BRPI0717098A2

BRPI0717098A2 - Análogos de insulina resistentes à protease

Info

Publication number: BRPI0717098A2
Application number: BRPI0717098-0A2A
Authority: BR
Inventors: Peter Kresten Nielsen; Frantisek Hubalek; Inger Lautrup-Larsen; Svend Ludvigsen; Ulla Ribel-Madsen; Per Balschmidt; Per Norgaard; Svend Havelund
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 2006-09-22
Filing date: 2007-09-20
Publication date: 2013-10-08
Also published as: NO20091563L; US20100009898A1; KR101729986B1; EP2404934A1; KR101699370B1; IL197609A; TW200829600A; JP2014129355A; RU2009114324A; KR20150031494A; CA2663074A1; BRPI0717098B1; CN101541830A; PT2074141T; EP2074141A1; DK2074141T3; EP2074141B1; ES2601839T3; WO2008034881A1; PL2074141T3

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANÁLOGOS DE INSULINA RESISTENTES À PROTEASE".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a novos análogos de insulina que exibem resistência em relação à protease, a um método para a preparação de tais análogos de insulina, a preparações de insulina que contêm os aná- logos de insulina da invenção e a um método de tratamento de diabetes mel- Iitus usando estes análogos de insulina. Antecedentes da Invenção

A via oral é, de longe, a via mais amplamente utilizada para administração de fármaco e é em geral muito bem tolerada por pacientes, especialmente para terapias crônicas. A administração de peptídeos ou proteínas terapêuticas é, no entanto, muitas vezes limitada a vias parente- rais ao invés da administração oral preferencial devido a várias barreiras, tais como degradação enzimática no trato gastrointestinal (Gl), bombas de efluxo de droga, absorção insuficiente e variável da mucosa intestinal, bem como metabolismo de primeira passagem no fígado. A insulina humana é degradada por várias enzimas digestivas encontradas no estômago (pepsina), no lúmen intestinal (quimotripsina, tripsina, elastase, carboxipepti- dases, etc.) e em superfícies mucosas do trato Gl (aminopeptidases, carboxipeptidases, enteropeptidases, dipeptidil peptidases, endopeptidases, etc.).

Isto é inoportuno porque muitos peptídeos e muitas proteínas provaram ser clinicamente eficazes e poderiam ter uma utilização mais ge- neralizada se fáceis de administrar e aceitáveis para os destinatários.

Diabetes mellitus é um distúrbio metabólico no qual a capacida- de de utilização da glicose é em parte ou completamente perdida. Aproxima- damente 5% de todas as pessoas sofrem de diabetes e o distúrbio aproxima- se de proporções epidêmicas. Desde a introdução da insulina nos anos 1920, esforços contínuos foram feitos para melhorar o tratamento da diabetes melli- tus. Como as pessoas que sofrem de diabetes estão sujeitas a tratamento crônico ao longo de várias décadas, existe uma grande necessidade de formulações de insulina seguras, adequados e que melhorem a qualidade de vida.

No tratamento da diabetes mellitus, muitas variedades de formu- lações de insulina foram sugeridas e usadas, tais como insulina regular, insu- Iina isofana (chamada NPH), a suspensão de insulina zinco (tais como Semi- lente®, Lente® e Ultralente®), e insulina isofana bifásica. Algumas das formula- ções comerciais de insulina disponíveis são caracterizadas por um rápido iní- cio de ação e outras formulações têm um início relativamente lento, mas mos- tram uma ação mais ou menos prolongada. Formulações de insulina de ação rápida são normalmente soluções de insulina, enquanto as formulações de insulina de atuação retardada podem ser suspensões que contêm insulina em forma cristalina e/ou amorfa precipitada apenas pela adição de sais de zinco ou pela adição de protamina ou por uma combinação de ambos.

A insulina humana é composta de duas cadeias polipeptídicas, cadeias AeB que contêm 21 e 30 resíduos de aminoácido, respectivamen- te. As cadeias AeB são interligadas por duas pontes dissulfeto. A insulina na maior parte de outras espécies é semelhante, mas podem conter substi- tuições de aminoácidos em algumas posições. Na década passada, diversos análogos de insulina humana foram desenvolvidos. São projetados para de- terminados perfis de ação, isto é, atuação rápida ou ação prolongada. Os produtos comercialmente disponíveis compreendendo tais análogos de insu- lina incluem Levemir®, NovoRapid®, Humalog®, Apidra® e Lantus®.

Normalmente, as formulações de insulina são administradas através de injeção subcutânea. No entanto, a administração pela via oral seria vantajosa devido

à adaptação, segurança e conveniência para o paciente.

A administração oral de fármacos proteicos, tais como insulina, muitas vezes resulta em biodisponibilidade muito baixa devido a barreiras enzimáticas e de absorção. A abordagem geral para a liberação do peptídeo e da proteína é a administração parenteral que é invasiva e inconveniente. Por isso, vias não-invasivas como produtos farmacêuticos baseados na libe- ração oral da proteína são cada vez mais investigados. Desenhos recentes de formulação para a liberação oral de proteína/peptídeo incluem coformula- ções com inibidores de protease, potencializadores de permeação, sistemas de liberação baseados em polímeros e conjugados de insulina. O último in- clui hexil-insulina-monoconjugada-2 (HIM2) (Nobex Cooperation e GSK), um análogo de insulina humana com um grupo 7-hexil PEG anexado a B29. Por exemplo, US 7.030.082, US 6.867.183 e US 6.770.625, HIM2 oral foi relata- da ter estabilidade proteolítica e biodisponibilidade aumentada em compara- ção com a insulina. Sumário da Invenção Em uma modalidade da invenção um análogo de insulina com

estabilidade proteolítica potencializada e atividade biológica de insulina con- servada é fornecido.

Em uma modalidade adicional da invenção, um análogo de insu- lina é fornecido em que pelo menos dois aminoácidos são substituídos e/ou deletados em relação à molécula de insulina precursora.

Ainda em uma modalidade adicional da invenção, é fornecido um análogo de insulina em que pelo menos dois aminoácidos hidrofóbicos foram substituídos com aminoácidos hidrofílicos em relação à insulina pre- cursora, em que as substituições estão dentro ou na proximidade de dois ou mais sítios de clivagem de protease da insulina precursora e em que tal aná- logo de insulina opcionalmente ainda compreende uma ou várias mutações adicionais.

É também um objetivo da invenção fornecer análogos de insuli- na de acordo com a invenção em que a cadeia A do análogo de insulina compreende pelo menos uma mutação e a cadeia B do análogo de insulina compreende pelo menos uma mutação e, relação à insulina precursora.

A presente invenção também está relacionada a seqüências de ácido nucleico que codificam para os pré-propeptídeos dos análogos de in- sulina reivindicados. Em uma modalidade adicional, a presente invenção está relacionada a vetores que contêm tais seqüências de ácido nucleico e células hospedeiras que contêm tais seqüências de ácido nucleico ou veto- res. Um processo para obtenção de um análogo de insulina, de acordo com a invenção, e o uso dos mesmos de uso como um produto far- macêutico também é fornecido. Descrição das Figuras Figurai: estabilidade proteolítica da insulina humana (IH) e aná-

logos de insulina em relação à quimotripsina, medida como percentagem de insulina intacta (análoga) a 37°C.

Figura 2: estabilidade proteolítica da insulina humana (IH) e aná- logos de insulina em relação à pepsina, medida como percentagem de insu- Iina intacta (análoga) a 25°C. Descrição da Invenção

Um análogo de insulina de acordo com a invenção é uma molé- cula de insulina que tem duas ou mais mutações das cadeias de aminoácido A e/ou B em relação a molécula de insulina precursora. Foi verificado que substituindo dois ou mais aminoácidos hidro-

fóbicos dentro de ou na proximidade de dois ou mais sítios de protease em uma insulina com aminoácidos hidrofílicos, é obtido um análogo de insulina que é o estável proteoliticamente em comparação à insulina precursora.

A seguir está uma lista não-restritiva de modalidades, que é ain- da descrita em outro lugar neste pedido.

Modalidade 1. Um análogo de insulina em que pelo menos dois aminoácidos hidrofóbicos foram substituídos com aminoácidos hidrofílicos em relação à insulina precursora, em que as substituições estão dentro ou na proximidade de dois ou mais sítios de clivagem de protease da insulina precursora e em que tal análogo de insulina opcionalmente ainda compreen- de uma ou várias mutações adicionais.

Modalidade 2. Um análogo de insulina de acordo com a modali- dade 1 em que o aumento da solubilidade em relação à insulina precursora é obtido.

Modalidade 3. Um análogo de insulina de acordo com qualquer

uma das modalidades 1 a 2 em que a cadeia A do análogo de insulina com- preende pelo menos uma mutação e a cadeia B do análogo de insulina compreende pelo menos uma mutação em relação à insulina precursora.

Modalidade 4. Um análogo de insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 3 em que o análogo de insulina compreende ainda pelo menos uma substituição de aminoácido em um sítio da protease de um primeiro análogo de insulina modificado, em que a pelo menos uma dita substituição de aminoácido é tal que pelo menos um aminoácido hidrofóbico foi substituído com pelo menos um aminoácido hidrofílico.

Modalidade 5. Uma insulina análoga de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4 em que · O aminoácido na posição A12 é Glu ou Asp e/ou o aminoá-

cido na posição A13 é His1 Asn1 Glu ou Asp e/ou o aminoácido na posição A14 é Asn1 Gln, Glu1 Arg1 Asp, Gly ou His e/ou o aminoácido na posição A15 é Glu ou Asp; e

• O aminoácido na posição B24 é His e ou o aminoácido na posição B25 é His e/ou o aminoácido na posição B26 é His, Gly, Asp ou Thr e/ou o aminoácido na posição B27 é His1 Glu1 Lys, Gly ou Arg e/ou o amino- ácido na posição B28 é His1 Gly ou Asp; e

que opcionalmente ainda compreende uma ou várias mutações

adicionais.

Modalidade 6. Um análogo de insulina de acordo com qualquer

uma das modalidades 1 a 5 em que o aminoácido na posição A14 é Glu1 Asp ou His, o aminoácido na posição B25 é His e que opcionalmente ainda com- preende uma ou várias mutações adicionais.

Modalidade 7. Um análogo de insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 6 em que o aminoácido na posição A14 é Glu1 Asp ou His, o aminoácido na posição B25 é His e o aminoácido na posição B30 é deletado.

Modalidade 8. Um análogo de insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 6 em que o aminoácido na posição A14 é Glu, Asp ou His e o aminoácido na posição B25 é His.

Modalidade 9. Um análogo de insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 6 em que uma ou várias mutações adicionais são selecionadas de um grupo consistindo em: A(-3)Gly, A(-2)Gly, A(-1)Pro, A(O)Pro1 A8His, A18Gln, A18Gln, A21Gln, A21Gly, B(-3)Gly, B(-2)Gly, B(- 1)Pro, B(O)Pro1 BIGIu1 BIGIn1 ro, BIGIu1 BIGIn1 B3Gln, BIOPro1 B14Thr, B16Glu, B17Ser, B26Asp, DesB26, DesB27, B27Glu, B27Glu, B28Asp, desB28, desB29, desB30, B31Leu, B32Glu.

Modalidade 10. Um análogo de insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 6 ou 9 em que a mutação adicional é desB30.

Modalidade 11. Um análogo de insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 10 em que A14 é Glu.

Modalidade 12. Um análogo de insulina de acordo com qualquer

uma das modalidades 1 a 11 que mostra o aumento da estabilidade em rela- ção a uma ou várias enzimas proteases em relação à proteína precursora.

Modalidade 13. Um análogo de insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 12 que mostra o aumento da estabilidade em rela-

ção a duas ou mais enzimas proteases, em relação a proteína precursora.

Modalidade 14. Um análogo de insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 13 em que a insulina precursora é selecionada de um grupo consistindo em:

• insulina humana;

· um análogo de insulina da insulina humana em que o resí-

duo de aminoácido na posição B28 é Pro1 Asp1 Lys1 Leu1 Val ou Ala e o resí- duo de aminoácido na posição B29 é Lys ou Pro e opcionalmente o resíduo de aminoácido na posição B30 é deletado;

• insulina humana des (B26-B30), insulina humana des (B27-

B30), insulina humana des (B28-B30), insulina humana des (B29-B30), insu- lina humana des (B27) ou insulina humana des (B30);

• um análogo de insulina da insulina humana em que o resí- duo de aminoácido na posição B3 é Lys e o resíduo de aminoácido na posi- ção B29 é Glu ou Asp;

· um análogo de insulina da insulina humana em que o resí-

duo de aminoácido na posição A21 é Gly e em que o análogo de insulina é ainda estendido no Terminal C com dois resíduos Arg; • um derivado de insulina em que o resíduo de aminoácido na posição B30 é substituído com uma treonina metil éster; e

• um derivado de insulina em que é anexada à posição Νε da Iisina na posição B29 da des (B30) insulina humana uma cadeia tetradeca-

noíla.

Modalidade 15. Um análogo de insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 6, 9 ou 11 a 14 em que uma ou várias mutações adicionais são selecionadas para potencializar a estabilidade química da insulina.

Modalidade 16. Um análogo de insulina de acordo com a moda-

lidade 15 em que uma ou várias mutações adicionais são selecionadas de um grupo consistindo em: A18G!n, A21Gln, A21GLy e B3G)n.

Modalidade 17. Um análogo de insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4 ou 12 a 14 compreendendo uma seqüência de

aminoácidos de cadeia A da fórmula 1:

XaaA(-2)-XaaA(-i)-XaaAo-Gly-lle-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-XaaA8-Ser- lle-Cys-XaaAi2-XaaAi3-XaaAi4-XaaAi5-Leu-Glu-XaaAi8-Tyr-Cys-XaaA2i-XaaA22

Fórmula (1) (SEQ ID N0:1)

e uma seqüência de aminoácidos de cadeia B da fórmula 2:

XaaB(.2)-XaaB(-i)-XaaBo-XaaBrXaaB2-XaaB3-XaaB4-His-Leu-Cys-

Gly-Ser-XaaBio-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaBi6-Leu-VaI-Cys-GIy-GIu-Arg-GIy- XaaB24-XaaB25-XaaB26-XaaB27-XaaB28-XaaB29-XaaB30-XaaB3i-XaaB32

Fórmula (2) (SEQ ID N°:2)

em que

XaaA (.2) é ausente ou Gly;

XaaA (.η é ausente ou Pro;

XaaAo é ausente ou Pro;

XaaAs é independentemente selecionado a partir de Thr e His;

XaaAi2 é independentemente selecionado a partir de Ser, Asp e

Glu;

XaaAi3 é independentemente selecionado a partir de Leu, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; XaaAi4 é independentemente selecionado a partir de Tyr1 Thr1 Asn1 Asp, Gln1 His1 Lys1 Gly1 Arg1 Pro, Ser e Glu;

XaaAi5 é independentemente selecionado a partir de Gln1 Asp e

Glu;

Gln;

XaaAie é independentemente selecionado a partir de Asn, Lys e

XaaA2i é independentemente selecionado a partir de Asn e Gln; XaaA22 é ausente ou Lys; Xaa8 (-2) é ausente ou Gly; Xaae (-1) é ausente ou Pro;

Xaaeo é ausente ou Pro;

Xaaei é ausente ou é independentemente selecionado a partir de Phe e Glu;

XaaB2 é ausente ou Vai; Xaae3 é ausente ou é independentemente selecionado a partir

de Asn e Gln;

XaaB4 é independentemente selecionado a partir de Gln e Glu; Xaa βίο é independentemente selecionado a partir de His1 Asp,

Pro e Glu;

XaaBi6 é independentemente selecionado a partir de Tyr1 Asp,

Gln, His1 Arg, e Glu;

XaaB24 é independentemente selecionado a partir de Phe e His; XaaB25 é independentemente selecionado a partir de Phe e His; Xaae26 é ausente ou é independentemente selecionado a partir de Tyr, His, Thr, Gly e Asp;

XaaB27 é ausente ou é independentemente selecionado a partir de Thr, Asn1 Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu;

XaaB28 é ausente ou é independentemente selecionado a partir de Pro, His, Gly e Asp; Xaas29 é ausente ou é independentemente selecionado a partir

de Lys e Gln;

XaaB3o é ausente ou Thr; XaaB3i é ausente ou Leu; Xaae32 é ausente ou Glu;

o Terminal C pode ser opcionalmente derivatizado como uma

amida;

em que a seqüência de aminoácidos da cadeia Aea seqüência

de aminoácidos da cadeia B são unidas por pontes dissulfeto entre as cisteí- nas na posição 7 da cadeia Aea cisteína na posição 7 da cadeia B, e entre a cisteína na posição 20 da cadeia Aea cisteína na posição 19 da cadeia B e em que as cisteínas na posição 6 e 11 da cadeia A são unidas por uma ponte dissulfeto;

em que opcionalmente a seqüência de aminoácidos da cadeia A do Terminal N está unida à seqüência de aminoácidos da cadeia B Terminal C por uma seqüência de aminoácidos compreendendo 3 a 7 aminoácidos para formação de uma molécula de insulina de cadeia única, em que opcio- nalmente o Terminal N da cadeia B é estendido com 1 a 10 aminoácidos;

em que se XaaA8 é Thr e XaaAi2 é Ser e XaaAi3 é Leu e XaaAi4 é Tyr1 então XaaAi5 é Glu ou Asp; e

em que se XaaB24 é Phe e XaaB25 é Phe e XaaB26 é Tyr e XaaB27 é Thr e XaaB2eé Pro1 então XaaB29 Gln. Modalidade 18. Um análogo de insulina de acordo com qualquer

uma das modalidades 1a4ou12a14 compreendendo uma seqüência de aminoácidos da cadeia A da fórmula 3:

Gly-lle-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-XaaA8-Ser-lle-Cys-XaaAi2-XaaAi3- XaaAi4-XaaAi5-Leu-Glu-XaaA18-Tyr-Cys-XaaA2i Fórmula (3) (SEQ ID N°:3)

e uma seqüência de aminoácidos da cadeia B da fórmula 4: XaaBi-Val-XaaB3-XaaB4-His-Leu-Cys-Gly-Ser-XaaBio-Leu-Val- Glu-Ala-Leu-XaaBi6-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-XaaB24-His-XaaB26-XaaB27- XaaB2 8-XaaB29-XaaB3o Fórmula (4) (SEQ ID N°:4)

em que

XaaA8 é independentemente selecionado a partir de Thr e His; XaaAi2 é independentemente selecionado a partir de Ser, Asp e

Glu;

XaaAi3 é independentemente selecionado a partir de Leu, Thr1 Asn1 Asp, Gln, His1 Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; XaaAi4 é independentemente selecionado a partir de Thr, Asn,

Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro1 Ser e Glu;

XaaAi5 é independentemente selecionado a partir de Gln, Asp e

Glu;

XaaAi8 é independentemente selecionado a partir de Asn, Lys e

Gln;

XaaA2i é independentemente selecionado a partir de Asn, e Gln; XaaBi é independentemente selecionado a partir de Phe e Glu; XaaB3 é independentemente selecionado a partir de Asn e Gln; XaaB4 é independentemente selecionado a partir de Gln e Glu; XaaBio é independentemente selecionado a partir de His, Asp,

Pro e Glu;

XaaBi6 é independentemente selecionado a partir de Tyr, Asp, Gln, His, Arg, e Glu;

XaaB24 é independentemente selecionado a partir de Phe e His; XaaB26 é ausente ou independentemente selecionado a partir de

Tyr, His, Thr, Gly e Asp;

XaaB27 é ausente ou independentemente selecionado a partir de Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu;

XaaB28 é ausente ou é independentemente selecionado a partir de Pro, His, Gly e Asp;

XaaB29 é ausente ou independentemente selecionado a partir de

Lys e Gln;

XaaB3o é ausente ou Thr;

o Terminal C pode ser opcionalmente derivatizado como uma

amida;

em que a seqüência de aminoácidos da cadeia Aea seqüência de aminoácidos da cadeia B são unidas por pontes dissulfeto entre as cisteí- nas na posição 7 da cadeia Aea cisteina na posição 7 da cadeia B, e entre a cisteina na posição 20 da cadeia Aea cisteina na posição 19 da cadeia B e em que as cisteínas na posição 6 e 11 da cadeia A estão unidas por uma ponte dissulfeto.

Modalidade 19. Um análogo de insulina de acordo com a moda-

lidade 18,

em que

XaaAe é independentemente selecionado a partir de Thr e His; XaaAi2 é independentemente selecionado a partir de Ser e Glu; XaaAi3 é independentemente selecionado a partir de Leu, Thr,

Asn, Asp, Gln1 His, Lys1 Gly, Arg, Pro, Ser e Glu;

XaaAu é independentemente selecionado a partir de Asp, His, e

Glu;

XaaA15 é independentemente selecionado a partir de Gln e Glu; XaaA18 é independentemente selecionado a partir de Asn, Lys e

Gln;

XaaA2i é independentemente selecionado a partir de Asn, e Gln; XaaBi é independentemente selecionado a partir de Phe e Glu; XaaB3 é independentemente selecionado a partir de Asn e Gln; XaaB4 é independentemente selecionado a partir de Gln e Glu;

XaaBio é independentemente selecionado a partir de His, Asp,

Pro e Glu;

Xaa616 é independentemente selecionado a partir de Tyr1 Asp, Gln, His, Arg, e Glu;

XaaB24 é independentemente selecionado a partir de Phe e His;

XaaB26 é independentemente selecionado a partir de Tyr, Thr,

Gly e Asp;

XaaB27 é independentemente selecionado a partir de Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, e Glu; XaaB2s é independentemente selecionado a partir de Pro, Gly e

Asp;

XaaB29 é independentemente selecionado a partir de Lys e Gln; XaaB3o é ausente ou Thr;

o Terminal C pode ser opcionalmente derivatizado como uma

amida;

em que a seqüência de aminoácidos de cadeia Aea seqüência de aminoácidos de cadeia B são unidas por pontes dissulfeto entre as cisteí- nas na posição 7 da cadeia Aea cisteína na posição 7 da Cadeia B1 e entre a cisteína na posição 20 da cadeia Aea cisteína na posição 19 da cadeia B e em que as cisteínas na posição 6 e 11 da cadeia A são unidas por uma ponte dissulfeto.

Modalidade 20. Um análogo de insulina de acordo com qualquer

uma das modalidades 1 a 16 em que a cadeia B Terminal C é unida cadeia A Terminal N com 3 a 15 aminoácidos ou 3 a 7 aminoácidos, para formar uma molécula de insulina de cadeia única, em que opcionalmente o Terminal N da cadeia B é estendido com 1 a 10 aminoácidos. Modalidade 21. Uma composição farmacêutica compreendendo

uma quantidade biologicamente ativa do análogo de insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 20 e um veículo farmaceuticamente acei- tável.

Modalidade 22. Uma composição farmacêutica compreendendo dois ou mais análogos de insulina, de acordo com qualquer uma das modali- dades 1 a 20 em que cada análogo é definido por ter pelo menos uma muta- ção, que está ausente em pelo menos uma das outras variantes.

Modalidade 23. Uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades 11 a 20 que ainda compreende um excipien- te e/ou veículo farmacêutico aceitável, e opcionalmente um adjuvante.

Modalidade 24. Um método para o tratamento de diabetes melli- tus em um indivíduo compreendendo a administração a um indivíduo de um análogo de insulina, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 20 ou uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modali- dades 21 a 23.

Modalidade 25. Um método para redução do nível sangüíneo de glicose em mamíferos através da administração a um paciente necessitando de tal tratamento de uma dose terapeuticamente ativa de um análogo de insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 20 ou uma com- posição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades 21 a 23.

Modalidade 26. Método de acordo com a modalidade 24 ou 25 sendo uma administração oral.

Modalidade 27. Método de acordo com a modalidade 24 ou 25 sendo administração parenteral.

Modalidade 28. Método de acordo com a modalidade 24 ou 25 sendo administração intratraqueal.

Modalidade 29. Um análogo de insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 20 para uso como produto farmacêutico no trata- mento ou prevenção de hiperglicemia, diabetes tipo 2, tolerância à glicose diminuída, diabetes tipo 1, obesidade, síndrome X e dislipidemia.

Modalidade 30. Um análogo de insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 20 para uso como produto farmacêutico retardan- do ou prevenindo a progressão da doença em diabetes tipo 2.

Modalidade 31. Um análogo de insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 20 para uso como um produto farmacêutico na redução da ingestão alimentar, redução da apoptose das células β, aumento da função das células β e da quantidade de células β e/ou para restituição da sensibilidade das células β à glicose.

Modalidade 32. Uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica um análogo de insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 20, um derivado dos mesmos, uma seqüência parcial dos mesmos, uma se- qüência degenerada dos mesmos ou uma seqüência que se hibridiza mes- mo sob condições estringentes.

Modalidade 33. Uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica um precursor de um análogo de insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 20, um derivado dos mesmos, uma seqüência parcial dos mesmos, uma seqüência degenerada dos mesmos ou uma seqüência que se hibridiza mesmo sob condições estringentes. Modalidade 34. Um vetor de expressão compreendendo uma seqüência de ácidos nucleicos de acordo com a modalidade 32 ou 33.

Modalidade 35. Uma célula hospedeira compreendendo vetor de expressão de acordo com a modalidade 34.

Modalidade 36. Um método para produção de um análogo de

insulina compreendendo a etapa de cultivo da célula hospedeira da modali- dade 35.

Modalidade 37. Um método para preparação de um análogo de insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 20 em que a substituição de aminoácidos é realizada por mutagênese sítio-dirigida.

Modalidade 38. Um processo para preparação de uma composi- ção farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades 21 a 23 compreendendo a mistura de um análogo de insulina, de acordo com qual- quer uma das modalidades 1 a 20 com substâncias farmaceuticamente acei- táveis e/ou excipientes.

Modalidade 39. Uma composição farmacêutica obtenível através do processo de acordo com a modalidade 38.

Insulina é um hormônio polipeptídico secretado pelas células β do pâncreas. A insulina é composta de duas cadeias polipeptídicas, AeB, que são ligadas por duas pontes dissulfeto intercadeia. Além disso, a cadeia A possui uma ponte dissulfeto intra-cadeia.

O hormônio é sintetizado como uma pró-insulina precursora de cadeia única (preproinsulina) composta de um pré-peptídeo de 24 aminoáci- dos seguido pela pró-insulina que contém 86 aminoácidos na configuração: pré-peptídeo-B-Arg Arg-C-Lys Arg-A, no qual C é um peptídeo de ligação de 31 aminoácidos. Arg-Arg e Lys-Arg são sítios de clivagem para clivagem do peptídeo de ligação das cadeias AeB.

Os análogos de insulina de acordo com a invenção podem com- preender mutações adicionais. Uma mutação em uma molécula de insulina pode ser na forma de uma substituição, uma deleção ou uma adição de um resíduo de aminoácido na cadeia A e/ou B da molécula de insulina que ocor- re naturalmente. Com "desB30" ou "B(1-29)" se entende que a cadeia B da insu- lina natural perde do resíduo de aminoácido B30 e "A(1-21)" significa a ca- deia A da insulina natura. O mini peptídeo Cea sua seqüência de aminoáci- dos são indicados no código de três de letras de aminoácidos.

Neste pedido termos como A1, A2, A3 etc. indicam a posição 1,

2 e 3, respectivamente, na cadeia A da insulina (contado a partir do Terminal N final). Similarmente, termos como B1, B2, B3 etc. indicam a posição 1, 2 e 3, respectivamente, na cadeia B da insulina (contado a partir do Terminal N final). Usando o código uma letra para aminoácidos, os termos como A21A, A21G e A21Q indicam que o aminoácido na posição A21 é A, G e Q, respec- tivamente. Usando o código de três letras para aminoácidos, as expressões correspondentes são A21Ala, A21Gly e A21Gln, respectivamente.

Neste pedido os termos A(O) ou B(O) indicam as posições Ter- minal Nmente próximas A1 ou B1, respectivamente. Os termos A(-1) ou B(- 1) indicam as posições dos primeiros aminoácidos Terminal Nmente a A(O) ou B(O), respectivamente. Assim A(-2) e B(-2) indicam posições N-terminais A(-1) e B(-1), respectivamente, A(-3) e B(-3) indicam posições Terminal Nmente a A(-2) e B(-2), respectivamente, e assim por diante.

O termo peptídeo de ligação abrange uma cadeia peptídica que pode unir o resíduo de aminoácido Terminal C da cadeia B com o resíduo de aminoácido de Terminal N da cadeia A na insulina.

O termo pró-peptídeo significa uma seqüência de polipeptídeo cuja função deve permitir ao polipeptídeo expresso ser direcionado do retícu- Io endoplasmático ao aparelho Golgi e ainda para uma vesícula secretória para secreção no meio de cultura (isto é, a exportação do polipeptídeo atra- vés da parede celular ou pelo menos pela membrana celular no espaço peri- plasmático da célula de levedura). O pró-peptídeo pode ser o pró-peptídeo do fator α de levedura vide US 4.546.082 e 4.870.008. Alternativamente, o pró-peptídeo pode ser um pró-peptídeo sintético, isto é, um pró-peptídeo não encontrado na natureza. Pró-peptídeos sintéticos adequados são os revela- dos em US 5.395.922; 5.795.746; 5.162.498 e WO 98/32867. O pró-peptídeo conterá preferencialmente um sítio de processamento de endopeptidase no fim do Terminal C1 tal como uma seqüência Lys-Arg ou qualquer análogo funcional dos mesmos.

O termo "diabetes" inclui diabetes tipo 1, diabetes tipo 2 e outros estados que causam hiperglicemia.

O termo "tratamento" de uma doença inclui o tratamento, a pre-

venção ou o alívio da doença.

Em uma modalidade da invenção o análogo de insulina é espe- cialmente adequado para a administração oral.

Aminoácidos hidrofóbicos devem ser entendidos neste pedido como aminoácidos que ocorrem naturalmente triptofano (Trp, W), fenilalani- na (Phe, F), valina (Vai, V), isoleucina (He, I), Ieucina (Leu, L) e tirosina (Tyr, Y) (com a abreviação de três letras e a de uma letra entre parênteses).

Aminoácidos hidrofílicos devem ser entendidos neste pedido como aminoácidos naturais que não são aminoácidos hidrofóbicos de acordo com a definição acima. Em uma modalidade, ácidos hidrofílicos de acordo com a invenção são selecionados a partir do grupo consistindo em: ácido glutâmico (Glu, E), ácido aspártico (Asp, D), histidina (His, H), glutamina (Gln, Q), asparagina (Asn, N), serina (Ser, S), treonina (Thr, T), prolina (Pro, P), glicina (Gly, G), Iisina (Lys, K) e arginina (Arg, R). Em uma modalidade adicional, aminoácidos hidrofílicos de acordo com a invenção são seleciona- dos a partir do grupo consistindo em: ácido glutâmico (Glu, E), ácido aspárti- co (Asp, D), histidina (His, H), glutamina (Gln, Q), asparagina (Asn, N), Iisina (Lys, K) e arginina (Arg, R).

"Uma insulina" de acordo com a invenção deve ser entendida neste pedido como insulina humana, um análogo de insulina ou um derivado de insulina.

O termo "insulina precursora", como usado neste pedido, é des- tinado a significar uma insulina antes de quaisquer mutações de acordo com a invenção terem sido aplicadas à mesma. Exemplos não limitados da insu- Iina precursora são, por exemplo, uma insulina de tipo selvagem, tal como insulina humana ou insulina porcina, um análogo da insulina humana ou um derivado da insulina humana ou um análogo de insulina, tal como insulina humana ou um análogo de insulina que foi PEGiIado ou acilado.

Em uma modalidade, uma insulina precursora de acordo com a invenção é selecionada a partir do grupo consistindo em: insulina humana;

um análogo de insulina da insulina humana em que o resíduo de

aminoácido na posição B28 é Pro, Asp, Lys1 Leu, Val1 ou Ala e o resíduo de aminoácido na posição B29 é Lys ou Pro e opcionalmente o resíduo de ami- noácido na posição B30 é deletado;

um análogo de insulina que é insulina humana des(B28-B30), insulina humana des(B27) ou insulina humana des(B30);

um análogo de insulina da insulina humana em que o resíduo de aminoácido na posição B3 é Lys e o resíduo de aminoácido na posição B29 é Glu ou Asp;

um análogo de insulina da insulina humana em que o resíduo de aminoácido na posição A21 é Gly e em que o análogo de insulina é ainda estendido no Terminal C com dois resíduos arginina;

um derivado de insulina em que o resíduo de aminoácido na po- sição B30 é substituído com uma treonina metil éster; e

um derivado de insulina em que é anexada à posição Νε da Iisi- na na posição B29 da des(B30) insulina humana uma cadeia tetradecanoíla.

Em uma modalidade, uma insulina precursora de acordo com a invenção é selecionada a partir do grupo consistindo em: insulina humana; insulina humana desB30; insulina humana AspB28;

insulina humana AspB28, desB30; insulina humana LysB3, GluB29; insulina humana LysB28, ProB29; insulina humana GlyA21, ArgB31, ArgB32; e insulina humana desB30, ArgB31, ArgB32.

O termo "análogo de insulina" como usado neste pedido signifi- ca uma insulina modificada em que um ou vários resíduos de aminoácido da insulina foram substituídos por outros de resíduos de aminoácido e/ou em que um ou vários resíduos de aminoácido foram deletados da insulina e/ou em que um ou vários resíduos de aminoácido foram adicionados à insulina.

Em uma modalidade, um análogo de insulina compreende me- nos de 8 modificações (substituições, deleções, adições) em relação à insu- lina precursora. Em uma modalidade, um análogo de insulina compreende menos de 7 modificações (substituições, deleções, adições) em relação à insulina precursora. Em uma modalidade, um análogo de insulina compre- ende menos de 6 modificações (substituições, deleções, adições) em rela- ção à insulina precursora. Em outra modalidade um análogo de insulina compreende menos de 5 modificações (substituições, deleções, adições) em relação à insulina precursora. Em outra modalidade um análogo de insulina compreende menos de 4 modificações (substituições, deleções, adições) em relação à insulina precursora. Em outra modalidade um análogo de insulina compreende menos de 3 modificações (substituições, deleções, adições) em relação à insulina precursora. Em outra modalidade um análogo de insulina compreende menos de 2 modificações (substituições, deleções, adições) em relação à insulina precursora.

O termo "derivado de insulina" como usado neste pedido signifi- ca uma insulina precursora quimicamente modificada ou mesmo análogas da mesma, em que pelo menos um substituinte não está presente na proteí- na precursora ou análoga da mesma, isto é, uma proteína precursora que foi covalentemente modificada. Modificações típicas são amidas, carboidratos, grupos alquilas, grupos acila, ésteres, PEGilações e similares. Exemplos de derivados da insulina humana de acordo com a invenção são a insulina hu- mana B30 treonina metil éster, insulina humana des(B30) Ns-B29-tetra- decanoíla, insulina humana GlnB3 des(B30) N£-B29-tetradecanoíla, insulina humana N£-B29-tridecanoíla, insulina humana N£-B29-tetradecanoíla, insuli- na humana Ns-B29-decanoíla e insulina humana Ne-B29-dodecanoíla O termo "insulina humana" como usado neste pedido significa o

hormônio humano cuja estrutura e propriedades são bem-conhecidas. A in- sulina humana tem duas cadeias polipeptídicas que são unidas por pontes dissulfeto entre resíduos cisteína, ou seja, a cadeia Aea cadeia Β. A cadeia A é um peptídeo de 21 aminoácidos e a cadeia B é um peptídeo de 30 ami- noácidos, as duas cadeias sendo unidas por três pontes dissulfeto: uma en- tre as cisteínas na posição 6 e 11 da cadeia A, a segunda entre a cisteína na posição 7 da cadeia Aea cisteína na posição 7 da cadeia B, e o terceiro entre a cisteína na posição 20 da Cadeia Aea cisteína na posição 19 da cadeia B.

Mutações na molécula de insulina são denotadas determinando a cadeia (A ou B), a posição, e o código de aminoácido de três letras que substitui o aminoácido nativo. Por "desB30" entende-se uma insulina natural de cadeia B ou um análogo da mesma que perdeu o de aminoácido B30. Dessa forma, a insulina humana A21Gly, B28Asp, desB30 é um análogo da insulina humana onde a posição 21 em uma cadeia está mutada para glici- na, a posição 28 na cadeia B está mutada para ácido aspártico, e a posição 30 na cadeia B está deletada.

Uma "protease" ou uma "enzima protease" é uma enzima diges- tiva que degrada proteína e peptídeos e que é encontrada em vários tecidos do corpo humano tais como, por exemplo, o estômago (pepsina), o lúmen intestinal (quimotripsina, tripsina, elastase, carboxipeptidases, etc.) ou as superfícies de mucosas do trato Gl (aminopeptidases, carboxipeptidases, enteropeptidases, dipeptidil peptidases, endopeptidases, etc.), o fígado (en- zima de degradação de insulina, catepsina D etc.), e em outros tecidos.

Um análogo de insulina proteoliticamente estável deve ser en- tendido neste pedido como um análogo de insulina, que é submetido à de- gradação mais lenta por uma ou várias proteases em relação à insulina hu- mana. Em uma modalidade, um análogo de insulina proteoliticamente está- vel, de acordo com a invenção, é submetido à degradação mais lenta por uma ou várias proteases em relação à insulina precursora. Em uma modali- dade adicional da invenção, um análogo de insulina, de acordo com a inven- ção, é estabilizado em relação à degradação por uma ou várias enzimas se- lecionadas a partir do grupo consistindo em: pepsina (tal como, por exemplo, as isoformas pepsina A, pepsina B, pepsina C e/ou pepsina F), quimotripsina (tal como, por exemplo, as isoformas quimotripsina A, quimotripsina B e/ou quimotripsina C), tripsina, enzima de degradação da insulina (IDE), elastase (tal como, por exemplo, as isoformas elastase pancreática I e/ou II), carboxi- peptidase (por exemplo, as isoformas carboxipeptidase A1 carboxipeptidase A2 e/ou carboxipeptidase B), aminopeptidase, catepsina D e outras enzimas apresenta em extratos intestinais derivados de rato, porco ou humano.

Em uma modalidade, um análogo de insulina de acordo com a invenção é estabilizado em relação à degradação por uma ou várias enzi- mas selecionadas a partir do grupo consistindo em: quimotripsina, tripsina, enzima de degradação da insulina (IDE), elastase, carboxipeptidases, ami- nopeptidases e catepsina D. Em uma modalidade adicional, um análogo de insulina de acordo com a invenção é estabilizado em relação à degradação por uma ou várias enzimas selecionadas a partir do grupo consistindo em: quimotripsina, carboxipeptidases e IDE. Ainda em uma modalidade adicio- nal, um análogo de insulina de acordo com a invenção é estabilizado em relação à degradação por uma ou várias enzimas selecionadas a partir de: quimotripsina e carboxipeptidases.

TYi pode ser determinado como descrito nos Exemplos como uma medida da estabilidade proteolítica de um análogo de insulina, de acor- do com a invenção, em relação a enzimas protease, tais como quimotripsina, carboxipeptidase e/ou pepsina A. Em uma modalidade da invenção T!4 está aumentado em relação à insulina humana. Em uma modalidade adicional, T>2 está aumentado em relação à insulina precursora. Ainda em uma moda- lidade adicional, T1A está aumentado pelo menos 2 vezes em relação à insu- Iina precursora. Ainda em uma modalidade adicional, T14 está aumentado pelo menos 3 vezes em relação à insulina precursora. Ainda em uma moda- lidade adicional, T1A está aumentado pelo menos 4 vezes em relação à insu- lina precursora. Ainda em uma modalidade adicional, ΤΆ está aumentada pelo menos 5 vezes em relação à insulina precursora. Ainda em uma moda- Iidade adicional, T Vz está aumentado pelo menos 10 vezes em relação à insulina precursora.

Os sítios de clivagem de protease (neste pedido também men- cionado como sítios de protease) devem ser entendidos como resíduos de aminoácidos que são reconhecidos por resíduos de aminoácidos e/ou prote- ases cuja ligação de peptídeo é clivada por proteases. Os sítios de clivagem de protease podem ser definidos pela determinação de "pontos quentes" de clivagem analisados por HPLC1 MS ou LC-MS e/ou pela predição com base na especificidade enzimática da enzima protease para a qual o sítio de cli- vagem de protease deve ser determinado. Um versado na técnica saberá como determinar sítios de clivagem de protease, por exemplo, com base nas especificidades enzimáticas como, por exemplo, descrito no Handbook of Proteolytical Enzymes, 2nd ed., Barrett1 A.J., Rawlings1 N.D., Woesner1 J.F. editors, Elsevier Academic Press 2004. Por exemplo, a quimotripsina é pre- dita para clivar ligações de peptídeo Terminal C a resíduos aromáticos (Trp1 Tyr1 Phe ou Leu), que não são seguidos por Pro. Similarmente, tripsina é predita para clivar ligações de peptídeo Terminal C a resíduos básicos Lys ou Arg, que não são seguidos por Pro1 elastase é predita para clivar o Ter- minal C de resíduos Ala, Vai, Gly ou Ser e carboxipeptidase A retirará qual- quer aminoácido de Terminal C1 mas não Arg1 Lys ou Pro. A enzima de de- gradação da insulina (IDE) é predita para clivar as seguintes posições da insulina humana B9-10, B10-11, B13-14, B14-15, B24-25, B25-26, A13-14 e A14-15.

O termo substituindo (um) aminoácido "dentro de ou na proximi- dade" de um sítio de clivagem de protease é usado neste pedido para indicar a substituição de aminoácidos dentro ou na proximidade de uma posição da insulina precursora que foi determinada para ser um sítio de clivagem de protease. Em uma modalidade dois ou mais aminoácidos hidrofóbicos dentro ou na proximidade de dois ou mais sítios de protease em uma insulina são substituídos, em que os ditos aminoácidos hidrofóbicos são substituídos com aminoácidos hidrofílicos. Em uma modalidade adicional, dois ou mais ami- noácidos hidrofóbicos dentro de dois ou mais sítios de protease em uma in- sulina são substituídos com aminoácidos hidrofílicos. Ainda em uma modali- dade adicional, dois ou mais aminoácidos hidrofóbicos situados ao lado de dois ou mais sítios de protease em uma insulina são substituídos com ami- noácidos hidrofílicos. Ainda em uma modalidade adicional, dois ou mais a- minoácidos hidrofóbicos situados dois aminoácidos afastados de dois ou mais sítios de protease em uma insulina são substituídos com aminoácidos hidrofílicos. Ainda em uma modalidade adicional, dois ou mais aminoácidos hidrofóbicos situados três aminoácidos afastados de dois ou mais sítios de protease em uma insulina são substituídos com aminoácidos hidrofílicos. Ainda em uma modalidade adicional, dois ou mais aminoácidos hidrofóbicos situados até quatro aminoácidos afastados de dois ou mais sítios de protea- se em uma insulina são substituídos com aminoácidos hidrofílicos. Ainda em uma modalidade adicional, dois ou mais aminoácidos hidrofóbicos situados um, dois, ou três aminoácidos afastados ou dentro de dois ou mais sítios de protease em uma insulina são substituídos com aminoácidos hidrofílicos. Ainda em uma modalidade adicional, dois ou mais aminoácidos hidrofóbicos situados um ou dois aminoácidos afastados ou dentro de dois ou mais sítios de protease em uma insulina são substituídos com aminoácidos hidrofílicos. Ainda em uma modalidade adicional, dois ou mais aminoácidos hidrofóbicos situados ao lado ou dentro de dois ou mais sítios de protease em uma insuli- na são substituídos com aminoácidos hidrofílicos.

Um análogo de insulina de acordo com a invenção pode ter uma carga líquida que é diferente da carga líquida da insulina precursora. Em uma modalidade, a carga líquida de um análogo de insulina de acordo com a invenção é mais positiva do que a carga líquida da insulina precursora. Em uma modalidade, a carga líquida de um análogo de insulina de acordo com a invenção é mais negativa do que a carga líquida da insulina precursora. Em uma modalidade, a carga líquida positiva média de um análogo de insulina, de acordo com a invenção, está entre 0,5 e 5 como medido em uma solução aquosa. Em uma modalidade, a carga líquida positiva média de um análogo de insulina de acordo com a invenção está entre 1 e 5. Em uma modalidade, a carga líquida positiva média de um análogo de insulina de acordo com a invenção está entre 1 e 4. Em uma modalidade, a carga líquida positiva mé- dia de um análogo de insulina de acordo com a invenção está entre 1 e 3. Em uma modalidade, a carga líquida positiva média de um análogo de insu- Iina de acordo com a invenção está entre 2 e 3. Em uma modalidade, a car- ga líquida negativa média de um análogo de insulina de acordo com a inven- ção está entre -0,5 e -5 como medido em uma solução aquosa. Em uma modalidade, a carga líquida negativa média de um análogo de insulina de acordo com a invenção está entre -1 e -5. Em uma modalidade, a carga lí- quida negativa média de um análogo de insulina de acordo com a invenção está entre -1 e -4. Em uma modalidade, a carga líquida negativa média de um análogo de insulina de acordo com a invenção está entre -1 e -3. Em uma modalidade, a carga líquida negativa média de um análogo de insulina de acordo com a invenção está entre -2 e -3.

Em uma modalidade, um análogo de insulina de acordo com a invenção pode ter solubilidade aumentada em relação à insulina humana. Em uma modalidade adicional, um análogo de insulina, de acordo com a invenção, teve a solubilidade aumentada em relação à insulina humana em pH 3 a 9. Ainda em uma modalidade adicional, um análogo de insulina, de acordo com a invenção, teve a solubilidade aumentada em relação à insulina humana em pH 4 a 8,5. Ainda em uma modalidade adicional, um análogo de insulina, de acordo com a invenção, teve a solubilidade aumentada em rela- ção à insulina humana em pH 4 a 8. Ainda em uma modalidade adicional, um análogo de insulina de acordo com a invenção teve a solubilidade au- mentada em relação à insulina humana em pH 4,5 a 8. Em uma modalidade adicional, um análogo de insulina, de acordo com a invenção, teve a solubili- dade aumentada em relação à insulina humana em pH 5 a 8. Ainda em uma modalidade adicional, um análogo de insulina, de acordo com a invenção, teve a solubilidade aumentada em relação à insulina humana em pH 5,5 a 8. Em uma modalidade adicional, um análogo de insulina, de acordo com a invenção, teve a solubilidade aumentada em relação à insulina humana em pH 6 a 8.

Em uma modalidade, um análogo de insulina, de acordo com a invenção, teve a solubilidade aumentada em relação à insulina humana em pH 2 a 4.

Em uma modalidade, um análogo de insulina, de acordo com a invenção, pode ter a solubilidade aumentada em relação à insulina precurso- ra. Em uma modalidade adicional, um análogo de insulina, de acordo com a invenção, teve a solubilidade aumentada em relação à insulina precursora em pH 3 a 9. Ainda em uma modalidade adicional, um análogo de insulina, de acordo com a invenção, teve a solubilidade aumentada em relação à in- sulina precursora em pH 4 a 8,5. Ainda em uma modalidade adicional, um análogo de insulina, de acordo com a invenção, teve a solubilidade aumen- tada em relação à insulina precursora em pH 4 a 8. Ainda em uma modali- dade adicional, um análogo de insulina de acordo com a invenção teve a solubilidade aumentada em relação à insulina precursora em pH 4,5 a 8. Ainda em uma modalidade adicional, um análogo de insulina, de acordo com a invenção, teve a solubilidade aumentada em relação à insulina precursora em pH 5 a 8. Ainda em uma modalidade adicional, um análogo de insulina de acordo com a invenção teve a solubilidade aumentada em relação à insu- Iina precursora em pH 5,5 a 8. Em uma modalidade adicional, um análogo de insulina de acordo com a invenção teve a solubilidade aumentada em relação à insulina precursora em pH 6 a 8.

Em uma modalidade, um análogo de insulina, de acordo com a invenção, teve a solubilidade aumentada em relação à insulina precursora em pH 2 a 4.

Por "solubilidade aumentada em um dado pH" entende-se que uma maior concentração de um análogo de insulina da invenção se dissolve em uma solução aquosa ou de tampão no pH da solução, em relação à insu- lina é comparada a, isto é, insulina humana ou insulina precursora. Métodos para determinar se a insulina contida em uma solução está dissolvida são conhecidos na técnica.

Em uma modalidade, a solução pode ser submetida à centrifu- gação durante 20 minutos a 30.000 g e então a concentração de insulina no sobrenadante pode ser determinada por RP-HPLC. Se esta concentração for igual, dentro do erro experimental, à concentração de insulina originalmente usada para fazer a composição, então a insulina é totalmente solúvel na composição da invenção. Em outra modalidade, a solubilidade da insulina em uma com- posição da invenção pode ser simplesmente determinada examinando a olho nu o recipiente no qual a composição está contida. A insulina é solúvel se a solução for clara a olho nu e nenhuma matéria particulada estiver sus- pensa ou precipitada nos lados/fundo do recipiente.

Um análogo de insulina, de acordo com a invenção, pode ter po- tência e/ou biodisponibilidade aumentada em relação à insulina precursora quando comparados mediante medição.

Ensaios-padrão para medir a potência ou a biodisponibilidade da insulina são conhecidos pela pessoa versada na técnica e incluem a propósito (1) ensaios de radiorreceptores de insulina, nos quais a potência relativa de uma insulina é definida como a razão de insulina para análogo de insulina ne- cessária para deslocar 50% da 125MnsuIina especificamente ligada aos recep- tores de insulina presentes nas membranas celulares, por exemplo, uma fra- ção de membrana plasmática de fígado de rato; (2) ensaios de lipogênese realizados, por exemplo, com adipócitos de rato, nos quais a potência relativa da insulina é definida como a razão de insulina para o análogo de insulina ne- cessário para conversão máxima de glicose [3-3H] em material orgânico e ex- traível (isto é, lipídios); (3) ensaios de oxidação da glicose em células de gor- dura isoladas nas quais a potência relativa do análogo de insulina é definida como a razão da insulina para o análogo de insulina para atingir 50% da con- versão máxima de glicose-1-[14C] em 14[C02]; (4) radioimunoensaios com insu- lina que podem determinar a imunogenicidade de análogos de insulina atra- vés da medição da eficácia pela qual a insulina ou um análogo de insulina competem com a 125MnsuIina na ligação a anticorpos anti-insulina específicos; e (5) outros ensaios que medem a ligação da insulina ou um análogo de insu- lina a anticorpos em amostras de plasma sangüíneo de animais, tais como ensaios de ELISA que possuem anticorpos insulina específicos.

Análogos de insulina, de acordo com a invenção, podem ser a- nalisados opcionalmente para sítios da protease adicionais que possam es- tar sujeitos a substituições adicionais de um ou vários aminoácidos hidrofó- bicos com aminoácidos hidrofílicos. Um análogo de insulina, de acordo com a invenção, pode ser um análogo de insulina que tenha pelo menos dois áci- dos hidrofílicos em sítios da protease em comparação com a insulina precur- sora, a primeira insulina modificada, e que ainda tem pelo menos uma subs- tituição de aminoácido em um novo sítio da protease da primeira insulina modificada em que pelo menos um aminoácido hidrofóbico foi substituído com pelo menos um aminoácido hidrofílico.

Em uma modalidade, um análogo de insulina é fornecido em que a cadeia B Terminal C está unida à cadeia A Terminal N com 3 a 15 a- minoácidos. Tal análogo de insulina é neste pedido denotado "insulina de cadeia única" ou "SCI" e tem a estrutura geral B-C-A em que B é a cadeia B da insulina humana ou um análogo ou derivado da mesma, A é a cadeia A da insulina humana ou um análogo ou derivado e C é a cadeia de ligação peptídica de 3 a 15 resíduos de aminoácido normalmente de ligação de B30 com A1. Se a cadeia B for uma cadeia desB30, o peptídeo de ligação unirá B29 com A1. A insulina de cadeia única conterá pontes dissulfeto correta- mente posicionadas (três) como na insulina humana que estão entre CysA7 e CysB7 e entre CysA20 e CysBI9 e uma ponte de dissulfeto interna entre CysA6 e CysA11. Em uma modalidade, um análogo de insulina é fornecido em que a cadeia B Terminal C está ligada à cadeia A Terminal N com 3 a 7 aminoácidos.

A presente invenção também está relacionada a seqüências de ácido nucleico que codificam para os análogos de insulina reivindicados. Em uma modalidade adicional, a presente invenção está relacionada a vetores que contêm tais seqüências de ácido nucleico e células hospedeiras conten- do tais seqüências de ácido nucleico ou vetores.

Ainda em uma modalidade adicional, a invenção relaciona-se a um processo para produção de um análogo de insulina compreendendo (i) cultura de uma célula hospedeira compreendendo uma seqüência de ácido nucleico que codifica um precursor de insulina; (ii) isolamento do precursor de insulina do meio de cultura e (iii) conversão do precursor de insulina em um análogo de insulina da invenção através de uma conversão enzimática in vitro. Ainda em uma modalidade adicional, a invenção relaciona-se a um processo para produção de um análogo de insulina compreendendo (i) cultura de uma célula hospedeira compreendendo uma seqüência de ácido nucleico que codifica um precursor de insulina; (ii) isolamento do precursor de insulina do meio de cultura e (iii) conversão do precursor de insulina em um análogo de insulina da invenção.

Em uma modalidade da presente invenção, a célula hospedeira é uma célula hospedeira de levedura e, em uma modalidade adicional, a cé- lula hospedeira de levedura é selecionada a partir do gênero Saccharomy- ces. Em uma modalidade adicional, a célula hospedeira de levedura é sele- cionada a partir das espécies Saccharomyces eerevisiae.

Por "análogo de insulina", como usado neste pedido, entende-se um polipeptídeo derivado da estrutura primária de uma insulina que ocorre naturalmente, por exemplo, aquela da insulina humana, através da deleção e/ou substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido que ocorre na insulina que ocorre naturalmente e/ou através da adição de pelo menos um resíduo de aminoácido. Os resíduos de aminoácidos adicionados e/ou subs- tituídos podem ser resíduos de aminoácidos codificáveis ou outros resíduos de aminoácido que ocorrem naturalmente. Os análogos de insulina de acordo com a presente invenção po-

dem ser insulina humana ou análogos mutados da mesma em uma ou várias posições. Em uma modalidade, os análogos de insulina são projetados para potencializar a estabilidade em relação a proteases com base nos sítios de clivagem de protease identificados. Em uma modalidade, pelo menos um sítio de clivagem sujeito à

mutação está em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: B2-3, B6-7, B9-10, B10-11, B13-14, B14-15, B16-17, B22-23, B24-25, B25- 26, A13-14, A14-15 e A19-20 da insulina humana.

Em uma modalidade, pelo menos um sítio de clivagem sujeito à mutação está em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: B2-3, B6-7, B16-17, B22-23, B24-25 e/ou de A19-20 de insulina humana.

Em uma modalidade pelo menos um sítio de clivagem sujeito à mutação está na posição B22-23.

Em uma modalidade, pelo menos um sítio de clivagem sujeito à mutação está em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: B9-10, B10-11, B13-14, B14-15, B24-25, B25-26, A13-14, A14-15.

Em uma modalidade, sítios de clivagem sujeitos à mutação es-

tão em duas ou mais posições selecionadas a partir do grupo consistindo em: B2-3, B6-7, B9-10, B10-11, B13-14, B14-15, B16-17, B22-23, B24-25, B25-26, A13-14, A14-15 e A19-20 da insulina humana.

Em uma modalidade, sítios de clivagem de sujeitos à mutação estão em duas ou mais posições selecionadas a partir do grupo consistindo em: B2-3, B6-7, B16-17, B22-23, B24-25 e/ou A19-20 da insulina humana.

Em uma modalidade, sítios de clivagem sujeitos à mutação es- tão em duas ou mais posições selecionadas a partir do grupo consistindo em: B9-10, B10-11, B13-14, B14-15, B24-25, B25-26, A13-14, A14-15. Em uma modalidade, um análogo de insulina, de acordo com a

invenção, é obtido em que a cadeia A do análogo de insulina compreende pelo menos uma mutação e a cadeia B do análogo de insulina compreende pelo menos uma mutação em relação à insulina precursora, em que pelo menos uma mutação na cadeia A está em um ou vários sítios de clivagem selecionados a partir do grupo consistindo em: A13-14, A14-15 e A19-20 e pelo menos uma mutação na cadeia B está em um ou vários sítios de cliva- gem selecionados a partir do grupo consistindo em: B2-3, B6-7, B9-10, B10- 11, B13-14, B14-15, B16-17, B22-23, B24-25 e B25-26.

Em uma modalidade, um análogo de insulina de acordo com a invenção é obtido em que a cadeia A do análogo de insulina compreende uma mutação e a cadeia B do análogo de insulina compreende pelo menos uma mutação em relação à insulina precursora, em que uma mutação na cadeia A está no sítio de clivagem A19-20 e pelo menos uma mutação na cadeia B está em um ou vários sítios de clivagem selecionados a partir do grupo consistindo em: B2-3, B6-7, B16-17, B22-23 e B24-25.

Em uma modalidade, um análogo de insulina de acordo com a invenção é obtido em que a cadeia A do análogo de insulina compreende pelo menos uma mutação e a cadeia B do análogo de insulina compreende pelo menos uma mutação em relação à insulina precursora, em que pelo menos uma mutação na cadeia A está em um ou vários sítios de clivagem selecionados a partir do grupo consistindo em: A13-14 e A14-15 e pelo me- nos uma mutação na cadeia B está em um ou vários sítios de clivagem sele- cionados a partir do grupo consistindo em: B9-10, B10-11, B13-14, B14-15, B24-25 e B25-26.

Resíduos de aminoácido adequados para substituição são sele- cionados com o objetivo de remover os sítios de clivagem. Em uma modali- dade, aminoácidos são selecionados com o objetivo adicional de aumentar a solubilidade. Em uma modalidade adicional, a solubilidade aumentada está na faixa de pH 3 a 9. Ainda em uma modalidade adicional, a solubilidade aumentada está na faixa de pH 4 a 8. A insulina ou o análogo de insulina podem ser substituídos em uma ou várias posições por qualquer aminoácido natural ou qualquer aminoácido natural pode ser acrescentado à insulina precursora ou ao análogo de insulina precursora. Por razões de conveniên- cia, aqui se segue os nomes de aminoácidos naturais, codificáveis, com os três códigos de letras habituais & códigos de uma letra entre parênteses: Glicina (Gly & G), prolina (Pro & P), alanina (Ala & A), valina (Vai & V), Ieuci- na (Leu & L), isoleucina (lie & I), metionina (Met & M), cisteína (Cys & C), fenilalanina (Phe & F), tirosina (Tyr & Y), triptofano (Trp & W), histidina (His & H), Iisina (Lys & K), arginina (Arg & R), glutamina (Gln & Q), asparagina (Asn & N), ácido glutâmico (Glu & E), ácido aspártico (Asp & D), serina (Ser & S) e treonina (Thr & T). Se, devido a erros de digitação, houver divergência com os códigos comumente usados, os códigos comumente usados aplicam-se. Os aminoácidos presentes nas insulinas desta invenção são, preferencial- mente, aminoácidos que possam ser codificados por um ácido nucleico. Em uma modalidade, insulina ou um análogo de insulina é substituído por Gly, Glu, Asp, His, Gln, Asn, Ser, Thr, Lys, Arg e/ou Pro e/ou Gly, Glu, Asp1 His, Gln, Asn, Ser, Thr, Lys, Arg e/ou Pro é adicionado à insulina ou a um análo- go de insulina. Em uma modalidade, insulina ou um análogo de insulina é substituído por Glu, Asp, His, Gln, Asn, Lys e/ou Arg e/ou Glu, Asp, His, Gln, Asn1 Lys e/ou Arg é adicionado à insulina ou a um análogo de insulina.

Os análogos de insulina podem ser tais em que a posição 25 da cadeia B pode ser modificada do resíduo natural Phe para His em combina- ção com a substituição da Tyr natural na posição A14 para Glu1 Asp ou His.

Uma ou várias mutações adicionais podem incluir desB30 e os análogos de insulina poderiam ser ainda modificados através da extensão do Terminal N ou extensão do Terminal C da cadeia A e/ou cadeia B tal como, por exem- plo, a extensão do Terminal N da cadeia A e/ou B do análogo de insulina com GGP, GGPP, GP ou GPP. Exemplos adicionais incluem, mas não são limitados a, mutações adicionais em que um ou dois resíduos Pro podem ser adicionados a posições AO e/ou BO1 Leu pode ser adicionada à posição B31 e/ou Glu pode ser adicionada à posição B32. Uma ou várias mutações adi- cionais podem ser selecionadas a partir da posição A8 modificada para His, posição A21 para Gly, posição B1 para Glu ou Gln, posição B16 para Glu, posição B26 para Asp1 posição B27 para Glu e/ou posição B28 para Asp.

Em uma modalidade, um análogo de insulina de acordo com a invenção é selecionado a partir do grupo consistindo em:

insu ina humana A14E, B25H, desB30; insu ina humana A14H, B25H, desB30; insu ina humana A14E, B1E, B25H, desB30; insu ina humana A14E, B16E, B25H, desB30; insu ina humana A14E, B25H, B28D, desB30; insu ina humana A14E, B25H, B27E, desB30; insu ina humana A14E, B1E, B25H, B27E, desB30; insu ina humana A14E, B1E, B16E, B25H, B27E, desB30; insu ina humana A8H, A14E, B25H, desB30; insu ina humana A8H, A14E, B25H, B27E, desB30; insu ina humana A8H, A14E, B1E, B25H, desB30; insu ina humana A8H, A14E, B1E, B25H, B27E, desB30; insu ina humana A8H, A14E, B1E, B16E, B25H, B27E, desB30 insu ina humana A8H, A14E, B16E, B25H, desB30; insu ina humana A14E, B25H, B26D, desB30; desB30;

insulina humana A14E, B1E, B27E, desB30;

insulina humana A14E, B27E, desB30;

insulina humana A14E, B28D, desB30;

insulina humana A14D, B25H, desB30;

insulina humana A(-1)P, A(O) Ρ, A14E, B25H, desB30;

insulina humana A14E, B(-1)P, B(O) Ρ, B25H, desB30;

insulina humana A(-1)P, A(O)P1 A14E, B(-1) P, B(O) Ρ, B25H,

insulina humana A14E, B25H, B30T, B31L, B32E; insulina humana A14E, B25H;

insulina humana A14E, B16H, B25H, desB30; insulina humana A14E, B10P, B25H, desB30; insulina humana A14E, B10E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B4E, B25H, desB30; insulina humana A14H, B16H, B25H, desB30;

insulina humana A14H, B10E, B25H, desB30;

insulina humana A14E, B25H, desB27, desB28, desB29,

desB30;

insulina humana A13H, A14E, B10E, B25H, desB30; insulina humana A13H, A14E, B25H, desB30;

insulina humana A14E, A18Q, B3Q, B25H, desB30; insulina humana A14E, B24H, B25H, desB30; insulina humana A8H, A14E, B10D, B25H, B26G, desB27, desB28, desB29, desB30; insulina humana A8H, A14E, B10D, B25H-amida, desB26,

desB27, desB28, desB29, desB30;

insulina humana A14E, B25H, desB26, desB27, desB28,

desB29, desB30;

insulina humana A14E, B25H, B26G, desB27, desB28, desB29,

desB30;

insulina humana A14E, B25H-amida, desB27, desB28, desB29,

desB30 insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; insulina humana A14E, B26G, desB27, desB28, desB29,

desB30;

insulina humana A14E, B25H, desB26, desB27, desB28, desB29, desB30;

insulina humana A14E, A18Q, A21Q, B3Q, B25H, desB30; insulina humana A14E, A18Q, A21Q, B3Q, B25H, B27E,

desB30;

insulina humana A14E, A18Q, B3Q, B25H, desB30; insulina humana Α13H, A14E, Β1 Ε, B25H, desB30;

insulina humana A13N, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13N, A14E, B1E, B25H, desB30; insulina humana A(-2)G, A(-1)P, A(O)P1 A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B(-2)G, B(-1)P, B(O)P, B25H, desB30; insulina humana A(-2)G, A(-1)P, A(O)P1 A14E, B(-2)G, B(-1)P,

B(O)P1 B25H, desB30;

insulina humana A14E, B27R, B28D, B29K, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27R, B28D, B29K, desB30; insulina humana A14E, B25H, B26T, B27R, B28D, B29K,

desB30;

insulina humana A14E, A18K, B25H, desB27, desB28, desB29,

desB30;

insulina humana A14E, A22K, B25H, desB27, desB28, desB29,

desB30;

insulina humana A14E, A22K, B25H, desB30;

insulina humana A14E, desB1, desB2, desB3, B25H-amida, desB26, desB27, desB28, desB29, desB30;

insulina humana A14E, desB1, desB2, desB3, B25H, desB27,

desB28, desB29, desB30; insulina humana A14E, desB1, desB2, desB3, B16H, B25H,

desB27, desB28, desB29, desB30;

insulina humana A14E, B25H, B27R, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27R, desB28-B30; insulina humana A14E, B25H, B27H, desB28-B30; insulina humana A14E, B25H, B27E, desB28-B30; insulina humana A14E, B25H, B27K, desB28-B30;

insulina humana A14E, B27K, desB28-B30; insulina humana A14E, A18Q, B3Q, B25H, desB30; insulina humana A13E, A14E, B25H, desB30; insulina humana A12E, A14E, B25H, desB30; insulina humana A15E, A14E, B25H, desB30;

insulina humana A13E, B25H, desB30; insulina humana A12E, B25H, desB30; insulina humana A15E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, desB27, desB30; insulina humana A14E, B25H, B26D, B27E, desB30;

insulina humana EEAEAEAPK-B(1 -29)-B25H-AAK-A (1-21)-

A14E;

insulina humana EEAEPK-B(1-29)-B25H-DGK-A (1-21)-A14E; insulina humana B(1-29)-B25H-AAK-A(1-21)-A14E; insulina humana B(1-29)-B1E, B25H-AAK-A(1-21)-A14E;

insulina humana B(1-29)-B25H, B27E-AAK-A(1-21)-A8H A14E; insulina humana B(1-29)-B1E, B25H, B27E-AAK-A(1-21).A8H,

A14E;

Insulina humana EEAEAEAPK-B (1-29)-B16E, B25H-AAK-A(1-

21)-A8H,A14E;

insulina humana B(1-29)-B25H, B29Q-TGLGGGQ-A(1-21)-A14E insulina humana B(1-29)-B16E, B25H, B29Q-TGLGGGQ-A( 1 -

21) -A14E

insulina humana B(1-29)-B25H, B29Q-TGLGGGQ-A(1-21)-A8H,

A14E

insulina humana A14E, B25H, B27R, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27N, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27D, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27Q, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27G, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27K, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27P, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27S, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27T, desB30; insulina humana A13R, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13N, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13D, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13Q, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13E, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13G, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13H, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13K, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13P, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13S, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13T, A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16R, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16D, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16Q, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16H, B25H, desB30; insulina humana A14R, B25H, desB30; insulina humana A14N, B25H, desB30; insulina humana A14D, B25H, desB30; insulina humana A14Q, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, desB30; insulina humana A14G, B25H, desB30; insulina humana A14H, B25H, desB30; insulina humana A8H, B10D, B25H; e insulina humana A8H, A14E, B10E, B25H, desB30. Insulina é um hormônio polipeptídico secretado pelas células β do pâncreas. A insulina é composta de duas cadeias polipeptídicas, A e B, que são ligadas por duas pontes dissulfeto intercadeia. Além disso, a cadeia A possui uma ponte dissulfeto intracadeia.

O hormônio é sintetizado como uma pró-insulina precursora de cadeia única (pré-proinsulina) composta de um pré-peptídeo de 24 aminoá- cidos seguido pela pró-insulina que contém 86 aminoácidos na configuração: pré-peptídeo-B-Arg Arg-C-Lys Arg-A1 no qual C é um peptídeo de ligação de 31 aminoácidos. Arg-Arg e Lys-Arg são sítios de clivagem para clivagem do peptídeo de ligação das cadeias AeB.

Três métodos principais foram usados para a produção da insu- lina humana em micro-organismos. Dois envolvem Escherichia coli, com a expressão de uma grande proteína de fusão no citoplasma (Frank et al. (1981) em Peptides: Proceedings of the 7th American Peptide Chemistry Symposium (Rich & Gross1 eds.), Pierce Chemical Co., Rockford, III. pp 729- 739), ou usa-se um peptídeo sinal para permitir a secreção da substância no espaço periplasmático (Chan et al. (1981) PNAS 78:5401-5404). Um terceiro método utiliza Saccharomyces cerevisiae para secretar um precursor de in- sulina no meio (Thim et al. (1986) PNAS 83:6766-6770). A técnica prévia divulga um número de precursores de insulina que são expressos em E. coli ou em Saccharomyces cerevisiae, vide Patente U.S. N0 5.962.267, WO 95/16708, EP 0055945, EP 0163529, EP 0347845 e EP 0741188. Os análogos de insulina são produzidos através da expressão

de uma seqüência de DNA que codifica o análogo de insulina em questão em uma célula hospedeira adequada através da técnica bem-conhecida co- mo divulgado em, por exemplo, Patente US N0 6500645. O análogo de insu- lina é expresso diretamente ou como uma molécula precursora que tem uma extensão Terminal N na cadeia B. Esta extensão Terminal N pode ter a fun- ção de aumentar o rendimento do produto diretamente expresso e pode ser de até 15 resíduos de aminoácidos de comprimento. A extensão Terminal N deve ser clivada in vitro após isolamento a partir da cultura celular e por isso terá um sítio de clivagem próximo de B1. As extensões N-terminais do tipo adequado na presente invenção são divulgadas na Patente US N0 5.395.922 e na Patente Européia N0 765.395A.

O análogo de insulina isolado pode ser acilado na posição dese-

jada através de métodos de acilação bem-conhecidos e exemplos de tais análogos de insulina são descritos, por exemplo, nos pedidos de patente europeus tendo a publicação dos Nos EP 214826, EP 375437 e EP 383472.

A seqüência de ácido nucleico para codificação do respectivo análogo de insulina polipeptídico pode ser preparada sinteticamente através de métodos-padrão estabelecidos, por exemplo, o método fosforoamidita descrito por Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters 22:1859-1869, ou o método descrito por Matthes et al. (1984) EMBO Journal 3:801-805. De acordo com o método fosforoamidita, oligonucleotídeos são sintetizados, por exemplo, em um sintetizador de DNA automático, purificados, duplexados e ligados para formar o construto de DNA sintético. Um modo atualmente pre- ferencial para preparação do construto de DNA é pela reação em cadeia da polimerase (PCR).

As seqüências de ácido nucleico também podem ser de mistura genômica, cDNA, e de origem sintética. Por exemplo, uma seqüência genô- mica ou cDNA que codifica um peptídeo líder pode ser combinada a uma seqüência genômica ou cDNA que codifica as cadeias AeB, após a se- qüência de DNA pode ser modificada em um sítio através da inserção de oligonucleotídeos sintéticos que codificam a seqüência de aminoácidos de- sejada para recombinação homóloga conforme procedimentos bem- conhecidos ou preferencialmente geram a seqüência desejada através da PCR usando oligonucleotídeos adequados.

O vetor recombinante capaz de replicação no micro-organismo selecionado ou célula hospedeira e que transporta uma seqüência de ácido nucleico que codifica o análogo de insulina polipeptídico em questão pode ser vetor de replicação autônoma, isto é, um vetor que existe como uma en- tidade extracromossômica, do qual a replicação é independente da replica- ção cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromos- sômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter qualquer meio para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser aquele que, quando introduzido na célula hospedeira, é inte- grado no genoma e replicado em conjunto com o(s) cromossomo(s) ao(s) qual(is) tenha sido integrado. Além disso, um vetor único ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que em conjunto contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon podem ser usados. O vetor pode ser linear ou plasmídeos circulares fechados e pre- ferencialmente conterá elemento(s) que permita a integração estável do ve- tor no genoma da célula hospedeira ou a replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

Em uma modalidade, o vetor de expressão recombinante é ca- paz de replicação em levedura. Exemplos de seqüências que permitem ao vetor replicar na levedura são os genes REP 1-3 de replicação e origem de replicação em plasmídeo de levedura de 2 pm.

Os vetores podem conter um ou vários marcadores selecioná- veis que permitem a fácil seleção de células transformadas. Um marcador selecionável é o produto de um gene que fornece resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrófico a auxotrófico, e similares. Exem- plos de marcadores selecionáveis bacterianos são os genes dal de Bacillus subtilis ou Bacillus Iicheniformis, ou marcadores que conferem a resistência antibiótica, tal como resistência à ampicilina, à canamicina, a cloranfenicol ou à tetraciclina. Marcadores selecionáveis para uso em uma célula hospe- deira fúngica filamentosa incluem amdS (acetamidase), argB (ornitina car- bamoiltransferase), pyrG (orotidina-5'-fosfato decarboxilase) e trpC (antrani- Iato sintase). Marcadores adequados para células hospedeiras de levedura são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, e URA3. Um marcador sele- cionável bem apropriado para levedura é o gene TPI de Schizosaccharomy- ces pompe (Russell (1985) Gene 40:125-130).

No vetor, a seqüência de ácido nucleico está operacionalmente unida a uma seqüência de promotor adequada. O promotor pode ser qual- quer seqüência de ácido nucleico que mostre atividade transcricional na cé- lula hospedeira de escolha incluindo promotores mutantes, truncados, e hí- bridos, e pode ser obtido de genes que codificam polipeptídeos extracelula- res ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição

em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos do operon Iac de E. coli, gene da agarase de Streptomyces coelicolor (dagA), gene da Ievanasacarase de Bacillus subtilis (sacB), gene da alfa-amilase de Bacillus Iieheniformis (amila), gene da amilase maltogênica de Bacillus stearother- mophilus (amyM), gene da alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaeiens (amyQ), e gene da penicilinase de Bacillus Iieheniformis (penP). Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição em uma célula hospedei- ra fúngica filamentosa são promotores obtidos dos genes da TAKA amilase de Aspergillus oryzae, proteinase aspártica de Rhizomueor miehei, alfa- amilase neutra de Aspergillus niger, e alfa-amilase ácida estável de Aspergil- Ius niger. Em um hospedeiro de levedura, promotores úteis são os promoto- res Saccharomyees eerevisiae Ma1, TPI1 ADH ou PGK.

O construto de ácido nucleico também será tipicamente opera- cionalmente ligado a um terminador adequado. Na levedura, um terminador adequado é o terminador TPI (Alber et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:419- 434).

Os procedimentos usados para ligar as seqüências de ácido nu- cleico individuais contidas no vetor de expressão, tais como DNA de codifi- cação do análogo de insulina polipeptídico desejado, o promotor e o termi- nador, respectivamente, e inseri-los em um vetor adequado que contém a informação necessária para replicação no hospedeiro selecionado, são bem- conhecidos por versados na técnica. Será entendido que o vetor pode ser construído pela preparação inicial de um construto de DNA contendo a se- qüência de DNA inteira que codifica os polipeptídeos do análogo de insulina da invenção, e posteriormente inserindo este fragmento em um vetor de ex- pressão adequado, ou sucessivamente através da inserção de fragmentos de DNA contendo informação genética para os elementos individuais (tais como sinal, pró-peptídeo, peptídeo de ligação, cadeias AeB) seguido pela ligação.

O vetor compreendendo tal seqüência de ácido nucleico é intro- duzido na célula hospedeira para que o vetor seja mantido como uma parte integrante cromossômica ou como um vetor extracromossômico autorreplica- tivo como descrito anteriormente. O termo "célula hospedeira" abrange qual- quer progênie de uma célula precursora que não é idêntica à célula precur- sora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A célula hospe- deira pode ser um micro-organismo unicelular, por exemplo, um procarioto, ou micro-organismo não-unicelular, por exemplo, um eucarioto. Células uni- celulares úteis são células bacterianas, tais como bactérias gram-positivas incluindo, mas não limitadas a, célula de Bacillus, célula de Streptomyces, ou bactérias gram-negativas, tais como E. coli e Pseudomonas sp. Células eucariotas podem ser de mamífero, inseto, planta, ou células fúngicas. Em uma modalidade preferencial, a célula hospedeira é uma célula de levedura. O organismo de levedura usado no processo da invenção pode ser qualquer organismo de levedura adequado que, em cultivo, produz grandes quantida- des da insulina de cadeia única da invenção. Exemplos de organismos de levedura adequados são cepas selecionadas a partir das espécies de Ieve- dura Saccharomyces eerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaeeha- romyees pombe, Saeehoromyees uvarum, Kluyveromyces laetis, Hansenula polymorpha, Piehia pastoris, Piehia methanoliea, Piehia kluyveri, Yarrowia lipolytiea, Candida sp., Candida utilis, Candida eaeaoi, Geotriehum sp., e Geotriehum fermentans. A transformação das células de levedura pode ser, por exemplo,

efetuada pela formação de protoplastos seguida pela transformação em uma maneira conhecida per se. O meio usado para cultivo das células pode ser qualquer meio convencional adequado ao crescimento de organismos de levedura. O análogo de insulina polipeptídico secretado, uma proporção sig- nificante do qual estará presente no meio na forma corretamente processa- da, pode ser recuperado do meio por procedimentos convencionais incluindo a separação das células de levedura do meio por centrifugação, filtração ou captura do precursor de insulina por uma matriz de troca iônica ou por uma matriz de absorção de fase reversa, precipitação dos componentes proteicos do sobrenadante ou filtrado por meio de um sal, por exemplo, sulfato de a- mônio, seguido pela purificação através de vários procedimentos cromato- gráficos, por exemplo, cromatografia de troca iônica, cromatografia de afini- dade, ou similares. Composições Farmacêuticas

Outro objetivo da presente invenção é fornecer uma formulação farmacêutica compreendendo um análogo de insulina de acordo com a pre- sente invenção que está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 500 mg/ml, e em que a dita formulação tenha um pH de 2,0 a 10,0. A formulação pode compreender, além disso, inibidor(es) de protease, um sistema de tampões, conservante(s), agente(s) de tonicidade, agente(s) quelante(s), estabilizadores e tensoativos. Em uma modalidade da invenção, a formula- ção farmacêutica é uma formulação aquosa, isto é, formulação compreen- dendo água. Tal formulação é tipicamente uma solução ou uma suspensão. Em uma modalidade adicional da invenção, a formulação farmacêutica é uma solução aquosa. O termo "formulação aquosa" é definido como uma formulação compreendendo pelo menos 50% em p/p de água. Do mesmo modo, o termo "solução aquosa" é definido como uma solução compreen- dendo pelo menos 50% em p/p de água, e o termo "suspensão aquosa" é definido como uma suspensão compreendendo pelo menos 50% em p/p de água.

Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é uma formu- lação congelada a vácuo, para que o médico ou o paciente acrescentem di- Iuentes e/ou solventes antes do uso.

Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é uma formu- lação seca (por exemplo, seca por congelamento ou seca por atomização) pronta para o uso sem qualquer dissolução prévia. Em uma modalidade adicional, a invenção relaciona-se a uma

formulação farmacêutica compreendendo uma solução aquosa de um aná- logo de insulina da presente invenção, e um tampão, em que o dito análogo de insulina esteja presente em uma concentração de 0,1 mg/ml ou acima, e em que a dita formulação tenha um pH de aproximadamente 2,0 a aproxi- madamente 10,0.

Formulações destinadas para o uso oral podem ser preparadas de acordo com qualquer método conhecido, e tais formulações podem con- ter um ou vários reagentes selecionados a partir do grupo consistindo em agentes adoçantes, agentes aromatizantes, agentes coloríficos e agentes conservantes a fim de fornecer preparações farmaceuticamente saborosas e palatáveis. Comprimidos podem conter o ingrediente ativo em uma mistura com excipientes farmaceuticamente aceitáveis não-tóxicos que são adequa- dos para a produção de comprimidos. Estes excipientes podem ser, por e- xemplo, diluentes inertes, tais como manitol, maltodextrina, caulim, carbona- to de cálcio, carbonato de sódio, lactose, fosfato de cálcio ou fosfato de só- dio; agentes granulantes e desintegrantes, por exemplo, amido de milho; agentes ligantes, por exemplo, amido, gelatina, polímero ou acácia; e agen- tes lubrificantes, por exemplo, estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco. Os comprimidos podem não ser revestidos ou podem ser revestidos por técnicas conhecidas para retardar a desintegração ou a liberação do po- lipeptídeo terapeuticamente ativo. As formulações oralmente administráveis da presente invenção

podem ser preparadas e administradas de acordo com métodos bem- conhecidos na química farmacêutica, ver Remington's Pharmaceutical Sci- ences, 17th ed. (A. Osol ed., 1985).

Em uma modalidade da invenção, as composições farmacêuti- cas da presente invenção podem ser administradas por meio de formas de dosagem sólidas, tais como comprimidos e cápsulas. Os comprimidos po- dem ser preparados através de granulação úmida, através de granulação seca, através de compressão direta ou granulação por fusão.

Comprimidos desta invenção podem ser preparados utilizando técnicas de prensagem em comprimido convencionais. Um método geral de produção implica a mistura de um análogo de insulina, um diluente solúvel em água, um Iigante hidrofílico e opcionalmente uma porção de um desinte- grante. Esta mistura então é granulada com uma solução aquosa do Iigante hidrofílico ou uma solução aquosa do Iigante hidrofílico e tensoativo e tritura- da, se necessário. Os grânulos são secos e reduzidos a um tamanho ade- quado. Qualquer outro ingrediente, tais como lubrificantes, (por exemplo, estearato de magnésio) e desintegrantes adicionais, são adicionados aos grânulos e misturados. Esta mistura então é comprimida em um tamanho e forma adequados usando máquinas de prensagem em comprimido conven- cionais, tais como uma prensa rotativa de comprimido. Os comprimidos po- dem ser revestidos com filme através de técnicas bem-conhecidas na técni- ca.

Formulações para uso oral também podem ser apresentadas como cápsulas de gelatina duras ou moles onde o ingrediente ativo é mistu- rado com um diluente sólido inerte, por exemplo, tal como manitol, maltodex- trina, carbonato de cálcio, carbonato de sódio, lactose, caulim, fosfato de cálcio ou fosfato de sódio, ou uma cápsula de gelatina mole em que o ingre- diente ativo é misturado com a água ou um meio oleoso, por exemplo, óleo de amendoim, parafina líquida, ou óleo de oliva.

Cápsulas para esta invenção podem ser preparadas utilizando métodos convencionais. Um método geral para a produção implica a mistura de um peptídeo terapeuticamente ativo, alginato, um diluente solúvel em á- gua, um Iigante hidrofílico, e opcionalmente uma porção de um desintegran- te. Esta mistura então é granulada com uma solução aquosa do Iigante hi- drofílico ou uma solução aquosa do Iigante hidrofílico e tensoativo em água, e triturada, se necessário. Os grânulos são secos e reduzidos a um tamanho adequado. Quaisquer outros ingredientes, tais como um lubrificante, são a- dicionados aos grânulos e misturados. A mistura resultante é então enchida em uma cápsula de gelatina dura de tamanho adequado usando máquinas de enchimento de cápsula convencionais.

Em uma modalidade adicional da invenção, o tampão é selecio- nado a partir do grupo consistindo em acetato de sódio, carbonato de sódio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, di-hidrogenofosfato de sódio, hidrogenofosfato dissódico, fosfato de sódio, e tris(hidroximetil)- amiriometano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico ou misturas dos mesmos. Cada um destes tampões específicos constitui uma modalidade alternativa da inven- ção.

Em uma modalidade adicional da invenção, a formulação com-

preende ainda um conservante farmaceuticamente aceitável. O conservante está presente em uma quantidade suficiente para obtenção de um efeito conservante. A quantidade do conservante em uma formulação farmacêutica é bem-conhecida para a pessoa versada e pode ser determinada, por exem- pio, a partir da literatura no campo e/ou quantidade(s) conhecida(s) de con- servantes, por exemplo, em produtos comerciais. Cada um destes conser- vantes específicos constitui uma modalidade alternativa da invenção. O uso de um conservante em composições farmacêuticas é bem-conhecido para a pessoa versada. Por conveniência referência é feita a Remington: The Sci- enee and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.

Em uma modalidade adicional da invenção, a formulação com- preende ainda um agente quelante. O uso de um agente quelante em com- posições farmacêuticas é bem-conhecido para a pessoa versada. Por con- veniência referência é feita a Remington: The Science and Practice of Phar- maey, 19th edition, 1995.

Em uma modalidade adicional da invenção, a formulação com- preende ainda um estabilizador. O termo "estabilizador" como usado neste pedido refere-se a produtos químicos adicionados às formulações farmacêu- ticas contendo polipeptídeo para estabilizar o peptídeo, isto é, aumentar a vida útil e/ou o tempo em uso de tais formulações. O uso de um estabilizador em composições farmacêuticas é bem-conhecido para a pessoa versada. Por conveniência referência é feita a Remington: The Science and Practice ofPharmacy, 19th edition, 1995.

Em uma modalidade adicional da invenção, a formulação com- preende ainda um tensoativo. O termo "tensoativo" como usado neste pedi- do refere-se a quaisquer moléculas ou íons que são compreendidos de uma parte solúvel em água (hidrofílica), a cabeça, e um segmento solúvel em gordura (lipofílico). Tensoativos acumulam-se preferencialmente em interfa- ces, na qual a parte hidrofílica é orientada em direção à água (fase hidrofíli- ca) e a parte lipofílica em direção ao óleo - ou fase hidrofóbica (isto é, vidro, ar, óleo etc.). A concentração na qual tensoativos começam a formar micelas é conhecida como a concentração micelar crítica ou CMC. Além disso, ten- soativos reduzem a tensão superficial de um líquido. Tensoativos também são conhecidos como compostos antipáticos. O termo "Detergente" é um sinônimo usado para tensoativos em geral. O uso de um tensoativo em composições farmacêuticas é bem-conhecido para a pessoa versada. Por conveniência referência é feita a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.

Em uma modalidade adicional da invenção, a formulação com- preende ainda inibidores de protease.

É possível que outros ingredientes possam estar presentes na formulação farmacêutica do análogo de insulina da presente invenção. Tais ingredientes adicionais podem incluir agentes umectantes, emulsificadores, antioxidantes, agentes de volume, modificadores de tonicidade, agentes quelantes, íons metálicos, veículos oleaginosos, proteínas (por exemplo, albumina sérica humana, gelatina ou proteína) e um zwitterion (por exemplo, aminoácido, tal como betaína, taurina, arginina, glicina, Iisina e histidina). Tais ingredientes adicionais, naturalmente, não devem afetar adversamente a estabilidade total da formulação farmacêutica da presente invenção.

Composições farmacêuticas contendo um análogo de insulina de acordo com a presente invenção podem ser administradas a um paciente com necessidade de tal tratamento em vários sítios, por exemplo, em sítios tópicos, por exemplo, pele e sítios mucosos, em sítios para desvio de absor- ção, por exemplo, administração em uma artéria, em uma veia, no coração, e em sítios que implicam absorção, por exemplo, a administração na pele, subcutânea, em um músculo ou no abdome. A administração de composições farmacêuticas de acordo com

a invenção pode ser por várias vias de administração, por exemplo, lingual, sublingual, bucal, na boca, oral, no estômago e intestino, nasal, pulmonar, por exemplo, através dos bronquíolos e alvéolos ou combinação dos mes- mos, epidérmicos, dérmico, transdérmico, vaginal, retal, ocular, para exem- plos através da conjuntiva, uretral, e parenteral a pacientes com necessida- de de tal tratamento.

Composições da corrente invenção podem ser administradas

em várias formas de dosagem, por exemplo, como soluções, suspensões, emulsões, microemulsões, emulsão múltipla, espumas, pomadas, pastas, bandagens, unguentos, comprimidos, comprimidos revestidas, enxaguantes, cápsulas, por exemplo, cápsulas duras de gelatina e cápsulas moles de ge- latina, supositórios, cápsulas retais, gotas, géis, pulverizadores, pó, aeros- sóis, inaladores, gotas oculares, unguentos oftálmicos, enxaguantes oftálmi- cos, pessários vaginais, anéis vaginais, pomadas vaginais, solução de inje- ção, soluções de transformação in situ, por exemplo, coagulação in situ, co- locação in situ, precipitação in situ, cristalização in situ, solução de infusão, e implantes.

Composições da invenção podem ainda ser combinadas em, ou anexadas a, por exemplo, através de interações covalentes, hidrofóbicas e eletrostáticas, um veículo de droga, sistema de liberação de fármaco e sis- tema de liberação de fármaco avançado a fim de ainda potencializar a esta- bilidade do composto análogo de insulina, aumentar biodisponibilidade, au- mentar solubilidade, reduzir efeitos adversos, realizar cronoterapia bem- conhecida aos versados na técnica, e aumentar a adaptação do paciente ou qualquer combinação dos mesmos.

Composições da presente invenção são úteis na formulação de sólidos, semissólidos, pó e soluções para administração pulmonar do análo- go de insulina, utilizando, por exemplo, um inalador de dose medida, inala- dor de pó seco e um nebulizador, todos sendo dispositivos bem-conhecidos aos versados na técnica.

Composições da corrente invenção podem ser úteis na formula- ção de sistemas de liberação de fármaco controlados, sustentados, prolon- gados, retardados, e lentos. Mais especificamente, mas não limitado a, as composições podem ser úteis na formulação de liberação parenteral contro- Iada e sistemas de liberação sustentados (ambos os sistemas levam a uma redução de muitas vezes no número de administrações), bem-conhecidos aos versados na técnica. Até mais preferencialmente, são sistemas de libe- ração controlada e liberação sustentada administrados subcutaneamente.

Sem limitar o escopo da invenção, exemplos de sistema de liberação contro- lada útil e composições são hidrogéis, géis oleaginosos, cristais líquidos, micelas poliméricas, microesferas, nanopartículas.

Métodos para produção de sistemas de liberação controlados úteis para composições da presente invenção incluem, mas não são Iimita- dos a, cristalização, condensação, cocristalização, precipitação, coprecipita- ção, emulsificação, dispersão, homogeneização de alta pressão, encapsu- lamento, secagem por pulverização, microencapsulamento, coacervação, separação de fase, evaporação de solvente para produção de microesferas, extrusão e processos de fluidos supercríticos. Referência geral é feita a Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L., ed. Mareei Dekker, New York, 2000) e Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E.J., ed. Mareei Dekker, New York, 2000).

Administração parenteral pode ser realizada por injeção subcu- tânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa por meio de uma serin- ga, opcionalmente uma seringa tipo caneta. Alternativamente, a administra- ção parenteral pode ser realizada por meio de uma bomba de infusão. Uma opção adicional é uma composição que pode ser uma solução ou suspensão para a administração do composto análogo de insulina na forma de pulveri- zador nasal ou pulmonar. Ainda como uma opção adicional, as composições farmacêuticas contendo o composto análogo de insulina da invenção tam- bém podem ser adaptadas à administração transdérmica, por exemplo, pela injeção sem agulha ou por um adesivo, opcionalmente um adesivo iontoforé- tico, ou transmucosal, por exemplo, administração bucal. O análogo de insulina de acordo com a invenção pode ser ad-

ministrado através da via pulmonar em veículo, como uma solução, suspen- são ou pó seco usando algum dos tipos conhecidos de dispositivos adequa- dos para a liberação pulmonar de droga. Exemplos destes compreendem de, mas não são limitados a, os três tipos gerais de geração de aerossol para a liberação de fármaco pulmonar, e podem incluir nebulizadores de jato ou ultrassônicos, inaladores de dose medida, ou inaladores de pó seco (Cf. Yu J, Chien YW. Pulmonary drug delivery: Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14 (4) (1997) 395-453).

Em uma modalidade adicional, a formulação pode ser aerossoli- zada por alguma tecnologia de aerossolização conhecida, tal como nebuli- zação, para atingir um MMAD de partículas de aerossol com menos de 10 pm, mais preferencialmente entre 1 a 5pm, e ainda mais preferencialmente entre 1 a 3 μιτι. O tamanho de partícula preferencial é baseado no tamanho mais eficaz para a liberação do fármaco ao pulmão profundo, onde a proteí- na é otimamente absorvida (cf. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer A, Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84 (2) (1998) 379-385).

Deposição no pulmão profundo das formulações pulmonares compreendendo o composto análogo de insulina pode ser opcionalmente ainda otimizada através do uso de modificações das técnicas de inalação, por exemplo, mas não limitado a: fluxo de inalação lento (por exemplo, 30 L/min), retenção de respiração e tempo de acionamento.

O termo "formulação estabilizada" refere-se a uma formulação com a estabilidade física aumentada, a estabilidade química aumentada ou a estabilidade física e química aumentadas.

O termo "estabilidade física" da formulação proteica como usado neste pedido refere-se à tendência da proteína de formar agregados biologi- camente inativos e/ou insolúveis da proteína em conseqüência da exposição da proteína a estresse termomecânico e/ou interação com interfaces e su- perfícies que são desestabilizadoras, tais como superfícies e interfaces hi- drofóbicas. A estabilidade física das formulações proteicas aquosas é avali- ada por meio de inspeção visual e/ou medidas de turvação de após exposi- ção da formulação enchida em recipientes adequados (por exemplo, cartu- chos ou frascos) a estresse mecânico/físico (por exemplo, agitação) a tem- peraturas diferentes em vários períodos de tempo. A inspeção visual das formulações é realizada em uma luz focada pontualmente em um fundo es- curo. A turvação da formulação é caracterizada por uma nota visual que po- siciona o grau da turvação, por exemplo, em uma escala de 0 a 3 (uma for- mulação mostrando que nenhuma turvação eqüivale a uma nota visual 0, e uma formulação mostrando que a turvação visual na luz do dia eqüivale à nota visual 3). Uma formulação é classificada fisicamente instável com res- peito à agregação de proteína, quando mostra turvação visual à luz do dia. Alternativamente, a turvação da formulação pode ser avaliada por medições de turvação simples bem-conhecidas para a pessoa versada. A estabilidade física das formulações protéicas aquosas também pode ser avaliada através do uso de um agente espectroscópico ou sonda de posição conformacional da proteína. A sonda é preferencialmente uma pequena molécula que prefe- rencialmente se liga a um confôrmero não-nativo da proteína. Um exemplo de uma sonda espectroscópica molecular pequena da estrutura proteica é Tioflavina T. Tioflavina T é corante fluorescente que foi largamente usado para a detecção de fibrilas amilóides. Na presença de fibrilas, e possivel- mente outras configurações de proteína também, Tioflavina T dá a origem a um novo máximo de excitação em aproximadamente 450nm e emissão po- tencializada em aproximadamente 482nm quando ligado a uma forma de proteína fibrila. Tioflavina T não-ligada é essencialmente não-fluorescente nos comprimentos de onda.

Outras moléculas pequenas podem ser usadas como sondas das modificações na estrutura proteica natural a estados não-nativos. Por exemplo, sondas de "parte hidrofóbica" que se ligam preferencialmente a partes hidrofóbicas expostas de uma proteína. As partes hidrofóbicas estão geralmente enterradas na estrutura terciária de uma proteína no seu estado nativo, mas se tornam expostos à medida que uma proteína começa a se abrir ou se desnaturar. Exemplos destas pequenas sondas espectroscópicas moleculares são corantes aromáticos, hidrofóbicos, tais como antraceno, acridina, fenantrolina ou similares. Outras sondas espectroscópicas são complexos metálicos de aminoácido, tais como os complexos metálicos de cobalto de aminoácidos hidrofóbicos, tais como fenilalanina, leucina, isoleu- cina, metionina, e valina, ou similares.

O termo "estabilidade química" da formulação proteica como usado neste pedido refere-se a modificações químicas covalentes na estru- tura proteica levando à formação de produtos de degradação química com possível menor potência biológica e/ou propriedades imunogênicas potenci- ais aumentadas em comparação com a estrutura proteica nativa. Vários pro- dutos de degradação química podem ser formados dependendo do tipo e natureza da proteína nativa e o ambiente ao qual a proteína é exposta. Eli- minação da degradação química muito provavelmente não pode ser comple- tamente evitada e aumento das quantidades de produtos de degradação química muitas vezes é visto durante o armazenamento e o uso da formula- ção proteica, como bem-conhecido pela pessoa versada na técnica. A maior parte das proteínas está propensa a deamidação, processo no qual o grupo amida da cadeia lateral nos resíduos glutaminila ou asparaginila é hidrolisa- do para formação de um ácido carboxílico livre. Outras vias de degradação implicam a formação de produtos de transformação de altos pesos molecula- res onde duas ou mais moléculas de proteína são covalentemente ligadas uma a outra por transamidação e/ou interações de dissulfeto levando a for- mação de dímero, oligômero e produtos de degradação de polímero ligados covalentemente, (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992). Oxidação (de, por exemplo, resíduos de metionina) pode ser mencionada como outra variante de degradação química. A estabilidade química da formulação proteica pode ser avaliada através da medida da quantidade de produtos de degradação química em vários pontos do tempo após exposição a condições ambientais diferentes (a formação de produtos de degradação muitas vezes pode ser acelerada, por exemplo, através do aumento da temperatura). A quantidade de cada produto de degradação individual muitas vezes é determinada pela separa- ção dos produtos de degradação dependendo da carga e/ou tamanho da molécula usando várias técnicas de cromatografia (por exemplo, SEC-HPLC e/ou RP-HPLC). Portanto, como delineado acima, uma "formulação estabilizada" refere-se a uma formulação com a estabilidade física aumentada, estabilida- de química aumentada ou estabilidade física e química aumentadas. Em geral, uma formulação deve ser estável durante o uso e o armazenamento (de acordo com as condições de uso recomendadas e armazenamento) até que a data de validade seja atingida.

Em uma modalidade da invenção a formulação farmacêutica compreendendo o composto análogo de insulina é estável durante mais de 6 semanas de uso e durante mais de 3 anos de armazenamento. Em outra modalidade da invenção a formulação farmacêutica

compreendendo o composto análogo de insulina é estável durante mais de 4 semanas de uso e durante mais de 3 anos de armazenamento.

Em uma modalidade adicional da invenção, a formulação farma- cêutica compreendendo o composto análogo de insulina é estável durante mais de 4 semanas de uso e durante mais de dois anos de armazenamento.

Ainda em mais uma modalidade adicional da invenção a formu- lação farmacêutica compreendendo o composto análogo de insulina é está- vel durante mais de duas semanas de uso e durante mais de dois anos de armazenamento.

Suspensões aquosas podem conter os compostos ativos na

mistura com excipientes adequados para a produção de suspensões aquo- sas.

Suspensões oleosas podem ser formuladas através da suspen- são do ingrediente ativo em um óleo vegetal, por exemplo, óleo de amendo- im, óleo de oliva, óleo de sésamo ou óleo de coco, ou em um óleo mineral, tal como uma parafina líquida. As suspensões oleosas podem conter um agente espessante, por exemplo, cera de abelha, parafina dura ou álcool cetílico. Agentes adoçantes, tais como os apresentados acima, e agentes aromatizantes podem ser adicionados para fornecer uma preparação oral palatável. Estas formulações podem ser conservadas através da adição de um antioxidante, tal como ácido ascórbico.

Pós dispersíveis e grânulos adequados para a preparação de uma suspensão aquosa através da adição de água fornecem o composto ativo na mistura com um agente de dispersão ou umectante, agente de sus- pensão e um ou vários conservantes. Agentes de dispersão ou umectantes e agentes de suspensão adequados são exemplificados por aquele já mencio- nado acima. Excipientes adicionais, por exemplo, agentes adoçantes, aro- matizantes, e coloríficos também podem estar presentes.

As formulações farmacêuticas compreendendo um composto para uso de acordo com a presente invenção também podem estar na forma de emulsões óleo-em-água. A fase oleosa pode ser um óleo vegetal, por exemplo, óleo de oliva ou óleo de amendoim, ou um óleo mineral, por exem- plo, uma parafina líquida, ou uma mistura dos mesmos. Agentes emulsio- nantes adequados podem ser gomas de ocorrência natural, por exemplo, goma de acácia ou goma tragacanta, fosfatídeos de ocorrência natural, por exemplo, soja, lecitina, e ésteres ou ésteres parciais obtidos de ácidos gra- xos e hexitol anidridos, por exemplo, mono-oleato de sorbitano, e produtos de condensação dos ditos ésteres parciais com o óxido de etileno, por e- xemplo, polioxietileno monooleato de sorbitano. As emulsões também po- dem conter agentes adoçantes e aromatizantes.

Xaropes e elixires podem ser formulados com agentes adoçan- tes, por exemplo, glicerol, propileno glicol, sorbitol ou sacarose. Tais formu- lações também podem conter um agente calmante, conservante e aromati- zante e colorífico.

Em uma modalidade adicional da invenção, a formulação ainda compreende um potencializador de permeação. Considera-se muitas vezes que sais de bile e ácidos graxos aumentam a permeabilidade oral das mem- branas de bicamada Iipidica do revestimento celular epitelial do trato Gl. Em geral, os potencializadores de permeação aumentam o transporte paracelu- Iar e transcelular de macromoléculas através da alteração reversível da inte- gridade da membrana. O sal de bile é selecionado a partir do grupo consis- tindo em colato, deoxicolato, taurocolato, glicocolato, taurodeoxicolato, urso- deoxicolato, tauroursodeoxicolato, e quenodeoxicolato. Os ácidos graxos são selecionados a partir do grupo de ácidos graxos de cadeia curta, média e longa, tais como ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido mirísti- co, ácido palmítico, ácido esteárico etc. Outros potencializadores podem ser tensoativos, tais como monoglicerídeos, ésteres de polioxietileno, tensoati- vos de sorbitano (não-iônico) e sulfatos (aniônico).

Em uma modalidade adicional da invenção, a formulação ainda

compreende um polímero mucoadesivo. Um contato íntimo do sistema de liberação de fármaco com a mucosa do trato gastrointestinal pode ser obtido através do uso de tal polímero mucoadesivo. Um contato íntimo da forma de dosagem com a membrana parece vantajoso visto que uma degradação en- zimática do polipeptídeo terapeuticamente ativo a caminho entre o sistema de liberação e a membrana absorvente pode ser evitada. Além disso, uma etapa de gradiente de concentração na membrana absorvente representan- do a força motriz para a absorção passiva do fármaco pode ser fornecida.

Em uma modalidade adicional da invenção, a formulação com- preende ainda um inibidor de enzima(s) proteolítica(s) para driblar, além dis- so, a barreira enzimática e executando a liberação do polipeptídeo terapeuti- camente ativo, tal como inibidor de aminopeptidase, amastatina, bestatina, boroleucina e puromicina. Exemplos de inibidores de protease são glicolato de sódio, mesilato de camostato, bacitracina, inibidor de tripsina de soja e aprotinina.

Microencapsulamento e encapsulamento são técnicas usadas em sistemas de liberação de fármaco de polipeptídeos terapeuticamente ativos para otimização das propriedades de liberação incluindo proteção em relação à degradação enzimática. Microencapsulamento ou encapsulamento podem estar na forma de sistemas poliméricos de liberação de droga, tais como hidrogéis e nanocápsulas/microesferas, e sistemas lipídicos de libera- ção de droga, tais como Iipossomas e microemulsões.

Formulações da presente invenção podem ser administradas em várias formas de dosagem, por exemplo, como soluções, suspensões, mi- cro- e nanossuspensão, emulsões, microemulsões, emulsão múltipla, espu- mas, pomadas, pastas, unguentos, comprimidos, comprimidos com revesti- mento, comprimidos efervescentes, comprimidos sublinguais, comprimidos orais, cápsulas, por exemplo, cápsulas de gelatina dura e cápsulas de gela- tina mole, pó, grânulos, soluções de transformação in situ, por exemplo, na gelificação in situ, na solidificação in situ, na precipitação in situ, na cristali- zação in situ, formulação de flutuação estomacal, tais como suspensão de flutuação, comprimido de flutuação ou similar.

Em outra modalidade, a presente invenção relaciona-se a um análogo de insulina de acordo com a invenção para uso como um medica- mento.

Em uma modalidade, um análogo de insulina de acordo com a invenção é usado para a preparação de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de hiperglicemia, diabetes tipo 2, tolerância à glicose diminu- ída, diabetes tipo 1, obesidade, hipertensão, síndrome X, dispilidemia, dis- túrbios cognitivos, aterosclerose, enfarte do miocárdio, derrame, doença co- ronariana e outros distúrbios cardiovasculares, síndrome inflamatória intesti- nal, dispepsia e úlceras gástricas.

Em outra modalidade, um análogo de insulina de acordo com a invenção é usado como um medicamento para retardar ou prevenir a pro- gressão da doença no diabetes tipo 2.

Em outra modalidade, um análogo de insulina de acordo com a invenção é usado como um medicamento para redução da ingestão alimen- tar, redução da apoptose das células β, aumento da função das células β e da quantidade de células β e/ou para restituição da sensibilidade das células β à glicose.

Em uma modalidade da invenção, o derivado de acordo com a invenção é para uso como um medicamento para o tratamento ou a preven- ção da hiperglicemia, diabetes tipo 2, tolerância à glicose diminuída, diabe- tes tipo 1, obesidade, hipertensão, síndrome X, dispilidemia, distúrbios cog- nitivos, aterosclerose, enfarte do miocárdio, doença coronariana e outros distúrbios cardiovasculares, derrame, síndrome inflamatória intestinal, dis- pepsia e úlceras gástricas ou para retardar ou prevenir a progressão da do- ença no diabetes tipo 2 ou para redução da ingestão alimentar, redução da apoptose das células β, aumento da função das células β e da quantidade de células β e/ou para restituição da sensibilidade das células β à glicose, é fornecido.

Em uma modalidade adicional da invenção, um método para tra- tamento ou prevenção da hiperglicemia, diabetes tipo 2, tolerância à glicose diminuída, diabetes tipo 1, obesidade, hipertensão, síndrome X, dispilidemia, distúrbios cognitivos, aterosclerose, enfarte do miocárdio, doença coronaria- na e outros distúrbios cardiovasculares, derrame, síndrome inflamatória in- testinal, dispepsia e úlceras gástricas ou para retardar ou prevenir a pro- gressão de doença no diabetes tipo 2 ou para redução da ingestão alimen- tar, redução da apoptose das células β, aumento da função das células β e da quantidade de células β e/ou para restituição da sensibilidade das células β à glicose, o método compreendendo administração a um paciente necessi- tando de tal tratamento uma quantidade eficaz de tal tratamento de um aná- logo de insulina de acordo com a invenção, é fornecido. O tratamento com um análogo de insulina de acordo com a pre-

sente invenção também pode ser combinado com um segundo ou mais substâncias farmacologicamente ativas, por exemplo, selecionados a partir de agentes antidiabéticos, agentes antiobesidade, agentes de regulação do apetite, agentes anti-hipertensivos, agentes para tratamento e/ou prevenção de complicações resultantes ou associadas com diabetes e agentes para tratamento e/ou prevenção de complicações e distúrbios resultantes ou as- sociados com obesidade. Exemplos destas substâncias farmacologicamente ativas são: GLP-1 e derivados e análogos de GLP-1, GLP-2 e derivados e análogos GLP-2, Exendina-4 e derivados e análogos de Exendina-4, amilina e derivados e análogos de amilina, sulfonilureias, biguanidas, meglitinidas, inibidores da glicosidase, antagonistas de glucagon, inibidores de DPP-IV (dipeptidil peptidase-IV), inibidores de enzimas hepáticas envolvidas na es- timulação da gliconeogênese e/ou glicogenólise, moduladores da absorção de glicose, compostos que modificam o metabolismo lipídico, tais como a- gentes de anti-hiperlipidêmicos como inibidores da HMG-CoA (estatinas), compostos que reduzem a ingestão alimentar, agonistas de RXR e agentes que atuam sobre o canal de potássio ATP-dependente das células β; Coles- tiramina, colestipol, clofibrato, genfibrozila, lovastatina, pravastatina, sinvas- tatina, probucol, dextrotiroxina, neteglinida, repaglinida; β-bloqueadores, tais como alprenolol, atenolol, timolol, pindolol, propranolol e metoprolol, inibido- res da ACE (enzima de conversão da angiotensina), tais como benazeprila, captoprila, enalaprila, fosinopriia, lisinoprila, alatrioprila, quinaprila e ramipri- Ia1 bloqueadores de canal de cálcio, tais como nifedipina, felodipina, nicardi- pina, isradipina, nimodipina, diltiazem e verapamila, e β-bloqueadores, tais como doxazosina, urapidila, prazosina e terazosina; agonistas de CART (transcrito regulado por cocaína e anfetamina), antagonistas de NPY (neuro- peptídeo Y), agonistas de MC4 (melanocortina 4), antagonistas de orexina, agonistas de TNF (fator de necrose tumoral), agonistas de CRF (fator de liberação de corticotropina), antagonistas de CRF BP (proteína de ligação ao fator de liberação de corticotropina), agonistas de urocortina, agonistas β3, agonistas de MSH (hormônio estimulante de melanócito), antagonistas de MCH (hormônio concentrador de melanina), agonistas de CCK (colecistoqui- nina), inibidores de recaptação de serotonina, inibidores de recaptação de serotonina e noradrenalina, compostos misturados de serotonina e noradre- nérgicos, agonistas de 5HT (serotonina), agonistas de bombesina, antago- nistas de galanina, hormônio de crescimento, compostos de liberação do hormônio de crescimento, agonistas de TRH (hormônio de liberação de tireo- tropina), moduladores de UCP 2 ou 3 (proteína desacopladora 2 ou 3), ago- nistas de leptina, agonistas de DA (bromocriptina, doprexina), inibidores de lipase/amilase, moduladores de RXR (receptor retinóide X), agonistas TR β; antagonistas de histamina H3, gastrina e análogos e derivados de gastrina. Deve-se entender que qualquer combinação adequada dos deri-

vados de acordo com a invenção com um ou vários dos compostos supraci- tados e ainda opcionalmente uma ou várias substâncias farmacologicamente ativas está dentro do escopo da presente invenção.

Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de patente, e patentes, citados neste pedido são por meio disso incorporados por refe- rência no seu conjunto e na mesma medida, como se cada referência fosse individualmente e especificamente indicada para ser incorporada por refe- rência e fosse apresentada em sua totalidade neste pedido (até ao limite máximo permitido por lei).

Todos os títulos e subtítulos são usados neste pedido somente para a conveniência e não devem ser interpretados como limitação da in- venção de nenhum modo.

O uso de todo e quaisquer exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, "tal como") fornecidos neste pedido, é destinado simplesmente para esclarecer melhor a invenção e não constitui uma limitação no escopo da invenção a menos que de outra maneira reivindicado. Nenhuma Iingua- gem no relatório deve ser interpretada como indicação de qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

A citação e a incorporação de documentos de patente neste pe- dido são feitas somente para a conveniência e não refletem nenhuma visão da validade, patentabilidade e/ou aplicabilidade de tais documentos de pa- tente.

Esta invenção inclui todas as modificações e os equivalentes dos assuntos referidas nas reivindicações anexas como permitido pela lei aplicável. EXEMPLOS EXEMPLO 1

Comparação da estabilidade proteolítica (Meia-vida) de B25H, A14E, A14E B25H e insulina humana em relação à pepsina. à quimotripsina. e à carboxipeptidase A

A estabilidade proteolítica da insulina humana e de análogos de insulina (0,06 mM, 10 pL) em relação à quimotripsina ou à pepsina (0,34 a 3,4 pg) foi medida após incubação em NH4HCO3 a 100 mM, pH 8,1 ou HCI a mM, pH 2,0, respectivamente e 25°C em um volume final de 100 pL. Em vários tempos (0, 5, 15, 30 e 60 minutos) as amostras foram temperadas com um volume igual de TFA a 0,5% ou TrisHCI a 0,1 m, pH 8,0 (pH final 7,7) e transferidas para 5°C. A insulina humana e os análogos de insulina foram imediatamente analisados por RP-HPLC em 214 nm e a área sob o pico correspondente à proteína intacta foi determinada. A estabilidade da insulina humana e dos análogos de insulina (0,06 mM, 13,9 pg) em relação à carboxipeptidase A (6,8 μΐ_ da solução de trabalho, 20mg/ml, 53 unidades/mg, Sigma C-9268) foi medida após incuba- ção em NaP a 5 mM, NaCI a 140 mM, Tween20 a 70 ppm, pH 7,4 e 37°C em um volume final de 400 μΙ_. Em vários tempos (5, 15, 30, 60 minutos) as a- mostras foram temperadas com um volume igual de TFA 0,2% e transferidas para 5°C. As amostras de referência (0 minuto) foram preparadas sem adi- ção das enzimas. A insulina humana e os análogos foram imediatamente analisados por RP-HPLC em um sistema de tampões neutros em 214 nm e a área sob o pico correspondente à proteína intacta foi determinada. Tempos de retenção idênticos foram observados para a insulina humana e desB30. meia-vidas (Ti/2) foram obtidas a partir das curvas e o aumento/redução em comparação com a insulina humana foi calculado (estabilidade relativa), meia-vidas semelhantes foram determinadas para a insulina humana, Ti/2 = 6,9 minutos, e insulina humana desB30, T1/2= 6,7. _

Sítio(s) de Mutação na T-i/2 [Min] (Ve- T1/2 (Min)/Vezes T1/2 (Min)/Vezes Insulina Humana zes) Pepsina Quimitripsina Carboxipeptidase A B25H 17,8 (16,2) 25,7 (5,1) 25,7 (2,1) Nenhum 1,1 (1,0) 5,0 (1,0) 6,9 (1,0) A14E, DESB30 3,7 (3,4) 33,2 (6,6) 15,7 (2,3) Nenhum 1,1 (1,0) 5,0 (1,0) 6,9 (1,0) A14E, B25H, DESB30 42,4 (38,5) 62,4 (12,5) 61,9 (9,0) Nenhum 1,1 (1,0) 5,0 (1,0) 6,9 (1,0)

EXEMPLO 2

Identificação de sítios de clivaaem de protease na insulina por análise de MS e especificidade enzimática

A identificação de sítios de clivagem de protease foi executada pela análise de curso de tempo de proteólise limitada de insulina e análogos de insulina por várias enzimas (pepsina, quimotripsina, carboxipeptidase A) por LC-MS. Os fragmentos peptídicos gerados foram identificados por MS ou MS/MS e quantificados em 214 nm a fim de identificar sítios de clivagem menores e principais (pontos quentes). Os pontos quentes seguintes da

10

15 pepsina (Β24-25, Β25-26, Β26-27) e quimotripsina (B16-17, B24-25, B25-26, B26-27, A14-15 e A19-20) dentro da insulina humana foram identificados. De maneira interessante, os pontos quentes ficam sobrepostos com a enzima de degradação da insulina (IDE), visto abaixo, e catepsina D (Hanne Refs- gaard, Novo Nordisk A/S, personal communication).

Os sítios de clivagem na seqüência da insulina também foram preditos com base na especificidade enzimática da quimotripsina, tripsina e enzima de degradação da insulina (IDE) como mostrado no exemplo 3 abai- xo. Os sítios de clivagem preditos para tripsina (resíduos básicos, C-term. pa- ra Lys, Arg), elastase (resíduos alifáticos, C-term. para Ala, Vai, Gly, Ser), car- boxipeptidase A (larga especificidade, mas não para Arg, Lys & Pro), pepsina A (resíduos aromáticos, N-term. para Trp, Tyr, Phe, e Leu e vários outros re- síduos), e quimotripsina (resíduos aromáticos, C-term. para Trp, Tyr, Phe, e Leu, mas não Xxx-Pro) são descritos em vários manuais de bioquímica. Sítios de clivagem da IDE na insulina foram recentemente publicados: B9-10, B10- 11, B13-14, B14-15, B24-25, B25-26, A13-14, A14-15 (Duckworth et al„ 2006) e mostrou-se que as seguintes substituições inibem a degradação pe- la IDE da insulina: B10D e B4E_B16Q_B17F (Bennett et al„ 2003). EXEMPLO 3

Ciclos repetidos de identificação de pontos quentes na insulina humana A14E. B25H. desB30

Os principais pontos quentes de clivagem da quimotripsina (B16-17, B24-25, A19-20) e sítios de clivagem menores (B1-2, B6-7) foram identificados na insulina humana A14E, B25H, desB30 de acordo com o mé- todo descrito no exemplo 2. Análogos de insulina foram projetados com base nos sítios de clivagem identificados e sítios de clivagem preditos para a es- pecificidade enzimática. Resíduos de aminoácido para substituição foram selecionados a fim de remover os sítios de clivagem e aumentar a solubili- dade.

Quimotripsina, desenho análogo baseado em pontos quentes

identificadas por LC-MS de digeridos de insulina humana A14E, B25H, desB30: Α14Χ1 Β25Η desB30X12 Ol B1X2 B6X3 B16X6 B24X8 A19X11 Χ1 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P X2 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X3 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X6 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo

X8 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X11 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X12 = desB30/aa nativo

Nota: a substituição de B24e/ou A19 na insulina humana prova- velmente reduzirá significativamente a afinidade pelo receptor.

A14X1 B25P desB30X12 Ol B1X2 B6X3 B16X6 B24X8 A19X11

XI = E/D/H/Q/N/S/T/M/P

X2 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X3 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X6 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo

X8 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo

XII = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X12 = desB30/aa nativo

Observe: a substituição de B25 com Pro provavelmente reduzirá significativamente a clivagem pela quimotripsina em B24-25.

Quimotripsina, projeto baseado em pontos quentes identificados

e preditos:

A14X1 B25H desB30X12 Ol B1X2 B6X3 B11X4 B15X5 B16X6 B17X7 B24X8 A13X9 A16X10 A19X11 X1 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P

X2 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X3 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X4 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X5 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X6 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo

X7 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X8 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo Χ9 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X10 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X11 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X12 = desB30/aa nativo Observe: a substituição de B11, B15, B24, A13, A16, e/ou A19

na insulina humana provavelmente reduzirá significativamente a afinidade pelo receptor.

Quimotripsina + tripsina, projeto baseado em pontos quentes i- dentificados e preditos: A14X1 B25H desB30X12 Ol B1X2 B6X3 B11X4 B15X5 B16X6

B17X7 B24X8 A13X9 A16X10 A19X11 B22X13

XI = E/D/H/Q/N/S/T/M/P

X2 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X3 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X4 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo

X5 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X6 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X7 = E/D/H/Q/N/SAT/M/P/aa nativo X8 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X9 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo

X10 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo

XII = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X12 = desB30/aa nativo

X13 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo Quimotripsina + tripsina + enzima de degradação da insulina (I-

DE), projeto baseado em pontos quentes identificados e preditos:

A14X1 B25H desB30X12 Ol B1X2 B6X3 B11X4 B15X5 B16X6 B17X7 B24X8 A13X9 A16X10 A19X11 B22X13 B4X14 B9X15 B10X16 B13X17 B14X18 X1 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P

X2 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X3 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo Χ4 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X5 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X6 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X7 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X8 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo

X9 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X10 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X11 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X12 = desB30/aa nativo X13 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo

X14 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X15 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X16 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X17 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X18 = E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo

EXEMPLO 4

Estabilidade proteolítica (Meia-vida) de análogos de insulina em relação à quimotripsina

Análogos de insulina foram testados em ensaios de estabilidade e os análogos exibindo resistência potencializada à digestão proteolítica fo- ram identificados através de meia-vidas aumentadas de acordo com os mé- todos descritos no exemplo 1. Os resultados demonstram o potencial dos análogos de insulina melhorados na biodisponibilidade aumentada devido à resistência potencializada à degradação proteolítica e a solubilidade melho- rada.

A estabilidade dos seguintes análogos de insulina em relação à quimotripsina foi testada relativamente à insulina humana: Análogos de insulina Digestão pela Quimo- tripsina [Vezes de es- tabilidade em relação à insulina humana] sulina humana A14E, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 43,8 sulina humana A8H, A14E, B25H, B27E, desB30 38,9 sulina humana EEAEAEAPK-B(1-29)-B25H-AAK-A(1-21)- A14E 33,2 sulina humana A8H, A14E, B1E, B25H, B27E, desB30 22,8 sulina humana A14E, B25H, B28D, desB30 17,4 sulina humana A14E, B25H, B26D, desB30 16,6 sulina humana A14E, B25H, B27E, desB30 14,1 sulina humana A8H, A14E, B25H, desB30 13,3 sulina humana A8H,A14E,B10E,B25H,desB30 12,6 sulina humana A14E, B25H, desB30 12,5 sulina humana A14E, B1E, B25H, B27E, desB30 11,9 sulina humana A8H, A14E, B1E, B25H, desB30 10,2 sulina humana A8H, A14E, B1E, B16E, B25H, B27E, desB30 8,3 sulina humana A14D, B25H, desB30 7,9 sulina humana A14E, B27E, desB30 7,7 sulina humana A14E, B28D, desB30 7,5 sulina humana A8H,B10D,B25H 7,4 sulina humana A14E, B1E, B16E, B25H, B27E, desB30 5,5 sulina humana A14E, B1E, B25H, desB30 4,8 sulina humana A14H, B25H, desB30 4,5 sulina humana A14E, B25H 4,1 sulina humana A14E, B1E, B27E, desB30 3,9 sulina humana A8H, A14E, B16E, B25H, desB30 2,3 sulina humana A14E, B16E, B25H, desB30 2,1 sulina humana (referência) 1 EXEMPLO 5

Estabilidade proteolítica de análogos de insulina em relação a extratos de intestino de rato (lúmen do duodeno)

Análogos de insulina foram testados para a sua estabilidade em relação à degradação proteolítica em extratos intestinais. Os extratos foram preparados através da lavagem do conteúdo Iuminal de animais em jejum. Análogos de insulina foram incubados com extratos diluídos a 37°C em pH=7,4 e após 20 horas de incubação a concentração do composto inteiro foi determinada por RP-HPLC. As quantidades relativas de análogos de in- sulina inteiros e insulina humana intacta foram comparadas. Aproximada- mente 5 a 10 vezes de diferença na estabilidade entre a insulina humana e o análogo de insulina humana A14E B25H desB30 foi encontrada. Listagem de Seqüências <110> NOVO NouDISK A/S <120> Análogos de insulina resistentes à protease <130> 7484.204-W0 <160> 4

<170> Patente versão 3.4 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Cadeia A da Insulina modificada <220>

<221 > MISCFEATURE <222> (1)..(1)

<223> Xaa é ausente ou Gly <220>

<221 > MISC FEATURE <222> (2)..(2)

<223> Xaa é ausente ou Pro <220>

<221 > MISCFEATURE <222> (3)..(3)

<223> Xaa é ausente ou Pro <220>

<221 > MISC FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa é Thr ou His <220>

<221 > MISC FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa é Ser, Asp ou Glu <220>

<221 > MISC FEATURE <222> (16)..(16)

<223> Xaa é Leu, Thr1 Asn, Asp1 Gln, His, Lys1 Gly1 Arg, Pro1 Ser ou Glu <220>

<221 > MISC FEATURE <222> (17)..(17)

<223> Xaa é Tyr1 Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser ou Glu <220>

<221 > MISC FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa é Gln, Asp ou Glu <220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is Asn, Lys ou Gln <220>

<221 > MISC FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa é Asn ou Gln <220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa é ausente ou Lys <400> 1

Xaa Xaa Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Xaa Xaa 10 15

Xaa Xaa Leu Glu Xaa Tyr Cys Xaa Xaa

25

<210> 2 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Modified Insulin B chain <220>

<221 > MISCFEATURE <222> (1)..(1)

<223> Xaa é ausente ou Gly <220>

<221 > MISC FEATURE <222> (2)..(2)

<223> Xaa é ausente ou Pro <220>

<221 > MISC FEATURE <222> (3)..(3)

<223> Xaa é ausente ou Pro <220>

<221 > MISC FEATURE <222> (4)..(4)

<223> Xaa é ausente Phe ou Glu <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (5)..(5)

<223> Xaa é ausente ou Val <220>

<221 > MISCFEATURE <222> (6)..(6)

<223> Xaa é ausente, Asn ou Gln <220>

<221 > MISC FEATURE <222> (7)..(7)

<223> Xaa é Gln ou Glu <220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa é His1 Asp1 Pro ou Glu <220>

<221 > MISC FEATURE <222> (19)..(19)

<223> Xaa é Tyr1 Asp1 Gln, His1 Arg ou Glu <220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa é Phe ou His <220>

<221 > MISC FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa é Phe ou His <220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (29)..(29)

<223> Xaa é ausente, Tyr, His1 Thr1 Gly ou Asp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (30)..(30)

<223> Xaa é ausente, Thr, Asn1 Asp, Gln1 His1 Lys, Gly, Arg1 Pro1 Ser ou Glu <220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (31)..(31)

<223> Xaa é ausente, Pro1 His, Gly ou Asp <220>

<221 > MISC FEATURE <222> (32)..(32)

<223> Xaa é ausente, Lys ou Gln <220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa é ausente ou Thr <220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa é ausente ou Leu <220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa é ausente ou Glu <400> 2

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Leu Cys Gly Ser Xaa Leu Val Glu 10 15

Ala Leu Xaa Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

25 30

Xaa Xaa Xaa 35

<210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Cadeia A da Insulina modificada <220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa é Thr ou His <220>

<221> MISCFEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is Ser, Asp ou Glu <220>

<221 > MISC FEATURE <222> (13)..(13)

<223> Xaa é Leu, Thr, Asn1 Asp1 Gln, His1 Lys1 Gly1 Arg1 Pro, Ser ou Glu <220>

<221 > MISC FEATURE <222> (14)..(14)

<223> Xaa é Thr, Asn, Asp, Gln, His1 Lys, Gly1 Arg, Pro1 Ser ou Glu <220>

<221 > MISC FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa é Gln, Asp ou Glu <220>

<221 > MISC FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa é Asn, Lys ou Gln <220>

<221 > MISC FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa é Asn ou Gln <400> 3

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 10 15

Glu Xaa Tyr Cys Xaa 20

<210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Cadeia B da Insulina modificada <220>

<221 > MISCFEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa é Phe ou Glu <220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa é Asn ou Gln <220>

<221 > MISC FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa é Gln ou Glu <220>

<221 > MISC FEATURE <222> (10)..(10)

<223> Xaa é His1 Asp, Pro ou Glu <220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (16)..(16)

<223> Xaa é Tyr1 Asp, Gln, His1 Arg ou Glu <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa é Phe ou His <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26)

<223> Xaa é ausente, Tyr1 His, Thr1 Gly ou Asp <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27)

<223> Xaa é ausente, Thr, Asn1 Asp1 Gln, His, Lys, Gly, Arg1 Pro1 Ser ou Glu <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa é ausente, Pro, His, Gly ou Asp <220>

<221 > MISC FEATURE <222> (29)..(29)

<223> Xaa é ausente, Lys ou Gln <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa é ausente ou Thr <400> 4

Xaa Val Xaa Xaa His Leu Cys Gly Ser Xaa Leu Val Glu Ala Leu Xaa 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 25 30

Claims

1. Análogo de insulina em que pelo menos dois aminoácidos hi- drofóbicos foram substituídos com aminoácidos hidrofílicos em relação à insulina precursora, em que as substituições estão dentro ou na proximidade de dois ou mais sítios de clivagem da protease da insulina precursora e em que tal análogo de insulina opcionalmente ainda compreende uma ou várias mutações adicionais.

2. Análogo de insulina de acordo com a reivindicação 1, em que a cadeia A do análogo de insulina compreende pelo menos uma mutação e a cadeia B do análogo de insulina compreende pelo menos uma mutação em relação à insulina precursora.

3. Análogo de insulina de acordo com a reivindicação 1 ou 2, que mostra estabilidade aumentada em relação a uma ou várias enzimas protease em relação à proteína precursora.

4. Análogo de insulina de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 3, compreendendo uma seqüência de aminoácidos da cadeia A da fórmula 1: <formula>formula see original document page 72</formula>Fórmula (1) (SEQ ID N0:1) e uma seqüência de aminoácidos da cadeia B da fórmula 2: <formula>formula see original document page 72</formula>Fórmula (2) (SEQ ID N°:2) em que XaaA (.2) é ausente ou Gly; XaaA (.1) é ausente ou Pro; XaaAo é ausente ou Pro; XaaA8 é independentemente selecionado a partir de Thr e His; XaaAi2 é independentemente selecionado a partir de Ser, Asp e Glu; XaaAi3 é independentemente selecionado a partir de Leu, Thr1 Asn1 Asp1 Gln1 His, Lys1 Gly1 Arg1 Pro1 Ser e Glu; XaaAH é independentemente selecionado a partir de Tyr1 Thr1 Asn1 Asp1 Gln, His1 Lys1 Gly1 Arg, Pro1 Ser e Glu; XaaAis é independentemente selecionado a partir de Gln1 Asp e Glu; Gln; XaaAi8 é independentemente selecionado a partir de Asn1 Lys e XaaA2i é independentemente selecionado a partir de Asn e Gln; XaaA22 é ausente ou Lys; Xaae(-2) é ausente ou Gly; XaaB(-i) é ausente ou Pro; Xaaeo é ausente ou Pro; XaaBi é ausente ou independentemente selecionado a partir de Phee Glu; XaaB2 é ausente ou Vai; Xaas3 é ausente ou independentemente selecionado a partir de Asn e Gln; XaaB4 é independentemente selecionado a partir de Gln e Glu; XaaBio é independentemente selecionado a partir de His1 Asp1 Pro e Glu; Xaaei6 é independentemente selecionado a partir de Tyr1 Asp1 Gln, His, Arg1 e Glu; XaaB24 é independentemente selecionado a partir de Phe e His; XaaB25 é independentemente selecionado a partir de Phe e His; XaaB26 é ausente ou independentemente selecionado a partir de Tyr1 His1 Thr1 Gly e Asp; XaaB27 é ausente ou independentemente selecionado a partir de Thr1 Asn1 Asp1 Gln1 His1 Lys1 Gly1 Arg, Pro, Ser e Glu; XaaB28 é ausente ou independentemente selecionado a partir de Pro, His, Gly e Asp; Xaas29 é ausente ou independentemente selecionado a partir de Lys e Gln; XaaB3o é ausente ou Thr; XaaB3i é ausente ou Leu; XaaB32 é ausente ou Glu; o Terminal C pode ser opcionalmente derivatizado como uma amida; em que a seqüência de aminoácidos da cadeia Aea seqüência de aminoácidos da cadeia B são unidas por pontes dissulfeto entre as cisteí- nas na posição 7 da cadeia Aea cisteína na posição 7 da cadeia B1 e entre a cisteína na posição 20 da cadeia Aea cisteína na posição 19 da cadeia B e em que as cisteínas na posição 6 e 11 da cadeia A são unidas por uma ponte dissulfeto; em que opcionalmente a seqüência de aminoácidos da cadeia A do Terminal N está unida á seqüência de aminoácidos da cadeia B Terminal C por uma seqüência de aminoácidos compreendendo 3 a 7 aminoácidos para formação de uma molécula de insulina de cadeia única, em que opcio- nalmente o Terminal N da cadeia B é estendido com 1 a 10 aminoácidos; em que se XaaA8 é Thr e XaaAi2 é Ser e XaaAi3 é Leu e XaaAi4 é Tyr1 então XaaAis é Glu ou Asp; e em que se XaaB24 é Phe e XaaB25 é Phe e XaaB26 é Tyr e XaaB27 é Thr e XaaB2sé Pro, então XaaB29 Gln.

5. Composição farmacêutica compreendendo uma quantidade biologicamente ativa do análogo de insulina como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

6. Método para tratamento, prevenção ou alívio da hiperglicemi- a, diabetes tipo 2, tolerância à glicose diminuída, diabetes tipo 1, obesidade, síndrome X ou dispilidemia em um indivíduo compreendendo administração a um indivíduo de um análogo de insulina como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 5.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, que é uma adminis- tração oral.

8. Análogo de insulina de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 4, para o uso como um produto farmacêutico no tratamento ou na prevenção da hiperglicemia, diabetes tipo 2, tolerância à glicose diminuí- da, diabetes tipo 1, obesidade, síndrome X e dispilidemia.

9. Análogo de insulina de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 4, para uso como produtos farmacêuticos para atraso ou pre- venção de progressão de doença em diabetes tipo 2.

10. Análogo de insulina de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 4, para uso como um produto farmacêutico na redução da in- gestão alimentar, redução da apoptose das células β, aumento da função das células β e da quantidade de células β e/ou para restituição da sensibili- dade das células β à glicose.

11. Seqüência de ácido nucleico que codifica um análogo de in- sulina como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

12. Processo para preparação de uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 5, compreendendo mistura de um análogo de insulina como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, com subs- tâncias e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.