TW200829600A - Protease resistant insulin analogues - Google Patents

Description

200829600 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 ,:明係關於對蛋白酶顯示抗性之新穎胰島素類似 勿’。亥寺胰島素類似物之製備方法、含有本發明之胰島素 類=之胰島素製劑及使用該等胰島素類似物治療糖尿病 之方法。 【先前技術】 、對於投予藥物而言’目前為止經π途徑為最廣泛使用 ，途徑且其尤其對於慢性治療一般而言極易為患者所接 =。然而，歸因於諸如胃腸（GI)道中之酶促降解、藥物 流出栗、腸黏膜之不充分及可變之吸收以及肝臟中之首次 =謝之若干障礙，投予治療性肽或蛋白質通常限於非經腸 途徑而非較佳經口投藥。人類胰島素會由胃部（胃蛋白 酶）腸月空（胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶、羧 -每等）及月腸迢之黏膜表面（胺肽酶、羧肽酶、腸肽酶、 二肽基肽酶、肽鏈内切酶等）中存在之各種消化酶降解。 此令人遺憾，因為許多肽及許多蛋白質已證實在臨床 上有效，且若易於投藥且受者可接受則可具有更廣泛用 途。 糖尿病為使用葡萄糖之能力部分或完全喪失之代謝病 症所有人中約5%患有糖尿病且該病症接近流行病比例。 仗在20世紀20年代引入胰島素，因此已進行不懈努力 以改良糖尿病之治療。由於患有糖尿病之個體經受數十年 6 200829600 之慢性治療，因此存 島素調配物之急切需要。’女全、便利及提高生活品質之胰 在糖尿病之治療中， 之變化形式，諸如普通騰島二::島用:種入騰島素調配物 m良妄拉辟-★ / ^ I 4項騰島素（命名為NPH)、 胰島素辞懸洋液（諸如Semi 及雙相等項胰島素。—此市…ente及Ultralente) 速起始作用，且其島素調配物之特徵在於快 ^,, 凋配物具有相對緩慢之起始但展示或

夕〜十 、速作用胰島素調配物通常為胰島素 _ + —丄 灵馬素凋配物可為含有藉由僅添加辞 鹽或猎由添加魚精蛋白戋蕻ώ + μ 次精由兩者之組合而沈澱的晶體及/ 或非晶型形式之胰島素的懸浮液。 人類胰島素由兩條多月太絲έΒ ★ 夕狀鏈組成，亦即分別含有21及30 個胺基酸殘基之Α及Β鏈。a及R細山工化 及B鏈由兩個二硫橋相互連 接。大多數其他物種之胰島辛_也 π旬U貝似，但在一些位置上可含 有胺基酸取代。在最近1 〇年内， 卞門已開發出許多人類胰島 素類似物。其經設計具有特定作用特性，亦即快速作用或 延長作用。包含該等胰島素類似物之市售產品包括

Levemir®、No-voRapid®、Humal〇g⑧、Apidra⑧及匕咖s⑧。 通常，藉由皮下注射投予胰島素調配物。 然而，歸因於患者順應性、安全性及方便性之原因， 藉由經口途徑投藥為有利的。由於酶及吸收障礙，經口投 予諸如胰島素之蛋白質藥物通常得到極低生物可用性。肽 及蛋白質傳遞之通用方法為具有侵襲性且不方便之非經腸 投藥。因此，愈發研究如經口傳遞蛋白質基藥物之非侵襲 7 200829600 ' 性途徑。用於經口蛋白質/肽傳遞之近期調配物設計包括與 蛋白酶抑制劑、滲透增強劑、基於聚合物的傳遞系統及胰 島素接合物之共調配物。胰島素接合物包括己基-胰島素_ 單接合物-2 (HIM2) ( No-bex Co〇perati〇n 與 GSK)、具有 與B29連接之PEG 7-己基的人類胰島素類似物。在例如us 7,〇30,082、US 6,867，183 及 US 6,77M25 中，已報導與胰 島素相比經口 HIM2具有增加之蛋白質水解穩定性及生物 可用性。 【發明内容】 在本發明之一具體實例中，提供具有增強之蛋白質水 解％定性及保留之生物胰島素活性的胰島素類似物。 在本發明之另一具體實例中，提供相對於親本胰島素 为子至少兩個胺基酸經取代及/或缺失的胰島素類似物。 在本發明之另一具體實例中，提供相對於親本胰島素 至少兩個疏水性胺基酸已經親水性胺基酸取代的胰島素類 似物，其中該取代位於親本胰島素之兩個或兩個以上蛋白 酉母裂解位點中或與其緊鄰且其中該胰島素類似物視情況進 一步包含一或多種其他突變。 本發明之目標亦為提供本發明之胰島素類似物，其中 $對於親本胰島素，該胰島素類似物之A鏈包含至少一個 大、交且該胰島素類似物之B鏈包含至少一個突變。 本^月亦係關於編碼所主張胰島素類似物之前原肽 核酉参床石1 口 ,。在另一具體實例中，本發明係關於含有該等核 8 200829600 酸序列之載體及含有該等核酸序列或載體之宿主細胞。 亦^供一種獲得本發明之胰島素類似物之方法及其作 為藥物之用途。 【實施方式】 本發明之胰島素類似物為相對於親本胰島素分子A及/ 或B胺基酸鏈具有兩個或兩個以上突變之胰島素分子。 已發現藉由以親水性胺基酸取代胰島素上兩個或兩個 以上蛋白酶位點内或與其緊鄰之兩個或兩個以上疏水性胺 基酸，獲得與親本胰島素相比具有蛋白質水解穩定性之胰 島素類似物。 以下為在本文中其他處進一步描述之具體實例之非限 制性清單： 具體實例-種胰島素類似物，其中相對於親本騰 島素至少兩個疏水性胺基酸已經親水性胺基酸取代，其中 。亥等取代位於親本胰島素之兩個或兩個以上蛋白 點中或與其緊_，且其中該胰島素類似物視情況進一步包 含一或多個其他突變。 種根據具體μ 1之胰島素類似物 具體實例2 : — 其中相對於親本胰島素獲得增加之溶解性 具體實例3 : 一種根據具體實例κ"任—且體實例 之胰島素類似物，纟中相對於親本胰島素，該胰島‘類似 物之A鏈包含至少-個突變且該胰島素類似物之b鍵包含 至少-個突變。具體㈣4:—種根據具體㈣丨 200829600 一具體實例之胰島素類似物，其中該胰島素類似物在第一 修飾胰島素類似物之蛋白酶位點中進一步包含至少一個胺 基酸取代’其中該至少一個胺基酸取代為使得至少一個疏 水性胺基酸已經至少一個親水性胺基酸取代之取代。 具體貫例5 : —種根據具體實例1 _4中任一具體實例 之胰島素類似物，其中： •位置A12之胺基酸為Glu或Asp，及/或位置A13 之胺基酸為His、Asn、Glii或Asp，及/或位置A14之胺基 酸為 Asn、Gin、Glu、Arg、Asp、Gly 或 His，及 /或位置 A 1 5之胺基酸為Glu或Asp ;且 •位置B24之胺基酸為His，及/或位置B25之胺基酸 為His，及/或位置B26之胺基酸為His、Gly、Asp或Thr， 及/或位置B27之胺基酸為His、Glu、Lys、Gly或Arg， 及/或位置B28之胺基酸為His、Gly或Asp ;且 其視情況進一步包含一或多個其他突變。 具體貫例6 : —種根據具體實例1- 5中任一具體實例 之胰島素類似物，其中位置A14之胺基酸為Glu、Asp或 His，位置B25之胺基酸為His，且其視情況進一步包含一 或多個其他突變。 具體實例7 : —種根據具體實例1 _6中任一具體實例 之胰島素類似物，其中位置A14之胺基酸為Giu、Asp或 His，位置B25之胺基酸為His且位置B30之胺基酸經缺 失。 具體實例8 : —種根據具體實例1 _ 6中任一具體實例 10 200829600 之胰島素類似物，其中位置Α14之胺基酸為Glu、Asp或 His且位置B25之胺基酸為His °

具體實例9 ·· 一種根據具體實例1 _6中任一具體實例 之胰島素類似物，其中該或該等其他突變係選自由以下突 變組成之群：A(-3)Gly、A(-2)GIy、A(-l)Pro、A(0)Pro、 A8His、A18Gln、A18Gln、A21Gln、A21Gly、B(-3)Gly、 B(-2)Gly、B(-l)Pro、B(0)Pro、BIGlu、BlGln、r〇、BIGlu、 BlGln、B3Gln、BlOPro、B14Thr、B16Glu、B17Ser、B26Asp、 DesB26、DesB27、B27Glu、B27Glu、B28Asp、desB28、 desB29、desB30、B31Leu、B32Glu。 具體實例1 0 : —種根據具體實例1 _ 6或9中任一具體 實例之胰島素類似物，其中該其他突變為desB3〇。 具體實例1 1 : 一種根據具體實例丨_丨〇中任一具體實 例之胰島素類似物，其中A14為Glu。 ί 具體實例I2·•—種根據具體實例丨—H中任一具體實 例之胰島素類似物， 酶展示增加之穩定性 其相對於親本蛋白質對一或多種蛋白 中任一具體實 兩種或兩種以 具體實例13 :一種根據具體實例 例之胰島素類似物，其相對於親本蛋白質對 上蛋白酶展示增加之穩定性。 具體實例1 4 : 例之胰島素類似物 組成之群·· —種根據具體實合"-13中任一具體實 '其中該親本胰島素係選自由以下各物 •人類胰島素； 200829600 ’ •人類胰島素之胰島素類似物，其中位置B28之胺基 酸殘基為 Pro、Asp、Lys、Leu、Val 或 Ala，且位置 B29 之胺基酸殘基為Lys或pro，且視情況位置B30之胺基酸 殘基經缺失； • des(B26-B30)人類胰島素、des(B27-B30)人類胰島 素、des(B28-B30)人類胰島素、des(B29-B30)人類胰島素、 des(B27)人類胰島素或des(B28_B3〇)人類胰島素； •人類胰島素之胰島素類似物，其中位置B3之胺基 s 酸殘基為Lys且位置B29之胺基酸殘基為Glu或Asp ; •人類胰島素之胰島素類似物，其中位置A21之胺基 酸殘基為Gly且其中該胰島素類似物之c末端以兩個Arg 殘基進一步延伸； •一種胰島素衍生物，其中位置B30之胺基酸殘基經 蘇胺酸甲g旨取代；及 種胰島素衍生物，其中十四醯基鏈與des(B30)人 類膜島素之位置B29之離胺酸之Νε位置連接。 ^ 具體實例15: 一種根據具體實例1_6、9或11-14中任 一具體貫例之胰島素類似物，其中選擇該或該等其他突變 以增強胰島素之化學穩定性。 具體貫例1 6 : —種根據具體實例丨5之胰島素類似物， 其中°亥或该等其他突變係選自由A18Gln、A21Gln、A21GLy 及B3Gln組成之群。 具體實例17 : —種根據具體實例ι-4或12_14中任一 八體貝例之騰島素類似物，其包含式1之A鏈胺基酸序列·· 12 200829600 " XaaA(.2)-XaaA(.1)XaaA〇-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys- ]XaaA8_Ser-Ile-CIys-!X 汪

XaaA18-Tyr-Cys-XaaA21XaaA22 式（1 ) ( SEQ ID No:l ) 及式2之B鏈胺基酸序列：

XaaB(_2)-XaaB(_i)-Xa^B〇_X^aBi_XaaB2_XaaB3_XaaB4.His-

Leu-Cys-Gly-Ser-XaaB10-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaB16-Leu-V al-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-XaaB24-XaaB25-XaaB26-XaaB27-、 X a a b 2 8- X a a b 2 9- X a a b 3 〇 - X a a b 31 - X a a b 3 2 式（2) ( SEQ ID No:2)， 其中：

XaaA(_2)不存在或為Gly ;

XaaA(-i)不存在或為Pro ;

XaaAG不存在或為pr〇 ;

XaaA8係獨立地選自Thr及His ;

XaaA12係獨立地選自ser、Asp及Glu ; k XaaA13 係獨立地選自 Leu、Thr、Asn、Asp、Gin、His、

Lys、Gly、Arg、pro、Ser 及 Glu ;

XaaA14 係獨立地選自 Tyr、Thr、Asn、Asp、Gin、His、 Lys、Gly、Arg、pro、Ser 及 Glu ;

XaaA15係獨立地選自Gin、Asp及Glu ;

XaaA18係獨立地選自Asn、Lys及Gin ;

XaaA21係獨立地選自Asn及Gin ;

XaaA22不存在或為LyS ; 13 200829600 % XaaB(-2)不存在或為Giy ;

XaaB(-U不存在或為Pr〇 ;

XaaBG不存在或為pr〇 ;

XaaB1不存在或獨立地選自phe及Giu ;

XaaB1不存在或為vai ;

XaaB3不存在或獨立地選自Asn及Gin ;

XaaB4係獨立地選自Asn及Glu ;

XaaB1G係獨立地選自ms、Asp、Pro及Glu ; ‘ XaaB16 係獨立地選自 Tyr、Asp、Gin、His、Arg 及 Glu ;

XaaB24係獨立地選自phe及His ;

XaaB25係獨立地選自phe及His ;

XaaB26不存在或獨立地選自Tyr、His、Thr、Gly及Asp; XaaB27不存在或獨立地選自Thr、Asn、Asp、Gin、His、 Lys、Gly、Arg、pro、Ser 及 Glu ;

XaaB28不存在或獨立地選自pr〇、His、Giy及Asp ; XaaB29不存在或獨立地選自Lys及Gln ; 、 XaaB3G不存在或為Thr ;

XaaB3i不存在或為Leu ;

XaaB32不存在或為Giu ; C末端可視情況衍生為醯胺； 其中A鏈胺基酸序列與B鏈胺基酸序列係由a鏈之位 置7上的半胱胺酸與B鏈之位置7上的半胱胺酸之間，及 A鏈之位置2G上的半胱胺酸與B鏈之位置19上的半脱胺 酸之間的二硫橋連接，且其中A鏈之位置6及u中的半 14 200829600 * 胱胺酸經二硫橋連接； 其中視情況N末端A鍵胺基酸序列由包含3 _ 7個胺基 酸之胺基酸序列與C末端B鍵胺基酸序列連接以形成單鏈 胰島素分子’其中視情況B鏈之N末端經1 _ 1 〇個胺基酸 延伸； 其中若 XaaA8 為 Thr，且 XaaA12 為 Ser，且 XaaA13 為 Leu， 且 XaaA14 為 Tyr ’ 則 XaaA15 為 Glu 或 Asp ;且 其中若 XaaB24 為 Phe，且 XaaB25 為 Phe，且 XaaB26 為 ( Tyr，且 XaaB27 為 Thr，且 XaaB28 為 Pro，則 XaaB29 為 Gin。 具體實例18 : —種根據具體實例1-4或12-14中任一 具體實例之胰島素類似物，其包含式3之A鏈胺基酸序列：

Gly_Ile_Val_Glu_Gln_Cys-Cys-XaaA8-Ser_Ile-Cys-

XaaA12-XaaA13-XaaA14-XaaA15-Leu-Glu -XaaA18-Tyr-Cys-

XaaA2i 式（3 ) ( SEQ ID No:3 ) 及式4之B鏈胺基酸序列： L XaaB1-V al-XaaB3-XaaB4-His-Leu-Cys-Gly-Ser-XaaB10-

Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaB16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly XaaB24-His_XaaB26XaaB27_XaaB28-XaaB29-XaaB30 式（4) ( SEQ ID No: 4)， 其中：

XaaA8係獨立地選自Thr及His ;

XaaA12係獨立地選自Ser、Asp及Glu ;

XaaA13 係獨立地選自 Leu、Thr、Asn、Asp、Gin、His、 15 200829600

Lys、Gly、Arg、Pr〇、Ser 及 Glu ;

XaaAi4 係獨立地選自 Thr、Asn、Asp、Gin、His、Lys、 Gly、Arg、Pr〇、Ser 及 Glu ;

XaaA15係獨立地選自Gln、Asp及Glu ;

XaaA18係獨立地選自Asn、LyS及Gin ;

XaaA21係獨立地選自Asti及Gin ;

XaaB1係獨立地選自Phe及Glu ;

XaaB3係獨立地選自Asn及Gin ; f

XaaB4係獨立地選自Gin及Glu ;

XaaB1G係獨立地選自His、Asp、Pro及Glu ;

XaaB16 係獨立地選自 Tyr、Asp、Gin、His、Arg 及 Glu ; XaaB24係獨立地選自phe及ms ;

XaaB26不存在或獨立地選自τ^、Η^、Thr、Gly及Asp ;

XaaB24不存在或獨立地選自Thr、Asn、Asp、Gin、His、 Lys、Gly、Arg、Pro、Ser 及 Glu ;

XaaB28不存在或獨立地選自Pro、His、Gly及Asp ;

XaaB29不存在或獨立地選自Lys及Gin ;

XaaB3G不存在或為; 一个，，丨月况衍生為醯胺； 其中Α鍵胺基酸序列與Β鍵胺基酸序列係由a鍵之位 置7上的半胱胺酸與5鏈之位置7上的半胱胺酸之間，及 A鏈之位置20上的丰胁跄缺你〇 μ 扪牛胱胺酸與Β鏈之位置19上的半胱胺 酸之間的二硫橋連接，且1中 八Υ Α鍵之位置6及η中的半 胱胺酸經二硫橋連接。 16 200829600 目；2 » /、 @ 9 19 : 一種根據具體實例1 8之胰島素類似物， 其中：

XaaA8係獨立地選自Thr及His ;

XaaA12係獨立地選自Ser及Glu;

Ai3 係獨立地選自 Leu、Thr、Asn、Asp、Gin、His、 Lys、Giy、Arg、Pr〇、^ 及 Giu ;

XaaA14係獨立地選自Asp、His及Gin ;

XaaA15係獨立地選自Gin及Glu ;

XaaA18係獨立地選自Asn、Lys及Gin ;

XaaA21係獨立地選自Asn及Gin ;

XaaB1係獨立地選自phe及Glu ;

XaaB3係獨立地選自Asn及Gln;

XaaB4係獨立地選自Gin及Glu ;

XaaB1G係獨立地選自His、Asp、Pr〇及Giu ;

XaaB16 係獨立地選自 Tyr、Asp、Gin、His、Arg 及 Glu ; XaaB24係獨立地選自phe及ms ;

XaaB26係獨立地選自Tyr、Thr、Gly及Asp ;

XaaB27 係獨立地選自 Thr、Asn、ASp、Gin、His、Lys、 Gly、Ar 及 Glu ;

XaaB28係獨立地選自pro、Gly及Asp ;

XaaB29係獨立地選自LyS及Gin ;

XaaB3G不存在或為Thr ; C末端可視情況衍生為驢胺； 其中A鏈胺基酸序列與b鏈胺基酸序列係由a鏈之位 17 200829600 A鏈之位^胱^與8鏈之位置7上的半胱胺酸之間，及 =置20上的半胱胺酸與B鏈之位… =:二硫橋連接，且其中A鍵之位置…i中的半 胱胺I經二硫橋連接。 /、焉例20 · 一種根據具體實例卜16中任一具體實 例之胰島素類似物，其中 末螭B鏈經3-15個胺基酸或3-7 個胺基酸與N末端A鏈連接， 项逆稷，以形成早鏈胰島素分子，其 不月况B鏈之N末端經1-10個胺基酸延伸。 曰八豆貝例21 · —種醫藥組合物，其包含生物學上有效 量之根據具體實例1-20中任一且俨每々丨+站*主丄L , T 1士 具體貝例之胰島素類似物及 醫藥學上可接受之載劑。 具體實例22: 一種醫藥組合物，其包含兩種或兩種以 上根據具體實例丨，中任—具體實例之胰島素類似物，其 中各類似物經定羞、且古$卜 ^ 二疋我具有至少一個在其他變異體之至少一者 中不存在之突變。 J體實例23 : 一種如具體實例"，中任一具體實例 之醫藥組合物’其進—步包含醫藥學上可接受之載劑及/或 賦形劑及視情況之佐劑。 具體實例24 : —種治療個體中糖尿病之方法，其包含 向個體投^根據具體實例㈣中任—具體實例之胰島素類 似物或根據具體實例21_23中任一具體實例之醫藥組合 物。 具體貫例2 5 : —種降低哺乳動物中血糖含量之方法， 該方法藉由向需要該治療之患者投予治療活性劑量之根據 18 200829600 ’ 具體實例1-20中任一具體實例之胰島素類似物或根據具體 實例2 1 -23中任一具體實例之醫藥組合物來實現。 具體實例26 :根據具體實例24或25之方法，其為經 口投藥。 具體實例27 :根據具體實例24或25之方法，其為非 經腸投藥。 % 具體實例28 :根據具體實例24或25之方法，其為氣 管内投藥。 具體實例29 : —種根據具體實例1 -20中任一具體實 例之騰島素類似物，其在治療或預防高血糖症、第二型糖 尿病、葡萄糖耐受不良、第一型糖尿病、肥胖症、X症候 群及異常血脂症中用作藥物。 具體實例30: —種根據具體實例i_2〇中任一具體實 例之胰島素類似物，其在延遲或防止第二型糖尿病疾病進 展中用作藥物。 具體貫例3 1 : —種根據具體實例1 _2〇中任一具體實 、例之胰島素類似物，其在降低食物攝入、降低卜細胞細胞 =亡、增加β-細胞功能及卜細胞質量及/或恢復β_細胞之 葡萄糖敏感性中用作藥物。 具體實例32 : —種核酸序列，其編碼根據具體實例卜 〇中任一具體貫例之胰島素類似物，其衍生物、其部分序 列、其簡并序列或在嚴格條件下與其雜交之序列。 具體實例33 : —種核酸序列，其編碼根據具體實例卜 中任具體貫例之胰島素類似物的前驅體，其衍生物、 19 200829600 其部分序列、其簡并序列或在 列。 厭&條件下與其雜交之序 ，、體貝例3 4 : —種表現載體， 或33之核酸序列。 、包含根據具體實例32 具體實例35 : 一種宿主 之表現載體。 其包含根據具體實例34 /、體錢例3 6 :-一種產生藤良备, 培養且髀胰島素頰似物之方法，其包含 乂〆、_只例3 5之宿主細胞之步驟。 二體實例37: 一種製備根據具體實例"。中任一且 體貝例之胰島素類似物之方法，1 八 基酸之取代。 ，、中精由疋位誘變進行胺 實例38: 一種用於製備根據具體實例21-23中任 ! . 一、口 方法，其包含將根據具體實例 壬一具體實例之胰島素類似物與醫藥學上可接受 物質及/或賦形劑混合。 *又& 具體實例3 9 : —種醫孳έ日人必甘π — 柰、、且口物，其可猎由根據具體實 例38之方法獲得。 胰島素為由胰腺之β'細胞分泌的多肽激素。騰島素由 λ ’卞夕肽鏈Α及Β組成，其由兩個鏈内二硫橋鍵聯。此外， A鏈特徵在於1個鏈内二硫橋。 激素經合成為單鏈前驅體胰島素原（前胰島素原）， /、在構型中由後接含有86個胺基酸之胰島素原之Μ個胺 基酸之前肽組成··前肽j_Arg Arg-C_Lys Arg_A，其中C 為3 1個胺基酸之連接肽。Arg_Arg及Lys_Arg為用於將連 20 200829600 ' 接肽自A及B鏈裂解開之裂解位點。 本發明之胰島素類似物可包含其他突變。胰島素分子 中之突變可呈天然產生之胰島素分子之A及/或B鏈中的 胺基酸殘基取代、缺失或添加形式。 「desB30」或「B(l-29)」意謂缺乏B3〇胺基酸殘基之 天然胰島素B鏈，且「A( 1-21)」意謂天然胰島素A鏈。 以3子母胺基酸代碼指示微型c肽及其胺基酸序列。 本文中如Al、A2、A3等之術語分別指示胰島素之a ( 鏈中之位置1、2及3(自N末端計算）。類似地，如B1、 B2、B3等之術語分別指示胰島素之B鏈中的位置丨、2及 3 (自N末端計算）。使用胺基酸之單字母代碼，如A2丨a、 A21G及A2 1 Q之術語指明A21位置上之胺基酸分別為a、 G及Q。使用胺基酸之三字母代碼，相應表述分別為 A2lAla、A21Gly 及 A21Gln。 本文中術語A(0)或B(0)分別指示n末端鄰接A1或B1 ( 之位置。術語A(-l)或B(-l)分別指示A(〇)或B(〇)之n末端 之第一個胺基酸的位置。因此A(-2)及B(-2)分別指示A(-l) 及B(-l)之N末端之位置；A(_3)及b(-3)分別指示A(-2)及 β〇2)之N末端之位置等。 術語連接肽涵蓋可連接胰島素中Β鏈之C末端胺基酸 殘基與Α鏈之Ν末端胺基酸殘基的肽鏈。 術語前肽（pro-peptide )意謂其功能允許所表現之多 月大自内負網導向南爾基體（Golgi apparatus )且進一步導 向为泌小泡以分泌至培養基中（亦即跨過細胞壁或至少經 21 200829600 '由細胞膜將多肽輸出至酵母細胞之周質空間中）之多肽序 列。前肽可為酵母α因子前肽，參閱us 4,546,〇82及 4,870,008。或者，前肽可為合成前肽，亦即自然界中未發 現之前肽。合適之合成前肽為彼等揭示於us 5,395,922 ; 5,795,746 ; 5，162,498 及 W〇 98/32867 中者。前狀較佳在 c末端含有肽鏈内切酶加工位點，諸如Lys_Arg序列或其 任何功能類似物。 術語「糖尿病（diabetes)」包括第一型糖尿病、第二 : 型糖尿病及其他造成高血糖症之病況。 術語「治療（treatment )」疾病包括治療、預防或緩 解疾病。 在本發明之一具體實例中，胰島素類似物尤其適合於 經口投藥。 本文中疏水性胺基酸應理解為天然產生之胺基酸色胺 酸（Trp，W)、苯丙胺酸（Phe，F)、纈胺酸（Val，v)、 異白胺酸（lie，I)、白胺酸（Leu，L)及赂胺酸（Tyr，Y) (括號中為3字母及單字母縮寫）。 本文中親水性胺基酸應理解為不為根據上文定義之疏 水性胺基酸之天然胺基酸。在一具體實例中，本發明之親 水性酸係選自由以下各物組成之群：麩胺酸（Glu，E )、 天冬胺酸（Asp，D )、組胺酸（His，Η )、麵醯胺酸（Gln，Q )、 天冬醢胺酸（Asn，N )、絲胺酸（Ser，S )、蘇胺酸（Thr，T )、 脯胺酸（Pro，P)、甘胺酸（Gly，G)、離胺酸（Lys，K) 及精胺酸（Arg，R )。在另一具體實例中，本發明之親水 22 200829600 性胺基酸係選自由以TΛ ^ E)、 Q)、 (Arg， 乂下各物組成之群：麩胺酸（Glu， 天冬胺酸（Asp，D )、^/ ’ 、、且月女酸（His, Η )、麩醯胺酸（Gln， 天冬酸胺酸（A s n Xr、 ^ ^ 5 )、離胺酸（Lys，Κ )及精胺酸 R)。 本文中本1明之「騰島素（1疆如）」應理解為人類 胰島素、騰島素類似物或胰島素衍生物。 、

立^本文中所用之術語「親本姨島素（parent insuiin )」 思H月向其施加任何本發明之突變前之胰島素。親本胰 島素之非限制性實例為（例如”于生型胰島素，諸如人類 胰島素或豬胰島素，人類胰島素之類似物，或人類騰島素 之何生物，或胰島素類似物，諸如已經聚乙二醇化或醯化 之人類胰島素或胰島素類似物。 在一具體實例中，本發明之親本胰島素係選自由以下 各物組成之群·· 人類胰島素； 人類胰島素之胰島素類似物，其中位置B28之胺基酸 殘基為 Pro、Asp、Lys、Leu、Val 或 Ala，且位置 B29 之 月女基i殘基為Lys或Pr〇，且視情況位置b3〇之胺基酸殘 基經缺失； 騰島素類似物，其為des(B28-B30)人類胰島素、des(B27) 人類胰島素或des(B3〇)人類胰島素； 人類胰島素之胰島素類似物，其中位置B3之胺基酸 殘基為Lys且位置B29之胺基酸殘基為Glu或Asp ; 人類姨島素之胰島素類似物，其中位置A21之胺基酸 23 200829600 殘基為Gly且其中該胰島素類似物之c末端以兩個精胺酸 殘基進一步延伸； 胰島素衍生物，其中位置B30之胺基酸殘基經蘇胺酸 曱酯取代；及 胰島素衍生物，其中十四醯基鏈與人類胰島素之位置 B29上離胺酸之Νε位置連接。 在一具體實例中，本發明之親本胰島素係選自由以下 各物組成之群： 人類騰島素；

DesB30人類胰島素； AspB28人類胰島素；

AspB28、DesB30人類胰島素； LysB3、GluB29人類胰島素；

LysB28、ProB29人類胰島素；

GlyA21、ArgB31、ArgB32 人類胰島素；及

DesB3〇、ArgB3 1、ArgB32 人類胰島素。 如本文中所用之術語「胰島素類似# ( anaiogue)」意謂經修飾之胰島素，其中騰島素之一或多 個胺基酸殘基已經其他胺基酸殘基取代，及/或其中一或多 個胺基酸殘基已自胰島素中缺失，及/或其中—或多個胺基 酸殘基已添加至胰島素中。 在一具體實例中’相對於親本騰島素’姨島素類似物 包含少於8個修飾（取代、缺失、添加）。在—具體實例 中’相對於親本胰島素，胰島素類似物包含少於7個修飾 24 200829600 (取代、缺失、添加）。在一具體實例中，相 島素’胰島素類似物包含少☆ 6個修飾（取代：缺：本： 加）。在另一具體實例中，相對於親本胰島素，、』 似物包含少於5個修飾（取代、缺失、添加)、 ： 體貝例中’相對於親本胰島素，胰島素類似物包含少於 们、飾（取代、缺失、添加）。在另一具體實例中，相對 於親本胰島素，胰島素類似物包含少於3個修鄉（取代、 缺失、添加）。在另一具體實例中，相對於親本胰島素， 騰島素類似物包含少於2個修飾（取代 如本文中所用之術語「騰島素衍生物.二 “一）」意謂經化學修飾之親本胰島素或其類似物， 其中至少一個取代基不存在於親本蛋白質或其類似物中， 亦即已經共價修飾之親本蛋白質。典型修飾為醯胺、醣、 烷基、醯基、酯、聚乙二醇化及其類似修飾。本發明之人 類胰島素之衍生物的實例為蘇胺酸甲酯_B3〇人類胰島素、 Νε-Β29_+四醯基des(B3〇)人類胰島素、Νε_Β29_十四醯基 GlnB3 des(B30)人類胰島素、Νε_Β29_十三醯基人類胰島 素、Νε-Β29-十四醯基人類胰島素、Νε_Β29_癸醯基人類胰 島素及Νε-Β29-十二醯基人類胰島素。 士本文中所用之術語「人類胰島素（hurnan insuiin )」 思谓結構及特性已熟知之人類激素。人類胰島素具有由半 胱私殘基之間的一硫橋連接之兩條多肽鏈，亦即A鏈及 B鏈。A鏈為21個胺基酸之肽且B鏈為3〇個胺基酸之肽， 該兩條鍵經三個二硫橋連接··一者位於A鏈之位置6與u 25 200829600 的半胱胺酸之間，第二者位於A鏈之位置7的半胱胺酸與 B鏈之位置7的半胱胺酸之間，且第三者位於a鏈之位置 2〇的半胱胺酸與B鏈之位置19的半胱胺酸之間。 藉由說明鏈（A或B )、位置及取代原生胺基酸之胺 基酸的三字母代碼來表示胰島素分子之突變。「desB3〇」 意謂缺乏B30胺基酸之天然:胰島素μ或其類似物。因^ A21Gly、B28Asp、desB3〇人類騰島素為人類騰島素之類 似物其中A鏈之位置21突變為甘胺酸，3鏈之位置μ 突變為天冬胺酸且Β鏈之位置3〇經缺失。 蛋白酶（protease 或 Λ 、 , 乂 protease enzyme)」為降解蛋 白質及肽，且存在於諸如胃部（胃 ’求 百3月口丨C月蛋白鰣）、腸腔（胰凝 礼蛋白酶、胰蛋白酶、强及 文拇_! 生蛋白it、叛肽酶等）或胃腸道 :黏膜表“胺肽酶、缓肽酶、腸肽酶、二肽基肽酶、肽 、’内切軸等）、肝臟（胰島素降解酶、組織蛋白酶 及其他組織的人體之各種組織中的消化酶。

人1藤ΪΙ蛋白f水解穩定胰島素類似物應理解為相對於 貞胰島t，經受較慢-或多種蛋白酶之降解之胰島辛句 :二具體貫例中，相對於親本姨島*，本發明之蛋 貝水解穩定胰島素類似物經 鏟 „ ^ . 又早乂反一或多種蛋白酶之降 解。在本發明之另一且濟者 叙稃定π斟铲 八中，本發明之胰島素類似物 …工％疋化對抗一或多種酶 ^ 姆之^解，该或該等酶係選自由以 下各物組成之群··胃蛋白醢f 、曰田Μ 胃蛋白酿R田 （堵如同功異型物胃蛋白酶A、 蛋白_ B、月蛋白酶。及，或胃蛋白 酶f古去《Λη FI f丄S I ) 屣/破导L蛋白 呢I渚如同功異型物姨凝 ^ 蛋白％ A、胰凝乳蛋白酶 26 200829600 ^騰破礼蛋白酶C)、胰蛋白酶、胰島素降解酶（IDE)、 :=白酶（諸如同功異型物胰腺彈性蛋白酶〗及/或π )、 竣肽酶（例如同功異型物羧肽酶Α、魏肽酶Α2及/或魏肽 Λ 胺肽酶、組織蛋白酶D及其他存在於獲自大鼠、 豬或人類之腸道提取物中之酶。 二 /、體貝例中，本發明之胰島素類似物經穩定化對

/夕種酶之降解，该或該等酶係選自由以下各物組成 胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胰島素降解酶（ide)、 弹^蛋白酶、羧肽酶、胺肽酶及組織蛋白酶D。在另一具 體只例中，本發明之胰島素類似物經穩定化對抗一或多種 酶之卩牛解，該或該等酶係選自由胰凝乳蛋白酶、羧肽酶及 一、且成之群。在另_具體實例中，本發明之姨島素類似 物^穩定化對抗-或多種酶之降解，該或該等酶係選自由 姨凝乳蛋白酶及魏肽酶組成之群。 t 貝例中所述，以本發明之胰島素類似物對諸如胰 是礼蛋白酶、月蛋白酶及/或羧肽酶A之蛋白酶的蛋白質 水解穩定性之量測形式來敎Τ1/”在本發明之—具體實 *中Τ/2相對於人類胰島素增加。在另一具體實例中，丁乂 相對於親本胰島素增加。在另一具體實例中，Μ相對於親 本胰島素增加至少2倍。在另一具體實例中，丁%相對於親 本胰島素增加至少3倍。在另一具體實例中，τι乂相對於親

本胰島素增加至少4供。A S m mb ^ , L 彳口 在另一具體貫例中，τ%相對於親 本夷島素:t曰加至少5倍。在另一具體實例中，T1/2相對於親 本胰島素增加至少1 0倍。 27 200829600 蛋白酶裂解位點（本文中亦稱作蛋白酶位點）應理解 為由蛋白酶所識別之胺基酸殘基及/或其肽鍵由蛋白酶裂解 之胺基酸殘基。可藉由以HPLC、Ms或lc_ms分析測定 裂解「熱點（hot spots)」及/或藉由基於蛋白酶裂解位點 對待測疋之蛋白酶之酶特異性的預測來測定蛋白酶裂解位 點。熟習此項技術者將知道如何測定蛋白酶裂解位點，例 如基於酶特異性，如（例如）於Handb〇〇k 〇f Pr〇te〇lyticai

Enzymes，第二版，Barrett，A.J·，RawlingS，ND，w〇esner，J F 編，Elsevier Academic Press 2〇04中所述。例如，胰凝乳蛋 白酶經預測裂解其後未接Pro之芳族殘基（Trp、丁厂、phe 或Leu ) C末端之肽鍵。類似地，胰蛋白酶經預測裂解其 後未接Pro之鹼性殘基Lys或Arg之c末端的肽鍵，彈性 蛋白酶經預測裂解Ala、Val、Gly或Ser之c末端的殘基， 且羧肽酶A將移除任何C末端胺基酸，但不移除Arg、LyS 或 Pro 〇 胰島素降解酶（IDE )經預測裂解以下人類胰島素位 ’ 置 B9-10、B1〇-H、B13-14、B14-15、B24-25、B25-26、A13-14 及 A14-15。 在本文中術語「在蛋白酶裂解位點内或與其緊鄰 (within or in close proximity to a protease cleavage site)」 取代胺基酸用以指示胺基酸之取代係處於親本胰島素之已 測定為蛋白酶裂解位點之位置中或與其緊鄰。在一具體實 例中’胰島素上兩個或兩個以上蛋白酶位點中或與其緊鄰 之兩個或兩個以上疏水性胺基酸經取代，其中該等疏水性 28 200829600 胺基酸係經親水性胺基酸取代。在另一具體實例中，騰島 素上兩個或兩個以上蛋白酶位點中之兩個或兩個以上疏水 性胺基酸經親水性胺基酸取代。在另一具體實例中，位於 緊接於胰島素上的兩個或兩個以上蛋白酶位點處之兩個或 兩個以上疏水性胺基酸經親水性胺基酸取代。在另一具體 實例中，位於離胰島素上兩個或兩個以上蛋白酶位點兩個 胺基酸處之兩個或兩個以上疏水性胺基酸經親水性胺基酸 取代。在另一具體實例中，位於離胰島素上兩個或兩個以 上蛋白i#位點三個胺基酸處之兩個或兩個以上疏水性胺基 酸經親水性胺基酸取代。在另一具體實例中，位於離胰島 素上兩個或兩個以上蛋白酶位點至多4個胺基酸處之兩個 或兩個以上疏水性胺基酸經親水性胺基酸取代。在另一具 體實例中，位於離胰島素上兩個或兩個以上蛋白酶位點 一、兩或三個胺基酸處或在胰島素上兩個或兩個以上蛋白 酶位點中之兩個或兩個以上疏水性胺基酸經親水性胺基酸 取代。在另一具體實例中，位於離胰島素上兩個或兩個以 上蛋白酶位點一或兩個胺基酸處或在胰島素上兩個或兩個 以上蛋白酶位點中之兩個或兩個以上疏水性胺基酸經親水 性胺基酸取代。在另一具體實例中，位於緊接於胰島素上 兩個或兩個以上蛋白酶位點處或在胰島素上兩個或兩個以 上蛋白酶位點中之兩個或兩個以上疏水性胺基酸經親水性 胺基酸取代。 本發明之胰島素類似物可具有不同於親本胰島素之淨 電何之淨電荷。在一具體實例中，本發明胰島素類似物之 29 200829600 =電荷具有比親本胰島素之淨電荷高之正^ 貝例中’本發明胰島素類似物—具體 之淨命尸古々名+ 尹電何具有比親本胰島辛 〜可焉之負電性。在一具體實例 灵馬素 量測，本發明牍象去相γ 4 在水/谷液中所 本毛月胰島素類似物之平均正淨 之間。在一具體實例中，本發明胰 、· ，、5 電荷介於1與5之間。/ 一目一 ” ”員似物之平均正淨 似物之平均正淨電荷介於 月夷島素類 本發明腩良去相/仏 ^ 之間。在一具體實例中， 本毛月胰島素類似物之平均正淨電荷介於… -具體實例中，本發明胰島素 ：間。在 ，之間。在-具體實例中，如在水= 表明胰島素類似物之平均負淨電荷介於Μ盘_ 一具體實例中，本發明脯良去 、 間。在 1與…1。在一呈r、中二平均負淨電荷介於- 本發明騰島素類似物u :負淨電荷介於…之間。在—具體實例 = 島素類似物之平均負淨電荷介於」 *月胰 一 間。在一呈辦每 列中’本發明胰島素類似物之平均負淨電荷介：： 間。 一 j之 在一具體實例中，相對於人類胰島素，本 素類似物可具有增加之溶解性。在另—具財財，^ 於人類胰島素，本發明之胰島素類似物在pH” 加之溶解性。在另一且鲈每 ^ ^ " 在另具體貝例中，相對於人類胰島素， 發明之胰島素類似物在pH 4_8 5下具有增加之溶解性 另-具體實例中，相對於人類胰島素，本發明之騰島素類 似物在PH 4_8下具有增加之溶解性。在另一具體實例中， 30 200829600 相對於人類胰島素，本發明之胰島素類似物在ρΗ 4·5_8下 具有增加之溶解性。在另一具體實例中，相對於人類胰島 素，本發明之胰島素類似物在ρΗ 5_8下具有增加之溶解 性。在另一具體實例中，相對於人類胰島素，本發明之胰 島素類似物在pH 5.5-8下具有增加之溶解性。在另一具體 貝例中，相對於人類胰島素，本發明之胰島素類似物在pH 6-8下具有增加之溶解性。 隹一具體實例中

、 〜八叫不'个/I <厥 素類似物在pH 2-4下具有增加之溶解性。 在一具體實例中’相對於親本胰島素，本發明之胰 素類似物可具有增加之溶解性。在另-具體實例中，相 於親本胰島素，本發明之胰島素類似物在pH Μ下具有 力之+解性。在另—具體實例中’相對於親本胰島素， 發明之騰島素類似物在pH 4_8 5下具有增加之溶解性。 另-具體實例中，相對於親本騰島素，本發明之胰島素 ^在ΡΗ 4·8下具有增加之溶解性。在另—具體實例中 目、於親本胰島素，本發明之胰島素類似物在ρΗ 4·5_8 , 具有增加之溶解性。在 辛…“ “具體“列中，相對於親本胰 性 ^之胰島素類似物在ρΗ 5_8 了具有增加之⑹ ⑴二具體實例中，相對於親本胰島素，本發明。 在ΡΗ5.5-8下具有增加之溶解性。在另-具, :=，相對於親本騰島素，本發明之姨島素_ '

6-8下具有增加之溶解性。 牡P 在一具體實例中 相對於親本胰島素 本發明之胰島 31 200829600 .素類似物在PH 2-4下具有增加之溶解性。 在、°疋PH值下增加之溶解性（increased s〇lubility at 8 §1彻PH )」意謂相對於所比較之胰島素，亦即人類胰 島素或親本胰島素，在溶液之pH值下較大濃度之本發明 騰島素類似物溶解於水性或緩衝溶液中。在此項技術中已 知測定含於溶液中之胰島素是 否溶解之方法。 乂 /、體只例中，该溶液可在30,000 g下經受離心20 r分鐘^且，後可藉由RP肌C測定上清液中之胰島素濃 % 又:在μ驗袂差内此濃度等於最初用以製備組合物之胰 島素浪度’則胰島素可充分溶解於本發明之組合物中。 哭以^另一具體實例中，可藉由肉眼檢查含有組合物之容 來簡單測疋胰島素在本發明之組合物中的溶解性。若肉 眼規察溶液澄清且無顆粒物質懸浮或沈殿於容器側面/底 則騰島素可溶。 在里測後比較時，本發明之胰島素類似物相對於親本 、 島素可具有增加之效力及/或生物可用性。 用於s測胰島素效力或生物可用性之標準檢定為熟習 产^技^者所已知且尤其包括：（1 )胰島素放射性受體 2疋L其中胰島素之相對效力係定義為置換與細胞膜上（例 大％肝臟質膜部分）存在之胰島素受體特異性結合的 月孝— 以 、 〇 /〇所罱的胰島素與胰島素類似物之比率；（2 ) 胰例如）大鼠脂肪細胞進行之脂肪生成檢定，其中相對 山素放力係疋義為實現[3_3Η]葡萄糖轉化為有機可提取 物^ c \ 、’、即脂質）之最大值之50〇/〇所需的胰島素與胰島素 32 200829600 •類似物之比率；（3)分離脂肪細胞中之葡萄糖氧化檢定， 其中胰島素類似物之相對效力係定義為實現葡萄糖小[η。] 轉化為[14C02]之最大值之50%的月夷島素與騰島素類似物之 比率；（4)胰島素放射性免疫檢定，其可藉由量測在盘 特異性抗胰島素抗體結合中胰島素或胰島素類似物與， 胰島素競爭之有效性來測定胰島素類似物之免疫原性；及 (5)量測動物血漿樣品中胰島素或胰島素類似物與抗體

„ 之結合的其他檢定，諸如具有特異性胰島素抗體之ELISA 檢定。 可視情況分析本發明胰島素類似物之其他可經受一或 多個疏水性胺基酸經親水性胺基酸進一步取代之蛋白酶位 點。本發明之胰島素類似物可為與親本胰島素、經第一修 飾之胰島素相比在蛋白酶位點中具有至少兩個親水性酸且 在經第一修飾之胰島素的至少一個疏水性胺基酸已經至少 一個親水性胺基酸取代的新穎蛋白酶位點中具有其他至少 一個胺基酸取代之胰島素類似物。 在一具體實例中，提供C末端B鏈經3-15個胺基酸 與N末端A鏈連接之胰島素類似物。本文中該胰島素類似 物稱為「單鏈胰島素（single chain insulin)」或「SCI」 且其具有通用結構B-C· A，其中B為人類B胰島素鏈或其 類似物或衍生物，A為人類胰島素A鏈或類似物或衍生物， 且C為通常連接B30與A1之3-15個胺基酸殘基之連接肽 鏈。若B鏈為desB30鏈，則連接肽將連接B29與A1。單 鏈胰島素將如人類胰島素般含有正確定位之二硫橋（三 33 200829600 ' 個），其為介於CysA7與CysB7之間及CysA20與CysB19 之間的二硫橋以及CysA6與CysAl 1之間的内部二硫橋。 在一具體實例中，提供C末端B鏈經3-7個胺基酸與N末 端A鏈連接之胰島素類似物。 本發明亦係關於編碼所主張騰島素類似物之核酸序 列。在另一具體實例中，本發明係關於含有該等核酸序列 之載體及含有該等核酸序列或載體之宿主細胞。 在另一具體實例中，本發明係關於一種用於產生胰島 ( 素類似物之方法，其包含：（i)培養包含編碼胰島素前驅 體之核酸序列的宿主細胞；（Π)自培養基分離該胰島素 前驅體；及（iii )藉由活體外酶致轉變將胰島素前驅體轉 化為本發明之胰島素類似物。 在另一具體實例中，本發明係關於一種用於產生胰島 素類似物之方法，其包含：（i)培養包含編碼胰島素前驅 體之核酸序列的宿主細胞；（ϋ)自培養基分離該胰島素 前驅體；及（iii )將胰島素前驅體轉化為本發明之胰島素 ( 類似物。 在本發明之一具體實例中，宿主細胞為酵母宿主細胞 且在另一具體實例中，酵母宿主細胞係選自酵母屬（genus 。在另一具體實例中，酵母宿主細胞係選 自物種釀酒酵母。 如本文中所用之「胰島素類似物（insuHn anal〇gue )」 意謂藉由缺失及/或取代至少一個存在於天然產生之胰島素 中的胺基酸殘基及/或藉由添加至少一個胺基酸殘基由天然 34 200829600 產生之胰島素（例如人類胰 肽。所添久、、、〇構衍生出之多 ，、、力及/或經取代之胺基酸殘基可為 基或其他天然產生之胺基酸殘基。 Ύ、扁碼胺基酸殘 本發明之胰島素類似物可為在一或多 之人悉音眭自φ 丨儿1上經犬變 人錢島素或其類似物。在一具體實例 之蛋白ϋ念】初， I於別出 -、乂解位點，胰島素類似物經設計 強之穩定性。 τ對蛋白_具有增

於强=具體實例中’至少―個經受突變之裂解位點係處 、二由以下位置組成之群的位置上：人類胰島素之仏 6-7'B9-l〇>B10-ll.B13-14^Bl4-15^Bl6-17>B22-23 > B24-25、B25-26、A13_14、A14-15 及 A19,。 、、阳在—具體實例中’至少—個經受突變之裂解位點係處 ;k自由以下位置組成之群的位置上··人類胰島素之Μ· 3、¥7、Bl6_17、B22_23、B24_25 及蠘 ai9_2〇。 在一具體實例中，至少一個經受突變之裂解位點係處 於位置B22-23上。 在一具體實例中，至少一個經受突變之裂解位點係處 於遥自由以下位置組成之群的位置上：B9-1〇、Bi〇-i 1、 B13-14、B14-15、B24-25、b25_26、A13-14、A14-15。 在一具體實例中，經受突變之裂解位點係處於選自由 以下位置組成之群的兩個或兩個以上位置上：人類胰島素 之 B2-3、B6-7、B9-10、B10-H、B 13-14、B 14-15、B16-17、 B22-23、B24-25、B25-26、A13-14、A14-15 及 A19-20。 在一具體實例中，經受突變之裂解位點係處於選自由 35 200829600 乂下位置組成之群的 之B2-3、B67 . 次兩個以上位置上··人類胰島辛 (W 3 B6_7、β16 17 鬲京 在一具I#者如士 _ 3、B2心25及/或Α19·2〇 〇 以下位置組：之群的：广突變之裂解位點係處於選自由 "、二:=:Γ 上位置一 ^ 在一具體者制由 <· 5、肪-26、Α13_14、Α14_15。 .相對Γ貝1 ，獲得本發明之勝島素類似物，其令 !對於親本胰島素，胰島素類似物…包含至少 受且姨島辛類似从 们大 f 之，？ ㈣物之B鏈包含至少—個突變，其中A鏈令 之β亥至少一個突變将彦 夕徊列& μ ; 1<"自由以下位點組成之群的一或 夕個裂解位點中·· ΑΠ 14 Λ 1 ^ 飞 15 及 Α19_20，且 Β 鏈 t 乂 .夕自大變係處於選自由以下位點組成之群的一或 -中· Β2-3、Β6-7、Β9-10、ΒΗΜ1、Bl3]4、 Bl6-17、Β22-23、Β24-25 及 Β25-26。 在具體貝例中，獲得本發明之胰島素類似物，其中 相對於親本胰島素，胰島素類似物之Α鏈包含一個突變且 胰島素類似物之B鏈包含至少一個突變，其中A鏈中之一 個犬變係處於裂解位點A19-20中，且B鏈中之至少一個 突變係處於選自由以下位點組成之群的一或多個裂解位點 中· B2-3、B6-7、B16-17、B22-23 及 B24-25。 在一具體實例中，獲得本發明之胰島素類似物，其中 相對於親本胰島素，胰島素類似物之A鏈包含至少一個突 變且騰島素類似物之B鏈包含至少一個突變，其中A鍵之 該至少一個突變係處於一或多個選自由a13_14及A14_15 組成之群的裂解位點中，且B鏈之該至少一個突變係處於 36 200829600 一或多個選自由以下位點組成之群的裂解位點中：Β9_ι〇、 Β10-11、Β13-14、Β14_14、Β24_25&Β25·26。

2於移除裂解位點之目的選擇適合於取代之胺基酸殘 基。在一具體實例中，出於增加溶解性之額外目的選擇胺 基酸。在另—具體實例中，增加之溶解性係在阳值範圍3_9 内。在另-具體實射，增加之溶解性係在阳值範圍4_8 内。胰島素或胰島素類似物可在一或多個位置經任何天缺 胺基酸取代，或任何天然胺基酸可添加至親本胰島素或親 本胰島素類似物中。為便利起見，此處遵循可編碼、天狹 胺基酸之名稱，其中括號中為常見三字母代碼及單字母代 碼：甘胺酸（Gly及G)、脯胺酸（Pr〇及ρ)、丙胺酸㈤a 及A)、網胺酸（Val及v)、白胺酸（―及l)、異白 胺酸（lie及I)、甲硫胺酸（MeUM)、半胱胺酸（CM 及c)、苯丙胺酸（PheAF)、路胺酸（TyqY)、色 胺酸（了卬及W)、組胺酸（His及η)、離胺酸（_及 K)、精胺酸（Arg及R)、麵醯胺酸（Gln&Q)、天冬 醯胺（Asn及N)、麩胺酸（Giu及E)、天冬胺酸（Asp 及D)、絲胺酸（Ser及S )及蘇胺酸（Thr及τ)。若由 於鍵入錯誤，存在與常用代碼之偏差，則應用常用代碼。 本發明之胰島素中存在之胺基酸較佳為可經核酸編碼之胺 基酸。在一具體實例中，胰島素或胰島素類似物係經Gly、 Glu、Asp、His、Gin、Asn、Ser、Thr、Lys、Arg 及/或 pro 取代’且 / 或將 Gly、Glu、Asp、His、Gin、Asn、Ser、Thr、 Lys、Arg及/或pr0添加至胰島素或胰島素類似物中。在 37 200829600 一具體實例中’胰島素或胰島素類似物係經Glu、Asp、His、 Gin、Asn、Lys 及/或 Arg 取代，且/或將 Glu、Asp、His、 Gin、Asn、Lys及/或Arg添加至胰島素或胰島素類似物中。 胰島素類似物可為B鏈位置25可自天然phe殘基修 飾為His且位置A14上之天然Tyr取代為Glu、Asp或His 之騰島素類似物。一或多個其他突變可包括desB3〇，且胰 島素類似物可進一步藉由A鏈及/或B鏈之N末端延伸或 C末端延伸來修飾，諸如胰島素類似物之a及/或b鏈之N 末端經GGP、GGPP、GP或GPP延伸。其他實例包括（但 不限於）其他突變，其中一或兩個Pr〇殘基可添加至位置 A0及/或BO，Leu可添加至位置B31及/或Glu可添加至位 置B32。一或多個其他突變可選自位置as經修飾為His、 位置A21經修飾為Gly、位置B1經修飾為Glu或Gin、位 置B16經修飾為Glu、位置B26經修飾為Asp、位置B27 經修飾為Glu及/或位置B28經修飾為Asp。 在一具體實例中，本發明之胰島素類似物係選自由以 下各物組成之群： A14E、B25H、desB30 人類胰島素； A14H、B25H、desB30 人類胰島素； A14E、ΒΙΕ、B25H、desB30 人類胰島素； A14E、B16E、B25H、desB30 人類胰島素； A14E、B25H、B28D、desB30 人類胰島素； A14E、B25H、B27E、desB30 人類胰島素； A14E、ΒΙΕ、B25H、B27E、desB30 人類胰島素· 38 200829600 A14E、ΒΙΕ、B16E、B25H、B27E、desB3 0 人類胰島 素； A8H、A14E、B25H、desB30 人類胰島素； A8H、A14E、B25H、B27E、desB30 人類胰島素； A8H、A14E、ΒΙΕ、B25H、desB30 人類胰島素； A8H、A14E、ΒΙΕ、B25H、B27E、desB30 人類胰島 素； A8H、A14E、ΒΙΕ、B16E、B25H、B27E、desB30 人 類胰島素； A8H、A14E、B16E、B25H、desB30 人類胰島素； A14E、B2 5H、B26D、desB30 人類胰島素； A14E、ΒΙΕ、B27E、desB30 人類胰島素； A14E、B27E、desB30 人類胰島素； A14E、B2 8D、desB30 人類胰島素； A14D、B25H、desB30 人類胰島素； Α(-1)Ρ、Α(0)Ρ、A14E、B25H、desB30 人類胰島素； A14E、Β(-1)Ρ、Β(0)Ρ、B25H、desB30 人類胰島素； A(-1)P、Α(0)Ρ; A14E、B(-1)P、Β(0)Ρ、B25H、desB30 人類胰島素； A14E、B25H、B3 0T、B31L、B3 2E 人類胰島素； A14E、B25H人類胰島素； A14E、B16H、B2 5H、desB30 人類胰島素； A14E、B10P、B25H、desB30 人類胰島素； A14E、B10E、B25H、desB30 人類胰島素； 39 200829600 A14E、B4E、B2 5H、desB30 人類胰島素； A14H、B16H、B25H、desB30 人類胰島素； A14H、B10E、B25H、desB30 人類胰島素； A14E、B25H、desB27、desB28、desB29、desB30 人 類胰島素； A13H、A14E、B10E、B25H、desB30 人類胰島素； A13H、A14E、B2 5H、desB30 人類胰島素； A14E、A18Q、B3 0、B25H、desB30 人類胰島素； A14E、B24H、B2 5H、desB30 人類胰島素； A8H、A14E、B10D、B25H、B26G、desB27、desB23、 desB29、desB30人類胰島素； A8H、A14E、B10D、B25H-醯胺、desB26、desB27、 desB28、desB29、desB30 人類胰島素； A14E、B25H、desB26、desB27、desB28、desB29、desB30 人類胰島素；

A14E、B25H、B26G、desB27、desB28、desB29、desB3Q i 人類胰島素； A14E、B25H-酉I 胺、desB27、desB28、desB29、desB30 人類胰島素； A14E、B25H、B26G、B27G、B28G、desB30 人類胰 島素； A14E、B26G、desB27、desB28、desB29、desB30 人 類胰島素； A14E、B25H、desB26、desB27、desB28、desB29、desB30 40 200829600 人類胰島素； A14E、A18Q、A21Q、B3Q、B25H、desB30 人類胰島 素； desB3 0

A14E、A18Q、A21G、B3Q、B25H、B27E 人類胰島素； A14E、A18Q、B3Q、B25H、desB30 人類胰島素； A13H、A14E、ΒΙΕ、B25H、desB30 人類胰島素； A13N、A14E、B25H、desB30 人類胰島素；

\ A13N、A14E、ΒΙΕ、B25H、desB30 人類胰島素； A(-2)G、Α(-1)Ρ、Α(0)Ρ、A14E、B25H、desB30 人類 胰島素； A14E、B(-2)G、Β(-1)Ρ、Β(0)Ρ、B25H、desB30 人類 胰島素； A(-2)G、Α(-1)Ρ、Α(0)Ρ、A14E、B(-2)G、Β(-1)Ρ、Β(0)Ρ、 B25H、desB30人類胰島素； A14E、B27R、B28D、B29K、desB30 人類胰島素； A14E、B25H、B27R、B28D、B29K、desB30 人類胰 島素； A14E、B25H、B26T、B27R、B28D、B29K、desB30 人類胰島素； A14E、A18K、B25H、desB27、desB28、desB29、desB30 人類胰島素； A14E、A22K、B25H、desB27、desB28、desB29、desB30 人類胰島素； 41 200829600 A14E、A22K、B25H、desB30 人類胰島素； A14E、desBl、desB2、desB3、B25H-醢胺、desB26、 desB27、desB28、desB29、desB30 人類胰島素； A14E、desBl、desB2、desB3、B25H、desB27、desB28、 desB29、desB30人類胰島素； A14E、desBl、desB2、desB3、B16H、B25H、desB27、 desB2 8、desB29、desB30 人類胰島素； A14E、B25H、B27R、desB30 人類胰島素； { A14E、B2 5H、B27H、desB30 人類胰島素； A14E、B25H、B27R、desB28-B30 人類胰島素； A14E、B2 5H、B27H、desB28-B30 人類胰島素； A14E、B25H、B27E、desB28-B30 人類胰島素； A14E、B25H、B27K、desB28-B30 人類胰島素； A14E、B27K、desB28-B30 人類胰島素； A14E、A18Q、B3Q、B25H、desB30 人類胰島素； A13E、A14E、B2 5H、desB30 人類胰島素； 、 A12E、A14E、B25H、desB3Q 人類胰島素； A15E、A14E、B2 5H、desB30 人類胰島素； A13E、B25H、desB30 人類胰島素； A12E、B25H、desB30 人類胰島素； A15E、B25H、desB30 人類胰島素； A14E、B25H、desB27、desB30 人類胰島素； A14E、B25H、B26D、B27E、desB30 人類胰島素； ΕΕΑΕΑΕΑΡΚ-Β(1-29)-Β25Η-ΑΑΚ-Α(1-21)-Α14Ε 人類 42 200829600 胰島素； EEAEPK-B(l-29)-B25H-DGK-A(l-21)-A14E 人類胰島 素； Β(1-29)-Β25Η-ΑΑΚ-Α(1·21)-Α14Ε 人類胰島素； Β(1-2 9)-Β1Ε、Β25Η-AAK-A( 1-21)-Α14Ε 人類胰島素； Β(1-29)-Β25Η、B27E-AAK-A(1-21)-A8H、Α14Ε 人類 胰島素；

Β(1-29)-Β1Ε、B25H、Β27Ε-ΑΑΚ-Α(1-21)·Α8Η、A14E 人類胰島素； ΕΕΑΕΑΕΑΡΚ-Β(1-29)-Β16Ε ^ Β25Η-ΑΑΚ-Α( 1-2 1)-Α8Η. Α14Ε人類胰島素； B(l-29)-B25H > B29Q-TGLGGGQ-Α( 1-2 1)-A14Ε 人類 胰島素；

Β(1-29)-Β16Ε、B25H、B29Q_TGLGGGQ-A(1-21)-A14E 人類胰島素； B(l-29)-B25H > B29Q-TGLGGGQ-A( 1-2 1)-A8H ^ A14E 人類胰島素； A14E、B25H、B27R A14E、B25H、B27N A14E、B25H、B27D A14E、B25H、B27Q A14E、B25H、B27E A14E、B25H、B27G A14E、B25H、B27H 、desB30人類胰島素 、desB30人類胰島素 、desB30人類胰島素 、desB30人類胰島素 、desB30人類胰島素 、desB30人類胰島素 、desB30人類胰島素 43 200829600 ’ A14E、B25H、B27K、desB30 人類胰島素. A14E、B25H、B27P、desB30 人類胰島素. A14E、B25H、B27S、desB30 人類胰島素； A14E、B25H、B27T、desB30 人類胰島素. A13R、A14E、B25H、desB30 人類胰島素. A13N、A14E、B25H、desB30 人類胰島素. A13D、A14E、B25H、desB30 人類騰島素. A13Q、A14E、B25H、desB30 人類胰島素. f A13E、A14E、B25H、desB30 人類胰島素. A13G、A14E、B2 5H、desB3D 人類胰島素, A13H、A14E、B25H、desB30 人類騰島素. A13K、A14E、B25H、desB30 人類騰島素. A13P、A14E、B25H、desB30 人類騰島素. A13S、A14E、B25H、desB30 人類騰島素. A1 3T、A14E、B2 5H、desB30 人類騰島素. A14E、B16R、B25H、desB30 人類騰島素. t A14E、B16D、B25H、desB30 人類騰島素. A14E、B16Q、B25H、desB30 人類胰島素. A14E、B16E、B25H、desB30 人類騰島素. A14E、B16H、B25H、desB30 人類騰島素. A14R、B25H、desB30 人類胰島素； A14N、B25H、desB30 人類胰島素； A14D、B25H、desB30 人類胰島素； A14Q、B25H、desB30 人類胰島素； 44 200829600 A14E、B25H、desB30 人類胰島素； A14G、B25H、desB30 人類騰 ^ 素· A14H、B25H、desB30 人類胰島素； A8H、B10D、B25H人類胰島素；及 繼、八^1應、6加、心_人類胰島素。 胰島素為由胰腺之β細胞分泌之多肽激素且由兩條由 兩個鏈内二硫橋連接之多肽鏈八及Β組成。此外，Α鏈特 徵在於1個鏈内二硫橋。

該激素經合成為單鏈前驅體胰島素原（前胰島素原）， 其在構型中由後接含有86個胺基酸之胰島素原之24個胺 基酸之前肽組成：前肽-B-Arg Arg-C-Lys Arg-A，其中c 為3 1個胺基酸之連接肽。Arg-Arg及Lys-Arg為用於將連 接肽自A及B鏈裂解開之裂解位點。 已使用三種主要方法在微生物中製造人類胰島素。兩 種涉及大腸桿菌，其中在細胞質中表現大的融合蛋白（Frank 等人·（1981)於 Peptides: Proceedings of the 7th American

Peptide Chemistry Symposium (Rich & Gross 編）：pierce Chemical Co·，Rockford，III.第 729-739 頁中）或使用信號 肽以能夠分泌至周質空間中（Chan等人 （1981) pNAS 78:5401-5404 )。第三種方法利用釀酒酵母將胰島素前驅 體分泌至培養基中（Thim 等人（1986)PNAS 83:6766-6770 )。先前技術揭示許多表現於大腸桿菌或釀酒酵母中 之胰島素前驅體，參閱美國專利第5,962,267號、WO

95/16708 、 EP 0055945 、 EP 0163529 、 EP 0347845 及 EP 45 200829600 0741188 〇

藉由如（例如）美國專利第6500645號中所揭示之熟 知技術在合適宿主細胞中表現編碼所討論之騰島素類似物 之DNA序列來產生胰島素類似物。胰島素類似物直接表 現或表現為於B鏈上具有N末端延伸之前驅體分子。此N 末端延伸可具有增加直接表現產物之產量的功能且長度可 為至多15個胺基酸殘基。>^末端延伸將在自培養肉湯分離 後活體外裂解且因此將具有緊接於B1之裂解位點。適於 本發明之類型之N末端延伸揭示於美國專利第5,395,922 號及歐洲專利第765,395A號中。 可藉由熟知醯化方法在 似物酸化，且該等胰島素類 開案編號為EP 214326、EP 利申請案中。 所需位置將所分離之胰島素類 似物之實例描述於（例如）公 3 7543 7及EP 3 83 472之歐洲專

可藉由已確定之標準方法合成製備編碼個別胰島素類 似物多肽之核酸序列，該等方法例如由Beaucage等人ο% 〇 Tetrahedron Letters 22:1859·1869描述之胺基磷酸醋法或 由 Matthes 等人（1984) EMB〇 Wnal 3:8〇18〇5 描述之方 法。根據胺基碟酸自旨法，在（例如）DNA自動合成儀中合 成寡核普酸 '純化、二重化且連接以形成合成魏㈣ 體。目前製備眶構築體之較佳方式為藉由聚合酶鍵反 應（PCR)製備。

CDNA及合成來源。 eDNA序列與編碼A 核酸序列亦可為混合染色體組、 例如’可將編碼前導狀之染色體組或 46 200829600 及B鏈之染色體組或cDNA序列接合，此後可將該 序列在某一位點藉由根據熟知程序插入用於同源重組編碼 所需胺基酸序列之合成募核苷酸或較佳使用合適募核苷酸 藉由PCR產生所需序列來加以修飾。 能夠在所選微生物或宿主細胞中複製且攜帶編碼所討 响之胰島素類似物多肽的核酸序列之重組載體可為自主複 製載體，亦即以染色體外實體形式存在之載體，其複掣不 ， 依賴於染色體複製，例如質體、染色體外元件、微小^色 體或人工染色體。載體可含有任何確保自我複製之構件。 或者，載體可為當引入宿主細胞中時整合入基因組中且連 同其整合於其中之染色體一起複製的載體。此外，可使用 共同含有待引入宿主細胞之基因組中的總DNA之單個載 體或質體或兩個或兩個以上載體或質體，或轉座子。載體 可=線性或閉環狀質體，且較佳將含有允許載體穩定整= 入宿主細胞之基因組中或允許載體在細胞中不依賴於基因 組自主複製之元件。 在一具體實例中，重組表現載體能夠在酵母中複製。 使載體能夠在酵母中複製之序列的實例為酵母質體2 μηι 複製基因REP 1_3及複製起點。 載體可含有一或多個允許易於選擇經轉化細胞之可選 擇標記。可選擇標記為其產物提供殺菌劑或病毒抗性、重 金屬抗性、對營養缺陷體型為原養型（pr〇t〇tr〇phy t〇 及其類似物之基因。細菌可選擇標記之實例 為枯早桿菌—而）或地衣芽孢桿g (5ad 47 200829600 或賦予諸如胺苄青黴素

— τρι 基因（以咖^ (my licheniformis )之基因， 黴素、氯黴素或四環音於从

Gene 40:125_130)。 在載體中，使核酸序列與合適啟動子序列操作性連接。 啟動子可為任何在所選宿主細胞中展示轉錄活性之核酸序 列’其包括犬、截短及雜交啟動子，且可獲自編碼與宿 主細胞同源或異源之細胞外或細胞内多肽之基因。 指導在細菌宿主細胞中轉錄之適當啟動子之實例為獲 自大腸桿菌/ac操縱子、天藍色鏈黴菌（ eoe//co/or)瓊脂糖酶基因（“Μ)、枯草桿菌果聚糖蔗糖 酶基因（MCjS )、地衣芽孢桿菌α-ί殿粉酶基因（am少Z )、

生麥芽 糖殿粉酶基因(謂)、解殿粉芽孢桿菌（ amyloliquefaciens ) α-殿粉酶基因（及地衣芽孢桿 菌青黴素酶基因（pwP )之啟動子。用於指導在絲狀真菌 宿主細胞中之轉錄的適當啟動子之實例為獲自米麯黴 (Aspergillus oryzae ) TAKA殿粉酶、米黑根毛徽 i Rhizomucor miehei )天冬胺後蛋白細^、票、魏數C Aspergillus 48 200829600 m·客π)中性α-澱粉酶及黑麯黴酸穩定型心澱粉酶之基因之 啟動子。在酵母宿主中，適用啟動子為釀酒酵母Mal、Tpi、 ADH或PGK啟動子。 亦通常將核酸構築體與合適之終止子操作性連接。在 酵母中，合適之終止子為TPI終止子（Alberet等人（1982) 了 Mol. Appl. Genet. 1:419-434 )。 用以連接含於表現載體中之個別核酸序列（諸如分別 編碼所需胰島素類似物多肽、啟動子及終止子之dna )且 將其插入含有在所選宿主中複製必要的資訊之適當載體中 的程序為熟習此項技術者所熟知。應瞭解可藉由首先製備 含有編碼本發明胰島素類似物多肽的全部DNA序列之DNA 構築體，且隨後將該片段插入合適表現載體中，或藉由依 次將含有個別元件（諸如信號、前肽、連接肽、八及B鏈） 之遺傳資訊的DNA片段插入接著連接來構築載體。 將包含該核酸序列之載體引入宿主細胞中以便該載體 以染色體成分或如先前所述之自我複製染色體外載體之形 式維持。術語「宿主細胞（host cell )」涵蓋歸因於複製 〃月間备生之突變，親本細胞之與親本細胞不同的任何子 代。彳s主細胞可為單細胞微生物，例如原核生物；或非單 細胞微生物，例如真核生物。適用單細胞為細菌細胞，諸 如革蘭氏陽性細菌，包括（但不限於）芽孢桿菌屬細胞、 鏈黴菌細胞；或革蘭氏陰性細菌，諸如大 腸桿菌及假單胞桿菌屬⑽似卬）。真核生物細 胞可為哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。在一較佳具體 49 200829600 實例中，宿主細胞為酵母細胞。用於本發明之方法中的酵 母生物體可為任何合適之酵母生物體，其在培養時產生大 量本發明之單鏈胰島素。合適酵母生物體之實例為選自酵 母物種釀酒酵母、穿殖酵母（心w吵μη )、 粟酒裂殖酵母（Sc/n’zoMec/mromKa户⑽心）、葡萄汁酵 母（SaCCharomyces uvarum )、乳酸克魯維斯酵母 (KluyVeromyces lactis )、漢遜多形酵母 q Hansenu!a po/ymorp/^)、巴斯德畢赤酵母（户#仙…）、甲醇 畢赤酵母（Pichia methanolica)、充魯維斯畢赤酵母（Pichia W吵ver〇 、解脂耶氏酵母（rarr㈣以办、假絲 酵母（Candida sP·)、產朊假絲'酵母（Candida ut出s)、 可可假絲酵母（〔⑽山·心cacaoz·)、地黴（印·） 及私酵絲孢酵母（以謂介，所⑼)之菌株。 酵母細胞之轉化可例如藉由原生質體形成、接著以本 2已知之方式轉化來實現。用以培養細胞之培養基可為適 於使酵母生物體增長之任何習知培養基。可藉由習知程 口養基中回收顯著比例以正確加工形式存在於培養基 了之所分泌之胰島素類似物多肽，該等習知程序包括藉由 離^過濾或藉由離子交換基質或藉由逆相吸附基質捕捉 夷=素則驅體自培養基分離酵母細胞，藉助於例如硫酸錄 之：使上清液或濾液之蛋白質組分沈澱，接著藉由例如離 換層析去、親和力層析或其類似方法之多種層析程序 來純化。 醫藥组合物 50 200829600 ' 本發明之另一目標為提供包含本發明胰島素類似物之 醫樂調配物’該騰島素類似物係以0· 1 xng/ml至5 00 mg/ml 之濃度存在’且其中該調配物具有2.0至i〇Q之pH值。 該調配物可進一步包含蛋白酶抑制劑、緩衝系統、防腐劑、 張力劑、螯合劑、穩定劑及界面活性劑。在本發明之一具 體實例中’醫藥調配物為水性調配物，亦即包含水之調配 物。該調配物通常為溶液或懸浮液。在本發明之另一具體 實例中，醫藥調配物為水性溶液。術語「水性調配物（aque〇us ( formulation)」係定義為包含至少5〇 w/w%水之調配物。 同樣，術語「水性溶液（aqueous soluti〇n)」係定義為包 含至少50 w/w%水之溶液，且術語「水性懸浮液（〒鶴 suspension)」係定義為包含至少5〇w/w%水之懸浮液。 在另一具體實例中，醫雖坰 私& 酉条调配物為經冷凍乾燥之調配 物，使用前醫師或患者向复巾 — 门/、甲添加〉谷劑及/或稀釋劑。 在另一具體實例中，醫筚 W梁w周配物為在無任何先前溶解 之備用之乾燥調配物f仏丨1、人土 ^ r 〔例#冷凍乾燥或喷霧乾燥）。 I 在另一具體實例Φ , 4» μ 、 本舍明係關於醫藥調配物，JL包 含本發明胰島素類似物之 /、包 尺/合液及緩衝劑，並φ兮Hi t 類似物係以〇.lmg/ml„t〇i / m、中違胰島素 a 0·1 mg/ml以上之濃度存 中該調配物具有約2.〇 子在且 芝約10.0之pH值。 可根據任何已知方法製備 ^ 該等調配物可含有一咬夕 、、二吏用之調配物，且 劑及防腐劑組成之群的 方香刈、者色 之製劑。錠劑可含有歲 西条予上精吴且可口 >、…、母·之醫藥學上可接受之適合於製 51 200829600 造錠劑之賦形劑混合的活性成分。該等賦形劑可（例如） 為惰性稀釋劑，諸如甘露醇、麥芽糖糊精、高嶺土、碳酸 鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；粒化及崩解劑，例 如玉米澱粉；黏合劑，例如澱粉、明膠、聚合物或阿拉伯 膠；及潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。錠劑可為 非包衣錠劑，或其可經已知技術包衣以延遲治療活性多肽 之崩解或釋放。 可根據醫藥化學中熟知之方法製備且投予本發明之可 經 口投予調配物，參見 Remingt〇n，s pharmaceutical Sciences， 第 17 版（A. Os 〇1 編，1985)。 在本發明之一具體實例中，可藉助於諸如錠劑及膠囊 之固體劑型投予本發明之醫藥組合物。該等錠劑可藉由渔 式造粒、乾式造粒、直接壓縮或熔體造粒來製備。 可使用習知製錠技術製備本發明之錠劑。製造之通用 方法包括摻合胰島素類似物、水溶性稀釋劑、親水性黏合 劑及視情況一部分崩解劑。隨後以親水性黏合劑之水溶液 或親水性黏合劑及界面活性劑之水溶液將該摻合物粒化\ 且研磨（若必要）。將顆粒乾燥且縮減至合適尺寸。可將 諸如潤滑劑（例如硬脂酸鎂）及其他崩解劑之任何其他成 分添加至顆粒中且混合。隨後使用諸如旋轉製錠機之習知 製鍵機將此混合物壓縮成合適之尺寸及形狀。錠劑可藉由 在此項技術中熟知之技術薄膜包衣。 曰 經口使用之調配物/亦可以硬或軟明膠膠囊形式存在， 其中將活性成分與例如甘露醇、春芽、 ’ ^ 夢牙糖糊精、碳酸鈣、碳 52 200829600 酸鈉、乳糖、高嶺土、磷酸鈣或磷酸鈉之惰性固體稀釋劑 混合；或以軟明膠膠囊形式存在，其中將活性成分與水或 例如花生油、液體石蠟或橄欖油之油性介質混合。 可使用習知方法製備本發明之膠囊。製造之通用方法 包括摻合治療活性肽、海藻酸酯、水溶性稀釋劑、親水性 黏合劑及視情況一部分崩解劑。隨後以親水性黏合劑之水 溶液或親水性黏合劑及界面活性劑之水溶液將該摻合物粒

化’且研磨（若必要）。將顆粒乾燥且縮減至合適尺寸。 將堵如潤滑劑之任何其他成分添加至顆粒中且混合。隨後 使用白知膠襄填充機將所得混合物填充於適當尺寸之硬殼 明膠膠囊中。 在本發明之另一具體實例中，緩衝劑係選自由以下各 物、、且成之群·乙酸鈉、石炭酸鈉、擦樣酸鹽、甘胺酷甘胺酸、 組胺酸、甘胺酸、離胺酸、精胺酸、冑酸二氫鈉、碟酸氣 :納、碟酸納及參（經甲基）-胺基甲烧、N-二（經乙基）_甘胺 χ >( &甲基）甲基甘胺酸、蘋果酸、丁二酸鹽、順丁 ::::反丁烯二酸、酒石酸、天冬胺酸或其混合物。該 ^寸&、及衝劑中之每—者構成本發明之替代具體實例。 ::發明之另—具體實例中，調配物進一步包含醫藥 了接雙之防腐劑。防腐劑係以^以獲得防腐作用 :可自：：：配物中防腐劑之量為熟習此項技術者所熟知 已知=域二之广/或㈣^ 代具體實例。醫葶έ且人物φιι 冓成本％明之替 -樂、，且口物中防腐劑之用途為熟習此項技術 53 200829600 者所熟知。為方係說目# 土^ π I 見多考 Remington: TTze Science ㈣d 尸…"ce〇/PWwac少第 19 版，1995。 在本毛明之另一具體實例中，調配物進一步包含螯合 M'1 w ^組合物中螯合劑之用途為熟習此項技術者所孰 知。為方便起見參考Remington: aw〜以心e二 P/iarmw兄第 19 版，1995。 在本lx明之另一具體實例中，調配物進一步包含穩定 片J 士本文中所用之術語「穩定劑（他b山⑽）」係指添 加至含有多肽之醫藥調配物中以使該肽穩定，φ即增加該 等調配物之存放期及/或使用時間的化學品。醫藥組合物中 穩定劑之料為熟胃此項技術者㈣知。^便起見來考 Remington: 77^ ⑼ce 〇/以以卿〜第 a 版，1995 〇 在本毛明之另-具體實例中，調配物進一步包含界面 活性劑。如本文中所用之術言吾「界面活性劑（surfactant)」 係心任何由頭部水溶性（親水性）部分及脂溶性（親脂性） 區奴、’且成之刀子或離子。界面活性劑較佳在界面處累積， 該親水性部分定向朝向纟（親水性相）且該親腊性部分定 向朝向油或疏水性相（亦即玻璃、空氣”、由等）。界面活 性劑開始开）成微胞之濃度稱為臨界微胞濃度《cmc。此 外界面活性劑降低液體之表面張力。界面活性劑亦稱為 兩親化合物。一般而言，術語「清潔劑（Detergent)」為 用於界面活性劑之同義詞。醫藥組合物中界面活性劑之用 途為熟習此項技術者所熟知。為方便起見參考Rem一〇n 54 200829600

The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版，19% 在本發明之另一具體實例中，調配物進一步包人蛋白 酶抑制劑。 其他成分可能存在於本發明之胰島素類似物醫藥★周配 物中。該等其他成分可包括濕潤劑、乳化劑、抗氧化郝丨、 膨化劑、張力調節劑、螯合劑、金屬離子、油性媒劑、蛋 白質（例如人血清白蛋白、明膠或蛋白質）及兩性離子（例 如胺基酸’諸如甜菜鹼、牛續酸、精胺酸、甘胺酸、離胺 酸及組胺酸）。該等其他成分當然不應不利地影響本發明 之醫藥調配物的總體穩定性。 可在若干部位將含有本發明之胰島素類似物的醫藥組 合物投予需要該治療之患者，例如在局部部位，例如皮膚 及黏膜部位；在繞過吸收之部位，例如在動脈、靜脈、心 臟中投藥；及在涉及吸收之部位，例如在皮膚中、在皮下、 在肌肉内或在腹内投藥。 本發明醫藥組合物之投藥可經由若干給藥途徑投予需 要該治療之患者，例如經舌、舌下、頰内、口腔内、經口、 月腸内、經鼻、肺部（例如經由細支氣管及肺泡或其組合）、 表皮、真皮、經皮、經陰道、經直腸、眼部（例如經由結 膜）、輸尿管及非經腸。 本發明之組合物可以若干劑型投予，例如以下列形式： 溶液、懸浮液、乳液、微乳液、多層乳液、泡洙、油膏、 烏狀物、T樂、軟貧劑、録;劑、包衣錠劑、清洗劑、膠囊 (例如硬明膠膠囊及軟明膠膠囊）、栓劑、直腸膠囊、滴 55 200829600 劑、凝膠、噴霧劑、散劑 _ 乳〆合膠、吸入齋、凉士 用軟貧劑、眼用清洗劑 一々眼劑、眼 注射溶液、原位轉 i 、陰道軟膏劑、 位沈澱、原位結晶）、輪 原位嘁固、原 ’ 翰/主洛液及植入物。 本發明之組合物可進一 β 疏水及靜電相互作用連接至;=或經由(例如)共價、 級藥物傳遞系統以進一步藥物傳遞系統及高 性、增…可用性、增物化合物之穩定 ^ , 日加/合解性、降低不利作用、眚 ^ ^此項技術者所熟知之慢性户 貫見 任何组合。 η療且θ M W者順應性或其 本^之组合物適用於調配使用（例如）彳量劑量吸 ^/粉吸人器及霧化器肺部投予胰島素類似物 I:半㈣、粉末及溶液，所有裳置為熟習此項技術者所 熟知之裝置。 7 本發明之組合物可適用於調配受控、持續、延長 遲及緩釋藥物傳遞系統。更特定言之（但不限於），电人 物可適用於調配熟習此項技術者所熟知之非經腸受控料 及持續釋放系、统（兩種系統均使得投藥次數降低許多倍）。 甚至更佳為皮下投予之受控釋放及持續釋放系統。在不限 制本發明之範田壽的情況下，適肖之受控釋放系、统及組合物 之實例為水凝膠、油性凝膠、液態晶體、聚合型微胞、微 球體、奈米顆粒。 製備適用於本發明之組合物的受控釋放系統之方法包 括（但不限於）結晶、冷凝、共結晶、沈澱、共沈澱、乳 56 200829600 化、分散、高壓均化、封裝、喷霧乾燥、微囊封裝、凝聚、 相分離、產生微球體之溶劑蒸發、擠壓及超臨界流化方法。 總體參考 Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise，D.L.編 Marcel Dekker，New York，2000)及 Drug and the Pharmaceutical Sciences 第 99 卷：Protein Formulati〇n and Delivery (MacNally，E.J·編· Marcel Dekker，New York， 2000) 〇 可藉由皮下、肌肉内、腹膜内或靜脈内注射，藉助於 注射器、視情況筆樣注射器進行非經腸投藥。或者，可藉 助於輸注泵進行非經腸投藥。另一選擇為可為用於以經鼻 或肺部喷霧形式投予胰島素類似物化合物之溶液或懸浮液 的組合物。作為另一選擇，含有本發明之胰島素類似物化 合物的醫藥組合物亦可適合於經皮投藥，例如藉由無針注 射或貼片、視情況離子導入貼片，或經黏膜投藥，例如頰 内投藥。 本發明之胰島素類似物可在媒劑中、以溶液、懸浮液 或乾粉形式，使用適合於肺部藥物傳遞之任何已知類型的 裝置經由肺部途徑投予。該等肺部投藥之實例包括（但不 限於）3種一般類型之用於肺部藥物傳遞之氣溶膠產生且 可包括噴射或超音波霧化器、計量劑量吸入器或乾粉吸入 器（參看 Yu J，Chien YW· Pulm〇nary drug deHvery:

PhyS1〇1〇glC and mechanistic aspects. Cdt Rev Ther Drug

CarrSys 14 (4) (1997) 395-453)。 在另一具體實例中，調配物可藉由諸如噴霧之任何已 57 200829600 知霧化技術霧化，以獲得小於10 μηι、更佳介於1 - 5 μπι 之間且最佳介於1 -3 μπι之間的氣溶膠顆粒之MMAD。較 佳粒徑係基於將藥物傳遞肺深部之最有效尺寸，其中蛋白 質經最佳吸收（參看 Edwards DA，Ben-Jebria A，Langer Α， Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84 (2) (1998) 379- 385 )〇 f

包含胰島素類似物化合物之肺部調配物之肺深部沈積 可視情況藉由使用吸入技術之改進，例如（但不限於）較 慢吸入流量（例如30 L/min )、屏氣及致動定時進一步優 化0 何。口 、、生知、疋化之调配物（stabilized formulation )」 係指具有增加之物理穩定性、增加之化學穩定性或增加之 物理及化學穩定性的調配物。 如本文中所用之術語蛋白質調配物之「物理穩定性 (Physical stability)」係指由於蛋白質暴露於熱機械應力 及/或與使失穩之諸如疏水表面及界面的界面及表面相互作 用，蛋白質形成蛋白質之生物學上非活性及/或不溶性聚集 體的趨勢。在不同溫度下歷時不同時間將填充於合適容器 々(例如濾筒或小瓶）中的調配物暴露於機械/物理應力（例 ，攪動）後，藉助於目測及/或濁度量測來評估水性蛋白所 二：3理穩定性。以具有黑暗背景之銳聚焦光進行調 二：目調配物之濁度由目測評分來表徵，目測評分 --排列在（例如）0至3範圍内（調配物未展示濁度 58 200829600 μ/目測砰分0，且調配物在曰光中展示可見濁度對應 ；、彳°平刀3 )。當調配物在日光中展示可見濁度時，其 蛋白質聚集歸類為物理不穩定。或者，可藉由熟習此 —術者所热知之簡單濁度測定來評估調配物之濁度。亦 σ 吏用蛋白貝之構形狀態之光譜劑或探針來評估水性 蛋白質調配物之物理穩定性。探針較佳為優先與蛋白質之 2 =然構象異構體結合的小分子。蛋白質結構之小分子光 / ^針之—貫例為硫代黃素T (thioflavin Τ)。硫代黃素 、τ為已廣泛用於偵測類澱粉原纖維之螢光染料。在原纖維 以及可能其他蛋白質構型存在下，當與原纖維蛋白質形式 、、口 口打硫代黃素T在約45〇 nm下產生新的激發最大值且 在約482 nm下產生增強之發射。在該等波長下未結合之 硫代黃素T基本上不具有螢光。 可使用其他小分子作為蛋白質結構自原生狀態改變為 非天然狀態之探針。例如優先與蛋白質之已暴露疏水補丁 ( 結合之「疏水補丁（hydroph〇bic patch)」探針。疏水補 丁通常内埋於處於天然狀態之蛋白質之三級結構中，但當 蛋白質開始打開或變性時變得暴露。該等小分子光譜探針 之實例為芳族疏水性染料，諸如葱…丫啶、菲咯啉或其類 似物。其他光譜探針為金屬-胺基酸錯合物，❹疏水性胺 基酸之始金屬錯合物，該等疏水性胺基酸諸如苯丙胺酸、 白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸及纈胺酸或其類似物。 如本文中所用之術語蛋白質調配物之「化學穩定性 (chermcal stability )」係指與天然蛋白質結構相比，蛋 59 200829600 白質結構中導致丑彡士、s 、 7成，、有潛在較低生物效力及/或潛在增加 之免疫原性特性的4卜與^找夂 的化予h解產物的化學共價變化。視天然 虫白貝之類型及性質及蛋白質暴露之環境而定，可形成各 種:匕學降解產物。化學降解之消除極不可能完全避免，且 ’、’、、白此頁技術者所热知’在儲存及使用蛋白質調配物期 —$可見、加里之化學降解產物。多數蛋白質易於脫醯 ^ 為種其中麵醯胺醯基或天冬醯胺醯基殘基之側

鏈-月女基水解形成游離叛酸之過程。其他降解途徑包括形 成高分子量轉變產物’ λ中兩個或兩個以上蛋白質分子經 由轉酸胺作用及/或雙硫相互作用彼此共價結合，從而導致 形成共價結合《二聚體、s聚物及聚合物降解產物 (Stability 〇f Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & 爲謂〜心…撕）。（例如甲 琉胺酸職之）氧化可經提及作為化學降解之另-變化形 式。可藉由在暴露於不同環境條件後之不同時間點量測化 學降解產物之量來評估蛋白質調配物之化學穩定性（降解 產物之形成通常可由（例如）遞增之溫度加速）。通常藉 由依賴於分子大小及/或電荷使用各種層析技術（例如 SEC-HPLC及/或RP_HPLC)分離降解產物來測定各個別降 解產物之量。 口此如上所述，「經穩定化之調配物（stabiUzed formulation )」係指具有增加之物理穩定性、增加之化學 穩定性或增加之物理及化學穩定性的調配物。一般而言， 在使用及儲存（遵照推薦使用及儲存條件）期間直至達到 60 200829600 失效期，調配物須穩定。 在本發明之一具體實例中’包含騰島素類似物化合物 之醫藥調配物穩定達使用6週之久，且達儲存3年之久。 在本發明之另一具體實例中，包含胰島素類似物化合 物之醫藥調配物穩定達使用4週之久，且達儲存3年之久。 在本發明之另一具體實例中，包含胰島素類似物化合 物之醫藥調配物穩定達使用4週之久，且達儲存兩年之久。 在本發明之另一種具體實例中，包含胰島素類似物化 合物之醫藥調配物穩定達使用2週之久，且達儲存兩年之 久。 水性懸浮液可含有與適合於製造水性懸浮液之賦形劑 混合之活性化合物。 可藉由將活性成分懸浮於例如花生油、撖彳覽油、芝麻 /由或椰子油之植物油或諸如液體石堪之礦物油中調配油性 懸洋液。油性懸浮液可含有例如蜂蠟、固體石蠟或十六烷 酉子之增稠劑。可添加諸如上文所述之甜味劑及芳香劑以提 么、可口經口製劑。該等調配物可藉由添加諸如抗壞血酸之 抗氧化劑來保存。 適合於藉由添加水來製備水性懸浮液之可分散粉末及 顆粒提供與分散劑或潤濕劑、懸浮劑及一或多種防腐劑混 合之活性化合物。合適分散劑或濕潤劑及懸浮劑由彼等於 上文提及者來例示。亦可存在例如甜味劑、芳香劑及著色 劑之其他賦形劑。 包含根據本發明使用之化合物的醫藥調配物亦可呈水 61 200829600 包油乳液之形式。油如iy t， …、广牌 為例如撖欖油或花生油之植物油 或例如液體石蠟之礦物 其此合物。合適乳化劑可為天 。產生之膠’例如阿拉伯膠或黃民膠；天然產生之填脂， : 、印磷脂及衍生自脂肪酸及己糖醇肝之醋或偏 \ 脫水山梨糖醇單油酸_，及該等偏s旨與氧化乙烯 之、倍口產4勿你】如聚氧化乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。乳 液亦可含有甜味劑及芳香劑。 梨糖醇或嚴糖之甜味劑調 可含有缓和劑、防腐劑及 ’調配物進一步包含滲透 肪酸來增加胃腸道的上皮 可以例如甘油、丙二醇、山 / %

配糖漿劑及酏劑。該等調配物亦 芳香劑及著色劑。 在本發明之另一具體實例中 增強劑。最通常考慮膽汁鹽及脂 細胞内層之脂質雙層膜之經口渗透性。一般而t，滲透增 強劑藉由可逆改變膜完整性來增加大分子之細胞旁路轉運 及跨細胞轉運。膽汁鹽係選自由以下各物組成之群：膽酸 鹽、脫氧膽酸鹽、牛磺膽酸鹽、甘膽酸鹽' 牛磺去氧膽酸 鹽、熊去氧膽酸鹽、牛磺脲去氧膽酸鹽及鵝去氧膽酸鹽。 脂肪酸係選自以下久物έ日士、滅 —,^ ^ χ 广合物組成之群.短、中等及長鏈脂肪酸， 老如辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸等。 其他增強劑可為諸如甘油單酯、聚氧化乙烯酯、脫水山梨 糖醇界面活性劑（非離子型）及硫酸鹽（陰離子型）之界 面活性劑。 在本發明之另一具體實例中，調配物進一步包含黏膜 黏附聚合物。可藉由使用該黏膜黏附聚合物獲得藥物傳遞 62 200829600

。劑型與膜之緊密接觸似乎 多狀在傳遞糸統與吸收膜之 。此外，可提供表示被動藥 务明之另一具體實例中，調配物進一步包含蛋白 貝水角午酶之抑制劑以進—步繞開酶障礙且實現治療活性多 肽之傳4 A抑制劑諸如胺肽酶抑制劑、胺莫司汀（&削3· tatm)、4笨美司（bestatin)、博羅新（“。⑻如〇及 納、曱石黃酸卡莫 (bacitracin )、 (aprotinin ) 〇 π ?彳放素（pur〇mycin )。蛋白酶抑制劑之實例為羥基乙酸 司他（camostat 大豆胰蛋白酶丰 stat mesilate )、桿菌肽 酶抑制劑及抑蛋白酶肽 包封及封裝為用於治療活性多肽之藥物傳遞系統以優 化包括抗酶促降解保護之傳遞特性之技術。包封或封裝可 呈諸如水凝膠及奈米囊劑/微球體之聚合型藥物傳遞系統及 諸如脂質體及微乳液之脂質藥物傳遞系統之形式。 本發明之調配物可以若干劑型投予，例如以以下形式： 洛液、懸洋液、微懸浮液及奈米懸浮液、乳液、微乳液、 多層礼液、泡沫、油膏、膏狀物、軟膏劑、錠劑、包衣錠 劑、泡騰錠劑、舌下錠劑、頰錠劑、膠囊（例如硬明膠膠 囊及㈣膠膠囊）、散劑、顆粒、原位轉化㈣（例^ 位凝膠、原位凝固、原位沈澱、原位結晶）、胃部浮動調 配物，諸如浮動懸浮液、浮動錠劑或其類似物。 。 在另一具體實例中，本發明係關於適用作醫藥品之本 63 200829600 發明之胰島素類似物。 在一具體實例中，本發明之胰島素類似物用於製備用 以治療或預防以下病症之醫藥品：高血糖症、第二型糖尿 病、葡萄糖耐受不良、第一型糖尿病、肥胖症、高血壓、 X症候群、異常血脂症、認知病症、動脈粥樣硬化、心机 梗基、中風、冠心病及其他心血管病症、發炎性腸病症候 群、消化不良及胃潰瘍。 在另一具體實例中，本發明之胰島素類似物用作用以 延遲或防止弟二型糖尿病之疾病進展的醫藥品。 在另一具體實例中，本發明之胰島素類似物用作用以 降低食物攝入、降低卜細胞凋亡、增加細胞功能及卜細 胞質量及/或恢復β-細胞之葡萄糖敏感性的醫藥品。 在本發明之一具體實例中，本發明之衍生物用作用以 治療或預防以下病症之醫藥品：高血糖症、第二型糖尿病、 葡萄糖耐受不良、第一型糖尿病、肥胖症、高血壓、χ症 候群、異常血脂症、認知病症、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、 冠心病及其他心血管病症、中風、發炎性腸病症候群、消 化不良及胃潰瘍，《用作用以延遲或防止第二型糖尿病疾 病進展或用以降低食物攝入、降低3_細胞凋亡、增加卜細 胞功能及β-細胞質量及/或用以恢復Ρ細胞之葡萄糖敏感性 之醫藥品。 在本發明之另-具體實例中，提供一種用於治療或預 防以下病症之方法：高血糖症、第二型糖尿病、葡萄糖耐 受不良、第-型糖尿病、肥胖症、高血壓、χ症候群、異 64 200829600 常血脂症、認知病症、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、冠心病 及其他心血管病症、中風、發炎性腸病症候群、消化不良 及胃潰瘍，或用於延遲或防止第二型糖尿病疾病進展，或 用於降低食物攝入、降低卜細胞凋亡、增加β_細胞功能及 β-細胞質量，及/或用於恢復卜細胞之葡萄糖敏感性的方 法σ亥方法包含向需要該治療之患者投予對於該治療有效 量之本發明之胰島素類似物。 以根據本發明之胰島素類似物治療亦可與第二或更多 Γ藥理學活性物質組合，該等活性物質（例如）選自抗糖尿 病劑、抗肥胖劑、食慾調節劑、抗高血壓劑、用於治療及/ 或預防由糖尿病所致或與糖尿病相關的併發症之藥劑及用 於治療及/或預防由肥胖症所致或與肥胖症相關的併發症及 病症之藥劑。該等藥理學活性物質之實例為：及 GLP-1衍生物及類似物、GLP-2& GLp_2衍生物及類似物、 Exendin-4及Exendin_4衍生物及類似物、支鏈澱粉及支鏈 I 瓜粕衍生物及類似物、績醯基脲、雙脈、美格替财 (me§lltlnides )、葡糖苷酶抑制劑、升糖素拮抗劑、DPP-IV (二肽基肽酶_IV )抑制劑、與葡糖新生及/或肝糖原累 積病之激化有關的肝酶之抑制劑、葡萄糖吸收調節劑、諸 如抗高血脂劑之作為HMGC〇A抑制劑（斯達汀（statins)) 的改、欠知貝代谢之化合物、降低食物攝入之化合物、rXr 促效劑及作用於β-細胞之A”依賴型鉀通道之藥劑；消膽 胺、考來替潑（colestipol )、氯貝丁酯（cl〇fibrate )、吉 非羅齊（gemfibrozil)、洛伐他汀（1〇vastatin)、普伐他 65 200829600 汀（pravastatin )、辛伐他汀（simvastatin )、丙 丁酚 (probucol )、右方疋甲狀腺素（dextrothyroxine )、那格列 奈（neteglinide )、瑞格列奈（repaglinide ) ; β-阻斷劑， 諸如阿普洛爾（alprenolol )、阿替洛爾（atenolol )、噻 嗎洛爾（timolol )、品多洛爾（pind〇l〇l )、普萘洛爾 (propranolol )及美托洛爾（met〇pr〇1〇1 ) ; ACE (血管緊 張素轉化酶）抑制劑，諸如貝那普利（benazepril )、卡托 晋利（captopril )、依那普利（enaiaprii )、福辛普利 (fosinopril )、賴諾普利（lisin〇pril )、阿拉普利 (alatriopril)、啥那普利（quinapril)及雷米普利（raniipril); 鈣通道阻斷劑，諸如硝苯地平（nifedipine )、非洛地平 (felodipine )、尼卡地平（nicardipine )、伊拉地平 (isradipine )、尼莫地平（nimodipine )、地爾硫卓 (diltiazem )及異搏定（verapamil );及^阻斷劑，諸 如多沙唑嗪（d〇xazosin)、烏拉地爾（urapidil)、哌唑嗪 (prazosin )及特拉唑嗪（teraz〇sin ) ; cart (可卡因苯 丙胺調郎之轉錄產物）促效劑、Νργ (神經肽γ)拮抗劑、 MC4 (黑皮素4)促效劑、食慾激素枯抗劑、tnf (腫瘤 壞死因子）促效劑、CRF (促腎上腺皮質素釋放因子）促 效劑、CRF BP (促腎上腺皮質素釋放因子結合蛋白）括抗 别、尿皮質素促效劑、β 3促效劑、MSH (促黑素細胞素） 促效劑、MCH (黑素細胞聚集素）#抗劑、CCK (縮膽囊 肽）促效劑、血清素再吸收抑制劑、血清素及去甲腎上腺 素再吸收抑制劑、混合型血清素及去腎上腺素能化合物、 66 200829600 5HT (血清素）促效劑、鈴蟾肽促效劑、甘丙肽拮抗劑、 生長激素、生長激素釋放化合物、TRH (促曱狀腺素釋放 激素）促效劑、UCP 2或3 (去偶合蛋白2或3 )調節劑、 瘦體素（leptin )促效劑、DA促效劑（溴隱亭（br〇m〇criptin )、 多普新（doprexin))、脂肪酶/澱粉酶抑制劑、rxr (類 視色素X受體）調節劑、TR β促效劑：組織胺H3拮抗劑； 胃泌素及胃泌素類似物及衍生物。

應瞭解認為本發明之衍生物與一或多種上述化合物及 視情況-或多種其他藥理學活性物f的任何合適之:合在 本發明之範疇内。 據此本文中引用之所有參考文獻，包括公開帛、專利 申請案及專利係以引入的方式全部併入，且其併入之程产 如各參考文獻以引入的方式個別且特定指示： 明於本文中-般（至法律允許之最大程度）。 續 =、方便起見在本文中使㈣有標題及副標題且其不 C視為以任何方式限制本發明。 如（本^中料之任何及所有實例或例示性用語（例如「諸 as」）之使用僅意欲更充分說 另外主張，否則其並不對本發明之範脅造成：月且f非 中之用語不應理解為指示對實 ：:書 要素。 文 < 仕何未主張 亚不反映該等專利文獻 命八！其 任何觀點。 夕性、專利性及/或可執行k 67 200829600 本發明包括適用法律所允許之附加申請專利範圍中所 ♦之標的物質之所有修改形式及等效物。 實施例 實施例1 B25H、A14E、A14E_B25H及人類狹岛素對胃蛋白峰、 胰凝乳蛋白蘇及叛肽酶A之蛋白f水解穩定性（半衰期） 的比較

分別在 ioomMNH4HC〇3(pH81)或 1〇mMHci(pH 2.0)中及25°c下’ a 1GG pL之最終體積培育後，量測人 類胰島素及胰島素類似物（〇〇6 mM，1〇吣）對胰凝乳蛋 白酶或胃蛋白酶（0.34-3.4 μ§)之蛋白質水解穩定性。在 不同時刻（0、5、15、30及60 min)以等體積之〇 5% TFA 或〇.11^士脆（阳8.0)(最終阳7.7)中止樣品且轉 移至5°C。立即藉由RP_HPLC在214 nm下分析人類胰島 素及胰島素類似物且測定對應於完整蛋白質之峰下之面 積。 在 5 mMNaP、140mMNaCI、70PPmTween20(pH7.4) 中及37 C下以400 pL之最終體積培育後，量測人類胰島 素及胰島素類似物（0.06 mM，13·9 pg )對羧肽酶Α ( 6·8此 工作溶液、20 mg/ml、53單位/毫克、Sigma C-9268)之穩 定性。在不同時刻（5、15、30、60 min )以等體積之〇 2〇/〇 TFA中止樣品且轉移至5°C。製備未添加酶之參考樣品（〇 min)。立即藉由RP-HPLC在中性緩衝系統中在214 nm 下分析人類胰島素及胰島素類似物，且測定對應於完整蛋 68 200829600 p，下之面積。對於人類胰島素& deSB30觀測到相 同W邊日守間。自曲食嫌 ,., 自曲線獲付丰衣期（Tm)且計算與人類胰

T 6.7 :去目比之增加/降低倍數（穩定性相對倍數）。對人類騰 …—測定類似半衰期Τι/2= 6 9心，且㈣。人類胰島素 人類胰島素 A14E - B25H ^ DESR^n A ' ----- Γ1/2 (Min) / (倍數） 胃蛋白酶 Ti/2 (Min) /倍數 胰凝乳蛋白酶 Γ1/2 (Min) 竣肽酶A 17.8 (16.2) 25.7 (5.1) 25.7 (2.1)— ~1 ~~〇0) ~ 5Ό~~〇Ό) 6^9 (Γ〇) 3.7 (3.4) 33.2 (6.6) 15.7 (2.3) _ 1.1 (1.0) 42.4 (38.5) 5.0 (1.0) AO ά 1 〇 r： \ 6.9 (1.0) —U (1.0) 〇丄外 V 12.5 ) 5.0 (1.0) 61.9 (9.0) 6.9 (1.0)

B25H A14E、DESB30 無 實施例2 藉由MS分析及酶特異性鐘別换島素内之蛋白酶裂 位點 藉由LC-MS藉由胰島素及胰島素類似物經各種酶（胃 蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶A)之有限蛋白質水解之 時程分析進行蛋白酶裂解位點的鑑別。藉由ms或ms/ms t別所產生之肽片段且在214 nm下量化以鑑別次要及主 要裂解位點（熱點）。隨後鑑別人類胰島素中胃蛋白酶之 熱點（Β24·25、B25_26、B26.27)及胰凝乳蛋白酶之熱點 (B16 17 B24-25、B25-26、B26-27、A14-15 及 A19-20 )。 有趣的是’熱點與胰島素降解酶（IDE )(參見下文）及 、、且織蛋白酶 D 重疊（Hanne Refsgaard，Novo Nordisk A/S， 69 200829600 個人通訊（personal communication))。 亦如下文貫施例3中所示基於胰凝乳蛋白酶、胰蛋白 酶及胰島素降解酶（IDE)之酶特異性預測胰島素序列内 之裂解位點。胰蛋白酶（鹼性殘基，Lys、Arg之c末端）、 彈性蛋白酶（脂族殘基，Ala、Val、Gly、Ser之c末端）、 羧肽酶A (覓特異性，但非Arg、Lys及pr〇)、胃蛋白酶 A (芳族殘基，Trp、Tyr、Phe及Leu及各種其他殘基之N 末端）及胰凝乳蛋白酶（芳族殘基，Trp、Tyr、phe及 之C末端，但非χχχ_ΡΓ0)之預測裂解位點描述於若干生 物化學手冊（hand-books of biochemistry )中。近期已公 開胰島素内之IDE裂解位點：b9_1〇、b1(M1、B13-14、 B14-15、B24-25、B25-26、A13-14、A14-15 ( Duckworth 等人，2006 )，且經展示以下取代抑制胰島素之IDE降解： B 1 0D 及 B4E—B 1 6Q—B 1 7F ( Bennett 等人，2003 )。 實施例3

Al4E、B25H、desB3〇人類胰島素内之熱點鐘別之重 複週期 根據貫施例2中描述之方法鏗別άμε、B25H、desB30 人類騰島素中騰旋乳蛋白酶裂解之主要熱點（B 1 6 -1 7、 B24-25、A19-20)及次要裂解位點（B1-2、B6_7)。基於 鑑別出之裂解位點及自酶特異性預測出之裂解位點設計胰 島素類似物。選擇用於取代之胺基酸殘基以移除裂解位點 且增加溶解性。 胰凝乳蛋白味’基於由A14E、B25H、desB30人類胰 70 200829600 島素之消化產物之LC-MS鐘別出的熱點之類似物設計： A14X1 B25H desB30X12HI B1X2 B6X3 B16X6 B24X8A19X1 1 X1=E/D/H/Q/N/S/T7M/P X2= E/D/H/Q/N/S/TVM/P/原生 aa X3= E/D/H/G/N/S/T/M/P/原生 aa X6= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X8= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa ’ Xll = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X12 = desB30/原生 aa 註釋：人類胰島素中B24及/或A19之取代可能顯著 降低受體親和力。 A14X1 B25P desB30X12 HI B1X2 B6X3 B16X6 B24X8 A19X11 X1=E/D/H/Q/N/S/T/M/P X2= E/D/H/Q/N/S/T/IWP/原生 aa 、 X3= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X6= ED/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X8= E/D/H/Q/N/S/T/m/P/原生 aa Xll= E/D/H/G/N/S/T/M/P/原生 aa X12 = desB30/原生 aa 註釋：B25經Pro取代可能顯著降低胰凝乳蛋白酶在 B24-25處之裂解。 胰凝乳蛋白酶，基於鑑別出及預測出之熱點之設計： 71 200829600 A14X1 B25H desB30X12 HI B1X2 B6X3 B11X4 B15X5 B16X6 B17X7 B24X8 A13X9 A16X10A19X11 X1=E/D/H/Q/N/S/T/M/P X2= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X3= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X4= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X5= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X6= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X7= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X8= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X9= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X10= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa XI 1= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X12 = desB30/原生 aa 註釋：人類胰島素中Bll、B15、B24、A13、A16及/ 或A1 9之取代可能顯著降低受體親和力。 胰凝乳蛋白酶+肤蛋白酶，基於鐘別出及預測出熱點 之設計： A14X1 B25H desB30X12 HI B1X2 B6X3 B11X4 B15X5 B16X6 B17X7 B24X8 A13X9 A16X10 A19X11 B22X13 X1=E/D/H/Q/N/S/T/M/P X2= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X3= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X4= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa 72 200829600 ’ X5= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X6= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X7二 E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X8= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X9= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X10= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa Xll = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X12二desB30/原生 aa f:' X13= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa 胰凝乳蛋白酶+胰蛋白酶+胰島素降解酶（IDE)，基 於鑑別出及預測出之熱點之設計： A14X1 B25H desB30X12 HI B1X2 B6X3 B11X4 B15X5 B16X6 B17X7 B24X8 A13X9 A16X10 A19X11 B22X13 B4X14 B9X15 B10X16 B13X17 B14X18 X1=E/D/H/Q/N/S/T/M/P X2= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa 、 X3= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X4= E/D/H/G/N/SAT/M/P/原生 aa X5= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X6= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X7= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X8= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X9= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X10二 E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa 73 200829600 • XI 1= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X12= desB30/原生 aa X13= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X14= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X15= E/D/H/Q/N/S/TM/P/原生 aa X16= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X17= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa X18= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/原生 aa Γ 實施例4 胰島素類似物對胰凝乳蛋白酶之蛋白質水解n定& (半衰期） 在穩定性檢定中測試胰島素類似物且根據實施例丨_ 描述之方法藉由半衰期增加鑑別對蛋白質水解消化顯# 性增加的類似物。結果證明進一步改良之胰島素類似物生 物可用性增加之潛力係歸因於對蛋白質水解降解之抗# # 加及溶解性提高。 〔 已相對於人類胰島素測試以下胰島素類似物對月夷 •芙更寺L» 蛋白酶之穩定性： 胰島素類似物 SSSFi A14E、B25H、desB27、desB28、desB29、desB30 人類 膜島素 43X A8H、A14E、B25H、B27E、desB30 人類胰島素 38.9 ΕΕΑΕΑΕΑΡΚ-Β(1-29)·Β25Η-ΑΑΚ·Α(1-21)-Α14Ε 人類胰 島素 33.2 74 200829600 A8H、A14E、ΒΙΕ、B25H、B27E、desB30 人類胰島素 22.8 A14E、B25H、B28D、desB30 人類胰島素 17.4 A14E、B25H、B26D、desB30 人類胰島素 16.6 A14E、B25H、B27E、desB30 人類胰島素 14.1 A8H、A14E、B25H、desB30 人類胰島素 13.3 A8H、A14E、B10E、B25H、desB30 人類胰島素 12.6 A14E、B25H、desB30 人類胰島素 12.5 A14E、ΒΙΕ、B25H、B27E、desB30 人類胰島素 11.9 A8H、A14E、ΒΙΕ、B25H、desB30 人類胰島素 10.2 A8H、A14E、ΒΙΕ、B15E、B25H、B27E、desB30 人 類月夷島素 8.3 A14D、B25H、desB30 人類胰島素 7.9 A14E、B27E、desB30 人類胰島素 7.7 A14E、B28D、desB30 人類胰島素 7.5 A8H、B10D、B25H人類胰島素 7.4 A14E、ΒΙΕ、B16E、B25H、B27E、desB30 人類胰島 素 5.5 A14E、ΒΙΕ、B25H、desB30 人類胰島素 4.8 A14H、B25H、desB30 人類胰島素 4.5 A14E、B25H人類胰島素 4.1 A14E、ΒΙΕ、B27E、desB30 人類胰島素 3.9 A8H、A14E、B16E、B25H、desB30 人類胰島素 2.3 A14E、B16E、B25H、desB30 人類胰島素 2.1 人類胰島素（參照） 1 實施例5 胰島素類似物對大鼠勝（十二指勝腔）提取物之蛋白 質水解穩定性測試胰島素類似物對腸提取物中蛋白質水解 降解之穩定性。藉由洗滌禁食動物之腸腔内含物製備提取 物。以稀釋之提取物在37°C在pH = 7.4下培育胰島素類似 物且培育20 h後，藉由RP-HPLC測定完整化合物之濃度。 比較完整胰島素類似物與完整人類胰島素之相對量。發現 人類胰島素與類似物A14E B25H desB30人類胰島素之間 75 200829600 ▲ 的穩定性存在約5_1〇倍之差異 【圖式簡單說明】 圖 1 * 曰、》 ^ •里測為3 7°C下完整胰島素（類似物）之百分數 的廣姨島素（HI)及胰島素類似物針對胰凝乳蛋白 蛋白質水解穩定性。 固2 ··量測為 百分數 之蛋白 1 70上π甸I {類似始j、 的人類胰島素（ΗΙ)及胰島 、 質水解穩定性。 *類似物針對胃蛋白 【主要元件符號說明】 無 76 200829600 序列表 / \ <110> 諾佛·儂迪克股份有限公司 <120> 蛋白酶抗性之胰島素類似物 <130> 7484.204-WO <160> 4 <170> PatentIN 3.4 版 <21〇> <21]> <212> <213> 1 2S PRT 人工 <220> <223> 經修飾之胰島素A鏈 <220> <221> <222> <223> MISC-FEATURE ⑴· ·⑴ Xaa木存在或為Gly <220> <221> <222> <223> MISC^FEATURE (2)·.(2) 、 Xaa不存在或為Pro <220> <221> <222> <22B> MISC—FEATURE (3)..(3) Xaa不存在或為Pro <220> <221> <222> <223> MISC.FEATURE (11)、，.（11)、 iaa 為 Thr 或 His <220> <221> <222> <223> MISCLFEATURE Xaa^Sers Asp或Glu <220> <221> <222> <223> MISC一 FEATURE ¢16)..(16) Xaa^Leu> Thr、Asn、 Asp、 <220> <221> <222> <223> MISC—FEATURE (17) (17) Xaa為Tyr、 Thr、 Asn、 Asp、 <220> <221> <222> <223> MISC一 FEATURE ¢18)..(18) Xaa為Gin、 Asp或Glu <220> <221> <222> <223> MISC^FEATURE (21)..(21) Xaa為Asn、 Lys或Gin 1 200829600 <220> <221> MISC.FEATURE (24)··(24)、 <223> Xaa 為 Asn 或 Gin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) iaa不存在或為Lys <4〇〇> 1 xaa Xaa Xaa Gly lie val Glu Gin Cys Cys 1 5 10 xaa xaa Leu Glu xaa Tyr cys xaa xaa 20 25 <210> 2 <21上> 35 <212> PRT <213>人工 <22〇>

<223>經修飾之胰島素B鏈 <220> <221> MI5CL,FEATURE <222> (1) · · (1) <223> Xaa不存在或為Gly <220>

<221> MISC.FEATURE <222> (2) ..(2) <223> Xaa不存在或為Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa不存在或為Pro <220> <222> MI5CL.FEATURE <222> ⑷.·（4) <223> Xaa不存在，為Phe或Glu <220> <221> <222> <22B>

M1SCJEATURE ¢5).,(5)

Xaa不存在或為Val <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa不存在，為Asn或Gin <220> <221> MISC.FEATURE <222> (7) ·.⑺ <223> xaa 為 Gin 或 Glu <220> <221> MISC^FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa為His、Asp、Pro或Glu 200829600 <220>

<221> MISC一 FEATURE <222> (19〕··（19〕 、 <223> Xaa為Tyr、Asp、Gin、His、Arg或Glu c <220> <221> <222> <223>

MISC_FEATURE (27),.. (27) 文aa爲Phe或His <220> <221> MISCL.FEATURE <222> (28).·(28) <223> Xaa 為 Phe 或 His <220> <221> MISC一 FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa木荐在，為Tyr、His、Thr、Gly或Asp <220> <221> MISC^FEATURE <222> (30),,(30) Xaa不存¢,為1113：、Asn、Asp、Gin、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser或Glu <220> <221> MISC-FEATURE <222> (31)··(31) <223> Xaa不存在，為Pro、His、Gly或Asp <220> <221> MISC一 FEATURE <222> (32)..(32)、 <223> Xaa不存在，為Lys或Gin <220> <22I> MISC-FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa不存在或為Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa不存在或為Leu <220> <221> MI5C_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa不存在或為Glu <400> 2 xaa Xaa xaa 1 Ala Leu xaa

Xaa xaa xaa xaa His Leu Cys Gly Ser xaa Leu val Glu 5 10 15

Leu val Cys Gly Glu Arg Gly Xaa xaa Xaa Xaa xaa Xaa 20 25 30

Xaa Xaa Xaa 35 <210> <211> 3 21 3 200829600 <212> PRT <213>人工 <220> <223>經修飾之胰島素A鏈 <22〇> <221> MISC一 FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa 為 Thr 或 His <220> <221> MISCL.FEATURE <222> (12〕、..（12〕 、 <223> Xaa為Ser、Asp或Glu <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (13〕. CB) 、 <223> kaa為Leu、 Thr、 Asn、 Asp、 Gin、 His、 Lys、 Gly、 Arg、 Pro、 Ser或Glu <220> f \

<221> MISC_FEATURE <222> (14〕，.·（14〕

Xaa為Tfir、Asn、Asp、Gin、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser或Glu <220> <221> MISC.FEATURE <222> (15)..(15〕 、 <223> Xaa為Gin、Asp或Glu <220> <221> MISCL.FEATURE <222> (18)..(18) 、 <223> Xaa為Asn、Lys或Gin <220> <221> MISC一 FEATURE <222> (21)..(21) xaa^Asn 或 Gin <4〇〇> 3

Gly lie val Glu Gin cys cys xaa ser lie cys xaa xaa xaa xaa Leu

15 10 IS

Glu xaa Tyr Cys xaa 20 <210> 4 <211> BO <212> PRT <213>人工 <220> <223>經修飾之胰島素B鏈 <220> <221> MI5C.FEATURE <222> (1),·(1) <223> Xaa為fhe或Glu 4 <220> 200829600

V <221> MISC-FEATURE <222> C3)..(3) <223> jiaa 為 Asn 或 Gin <220> <22I> MISC^FEATURE <222> (4)..(4)

Xaa 為 Gin 或 Glu <220> <221> MISC-FEATURE <222> (10)..(10) c223> Raa為His、Asp、Pro或Glu <220>

<221> MISC^FEATURE <222> (16〕· ·（16) 、 <223> Xaa為Tyr、Asp、Gin、His、Arg或Glu <220> <221> MISC^FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa 為 Phe 或 His <220> <221> MISC.FEATURE <Z22> (26)..(26) <223> Xaa木存在，為Tyr、His、Thr、Gly或Asp <220> <221> MI5CL.FEATURE <222> (27〕··（27) <223>》aa不存在，為Thr、Asn、Asp、Gin、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser或Glu <220>

<221> MISC^FEATURE <222> 〔28〕.·C28)、 <223> Xaa不存在，為Pro、His、Gly或Asp <220> <221> MISC一FEATURE <222> (29)..(29)、 <223> Xaa不存在，為Lys或Gin <220> <221> <222> <223>

MISCL.FEATURE £?本認)或為Thr <400> 4 xaa val xaa xaa His Leu cys Gly Ser Xaa Leu val Glu Ala Leu xaa 15 10 15

Leu val cys f〇y Cla Arg Gly Xaa His xaa Xaa xaa xaa xaa 5

Claims (1)

1. 200829600 十、申請專利範園： 種騰島素類似物，其中相對於親本胰島素至少兩 個疏水性胺基酸p奴 I已、、二親水性胺基酸取代，其中該等取代係 位於該親本M 11β1 , 紙馬京之兩個或兩個以上蛋白酶裂解位點中或 與其緊鄰，且盆Φ 6 /、τ δ亥胰島素類似物視情況進一步包含一或 多個其他突變。 申明專利範圍苐1項之胰島素類似物，其中相對 於°亥親本姨島素’該胰島素類似物之Α鏈包含至少一個突 f 變且該胰島素類似物之B鏈包含至少一個突變。 3 ·如申晴專利範圍第1或2項中任一項之胰島素類似 物〃相對於5玄親本蛋白質對一或多種蛋白酶展示增加之 穩定性。 4 ·如申請專利範圍第1或2項中任一項之胰島素類似 物’其包含式1之A鏈胺基酸序列： ^aaA(-2)-XaaA(_1)-XaaA0-Gly-Ile-V al-Glu-Gln-Cys-Cys-X a a a 8 S e r 11 e - C y s - X a a a 12_ X a a a 13 _ X a a a 14 "* X a a a 15 - L e u - G1 u - / i XaaA18-Tyr-Cys_XaaA21_Xaa22 式（1 ) ( SEQ ID No: 1 ) 及式2之B鏈胺基酸序列·· XaaB(.2)-XaaB(_i)-XaaB〇-XaaBi-XaaB2-XaaB3-XaaB4-His- Leu-Cys-Gly-Ser-XaaB10-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaB16-Leu- Val-Gys-Gly-Glu-Arg-Gly-XaaB24-XaaB25_XaaB26-XaaB27_ XaaB28-XaaB29-XaaB3〇-XaaB3 1- XaaB32 式（2) ( SEQ ID No: 2)， 77 200829600 羲 、 其中： XaaA{_2)不存在或為Gly ; XaaA(-i)不存在或為Pro ; XaaAG不存在或為pr〇 ; XaaA8係獨立地選自Thr及His ; XaaAi2係獨立地選自Ser、Asp及Glu ; XaaAi3 係獨立地選自 Leu、Thr、Asn、Asp、Gin、His、 Lys、Gly、Arg、Pro、Ser 及 Glu ; XaaA14 係獨立地選自 Tyr、Thr、Asn、Asp、Gin、His、 Lys、Gly、Arg、pro、Ser 及 Glu ; XaaA15係獨立地選自Gin、Asp及Glu ; XaaA18係獨立地選自Asn、Lys及Gin ; XaaA21係獨立地選自Asn及Gin ; XaaA22不存在或為LyS ; XaaB(_2)不存在或為Gly ; XaaB(.n不存在或為Pr〇 ; XaaBG不存在或為Pr〇 ; XaaB1不存在或獨立地選自phe及Glu ; XaaB2不存在或為vai ; XaaB3不存在或獨立地選自Asn及Gin ; XaaB4係獨立地選自Gin及Glu ; XaaB1G係獨立地選自ms、Asp、Pr〇及Glu ; XaaB16 係獨立地選自 Tyr、Asp、Gin、His、Arg 及 Glu ; XaaB24係獨立地選自Phe及His ; 78 200829600 4 XaaB25係獨立地選自phe及His ; XaaB26不存在或獨立地選自Tyr、HiS、Thr、Gly&Asp; XaaB27不存在或獨立地選自Thr、Asn、Asp、Gin、His、 Lys、Gly、Arg、Pro、Ser 及⑽； XaaB28不存在或獨立地選自pr〇、ms、Giy及Asp; XaaB29不存在或獨立地選自及⑴n; XaaB3G不存在或為Thr ; XaaB3i不存在或為Leu ; XaaB32不存在或為giu ; C末端可視情況衍生為醯胺； 其中該A鏈胺基酸序列與該B鏈胺基酸序列係由該a 鏈之位置7上的半胱胺酸與該B鏈之位置7上的半胱胺酸 之間，及該A鏈之位置2〇上的半胱胺酸與該B鏈之位置 19上的半胱胺酸之間的二硫橋連接，且其中該a鏈之位置 6及11上的半胱胺酸係經二硫橋連接； 其中視情況N末端A鏈胺基酸序列由包含3_7個胺基 酉欠之胺基馱序列與c末端B鏈胺基酸序列連接以形成單鏈 胰島素分子，其中視情況該B鏈之該N末端經卜“個胺 基酸延伸； 其中右 XaaA8 為 Thr，且 XaaA12 為 Ser，且 xaaAn 為 Leu， 且 XaaA14 為 Tyr，則 XaaA15 為 Glu 或 Asp ;且 其中若 XaaB24 為 Phe，且 XaaB25 為 Phe，且 XaaB26 為 Tyr，且 XaaB27 為丁hr，且 XaaB28 為 Pr〇，則 XaaB29 為 _。 5·如申請專利範圍第1或2項中任一項之胰島素類似 79 200829600 物’其在治療或預防鬲血糖症、第二型糖尿病、葡萄糖耐 受不良、第一型糖尿病、肥胖症、χ症候群及異常血脂症 中用作藥物。 6·如申請專利範圍第丨或2項中任一項之胰島素類似 物’其在延遲或防止第二型糖尿病之疾病進展中用作藥 物。

   7·如申明專利範圍第丨或2項中任一項之胰島素類似 物，其在降低食物攝人、降低卜細胞計、增力口 M田胞功 能及β'細胞質量及/或恢復ρ·細胞之葡萄糖敏感性中用作 藥物。 種请樂組合物，其包含生物學上有效量之如申請 專利範圍帛^項中任一項之胰島素類似物及醫藥學上可 接受之載劑。 =種如巾請㈣範㈣項中任_項之騰島素類 二:其係用於製備用於治療、預防或緩解個體中 =、症H糖尿病、㈣糖耐受不良、第-型糖尿 巧肥胖症、X症候群或異常血脂症之醫藥品。 10.如申請專利範圍第9項 ' °口 於經口投藥。 用途，其中該醫藥品係用 u·—種核酸序列，其編碼如中 任—項之胰島素類似物。 ^專利_第Μ項中 I2·—種用於製備如申請專利範 的方法，*包含將如申請專利範圍第二8項之醫藥組合物 島素類似物與醫藥學上可接 ：$中任-項之胰 胃或靖形劑混合。 80