上述物質具有以下 &力’⑴引出多種a株之殺菌性抗體；（2)與多種菌株之 表面反應；（3)賦予被動保護以防活攻毒；及/或⑷防止定 植。該等免疫原性組合物之調配物為熟f此領域者所熟 矣在特疋實施例中，本發明之組合物包括醫藥學上可接 文之載劑及/或稀釋劑。合適之醫藥學上可接受之載劑及/ 或稀釋蜊包括任何及所有習知溶劑、分散介質、填充劑、 固體載劑、水溶液、塗料、抗菌劑及抗真菌劑、等張劑及 吸收延遲劑及其類似物。合適之醫藥學上可接受之載劑包 括（例如）水、生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、右旋 糖、甘油、乙醇及其類似物之一或多者，以及其組合。醫 藥學上可接受之載劑彳進一步包含少量助劑物質，諸如濕 潤劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑，其增強抗體之存放期或 有效性。醫藥學上可接受之載劑之製備及用途在此項技術 中熟知。除非任何習知介質或試劑與活性成份不相容，否 則涵蓋其在本發明之免疫原性組合物中之用途。根據本發 明之特定實施例，醫藥學上可接受之載劑為載體蛋白。 載體蛋白 載體蛋白較佳為無毒且不具反應原性且可以足夠量及純 度獲得之蛋白。載體蛋白應服從標準結合程序。在本發明 之一特定實施例中，crm197係用作載體蛋白。 CRMm(Wyeth，Sanford，NC)為自生長於酪蛋白胺基酸及 基於酵母提取物之培養基中之冷嚓棒欢#磨 (Corynebacterium diphtheria)菌株(2Ί(^Λ9Ί)的培秦物分離 127230.doc -36- 200844226 之白喉毒素之無毒變異體（亦即類毒素）。經由超遽、硫酸 銨沈殿及離子交換層析純化CRM197。獲得CRMi97之另一 方法係在美國專利第4,925,792號t描述。或者，根據美國 專利第5,614,382號重組製備CRM|97。其他白喉類毒素亦 適於用作載體蛋白。 ^在其他實施例中，本發明之載體蛋白為酶促非活性鍵球 菌C5a肽酶（SCP)(例如，美國專利第6,27〇,775號、第 6,3 5 5,255號及第6,951，653號中所述之8〇?變異體之一戋夕 者)。 3夕 其他合適之載體蛋白包括非活化細菌毒素，諸如破傷風 類毒素、百日咳類毒素、霍亂類毒素（例如國際pcT公開案 第WO 2004/083251號中所述之CT E29H)、乂麖痒磨lt、 乂廣#磨ST、乂廣#磨DnaK蛋白及來自·請腐#磨 (P繼而mo謝㈣咖謂幻之外毒素。亦可使用細菌外膜蛋 白，諸如外膜複合物c(〇MPC)、孔蛋白、轉鐵蛋白結合蛋 白、肺炎球菌溶血素毒素（例如美國專利第5,565,2〇4號）、 肺炎球菌溶血素類毒素（例如國際PCT公開案第w〇 2005/1085 80號）、肺炎球菌表面蛋白八(1>邛八）、肺炎球菌黏 附素蛋白（PsaA)或浚滅营蛋白D。亦可使用細菌熱 休克蛋白，諸如分枝桿菌hsp-70。亦可使用其他蛋白，諸 如表皮葡萄球菌{Staphylococcus epidermidisn白从心、 SitC及絡鐵合金結合蛋白及金黃芑截考硪磨 (5Ϊ 叩 ⑽ aw)蛋白 ClfA、clfB 及 FnbA。諸如卵 白蛋白、匙孔螺血藍蛋白（KLH)、麵胱甘肽s_轉移酶 127230.doc •37· 200844226 (GST)、牛血清白蛋白（BSA)、半乳糠激酶、泛素、 β-半礼糖苦酶、流行性感冒Ns丨蛋白或結核菌素之經純化 蛋白衍化物（PPD)之其他蛋白亦可用作載體蛋白。亦可使 用例如來自輪狀病毒VP6或來自噬菌體QPi類病毒粒子。 佐劑 在某些實施例中，本文中所述之免疫原性組合物亦包含 一或多種佐劑。佐劑為一種與免疫原或抗原一起投與時可 增強免疫反應之物質。許多細胞因子或淋巴因子已顯示具 有免疫凋節活性，因此可用作佐劑，包括（但不限於）介白 素1 α l-β、2、4、5、6、7、8、10、12(參見例如美國專 利第 5,723，127號）、13、14、15、16、17及 18(及其突變形 式），干擾素_α、β及γ ;顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子 (GM-CSF)(參見例如美國專利第Μ?8，"6號及ATCC寄存編 號39900);巨噬細胞群落刺激因子（M-CSF);顆粒球群落 刺激因子（G-CSF);及腫瘤壞死因子α及p。適用於本文= 所述之免疫原性組合物之其他佐劑包括：趨化因子，包括 (但不限於）MCP-1、ΜΙΡ-Ια、ΜΙΡ·1β及 RANTES ;黏著分 子，諸如選擇素，例如L_選擇素、ρ-選擇素及^選擇素； 類黏蛋白分子，例如CD34、GlyCAM]及MadCAM七整 合素家族之成員，諸如LFA]、Vla-1、Mac]及 P150.95 免疫球蛋白超家族之成員，諸如pEcAM、 ICAM(例如 ICAM-1、iCAM-2及 ICAM-3)、CD2&lfa 3 共刺激分子，諸如CD40及CD40L ;生長因子，包括血管生 長因子、神經生長因子、纖維母細胞生長因子、表皮2長 127230.doc -38 - 200844226 因子、Β7·2、PDGF、BL-1及血管内皮生長因子；受體分 子，包括 Fas、TNF 受體、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、 DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、 DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2 及 DR6 ;及卡斯蛋白 酶（Caspase)(ICE) 〇 用於增強免疫反應之合適佐劑進一步包括（但不限 於）MPLTM(3-0-脫酿化單構醯月旨質A，Corixa，Hamilton, MT)，其係在美國專利第4,912,094號中描述。亦適於用作 ( 佐劑的為合成脂質A類似物或胺基烷基葡糖胺磷酸鹽化合 物（AGP)，或其衍生物或類似物，其可得自 Corixa(Hamilton，MT)，其係在美國專利第6，113,918號中 指述。一種AGP為2-[(R)-3-四癸醯氧基四癸醯基胺基]乙基 2-脫氧基-4-0-膦醯基-3-0-[(R)-3-四癸醯氧基四癸醯基]-2-[(R)-3-四癸醯氧基四癸醯基-胺基葡萄哌喃糖苷，其 亦稱為529(原先稱為RC529)。此529佐劑係調配為水性形 式（AF)或穩定乳液（SE)。 I 其他佐劑包括胞壁醯肽，諸如N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇 月安醯基-D-異麩胺醯胺（thr-MDP)、N-乙醯基-非胞壁醯基-L-丙胺酸-2-(Γ-2’二軟脂醯基-sn-甘油醯基-3-羥基磷醯氧 基）-乙胺（MTP-PE);水包油乳液，諸如MF59(國際PCT公 開案第WO 90/14837號）（含有5%角鯊烯、0·5% Tween 80及 0.5% Span 8 5(視情況含有各種量之MTP-PE)，使用諸如型 號110Y微流化床裝置（Microfluidics，Newton，MA)之微流 北床裝置調配為次微米粒子）及SAF(含有1 0%角鯊烯、 127230.doc -39- 200844226 0.4% Tween 80、5%泊洛尼克（pluronic)嵌段共聚物L121及 thr-MDP，微流體化為次微米乳液或渦動產生較大粒度乳 液）；不完全費氏佐劑（incomplete Freund’s adjuvant， IFA);鋁鹽（明礬），諸如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁；愛 菲金（Amphigen);阿夫立定（Avridine) ; L121/角鯊稀；D-丙交酯·聚丙交酯/糖苷；泊洛尼克多元醇；殺死之武 存彦（方;息角苷，諸如在美國專利第5,057,540號 中描述之 Stimulon™ QS-21 (Antigenics5 Framingham, ΜΑ·)、在美國專利第5,254,339號中描述之ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville，Australia)及免疫刺激複合物 ·，結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis) ·， 細菌脂多醣；合成聚核苷酸，諸如含有CpG基元之寡核苷 酸（例如美國專利第 6,207,646 號）；IC-31 (Intercell AG， Vienna，Austria)，在歐洲專利第 1，296,713號及第 1，326,634 號中描述；百曰咳毒素（PT)或其突變體、霍亂毒素或其突 變體（例如國際卩(：丁公開案第\¥0 00/18434號、第\^0 02/098368號及第WO 02/098369號）；或乂廣#磨不耐熱腸 毒素（LT)，尤其 LT-K63、LT-R72、PT-K9/G129 ;參見例 如，國際PCT公開案第WO 93/13302號及第WO 92/19265 號。 投藥方式 該等免疫原性組合物可非經腸投與，例如藉由注射，經 皮下或經肌肉内投與，以及經口或經鼻内投與。用於肌肉 内免疫之方法係由Wolff等人及Sedegah等人描述。其他投 127230.doc -40- 200844226 弋和用（例如，但不限於）口服調配物、肺用調配物、 栓劑及經皮施用。口服調配物例如包括該等通常所用之賦 ㈣卜例如（但不限於）醫藥等級之甘露糖醇、乳糖、殺 爭刀硬月曰酸_、糖精納、纖維素、碳酸鎮及其類似物。 本發明之免疫原性組合物可以ISC〇MS(免疫刺激複合 物）之形式傳遞’ ISC()MS含有CTB、脂質體或封裝於諸如 烯駄S曰或聚（DL-丙交酯·共·糖苷）之化合物中以形成適於
吸收尺寸之微球體。本發明之蛋白質亦可併入油性乳液 中。 多種抗原 匕括本毛明之蛋白質、聚核苷酸及相等物之免疫原性試 d可以免疫原性組合物中之溶膠活性免疫原形式投與，或 另外組合物可包括其他活性免疫原，包括其他Μ歸免 疫原性多肽或一或多種其他微生物病原體（例如（但不限於） 病t、朊病毒、細菌或真菌）之免疫活性蛋白質或莢膜多 聽。組合物可包含—或多種所需蛋自f、片段或所選適應 症所需之醫藥化合物。以相同方式，#用免疫原性組合物 中之一或多種核酸的本發明之組合物亦可包括編碼如上所 述之相同各種蛋白質組的核酸。 本發明涵蓋任何多抗原或多價免疫原性組合物。舉例而 口，本發明之組合物可包含兩種或兩種以上2〇86蛋白質之 、、且& 2086蛋白質與一或多種Por A蛋白質之組合，2086 蛋白質與腦膜炎球菌血清群A、c、丫及W135多醣及/或多 醣結合物之組合，2086蛋白質與腦膜炎球菌及肺炎球菌組 127230.doc -41 - 200844226 口之組合，或上述任一者以適合於黏膜傳遞之形式的組 口。沾習此項技術者將易能夠調配該等多抗原或多價免疫 組合物。 本發明亦涵蓋多免疫療法，其中適用於對抗病原體之任 何組合物可組合於其中或與本發明之組合物組合。舉例而 吕，但不限於，可向患者投與本發明之免疫原性組合物及 作為多免疫療法之一部分的用於免疫抵抗I芡鐽硪磨（& 户以以）的另一免疫組合物。熟習此項技術者將易能 夠k擇免疫原性組合物與本發明之免疫原性組合物聯合使 用以實現開發及實施多免疫療法之目的。 本發明之特定實施例係關於一或多種本發明之多肽或編 碼其之核酸在組合物中或作為治療療法之一部分用於預防 或改善#义鐽硪磨感染之用途。吾人可將2086多肽或2086 聚核苷酸與任何免疫原性組合物組合以用於抵抗I芡鐽硪 磨感染。吾人亦可將2086多肽或2086聚核苷酸與任何其他 基於蛋白質或多醣之腦膜炎球菌疫苗組合。 086夕肽、片#又及相專物可用作結合物免疫原性組合物 之一部分；其中一或多種蛋白質或多肽與載體結合以產生 具有抵抗若干血清型及/或抵抗若干疾病之免疫原性特性 之組合物。或者，2086多肽之一者可用作其他免疫原性多 肽之載體蛋白。 本發明亦係關於一種誘發哺乳動物體内之免疫反應的方 法，其包含向該哺乳動物提供本發明之免疫原性組合物之 步驟。該免疫原性組合物為在所治療動物或人類體内具有 127230.doc -42- 200844226 抗原性使得該組合物中所含之免疫有效量之多肽引起對抗 I廣爻奈還#感染之所需免疫反應的組合物。較佳實施例 係關於一種包括改善或預防廢廯爻奈遂磨感染之治療方 法，其包含向人類投與免疫有效量之組合物。 如本文所使用，片語”免疫有效量”係指將該量以單次劑 量或作為一系列劑量之部分投與哺乳動物宿主（較佳人 類），足以至少引起所治療個體之免疫系統產生降低細菌 感染之臨床影響的反應。此可在預防感染之最小細菌負荷 降低之範圍内。理想地，所治療個體將不展現細菌感染之 更嚴重臨床表現。劑量之量可視個體之特定情況而變化。 此量可以常規試驗或者藉由熟習此項技術者已知之方法測 定。 本發明之另一特定態樣係關於使用表現本發明之蛋白質 或其免疫原性部分之載體或質體作為免疫原性組合物。因 此，本發明之另一態樣提供一種誘發哺乳動物體内之免疫 反應之方法，其包含向哺乳動物提供表現至少一種經分離 2086多肽之載體或質體。本發明之蛋白質可使用活載體， 尤其使用活重組細菌、病毒或含有表現作為外來多肽之多 肽或免疫原性部分所必需之遺傳物質的其他活試劑傳遞至 哺乳動物。 根據本土明之另一實施例，提供一種診斷哺乳動物之細 菌性腦膜炎之方法’其包含：偵測哺乳動物體内或來自該 哺乳動物之組織樣品中免疫複合物之存在，使該哺乳動物 或組織樣品與包含抗體之抗體組合物接觸，該等抗體係與 127230.doc -43· 200844226 至少一種包含偶數SEQ ID NO: 2-12之任一者之胺基酸序 列的多肽免疫特異性結合；其中使哺乳動物或組織樣品與 該抗體組合物在適於形成該免疫複合物之條件下接觸。 病毒及非病毒載體 較佳載體、尤其用於活體外及活體内細胞檢定之載體為 病毒載體，諸如慢病毒、反轉錄病毒、疱疹病毒、腺病 毒、腺相關病毒、殖瘡病毒、桿狀病毒及具有所需細胞向 性之其他重組病毒。因此，編碼2086蛋白質或其免疫原性 片&之核I可使用病毒載體或經由直接引入dna而活體 内、離體或活體外引入。在目標組織中之表現可藉由使轉 殖基因載體靶向特定細胞’諸如用病毒載體或受體配位 體，或藉由使用組織特異性啟動子或兩者來實現。目標基 因傳遞係在PCT公開案第彻95/28494號中描述，該案以 引用的方式全部併入本文中。 书用於活體内或離體乾向及治療程序之病毒載體為基於 腦之載體及反轉錄病毒載體。用於建構及使用病毒載體 之方法在此項技術中已知（例如Miller及Rosman， 价〇7^叫咖，i992, 7:980-99)。較佳土也，病毒載體有複製 缺亦即其不旎在目標細胞中自主複製。較佳地，複製 缺，為最小病4，亦即其僅保留其封裝基因組以產生 病毒粒子所必需之基因組之序列。 病母载體包括減毒或缺陷DNA病毒，諸如（但不限 於）單純癌療病毒（聊）、乳頭瘤病毒、E-B病毒（Epstein Μ咖8，EBV)、腺病毒、腺相關病毒（AAV)及其類似 127230.doc • 44 - 200844226 物。全部或幾乎全部缺乏病毒基因之缺陷病毒較佳。缺陷 病毒在引入細胞中後不具感染性。缺陷病毒載體之使用允 許向特異性限定區域之細胞投與，而不考慮載體可感染其 他細胞。因此，可明確靶向特定組織。特定載體之實例包 括（但不限於）缺陷疱疹病毒1(HSV1)載體（Kaplitt等人， Mo/ec. Ce//. TVewrwcz··，1991，2:320-330)、缺乏醣蛋白 L基 因之缺陷疱疹病毒載體或其他缺陷疱疹病毒載體（PCT公開 案第WO 94/21807號及第WO 92/05263號）；減毒腺病毒載 體，諸如由 Stratford-Perricaudet 等人（J. C//n. 1992，90:626-630;亦參見 La Salle 等人，心化加心 1993， 259:988-990)描述之載體；及缺陷腺相關病毒載體 (Samulski 等人，J. Virol·，1987, 61:3096-3 101 ; Samulski 等 人，义 Virol·，1989， 63:3 822-3 828 ; Lebkowski 等人，Mo/· Ce//· 5ζ·ο/·，198 8, 8:3 98 8-3996)，其中每一者均以引用的方 式全部併入本文中。 各種公司商業上生產病毒載體，該等公司包括（但不限 於）Avigen，Inc. (Alameda，CA ; AAV載體）、Cell Genesys (Foster City，CA ;反轉錄病毒、腺病毒、AAV載體及慢病 毒載體）、Clontech(反轉錄病毒及桿狀病毒載體）、Genovo, Inc.(Sharon Hill，PA ;腺病毒及 AAV載體）、Genvec(腺病毒 載體）、IntroGene (Leiden，Netherlands ;腺病毒載體）、 Molecular Medicine(反轉錄病毒、腺病毒、AAV及疮療病 毒載體）、Norgen(腺病毒載體）、Oxford BioMedica(Oxford, United Kingdom ;慢病毒載體）及 127230.doc -45- 200844226
Transgene(Strasbourg，France ;腺病毒、痘瘡、反轉錄病 毒及慢病毒載體），其以引用的方式全部併入本文中。 腺病毒載體。腺病毒為可經修飾以將本發明之核酸有效 傳遞至多種細胞類型之真核DNA病毒。存在腺病毒之多種 血清型。在此等血清型中，在本發明之範疇内較佳使用2 型或5型人類腺病毒（Ad 2或Ad 5)或動物來源之腺病毒（參 見PCT公開案第WO 94/269 14號）。在本發明之範疇内可使 用之彼等動物來源之腺病毒包括犬、牛、鼠（實例： Mavl，Beard等人，Virology, 1990，75-81)、綿羊、緒、鳥 及猿（實例：SAV)來源之腺病毒。較佳地，動物來源之腺 病毒為犬腺病毒，更佳為CAV2腺病毒（例如Manhattan或 A26/61菌株，例如ATCC VR-800)。各種複製缺陷腺病毒 及最小腺病毒載體已有所描述（PCT公開案第WO 94/26914 號、第 WO 95/02697 號、第 WO 94/28938 號、第 WO 94/28152號、第 WO 94/12649號、第 WO 95/02697號、第 WO 96/22378號）。根據本發明之複製缺陷重組腺病毒可藉 由熟習此項技術者已知之任何技術製備（Levrero等人， Gew，1991，101:195 ;歐洲公開案第 EP 185 573 號； Graham，EMBO J·，1984，3:2917 ; Graham等人 Ge”. P7ro/.，1977, 3 6:59)。回收重組腺病毒且使用一般熟習此項 技術者熟知之標準分子生物技術將其純化。 線相關病毒。腺相關病毒（A A V)為相對小尺寸之D N A病 毒，其可以穩定及位點特異性方式整合至其所感染之細胞 之基因組中。其能夠感染廣泛範圍之細胞，而不誘導對細 127230.doc -46- 200844226 胞生長、形態或分化之任何影響，且其似乎並不涉及人類 病狀。已選殖、定序且表徵AAV基因組。使用源自AAV之 載體在活體外及活體内轉移基因已有所描述（參見，PC丁公 開案第WO 91/18088號及第WO 93/09239號；美國專利第 4,797,368號及第5，139,941 號；歐洲公開案第EP 488 528 號）。根據本發明之複製缺陷重組AAV可藉由將含有兩側 為兩個AAV反向末端重複（ITR)區之相關核酸序列的質體 及帶有AAV包裝基因（rep及cap基因）之質體共轉染至經人 ( ' 類輔助病毒（例如腺病毒）感染之細胞株中。接著藉由標準 技術純化所產生之AAV重組體。 及為f #病#裁禮。在本發明之另一實施例中，核酸可引 入反轉錄病毒載體中，例如以下文獻中所述：美國專利第 5，399,346號；Mann等人，Ce//，1983, 33:153 ;美國專利第 4,650,764及 4,980,289號；Markowitz等人，丄 FzW·，1988, 62:1120;美國專利第5，124,263號；歐洲公開案第£?453 242及 EP 178 220號；Bernstein 等人，Gwei.五叹·，1985, I 7:235 ; McCormick，⑽/og少，1985，3:689 ; PCT公開
案第 WO 95/07358號；及 Kuo等人，5/oW，1993, 82:845， 其每一者均以引用的方式全部併入。反轉錄病毒為感染分 裂細胞之整合病毒。反轉錄病毒基因組包括兩個LTR、一 個包裝序列及三個編碼區（g%、pW及πv)。在重組反轉錄 病毒載體中，gag、pol及env基因通常整個或部分缺失’且 經相關異源性核酸序列置換。此等載體可自不同類型之反 轉錄病毒建構，該等反轉錄病毒係諸如HIV、MoMuLV 127230.doc -47- 200844226 (’’鼠莫洛尼白血病病毒（murine Moloney leukaemia virus)1’）、MSV(n 鼠莫洛尼肉瘤病毒（murine Moloney sarcoma virus)”）、HaSV(n哈維肉瘤病毒（Harvey sarcoma virus)’’）； SNV(n脾壞死病毒’’）；RSV ("勞斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus)’’）及弗氏病毒（Friend virus)。合適之包裝細 胞株已在先前技術中描述，尤其細胞株PA3 17(美國專利第 4,861，719號）；卩81011?細胞株（？(：1：公開案第\¥0 90/02806 號）及GP+envAm-12細胞株（PCT公開案第WO 89/07150 號）。另外，重組反轉錄病毒載體可在LTR中含有抑制轉錄 活性之修飾以及可包括gag基因之一部分之廣泛包裝序列 (Bender等人，/· 1987，61:1639)。藉由一般熟習此 項技術者已知之標準技術純化重組反轉錄病毒載體。 反轉錄病毒載體可經建構以充當感染性粒子或經歷單輪 轉染。在前一種情況下，病毒經修飾以保留除造成致癌轉 型特性之彼等者外的其所有基因，且表現異源性基因。非 感染性病毒載體經操縱以破壞病毒包裝信號，但保留包裝 經工程化以含有異源性基因及包裝信號之共引入病毒所需 之結構基因。因此，所產生之病毒粒子並不能夠產生其他 病毒。 反轉錄病毒載體亦可藉由DNA病毒引入，此允許一個反 轉錄病毒複製循環且放大轉染效率（參見PCT公開案第WO 95/22617號、第 WO 95/26411 號、第 WO 96/39036 號及第 WO 97/19182號）。 慢病毒載體。在本發明之另一實施例中，慢病毒載體可 127230.doc -48- 200844226 用作在包括大腦、視網膜、肌肉、肝及血液之若干組織類 型中直接傳遞及持續表現轉殖基因的試劑。該等載體可有 效轉導此等組織中之分裂及非分裂細胞，且實現相關基因 之長』表現。關於評論，參見Naidini，Curr· Opin. Biotechnol·，1998, 9:457·63 ;亦參見Zufferey，等人，乂 1998, 72:9873-80。慢病毒包裝細胞株係可獲得的且 通常在此項技術中已知。其促進用於基因治療之高效價慢 病毒載體之產生。一實例為四環素可誘導之VSV_G假型慢 病毒包裝細胞株，其可產生效價大於1〇6 m/mL2病毒粒 子歷日守至y 3至4天（Kafri，等人，j厂，1999，73 : 576· 584)。由可誘導之細胞株產生之載體可按活體外及活體内 有效轉導非分裂細胞之需要來濃縮。
非病毒載趙。在本發明之另一實施射，載體可藉由以 裸DNA形式之脂質轉染或用其他轉染促進劑（肽、聚合物 等）在活體内引入。合成陽離子脂質可用於製備活體内轉 染編碼標記之基因之脂質體（Felgner，等人，pr〇c·他化
Acad. Sci. U.S.A. 1987, 84:7413-7417 ； Feigner A Ringold,
Science，1989, 337:387_388 ;參見Mackey，等人， #如/· AW. t/u.，1988, 85:8〇27-8〇3i ; 等人， ⑽卿，密3, 259:1745_1748)。用於轉移核酸之適用脂質 化合物及組合物係在PCT專利公開案第w〇 95/ι “Μ號及 第购則則號及美國專利第5,459，127號中描述。脂質 可出於靶向之目的與其他分子化學偶合(參見M—，等 人，見上）。例如激素或神經傳_及諸如抗體之蛋白質 127230.doc -49- 200844226 之目標肽或非肽分子可與脂質體化學偶合。 其他分子亦適用於促進核酸之活體内轉染，諸如陽離子 寡肽（例如PCT專利公開案第WO 95/2193 1號）、源自DNA結 合蛋白之肽（例如PCT專利公開案第WO 96/25508號）或陽離 子聚合物（例如PCT專利公開案第WO 95/21931號）。 亦有可能以裸DNA質體形式活體内引入載體。用於疫苗 目的或基因治療之裸DNA載體可藉由此項技術中已知之方 法引入所需宿主細胞中，該等方法係例如電穿孔、微量注 射、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沈澱、使用基因槍 或使用DNA載體轉運體（例如，Wu等人，/· C/^m·， 1992，267:963-967 ; Wu 及 Wu，，价〇/· C/^m·， 1988, 263:14621-14624 ;加拿大專利申請案第2,012,311號； Williams等人，proc· Natl. Acad. Sci. USA，1991，88:2726-2730)。亦可使用受體介導之dNA傳遞方法（Curiel等人， //謂· r/zer·，1992，3:147-154 ; Wu 及 Wu，J· 5M/· CT^m·，1987，262:4429-4432)。美國專利第 5,580,859 號及 第5,589,466號揭示在哺乳動物體内在無轉染促進劑情況下 外源性DNA序列之傳遞。最近，稱為電轉染之相對低壓高 效之活體内DNA轉移技術已有所描述（Mir等人，C.P. dead. 5W·，1988, 321:893 ; PCT公開案第 WO 99/01157號；第 WO 99/0 11 58號；第WO 99/0 11 75號）。因此，本發明之其他實 施例係關於一種誘發人類體内之免疫反應的方法，其包含 向該人類投與適量編碼本發明之2086多肽之DNA分子，視 情況以及轉染促進劑，其中該多肽在表現時保留免疫原性 127230.doc -50- 200844226 且在併入免疫原性纟人 後用太赶涔届 1投與人類時提供保護而在隨 病原體(諸如崎蝴)感染人類後不誘 《疾病增強.。轉染促進劑在此項技術中已知且包括布比卡 因(bupiVlcaine)及其他局部麻醉劑(例# |見美國專利第 5,739，118號）及陽離子多元胺（如在國際專利中請案觸 96/1 0038中所公開），該等專利以引用的方式併人本文中。 本發明亦係關於-種抗體，其可能為單株或多株抗體， 對如上所述之鳩多肽具有特異性。該等抗體可藉由熟習 此項技術者所熟知之方法產生。 細菌表現系統及質體 i 本發明亦提供一種重組DNA分子，諸如載體或質體，其 包含具有啟動子序列及起始子序列之表現控制序列及編碼 本發明之多肽之核苷酸序列，該核苷酸序列位於啟動子及 起始子序列之3,端。在另一態樣中，本發明提供一種能夠 表現2086多肽之重組DNA選殖載體，其包含具有啟動子序 列及起始子序列之表現控制序列及編碼2〇86多肽之核苷酸 序列，該核苷酸序列位於啟動子及起始子序列之3,端。在 另一態樣中，提供一種含有如上所述之重組DNa選殖載體 及/或重組DNA分子之宿主細胞。合適之表現控制序列及 侣主細胞/遥殖載體組合在此項技術中熟知，且例如在 Sambrook等人（1989)中描述。 一旦表現本發明之所需多狀之重組DNA選殖載體及/或 伯主細胞猎由用含有相應2 0 8 6聚核苦酸之質體轉型、轉千 或感染該等選殖載體或宿主細胞來建構，在表現多肽之條 127230.doc -51 - 200844226 件下培養選殖載體或宿主細胞。接著藉由熟習此項技術者 所熟知之技術分離大體上不含污染宿主細胞組份之多肽。 本發明包括以下實例以證明本發明之較佳實施例。熟習 此項技術者應瞭解，以下實例中所揭示之技術代表發明者 所發現在實踐本發明時運作良好之技術，且因此可視作構 成用於其實踐之較佳方式。然而，鑒於本發明之揭示内 容，熟習此項技術者應瞭解可在不脫離本發明之精神及範 嘴情況下在所揭示之特定實施例中作出許多改變且仍然獲 得類似或相似結果。 實例 實例1 能夠引出抵抗異源菌株之殺菌性抗體之奈瑟菌膜蛋白提取 物的鑑別： 參看下表II，已展示LOS(脂寡醣）空乏之外膜蛋白製劑 引出殺菌性抗體。此等抗體常常針對各別菌株之PorA。來 自灰清群B腦膜炎球菌菌株8529(6:15:1>1713,3)之1^〇8空乏 外膜製劑在此方式中非比尋常，因為其出乎意料地引出若 干異源菌株之殺菌性抗體。 127230.doc 52- 200844226
表格II 抵抗潘廯爻奈瑟磨之不同菌株之抗SOMP的BC活性 抗血清第6週 Η44/76 5315 Η355 Μ982 880049 8529* ΝΜΒ 血清亞型 Pl.7,16 Ρ1·5 Ρ1.15 Ρ1.9 Ρ1.4 Ρ1.3 Ρ1·5,2 sOMPH44/76 25pg QS-21 20 μ8 1,000 <50 <50 <50 <50 980 <50 sOMP5315 25pg QS-21 20 μζ 50 <50 <50 <50 <50 2170 <50 8〇1\«>11355 25蚪运 QS-21 20 <50 <50 450 <50 <50 860 <50 sOMPM982 25pg QS-21 20 μζ 92 <50 <50 300 <50 1100 <50 sOMP 880049 25 pg QS-21 20 μζ 50 <50 <50 <50 <50 1190 <50 sOMP8529 25pg QS-21 20 μβ 1,000 <50 450 50 215 >4050 (81.7) <50 sOMP2996 25pg QS-21 20 μβ <50 <50 <50 <50 <50 790 148 全細胞對照血清25 pg 3DMPL25 μβ 450 50 100 500 150 >1350 (66.0) 952 為促進造成引出異源性殺菌性抗體之抗原之分離及表 徵，吾人設法鑑別何種清潔劑最佳地提取抗原。 菌株及培養條件 將來自冷凍小瓶之腐廯爻奈瑟磨菌株8529於GC盤上劃 線。（該腦膜炎球菌菌株8529來源於The RIVM，Bilthoven， The Netherlands)。將該盤於36°C/5% C〇2下培養 7.5 h。使 用若干菌落接種於含有50 mL改良Frantz培養基+GC補充劑 127230.doc -53 - 200844226 之燒瓶中。將該燒瓶於36°C下於空氣震盪器中培養且以 200 RPM攪拌4.5 h。使用5 mL接種於含有450 mL改良 Frantz培養基+GC補充劑之費氏燒瓶（Fernbach flask)中。 將該燒瓶於36°C下於空氣震盪器中培養且以1〇〇 RPM攪拌 11 h。使用全部450 mL接種於10 L酸酵槽中之8.5 L改良
Frantz培養基+GC補充劑中。 改良Frantz培養基之組成： 麩胺酸 1.3 g/L 半胱胺酸 0.02 碟酸氫二鈉，7水合物 10 氯化鉀 0.09 氯化納 6 氣化按 1.25 透析酵母提取物（YE) 40 ml (25% YE溶液相對於5體積之dH20透析隔夜，接著高壓釜 處理） GC補充劑1〇〇χ，過濾器滅菌 右旋糖 400 g/L 麩胺酸 10 輔羧化酶 0.02 硝酸鐵 0.5 在醱酵期間控制以下參數 :溫度=36°C ; pH=7.4 ;溶解 氧=20%。添加若干滴P_2〇〇〇消泡劑以控制發泡。使培養物 生長至穩定期。藉由於OD650 = 5.25下離心收穫細胞。通常 127230.doc -54- 200844226 自約8.5 L培養物收穫總共100_300公克濕細胞糊狀物。 來自引出異源性殺菌性抗體之腦膜炎球菌之外膜蛋白部 分（fraction)的部分純化：
將100 gms濕重之細胞懸浮於五倍濕重體積中（含有10 mM HEPES-NaOH (pH 7.4)、1 mM Na2EDTA)且藉由於約 18,000 psi下流過裝備有腔室之110γ流化床裝置來溶胞。 使細胞溶菌液澄清且藉由於1〇。〇下以300,000xg離心1小時 來分離細胞被膜。藉由用均質器懸浮，接著如上離心來用 相同緩衝劑將細胞被膜洗滌2次。接著用320 mL於10 mM HEPES-NaOH (pH 7·4)、1 mM MgCl2 中之 l〇/〇(w/v)Triton X-100提取細胞被膜。參看下表m，使用Trit〇n X_100及兩 性洗滌劑（Zwittergent)3-14連續差示清潔劑提取，接著使 小鼠免疫之結果使得吾人判定Triton提取物最佳地提取相 關候選物。接著藉由在BioRad Rotophor裝置中之製備型等 電點聚焦（IEF)來將引起抵抗表⑴中所列之5種菌株中之4 種的殺菌性抗體反應之此Triton X-100提取物分級分離。 兩性電解質濃度為與1% pH 4-6混合之1% pH 3-10。如表 III中所示，發現若干部分引起異源性殺菌性反應。如殺菌 性檢定所測定，聚焦於5.5-7· 8之pH值範圍内的自IEF獲得 之部份引起對大多數菌株之異源性反應。濃縮彙集之IEF 部份且藉由乙醇沈澱移除兩性電解質。藉由使在約5·5_7·8 之pH值範圍内獲得之一些蛋白吸附於陰離子交換柱上且比 較用已吸附及未吸附之蛋白使小鼠免疫後獲得的殺菌活性 來達成進一步純化。再次參看表π，雖然許多蛋白吸附於 127230.doc •55- 200844226 陰離子交換樹脂上，但未由管柱吸附之蛋白引出更多異源 性殺菌性抗體。
表III
BC50目標菌米 方法 部分 H44/76 880049 H355 539* M982 LOS 空乏 sOMP 1，000 215 450 NC 50 清潔劑 提取 細胞質提取物 200 NT NT NT NT TX-100 >800 >800 >800 >800 <25 兩性洗條劑3-12 400 >25 100 400 <25 兩性洗務劑3-14 <25 NT NT NT NT Zw.3-14+NaCl <25 NT NT NT NT 十二烷基肌胺酸鈉 <25 NT NT NT NT Zw.3-14+加熱 <25 NT NT NT NT 製備型 部分l-3(pH 2.3-3.9) 50 NT NT NT NT IEF 部分 4(pH4.1) >800 <25 100 <25 NT 部分 5(pH4.3) >800 <25 100 200 NT 部分 6(pH4.5) 400 NT NT NT NT 部分 7(ρΗ4·8) <25 NT NT NT NT 部分 8-9(ρΗ5·0-5.3) <25 NT NT NT NT 部分 10-17(pH 5.5-7.8) >800 200 <800 <800 NT 陰離子 交換 已吸附 400 NT 100 100 NT 未吸附 >6,400 NT <800 <800 NT NT :未測試 v *臨床分離株539為8529之同源菌株，自相同大量繁殖中分離 如圖1A中所示，藉由SDS-PAGE所測定，兩種主要蛋白 質存在於未吸附部分中。為鑑別此等蛋白質，執行兩種類 型之分析。一種分析為執行有限制之蛋白水解降解（參見 圖1A及圖1B)，接著分離肽且直接蛋白質定序。另一種分 析為執行SDS-PAGE，接著凝膠切取、蛋白水解消化及LC-MS/MS(液體層析聯合質譜法），（參見圖3)以獲得關於相關 製劑之組份的質譜資訊。（參見本節中隨後描述之肽定位 127230.doc -56- 200844226 及定序方法）。 使用 Zagursky and Russell，2001，BioTechniques，3 1:636- 659中所述之方法及演算法分析腐廯义奈彥磨a Sanger染 色體組序列。此挖掘分析產生超過12,000個可能開放閱讀 框架（ORF)。上文所述之直接序列資料及質譜資料兩者表 明未吸附部分之主要組份為存在於Sanger資料庫之分析中 之若干ORF的產物。由此方法鑑別之三種主要蛋白質對應 於 ORF 4431、5163 及 208 6(參見圖 1B 及 3)。 儘管ORF 443 1為部分中所鑑別之最主要蛋白質，但重組 月曰I化443 1之小鼠抗體不具有殺菌性且在動物模型中不提 供保護反應。進行ORF 5163之另一分析。 本文中所述之製劑之第二最主要組份對應於〇RF 2086之 產物。 免疫原性方法： 抗血清之製備： 除有註釋外，將蛋白質組合物/疫苗用25叫總蛋白質調 配且用20 pg QS-21作佐劑。在第〇及4週藉由皮下（臀部）注 射將〇_2 mL劑量投與6-8週齡雌性Swiss-Webster小鼠。在 第〇及4週收集血液，且在第6週執行最後放血。 殺菌性檢定： 基本上如所描述執行殺菌性檢定（參見]^〇11加2〇町〇3及 H〇Well，2000, /· C"«•施cr〇W· 38(8):2878 2884)。sba 之補體介導之抗體依賴性殺菌效價係表示為殺死5〇%引入 檢定中之目標細胞之測試血清的最高稀釋度之倒數（BC5〇 127230.doc -57· 200844226 效價）。 用於鑑別2 0 8 6蛋白質之方法： 片段之溴化氰裂解及直接定序： 陰離子交換未吸附部分（AEUF)之溴化氰裂解。用9〇%冷 乙醇使AEUF沈澱且用70%甲酸中之1〇 mg/mL溴化氰將其 溶解至1 mg/mL之蛋白質濃度。於室溫下在黑暗中執行反 應隔夜。藉由快速真空乾燥裂解產物，且用HE/〇1%還原 TX-100溶解小球。使用SDS-PAGE，接著N末端胺基酸定 f 序鑑別此部分之組份。 用於鑑別組份之蛋白酶消化/逆相/N末端定序·· 用GluC(V8)、LysC或ArgC消化AEUF。蛋白質與酶之比 率為30吨蛋白質比1盹酶。於37χ：下進行消化隔夜。使消 化之蛋白質混合物（30 pg)通過七微米AqUap0re rf-300管 柱且用10-95%乙腈於〇·ΐ 〇/。三氟乙酸中之梯度溶離，且手動 收集峰。亦使無蛋白質空白通過柱，且自樣品層析圖減去 , 來自此空白之峰。藉由質譜儀分析僅發生在樣品過柱時之 i 峰，且分析彼等產生純質量之樣品以用於N末端胺基酸定 序。 N末端胺基酸定序： 對於自墨點切取之譜帶而言，將蛋白質樣品自SDS凝膠 轉移至PVDF膜，用醯胺黑（於去離子水中之1〇%乙酸、 〇· 1 %酿胺黑）染色且於1 〇%乙酸中脫色。接著使用曱醇清洗 之小刀或迷你Exacto刀自所有十條色帶切取所需蛋白質譜 可且將其置於Applied Bio systems 477A蛋白質定序5|之反 127230.doc -58- 200844226 應濾筒中。對於溶液中樣品之直接定序而言，組裝Pr〇s〇rb 濾筒且用60 μί甲醇濕潤PVDF。用5〇此去離子水沖洗 PVDF且將樣品（50 μι)裝載於pVDF上。使用5〇吣去離子 水沖洗樣品後’將Prosorb PVDF打孔，乾燥，且置於 Applied Biosystems 477A蛋白質定序器之反應濾筒中。對 於兩種方法而言，隨後在最優墨點條件下使Applied Biosystems N末端定序器運作12個或更多個循環（1個循環 空白、1個循環仏準，且所需殘基鑑別為丨〇個或更多個循 環）且於 Applied Biosystems 120A PTH 分析器上進行 PTH_ 胺基酸偵測。於類比圖表記錄器上及用數位方法經由儀器 摩人體收集δ亥專循ί衣。使用類比及數位資料，藉由比較ρτΗ_ 胺基酸之標準組及其於分析器上之各別滯留時間來進行胺 基酸分配（半胱胺酸殘基在轉化期間被破壞且未偵測到）。 可自單一殘基獲得多個序列資訊且基於信號強度得到一級 分配對比二級分配。
LC-MS/MS 藉由SDS -聚丙稀醯胺凝膠電泳進一步分析藉由ief純化 之蛋白質樣品。藉由庫馬斯（Coomaasie)藍染色觀察蛋白 質，且手動切取相關譜帶，接著將其還原，烷基化及使用 自動凝膠内胰蛋白酶消化自動儀器用胰蛋白酶 (Promega，Madison，WI)原位消化。消化後，使用 Savant Speed Vac濃縮器（ThermoQuest，Holdbrook，NY)將肽提取 物濃縮至10-20 pL之最終體積。 •於自動微電喷逆相HPLC上分析肽提取物。簡言之，微 127230.doc -59- 200844226 電喷界面係由Picofrit溶融二氧化矽喷霧針組成，其長度 為 50 cm、ID 為 75 μηι 、孑L 口直徑（New Objective， Cambridge MA)為 8 μιη，裝有 1 0 μιη長度為 1 0 cm之 C 1 8 逆相珠粒（YMC，Wilmington，NC)。將 Picofrit針安裝於 固持於自製基座上之光纖固持器（Melles Griot，Irvine， CA)中，該自製基座係定位於質譜儀偵測器前方。經由 鈦接頭將管柱之後部垂直以向電喷界面供應電連接。該 接頭與管接於連接於HPLC溶劑泵（八81140(：，？61^11-Elmer，Norwalk，CT)之 FAMOS 自動取樣器（LC-Packings， San Francisco，CA)之一段溶融二氧化石夕毛細管（FSC)連 接。HPLC溶劑泵傳遞50 pL/min之流量，使用PEEK microtight 對開三通（splitting tee)(Upchurch Scientific， Oak Harbor，WA)將其降低至250 nL/min，且接著使用 FSC輸送管傳遞至自動取樣器。LC泵及自動取樣器各自 使用其内部使用者程式來控制。將樣品插入塑膠自動取 樣器小瓶中，密封，且使用5 pL樣品環管注射。 微毛細管HPLC_質譜法： 藉由微電喷HPLC系統，使用0-50%溶劑B (A : 0·1 Μ HoAc，Β : 90% MeCN/0.1 M HoAc)之 50 分鐘梯度分離自 凝膠内消化液提取之肽。在於1.5 kV之喷霧電壓下操作且 使用150°C之加熱毛細管溫度之Finnigan LCQ離子阱質譜 儀（ThermoQuest，San Jose, CA)上進行肽分析。使用具備 儀器之資料獲取軟體以自動MS/MS方式獲得資料。獲取方 法包括1 MS掃描（3 75-1200 m/z)，接著MS掃描中最豐富 127230.doc -60- 200844226 3種離子之MS/MS掃描。利用動態排除及同位素排除功 能增加所分析之肽離子之數目（設置：3 amu=排除寬度， 3 min=排除持續時間，30秒=預排除持續時間，3 amu=同 位素排除寬度）。使用SEQUEST電腦演算法合併使用源自 廢廯义奈虛磨（來自Sanger)之完整基因組之蛋白質資料庫 的 Finnigan Bioworks資料分析包（ThermoQuest，San Jose， CA)執行MS/MS資料之自動分析。研究之結果在圖3中說 明。 實例2 重組脂質化P2086(RLP2086)之選殖： A.)原生前導序列： 源材料· 藉由PCR，自稱為8529之血清群B廢腐义奈茗磨菌株之 臨床分離株擴增ORF 20 86基因。此菌株之血清群、血清型 及血清亞型係以括號展示；8529 (Β··15，Pl:7b，3)。此腦膜 炎球菌菌株來源於The RIVM， Bilthoven， The Netherlands 〇 PCR擴增及選殖策略： ORF 2086之目測檢查表明此基因具有潛在脂蛋白信號序 列。使用專屬隱馬爾可夫模型（Hidden Markov Model)脂蛋 白演算法之其他分析證實ORF 2086含有脂蛋白信號序列。 為以更類似原生構形重組表現P2086，寡核苷酸引子經設 計以擴增脂蛋白信號序列完好之全長基因且基於對腐廯义 奈彥磨A ORF 2086之Sanger序列分析。藉由聚合酶鏈反應 127230.doc -61 - 200844226 (PCR)[ABI 2400 熱循環儀，Applied Biosystems，Foster City，CA]自腐腐爻奈层磨菌株8529擴增2086基因。將正確 尺寸擴增產物接合且選殖至pCR2.1-TOPO (Invitrogen) 中。將質體DNA用Ndel及BamHI限制性消化，凝膠純化且 接合至 pET-27b(+)載體（Novagen)中。 本文中所述之寡核苦酸引子係於Per Septive Bio systems 寡核苷酸合成器（Applied Biosystems，Foster City CA)上使 用β -氰基乙基胺基碌酸自旨化學（Applied Biosystems，Foster City CA)合成。 利用原生前導序列之rLP2086脂蛋白表現： 參看圖5，將質體pPX7340轉型/轉染或感染至 BLR(DE3)pLysS宿主細胞（Life Sciences)中。選擇一種轉化 子且將其接種於50 mL含有2%葡萄糖、卡那黴素 (kanamycin)(3 0 pg/mL)、氯黴素（30 gg/mL)及四環素（12 pg/mL)之極品肉湯中。隔夜培養物之OD600為6.0。將隔夜 培養物於1公升具有1%甘油及相同抗生素之極品肉湯中稀 釋。起始OD600為0.4。2小時後，OD600為1.6且收集預誘 導樣品。將等於OD600=1之細胞離心且移除上清液。將全 細胞小球再懸浮於150 pL Tris-EDTA緩衝劑及150 pL 2xSDS-PAGE樣品緩衝劑中。添加IPTG至1 mM之最終濃 度。3_5小時後，如所描述收集誘導後樣品且於SDS-PAGE 上進行分析（參見圖4)。 rLP2086之純化： 在差示清潔劑提取後增溶來自乂靡#磨之rLP2086。不 127230.doc -62- 200844226 同於在其原生環境中之P2086，rLP2086並不由Triton X-100或兩性洗滌劑3-12顯著增溶。用十二烷基肌胺酸鈉增 溶大部分rLP2086，表明其與乂腐#苈之外膜組份相互作 用，此與其在腐廯爻奈态磨中不同。一旦增溶，則類似於 原生蛋白質來純化rLP2086，因為許多污染乂廣#磨蛋白 質可藉由於pH 8下吸附於陰離子交換樹脂而移除。儘管高 於其理論pi大於半個pH值單位，但在pH 8時rLP2086仍未 吸附。藉由於pH 4.5下使rLP2086吸附於陽離子交換樹脂 來達成進一步純化。 SDS-PAGE後，rLP2086之均質性係在圖2中展示。 rLP2086之質量係藉由MALDI-TOF質譜分析測定為 27,836。此質量與理論質量27,100相差736，此接近細菌脂 蛋白共有之N末端脂質修飾之質量。原生及rLP2086兩者似 乎均為外膜脂蛋白。用N末端定序之嘗試受阻且此與末端 修飾一致。 純化方法： 將表現P2086之BLR DE3 pLysS細胞之冷束小球以20 mL/g濕細胞重量再懸浮於10 mM HEPES-NaOH/1 mM EDTA/1 μg/mL Pefabloc SC 蛋白酶抑制劑（Roche)pH 7·4(ΗΕΡ)中且藉由流化床裝置（Microfluidics Corporation型 號110Y)溶胞。將細胞溶菌液以150,000xg離心1小時。將 離心塊用HEP洗務兩次且離心兩次，且將所得膜離心塊冷 凍隔夜。將離心塊用 10 mM HEPES-NaOH/1 mM MgCl2/l% TX-100 pH 7.4增溶30分鐘，接著以150,000xg離心30分 127230.doc -63- 200844226 鐘。將此重複三次。膜離心塊係如上用50 mM Tris-HC1/5 mM EDTA/1%兩性洗滌劑3-12 pH 8洗滌兩次，接著分別 用 50 mM Tr*is-HCl/5 mM EDTA/1%兩性洗滌劑 3-14 pH 8及 50 mM Tris-HCl/5 mM EDTA/1%兩性洗滌劑 3-14/ 0·5Μ NaCl pH 8洗滌兩次。 接著用50 mM Tris-HCl/5 mM EDTA/1%十二烷基肌胺酸 鈉增溶rLP2086。將此十二烷基肌胺酸鈉提取物調整至1% 兩性洗滌劑3-14(Z3-14)且相對於30倍過量之50 mM Tris-HCl/5 mM EDTA/1% Z3-14透析兩次 。用 90%乙醇使 透析之 rLP2086提取物沈澱以移除殘餘十二烷基肌胺酸鈉，且用 50 mM Tris-HCl/5 mM EDTA/1% Z3-14 pH 8 (TEZ)增溶。 藉由離心移除不可溶物質，使上清液通過陰離子交換層析 管柱，且於未結合之溶離份中收集rLP2086。接著將未結 合之物質相對於30倍過量之25 mM NaAc/1% Z3-14 pH 4.5 透析兩次，且通過陽離子交換層析管柱。將rLP2086用0-0.3 M NaCl梯度溶離且藉由SDS-PAGE(庫馬斯染色）分析。 藉由雷射密度測定法測定rLP2086混合物純度為84%。 rLP2086亞族B之抗血清之表面反應性及殺菌活性。 參看表VII，來自亞族B菌株8529之經純化rLP2086之抗 血清係藉由全細胞ELIS A測試證明對所有十種2086亞族B 菌株之表面反應性。偵測到抵抗表現異源性血清亞型抗原 PorA之十種2086亞族B菌株中之九種的殺菌活性。此等菌 株代表引起整個西歐、美國、澳大利亞及新西蘭之血清群 B腦膜炎球菌疾病之菌株。在殺菌性檢定中唯一未殺死之 127230.doc -64- 200844226 菌株870227藉由全細胞ELISA與抗rLP2086(亞族B)血清強 烈地反應，表明此菌株表現具有與P2086共有之抗原決定 基之蛋白質。 亦藉由全細胞ELISA測試表VII中所列之2086亞族A菌株 之表面反應性。三種此等菌株中之兩種似乎具有極低程度 之反應性，此表明一些2086亞族A菌株可能不與抗rLP2086 亞族B之抗體交叉反應。亦對菌株870446、NMB及6557執 行用於鑑別來自菌株8529之2086亞族B基因之PCR擴增程 序。未偵測到2086亞族B PCR擴增產物。 免疫原性方法： 抗血清之製備： 如先前實例1中所述調配疫苗。然而，使用10 pg劑量。 全細胞酶聯免疫吸附檢定（ELISA):
將廢廯爻奈蘑磨全細胞懸浮液於無菌0.01 Μ磷酸鹽、 0·137 M NaC卜 0·002 M KCl(PBS)中稀釋至於 620 nm下 0.1 之光學密度。自此懸浮液，將0.1 mL添加至Nunc Bac T 96 孔盤（目錄# 2-69620)之各孔中。於室溫下將細胞於盤上乾 燥三天，接著蓋上蓋子，倒置且儲存於4°C下。用洗滌緩 衝劑（0·01 M Tris-HC卜 0.139 M NaCl/KC卜 0.1%十二烷基 聚（氧乙浠二醇醚）n n=23(Brij-35®，可得自 ICI Americas， Inc.，Wilmington，Delaware)，pH 7.0-7.4)將盤洗滌三次。 於PBS、0.05% Tween-20/疊氮化合物中製備抗血清之稀釋 液且將0.1 mL轉移至經塗覆盤中。將盤於37°C下培養兩小 時。將盤於洗滌緩衝劑中洗滌三次。將山羊-抗小鼠IgG 127230.doc -65- 200844226 AP (Southern Biotech)以 1:1500 稀釋於 PBS/0.05% Tween-20 中，將0.1 mL添加至各孔中，且將盤於37°C下培養兩小 時。（如上）洗滌盤。藉由將磷酸對硝基苯酯（Sigma)於1 Μ 二乙醇胺/0.5 mM MgCl2中稀釋至1 mg/mL來製備受質溶 液。將受質以每孔〇. 1 mL添加至盤中且於室溫下培養一小 時。用50 μυ孔之3 N NaOH停止反應且以690 nm作為參考 於405 nm下讀盤。 B.) P4前導序列： PCR擴增及選殖策略： •為最優化rLP2086表現，將2086基因選殖在未分型流滅 嗦蓋#崴之P4信號序列後（Green等人，1991)。用於脂 蛋白選殖之引子係列於表IV中且藉由以下化合物編號來 鑑別：565 8、5660、6473、6543及63 85。使用具有以下 化合物編號5658及5660之引子自腐廯爻奈彥苈B菌株 8529擴增ORF 2086。使用具有以下化合物編號6385及 5660之引子自膺廯义奈蘑磨血清群B菌株CDC1573擴增 ORF 20 86。使用具有以下化合物編號6473及6543之引子 自廢廯义奈靡磨血清群B菌株2996擴增ORF 2086。N末 端（5f)引子經設計以與2086基因之成熟區（起始於胺基酸 位置3處之絲胺酸殘基，剛好位於半胱胺酸之下游）同 源。將限制性位點BamHI(GGATTC)併入各N末端引子之 5’末端且導致甘胺酸殘基在胺基酸位置2處插入成熟蛋 白質中。C末端（3，）引子經設計以與2086基因之C末端同 源且包括終止密碼子以及用於選殖目的之SPhI位點。將 127230.doc -66- 200844226 自各腐廯义奈茗#B菌株擴增之片段選殖至中間載體中 且藉由序列分析筛選。 •將來自合適純系之質體DNA用BamHI及SphI限制酶（New England Biolabs, (NEB))消化。選擇稱為 pLP339 之載體 (由申請案之受讓人供應）作為表現載體。此載體利用 p BAD 1 8_Cm主鏈（Beckwith等人，1995)且含有未分型流 感嗜血桿菌（Green等人，1991)之P4脂蛋白信號序列及 P4基因。將pLP339載體用限制酶BamHI部分消化且接著 經受SphI消化。將擴增之2086片段（BamHI/SphI)各自分 別接合至pLP3 39載體（部分BamHI/SphI)。此選殖策略將 成熟2086基因置於P4脂蛋白信號序列後。BamHI位點保 留在P4信號序列與2086基因之間的選殖接合點處（參見 圖7中所示之質體構築體）。以下為BamHI選殖接合點處 序列之一實例： • [P4信號序列]-TGT GGATCC [保留2086成熟核酸序列] • [P4信號序列]-Cys Gly Ser -[保留2086成熟核酸序列] •參看圖7，將各擴增片段選殖至含有P4前導序列之經修 飾pBAD18-Cm載體中。對表現rP4LP2086(重組P4脂質化 2086)之重組乂 I#窗BLR pPX7343執行醱酵以試圖藉 由添加額外葡萄糖來增加細胞密度。根據Sambrook，將 醱酵槽填充10 L補充有1%葡萄糖之完全M9基本培養 基。 •醱酵槽中葡萄糖之初始濃度為45 g/L。將醱酵槽接種至 約0.25之初始OD。約OD 25時，再添加20 g/L葡萄糖。 127230.doc -67- 200844226 在OD 63.4時葡萄糖空乏時用1%阿拉伯糖誘導培養物。 繼續醱酵直至誘導後3小時。在誘導後t=0、1、2、3時 保存樣品且使用BSA量化蛋白質。t=3時，蛋白質產量 為約0.3 5 g/L，及7%總細胞蛋白質。自約10 L培養物收 穫總共895公克濕細胞糊狀物。 •使用與上文實例2、A小節中所述相同之方法執行 rP4LP2086之純化。 本文中所述之募核皆酸引子係於Per Septive Bio systems 寡核苦酸合成器（Applied Biosystems，Foster City CA)上使 用β-氰基乙基胺基構酸酉旨化學（Applied Biosystems，Foster City CA)合成。用於PCR擴增ORF 2086基因家族之引子係 列於表IV中，該表展示本發明之引子之非限制性實例。 表IV 引子 化合物編號 引子 限制性位點 4623 反向 BamHI 4624 正向 Ndel 4625 正向 5005 正向 5007 反向 5135 反向 Bglll 5658 正向 BamHI 5660 反向 SphI 6385 正向 BamHI 6406 正向 Bglll 及 Ndel 6470 正向 6472 反向 6473 正向 BamHI 6474 正向 Bglll 及 Ndel 127230.doc -68- 200844226 化合物編號 引子 限制性位點 6495 正向 6496 反向 6543 反向 SphI 6605 反向 Bglll 6721 正向 Bglll 及 Ndel 實例3 非脂質化成熟2086蛋白質之發育遺傳學： •為進一步評估2086蛋白質之免疫原性，執行非脂質化 形式之P2086之選殖及表現。 f ORF 2086之PCR基因擴增： 來自各種染色之2086基因可用如PCT/US02/32369(於 2003 年 8 月 7 日以 WO 03/063766公開）及 PCT/US04/11901(於 2004年11月4日以WO 04/094596公開）中所述之引子來擴 增。 此等引子之特徵包括各引子中之合成Bglll限制性位點、 化合物編號6406及6474中之合成Ndel限制性位點及存在於 化合物編號5135及6605中之所有三種閱讀框架中之終止密 、 碼子。引子編號6406及6474擴增具有與第二胺基末端密碼 子（ACG)融合之ATG(Met)的2086基因，此表示成熟2086多 肽之單一胺基酸取代（置換TGC Cys)。 PCR 選殖載體為 TOPO-PCR2.1，Invitrogen，Valencia， CA 〇 用於表現非脂質化2086蛋白質之載體為來自Novagen， Madison，WI之 pET9a 〇 乂靡斧磨選殖菌株為 ToplO，invitrogen，Carlsbad，CA。 127230.doc -69- 200844226 乂靡办磨表現菌株為BLR(DE3)pLysS，Novagen， Madison，WI。 用於遠殖目的之培養基為根據Sambrook等人之具有l0/〇 取代甘油之無菌葡萄糖及適當抗生素（胺苄西林或卡那黴 素）的極品肉湯液體或瓊脂。 貝體純化係用Qiageri Spin小規模純化套組（Valencia， CA)進行。 用於非脂質化2086表現之產物菌株或細胞株之製備： 藉由聚合酶鏈反應（PCR)[AmpliTaq及ABI 2400熱循環 儀 ’ Applied Biosystems，Foster City，CA]自源自腦膜炎球 菌菌株8529之染色體DNA擴增2086基因。2086基因之PCR 擴增在由化合物編號6474及5 135鑑別之各反應中利用兩種 寡核苷酸引子。將擴增之2086 PCR產物直接選殖至TOPO-PCR2.1選殖載體中且於補充有1〇〇 pg/mi胺苄西林及2〇 pg/ml X-Gal之極品肉湯瓊脂上選擇。選擇白色菌落且使其 生長。使用Qiagen小規模純化套組製備質體DNA且針對 PCR片段插入篩選質體。使PCR插入質體經受DNA定序 (Big Dye chemistry 於 ABI377 定序器上，Applied Biosystems，Foster City，CA)。 將展現正確DNA序列之質體用Bglll限制酶消化且使用
GeneClean II純化套組（BiolOl，Carlsbad，CA)將 Bglll 片段 凝膠純化。將經純化之Bglll片段選殖至表現載體pET9a之 BamHI位點處。於補充有30 pg/ml卡那黴素之極品肉湯盤 上選擇pET9a/2086純系。使卡那黴素抗性純系生長且製備 127230.doc -70- 200844226 小規模純化質體DNA。針對2086基因在BamHI位點處之適 當取向篩選質體。取向正確之質體表示T7-抗原與2086基 因之胺基末端融合（rP2086T7)。將此等rP2086T7基因融合 物轉型至BLR(DE3)pLysS中，於極品肉湯/Kan盤上選擇， 於極品肉湯中生長且用1 mM IPTG(異丙基β-D-硫代吡喃半 乳糖苷）誘導表現rP2086T7融合蛋白。rP2086T7融合蛋白 係以高含量表現。 接著使此等融合質體經受Ndel限制消化，此刪去T7-抗 原且將成熟2086基因直接連接於由載體提供之ATG起點。 將此等Ndel缺失質體轉型至ToplO細胞中且於極品肉湯/ Kan盤上選擇。使候選物純系生長且製備小規模純化質體 DNA。將質體DNA經受DNA定序以證實2086基因序列之缺 失及完整性。此等質體由稱為PPX7328之質體圖表示（圖 6)。將表示正確DNA序列之質體轉型至BLR(DE3)pLysS 中，於極品肉湯/Kan盤上選擇，於極品肉湯中生長且用 IPTG誘導表現2080蛋白質。當移除T7標籤後，pET9a載體 未能表現菌株BLR(DE3)pLysS中之成熟2086蛋白質。 非脂質化2086蛋白質之產生： 經純化之質體DNA用於使表現菌株BLR(DE3)pLysS轉 型。帶有質體之BLR(DE3)pLysS細胞對卡那黴素有抗性且 可藉由添加1 mM IPTG而誘導表現高含量PorA蛋白質。 rP2086T7融合蛋白可在乂麖#磨細胞株BLR(DE3)pLysS中 以約40%之總蛋白質表現為不可溶包涵體。此經純化融合 蛋白用於使小鼠免疫且產生抵抗異源性腦膜炎球菌菌株之 127230.doc -71 - 200844226 顯著含量之殺菌性抗體。（參見表v) 2086非脂質化基因突變誘發： 對2086基因之5’末端執行PCR引子突變誘發。表現研究 正在進行以判定是否可移除T7標籤，同時展現成熟 rP2086T7之高表現量。 非脂質化rP2086T7之純化： 藉由流化床裝置以10 mM Hepes-NaOH/5 mM EDTA/ 1 mM Pefabloc SC pH 7.4使表現非脂質化rP2086T7之乂麖 禪彦BLR(DE3)pLysS細胞溶胞。接著將細胞溶菌液以 18,000>^離心30分鐘。將包涵體離心塊用50111]^丁1^-HC1/5 mM EDTA/l% TritonX-100 pH 8洗滌三次，接著每 次以24,00〇xg離心30 min。接著將包涵體離心塊用50 mM Tris-HCl/5 mM EDTA/1%兩性洗滌劑3-14 pH 8洗滌兩次， 接著每次以24,00〇xg離心15 min。接著用50 mM Tris-HC1/5 mM EDTA/4 Μ尿素pH 8溶解包涵體離心塊歷時兩小 時，接著離心以移除不可溶物質。將上清液（溶解之 rP2086T7)分成四個相等樣品。使用儲備溶液將一個樣品 調整至 50 mM Tris-HCl/5 mM EDTA/250 mM NaCl/2 Μ尿素 pH 8(無清潔劑），一個調整至50 mM Tris-HCl/5 mM EDTA/250 mM NaCl/2 Μ 尿素/1% 氫化 Triton X-100 pH 8 (TX-100)，一個調整至50 mM Tris-HCl/5 mM EDTA/250 mMNaCl/2M尿素/l%兩性洗滌劑3-12pH8(Z3-12)，且一 個調整至 50 mM Tris-HCl/5 mM EDTA/250 mM NaCl/2 M尿 素/1%兩性洗滌劑3-14 pH 8(Z3-14)。為移除尿素，將樣品 127230.doc -72- 200844226 相對於不含有尿素之各別緩衝劑透析完全。接著將樣品相 對於不含有尿素及60 mM NaCl之各別緩衝劑透析完全以降 低NaCl濃度。離心以2,〇〇〇xg離心15分鐘來移除，不可溶 物質，且使用所得上清液（再摺疊之rP2〇86T7)作其他實 驗。發現如使用庫馬斯染色SDS-PAGE及雷射密度測定法 所測定，rP2086T7之均質性為91-95%。 •免疫原性程序-如實例2中所述 •此經純化融合蛋白係用於使小鼠免疫且產生抵抗異源 性腦膜炎球囷囷株之顯著含量之殺菌性抗體。（參見下表 V):
表V 抗rP2086T7之小鼠抗體之殺菌性效價 小鼠血清 描述 異源菌株/H44/76 第6週AF780 r2086T7, 10 pg 3200 第0週混合物 預免疫血清 10 第6週AE203 rLP2086, 10 pg (陽性對照)* 6400 • (*陽性對照血清係由用rLP2086使小鼠免疫而產生） 實例4 ORF 2086之嵌合純系之發展 來自菌株CDC-1 573之2086基因之N末端區域含有不存在 於來自菌株8529且2996之2086基因中的重複區段（參見圖 8)。似乎此重複區段造成自兩種基於大腸桿之表現糸統 (pET及pBAD)重組2086蛋白質表現之量增加。自CDC-1573 2086基因之重組蛋白質表現量在PET及pBAD表現系統中顯 127230.doc -73 - 200844226 著好於自使用相同系統之菌株8529及2996之2086基因的重 組表現量。來自所有三種菌株之2086基因之N末端區域相 對同源，此重複區段除外。因此，合理的假定藉由將 CDC-1 5 73 N末端與來自菌株8529及2996之2086基因融 合，當使用pET及pBAD系統時自此等基因表現之重組2086 蛋白質含量將增加。 材料及方法· 將來自菌株8529及2996之染色體DNA純化且用作PCR擴 增嵌合2086基因之模板。具有化合物編號6721及5135之 PCR引子係用於擴增來自菌株8529之嵌合2086基因且具有 化合物編號6721及6605之PCR引子係用於擴增來自菌株 2996之嵌合2086基因。將PCR產物直接選殖至來自 Invitrogen之PCR2.1 TOPO載體中且接著藉由DNA序列分析 篩選以鑑別完整嵌合2086基因。接著用Bglll將彼基因自 PCR2.1載體裂解且將Bglll片段插入pET9a質體之BamHI位 點中。針對適當取向篩選質體插入物且接著使其經受Ndel 消化。線性Ndel片段自體接合以達成含有由pET9a載體提 供之T7標籤序列之小Ndel片段的刪去。此刪去直接將T7啟 動子連接至嵌合2086基因之51末端。將將Ndel缺失質體轉 型至乂麖#磨菌株BL21(DE3)中且針對用iptg誘導之嵌合 2086蛋白質表現篩選卡那黴素抗性菌落。 初始研究表明當在pET9a系統中表現時，來自菌株2996 之嵌合20 86基因表現重組蛋白質為天然2996/20 86基因之 約兩倍。pB AD系統尚未測試。 127230.doc -74- 200844226 儘管僅執行一個實驗，但資料表明存在來自嵌合2086基 因之增強效用。與來自菌株8529及2996之2086基因之 CDC-1 573 N末端融合物的產生提供增強之重組2086蛋白 質表現。 實例5 腐废爻奈蘑磨菌株之2086卩《1篩選： •為測定臨床分離株中2086基因之保守性，對88種廢廣 爻奈蘑磨菌株執行PCR擴增。 • ORF 2086之初始PCR鑑別利用表IV中所列之引子（參 見上述實例2)，其係由以下化合物編號鑑別·· 4623、4624 及4625。此等引子基於Sanger之腦膜炎奈瑟磨血清群A序 列而設計。為促進篩選大量菌株，將内部引子設計成 2086。藉由PCR，用由化合物編號5005及5 007識別之新設 計之内部2086引子篩選總共88種腦膜炎奈彥磨菌株。用此 等引子，申請者能夠鑑別來自88種腦膜炎奈#磨菌株中之 63種（約70%)的208 6基因（參見表VIA)。 •檢查且比對Sanger之腐廯义奈遂磨血清群A序列與 TIGR之腐廯义奈瑟磨血清群B序列中之2086基因周圍之擴 展區。設計引子以對應於2086基因上游及下游之區域。該 目的在於利用此等引子以自多種腦膜炎奈#磨菌株擴增大 於全長2086基因以作序列比較。使用化合物編號6470及 6472進行一種菌株（6557)之PCR擴增，產生低產率之產 物。選殖菌株6557擴增產物，且將質體DNA提交序列分 析。結果顯示一種具有比先前所見更大序列變異性之新型 127230.doc -75- 200844226 2086基因。產株6557之2086基因在胺基酸層面上與其他菌 株序列約75%—致。有趣地，菌株65 57為先前藉由上文所 述之2086 PCR篩選測試為陰性之30%菌株之一。 •設計對於菌株6557中之C端可變區具有特異性之内部 引子。此等引子係用於篩選先前藉由2086 PCR篩選測試為 陰性之約30%菌株中更大變異之2086基因。藉由PCR使用 此等新識別之内部2086引子（由化合物編號6495及6496識 別）篩選所有可得之腦膜炎奈蘑磨菌株（n=88)。在此篩選 中，僅先前藉由對於2086之PCR測試為陰性的約30%贗廯 义奈彥苈菌株為PCR陽性。自先前PCR陰性（約30%)菌株擴 增之基因組應表新型2086基因或第二2086基因家族，在本 文中稱為2086亞族A。用源自8529之引子自約70%菌株擴 增之2086基因組在本文中稱為亞族B。 •用於PCR擴增研究之廢廯爻奈瑟磨菌株係選自下表， 表VIA及表VIB。表中所列之菌株提供作為本文先前所揭 示者以外的腐廯义奈#崴菌株之實例，但不限於此。表 VIA中所列之菌株係分類為2086蛋白質亞族A，表VIB中所 列之菌株係分類為2086蛋白質亞族B。各表中所列之菌株 係由血清亞型分組。該等菌株可得自表中所示之以下四個 來源：MPHL-Manchester Public Health Laboratory， Manchester，UK ; RIVM，Bilthoven，The Netherlands ;
University of Iowa，College of Medicine，Department of Microbiology，Iowa City，IA ;及 Walter Reed Army Institute of Research, Washington, D.C. 127230.doc •76- 200844226 表VIA 菌株 血清亞型 來源 M97 251854 B:4z, PI:4 MPHL M98 250622 B:2b，PI:10 MPHL M98 250572 B:2b，PI:10 MPHL M98 250771 B:4z，PI:14 MPHL M98 250732 B:4z，PI:14 MPHL M98 250809 B:15，PI:7，16 MPHL M97 252697 B:1，PI:6 MPHL M97 252988 B:4，PI:6 MPHL M97 252976 B:4, PI:6 MPHL M97 252153 B:4? PI:6 MPHL M97 253248 B:15，PI:7，NT MPHL CDC1610 P1:NT 4(15) CDC CDC1521 P 1.6,3 2b(4) CDC CDC1034 P1.7 4(15) CDC L8 Ρ1·7，1 15(4) Walter Reed CDC1492 Ρ1·7，1 4(15) CDC 870446 P1.12a，13 RIVM CDC2369 PL(9)，14 CDC 6557 Ρ1·(9)，14 RIVM 2996 Ρ1·5,2 RIVM NmB Ρ1·5,2 UIOWA L3 Ρ1·5,2 Walter Reed B16B6 Ρ1·5,2 RIVM CDC1135 CDC L5 Ρ1.ΝΤ Walter Reed L4 ΡΙ·21，16 Walter Reed 127230.doc -77- 200844226
表VIB 菌株 血清亞型 來源 M98 250670 B:1，PI:4 MPHL M98 250024 B:1，PI:4 MPHL M97 253524 B:1，PI:4 MPHL M97 252060 B:1?PI:4 MPHL M97 251870 B:4z，PI:4 MPHL M97 251836 B:4z，PI:4 MPHL M97 251830 B:4z，PI:4 MPHL M97 251905 B:4z，PI:4 MPHL M97 251898 B:4z，PI:4 MPHL M97 251885 B:4z，PI:4 MPHL M97 251876 B:4z，PI:4 MPHL M97 251994 B:4z，PI:4 MPHL M97 251985 B:4z，PI:4 MPHL M97 251957 B:4z，PI:4 MPHL M97 251926 B:4z，PI:4 MPHL M97 252045 B:4z，PI:4 MPHL M97 252038 B:4z，PI:4 MPHL M97 252026 B:4z，PI:4 MPHL M97 252010 B:4z，PI:4 MPHL M97 252098 B:4z，PI:4 MPHL M97 252083 B:4z，PI:4 MPHL M97 252078 B:4z，PI:4 MPHL M98 250735 B:4z，PI:15 MPHL M98 250797 B:4z，PI:15 MPHL M98 250768 B:4z，PI:15 MPHL M98 250716 B:2b，PI:10 MPHL M98 250699 B:4z5PI:10 MPHL M98 250393 B:4z5PI:10 MPHL M98 250173 B:4z?PI:10 MPHL M97 253462 B:4z，PI:14 MPHL M98 250762 B:15，PI:7，16 MPHL 127230.doc -78- 200844226 菌株 企清亞型 來源 M98 250610 B:15，PI:7，16 MPHL M98 250626 B:15，PI:7，16 MPHL M97 250571 B:15，PI:16 MPHL M97 252097 B:15，PI:16 MPHL M97 253092 B:1，PI:6 MPHL M97 252029 B:15，PI:7，NT MPHL M97 251875 B:15，PI:7，NT MPHL CDC1127 PI.7，16 4(15) CDC CDC982 PI.7,16 4(15) CDC CDC1359 PI.7，16 4(15) CDC CDC798 PL7，16 15(4) CDC CDC1078 PI.7，16 15(4) CDC CDC1614 PI.7,16 15(4) CDC CDC1658 PI.7,16 15(4) CDC H44/76 PI.7,16 15(4) RIVM CDC1985 P1.7，13 4(15) CDC L6 P1.7，l ?(4) Walter Reed CDC1573 Ρ1·7，1 4(15) CDC L7 Ρ1·7,⑼，1 Walter Reed CDC937 Ρ1·7,3 CDC 8529 Ρ1·7,3 RIVM 880049 P1.7b，4 RIVM CDC2367 Ρ1.15 4(15) CDC H355 Ρ1·19，15 RIVM CDC1343 Ρ1.14 4(15) CDC M982 Ρ1·22,9 RIVM 870227 P1.5c，10 RIVM B40 P1.5c，10 RIVM 5315 P1.5c，10 RIVM CDC983 Ρ1·5,2 CDC CDC852 Ρ1·5,2 CDC 6940 Ρ1·18,25 (6) RIVM 其他菌株易於以來自受感染個體之分離株形式得到。 127230.doc -79- 200844226 實例6 rLP2086抗血清相對於腦膜炎球菌菌株之反應性： 下表，表VII展示如上文所述之rLP2086之交叉反應及交 叉保護能力。如表中所指，加工rLP2086且使用包括全細 胞ELISA(WCE)、殺菌性檢定（BCA)及幼大鼠（IR)檢定之多 種技術進行分析以測定多株抗體相對於2086蛋白質之表面 反應性。
表VII RLP2086-8 529抗血清相對於多種腦膜炎球菌菌株之反應性 菌株 血清亞型 WCE BC IR 2086亞族A 870446 P1.12a，13 808,615 >800 NmB P1.5a，2c 47,954 <100 6557 P1.22a，14a 169,479 <25 - 2086亞族B 880049 P1.7b，4 1，402,767 100 + H44/76 P1.7，16 8,009,507 >6400 H355 PI.19,15 10,258,475 3,200 + 6940 PI.18,25(6) 5,625,410 800 870227 P1.5c，10 4,213,324 <25 + 252097 P1.7b，16 10,354,512 >800 539/8529 P1.7b，3 11,635,737 3,200 M982 Ρ1·22,9 1，896,800 800 CDC-1573 P1.7a，l 208,259 25 CDC-937 P1.7b，(3) 9，151，863 >800 +敗血症減少大於10倍 -敗血症減少小於10倍 127230.doc -80- 200844226 實例7 製備表現ORF2086蛋白質之各種構築體。下表，表νιπ 為出於展示實例且說明本發明之實施例（但不限於其）之目 的的r2086構築體表。
表 VIII R2086構築體概述 構築體 啟動子 前導序列 表現 mi ~ϋ~ 總蛋白質。/。 PPX7340 T7 天然 庫馬 斯 ^十二烷基肌胺 酸鈉可溶 pET27b 2.5%經加工脂 蛋白 PPX7341 T7 P4 庫馬 斯 十二烷基肌胺 酸鈉可溶 pET27b 5%經加工脂蛋 白 pPX7343 阿拉伯 糖 P4 庫馬 斯 十二烷基肌胺 酸鈉可溶 pBAD18 cm 7-10%經加τ 脂蛋白 PPX7325 T7 T7標籤融 合/成熟 庫馬 斯 包涵體 pET9a 40-50%^¾^ 白質 PPX7328 T7 成熟 庫馬 斯 可溶 pET9a 10%成熟蛋白 質 實例8 •用LOS空乏外膜蛋白進行之其他研究鑑別產生非P〇rA 之能夠引出表現異源性血清亞型之菌株之殺菌性抗體的外 膜蛋白之其他菌株。以下描述根據本發明之一實施例鐘別 其他蛋白質且具體而言外膜脂蛋白之其他研究’其可減少 腦膜炎球菌免疫原性組合物中所需之蛋白質數目。此等其 他研究補充先前實例中所述之研究。 •亞細胞分級分離、差示清潔劑提取、等電聚焦及離子 交換層析法與抵抗多種菌株之免疫及殺菌性檢定結合使用 以鑑別所關注之蛋白質的小組。主要組份之直接定序指示 N末端被阻斷。藉由源自化學及蛋白水解消化物之多狀之 127230.doc -81 - 200844226 直接定序來獲得内部蛋白質序列。A群腦膜炎球菌菌株之 染色體組序列係自Sanger中心下載且由吾人之生物資訊組 使用現有及專用演算法進行分析以建立可查找資料庫。肽 序列資料指示ORF2086為受關注的。基於此off之引子用於 自菌株8529 PCR P2086基因。基因序列之分析、N末端被 阻斷之事實及其亞細胞定位指示P2086為脂質化外膜蛋白 (LP2086)。rLP2086-8 529及來自其他腦膜炎球菌菌株之變 異體使用流滅f立#磨（//· /^/7wmz(^)P4信號序列在义廣 #磨中重組表現為脂蛋白。藉由差示清潔劑提取將此等重 組蛋白質自乂廣#彦膜分離，使用離子交換層析法純化， 且用於使小鼠免疫。小鼠抗LP2086血清能夠促進抵抗|廯 义奈#磨之若干不同血清亞型菌株之殺菌活性。自許多膺 廯爻奈荔磨菌株進一步分析P2086基因展示此等序列分成 兩組，稱為亞族A與亞族B。（參見圖12)抵抗亞族B蛋白質 之抗血清具有抵抗表現亞族B蛋白質之九種菌株及表現亞 族A蛋白質之一種菌株之殺菌性。亞家族A抗血清具抵抗 亞族A菌株之殺菌性。一種rPorA與一種rLP2086之混合物 激發擴展除由單獨任一蛋白質誘導外之疫苗覆蓋之互補抗 •此等觀察結果產生以下結論。rLP2086抗原能夠引出抵 抗表現異源性PorA及異源性P2086蛋白質之腦膜炎球菌菌 株之殺菌性抗體。P2086家族之抗原單獨或與其他奈瑟菌 抗原組合時可為適用疫苗或具有免疫原性。 •下文詳細描述上述研究。發現可溶外膜蛋白（sOMP)之 127230.doc -82 - 200844226 複口此合物引出抵抗表現異源性Por A蛋
白質之囷株之PorA
•在每一步驟中， ‘兄殁之過程用於跟蹤免疫活性組份。 針對表面反應性及抵抗含有代表腦膜 炎球菌疾病之世界範圍流行病學之血清亞型抗原的若干菌 株之殺菌活性檢定血清。 •此/刀離及免疫過程係用於鑑別B組廢廯爻奈瑟磨之新穎 父叉反應性免疫原性候選物。 •PorA缺乏菌株之產生-將p〇rA染色體基因座選殖至來自 菌株2996之質體ρΡΧ7〇16中。在質體中，沖“啟動子、 S/D盒及最初末端密碼子已經刪去且經自含KanR表 現卡E置換。用限制酶使質體線性化且自然地轉型至血清 亞型菌株PI:5,2 ; PI:9 ; PI:7，16 ; PI:15 ; PI:4 ; PI:3及ΡΙ:1〇 中。選擇卡那黴素抗性轉化子且在ELIS A中針對血清亞型 特異性單株之PorA之損失來篩選。
•殺 I)性檢定：參見Mountzourous，K.T.及 Howell，A.P. Detection of Complement 瞻 Mediated Anti body-Dependent Bactericidal Activity in a Flourescence-Based Serum Bactericidal Assay for Group B Neisseria meningitidis. J
Clin Microbiol· 2000; 38:2878-2884。 •全細胞酶聯免疫吸附檢定（ELISA):將翁廯爻奈瑟蔚全 細胞懸浮液於無菌0.01 Μ磷酸酯、0.137 M NaC卜0.002 Μ KC1 (PBS)中稀釋至於620 nm下0· 1之光學密度。自此懸浮 液’將0· 1 mL添加至Nunc Bac T 96孔盤（目錄# 2-69620)之 127230.doc -83- 200844226 各孔中。於37它下將細胞於盤上乾燥隔夜，接著蓋上蓋 子，倒置且儲存於4°C下。用洗滌緩衝劑（〇〇1 fTris_ Ηα、〇·139 M NaC1/KC1、〇1% Bri[35，pH 7|7 句將盤 洗滌三次。於PBS、0.05❹/〇 Tween-20/疊氮化合物中製備抗 血清之稀釋液且將0.1 mL轉移至經塗覆盤中且於37它下培 養兩小時。將盤於洗滌緩衝劑中洗滌三次。將山羊-抗小 鼠 IgG AP (Southern Bioteeh)g1:15〇〇 稀釋於 pBs/〇〇5% Tween-20中，將（M mL添加至各孔中，且將盤於37它下培 養兩小日守。（如上）洗滌盤。藉由以i mg/ml將對硝基苯基磷 酸酯（Sigma)稀釋於二乙醇胺中來製備受質溶液。將受質 以每孔0.1 mL添加至盤中且於室溫下培養一小時。用5〇 μΐ/孔之3 N NaOH停止反應且以690 nm作為參考於4〇5 下讀盤。 •重組PorA誘導：使BLR(DE3)/PET9a菌株於37t：下於補 充有 Kan-30及 2% 葡萄糖之 HySoy 肉湯（Sheffield Products)
中生長隔夜。早晨，將0/N培養物以1/20稀釋於HyS〇y肉湯 KandO*!%甘油中且於37。(：下生長i小時。藉由添加ipTQ 至1 mM之最終濃度來誘導此等培養物。使培養物再生長 3小時且接著收穫。 •重組PorA純化：用8 Μ尿素將rporA自乂腐猙磨包涵體 增溶，且藉由相對於不含有尿素之緩衝劑透析來再摺疊。 接著藉由透濾濃縮再摺疊rPorA且藉由G25管柱將緩衝劑交 換為NaPCU pH 6。接著使經透析之rP〇rA於陽離子交換管 柱（S Fractogel)上過柱且用1 μ NaCl溶離。 127230.doc -84- 200844226 •來自菌株8529(P1.7-2,3)之sOMP引出小鼠體内抵抗表現 異源性血清亞型之菌株之PorA非依賴性殺菌活性。下表， 表IX展示在研究菌株中之殺菌活性。
表IX 測試菌株 血清亞型 BC50效價1 539 PI.7-2,3 1280 539 PorA- NST2 1080 H44/76 Ρ1·7，16 3285 H44/76 PorA- NST 2620 H355 PI.19,15 >1350 H355 PorA- NST >1350 880049 Ρ1·7-2,4 290 880049 PorA- NST 85 M982 P1.22,9 85 M982 PorA- NST <50 • sOMP之製備：用TX-100、兩性洗滌劑3-14及兩性洗滌 劑3-14+0.5 M NaCl提取贗腐义奈层磨膜。將上文所提及之 sOMP增溶於兩性洗條劑3 -14/0·5 M NaC 1提取物中。使用 熟習此項技術者熟知之技術執行該提取，例如參見美國專 利第6,3 5 5,253號，其以引用的方式併入本文中。 •免疫原性：在第〇及4週用25 pg總蛋白質及20 pg QS-21 佐劑使雌性Swiss-Webster小鼠免疫。在第6週進行放血及 貢料分析。 • 1殺菌性（BC5〇)效價係表示為減少50%活細胞計數之抗 血清之稀釋度的倒數。第〇週正常小鼠血清具有小於25之 BC5G效價。 • 2 NST=不可血清亞型分類 下表，表X展示亞族A及亞族B兩者之重組脂質化 127230.doc -85- 200844226 P2086(rLP2086)之純化及表徵概述。 亞族A rLP2086純化
表X rLP2086變異體 A.A.同源性(％)1 理論pi 純度(°/。)2 870446 75 6.1 80 2996 71 5.9 95 M97 252988 71 6.3 96 C11 68 6.4 82 M98 250771 62 6.1 83 •亞族B rLP2086純化
表XI rLP2086變異體 A.A.同源性(％)1 理論pi 純度(％)2 8529 100 7.5 96 M982 94 6.3 96 88049 92 6.2 90 CDC1573 87 5.6 93 •純化方法：用TX-1 00將所有變異體自乂麖岸磨膜增溶 (rLP2086-8529除外，其係用十二烷基肌胺酸鈉或尿素增 溶）。用於Tris-HCl或NaP04緩衝劑中之陰離子交換 (TMAE)、尺寸排阻及/或陽離子交換（S Fractogel)層析法之 組合來達成進一步純化。 • 1與來自菌株8529之P2086相比的胺基酸同源性 • 2如藉由SDS-PAGE及膠狀庫馬斯染色譜帶（簡稱為藍 染）之雷射密度測定法所測定之純度 •經測試抵抗同源及異源菌株之亞族B成員，rLP2086-8529之免疫原性 •下表XII展示經測試抵抗同源及異源菌株之亞族B成 員，rLP2086-8529之免疫原性 127230.doc -86 - 200844226 表XII 目標菌株 P2086 亞族 目標菌株 血清亞型 Α.Α. 同源性a 全細胞 ELISAb效價 bc5〇效價e 539 B Ρ1·7-2,3 100 >1,458,000 3,200 H44/76 B Ρ1·7，16 100 >1，458,000 3,200 H355 B Ρ1·19，15 100 >1,458,000 3,200 CDC937 B Ρ1·7-2,3-4 100 >1，458,000 >800 M97 252097 B P1.7-2J6 100 >1，458,000 >800 870227 B Pl.5-2,10 100 >1,458,000 <25 6940 B Ρ1·18,25,6 97 900,162 >800 M982 B Ρ 1.22,9 94 435,909 200 880049 B Ρ 1.7-2,4 92 349,912 400 CDC1573 B Ρ1·7-1，1 87 102,508 25 870446 A PL12-1,13 71 389,829 800 M98 250771 A Ρ1·22，14 62 139,397 <25 NmB A Ρ1·5·1，2-2 71 <2,000 <25 •疫苗接種程序··在第0週及第4週用10 pg rLP2086-8529+20 pg QS-21 使 6-8 週齡雌性 Swiss-Webster 小鼠免疫。 在第6週放血時執行資料分析。 • a與rLP2086-8529相比P2086之胺基酸同源性 • b表示為吸收率=0· 1時稀釋度之倒數之終點效價 • c表示為減少50%活細胞計數之抗血清之稀釋度的倒數 之BC5〇效價。第0週正常小鼠血清具有小於10之BC50效 價。 •表XII展示經測試抵抗同源及異源菌株之亞族B成員， rLP2086-2996之免疫原性。 127230.doc •87- 200844226 表 XIII 目標 菌株 P2086 亞族 目標菌株 血清亞型 A.A. 同源性a 全細胞 ELISAb效價 BC5〇效價e NmB A Ρ1·5-1，2-2 99.6 8,979 <25 870446 A P1.12-l，13 99 <1，458,000 >800 M97 252697 A PI.18,25,6 98 320,732 >800 6557 A Pl.22-1,14-1 98 17,319 <25 M98 250732 A Pl.22,14-1 89 241,510 >800 M98 250771 A PL22，14 89 447,867 800 H44/76 B Pl.7,16 72 56,386 <25 •疫苗接種程序：在第0週及第4週用10μgrLP2086-2996+20 pg QS-2 1 使 6-8週齡雌性 Swiss-Webster小鼠免疫。 在第6週放血時執行資料分析。 • a與rLP208 6-2996相比P20 86之胺基酸同源性 • b表示為吸收率=0· 1時稀釋度之倒數之終點效價 • c表示為減少50%活細胞計數之抗血清之稀釋度的倒數 之殺菌性（BC5〇)效價。第0週正常小鼠血清具有小於10之 B C 5 G效價。 •下表XIV展示rLP2086及rPorA之抗血清當混合時互補且 檢定其殺菌活性。 127230.doc -88- 200844226
表XIV 抗血清 H44/76 (P 1.7,16) NMB (P1.5- 1,2-2) 880049 (P1.7- 2,4) H355 (P1.19,15) 870227 (P1.5- 2?1〇) 6557 (P1.22- U4-1) 抗rLP2086+三種 rPorA抗血清 >3,200 >800 200 >800 200 200 對照組 抗 ΛΡ2086 6,400 <25 100 3,200 <25 <25 相應單價rPorA抗 血清 - 1,600 - - 200 400 •疫苗接種程序：在第0週及第4週用10 pg rLP2086-8529/20 pg QS-21 或 15 pg rPorA/100 pg MPL使 6-8週齡雌 性Swiss-Webster小鼠免疫。在第6週放血時執行資料分 析。 • a表示為減少50%活細胞計數之抗血清之稀釋度的倒數 之殺菌性（BC5〇)效價。第0週正常小鼠血清具有小於10之 BC5G效價。 •下表，表XV展示rLP2086亞族與兩種rPorA之混合物引 出小鼠體内之殺菌性抗體。 127230.doc 89· 200844226 表χν H44/76 6940 880049 M982 M98 250771 M98 250732 M97 252697 870446 NmB 6557 SfBb SfB SfB SfB SfAb SfA SfA SfA SfA SfA Ρ1·7， 16 PI.18 25,6 P1.7- 2,4 P1.22 ，9 PI.22 ,14 P1.22 J4-1 PI.18 ,25,6 PI.12 -1,13 P1.5- 1,2-2 P1.22- 1,14-1 抗原 rLP2086- 8529+rLP 2086- 2996 >800 >800 200 400 800 >800 >800 >800 - <25 rLP2086- 8529+rLP 2086- 2996+rPl .5-1,2- 2+rP1.22- 1,14-1 >800 800 100 200 400 400 >800 >800 >800 200 單價對照 組c >800 >800 200 400 800 >800 >800 >800 >800 800 •疫苗接種程序：在第〇週及第4週用10 pg每一蛋白質 + 20 pg QS-2 1使6-8週齡雌性Swiss-Webster小鼠免疫。在第 6週放血時執行資料分析。 • a表示為減少50%活細胞計數之抗血清之稀釋度的倒數 之殺菌性（BC5〇)效價。第0週正常小鼠血清具有小於10之 B C 5 〇效價。
• b SfA-亞族 A，SfB-亞族 B • c相應單價對照組：rLP2086-8529、rLP2086-2996、 斤1.5-1，2-2或叩1.22-1，14-1抗血清 •下文總結上述研究之結果。抗rLP2086抗血清具有抵抗 13/1 6種測試菌株之殺菌性。表現不同血清亞型之十一種 127230.doc -90- 200844226 菌株由抗P2086血清殺死。抗rLP2086血清之殺菌活性與抗 rPorA血清互補。P2086與PorA之混合物引出小鼠體内之互 補殺菌性抗體。差示清潔劑提取、純化及免疫連同抵抗許 多菌株之功能性抗體檢定可用於鑑別新疫苗候選物。 P2086已鑑別作為疫苗候選物，其激發抵抗在P2086及 rPorA兩者方面異源之菌株之殺菌性抗體。因此，蛋白質 之2086家族單獨或與其他奈瑟菌抗原組合時可為適用疫 苗。 實例9 藉由PCR針對ORF 2086基因之存在篩選不同血清群之腦 膜炎球菌菌株。最終，篩選超過一百種腦膜炎球菌菌株。 兩組對C末端可變區具有特異性之内部PCR引子係用於 區別亞族A及B基因序列。約350 bp之PCR擴增產物之存在 表明2086基因序列存在於染色體上。所有菌株產生預期尺 寸之單一 PCR產物。測定全長ORF 2086基因之核苷酸序 列，將其比對（DNAStar MegAlign)且用於產生系統樹。 2086基因在pBAD阿拉伯糖可誘導啟動子系統中重組表 現為rLP2086脂蛋白或在IPTG可誘導pET系統中表現為 rP2086非脂質化蛋白質。此等重組蛋白質在乂靡#磨B中 表現。經純化之重組蛋白質係用於使小鼠免疫且檢定小鼠 抗血清其血清IgG效價及其抵抗多種異源腦膜炎球菌菌株 之殺菌活性。 藉由PCR自以下全腦膜炎球菌細胞、經純化染色體DNA 或質體DNA模板之一者擴增ORF 2086。 127230.doc -91 - 200844226 將ORF 2086基因選殖至載體pLP339中，其將 ^fP4前導序列與ORF 2086基因之5’端融合。乂廣#磨菌株 BLR係用作宿主菌株以自pBAD/ORF 2086純系重組表現脂 質化形式之rP2086。（參見圖10A)pBAD阿拉伯糖可誘導啟 動子驅使表現P4信號/ORF 2086融合蛋白以表現脂質化形 式之rP2086。將缺乏信號序列之P2086基因選殖至pET9a載 體中之高度活性T7噬菌體啟動子後。乂廣#磨菌株 BL21(DE3)係用作宿主菌株以自pET9a/ORF 2086純系重組 表現非脂質化形式之ORF 2086。可藉由添加IPTG誘導大 腸桿菌菌株BL21中之DE3溶素原以在lacUV5啟動子控制下 表現 T7 RNA聚合酶。參見WCE; FEMS Micro. 1州·，48 (1987) 367-371 及 BCA; J· C/h. Mz.crMb/·，38 (2000) 2878-2884 ° 將基因ORF 2086自不同廢廯义奈瑟窗菌株選殖且定序。 將核苷酸序列比對（DNAStar MegAlign)且用於產生系統 樹。此樹揭露兩種不同亞族之ORF 2086基因核苷酸序列。 兩種亞族之基因在其5’端類似，但在其3,端附近含有相當 多變異。儘管似乎存在顯著可變性，但基因之特定關鍵區 域在不同菌株中高度同源。在不欲受理論約束之情況下， 此等保守性區域可提供蛋白質功能連續性且可表示用作疫 苗目標之交叉保護性抗原決定基。 自若干血清群B腦膜炎球菌菌株選殖2086基因且在有或 無脂質化信號序列情況下表現。與丁7標籤融合之非脂質化 形式以高量表現。T7標籤定序可提供mRNA穩定性且顯著 127230.doc -92- 200844226 增強多肽轉譯程度。此融合蛋白似乎沈積於包涵體中且可 容易用已知方案純化且再摺疊。脂質化及非脂質化形式之 P2086以約5至8%之總細胞蛋白質表現，例外的為T7標籤 融合物，其以約50%總蛋白質表現rP2086。非脂質化形式 之蛋白質似乎可溶且集中於細胞質中。脂質化形式之蛋白 質似乎與膜部分相關且用清潔劑溶解。其天然脂質化形式 之蛋白質可具有用於抗原呈現之優良三級結構及/或所連 接之脂質可充當刺激較高免疫原性反應之佐劑。 广 所有經測試之贗廯爻奈#苈B菌株似乎具有一個類2086 基因。闡述2086基因之至少兩個家族。2086同系物已藉由 在以下各物中PCR篩選而鑑別： 腐廯义奈茗磨A、B、C、W135、Y 乳糖奈瑟菌 满病奈茗磨FA1090 若干ORF 20 86基因已經選殖且重組表現。 自各種腦膜炎球菌菌株表現P2086之脂質化形式。 、 此等重組蛋白質已經純化且用於給小鼠接種疫苗。 所得抗血清具有殺菌性。 自各種菌株表現P2086之非脂質化形式。 rLP2086始終引發比rP2086高之免疫反應。 rLP2086亦展現增強之抵抗同源及異源腦膜炎球菌菌株 兩者之殺菌活性。 實例11 以下進一步證明P2086在奈瑟菌菌株中表現且提供P2086 127230.doc -93- 200844226 在若干菌株中表現之其他特定實例。 用再懸浮於SDS樣品緩衝劑中且於98°C下加熱四分鐘之 來自盤培養物之細胞製備細胞溶菌液。以每孔約30-50 pg 總蛋白質將樣品裝載於10-20%預鑄凝膠（ICN)上且在175 V 下過柱。將該等凝膠轉移至硝化纖維膜上，接著用於Tris 緩衝生理食鹽水（Blotto)中之5°/〇奶粉阻斷30 min。所用一 次抗體為抵抗小鼠體内個別rLP2086變異體之多株抗血清 之混合物。 參看圖17及18，西方墨點法展示rLP2086小鼠抗血清對 P2086亞族A及B全細胞溶菌液之反應性。對於亞族A細胞 溶菌液墨點法而言，所用抗血清抵抗rLP2086-2996、 rLP2086-870446 及 rLP2086-250771，其中 rLP2086-250771 以1/500稀釋於Blotto中且其他以1/1 000稀釋於Blotto中。 對於亞族B細胞溶菌液墨點法而言，所用之抗血清抵抗 rLP2086-8529(以 1/1000 稀釋於 Blotto 中）、rLP2086_ CDC1573、rLP2086-M982 及 rLP2086-880049(此三種以 1/5 00稀釋於Blotto中）。將一次抗血清及墨點於4°C下培養 隔夜。洗滌墨點，將山羊-抗小鼠AP二次抗體以1/500添加 於Blotto中，且將墨點於室溫下培養30 min。洗滌後，使 用BCIP/NBT膜磷酸酶受質系統（KPL)使墨點顯影。 參考文獻 上文所提及之參考文獻在下文指出且以引用的方式全部 併入本文中： 1. 1997. Case definitions for Infectious Conditions Under 127230.doc -94- 200844226
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SEQ ID ΝΟ:1，當與原生前導序列組合時編碼來自 CDC 1135菌株之成熟2086蛋白質之胺基酸序列的核酸序 列。 SEQ ID NO:2，使用原生前導序列製備之來自cdcu35 菌株之成熟2086蛋白質的胺基酸序列。 SEQ ID NO」，#與p4前導序列組合時編碼來自 CDCU35之成熟2G86蛋白f之胺基酸序列的核酸序列。 SEQ ID N0:4,使用料前導序列製備之來自cd⑶_ 株之成熟2086蛋白質的胺基酸序列。 卿m紙5’編碼來自CDC1135菌株之成熟鳩蛋白 質之胺基酸序列的核酸序列。 SEQ ID NO:6，來自 CDril35i^i 姓丄、 木目妁菌株之成熟2〇86蛋白質的 胺基酸序列。 、 SEQ ID NO:7，當與原生前導序 ▽〜組合時編碼來自 CDC1127菌株之成熟2〇86蛋白質 妝暴酸序列的核酸序 列0 列製備之來自CDC1127 SEQ ID NO:8， 使用原生前導序 127230.doc -113 - 200844226 菌株之成熟2086蛋白質的胺基酸序列。 SEQ ID NO:9，當與P4前導序列組合時編碼來自 CDC1127之成熟2086蛋白質之胺基酸序列的核酸序列。 SEQ ID NO:10，使用P4前導序列製備之來自CDC1127菌 株之成熟2086蛋白質的胺基酸序列。 SEQ ID ΝΟ:11，編碼來自CDC1127菌株之成熟2086蛋白 質之胺基酸序列的核酸序列。 SEQ ID NO:12，來自CDC1127菌株之成熟2086蛋白質的 " 胺基酸序列。 127230.doc -114-

Claims (1)

  1. 200844226 十、申請專利範圍： 1 · 一種聚核苷酸，其包含： (a) 與SEQ ID ΝΟ:1-11之奇數序列之任一者具有至少約 95°/〇序列一致性的核苷酸序列；或 (b) 編碼一種包含胺基酸序列與SEq id n〇:2_12之偶數 序列之任一者的胺基酸序列具有至少約95%序列一致性 之多肽之核苷酸序列。 2·如請求項1之聚核苷酸，其中該核苷酸序列與SEQ ID / N0:1_11之奇數序列之任一者具有至少約95%序列一致 性。 3 ·如睛求項1之聚核苷酸’其中該核苷酸序列包含seQ ID ΝΟ:1-11之奇數序列之任一者。 4. 如請求項1之聚核苷酸，其中該核苷酸序列編碼一種包 含胺基酸序列與SEQ ID NO:2-12之偶數序列之任一者的 胺基酸序列具有至少約9 5 %序列一致性之多肽。 5. 如請求項1之聚核苷酸，其中該核苷酸序列編碼一種包 、 含SEQ ID NO:2-12之偶數序列之任一者的多肽。 6·如晴求項1之聚核普酸’其中該核普酸序列與seq id NO: 1·5之奇數序列之任一者具有至少約95%序列一致 性。 7·如凊求項1之聚核苦酸’其中該核苦酸序列包含seq id NO: 1-5之奇數序列之任一者。 8 ·如請求項1之聚核苷酸，其中該核苷酸序列編碼一種包 含胺基酸序列與SEQ ID ΝΟ··2-6之偶數序列之任一者的 127230.doc 200844226 胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之多狀。 9.如請求項丨之聚核苷酸，其中該核苷酸序列編碼—種包 含SEQ ID NO:2-6之偶數序列之任一者的多肽。 1〇·如請求項1之聚核苷酸，其中該核苷酸序列與seq出 NO.7-11之奇數序列之任一者具有至少約％%序列一致 性。 11 ·如請求項1之聚核苷酸，其中該核苷酸序列編碼包含seq ID NO:7-11之奇數序列之任一者的多肽。 12·如請求項1之聚核苷酸，其中該核苷酸序列編碼一種包 含胺基酸序列與SEq ID NO:8-12之偶數序列之任一者的 胺基酸序列具有至少約95%序列一致性之多肽。 13·如請求項1之聚核苷酸，其中該核苷酸序列編碼一種包 含SEQ id NO:8-12之偶數序列之任一者的多肽。 14·如請求項1之聚核苷酸，其中該聚核苷酸編碼一種可激 I對於屬f腐义奈层磨（见⑴·叹"油·5)血清群B之抗體之 多肽。 15·如請求項1之聚核苷酸，其中該聚核苷酸編碼一種可激 發對於潑腐芡奈荔磨血清群B亞族A之抗體的多肽。 1 6·如晴求項1之聚核苷酸，其中該聚核苷酸編碼一種可激 發對於屬腐芡奈彥磨血清群B亞族B之抗體的多肽。 1 7·如請求項1至1 6中任一項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸 為重組聚核苷酸。 18.如請求項1到16中任一項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸 係自天然來源分離。 127230.doc 200844226 19. -種載體，其包含如請求項u18中任一項之聚核苷 酸。 20. 如請求項19之載體，其中該載體為質體。 21·如請求項19之載體，其中該載體為嗟體（phage)。 22.如請求項19之載體，其中該載體為噬菌體。 23·如請求項19之載體，其中該載體為中等（m〇derate)噬 體。 24. —種重組細胞，其包含如請求項19_23中任一項之載體。 25. 如請求項24之重組細胞，其中該重組細胞為融合瘤。 26·如請求項24之重組細胞，其中該重組細胞為三體雜交瘤 (trioma) 〇 27. —種多肽，其包含： (a) 與SEQ ID NO:2_12之偶數序列之任一者具有至少 95%序列一致性的胺基酸序列； (b) 由一個與SEQ ID NO:Mi之奇數序列之任一者具有 至少9 5 %序列一致性的核苷酸序列編碼之胺基酸序列； (c) 至少一個（a)或（b)中所述之胺基酸序列之免疫原性 部分；或 (d) 至少一種（a)或（b)中所述之胺基酸序列或（c)中所述 之免疫原性部分之生物相等物。 28. 如請求項27之多肽，其中該多肽包含與SEq id n〇:2-12 之偶數序列之任一者具有至少95%序列一致性的胺基酸 序列。 29·如請求項27之多肽，其中該多肽包含SEq id NO:2-12之 127230.doc 200844226 偶數序列之任一者的胺基酸序列。 3〇·如請求項27之多肽，其中該多肽包含由一個與SEQ ID NO: 1 -11之奇數序列之任一者具有至少95%序列一致性的 核苷酸序列編碼之胺基酸序列。 31·如請求項27之多肽，其中該多肽包含由SEQ ID NO: 1-11 之奇數序列之任一者的核酸序列編碼之胺基酸序列。 32·如請求項27之多肽，其中該多肽包含與seQ ID NO:2-6 之偶數序列之任一者具有至少95%序列一致性的胺基酸 序列。 33·如請求項27之多肽，其中該多肽包含SEQ ID NO:2-6之 偶數序列之任一者的胺基酸序列。 34·如請求項27之多肽，其中該多肽包含由一個與SEQ ID SEQ ID ΝΟ:1-5之奇數序列之任一者具有至少95%序列一 致性的核苷酸序列編碼之胺基酸序列。 3 5·如請求項27之多肽，其中該多肽包含由SEq id NO: 1-5 之奇數序列之任一者的核酸序列編碼之胺基酸序列。 3 6·如請求項27之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO:8-12 之偶數序列之任一者具有至少9 5 %序列一致性的胺基酸 序列。 3 7·如請求項27之多肽，其中該多肽包含SEQ ID NO:8· 12之 偶數序列之任一者的胺基酸序列。 3 8.如請求項27之多肽，其中該多肽包含由一個與SEQ ID N0:7-11之奇數序列之任一者具有至少95%序列一致性的 核苷酸序列編碼之胺基酸序列。 127230.doc 200844226 39·如請求項27之多肽，其中該多肽包含由seq⑴n〇 7_u 之奇數序列之任一者的核酸序列編碼之胺基酸序列。 4〇·如請求項27之多肽，其進一步包含至少一個p〇r a、p〇r Β '轉鐵蛋白結合蛋白或不透明蛋白（〇pc)。 41. 如請求項27之多肽，其進一步包含至少一種奈茗苈廣 之其他表面抗原，該其他表面抗原為 非ORF2086蛋白質。 42. 如請求項27之多肽，其中該多肽具有如質譜法所測量之 約26,000至約30,000之分子量。 43. 如明求項27之多肽，其中該多肽具有如於sDs 聚丙烯醯胺凝膠上所測量之約28-35 kDa之分子量。 44·如請求項27之多肽，其中該蛋白質非脂質化。 45_如清求項27之多肽’其中該蛋白質為重組蛋白質。 46. 如請求項27之多肽，其中該蛋白質係自原生菸蘑磨禮分 離。 47. —種抗體，其包含以下任一者： (a) 與一種包含偶數SEQ ID NO:2-12之任一者之胺基酸 序列的多肽免疫特異性結合之多肽；或 (b) 至少一個（a)中所述之多肽之免疫原性部分；或 (c) 至少一種（a)中所述之多肽或（b)中所述之免疫原性 部分之生物相等物。 48. 如請求項47之抗體，其中該至少一個抗體為單株抗體。 49. 一種組合物，其包含如請求項1-48中任一項之聚核皆 酸、載體、重組細胞、多肽或抗體。 127230.doc 200844226 其申該組合物另外包含醫藥學上 劑、佐劑或载劑。 其中該組合物另外包含載劑。 其中該組合物另外包含佐劑。 其中該佐劑包含液體。 其中該多肽為脂蛋白。 其中該組合物另外包含—種多
    5〇·如請求項49之組合物， 可接受之緩衝劑、稀釋 51·如請求項49之組合物， 52·如請求項49之組合物， 53·如請求項52之組合物， 54·如請求項49之組合物， 55·如請求項49之組合物， 醣0 56. 如請求項49之組合物，其中該組合物包含另一種肽、多 肽或與該多肽形成結合物之蛋白質。 夕 57. 如請求項56之組合物’其中該另一種肽、多肽或蛋白質 开y成種可誘發哺乳動物對兩種或兩種以上細菌之备^ 反應的結合物。 、免疫 58. 如請求項49之組合物，其中該組合物另外包含編碼另— 種肽、多肽或蛋白質之核酸序列。 5 9· —種組合物，其包含： (a) 第一聚核苷酸，其包含與SEQ ID ΝΟ:1_5之奇數序 列之任一者具有至少約95%序列一致性之核苷酸序列， 或與編碼SEQ ID NO:2-6之偶數序列之任一者之胺基酸 序列的核普酸序列具有至少約9 5 %序列一致性之核苦酸 序列；及 (b) 第二聚核苷酸，其包含與SEQ ID NO: 8-12之偶數多 肽之任一者的胺基酸序列具有至少約95%序列一致性或 與編碼奇數序列7 -11之任一者之胺基酸序列的核皆酸序 127230.doc 200844226 列具有至少9 5 %序列一致性之核苷酸序列。 60.如請求項59之組合物，其中該第一聚核苷酸包含SEQ 1£) Ν Ο ·· 1 - 5之奇數序列之任一者。 61 ·如請求項59之組合物，其中該第二聚核苷酸序列包含 SEQ ID ΝΟ:7-11之奇數序列之任一者。 62· —種組合物，其包含： (a) 第一多肽，其包含與SEQ ID ΝΟ··2-6之偶數序列之 任一者具有至少約95%序列一致性的胺基酸序列； (b) 第二多肽，其包含與SEQ ID NO:8-12之偶數序列之 任一者具有至少約95%序列一致性的胺基酸序列。 63 ·如请求項62之組合物，其中該第一多肽包含⑴ NO:2-6之偶數序列之任一者的胺基酸序列。 64·如請求項62之組合物，其中該第二多肽包含SEQ id NO:8-12之偶數序列之任一者的胺基酸序列。 65. —種藉由包含以下步驟之方法製備之組合物： 自奈瑟菌種分離及純化或重組製備以下任一者： (a)包含偶數SEq ID Ν〇:2·12之任一者之胺基酸序列的 多肽； (b)由種包含奇數SEQ ID N〇:l-ll之任一者之核酸序 列的聚核苷酸編碼之多狀；
    之一種生物相等物。 一種如請求項K65中任一 一個免疫原性部分；或 (c)中所述之免疫原性片段 一項之組合物的用途，其係用於 127230.doc 200844226 製傷用於誘發哺乳動物免疫反應之藥劑。 67·如請求項^ ^貝66之用途，其中該組合物係非經腸投與。 3 z員66之用途，其中該組合物係經黏膜投與。 69· '一種如士主、七丈 明來項49-65中任一項之組合物的用途，其係用於 種有效抵抗哺乳動物之細菌性腦膜炎之藥劑中。 月求項69之組合物之用途，其中該組合物係非經腸投 與。
    月求項69之組合物之用途，其中該組合物係經黏膜投 與。 72·如明求項69之組合物之用途，其中該組合物係藉由皮下 或肌肉内注射投與。 73 ·種製備組合物之方法，其包含： 在佰主細胞中表現一種編碼本文中所述之多肽之任一 者的核酸序列。 74.如請求項73之方法，其中該核酸序列係在活體内表現。 75·如請求項73之方法’其中該核酸序列係在活體外表現。 76’如μ求項73之方法’其進—步包含使前導序列與該核 酸序列結合以表現該多肽。 、免疫原性部分或 種動物後自該動物 77· —種製備抗體組合物之方法，其包含 在將一種包含本文中所述之蛋白質 生物相等物之任一者的組合物引入一 回收抗體。 78. 一種誘發哺乳動物免疫反 向該哺乳動物投與有效 應之方法，其包含： 量之如請求項49-65之組合物之 127230.doc 200844226 一或多者。 如請求項78之 如請求項78之 一種預防或治 含·· 79. 80. 81. 去，其中垓組合物係非經腸投與。 去，其中该組合物係經黏膜投與。 療哺孔動物之細菌性腦膜炎之方法，其包 "甫乳動物投與有效量之如請求項49-65之組合物之 一或多者。 如月求項8 1之方法，其中該組合物係非經腸投與。 8 3 · 士明求項$ 1之方法，其中該組合物係經黏膜投與。 84.如請求項81之方法，其中該組合物係藉由皮下或肌肉内 注射投與。 127230.doc
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