MXPA05014171A - Metodo de inmunizacion contra neisseria meningitidis serogrupos a y c. - Google Patents

Abstract

La presente invencion describe metodos de inmunizacion de un paciente con una vacuna combinada que ofrece proteccion contra el padecimiento de meningococos provocada por la bacteria patogenica Neisseria meningitidis serogrupos A y C. La vacuna comprende al menos dos distintos conjugados de polisacarido-proteina que estan formulados como una sola dosis de vacuna. Los polisacaridos capsulares purificados de Neisseria meningitidis serogrupos A y C se activan quimicamente y se unen selectivamente a una proteina portadora por medio de un enlace quimico covalente, formando conjugados de polisacarido-proteina capaz de generar inmunidad a largo plazo para una variedad de la cepa de N. Meningitidis en infantes.

Description

MÉTODO DE INMUNIZACIÓN CONTRA NEISSERIA MENINGITIDIS SEROGRUPOS A Y C Campo de la Invención La presente invención se refiere al campo de la medicina en general, y más específicamente a la microbiología, inmunología, vacunas y la prevención de infecciones por patógenos bacterianos por medio de inmunización. Antecedentes de la invención La Neisseria meningi tidis es una causa principal de la meningitis y la septicemia bacterianas en todo el mundo. La incidencia de la enfermedad del meningococo durante los últimos treinta años varía desde 1 a 5 de cada 100,000 en el mundo desarrollado, y desde 10 a 25 de cada 100,000 en los países desarrollados (Reido, F. X., et al., 1995). Durante las epidemias, la incidencia de la enfermedad de meningococos se acera a 1000 por cada 1000,000. Hay aproximadamente 2,600 casos de meningitis bacteriana por año en los Estados Unidos, y en promedio 330,000 casos en los países desarrollados. La tasa de casos fatales varía entre el 10 y el 20%. Los meningococos patógenos están envueltos por una cápsula de polisacáridos que se une a la superficie de la membrana externa 'del organismo. Se han identificado trece diferentes serogrupos de meningococos sobre la bases de la especificidad inmunológica de los polisacáridos capsulares (Frasch, C. E., et al., 1985) . De estos trece serogrupos, cinco provocan la mayor parte de las enfermedades de meningococos; estos incluyen los serogrupos A, B, C, W-135, e Y. El serogrupo A es responsable por la enfermedad más epidémica. Los serogrupos B, C, e Y provocan la mayoría de las enfermedades endémicas y las epidemias localizadas. La mucosa naso^orofaringea humana es el único depósito natural conocido de Neisseria meningi tidis . La colonización toma lugar tanto en la superficie exterior de las células mucosas y el tejido subepitelial de la nasofaringe . El transporte de los meningococos puede durar por meses . La propagación de los meningococos ocurre por contacto directo o por medio de gotas enviadas al aire. Los meningococos se vuelven invasivos pasando a través del epitelio mucoso vía las vacuolas fagocíticas como resultado de la endocitosis. Las defensas del anfitrión contra los meningococos invasores dependen de la bacteriolisis mediada por complementos. Los anticuerpos del suero que son responsables por la bacteriolisis mediada por complementos se dirigen en gran parte contra los polisacáridos capsulares externos. Se han descrito vacunas basadas en los polisacáridos de meningococos las cuales provocan una respuesta inmune contra los polisacáridos capsulares. Estos anticuerpos pueden realizar la bacteriolisis mediada por complementos de los meningococos específicos del serogrupo. Las vacunas de polisacáridos de meningococos dan evidencias de ser eficaces en niños y adultos (Peltola, H. , et al., 1997 y Artenstein, M. S., et al., 1970), pero la eficacia se limita a infantes y niños pequeños (Reingold, A. L. et al., 1985). Las dosis subsecuentes de polisacáridos en las poblaciones más jóvenes provocó una respuesta débil o no defensora (Goldscheinder, L. , et al., 1973 y Gold, R. , et al., 1997) la duración de la protección provocada por las vacunas de polisacáridos de meningococos no es perdurable, y se ha estimado que es entre 3 a 5 años en los adultos y niños con más de cuatro años (Brandt, B., et al., 1975, ythy, H. , et al., 1980, y Ceesay, S. J. , et al., 1993) . Para los niños de uno a cuatro años de edad, la duración de la protección es de menos que tres años (Reingold, S. L. , et al., 1985). Los polisacáridos son incapaces de enlazarse a las moléculas complejas de histocompatibilidad principales un prerrequisito para la presentación de antígenos a y la estimulación de los linfocitos T coadyuvantes, es decir, estos son antígenos independientes de las células T. Los polisacáridos son capaces de estimular los línfocitos B en cuanto a la producción de anticuerpos sin la ayuda de los linfocitos T coadyuvantes. Como resultado de la estimulación independiente de T de los linfocitos B, existe una carencia de inducción de memoria enseguida de la inmunización por estos antígenos. Los antígenos de polisacáridos son capaces de provocar respuestas independientes de T muy efectivas en adultos, pero estas respuestas independientes de T son débiles en el sistema inmunológico inmaduro de los infantes y niños pequeños . Los antígenos de polisacáridos independientes de T se pueden convertir a antígenos dependientes de T por el enlazamiento covalente de los polisacáridos con las moléculas de proteína ("portadoras" o "proteínas portadoras"). Las células B que se enlazan al componente polisacárido de la vacuna conjugada pueden ser activadas por las células T coadyuvantes específicas para los péptidos que son parte de la proteína portadora conjugada. La respuesta de las células T coadyuvantes a la proteína sirve para aumentar la producción del anticuerpo para el polisacárido. La conjugación a una proteína portadora no siempre ha resultado en una vacuna capaz de inducir la memoria contra el polisacárido. MacLennan et al . , describe un estudio de una vacuna de conjugado con adyuvante A/C de meningococos dada a infantes, menores que seis meses de edad. MacLennan, J. et al., Infect . Dis. 2001;183:97-104. La vacuna conjugada contenía 11 µg de cada polisacárido y 49 µg de CRM197 con adyuvante con 1 mg de hidróxido de aluminio. Los niños se apoyaron ya sea con la vacuna de polisacáridos A/C de meningococos conteniendo 50 µg de cada polisacárido o el conjugado cuando los niños tenían entre 18 y 24 meses, y se revacunaron aproximadamente a los 5 años de edad con una sola vacuna A/C de meningococos conteniendo 10 µg de cada polisacárido. Se sacaron muestras de sangre antes de la vacunación y diez días después de la vacunación. Los autores notaron que las concentraciones del anticuerpo del Grupo A antes de la vacunación son altas en todos los grupos, y concluyeron que no creían que la memoria inmunológica para los componentes del grupo A de esta vacuna este probada concluyentemente . El polisacárido del serogrupo B ha dado evidencias de ser pobremente a no in unogénico en la población humana (Wyle, F. A., et al., 1972). En enlazamiento químico de este serogrupo de polisacárido a las proteínas no ha alterado significativamente la respuesta inmune en los animales de laboratorio (Jennings, H. J. et al., 1981). Se piensa que la razón para la carencia de respuesta inmune a este polisacárido serogrupo surge de las similitudes estructurales entre el polisacárido del serogrupo B y las glicoproteínas polisililatadas del anfitrión, tales como las moléculas de adhesión de las células neuronales. Se ha descrito una vacuna de conjugados de meningococos basados en el polisacárido de serogrupo C. Esta vacuna monovalente provoca una respuesta de anticuerpos funcionales fuertes para el polisacárido capsular presente en la cepas de N. meningi tidis correspondientes al serogrupo C. Tal vacuna sólo es capaz de proteger contra la enfermedad provocada por las bacterias del serogrupo C. La USP 5,425,946, describe un conjugado inmunogénico que comprende un polisacárido de meningococo del grupo C modificado (GCMP) acoplado a una molécula portadora. El GCMP se modifica por la O-desacetilación en una extensión variable. La patente describe remover selectivamente los grupos O-acetilo en las posiciones 7 y/o 8 de las porciones sililo en el polisacárido del grupo C de las cepas OAc+ a una extensión variable del polisacárido del grupo C de meningococos por el tratamiento con un reactivo apropiado. Los métodos para preparar conjugados de proteína-polisacárido usando un separador de dihidrazida adipica se describen por Schneerson, R. et al., Preparation, Characterization and Immunogenicity of Haemophilus Influenzae Type b Polysaccharide-Protein Conjugates, J. Exp. Med. 1952, 361-476 (1980), y en la Patente Norteamericana No. 4,644,059 de Lance K. Gordon. Se conocen otros métodos de enlazamiento tales como una tecnología de separados binario como se describe por Marburg, S., et al., "Biomolecular Chemistry of Macromolecules,- Synthesis of Bacterial Polisaccharide Conjugates with Neisseria meningitidus Membrane Protein" , J. Am. Chem. Soc . , 108, 5282-5287 (1086) y una metodología de extremos de reducción, como se menciona por Anderson en la Patente Norteamericana No. 4,673,574. Las vacunas existentes basadas en polisacáridos de meningococos son de uso limitado en niños pequeños y no proporcionar protección duradera en adultos . La única vacuna de meningococos que ha mostrado evidencia de ser capaz de provocar una protección perdurable en todos los grupos, incluyendo los niños, en riesgo de infección de meningococos, se basa en un polisacárido de un sólo serogrupo de N. meningi tidis y no proporciona protección contra las infecciones por otros serogrupos. Por lo tanto, existe una necesidad en cuanto a una vacuna conjugada de meningococos capaz de conferir protección amplia, de larga vida contra la enfermedad de meningococos en niños y adultos en riesgo de infección de meningococos. Los polisacáridos multivalentes de meningococos de la presente invención resuelven esta necesidad proporcionando formulaciones de vacunas en las cuales los polisacáridos inmunogénicos de los serogrupos patogénicos principales de N. meningitidis se han convertido en antígenos T-dependiente a través de conjugaciones por proteínas portadoras .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para la prevención de enfermedades provocadas por los serogrupos A y C patogénicos de Neisseria meningi tidis mediante la administración de una composición que comprende conjugados de proteína-polisacárido de meningococos libres de aluminio. La presente invención proporciona un método para inducir una respuesta inmunológica para los polisacáridos capsulares de los serogrupos A y C de N. meningi tidis administrando una cantidad inmunológicamente efectiva de la composición inmunológica a un humano. La composición inmunológica es una vacuna de meningococos multivalente que comprende al menos dos conjugados de proteína-polisacáridos diferentes, un conjugado que comprende un polisacárido capsular del serogrupo A, conjugado, ya sea directamente o por un enlazador, con una proteína portadora, y un segundo conjugado que comprende un polisacárido capsular del serogrupo C conjugado, ya sea directamente o por un enlazador, con una proteína portadora. La composición inmunológica se encuentra libre de aluminio. La composición inmunológica puede contener otros compuestos, tales como auxiliares libre de aluminio, o conservadores. Todas las patentes, solicitudes de patente, y otras publicaciones enumeradas aquí se incorporan por este medio como referencia en su totalidad.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para inducir una respuesta inmunológica para los polisacáridos capsulares de los serogrupos A y C de N. meningi tidis administrando a un humano una cantidad in unológicamente efectiva, libre de aluminio de la composición inmunológica que comprende los polisacáridos capsulares de los serogrupos a y C conjugado cada uno a una proteína portadora. Los polisacáridos capsulares de los serogrupos A y C preferiblemente se conjugan individualmente a una proteína portadora. La conjugación puede ser un enlazamiento químico directo entre el polisacárido y la proteína portadora, o un enlazamiento indirecto por medio del cual el polisacárido y la proteína portadora se unen químicamente vía una molécula enlazadora. El polisacárido se puede enlazar primero covalentemente a la molécula enlazadora, después la proteína portadora se enlaza covalentemente a la molécula enlazadora. Alternativamente, la proteína portadora se puede enlazar primero covalentemente a la molécula enlazadora, después se enlaza el polisacárido a la molécula enlazadora. La composición inmunológica puede contener otros compuestos, tales como auxiliares libre de aluminio, o conservadores . Los métodos para preparar los polisacáridos capsulares de N. meningitidis serogrupos A y C son bien conocidos en la técnica, ya que las vacunas que contienen los polisacáridos de N. meningitidis han sido vendidas bajo licencia por muchos años. Por ejemplo, los métodos para obtener los polisacáridos capsulares del serogrupo A de N. meningi tidis se describen en La Patente Norteamericana 6,045,805 de Moreau, Patente Norteamericana No. 6,945,805, usando un método descrito en Gotschlich et al., Prog. Immunobiol . Standard. (1972) 5:485. Patente Norteamericana 6,045,805 describe la preparación de un oligosacárido a partir de un polisacárido nativo, más grande despolimerizando el polisacárido y fluyendo el oligosacárido más pequeño desde una columna de cromatografía. El oligosacárido se puede aislar usando varias técnicas convencionales, por ejemplo, por precipitación usando un agente de precipitación adecuado tal como acetona o alcohol, por filtración sobre una membrana que tiene un umbral de separación apropiada, por exclusión-difusión o por cromatografía de intercambio iónico. Subsecuentemente, se pueden obtener las fracciones del oligosacárido que contienen las moléculas que tienen una constante de elusión igual, a o cerca de, la constante de elusión media. El polisacárido de acuerdo a la invención se puede acoplar, vía enlazamiento covalente, con un compuesto de naturaleza peptídica o proteínica o con otro polímero orgánico tal como por ejemplo poliacrilato, para formar un conjugado capaz de promover la inmunogenicidad del polisacárido, especialmente en un mamífero.. Se prefiere que el polisacárido se conjugue con una proteína bacteriana, más preferiblemente, una toxina bacteriana, la anatoxina correspondiente o una subunidad de una toxina multimerica así como una proteína de membrana, una subunidad de una proteína de membrana multimerica o una proteína citoplasmática. Las toxinas preferidas incluyen, la toxina de tos ferina, la toxina del cólera, la toxina del tétanos y la toxina de la difteria. Estas proteínas se pueden extraer de las bacterias originales o alternativamente se pueden preparar recombinantemente . Los métodos químicos para preparar los congojados de polisacárido-proteína son bien conocidos. Por ejemplo, se puede crear un grupo funcional en el .oligosacárido, el cual es capaz de reaccionar con un grupo funcional de la proteína portadora. También se puede hacer reaccionar un agente de acoplamiento bifuncional con el oligosacárido y después con una proteína portadora, o viceversa. W. E. Dic y M. Beurret en Conjugates Vaccines, J. M. Cruse, R. E. Le is Jr Eds, Contrib. Microbiol . Immunol . Basel, Karger (1989) 10:48, proporciona un repaso de estos varios métodos de acoplamiento. Además, el proceso de fragmentación por oxidación-reducción introduce grupos de reducción, especialmente en los oligosacáridos derivados de un polisacárido de N. meningitidis grupo A. En una modalidad preferida, estos conjugados de serogrupos de meningococos se preparan por procesos separados y se formulan en una sola formulación de dosificación. Por ejemplo, los polisacáridos capsulares de los serogrupos A y C de N. meningi tidis se purifican por separado. En una modalidad preferida de la presente invención, los polisacáridos A y C purificados se despolimerizan por separado y se activan por separado antes de la conjugación con una proteína portadora. Preferiblemente, los polisacáridos capsulares de los serogrupos A y C de N. meningi tidis se despolimerizan parcialmente por separado, usando condiciones oxidantes moderadas . La despolimerización o la despolimerización parcial de los polisacáridos pueden estar seguidas entonces por un paso de activación. Por "activación" se quiere decir el tratamiento químico del polisacárido para proporcionar grupos químicos capaces de reaccionar con la proteína portadora. Un método de activación preferido involucra el tratamiento con dihidrazina de ácido adípico en solución salina fisiológica a pH S.O±O.l por aproximadamente dos horas de 15 a 30°C. Un proceso para la activación se describe en la Patente Norteamericana 5,965,714.

Una vez activados, los polisacáridos capsulares se pueden conjugar entonces con una o más proteínas portadoras.

En una modalidad preferida de la presente invención, cada polisacárido capsular A y C se conjuga por separado con una proteína portadora individual, más preferiblemente, cada uno se conjuga con la misma proteína portadora. Las proteínas portadoras pueden incluir toxinas bacterianas desactivadas tales como anatoxina de difteria, CRM197, anatoxina de tétanos, anatoxina de tos ferina, E. coli LT, E. coli ST, y exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa . Las proteínas de la membrana bacteriana externa tales como, el complejo c de la membrana externa (OMPC) , porinas, proteínas de enlace de transferrina, pneumolisis, proteína A de superficie neumocócica (PspA) , proteína de adhesión del neumocócica (PsaA) , también se podría usar. Otras proteínas tales como la ovalbumina, hemocianina de lapa californiana (KLH) , albúmina de suero de bovino (BSA) o derivados proteicos purificados de tuberculina (PPD) también se pueden usar como proteínas portadoras . Las proteínas portadoras son preferiblemente proteínas que son no tóxicas y no reactogenicas y que se pueden obtener, en cantidad y pureza suficientes . Las proteínas portadoras deben ser asequibles a los procedimientos de conjugación estándar. En una modalidad preferida de la presente invención, la toxina de difteria purificada a partir de cultivos de Corynebacteria diphtheriae y destoxificada químicamente usando formalde ído se usa como la proteína portadora. Después de la conjugación del polisacárido capsular con la proteína portadora, los conjugados de polisacárido-proteína se pueden purificar (enriquecidos con respecto a la cantidad del conjugado de polisacárido-proteína) mediante una variedad de técnicas. Un objetivo del paso de purificación es remover el polisacárido no enlazado del conjugado de polisacárido-proteína. Un método para la purificación, que involucra ultrafiltración en presencia de sulfato de amonio, se describe en la Patente Norteamericana 6,146,902. Alternativamente, los conjugados se puede depurar de la proteína sin reaccionar y el polisacárido por medio de varias técnicas estándar incluyendo, inter alia, cromatografía por exclusión de tamaños, centrifugación por gradiente de densidad, cromatografía de interacción hidrofóbica o fraccionamiento por sulfato de amonio. Véase, por ejemplo, P. W. Anderson, et al., (1986). J. Immunol. 137:1181-1186. Véase también H. J. Jennings y C. Lugo ski (1981) J. Immunol . 127:1011-1018. Después de la conjugación del polisacárido y la proteína portadora, las composiciones inmunológicas de la presente invención se preparan combinando los varios conjugados de polisacárido-proteína, preferiblemente en cantidades aproximadamente iguales. Las composiciones inmunológicas de la presente invención comprenden dos o más polisacáridos capsulares conjugados con una o más proteína (s) portadoras. Una modalidad preferida de la presente invención es una composiciones inmunológica bivalente que comprende los polisacáridos capsulares de los serogrupos A y C de N. meningi tidis cada uno conjugado por separado a la anatoxina de difteria. La cantidad total de polisacárido en la composición contiene aproximadamente 0.5 a aproximadamente 50 µg de polisacárído, más preferiblemente, aproximadamente 2 a aproximadamente 30 µg de polisacárido, y más preferiblemente, aproximadamente, y a aproximadamente 20 µg de polisacárido. Las cantidades relativas de los polisacáridos A y C en una composición dada pueden variar, pero preferiblemente, están presentes en cantidades iguales dentro de aproximadamente una diferencia del 25%, más preferiblemente, dentro de una diferencia de aproximadamente 15%, o alternativamente en un rango de relaciones de polisacáridos A: C de 1:3 a 3:1, más preferiblemente de un rango de 1:2 a 2:1. La preparación y uso de las proteínas portadoras, y una variedad de procedimientos de conjugación potenciales, son bien conocidos para aquellas personas experimentadas en la técnica. Los conjugados de la presente invención pueden ser preparados por tales personas experimentadas usando las enseñanzas contenidos en la presente invención así como la información fácilmente disponible en la literatura general . También se puede obtener orientación de alguna o todas las siguientes Patentes Norteamericanas, las enseñanzas de las cuales se incorporan por esto en su totalidad como referencia: U.S. 4,356,170; U.S. 4,619,828; U.S. 5,153,312; U.S. 5,422,427 y U.S. 5,445,817. La cantidad total de proteína portadora en la composición contiene aproximadamente 20 a aproximadamente 75 µg de proteína portadora, y más preferiblemente, aproximadamente 30 a aproximadamente 50 µg de proteína portadora. Las composiciones inmunológicas de la presente invención se hacen preparando por separado los conjugados de proteína-polisacárido de diferentes serogrupos de meningococos y después combinando los conjugados. Las composiciones inmunológicas de la presente invención se pueden usar como vacunas . La formulación de las vacunas de la presente invención se puede lograr usando los métodos reconocidos en la técnica. Las composiciones de vacunas de la presente invención también pueden contener uno o más adyuvantes libre de aluminio. Los adyuvantes incluyen, a manera de ejemplo y sin limitación, Adyuvante de Freund, BAY, DC-chol, pcpp, lípido A monofosforilo, CpG, QS-21, toxina de cólera y péptido formal metionilo. Véase, por ejemplo, Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach, 1995 (M. F. Powell y M. J. Ne man, eds . , Plenum Press. NY) . La presente invención se dirige a un método para inducir una respuesta inmunológica en una paciente, preferiblemente un paciente humano . Como se demuestra abajo, las vacunas y las composiciones inmunológicas de acuerdo a la invención provocan una respuesta inmune similar a T-dependiente en varios modelos animales, en tanto que la vacuna de polisacárido provoca una respuesta inmune similar a T-dependiente. Por lo tanto, las composiciones de la invención también son herramientas de investigación útiles para estudiar las vías biológicas y los procesos involucrados en las respuesta inmunes similares a T-dependientes a los antígenos de N. meningi tidis . La cantidad de vacuna de la invención a ser administrada a un humano o animal y el régimen de administración se pueden determinar de acuerdo con las técnicas estándar bien conocidas por aquellas personas con experiencia ordinaria en las técnicas farmacéutica y veterinaria, tomando en consideración factores tales como el antígeno particular, el adyuvante (si esta presente) la edad, sexo, peso especie y condición del animal o paciente particular, y la ruta de administración. En la presente invención, la cantidad de polisacárido-proteína portadora para proveer una dosis eficaz para la vacunación contra la N. meningi tidis puede ser de entre aproximadamente 0.02 µg a aproximadamente 5 µg por kg de peso corporal. En una composición preferida y método de la presente invención la dosificación es entre aproximadamente 0.1 µg a 3 µg por kg de peso corporal. Por ejemplo, una dosificación eficaz requerirá menos anticuerpo si el tiempo transcurrido después de la infección es menor ya que hay menos tiempo para que la bacteria prolifere. De la misma manera una dosificación eficaz dependerá de la carga bacteriana en el momento del diagnóstico. Varias inyecciones administradas durante un periodo de días se podrían considerar para el uso terapéutico.

La presente invención proporciona un método para acrecentar en un sujeto humano una respuesta inmune meningocócica contra uno de los polisacáridos capsulares A y C. El método implica en general una vacunación primaria usando una composición de vacuna de conjugado polisacárido-proteína libre de aluminio, que comprende los polisacáridos capsulares meningocócicos A y C conjugados a una proteína portadora, por ejemplo, una vacuna de conjugado A/C. En una modalidad preferida, una sola vacunación primaria es suficiente para provocar una respuesta inmune anti-meningocócica en el sujeto vacunado la cual es específica para los meningococos serogrupos A y C. Después que la respuesta inmune provocada por la vacunación primaria ha declinado a niveles sub- protectores, se lleva a cabo una vacunación de refuerzo para proporcionar una respuesta inmune anti-meningocócica reforzada o acrecentada. La vacunación de refuerzo puede ser una vacuna de los polisacáridos A y C de meningococos, o un meningococo A y C conjugado a una proteína portadora, por ejemplo, la vacuna de conjugado A/C. Los conjugados multivalentes de la presente invención se pueden administrar como una dosis individual o eri una serie (es decir, con un "reforzador" o "reforzadores"). Por ejemplo, un niño podría recibir una sola dosis en los primeros años de vida, después se administra una dosis reforzadora diez años más tarde, como se recomienda actualmente para otras vacunas que previenen enfermedades de niñez. Preferiblemente, el paciente se inmuniza en una dosis individual antes de un año de edad. La presente invención demuestra que la inmunización con la vacuna de conjugado A/C se puede administrar concomitantemente con otras vacunas de la niñez, tales como DTP y OPV. • La dosis de refuerzo generará los anticuerpos de las células B cebadas, es decir, una respuesta anamnésica. Es decir, la vacuna de conjugado multivalente provoca una alta respuesta del anticuerpo funcional primario (es decir, enseguida de una sola administración de la vacuna) en las poblaciones más jóvenes en comparación con la vacuna de polisacárido autorizada, y es capaz de provocar una respuesta anamnésica (es decir, enseguida de una administración de revacunación) , demostrando que la respuesta inmune protectora provocada por la vacuna de perdurable . Las composiciones de la invención pueden incluir preparaciones líquidas para la administración por los orificios, por ejemplo, oral, nasal, anal, vaginal, peroral, intragástrico, de la mucosa (por ejemplo, la mucosa perlingüal, alveolar, gingival, olfativa o respiratoria) , etc., tales como por ejemplo suspensiones, jarabes o elixires; y preparaciones para la administración (por ejemplo, administración por inyección) parenteral , subcutánea, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal , o intravenosa, tales como suspensiones o emulsiones estériles. Se prefiere la administración intravenosa y parenteral. Tales composiciones se pueden encontrar en un preparado con un portador, diluyente, o excipiente adecuado tales como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa o los similares. Las composiciones también pueden estar liofilizadas. Las composiciones pueden contener substancias auxiliares tales como agentes de humectación o emulsionantes, agentes amortiguadores de pH, aditivos que aumentan la gelificación o la viscosidad, conservadores, agentes saborizantes, colorantes, y los similares, dependiendo de la ruta de administración y la preparación deseada. Los textos estándar, tales como "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17° edición, 1985, incorporado aquí como referencia, puede ser consultado para preparar las preparaciones adecuadas, sin experimentación excesiva. Las composiciones de la invención se proporcionan convenientemente como preparaciones líquidas, por ejemplo, soluciones acuosas isotónicas, suspensiones, emulsiones o composiciones viscosas, que se pueden amortiguara a un pH seleccionado. Si se prefiere la absorción por el tracto digestivo, las composiciones de la invención puede estar en las formas "sólidas" de pildoras, tabletas, cápsulas, comprimidos con forma ovalada, y las similares, incluyendo las preparaciones "sólidas" las cuales se liberan por tiempos o las cuales tienen un relleno de líquido, por ejemplo, líquido cubierto con gelatina, por lo cual la gelatina se disuelve en el estomago para suministrarlo al intestino. Si se desea la administración nasal o respiratoria (por la mucosa) , las composiciones pueden estar en una forma y se suministran por medio de un dosificador de atomizador de estrujamiento, dosificador de bomba o dosíficador en aerosol. Los aerosoles se encuentran usualmente a presión por medio de un hidrocarburo. Los dosificadores de bomba pueden dosificar preferiblemente una dosis medida o una dosis que tiene un tamaño de partícula determinado. Las preparaciones líquidas normalmente son más fáciles de preparar que los geles, otras composiciones viscosas, y composiciones sólidas. Adicionalmente, las composiciones líquidas son algo más convenientes de administrar, en especial por inyección u oralmente, a animales, niños, en particular niños pequeños, y otros quienes pueden tener dificultad para tragar una pildora, cápsula o las similares, o en situaciones de dosis múltiples. Las composiciones viscosas, por otro lado, se pueden formular dentro del rango de viscosidad apropiado para proveer periodos de contacto prolongados con la mucosa, tales como el recubrimiento del estomago o la mucosa nasal . Obviamente, la elección de los portadores adecuados y otros aditivos dependerá de la ruta exacta de la administración y la naturaleza de la forma de dosificación particular, por ejemplo, forma de dosificación líquida para (por ejemplo, si la composición se debe formular en una solución, una suspensión, gel u otra forma líquida) , o forma de dosificación sólida (por ejemplo, si la composición se debe formular en una pildora, tableta, cápsula, comprimido con forma ovalada, forma de liberación por tiempos, o forma rellena de líquido) . Las soluciones suspensiones y geles, normalmente contienen una cantidad mayor de agua (preferiblemente agua purificada) además del ingrediente activo. Las cantidades menores de otros ingredientes tales como ajustadores de pH (por ejemplo, una base tal como NaOH) , emulsionantes o agentes dispersantes, agentes amortiguadores, conservadores, agentes de humectación, agentes de gelatinización (por ejemplo, metilcelulosa) , colorantes y/o saborizantes también pueden estar presentes. Las composiciones pueden ser isotónicas, es decir, estas pueden tener la misma presión osmótica que la sangre y el fluido lacrimal. La isotonicidad deseada de las composiciones de esta invención se puede lograr usando tartrato de sodio, polietilenglicol y otros solutos inorgánicos u orgánicos. Se prefiere el cloruro de sodio en particular para los amortiguadores que contienen iones de sodio. La viscosidad de las composiciones se puede mantener al nivel seleccionado usando un agente de espesamiento farmacéuticamente aceptable. La metilcelulosa se prefiere porque esta se consigue fácilmente y sin demasiado gasto y es fácil trabajar con ella. Otros agentes de espesamiento adecuados incluyen, por ejemplo, goma de xantano, carboximetil celulosa, hidroxípropil celulosa, carbómero, y los similares. La concentración preferida del espesante dependerá del agente seleccionado. El punto importante es usar una cantidad que logrará la viscosidad seleccionada. Las composiciones viscosas se preparan normalmente a partir de soluciones por la adición de tales agentes de espesamiento. Se puede emplear un conservador farmacéuticamente aceptable para aumentar la vida de almacenamiento de las composiciones. El alcohol bencílico puede ser adecuado, aunque también se puede emplear una variedad de conservadores incluyendo, por ejemplo, parabenos, timerosal, clorobutanol, o cloruro de benzalconio. Una concentración adecuada del conservador será desde 0.02% a 2% con base en el peso total aunque pueden haber ahí variaciones apreciables dependiendo del agente seleccionado. Aquellas personas experimentadas en la técnica reconocerán que los componentes de las composiciones se deben seleccionar para ser químicamente inertes con respecto a los conjugados de polisacárido-proteína portadora de N. meningi tidis . La invención se describirá posteriormente por la referencia a los siguientes ejemplos ilustrativos, no limitantes que explican con detalle varias modalidades preferidas del concepto inventivo. Otros ejemplos de esta invención serán aparentes para aquellas personas experimentadas en la técnica sin apartarse del espíritu de la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Preparación de polvos de polisacáridos capsulares purificados de Neisseria meningitidis serogrupos A y C Preparación de Pasta Cruda Por separado, cultivos semilla congelados en húmedo de Neisseria meningi tidis serogrupos A y C se descongelaron y se recuperaron con ayuda de un medio de Watson Scherp líquido y se plantaron en botellas de Blake conteniendo medio de agar de Mueller Hinton. Los Blake se incubaron de 35 a 37°C en una atmósfera de C02 por 15 a 19 horas. Enseguida del periodo de incubación, se desprendió el cultivo de las botellas de Blake y se agregaron a matraces de 4 L conteniendo medio de Watson Scherp. Los matraces se incubaron de 35 a 37 grad. C. por 3 a 7 horas sobre una plataforma de agitación. Los contenidos de los matraces de 4 L se transfirieron a un recipiente de fermentación conteniendo medio de Watson Scherp. El recipiente de fermentación se incubó de 35 a 37 grad. C. por 7 a 12 horas controlando el contenido de oxígeno disuelto y el pH con alimentación complementaria y adiciones de antiespumante. Después del periodo de incubación, los contenidos del recipiente de fermentación se transfirieron a un tanque de 500 L, se agregó Cetvalon™, y el material se mezcló por 1 hora. Los cultivos tratados con Cetvalon se sometieron a centrifugación a aproximadamente 15,000 a 17,000 x g a una velocidad de flujo de aproximadamente 30 a 70 litros por hora. El polisacárido crudo se precipitó del sobrenadante con una segunda precipitación de Cetvalon™. Se agregó Cetvalon™ al sobrenadante y el material se fijó por al menos 1 hora a la temperatura ambiente. El material se almacenó de 1 a 5 grad. C por 8 a 12 horas. El polisacárido precipitado se recolectó por centrifugación a aproximadamente 45,000 a 50,000 x g a una velocidad de flujo de 300 a 400 mL por minuto. La pasta desactivada, recolectada se almacena a -60 grad. C o menos hasta el procesamiento posterior. La pasta desactivada se puede preparar en varios lotes y se combinan. Preparación de Polvo de Polisacárido Purificado La pasta desactivada se descongela y se transfiere a un mezclador. La pasta se mezcla con cloruro de calcio 0.9 M para dar una suspensión homogénea. La suspensión se somete a centrifugación a aproximadamente 10,000 x g por 15 minutos. El sobrenadante se decanta a través de un relleno libre de borra hacia un recipiente como el primer extracto . Se agrega a la pasta un segundo volumen de cloruro de calcio 0.9 M, y se mezcla para dar una suspensión homogénea. La suspensión se somete a centrifugación como arriba, y el sobrenadante se combina con el sobrenadante de la primera extracción. Se llevan a cabo un total de cuatro extracciones, y los sobrenadantes se combinan. Los extractos combinados se concentran por ultrafiltración usando unidades de ultrafiltración espiral MWCO de 10-30 kDA. Se agrega cloruro de magnesio al concentrado, y se ajusta el pH a 7.2-7.5 usando hidróxido de sodio. Se agregan DNasa y RNasa al concentrado, y se incuba a 25-28 grad. C. con mezclado por 4 horas . Se agrega etanol a una concentración de 30-50%. El ácido nucleico precipitado y la proteína se remueven por centrifugación a 10,000 x g por 2 horas. Se recupera el sobrenadante y se precipita el polisacárido agregando etanol a 80% y permitiéndole reposar durante toda la noche a 1-5 grad. C. Se extrae por sifón el alcohol, y el polisacárido precipitado se somete a centrifugación por 5 minutos a 10,000 x g. El polisacárido precipitado se lava con alcohol. El polisacárido se extrae con acetona, se somete a centrifugación a 15-20 minutos a 10,000 x g. El polisacárido se seca al vacío. El polvo de polisacárido inicial se disuelve en solución de acetato de sodio. Se agrega cloruro de magnesio y se ajusta el pH a 7.2-7.5 usando solución de hidróxido de sodio. Se agregan DNasa y RNasa a la solución y se incuba a 25-28 grad. C. con mezclado por 4 horas para remover los ácidos nucleicos residuales. Después de la incubación con estas enzimas, se agrega un volumen igual de solución de acetato de sodio-fenol a la mezcla de polisacárido enzima, y se coloca en una plataforma de agitación a 1-5 grad. C. por aproximadamente 30 minutos. La mezcla se somete a centrifugación a 10,000 x g por 15 a 20 minutos. Se recupera la capa acuosa superior y se conserva. Se agrega un volumen igual de solución de acetato de sodio-fenol a la capa acuosa, y se extrae como arriba. Se lleva a cabo un total de cuatro extracciones para remover la proteína y la endotoxina de la solución de polisacárido. Los extractos acuosos combinados se diluyen hasta diez veces con agua para inyección, y se diafiltra contra 10 volúmenes de agua de inyección. Se agrega cloruro de calcio al polisacárido diafiltrado. El polisacárido se precipita durante toda la noche a 1-5 grad. C. agregando etanol al 80%. El sobrenadante de alcohol se retira, y se recolecta el polisacárido por centrifugación a 10,000 x g por 15 minutos. El polisacárido purificado se extrae dos veces con etanol, y una vez con acetona. El polvo extraído se seca al vacío en un desecador. El polvo seco se almacena a -30 grad. C. o menos hasta ser procesado al conjugado. Ejemplo 2: Despolimerización del polvo de polisacárido capsular de Nisseria meningitidis serogrupos A y C Los materiales usados en la preparación incluyen los polvos de polisacáridos capsulares purificados de Neisseria meningi tidis serogrupos A y C preparados de acuerdo con el Ejemplo de arriba, amortiguador de acetato de sodio 50 mM estéril, pH 6.0, ácido clorhídrico 1N estéril, hidróxido de sodio 1N estéril, peróxido de hidrógeno al 30%, y solución salina fisiológica estéril - (cloruro de sodio al 85%) . Alternativamente, el amortiguador de citrato de sodio puede ser substituido por amortiguador de acetato de sodio. Cada polisacárido de serogrupo se despolimeriza en una reacción separada. Un tanque de acero inoxidable se carga hasta con 60 g de polvo de polisacárido capsular purificado. Amortiguador de acetato de sodio 50 mM estéril, pH 5 se agrega al polisacárido para dar una concentración de 2.5 g de polisacárido por litro. Se permite que la solución de polisacárido se mezcle a 1-5 grad. C. por 12 a 24 horas para efectuar la solución. El tanque de reacción se conecta a una unidad de intercambio de calor. Amortiguador de acetato de sodio 50 mM adicional, pH 6.0 se agrega para diluir el polisacárido a la concentración de reacción de 1.25 g por litro. La solución de polisacárido se calienta a 55 grad. C. ±0.1. Se agrega una alícuota de peróxido de hidrógeno a la mezcla de reacción para dar una concentración de reacción de 1% de peróxido de hidrógeno. El curso de la reacción se monitorea siguiendo el cambio en el tamaño molecular del polisacárido a través del tiempo. Cada 15 a 20 minutos, se retiran, alícuotas de la mezcla de reacción y se inyectan a una columna HPSEC para medir el tamaño molecular del polisacárido. Cuando el tamaño molecular del polisacárido alcanza el tamaño de molécula buscado como objetivo, se apaga la unidad de calentamiento y la solución de polisacárido se enfría rápidamente a 5 grad. C. por circulación a través de un baño de hielo. La solución de polisacárido despolimerizado se concentra a 15 g por litro, conectando el tanque de reacción a una unidad de ultrafiltración equipada con 3000 cartuchos de celulosa regenerada MWCO. La solución concentrada de polisacárido despolimerizado se diafiltra contra aproximadamente 5 a 15 volúmenes, preferiblemente, aproximadamente 6 a 10 volúmenes, o más preferiblemente, 10 volúmenes de solución salina fisiológica estéril (cloruro de sodio al 0.85%). EL polisacárido despolimerizado se almacena a 1-5 grad. C. hasta el siguiente paso del proceso. El polisacárido despolimerizado se puede preparar en lotes y se combina. El tamaño preferido buscado como objetivo para el polisacárido despolimerizado es entre aproximadamente 5 y 75 kDa, preferiblemente, entre 5 y 40 kDa, y más preferiblemente, entre aproximadamente 10 y 25 kDa. El tamaño molecular del polisacárido despolimerizado se determina por el paso a través de una columna de cromatografía de filtración de gel vendida bajo la marca comercial "Ultrahydrogel .TM.250" que se calibra usando estándares de tamaño molecular de dextrano y por dispersión de luz de láser a varios ángulos. La cantidad de polisacárido se determina por el contenido de fósforo para el serogrupo A usando el método de Bartlet, G. - R . J. (1959) Journal of Biological Chemistry, 234, pp-466-468, y por el contenido de ácido siálico para los serogrupos C, W135 e Y usando el método de Svennerholm, L. (1955) Biochimica Biophysica Acta 24, pp 604-611. El contenido de 0-acetilo se determina por el método de Hesterin, S. (1949) Journal of Biological Chemistry 180, p249. La actividad de reducción se determina por el método de Park, J. T. y Johnson, M. J. (1949) Journal of Biological Chemistry 181, pp 149-151. La integridad estructural del polisacárido despolimerizado se determina por RMN . sup .1H y .sup.l3C de proteína. La pureza del polisacárido despolimerizado se determina midiendo el contenido de LAL (endotoxina) y el contenido de peróxido de hidrógeno residual . Ejemplo 3: Derivación del polisacárido despolimerizado de Neisseria meningitidis serogrupos A, C, W-135 e Y Los materiales usados en esta preparación incluyen peróxido de hidrógeno, polisacáridos capsulares despolimerizados serogrupos A y C de Neisseria meningitidis, preparados de acuerdo con el Ejemplo 2 de arriba, dihidrazida de ácido adípico, l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDAC) para el serogrupo A solamente, cianoborohidruro de sodio, ácido clorhídrico 1N estéril, hidróxido de sodio 1N estéril, cloruro de sodio 1M estéril, y solución salina fisiológica estéril (0.85% cloruro de sodio). Cada polisacárido de serogrupo se deriva en una reacción separada. Un tanque de acero inoxidable se carga con el polisacárido despolimerizado, purificado, y . se diluye con solución salina fisiológica al 0.85% estéril para alcanzar una concentración de reacción final de 6 g de polisacárido por litro. A esta solución se agrega una alícuota concentrada de • dihidrazida de ácido adípico disuelta en solución salina fisiológica al 0.85% estéril, para alcanzar una concentración de reacción de 1 g por litro. Para el serogrupo A solamente, EDAC se agrega como una alícuota concentrada dísuelta en solución salina fisiológica al 0.85%, para alcanzar una concentración de reacción de 1 g por litro. El pH se ajusta a 5.0 ± 0.1, y este pH se mantiene por 2 horas usando ácido clorhídrico 1N estéril e hidróxido de sodio 1N estéril a la temperatura ambiente (15 a 30 grad. C.) después de dos horas, se disuelve una alícuota concentrada de cianoborohidruro de sodio en solución salina fisiológica al 0.85%, se agrega a la mezcla de reacción para alcanzar una concentración de reacción de 2 g por litro. La reacción se agita a la temperatura ambiente (15 a 30 grad. C.) por 44 horas ± 4 horas en tanto que se mantiene el pH a 5.5 ± 0.5. Enseguida de este periodo de reacción, el pH se ajusta a 6.0 ± 0.1 y el polisacárido derivado se concentra a 12 g de polisacárido por litro, conectando el tanque de reacción a una unidad de ultrafiltración equipada con 3000 cartuchos de celulosa regenerada MWCO. El polisacárido derivado se diafiltra contra 30 volúmenes de cloruro de sodio 1M, seguido por 10 volúmenes de cloruro de sodio 0.15 M. El tanque se desconecta de la unidad de ultrafiltración y se almacena a 1-5 grad. C. por 7 días. El tanque se reconecta a una unidad de ultrafiltración equipada con 3000 cartuchos de celulosa regenerada MWCO, y se diafiltra contra 30 volúmenes de cloruro de sodio 1M, seguido por 10 volúmenes de cloruro de sodio 0.15 M. Alternativamente, el polisacárido derivado se dializa contra aproximadamente 10 a aproximadamente 30 volúmenes de cloruro de sodio 1M y después contra 10 a aproximadamente 30 volúmenes de solución salina fisiológica. El tamaño molecular del polisacárido derivado, la cantidad de polisacárido, y el contenido de O-acetilo se miden mediante los mismos métodos usados en el polisacárido despolimerizado. El contenido de hidracida se mide por medio del método de ácido 2, , 6-trinitrobencenosulfónico de Snyder, S. L. y Sobocinski, P. Z. (1975) Analytical Biochemistry 64, pp 282-288. La integridad estructural del polisacárido derivatizado se determina por XH y 13C RMN de protones. La pureza del polisacárido derivatizado se determina midiendo el nivel de hidracina no enlazada, el contenido de LAL (endotoxina), y el contenido de cianoborohidruro residual. Ejemplo 4: Preparación de la proteína portadora Preparación de Proteína de Anatoxina de Difteria Cruda Cultivos semilla liofilizados se reconstituyen y se incuban por 16 a 18 horas. Una .alícuota del cultivo se transfiere a un matraz de 0.5 litros que contiene medio de cultivo, y el matraz de cultivo se incuba a 34.5-36.5 grad. C. sobre un agitador giratorio por 7 a 9 horas. Una alícuota del matraz de cultivo se transfiere a un matraz de 4 litros que contiene medio de cultivo, y el matraz de cultivo se incuba a 34.5-36.5 grad. C. en un agitador giratorio por 14 a 22 horas. Los cultivos del matraz de 4 litros se usan para inocular un fermentador que contiene medio de cultivo. El fermentador se incuba a 34.5-36.5 grad. C. por 70 a 144 horas. Los contenidos del fermentador se filtran a través de filtros de profundidad hacia un recipiente de recolección. Una alícuota de la solución de formaldehído, 37% se agrega a la cosecha para alcanzar una concentración de 0.2%. El pH se ajusta a 7.4-7.6. La recolección se filtra a través de un cartucho de filtrado de 0.2 micrones en botellas estériles de 20 litros. Las botellas se incuban a 34.5-36.5 grad. C. por 7 días. Una alícuota de solución de formaldehído, 37%, se agrega a cada botella de 20 litros para alcanzar una concentración de 0.4%. El pH de las mezclas se ajusta a 7.4-7.6. Las botellas se incuban a 34.5-36.5 grad. C. por 7 días en un agitador. Una alícuota de solución de formaldehído, 37%, se agrega a cada botella de 20 litros para alcanzar una concentración de 0.5%. El pH de las mezclas se ajusta a 7.4-7.6. Las. botellas se incuban a 34.5-36.5 grad. C. por 8 semanas. La anatoxina o toxoide crudo se evalúa en cuanto a la destoxificación. Las botellas se almacenan a 1-5 grad. C. durante el periodo de evaluación. Purificación de la Proteína de Anatoxina de Difteria Cruda Se permite que el toxoide o anatoxina cruda se caliente a la temperatura ambiente, y los contenidos de las botellas de 20 litros se combinan en un tanque de purificación. El pH de la anatoxina se ajusta a 7.2-7.4 y se agrega carbón vegetal a la anatoxina cruda y se mezcla por 2 minutos . Se permite que la mezcla de carbón vegetal y anatoxina repose por 1 hora, y después se filtra a través de un cartucho de filtrado profundo a un segundo tanque de purificación. Se agrega sulfato de amonio sólido al filtrado para alcanzar 70% de saturación. El pH se ajusta a 6.8-7.2 y se permite que la solución repose por 16 horas. Se recolecta la proteína precipitada por filtración y se lava con 70% de solución de sulfato de amonio de saturación, pH 7.0. El precipitado' se disuelve en agua destilada estéril, y la solución de proteína se filtra a un recipiente de recolección de acero inoxidable. El pH se ajusta a 6.8-7.2, y se agrega sulfato de amonio al 40% de saturación. El pH de la solución se ajusta a 7.0-7.2 y se permite que la solución repose por 16 horas. El precipitado se remueve por filtración y se desecha. Se agrega sulfato de amonio al filtrado a 60% de saturación, y se ajusta el pH a 7.0-7.2. Se permite que la mezcla repose por 16 horas, y se recolecta la proteína precipitada por filtración. El precipitado se disuelve en agua destilada estéril, se filtra para remover la proteína no disuelta, y se filtra contra solución salina fisiológica al 0.85%. Concentración y Filtración Estéril de la Proteína de Anatoxina de Difteria Purificada La solución de proteína se concentra a 15 g por litro y se diafiltra contra 10 volúmenes de solución salina fisiológica al 0.85% usando un cartucho de filtración de celulosa regenerada de 10,000 MWCO. La solución de proteína se esteriliza por filtración a una través de una membrana de 0.2 micrones. La solución de proteína se almacena a 1-5 grad. C. hasta ser procesada en el conjugado. La concentración de proteína se determina por el método de Lo ry, O. H. et al., (1951) Journal of Biological Chemistry 193, p265-275. La pureza de la proteína se mide por esterilidad, contenido de LAL (endotoxina) , y contenido residual de formaldehído. Ejemplo 5: Preparación de conjugados monovalentes de polisacáridos de Neisseria meningitidis serogrupos A y C con proteína de anatoxina de difteria Los materiales usados en esta preparación incluyen polisacárido derivado con ácido adípico de Neisseria meningitidis serogrupos A y C, preparada de acuerdo con el Ejemplo de arriba, proteína de anatoxina de difteria estéril, preparada de acuerdo con el Ejemplo de arriba, EDAC, sulfato de amonio, ácido clorhídrico 1N estéril, hidróxido de sodio 1N estéril, y solución salina fisiológica estéril (0.85%). Cada conjugado de polisacárido de serogrupo se prepara por medio de una reacción separada. Todos los cuatro conjugados se preparan siguiendo el mismo proceso. Un tanque de acero inoxidable se carga con el polisacárido derivatizado con ácido adípico purificado a una concentración de reacción de 700 a 1000 .mu.moles de hidracida reactiva por litro y proteína de anatoxina de difteria purificada a una concentración de reacción de 3.8 a 4.0 g de proteína por litro. Se usa la solución salina fisiológica al 0.85% para diluir los materiales iniciales a las concentraciones de reacción buscadas y el pH se ajusta a 5.0+0.1. Se agrega uña alícuota de EDAC a la mezcla de polisacárido-proteína para alcanzar una concentración de reacción de 2.28 a 2.4 g por litro. El pH de la reacción se mantiene a S.O±O.l por 2 horas a 15-30 grad. C. Después de dos horas, se ajusta el pH a 7.0±0.1 usando hidróxido de sodio 1N estéril, y la reacción se almacena a 1-5 grad. C. por 16 a 20 horas. Se permite que la mezcla de reacción se caliente a 15-30 grad. C. y se conecta el recipiente de reacción a una unidad de ultrafiltración equipada con un cartucho de celulosa regenerada de 30,000 MWCO. Para el serogrupo A, se agrega sulfato de amonio sólido a 60% de saturación, y para el serogrupo C, se agrega sulfato de amonio sólido a 50% de saturación. Para los serogrupos A, la mezcla de reacción de conjugado se diafiltra contra 20 volúmenes de 60% de solución de sulfato de amonio saturado, y para el serogrupo C, la mezcla de reacción de conjugado se diafiltra contra 20 volúmenes de 50% de solución de sulfato de amonio saturado, seguido por 20 volúmenes de solución salina fisiológica, 0.85%. El conjugado diafiltrado se filtra primero a través de una primera cápsula de filtrado que contiene un filtro de 1.2 micrones, y uno de 0.45 micrones, y después a través de una segunda cápsula de filtrado que contiene un filtro de 0.22 micrones. Alternativamente, la mezcla de reacción de conjugado se puede i purificar por medio de varias precipitaciones de sulfato de amonio, preferiblemente, aproximadamente tres. La cantidad de polisacárido y el contenido de O-acetilo se miden por los mismos métodos usados en el polisacárido despolimerizado y derivatizado. La cantidad de de proteína se determina por el método de Lowry. El tamaño molecular del conjugado se determina por el paso a través de una columna de cromatografía de filtración en gel vendida bajo la marca "TSK6000PW" que usa ADN como el marcador de volumen nulo, ATM como el marcador de volumen total, y tiroglobulina de bovino como un marcador de referencia. Además, el tamaño molecular del conjugado eluído desde la columna T S6000PW se mide por dispersión de luz de láser de ángulos múltiples. El carácter antigénico del conjugado se mide por enlazamiento a un anticuerpo específico del serogrupo anti-polisacárido usando un método ELISA doble sandwich. La pureza de los conjugados se determina midiendo la cantidad de polisacárido no enlazado (no conjugado) por elusión a través de una columna de cromatografía de interacción hidrofóbica, de la proteína no conjugada por electroforesis capilar, la esterilidad, contenido de LAL (endotoxina) , contenido residual de EDAC, y contenido residual de iones de amonio. Ejemplo 6: Formulación de una vacuna de conjugado de polisacárido-anatoxina de difteria de meningococos A y C, multivalente, libre de aluminio Los materiales usados al preparar los conjugados de A y C se pueden preparar de acuerdo con los métodos de arriba. Preferiblemente, la composición de vacuna se fórmula en solución salina fisiológica amortiguada con fosfato, libre de pirógenos. La concentración salina se puede lograr por 0.9% de cloruro de sodio 15 mM y fosfato de sodio 10 M. Preferiblemente, la composición de vacuna no contiene aluminio. Ejemplo 7: Inmunogenicidad en los pacientes humanos de una vacuna de conjugado de anatoxina de difteria de polisacáridos de meningococos A y C, multivalente, libre de aluminio Se lleva a cabo un estudio clínico con sujetos infantes el cual compara la respuesta inmune con la vacuna de polisacárido A/C bivalente versus la vacuna de conjugado A/C bivalente. En este estudio, se recluta un tercer grupo de infantes para servir como un grupo de control y estos reciben un conjugado de Haemophilus influenzae tipo b. Todos los tres grupos de vacunas reciben las mismas vacunas pediátricas. El grupo de conjugado A/C bivalente recibe tres dosis de vacuna de conjugado de difteria (4 µg de polisacárido por dosis) a las 6, 10 y 14 semanas de edad. El grupo de polisacárido A/C bivalente recibe dos dosis de una vacuna de polisacárido AC bivalente (50 µg de polisacárido por dosis) a las 10 y 14 semanas de edad. El grupo de conjugado de Haemophilus influenzae del tipo b recibió tres dosis de vacuna de conjugado a las 6, 10, y 14 semanas de edad. Se tomaron especímenes de sangre 6 semanas, antes de la vacunación, y 18 semanas, 4 semanas después de la vacunación. Cuando los niños tuvieron 11 y 12 meses de edad, se tomaron especímenes de sangre y los niños que recibieron la vacuna de conjugado AC bivalente o la vacuna de polisacárido AC bivalente recibieron una dosis de revacunación del polisacárido AC. La razón para la dosis de revacunación de polisacárido es evaluar si los sujetos producirán una respuesta aneméstica o no. Los resultados de este estudio, tanto las respuestas inmunes primaria y de la revacunación del polisacárido, se presentan en la Tabla 1 para la respuesta del anticuerpo y la Tabla 2 para la respuesta del anticuerpo SBA. La respuesta del anticuerpo IgG después de la serie primaria es aproximadamente la misma tanto para el polisacárido y la vacuna de conjugado. Sin embargo, la respuesta del anticuerpo bactericida en los sujetos vacunados con el conjugado es mucho mayor que la de los sujetos vacunados con el polisacárido. Como se observa con los sujetos de un año de edad, la vacunación de los infantes con el polisacárido provoca muy poco • anticuerpo bactericida funcional . El anticuerpo producido como respuesta por los infantes a la vacuna de polisacárido es presumiblemente el anticuerpo de baja avidez, en tanto que, la vacuna de conjugado parece producir como respuesta el anticuerpo de alta avidez, siendo responsable por el título mucho mayor de anticuerpo bactericida. El alto nivel de anticuerpo funcional producido por la dosis de revacunación de la vacuna de polisacárido en los sujetos que recibieron la vacuna de conjugado en la serie de vacunación primaria, indica que estos sujetos han sido cebados por una memoria de respuesta de anticuerpo dependiente de células T. Los sujetos que recibieron la vacuna de polisacárido en la serie de vacunación primaria producen una respuesta modesta a la dosis de revacunación, que es indicativa de una respuesta dependiente de células T. La Tabla 1 muestra IgG GMC anti-polisacárido (concentración promedio del grupo) en los infantes contra los serogrupos A y C antes y después tanto después de la primera serie de inmunización primaria (6, 10 y 14 semanas de edad) y la vacunación de revacunación con el polisacárido AC bivalente administrada a los 11-12 meses de edad.

Tabla 1 La Tabla 2 muestra el GMT (título promedio del grupo) del anticuerpo SBA en los infantes, contra los serogrupos A y C antes y después tanto de la serie de inmunización primaria (6, 10 y 14 semanas de edad) y la revacunación con el polisacárido AC bivalente administrado a las 11 a 12 semanas de edad.

Tabla 2 Además de los beneficios que ofrece esta invención para la protección mejorada contra la enfermedad meningocócica en las poblaciones jóvenes y la protección mas amplía contra los serogrupos A, C, W-135 e Y, el conjugado tetravalente puede proporcionar protección para otros patógenos induciendo una respuesta de anticuerpo para la proteína portadora. Cuando se administra a los infantes la vacuna de conjugado tetravalente, usando conjugado de anatoxina de difteria, estos sujetos también reciben inmunizaciones pediátricas de rutina, las cuales incluyen la anatoxina de difteria. Por lo tanto, en estos sujetos no hay mejoría aparente en la respuesta de anticuerpos para la anatoxina de la difteria. Sin embargo, cuando se administra el conjugado de anatoxina de difteria a los sujetos que no recibieron vacunas que contienen la anatoxina de difteria concomitante, se observa una fuerte respuesta de revacunación para la anatoxina de difteria. Estos sujetos habían recibido un régimen de tres dosis de DTP a las 2, 3, y 4 meses de edad. En este estudio, los sujetos recibieron ya sea la dosis individual de conjugado AC bivalente o una dosis individual de vacuna de polisacárido AC bivalente entre los 2 y 3 años de edad. Se tomaron especímenes de sangre en el momento de la vacunación y 30 días después de la vacunación. El conjugado de AC bivalente usa la anatoxina de difteria como la proteína portadora. La respuesta inmune de la anatoxina de difteria en los dos grupos de vacunas se presenta en la Tabla 3. El polisacárido no sirve para estimular una respuesta inmune anti-difteria en estos sujetos, como se esperaba, sin embargo se observa una fuerte respuesta anti-difteria para los sujetos que recibieron el conjugado de AC. Por lo tanto, la vacuna de conjugado meningocócico puede proporcionar un beneficio añadido de estimular una respuesta inmune a la proteína portadora, proporcionando por ello la protección contra enfermedades provocadas por Corynebacteria díphtheriae cuando se usa la anatoxina de difteria como una proteína portadora. La Tabla 3 muestra GMT (título promedio de grupo) del anticuerpo anti-difteria en ül/ml por ELISA en niños pequeños saludables vacunados ya sea con la vacuna de conjugado de anatoxina de difteria AC bivalente formulada a 4 µg como el polisacárido por dosis, o una vacuna de polisacárido AC bivalente formulada a 50 µg como el polisacárido por dosis.

Tabla 3 Ejemplo 8: Inmunogenicidad, seguridad, y memoria de diferentes itinerarios de una vacuna conjugada de Neisseria meningitldis A/C-anatoxina de difteria, sin adyuvante en infantes Se presenta un estudio clínico en una prueba controlada al azar, de etiqueta abierta de 618 infantes en Níger que recibieron una a cuatro disks de una vacuna de polisacáridos A y C conjugados con la anatoxina de difteria (conjugado A/C) o una vacuna de polisacárido A/C estándar (A/C PS) junto con las inmunizaciones infantiles de rutina. A los 24 meses, se administra la A/C PS y se mide la respuesta de memoria una semana después. Se miden la actividad bactericida del suero (SBA) y el anticuerpo IgG por ELISA. La vacuna consta de polisacáridos capsulares de N. meningi tidis serogrupos A y C conjugados con anatoxina de difteria. La vacuna se encuentra en jeringas de 0.5 mi desechables que contienen 4 µg de cada uno de los dos polisacáridos conjugados a 48 µg de anatoxina o toxoide de difteria. La vacuna de conjugado A/C se formula en una dosis de 0.5 mi de solución salina fisiológica amortiguada con fosfato, libre de pirógenos, sin conservadores, específicamente, 0.9% de cloruro de sodio 15 mM y fosfato de sodio 10 mM. Los 618 infantes enlistados - en el estudio se aleatorizaron en 6 grupos de igual tamaño. Los criterios de inclusión son: 1) infantes con buena salud con temperatura rectal <38°C; 2) entre 5 y 11 semanas de edad; 3) dados a luz a >36 semanas de gestación; 4) familia residida permanentemente en Niamey y 5) los padres proporcionan el consentimiento escrito. Los criterios de exclusión son: enfermedades crónicas severas; enlistados en otras pruebas clínicas; vacunados previamente con la vacuna DTP, PS meningocócica, o vacuna conjugada de Haemophilus influenzae b (Hib) ; meningitis precedente; administración de BCG o terapia de corticosteroides en las tres semanas pasadas; o una contraindicación a la vacunación. Los niños aleatorizados a los grupos de control recibieron ya sea polisacáridos A/C de meningococos (MenPS, Aventis Pasteur) que contenía 50 µg de cada polisacárido, o vacuna conjugada de Hib (Act-Hib, Aventis Pasteur) . Se Administraron inyecciones intramusculares de MenD, MenPS y Act-Hib en el muslo anterolateral derecho. Los niños habían recibido BCG y vacuna de polio oral (OPV) al nacer. De acuerdo con el itinerario del Programa Expandido sobre Inmunización (EPI) , ellos recibieron DTP y OPV a las 6, 10 y 14 semanas, con revacunaciones a los 15 meses. Las vacunas de sarampión y fiebre amarilla se administraron a la edad de 9 meses. Las inyecciones de EPI se administraron intramuscularmente en el músculo deltoides izquierdo. Hay 6 grupos de 103 infantes quienes recibieron cuatro, (grupo 1) , tres (grupo 2) , o una dosis (grupos 4 y 5) de conjugado de A/C o una dosis de A/C PS (grupo 6) durante los primeros 9 meses de vida, junto con las vacunas EPI de rutina, véase la Tabla 4 de abajo: Tabla 4 Asignaciones de grupos, itinerario de prueba, y numero de sujetos con especímenes de san re evaluables A los 24 meses de edad, los sujetos- recibieron una dosis de A/C PS, para evaluar la respuesta anamnésica y estimular la respuesta inmune al encontrar la bacteria N. meningitidis . Se recolectaron 4 especímenes de sangre de 3 mL, a las 18 semanas, 10 meses, 24 meses y de edad una semana después. Los niños se monitorean por 30 minutos después de cada inyección en cuanto a las reacciones inmediatas que podrían representar reacciones de hipersensibilidad. Se hacen evaluaciones repetidas durante las visitas domesticas 24 y 27 horas después de las inyecciones del estudio.

Se mide la actividad bactericida del suero tanto para el serogrupo A y C por medio de los métodos estándar usando complemento de conejo recién nacido, Maslanka SE, et al., Clin. Diagn Lab Immunol 1997; 4:155-67. La actividad bactericida se define como la dilución reciproca de suero que da 50% de crecimiento bacteriano en comparación con un cultivo de control . Se mide la concentración de IgG por medio de ELISA estandarizado y se expresa en µg/ l, Carlone GM, et al., J Clin Microbiol 1992; 30:154-9 y Gheesling LL, et al., 'J Clin Microbiol, 1994; 32: 1475-82. Se midieron los Anticuerpos contra la difteria, tétanos, tos ferina, y virus de polio tipos 1, 2 y 3, en el suero a las 18 semanas de edad usando los métodos estándar. Se evalúa la reactogenicidad para cada grupo de estudio enseguida de cada dosis administrada, con base en la proporción de infantes que tuvieron al menos una reacción local en un plazo de 30 minutos de la administración, o una reacción local o sistémica en un plazo de 24 a 27 horas enseguida de la administración. La respuesta inmune se expresa como la concentración de anticuerpo para ELISA y los títulos medios geométricos (GMT) de la dilución inhibitoria para SBA. Los niveles del anticuerpo se han considerado protectores con base en > 2 µg/mL de acuerdo a ELISA y > 1:4 para SBA usando complemento humano, Goldshneider I. et al., J. Exp. Med., 1969, 129; 1327-48 y Lepow ML, et al., Pediatrics 1977; 60: 673-680. Además, los resultados presentan el porcentaje de infantes con concentración de anticuerpo por ELISA > 2 µg/mL y un título de SBA > 1:128, Jodar L, et al., Biologicals 2002, 30:323-9. Los intervalos de confianza se calculan para GMT y las concentraciones del anticuerpo. Los grupos se comparan por análisis de ANOVA de varianza, de acuerdo a la distribución de logaritmo de los títulos para SBA contra los serogrupos A y C en la visita 6. Se usa la prueba de Student-Newman-Keuls para las comparaciones múltiples. Se evalúa la respuesta anamnéstica por la comparación de los porcentajes e intervalos de confianza del 95% y la relación de GMTs de los infantes con protección serológica en comparación con la línea base de SBA y ELISA para el grupo 6. No se atribuyen casos adversos severos para la vacuna administrada por el estudio. La Tabla 5 muestra los títulos de SBA para los serogrupos A y C a las 18 semanas, 10 meses, y 24 meses y una semana después del periodo de tiempo de 24 meses proporcionado en la Tabla 8, para los seis grupos. Se da la proporción de sujetos que tienen títulos de SBA > 1:128 para cada uno de los Grupos .

Tabla 5 Actividad bactericida del suero, polisacáridos de serogrupos A y C GMT: título medio geométrico, [intervalo de confianza del 95%]

Claims (17)

1. REIVINIDCACIONES 1. Un método para inducir una respuesta inmunológica en un paciente para los polisacáridos capsulares A y C de Neisseria meningi tidis, caracterizado porque comprende administrar al paciente una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición inmunológica libre de aluminio, en donde la composición comprende dos conjugados de proteína-polisacárido, el primer conjugado que comprende un polisacárido capsular del serogrupo A de N. meningi tidis conjugado con una o mas proteína (s) portadora (s) y un segundo conjugado que comprende un polisacárido capsular del serogrupo C de N. meningi tidis conjugado a una o mas proteína (s) capsulare (s) .
2. 2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína portadora es una anatoxina de difteria.
3. 3. El método de la reivindicación 2, caracterizado porque la proteína portadora y el polisacárido se unen covalentemente con un enlazador.
4. 4. El método de la reivindicación 3, caracterizado porque el enlazador es dihidrazida adipica.
5. 5. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque los polisacáridos capsulares A y C tienen un tamaño promedio de entre 5 y 100 kDa.
6. 6. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque los polisacáridos capsulares A y C tienen un tamaño promedio de entre 10 y 75 kDa.
7. 7. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque los pslisacáridos capsulares A y C tienen un tamaño promedio de entre 10 y 50 kDa.
8. 8. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque los pslisacáridos capsulares A y C tienen un tamaño promedio de entre 10 y 30 kDa.
9. 9. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque los pslisacáridos capsulares A y C tienen un tamaño promedio de entre 10 y 25 kDa.
10. 10. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la composición comprende un adyuvante.
11. 11. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la composición inmunológica se administra al paciente en una dosis individual .
12. 12. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque el paciente tiene menos de 12 meses de edad en el momento en que se administra la composición inmunológica.
13. 13. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la composición inmunológica se administra el mismo día o dentro de los seis meses siguientes de la administración de una vacuna para la difteria, tétanos, virus de polio, o tos ferina.
14. 14. El método de la reivindicación 13, caracterizado porque la composición inmunológica se administra en el mismo día o dentro de los tres meses siguientes de la administración de una vacuna para la difteria, tétanos, virus de polio, o tos ferina .
15. 15. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque la composición inmunológica se administra en el mismo día o dentro un mes siguiente de la administración de una vacuna para la difteria, tétanos, virus de polio, o tos ferina.
16. 16. El método de la reivindicación 15, caracterizado porque, la composición inmunológica se administra en el mismo día de la administración de una vacuna para la difteria, tétanos, virus de polio, o tos ferina.
17. 17. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque la vacuna es un poliovirus del tipo 1, 2, o 3.