TWI409275B

TWI409275B - 脂質化腫瘤相關抗原及其免疫治療的組成物及方法

Info

Publication number: TWI409275B
Application number: TW099120195A
Authority: TW
Inventors: Chih Hsiang Leng; Shih Jen Liu; Hsin Wei Chen; Pele Choi-Sing Chong
Original assignee: Nat Health Research Institutes
Priority date: 2009-06-22
Filing date: 2010-06-22
Publication date: 2013-09-21
Also published as: EP2445927A1; TW201103946A; WO2010148496A8; EP2445927B1; CN102482327A; WO2010148496A1; EP2445927A4; HK1171457A1; US20100322953A1; US8658176B2; CN102482327B

Description

脂質化腫瘤相關抗原及其免疫治療的組成物及方法

本發明係關於多肽及脂質化融合蛋白質。本發明亦揭示與該等多肽及融合蛋白質相關於免疫治療的組成物及方法。

相關申請案

本發明係對於2009年6月22日提出申請之美國臨時申請案No. 61/219,301主張優先權；該先申請案之內容皆以引用方式納入本文做為參考。

發明背景

病毒感染會引起各種病症，包括癌症。舉例而言，人類乳頭狀瘤病毒(HPVs)感染會造成數種癌症發展，尤其是成為世界婦女第二大癌症死因之子宮頸癌，且其已經決定性證實HPV為子宮頸癌的病原體(Schwarz,T.F.,Expert Rev Vaccines 7 :1465-73,2008)。據估計，每年有大約493,000件新的子宮頸癌個案被診斷出來(Parkin,D.M.等人,CA Cancer J Clin 55 :74-108,2005)。已研發用於預防引起癌症之病毒感染、治療已存在癌症、或防止於高危險群個體內發展成癌症的疫苗。然而，其中有許多並不具有功效。故仍需要有效的疫苗與相關的試劑。

本發明係關於新穎多肽、脂質化融合蛋白質、免疫治療的組成物及方法。

據此，本發明之一方面係關於一種具有SEQ ID NO: 2所述序列之單離的多肽(其序列列示於圖2B)。本發明亦關於一種具有編碼該多肽之序列，或其互補序列之單離的核酸。該核酸之實例包括SEQ ID NO: 13所述之序列(如下所示)，及其中一或多個密碼子被其他編碼相同殘基之密碼子取代的簡併性變體(degenerate variants)。

本發明亦關於一種單離的融合蛋白，其包含具有脂質化序列之第一片段，及具有腫瘤相關抗原序列之第二片段。於該融合蛋白中，第一片段係位於第二片段的N-端。於一項實例，該融合蛋白為脂質化。脂質化序列包括：Met Lys Lys Leu Leu Ile Ala Ala Met Met Ala Ala Ala Leu Ala Ala Cys Ser Gln Glu Ala Lys Gln Glu Val Lys Glu Ala Val Gln Ala Val Glu Ser Asp Val Lys Asp Thr Ala(SEQ ID NO: 12)。腫瘤相關抗原可為衍生自一種與人類慢性疾病或癌症(例如子宮頸癌)關連之病毒的病毒抗原。於一項實例，該病毒抗原係衍生自人類疱疹病毒第四型(EBV)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、C型肝炎病毒(HCV)、B型肝炎病毒(HBV)或巨細胞病毒(CMV)。於一項具體態樣，該病毒抗原為去活化HPV致癌蛋白E5、E6或E7。於一項較佳具體態樣，該病毒抗原為去活化HPV 16 E7致癌蛋白，例如SEQ ID NO: 1或2。融合蛋白之實例包括，於下述實施例中所描述之rlipo-E7m融合蛋白。以下列示rlipo-E7m融合蛋白之胺基酸序列，及編碼此融合蛋白的核酸序列(SEQ ID NOs: 14及15)：

本發明亦關於一種單離的核酸，其含有編碼上述融合蛋白之核酸序列，或該核酸的互補序列。該核酸之實例包括SEQ ID NO: 15，及其中一或多個密碼子被其他編碼相同殘基之密碼子取代的簡併性變體。

核酸係指一種DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如mRNA)、或是DNA或RNA類似物。DNA或RNA類似物可自核苷酸類似物合成得。核酸分子可為單股或雙股，但較佳為雙股DNA。“單離的核酸”係一種其構造不與任何天然核酸的，或天然基因組核酸之任何片段的構造相同之核酸。因此該術語含括(例如)(a)具有天然基因組DNA分子之部分序列的DNA，但其編碼序列兩端所銜接的片段並非該分子部分序列存在生物體基因組中之天然狀態下的兩端所銜接者；(b)以一種使所成之分子不與任何天然載體或基因組DNA相同之方式併入一載體中，或併入一原核或真核生物之基因組DNA中的核酸；(c)一種分離的分子例如cDNA、基因組片段、經由聚合酶鏈反應(PCR)製得之片段或限制酶切割片段；及(d)其為雜合基因(亦即編碼融合蛋白之基因)的一部份之重組核苷酸序列。上述核酸可用於表現本發明之多肽或蛋白質。為此目的，習於該項技藝者可將該核酸操作性連接至適宜調節序列，以產生表現載體。

載體係指一種能夠傳送另一已與其連接之核酸的核酸分子。載體能自我複製或整合到宿主DNA中。載體之實例包括質體、黏質體或病毒載體。本發明之載體包括，以適於在宿主細胞中表現該核酸之形式存在的核酸。較佳地該載體包括一或多種調節序列，其經操作性連接至欲被表現之核酸。調節序列包括啟動子、增效子及其他表現調控元件(例如，T7啟動子、花椰菜鑲嵌病毒35S啟動子序列或聚腺化訊號序列)。調節序列包括該等直接固有性表現一核酸序列者，以及組織特異性調節與/或可誘導序列。表現載體之設計可取決於，諸如所選擇欲轉形之宿主細胞、所希望之蛋白質表現程度等因素。表現載體可引導入宿主細胞中，用以製造本發明之多肽或融合蛋白。

本發明之範圍亦包含一種含有前述核酸之宿主細胞。實例包括大腸桿菌細胞、昆蟲細胞(例如使用桿狀病毒表現載體)、植物細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞。參見(例如)Goeddel,(1990)基因表現技術：酵素學方法185，學院出版，聖地牙哥，CA。

為製造本發明之融合蛋白/多肽，習於該項技藝者可將宿主細胞培養於允許由本發明核酸編碼之融合蛋白/多肽表現的條件下，及將該融合蛋白/多肽自所培養細胞或培養基純化出來。或者，本發明之核酸可於活體外，例如使用T7啟動子調節序列與T7聚合酶，於得自(例如)大腸桿菌之細胞溶解產物中進行轉錄及轉譯作用。脂質化融合蛋白可包括(從N-端至C-端)Ag473之D1片段與標靶蛋白，例如抗原性病毒蛋白。

於另一方面，本發明係關於一種包含前述多肽或融合蛋白之免疫原組成物。免疫原組成物可與或不與醫藥上可接受之佐劑調配。

於又一方面，本發明係關於一種誘發對於病毒(例如HPV)之免疫反應的方法。該方法包括將有效量之上述免疫原組成物投藥予有其需要之個體的步驟。“個體”係指人類及非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物如非人類靈長類(尤其是高等靈長類)、狗、嚙齒類(例如小鼠或大鼠)、天竺鼠、貓及非哺乳動物，例如鳥類、兩棲類等。於一項較佳具體態樣，該個體為人類。於另一項具體態樣，該個體為實驗動物或適宜做為疾病模式之動物。

下述所提供之圖式與詳細說明例舉本發明之一或多項具體態樣的詳細內容。本發明之其他特色、目的及優點方面將由下列說明與圖示，以及由申請專利範圍彰顯出。

本發明(至少一部份)係基於意外發現一種新穎的腫瘤相關抗原變體，及腫瘤相關抗原與脂質化序列之融合蛋白。該融合蛋白(意外地)可被脂質化，並以高產量表現於諸如大腸桿菌等細菌細胞中。其一旦經投藥予個體後，二者皆會誘發對抗腫瘤之免疫反應(例如，細胞毒性T淋巴細胞或抗體)。

本發明特徵在於一種對抗病毒感染，及/或所相關之其他病症(例如，癌症)的免疫原組成物，例如疫苗。如前所述，免疫原組成物可含有重組型融合蛋白。該融合蛋白具有一段含脂質化序列之第一片段，及一段有腫瘤相關抗原之序列的第二片段。

腫瘤相關抗原可為一種衍生自與人類慢性疾病或癌症(例如子宮頸癌)關連之病毒的病毒抗原。於一項實例，該病毒抗原係衍生自人類疱疹病毒第四型(EBV)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、C型肝炎病毒(HCV)、B型肝炎病毒(HBV)或巨細胞病毒(CMV)。以下列示例舉性病毒抗原之序列。有數種蛋白質及其抗原性片段可用於製備本發明之免疫原組成物。人類疱疹病毒第四型(Epstein-Barr病毒)，潛伏性膜蛋白-1(LMP1)：

人類疱疹病毒第四型(Epstein-Barr病毒)，終端蛋白LMP-2A：

人類疱疹病毒第四型(Epstein-Barr病毒)，終端蛋白LMP-2B：

人類疱疹病毒第四型(Epstein-Barr病毒)，外膜醣蛋白gp350：

人類疱疹病毒第四型(Epstein-Barr病毒)，EBNA-2核蛋白：

人類疱疹病毒第四型(Epstein-Barr病毒)，EBNA-3C核蛋白：

NS3(C型肝炎病毒)：

NS5B(C型肝炎病毒)：

E1(C型肝炎病毒)：

F2(C型肝炎病毒)：

HBsAg(B型肝炎病毒)：

pre-S1蛋白(B型肝炎病毒)：

pre-S2蛋白(B型肝炎病毒)：

外膜醣蛋白B，gB(人類巨細胞病毒CMV)：

pp65(人類疱疹病毒第五型與人類巨細胞病毒CMV)：

IE-2蛋白(人類疱疹病毒第五型，與人類巨細胞病毒CMV)：

前述任一種具有Ag473之N-端部分的融合蛋白，可以令人意外的高產量於大腸桿菌表現系統中製得。亦意外發現，該重組型融合蛋白可誘發對抗該抗原及相關病症(例如癌症)之免疫反應。

上述之Ag473為一種腦膜炎雙球菌Neisseria Mengitidis 的脂蛋白，其係由四個功能域(SP及功能域1-3)所組成。

以下列示其具有四個已確定功能域之胺基酸序列：

SP：SEQ ID NO：7中之胺基酸殘基1-17 功能域1：SEQ ID NO：7中之胺基酸殘基18-40(以粗斜體標示) 功能域2：SEQ ID NO：7中之胺基酸殘基41-71(以粗體標示) 功能域3：SEQ ID NO：7中之胺基酸殘基72-121(以斜體標示)

術語“脂質化序列”如用於本文意指一種非天然胺基酸序列，其(a)包括與Ag473之SP具有同一性至少達80%(85%、90%、95%或99%)之第一片段，及與Ag473之功能域1具有同一性至少達80%(85%、90%、95%或99%)之第二片段，第一片段係位於該脂質化序列的N-端；且(b)有助於在大腸桿菌中將在其N-端帶有該脂質化序列之多肽脂質化。於脂質化序列中，第一片段係直接或經由連接肽而連接至第二片段。較佳地，此序列具有最大長度為40-100(例如，40-80)個胺基酸。於一項實例，該脂質化序列包括SP與功能域1，亦即SEQ ID NO：7之胺基酸1-40(SEQ ID NO：12)。脂質化序列之另外實例包括，SEQ ID NO：7之包括有SEQ ID NO：7胺基酸1-40的任何其他片段，例如1-41、1-45、1-50、1-60、1-80、1-100及1-121。

如用於本文，兩種胺基酸序列之“百分比同源性”係使用經描述於Karlin與Altschul，Proc,Natl .Acad .Sci .USA 87:2264-2268,1990之演算法(其修改描述於Karlin與Altschul，Proc,Natl .Acad .Sci .USA 90:5873-5877,1993)而測定得。此種演算法被納入Altschu;等人，J .Mol .Biol . 215:403-410,1990所述之NBLAST及XBLAST程式中。BLAST蛋白質搜尋係以XBLAST程式來執行，分數=50，字長=3，而獲得相對於參考多肽之序列同源性。為達比較目的而得到具有空隙之比對，遂使用如Altschul等人，於Nucleic Acids Res . 25:3389-3402,1997所述之具空隙BLAST(Gapped BLAST)。當利用BLAST與具空隙BLAST程式時，係使用該等各別程式(例如，與)之不履行參數。參見，www.ncbi.nlm.nih.gov。

本發明之多肽或融合蛋白可呈合成型多肽，或呈重組型多肽之形式獲得。關於重組型多肽之製備，可將編碼其之核酸與另一編碼融合夥伴，例如谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)、6x-His表位標籤或M13基因3蛋白之核酸連接。所成之融合核酸於適宜宿主細胞中表現，得一種能藉由該項技藝已知之方法單離的融合蛋白。單離的融合蛋白可進一步(例如)以酵素分解進行處理，去除融合夥伴而得到本發明之重組型多肽。

異源多肽、核酸或基因係指其源自外來物種，或(若來自同一物種)實質上已從其原始形式修飾過者。兩種經融合之功能域或序列，若彼等在天然蛋白質或核酸中彼此不相鄰，則其對彼此而言為異源的。術語“重組型”當用於引述(例如)細胞，或核酸、蛋白質或載體時，意指該細胞、核酸、蛋白質或載體已經由導入異源核酸或蛋白質，或藉由改變天然核酸或蛋白質而受修飾，或指該細胞係衍生自經由此類修飾之細胞。因此，舉例而言，重組型細胞可表現未存在於該細胞之天然形式中的基因，或表現天然基因之被正常或異常表現、表現不足或不被表現的第二複本。

於本發明，係將前述所提及之脂質化序列連接至腫瘤相關抗原，例如衍生自HPV之病毒性抗原(例如，HPV E7)而形成一種融合蛋白質，當其藉由習知重組技術在大腸桿菌中進行表現時，係呈脂質化形式。以下描述一種實例。將編碼脂質化序列之DNA片段，與編碼E7m之DNA片段，插入一種表現載體(其較佳地帶有強啟動子，例如T7、T5、T3或SP6)中，而構築得表現質體。強啟動子可為可誘導性，例如可被異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導。接著將該表現質體導入大腸桿菌宿主菌株中，並將陽性轉形株培養於適於蛋白質表現之條件下。較佳地，該大腸桿菌宿主菌株對於因過度表現外源性蛋白質所誘導的毒性作用具有抗性。此類大腸桿菌株可經由美國專利案號6,361,966中所描述之方法鑑定/產生。此等大腸桿菌株之實例包括(但不限定於)C43(DE3)(ECCC B96070445)、C41(DE3)(ECCC B96070444)、C0214(DE3)、DK8(DE3)S(NCIMB 40885)及C2014(DE3)(NCIMB 40884)。

較佳地，係將經此所表現得之融合蛋白質從大腸桿菌宿主細胞分離出，並且經由該項技藝已知之方法，例如以抗-脂蛋白抗體進行之免疫轉漬法，或質譜分析法確認其脂質化狀態。

本發明之多肽或融合蛋白可用於製備免疫原組成物(例如，疫苗)，其係供於易受病毒感染之個體(例如，人類個體)中產生對抗(例如)HPV的抗體。此類組成物可以(例如)下述之方法，或藉由該項技藝中已知之任何其他相當方法製備得。

本發明之多肽或融合蛋白可與醫藥上可接受之載體，例如磷酸鹽緩衝食鹽水、碳酸氫鹽溶液或佐劑混合，而製得一種醫藥組成物。載體必須為“可接受的”意指，其可與組合物中之活性成份相容，且較佳地，能夠使活性成份安定，而不會對受治療個體產生有害影響。載體係以投藥模式與途徑，以及標準製藥操作為基礎而進行選擇。適宜之醫藥載體與稀釋劑，及供彼等使用之必需品，係經描述於雷明頓氏製藥科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)中。於一項實例，係將融合蛋白質與佐劑混合而形成可用於免疫調節之組成物。此組成物可製備呈可注射液，呈液態溶液或乳液。參見，美國專利案4,601,903、4,599,231、4,599,230及4,596,792。

“佐劑”意指添加至免疫原組成物(例如，疫苗)之物質，其雖然本身不具有特異性抗原功效，但能刺激免疫系統並增加對該免疫原組成物的免疫反應。佐劑之實例包括(但不限定於)明礬沉澱物、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、單磷氧基-脂質　A/海藻糖二霉菌酸酯佐劑、含有棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)與tRNA之油包水乳液、及其他可藉由模擬特定組演化固有分子而執行增加免疫反應之任務的物質，包括脂質體、脂多醣(LPS)、對應抗原之分子籠(molecular cage)、細菌細胞壁組成、被細胞吞噬之核酸例如雙股RNA、單股DNA及含有未甲基化CpG二核苷酸之DNA。其他實例包括霍亂毒素、大腸桿菌熱不安定性內毒素、脂質體、免疫刺激複合體(ISCOM)、免疫刺激性序列寡去氧核苷酸及氫氧化鋁。組成物亦可包括有助於活體內遞送之聚合物。參見Audran R.等人，疫苗21:1250-5,2003；及Denis-Mize等人Cell Immunol.,225:12-20,2003。

有效量之前述組成物可以非經腸道方式，例如藉由皮下注射或肌肉內注射進行投藥。或者，可希望呈其他投藥形式，包括栓劑與口服調配物。對於栓劑，可包括黏著劑與載體，例如聚烷二醇類或三酸甘油酯類。口服調配物可包括正常使用之賦形劑，例如製藥級糖精、纖維素、碳酸鎂等類。此等組成物採取溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物或粉末之形式。“有效量”意指該組成物可於個體之組織系統，或於個體中引起生物學或醫學反應的量，其係由研究人員、醫師或其他臨床醫療人員探究得。

前述之多肽或及融合蛋白可用於製備免疫原組成物(例如，疫苗)，以供於易受病毒感染之個體中產生對抗病毒的抗體。疫苗可以與其劑量調配物相容之方式，及以治療上有效、具保護性且可產生免疫的量進行投藥。欲投藥之量係視受治療個體而定，包括(例如)該個體之免疫系統合成抗體，及(若需要)產生細胞-介導之免疫反應的能力。活性成分所需要投藥之實際劑量，取決於開業醫師的專業判斷。然而，熟悉該項技藝者可容易蒂測定得適宜之劑量範圍，且其層級可為數微克的本發明多肽。對於起始投藥及追加劑量之適當用藥療程亦可有所差異，但可包括起始投藥隨後施予後續的投藥。疫苗之劑量可視投藥途徑而定，且依據宿主的大小而變化。

術語“免疫反應”或“免疫原反應”係指於一個體中，其免疫系統在對某一種抗原反應時所產生的任何反應。脊椎動物之免疫反應實例包括(但不限定於)製造抗體、誘導細胞介導之免疫作用及活化補體。對於由同一抗原之後續刺激產生的免疫反應(亦稱為次級免疫反應)，較於初級免疫中所發生之情況快速。術語“免疫原性”係指，於宿主動物中產生對抗一或多種抗原之免疫反應的能力。此免疫反應係構成，由對抗特定感染性生物體所引發之保護性免疫作用的基礎。

“抗原”係指一種含有一或多個會刺激宿主的免疫系統製造體液，及/或細胞抗原專一性反應之抗原表位的分子。術語“抗原”可與“免疫原”互換使用。與適當細胞接觸後之結果，抗原會誘發一種敏感或免疫反應的狀態，並以可論證的方式與受敏化個體之抗體或免疫細胞，於活體內或活體外進行反應。抗體可被生物個體內之抗體專一地辨識及結合。與主要組織相容性複合體(MHC)締合之抗原，亦可被位於T淋巴細胞(T-細胞)表面上之受體辨識及結合，而導致T-細胞活化。術語“抗原表位”用於本文係指於抗原上，一特定抗原分子或T-細胞受體與其結合的部位。該術語可與“抗原決定基”或“抗原決定部位”互換使用。

“抗體”係指一種具有特定胺基酸序列，且僅和一種或一群密切相關之抗原結合之免疫球蛋白分子，或免疫球蛋白分子之至少一具有免疫活性的部份。抗體之實例包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。免疫球蛋白分子之具有免疫活性的部份實例包括Fab及F(ab)'₂ ，其可藉由將抗體以諸如胃蛋白酶之酵素處理而產生。抗體可為單株抗體或多株抗體。術語“單株抗體”係指一群僅含有一種抗原結合部位，且能夠與特別抗原表位進行免疫反應之抗體分子族群。術語“多株抗體”係指一群含有一種以上抗原結合部位，且能夠與多肽上一個以上抗原表位進行免疫反應之抗體分子族群。

可藉由該項技藝已知之方法鑑定出容易受病毒感染之個體，並投藥予本發明之組成物。組成物之劑量係取決於(例如)特別的多肽/蛋白質、是否有佐劑共同投藥、及共同投藥之佐劑類型、投藥形式與頻數等，其可由熟習該項技藝者測定得。若需要可進行重複投藥，其可由熟習該項技藝者決定。舉例而言，在第一次免疫後4至8週可給予追加劑量，且於8至12週可給予第二次追加(使用相同的調配物)。可從個體採集血清或T細胞，以測試由對抗該病毒之組成物所引起的免疫反應。分析對抗某一種蛋白質或感染之抗體或細胞毒性T細胞的方法，為該項技藝已熟知。若需要可給與額外的追加免疫。藉由改變多肽/蛋白質之用量、組成物之劑量及投藥的頻數，而可將免疫程序最適化以引起最大免疫反應。於大規模投藥前，可希望進行功效測試。於功效測試中，可將非人類個體(例如，小鼠、大鼠、兔子、馬、豬、牛或猴子)經由口服或非經腸道途徑，投藥予本發明之組成物。在最初投藥之後，或在視需要之追加投藥後，可將測試個體與對照組個體(接受偽裝投藥)皆以病毒進行攻毒，以測試該組成物之有效性。

可使用各種抗原。於某些具體態樣，抗原可為一種腫瘤相關抗原、癌症抗原或腫瘤抗原。術語癌症抗原與腫瘤抗原可互換使用，且係指一種由癌細胞差異表現之抗原。於是，可將癌症抗原利用於差異靶定一種對抗癌細胞之免疫反應。因此癌症抗原可能刺激腫瘤-特異性免疫反應。某些癌症抗原係由正常細胞所編碼，雖然不是必然會被表現。有些此等抗原之特徵可能是，其在正常細胞中正常狀態下為緘默的(亦即，不被表現)，有些只在分化的某些階段被表現，而有些是暫時被表現(例如，胚胎與胎兒抗原)。其他癌症抗原可由突變型細胞基因，例如致癌基因(例如經活化的ras致癌基因)、抑制因子基因(例如突變型p53)，或因內部缺失或染色體異位產生的融合蛋白。又，其他癌症抗原可由病毒基因，例如RNA及DNA腫瘤病毒所攜帶之基因編碼。

腫瘤抗原之實例包括MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPUV)、腺苷脫胺酶結合蛋白(ADAbp)、親環蛋白(cyclophilin)b、結直腸相關抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚性抗原(CEA)及其抗原性表位CAP-1與CAP-2、etv6、aml1、前列腺專一性抗原(PSA)及其抗原性表位PSA-1、PSA-2與PSA-3、前列腺專一性膜抗原(PSMA)、T-細胞受體/CD3-.zeta.鏈、腫瘤抗原之MAGE-家族(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、腫瘤抗原之GAGE-家族(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪胺酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎蛋白、E-鈣黏著蛋白、α-連環蛋白、β-連環蛋白、γ連環蛋白、p120ctn、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺腫瘤性大腸息肉蛋白(APC)、胞襯蛋白(fodrin)、連接蛋白(Connexin)37、Ig-個體遺傳型、p15、gp75、GM2與GD2神經節苷脂、病毒產物例如人類乳頭狀瘤病毒蛋白、腫瘤抗原之Smad家族、Imp-1、P1A、EBV-編碼之核抗原(EBNA)-1、腦肝糖磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-3、SSX-4、SSX-5、SCP-1與CT-7及c-erbB-2。

癌症或腫瘤及與此類腫瘤(非排他地)相關之特定腫瘤抗原，包括急性淋巴性白血症(etv6、aml1、親環蛋白b)、細胞淋巴瘤(Ig-個體遺傳型)、神經膠瘤(E-鈣黏著蛋白、α-連環蛋白、β-連環蛋白、γ-連環蛋白、p120ctn)、膀胱癌(p21ras)、膽管癌(p21ras)、乳癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、子宮頸癌(p53、p21ras)、結腸癌(p21ras、HER2/neu、c-erbB-2、MUC家族)、結直腸癌(結直腸相關抗原(CRC)-C017-1A/GA733、APC)、絨毛膜癌(CEA)、上皮細胞癌(親環蛋白b)、胃癌(HER2/neu、c-erbB-2、ga733醣蛋白)、肝細胞癌(α-胎蛋白)、哈金氏淋巴瘤(Imp-1、EBNA-1)、肺癌(CEA、MAGE-3、NY-ESO-1)、淋巴細胞衍生之白血病(親環蛋白b)、黑色素瘤(p5蛋白、gp75、癌胚胎抗原、GM2與GD2神經節苷脂、Melan-A/MART-1、cdc27、MAGE-3、p21ras、gp100)、骨髓瘤(MUC家族、p21ras)、非小細胞肺癌(HER2/neu、c-erbB-2)、鼻咽癌(Imp-1、EBNA-1)、卵巢癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、前列腺癌(前列腺專一性抗原(PSA)及其抗原性表位PSA-1、PSA-2與PSA-3、PSMA、HER2/neu、c-erbB-2、ga733醣蛋白)、腎癌(HER2/neu、c-erbB-2)、子宮頸與食道之鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)、與T細胞白血病(HTLV-1抗原表位)，及病毒性產物或蛋白質。

如前所述，病毒感染會引起各種病症，包括癌症。引起癌症之病毒實例包括EBV、HPV、HCV、HBV及CMV。其中，HPV已知會引起包括疣(例如生殖器疣)、子宮頸細胞分化不良及癌症(例如，子宮頸癌)。於是，本發明之範圍包含一種對抗感染及相關病症之免疫原組成物。可利用許多種HPV抗原。與其致癌能力有關連之HPV基因型係歸類為高危險型，包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73及82型(Munoz等人,N Engl J Med 348:518-27,2003)。其中以HPV16與HPV18特別有用，因為彼等為在侵入性子宮頸癌中具有高流行率的兩型(Bosch等人,J Natl Cancer Inst 87:796-802,1995)。於50%子宮頸癌中有偵測到HPV16，而HPV18與18%子宮頸癌有關。於腺癌及鱗狀腺癌中，HPV流行率(76.4%)明顯較其於鱗狀細胞癌中的(87.3%)低，且HPV18為佔優勢型(~40%)(Clifford等人，Br J Cancer 89:101-5,2003)。在治療罹患HPV-相關腫瘤之患者方面，已針對疫苗療法進行數種臨床試驗。其中大多數係以E7或E7/E6致癌蛋白為基礎，因為在前惡性癌及惡性癌中一致地表現E6與E7。而且，有許多報導指出細胞介導之免疫反應對此等患者的重要性(Moscicki,J Adolesc Health 43:S26-40,2008)。

如以下之實施例所述，可將去活性HPV致癌蛋白(例如去活性E7(E7m))與Ag473之D1融合，而製得重組型脂質-免疫原(rlipo-E7m)。於TC-1小鼠模式中，lipo-E7m可保護該小鼠對抗腫瘤細胞之攻毒。此等結果清楚證明，lipo-E7m可用做為一種對抗HPV-相關腫瘤的有效疫苗，且暗示脂質-免疫原策略可應用於諸如E7與E6等HPV致癌蛋白對抗HPV-相關腫瘤。

下述之特別實施例僅供做為說明範例，而非用以限制本發明揭示之其他部分。無需進行過度實驗，相信熟悉該項技藝具有通常知識者可基於本說明書之敘述，將本發明利用至其最完整的程度。本文中所引用之公開文獻，皆完整地以參考方式納入本文。此外，下文中所推論之任何機制不會限制本發明之申請專利範圍。

實施例 脂質化融合蛋白rlip0-E7m之表現

使用以重疊引子進行之組合PCR方法獲得E7m基因。然後將組合PCR之產物藉由習知PCR擴增(Dillon PJ,Rosen CA. Biotechniques 1990; 9: 298,300)。用於此步驟之前向引子(5’-GGAATTCCACGGCGATACCCCGACCCTGC-3’(SEQ ID NO: 3))包括一個Nde I切位(以網底標示)，而反向引子(5’-AGAGCCGCGGTTTCTGGCTCGCAATCGG-3’(SEQ ID NO: 4))包括一個Xho I切位(以網底標示)。將PCR產物利用Nde I與Xho I切位選殖入表現載體pET-22b(+)(NOVAGEN,Madison,WI)中，而製得pE7m質體。結果，該重組蛋白之C-端含有額外的六組胺酸標籤(HisTag)。

將表現質體pE7m轉形至大腸桿菌株BL21Star(DE3)(INVITROGEN,USA)中，以供進行蛋白質表現。將經轉形之細胞於37℃下培養過夜，然後以1 mM之IPTG進行誘導3小時。為獲得用於表現脂質化免疫原之質體，吾等遂將能夠被轉形至CD43(DE3)菌株中，用以表現重組型脂蛋白rlipo-D1E3(Chenet al. ,Vaccine 2009;27: 1400-9)的質體pD1E3加以修改。用於此步驟之前向引子(5’-CGCATGCACGGCGATACCCCGACCCT-3’(SEQ ID NO: 5))包括一個Bam HI切位(以網底標示)，而反向引子(5’-AGAGCCGCGGTTTCTGGCTCGCAATCGG-3’(SEQ ID NO: 6))包括一個Xho I切位(以網底標示)。利用Bam HI與Xho I切位，將PCR產物選殖入pD1E3中，而製得plipo-E7m質體。結果，該重組蛋白之C-端含有額外的六組胺酸標籤(HisTag)。將表現質體plipo-E7m轉形至大腸桿菌株C43(DE3)(INVITROGEN,Carlsbad,CA)中，以供進行脂質-蛋白表現。將經轉形之細胞於37℃下培養過夜，然後以1 mM之IPTG進行誘導3小時。

rlip0-E7m之特徵化

藉由如下述之固定化金屬親合性層析術(IMAC)，將自pE7m表現之重組型E7m(rE7m)與自plipoE7m表現之重組型rlipo-E7m從C43(DE3)細胞分離出。藉由離心(8000 xg ，20分鐘)自4-升細胞培養物採收大腸桿菌細胞，並將藉此收集得之細胞沈澱再懸浮於100 ml含有50 mM Tris(pH 8.0)之均質化緩衝液(homogenization buffer)中。然後使用French Press(Constant Systems,Daventry,UK)於27 Kpsi.下，將大腸桿菌細胞在有清潔劑存在下打破，並將因此所得之細胞溶解產物於80,000 xg 下離心60分鐘。收集沉澱物，並使用萃取緩衝液(1% TRITON X-100/50 mM Tris(PH8.9))使其溶解。於80,000 xg 下離心40分鐘後，將上清液與5 ml Ni-NTA樹脂(Qiagen，聖地牙哥，CA，USA)於冷房下培育過夜。將經過培育之樣本與樹脂漿液加樣至管柱(1.6 cm i.d. x 2.7 cm)上。首先將該管柱以50 mL萃取緩衝液沖洗。待以緩衝液(1% TRITON X-100,50mM Tris (PH8.9))溶析出重組蛋白質後，將彼等並藉由SDS-PAGE與免疫轉漬法進行特徵化。結果指出，分離得的重組型lipo-E7m具有高純度(如圖2所示)。使用與銅離子偶合之IMAC，並以1000 mL溶析緩衝液與300 mL清洗緩衝液(100 mM咪唑,1% TRITON X-100,50mM Tris(PH8.9))充分沖洗，以去除脂多醣(LPS)。於所得製劑中之殘留量少於30 EU/mg。

然後將融合蛋白質lipo-E7m依如下所述進行質譜術(MS)分析。特別是，將純化的rlipo-E7m使用手動擷取模式，灌流入WATERS SYNAPT HDMS質譜儀中。使用最大熵數演算法進行15重複次計算，而計算得分子質量。為鑑定rlipo-E7m之N-端片段，首先將rlipo-E7m對5 mM碳酸氫銨(於pH 8.5)進行透析，然後以胰蛋白酶(Promega Co.,Madison,WI)，於lipo-E7m：胰蛋白酶為50:1(wt/wt)之比例下，於25 mM碳酸氫銨(pH 8.5)中於室溫下處理5分鐘。藉由添加甲酸(終濃度為1.2%)終止該酵素反應。使用ZIPTIP(MILLIPORE)將反應混合物進一步研磨。將一微升經胰蛋白酶分解之蛋白質與1 μlα-氰基-4-羥基肉桂酸(Sigma)溶於乙腈/0.1%三氟乙酸(1:3，vol/vol)之飽和溶液混合。將一微升混合物置於基質輔助雷射脫附游離/飛行時間(MALDI-TOF)質譜儀(Burker)之標的平盤上進行分析。從MALDI-TOF分析得到的結果指出，部份胰蛋白酶分解作用產物相當於lipo-E7m之N-端片段，且此等肽類係經脂質化。

如圖3A中所示，結果證明純化的rlipo-E7m具有至少五個不同修飾，且各修飾相差14 amu。藉由最大熵數演算法(MaxEnt1)測得分子質量(以道耳頓為單位)。已證明有五個分別位於15384.5、15400、15412.5、15426及15439之主要高峰。如圖3B所示，為經由Bruker AutoFlex III質譜儀進行分析之10分鐘-分解樣本。MALDI-TOF MS光譜亦證明，有五個分別位於m/z 1452、1466、1480、1492及1506之高峰，其為脂質化衍生物之特徵。

上述結果實屬意外，因為大腸桿菌一般不適合用於製造經修飾的蛋白質，特別是脂質化蛋白質。

細胞毒性T淋巴細胞分析

為研究rlipo-E7m致免作用是否會於活體內誘導細胞毒性T淋巴細胞，遂將C57BL/6小鼠以rE7m或rlipo-E7m蛋白進行免疫，並使用如下述之鉻釋出分析法來分析細胞毒性T淋巴細胞活性。

簡述之，將C57BL/6小鼠以PBS、rE7m(30 mg)或rlipo-E7m(30 mg)，於第0天及第14天經皮下進行免疫接種。於第21天，收集各組小鼠之脾臟細胞，並以溶於10% FBS RPMI之1 mg/ml RAH於10 U/ml IL-2存在下進行再刺激5天供做為效應細胞。於進行最後一次免疫後七天，將紅血球-耗盡之脾臟細胞(1 x 10⁶ 細胞/mL)與1 mg/mL之HPV16 E7-衍生肽RAH(RAHYSIVTF)，及TC-1 10 U/mL重組型人類IL-2於24-孔平盤中進行活體外培養5天。將細胞(5 x 10⁵ )以100 mCi的⁵¹ Cr(Na₂ ⁵¹ CrO₄ ;PERKINELMER,Waltham,MA,USA)於下進行標定小時，以供做為標靶細胞。將經肽刺激之脾臟細胞與經標定的標靶細胞，以各種如所指定之效應細胞-對-標靶細胞比例混合。經於37℃下培育4小時後，使用加瑪計數器(PERKINELMER)測量上清液之放射活性。使用下列公式計算比溶解之百分比值：100×[(實驗釋出量-自發釋出量)/(最大釋出量-自發釋出量)]。

如圖4所示，於100及50之E/T比例下，rlipo-E7m能對E7-表現之腫瘤(TC-1細胞)誘發rE7m較強的殺死效應。此等結果指出，rlipo-E7m致免作用可於活體內誘導CTL反應。

活體內腫瘤保護實驗

關於活體內腫瘤保護實驗，係將C57BL/6小鼠(每組六隻)以30 μg rE7m或rlipo-E7m進行免疫。以與用於第一次疫苗接種相同的程序，對小鼠施予兩次追加免疫。於最後一次疫苗接種後兩週，將小鼠以2x10⁵ TC-1腫瘤細胞/小鼠，經皮下注射於右大腿內進行攻毒，並以視診及觸診每週進行檢測兩次。將另一動物模式首先注射以2x10⁵ TC-1腫瘤細胞/小鼠。在第七天，將30 μg rE7m或rlipo-E7m投藥予C57BL/6小鼠(每組六隻)。以視診及觸診對此等小鼠每週進行檢測兩次。

如圖5A所示，小鼠係以免疫原進行疫苗接種，然後使用TC-1腫瘤細胞攻毒。待以rlipo-E7m疫苗接種，100%之小鼠在腫瘤接種後歷經60天仍保持無腫瘤產生，而該等注射以PBS者於20天內即發展出腫瘤，且67%之小鼠在以rE7m疫苗接種後有發展出腫瘤。圖5B證明，於注射以腫瘤細胞之小鼠在投藥予免疫原之前，rlipo-E7m仍顯示具有較其非脂質化對應物(rE7m)更為優良的功效。特別是，83%接受rlipo-E7m者仍保持無腫瘤產生，而所有注射以PBS之小鼠在20天內皆發展出腫瘤，且僅有18%接受rE7m之小鼠仍保持無腫瘤產生。此等結果證明，於該二種小鼠模式中，去活化-E7之功效在其呈現脂質化形式時有顯著被增加。經rlipo-E7m疫苗接種之小鼠，當相較於以rE7m疫苗接種之小鼠，可提供顯著的對抗TC-1細胞攻毒之保護作用。

其他具體態樣

本說明書中所揭示之全部特徵可以任何組合方式組合。本說明書中所揭示之各別特徵可由依相同、相等或類似目的之替代特徵取代。因此，除非另行清楚地指示，所揭示之各特徵僅為一系列同等物或類似特徵之實例。前述之說明已描述本發明之許多較佳實施例。習於該項技藝人士應了解，在未偏離本發明之精神及範圍下可進行各種改變與修飾，以使其適於各種不同用途與狀況。因此，於申請專利範圍內亦包含其他具體態樣。

<110>　國家衛生研究院

<120>　脂質化腫瘤相關抗原及其免疫治療性組成物

<130>　38301-013001

<150>　61/219,301

<151>　2009-06-22

<160>　32

<170>　PatentIn version 3.5

<210>　1

<211>　98

<212>　PRT

<213>　人類乳頭狀瘤病毒

<400>　1

<210>　2

<211>　98

<212>　PRT

<213>　人類乳頭狀瘤病毒

<400>　2

<210>　3

<211>　35

<212>　DNA

<213>　人造序列

<220>

<223>　合成引子

<400>　3

<210>　4

<211>　34

<212>　DNA

<213>　人造序列

<220>

<223>　合成引子

<400>　4

<210>　5

<211>　32

<212>　DNA

<213>　人造序列

<220>

<223>　合成引子

<400>　5

<210>　6

<211>　34

<212>　DNA

<213>　人造序列

<220>

<223>　合成引子

<400>　6

<210>　7

<211>　121

<212>　PRT

<213>　腦膜炎雙球菌

<400>　7

<210>　8

<211>　17

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　Ag473(腦膜炎雙球菌脂蛋白)之片段(aa 1-17)

<400>　8

<210>　9

<211>　23

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　Ag473(腦膜炎雙球菌脂蛋白)之片段(aa 18-40)

<400>　9

<210>　10

<211>　31

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　Ag473(腦膜炎雙球菌脂蛋白)之片段(aa 41-71)

<400>　10

<210>　11

<211>　50

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　Ag473(腦膜炎雙球菌脂蛋白)之片段(aa 72-121)

<400>　11

<210>　12

<211>　40

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　Ag473(腦膜炎雙球菌脂蛋白)之片段(aa 1-40)

<400>　12

<210>　13

<211>　294

<212>　DNA

<213>　人類乳頭狀瘤病毒

<400>　13

<210>　14

<211>　140

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　rlipo-E7m融合蛋白質

<400>　14

<210>　15

<211>　420

<212>　DNA

<213>　人造序列

<220>

<223>　編碼rlipo-E7m融合蛋白質之DNA序列

<400>　15

<210>　16

<211>　404

<212>　PRT

<213>　人類疱疹病毒第4型

<400>　16

<210>　17

<211>　497

<212>　PRT

<213>　人類疱疹病毒

<400>　17

<210>　18

<211>　378

<212>　PRT

<213>　人類疱疹病毒第4型

<400>　18

<210>　19

<211>　886

<212>　PRT

<213>　人類疱疹病毒第4型

<400>　19

<210>　20

<211>　454

<212>　PRT

<213>　人類疱疹病毒第4型

<400>　20

<210>　21

<211>　992

<212>　PRT

<213>　人類疱疹病毒第4型

<400>　21

<210>　22

<211>　631

<212>　PRT

<213>　C型肝炎病毒

<400>　22

<210>　23

<211>　218

<212>　PRT

<213>　C型肝炎病毒

<400>　23

<210>　24

<211>　188

<212>　PRT

<213>　C型肝炎病毒

<400>　24

<210>　25

<211>　73

<212>　PRT

<213>　C型肝炎病毒

<400>　25

<210>　26

<211>　57

<212>　PRT

<213>　B型肝炎病毒

<400>　26

<210>　27

<211>　88

<212>　PRT

<213>　B型肝炎病毒

<400>　27

<210>　28

<211>　220

<212>　PRT

<213>　B型肝炎病毒

<400>　28

<210>　29

<211>　175

<212>　PRT

<213>　人類巨細胞病毒

<400>　29

<210>　30

<211>　551

<212>　PRT

<213>　人類巨細胞病毒

<400>　30

<210>　31

<211>　491

<212>　PRT

<213>　人類巨細胞病毒

<400>　31

<210>　32

<211>　100

<212>　PRT

<213>　人類巨細胞病毒

<400>　32

圖1A與1B為野生型HPV16 E7蛋白(1A;SEQ ID NO: 1)及去活化E7蛋白E7m(1B;SEQ ID NO:2)之胺基酸序列。

圖2A與2B為顯示重組E7m(rE7m;2A)與重組脂蛋白lipo-E7m(rlipo-E7m;2B)，經由IMAC純化及以15%SDS-PAGE於還原條件下進行偵測並以考馬斯藍(Coomassie Blue)染色(左圖)，或使用抗-(His)6抗體進行免疫轉漬偵測(右圖)而得之圖片。(A)列1：經IPTG誘導後之細胞溶解產物；列2：於IPTG誘導前之細胞溶解產物；列3：經誘導細胞之可溶部份；列4：經純化之rE7m；列5-8：免疫轉漬；(B)列1：經IPTG誘導後之細胞溶解產物；列2：於IPTG誘導前之細胞溶解產物；列3：經純化之rlipo-E7m；列4-6：免疫轉漬。

圖3A與3B為鑑定完整rlipo-E7m蛋白及其N-端片段之圖表。

圖4為顯示於C57BL/6小鼠中由rlipo-E7m誘發之腫瘤-特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應。

圖5A與5B為顯示rlipo-E7m於保護小鼠對抗腫瘤之功效，相較於rE7m。

Claims

一種單離的去活化HPV致癌蛋白E7蛋白E7m多肽，其係由SEQ ID NO：2之序列組成。
一種單離的核酸，其包含編碼如申請專利範圍第1項之多肽的序列，或其互補序列。
如申請專利範圍第2項之核酸，其中核酸含有SEQ ID NO：13之序列。
一種表現載體，其包含如申請專利範圍第2項之核酸。
一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第2項之核酸。
如申請專利範圍第5項之宿主細胞，其為大腸桿菌。
一種於個體中誘發對抗人類乳頭狀瘤病毒(HPV)之免疫反應的醫藥組成物，其包含有效量之如申請專利範圍第1項之去活化HPV致癌蛋白E7蛋白E7m多肽，及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
如申請專利範圍第7項之醫藥組成物，其中該組成物進一步包含醫藥上可接受之佐劑。
一種製造重組去活化HPV致癌蛋白E7蛋白E7m多肽之方法，其包含將包含如申請專利範圍第2項之核酸的宿主細胞培養於允許由該核酸編碼之多肽表現的條件下，及將該多肽自所培養之細胞或培養基純化出。
一種單離的脂質化融合蛋白質，其包含具有Ag473之N-端40個殘基(SEQ ID NO.12)之脂質化序列的第一片段，及具有如申請專利範圍第1項之去活化HPV致癌蛋白E7蛋白E7m多肽(SEQ ID NO.2)之第二片段，其中於該融合蛋白質中該第一片段係位於該第二片段的N-端。
一種單離的核酸，其包含編碼如申請專利範圍第10項之脂質化融合蛋白質的序列，或其互補序列。
如申請專利範圍第11項之核酸，其中核酸含有SEQ ID NO：15之序列。
一種表現載體，其包含如申請專利範圍第11項之核酸。
一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第11項之核酸。
如申請專利範圍第14項之宿主細胞，其為大腸桿菌。
一種於個體中誘發對抗腫瘤相關抗原之免疫反應的醫藥組成物，其包含將有效量之如申請專利範圍第10項之融合蛋白質，及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
如申請專利範圍第16項之醫藥組成物，其中該組成物進一步包含醫藥上可接受之佐劑。
一種製造如申請專利範圍第10項之脂質化融合蛋白質之方法，其包含將包含如申請專利範圍第11項之核酸的大腸桿菌宿主細胞培養於允許由該核酸編碼之融合蛋白質表現的條件下，及將該融合蛋白質自所培養細胞或培養基純化出。