TW200817433A - High affinity human and humanized anti-α5β1 integrin function blocking antibodies with reduced immunogenicity - Google Patents

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200817433 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 素結合且具有阻斷 揭示該等多肽之診 本發明係關於以高親和力與α5β1整告 功能之重組人類或人類化多肽。此外， 斷學及醫藥學應用。 【先前技術】 血管生成係自預存在血管發展新血管之過程。新血管之 生長促進胚胎發育、癒傷及雌性生殖週期。其在實體癌症 及其他例如血管瘤、糖尿病性視網膜病、年齡相關之黃斑 退化、牛皮癬、類風濕性關節炎及可能的骨關節炎及發炎 性腸道疾病之病理發展中亦起重要作用（1)。 缺氧腫瘤組織釋放之生長因子刺激新血管生長。儘管 長因子及其受體在血管生成萌發中起關鍵作用，但黏 胞外基質(職)亦為血管生成之引發調節劑。黏附促進内 皮細胞存活以及内皮增生及遷移(2_5)。_種ecm蛋白質， 尤其纖維結合蛋白，其表現於臨時(腫瘤)基質中且向：技 、、’田胞提供增生仏號（2，3)。顯然，無纖維結合蛋白2 ,丨 在包括不恰當形成之維管結構之許多缺陷的發展早$ 亡（6, 7)。 卞死 實驗動物模型及突變小鼠研究指示作為纖維結合蛋白 最重要受體的α5β1整合素在調節血管生成中起關㈣/ 胚胎缺失此整合素誘導早期及致死間質異常，其包括 維管結構之組織缺陷（8, 9)及内皮細胞活體外形成血=現 結構之能力的缺陷（i 〇，i i )。 g樣 120159.doc 200817433 α5β1整合素之表現與血管生成特異相關：其在靜止内皮 中不可偵測，但回應血管生成生長因子活體外表現（3，4) 或活體内表現於生長腫瘤之血管生成維管結構中（丨2，20, 21)。

Kim等人（3)可證明小鼠抗α5β1整合素功能阻斷抗體nai 抑制生長因子誘導之瘤血管生成與活體内腫瘤血管生成。 當此整合素受到拮抗時轉導之信號研究指示未接合之受體 活化PKA，其隨後活化卡斯蛋白酶3及8且誘導細胞凋亡（2, Ο 13)。 已嘗試製備小鼠抗體IIA1之人類化衍生物（bd Pharmingen 目錄號555614)。因此產生稱為M200之82%人類/18%小鼠 甘欠合IgG4單株抗體。此外，已產生稱為F200之M200之單 價Fab片段，且其已於獼猴模型中成功測試黃斑退化。進 一步嘗試製備M2〇0之完全人類化抗體衍生物，然而導致 急劇生物活性損失（14)。 目别已知的抗α5β1整合素之諸如M200或F200之抗體於 人類藥物中之任何應用具有誘導人類患者之免疫原性人類 抗嵌合抗體（HACA)反應之風險。因此，本發明之目標為 提供與已存在嵌合抗體相比具有降低之免疫原性，而保留 才示靶特異性及高生物活性及親和力的人類抗α5β 1整合素抗 體。 【發明内容】 根據本發明，藉由噬菌體呈現使用α5β1整合素轉染之細 胞由HuCAL -Gold抗體庫分離Fab形式之完全人類抗體。 120159.doc 200817433 此等抗體展示高活體外活性，而歸因於完全人類起點可預 期人類患者低免疫原性。 因此’本發明之第一態樣為人類或人類化抗體或其抗原 結合片段，其⑴以1〇〇 nM及較佳$10 nM之親和力與α5β1 整合素結合；且（ii)抑制表現“卩丨整合素之細胞與其受體 活體外及活體内黏附。 Γ ϋ 本發明之多肽為人類或人類化抗體或其抗原結合片段。 根據本發明術語”人類抗體”係關於具有實質上人類或完全 人類可變域及（若存在）人類恆定域之抗體分子。如本申請 案所用術語”人類”係關於可於個別人類中或藉由使用由其 而得到的一致序列形成之序列，例如如以下文獻之對應概 略中所描述，Kabat 等人（1991)，Sequences of Proteins 〇f immunological Interest，第五版，Nm puMicati⑽第”， 3242 號，US Department of Health and HUman Services，

Washington，DC，其以引入的方式併入本文中。術語，，實質 上人類”係指如Kabat等人所描述高達！、2、3、4或5個胺 基酸不同於"全部人類，，序列之序列。更特定言之，本發明 之抗體或抗體片段包含重（H)及輕（L)免疫球蛋白鏈之實質 上或完全人類可變框架區域。在本發明之意義上術語，，人 類化抗體”係關於具有實質上鼠類或完全鼠類可變域及人 類或實質上人類恆定域，且其為>82%、較佳至少㈣且尤 其較佳至少98%人類之抗體分子。如本中請案所用術語，，鼠 類”係關於可於個別齧齒動物中或藉由使用由其而得之一 致序列形成的序列。術語，，實質上鼠類，，係指高達丨、2、 120159.doc 200817433 3、4或5個胺基酸不同於11完全鼠類’’序列之序列。抗體或 其抗體片段較佳為IgG抗體，例如人類或人類化IgGl、 IgG2、IgG3或IgG4抗體或其片段，例如Fab、Fab’或（Fab)2 片段。然而本發明亦係關於具有例如單鏈（sc)抗體或其片 段（例如scFv片段）之人類序列之重組抗體。 本發明之抗體或抗體片段含有一或多種與α5β1整合素特 異性相互作用之抗原結合位點。較佳藉由組合可變重鏈 (VH)與可變輕鏈（VL)區域獲得此抗原結合特性。VH或VL 區域包括框架區域（FR1、FR2、FR3及FR4)及抗原結合調 節 CDR 區域（VH 區域之 H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3 ;及 VL 區域之 L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3)。 本發明之人類或人類化抗體或抗體片段較佳對α5β 1整合 素具有對應於KD值$100 ηΜ、較佳$10 ηΜ且最佳$1 ηΜ之 親和力，其中如實例中所述藉由FACS滴定α5β1陽性人類 HUVEC細胞或藉由競爭BIAcore或競爭ELISΑ量測來測定 親和力。 此外，本發明之多肽抑制如實例中所述表現α5β1整合素 之人類腫瘤細胞之黏附，該腫瘤細胞例如由Lozzio等人 (1979)，Leukemia Research，3: 363-370 活體外研究之 K562 細胞（ATCC寄存編號：CCL-243)。抗體或抗體片段較佳在 $10 nM且較佳$5 nM之濃度（IC50)展示50%細胞黏附抑制 作用。 此外，本發明之多肽較佳能夠誘導HUVEC細胞之卡斯 蛋白酶活性。關於HUVEC生存力之IC50值較佳$10 nM、 120159.doc 200817433 更佳$5 nM，其中如實例中所述測定該IC50值（50%生存 力）。 此外，本發明之多肽、抗體及抗體片段較佳可用於診斷 且用於預防及治療腫瘤及癌症，尤其結腸癌。 該等多肽、抗體及抗體片段可與可偵測標記基團結合， 諸如放射性、NMR、染料、酶及螢光標記基團。放射性基 團可為例如I125、I131或Y9G。 本發明之抗體或抗體片段較佳包含： (a) VH區域，其選自 ⑴胺基酸序列 SEQ ID NO: 1(MOR04624)、SEQ ID NO: 3(MOR04055)或該等VH區域之一之至少一H-CDR1、H-CDR2及 / 或 H-CDR3區域；或 (ii)藉由更改至少一個H-CDR區域獲自（i)之序列的胺 基酸序列；及/或 (b) VL區域，其選自 ⑴胺基酸序列 SEQ ID NO: 2(MOR04624)、SEQ ID NO: 4(MOR04055)或該等VL區域之一之至少一L-CDR1、L-CDR2及 / 或 L-CDR3區域；或 (ii)藉由至少一個L-CDR區域獲自⑴之序列的胺基酸序 列。 尤其較佳為包含藉由使H_Cdr2區域隨機化而自如上所 述（a)(1)之VH區域獲得的VH區域之抗體或抗體片段。

在另一尤其較佳實施例中，抗體或抗體片段包含如上所 述藉由使L-CDR3區域隨機化而自（b)⑴之VL區域獲得的VL 120159.doc 200817433 區域。 在另一尤其較佳實施例中，抗體或抗體片段包含藉由使 抗體鏈改組而自（a)(i)之VH區域及/或（b)(i)之VL區域獲得 的VH及/或VL區域。 藉由蛋白質工程化方法以人類CDR清單分別交換H-CDR2及 L-CDR3 產生 H-CDR2及 L-CDR3 之子庫（17)。 例如，抗體或抗體片段包含自如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2(MOR04624)中所述之VL及/或VH區域獲得的VH及/ f、 或VL區域。尤其較佳為包含以下之多肽： (a) 選自胺基酸序列 SEQ ID NO: 5(MOR04971)、SEQ ID NO: 7(MOR04974)、SEQ ID NO: 9(MOR04975)、SEQ ID NO: 11(MOR04977)及 SEQ ID NO: 11(MOR04985)之 VH區域，或該等VH區域之至少一 H-CDR1、H-CDR2 及/或H-CDR3區域；及/或

(b) 選自胺基酸序列 SEQ ID NO: 6(MOR04971)、SEQ ID NO: 8(MOR04974)、SEQ ID NO: 10(MOR04975)、SEQ ◎ ID NO: 12(MOR04977)及 SEQ ID NO: 14(MOR04985)之 VL區域，或該VL區域之至少一 L-CDR1、L-CDR2及/ 或L-CDR3區域。 本發明之多肽之特定實例如下： 包含 SEQ ID NO: 1 之 VH 區域及 SEQ ID NO: 2(MOR04624) 之 VL 區域，或其至少一 H-CDR1、H-CDR-2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區域的抗體或抗體片段。 包含 SEQ ID NO: 3 之 VH 區域及 SEQ ID NO: 4(MOR04055) 120159.doc 11 200817433 之 VL 區域，或其至少一 H-CDRl、H-CDR-2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區域的抗體或抗體片段。 包含 SEQ ID NO: 5 之 VH 區域及 SEQ ID NO : 6(MOR04971) 之 VL 區域，或其至少一 H-CDR1、H-CDR_2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區域的抗體或抗體片段。 包含 SEQ ID NO: 7之VH 區域及 SEQ ID NO : 8(MOR04974) 之 VL 區域，或其至少一 H-CDR1、H-CDR-2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區域的抗體或抗體片段。· 包含SEQ ID NO: 9之VH區域及SEQ ID NO : 10(MOR04975) 之 VL 區域，或其至少一 H-CDR1、H-CDR-2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區域的抗體或抗體片段。 包含SEQ ID NO: 11之VH區域及SEQ ID NO : 12(MOR04977) 之 VL 區域，或其至少一 H-CDR1、H-CDR-2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區域的抗體或抗體片段。 包含SEQ ID NO: 13之VH區域及SEQ ID NO : 14(MOR04985) 之 VL區域，或其至少一H-CDR1、H-CDR-2、H-CDR3、L-

U CDR1、L-CDR2或L-CDR3區域的抗體或抗體片段。 本發明亦係指針對與上文所述之較佳及/或例示性抗體 或抗體片段相同的抗原之抗原決定基之抗體或抗體片段。 該多肽之VH及VL鏈包含下列區域： MOR〇4624、MOR04055及衍生物之VH鏈（編號方案根據 (17))： -框架1區域自胺基酸1延伸至30aa ; -CDR1區域自胺基酸31延伸至35 aa ; 120159.doc -12- 200817433 -框架2區域自胺基酸36延伸至49aa ; -CDR2區域自胺基酸50延伸至65aa ; -框架3區域自胺基酸66延伸至94aa ; -CDR3區域自胺基酸95延伸至102aa ; -框架4區域自胺基酸103延伸至113aa ; MOR04624及衍生物之VLK1鏈（編號方案根據（17)): 框架1區域自胺基酸1延伸至23aa ; CDR1區域自胺基酸24延伸至35aa ; 框架2區域自胺基酸36延伸至50aa ; CDR2區域自胺基酸51延伸至57aa ; 框架3區域自胺基酸59延伸至89aa ; CDR3區域自胺基酸90延伸至98aa ; 框架4區域自胺基酸99延伸至109aa ; MOR0405 5及衍生物之VLK1鏈（編號方案根據（17)): 框架1區域自胺基酸1延伸至23aa ; CDR1區域自胺基酸24延伸至35aa ; 框架2區域自胺基酸36延伸至50aa ; CDR2區域自胺基酸51延伸至57aa ; 框架3區域自胺基酸58延伸至89aa ; CDR3區域自胺基酸90延伸至98aa ; 框架4區域自胺基酸99延伸至109aa ; 可藉由交換一或多個胺基酸，例如1、2、3、4或5個胺 基酸來改變VH及/或VL鏈之框架區域。例如，MOR04624 家族之成員的VLk 1鏈之框架3區域可改變。Fab序列之位 120159.doc -13- 200817433 置85的胺基酸較佳可交換，其中纈胺酸（M〇R〇4624， MOR04985)交換為蘇胺酸（MOR04974，75，77)尤其較 佳。此外，VH鏈之框架1區域可改變。在一較佳實施例 中，各VH-Fab序列之位置3的胺基酸可交換。尤其較佳為 麩胺醯胺（q)交換為麩胺酸（e)，其可發生在（例如）選殖期 間。 本舍明之多狀適於治療或診斷應用，例如對於活體外或 活體内診斷應用。 對於治療應用，抗體或抗體片段可原態使用。或者，多 肽可呈與治療劑之結合物形式，該治療劑選自（例如）放射 治療劑或化學治療劑，例如低分子量或生物細胞生長抑制 劑或細胞毒性劑。治療劑可根據已知方法，較佳經由與多 肽之反應性胺基、羧基、羥基及/或巯基之共價鍵，視情 況使用均或雜二官能鍵聯劑與抗體或抗體片段結合。 在另一實施例中，多肽可呈包含抗體或抗體片段域及異 源性融合域之融合蛋白質形式，該異源性融合域例如細胞 激素諸如IL-2、IL-12或TNF-α。本發明抗體或抗體片段之 其他治療相關融合搭配物包含工程化之用於增加或降低免 疫效應細胞募集之IgG Fc部分、諸如rnA酶或ETA之蛋白 貝毋素諸如美登素（maytansine)或奥瑞他汀（auristatin)衍 生物之小型藥物分子、用於活化前藥之酶、與其他整合素 功旎阻斷拮抗劑之融合蛋白質，或與具有抗血管生成活性 之酶的融合蛋白質，諸如MMP-24 MMp_9(15)。此外，融 合蛋白質可呈包含至少一如上所述之心…整合素結合域及 120159.doc -14- 200817433 另一抗原之特異性結合域的雙特異性抗體形式。例如，第 二抗原結合域可針對診斷及/或治療放射性核苷酸（例如α、 β或γ放射性核素，諸如9GY)之螯合劑、診斷NIR(近紅外）染 料、治療活性染料、免疫學效應細胞（例如NK細胞、細胞 毒性T細胞或NK T細胞）上之表面分子、功能阻斷抗VEGF 結合域及功能阻斷結合域抗VEGF受體1、2及3，及諸如介 白素之細胞激素。 對於診斷應用，多肽可呈與可偵測標記基團之結合物的 形式，例如用於活體外或活體内診斷應用之標記基團。例 如’可偵測標記基團可選自放射性、NMR、染料、酶及螢 光（例如NIR螢光）標記基團。 對於治療應用，多肽較佳經調配成可另外包含其他活性 成份及/或醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及/或佐劑的醫 藥組合物。該醫藥組合物包含治療活性劑量之活性劑，其 可由熟習此項技術者根據標準方法，藉由例如活體外實驗 或於動物模型中確定。該組合物較佳藉由輸注、注射或吸 入投與。根據病症之類型及嚴重程度及待治療患者之體質 確定活性成份之劑量。較佳以若干劑量經至少2_4週之時 間投與治療組合物。在此上下文中，提及如Ferrara等人，

Nature Reviews Drug Discovery，第 3 卷，2004年五月， 391-400 ;及 Salgaller，Current 〇pini〇n in Molecular

Therapeutics，2003，5 (6)，057-667中所述用於投與抗體或 抗體結合物之已知方案，或提及用於投與如利妥昔單抗 (Rituximab)、坎帕斯（Campath)、英利昔單抗（Remicade)等 120159.doc -15- 200817433 之醫藥抗體的方案。 此外，本發明係關於包含如上所述作為診斷試劑之抗體 或抗體片段的診斷組合物。該診斷組合物可包人其他〆斷 可接受之試劑、載劑、稀釋劑及/或佐劑。' y ^ N 遠沴斷組合物 包含於個別檢定形式中、例如於活體内吱 n a，舌體外診斷檢定 形式中足以容許診斷偵測之量的多肽。 該組合物可用於α5β1整合素相關病症之治療或診斷應用 中。例如，此等病症可為過度增生病症，例如與血管生成 及/或轉移相關之病症’尤其癌症。藉由本發明之組合物 可治療之癌症尤其包含各種實體腫瘤，例如結腸癌、腎 癌、肺癌、前列腺癌、乳癌、腦癌、胃癌、肝癌或皮膚 癌。或者，組合物可用於治療與血管生成相關之血液學： 症。與新血管生成相關之其他病症包含（但不限於）子宮内 膜異位、血管瘤、類風濕性關節炎、骨關節炎、血管硬化 性斑塊、發炎性腸道疾病、發炎性CNS疾病、牛皮癖、諸

如糖尿病性視網膜病或年齡相關黃斑疾病之眼睛病症，及 肥厚性瘢痕。在一較佳實施例中，該組合物之抗血管生成 活性與生長因子無關。 〆、、且a物可包含一或若干抗體或抗體片段，例如結合 β1正&素之不同域的抗體或抗體片段之組合。該組合物 亦可含有用於組合療法之小分子藥物。該組合物適於人類 及被醫學應用。尤其較佳為人類藥物應用。 人此外，本發明係關於編碼如上所述抗體或抗體片段或融 口多肽之核酸。核酸可為例如單鏈或雙鏈DNa或rNa。核 i20l59.doc -16 - 200817433 酸較佳與表現控制序列操作連接，其容許於適當宿主細胞 或宿主生物體中表現。核酸可存在於可引入宿主細胞或宿 主生物體中之載體或載體系統（亦即複數個載體）上。該載 體可為適用於原核細胞之原核載體，例如質體或噬菌體。 此外’載體可為真核宿主細胞或宿主生物體之真核載體， 例如質體、人工染色體或病毒載體。適當載體描述於（例如）

Sambrook 專人（1989)，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press ;及 Ausubel 荨人（1989)，Current Protocols in Molecular Biology，John

Wiley and Sons 中。 本發明亦係指例如原核細胞或真核細胞（諸如人類細胞） 之細胞，其經如上所述之核酸或載體轉型。此外，本發明 係關於非人生物體，例如轉基因動物，諸如轉基因非人類 哺乳動物，其經如上所述之核酸或載體轉型。術語，，轉型，， 包括向細胞或生物體引入外來核酸之所有方法，包括轉染 或感染。 可如上所述藉由在多肽表現且所表現之多肽自（例如）細 胞、培養基、生物體或生物體之排泄產物回收的條件下培 養細胞或非人生物體來製備多肽。 【實施方式】 進-步於實例中說明本發明。然而下列實例不應理解為 限制。 … 實例 1·產生功能阻斷抗α5βΐ整合素抗體 120159.doc -17- 200817433 ι·ι篩選策略 小鼠單株抗體IIA1與僅存在於活化之活（内皮）細胞上之 α5 β 1整合素之構型抗原決定基結合。為涵蓋選擇性及功能 活性，確立由交替淘選分離之抗原及抗原表現細胞與功能 細胞基篩選檢定組成之篩選路徑，以鑑別呈Fab形式之 HuCAL® GOLD衍生之引導候選抗體： 1. 藉由噬菌體呈現使用HuCAL®-Gold庫（MorphoSys)選 擇結合Fab抗體片段之抗α5β1整合素。對分離之抗原及抗 〇 原表現細胞進行淘選實驗。基於最佳抗體株之胺基酸序 列，藉由VL-CDR3或VH-CDR2之隨機化使用人類CDR序列 產生子庫，且在進一步淘選實驗中甚至自其中選擇高級結 合劑。藉由選殖在1個抗體分子中含有所關注之VL-CDR3 及VH-CDR2之輕及重鏈之組合獲得其他株（ΠΧ選殖”）。 2. 富集Fab抗體之篩選進行如下。測試所有淘選結合劑 之對α5β1整合素陽性及α5β1整合素陰性細胞之ELISA結 合。隨後在FACS實驗中進一步分析ELISA陽性株對α5過渡 〇 表現細胞及α5陰性細胞之細胞結合。隨後在功能檢定中分 析適當株之i)與纖維結合蛋白之細胞黏附；ii)HUVEC(人 類臍靜脈内皮細胞）及/或HDMVEC(人類皮膚血管内皮細 胞）之細胞凋亡之誘導；iii)參比抗體IIA1之親和力量測及 FACS競爭檢定；及iv)物種交叉反應性。

1.2工具產生及檢定開發 α5整合素鏈cDNA 人類α5鏈之cDNA購自RZPD(IMAGE-ID 6821577)且根據 120159.doc -18 - 200817433 標準方法選殖於pcDNA3表現載體（INVITROGEN)中。 純化之整合素受體 清潔劑溶解之人類整合素受體(x5pi(Chemicon CC1052) 及a3pl(Chemicon CC1092)購自 CHEMICON INTERNATIONAL (Temecula，CA，USA)。對於固相噬菌體呈現、ELISA及 BiaCore檢定，藉由非變性SDS-PAGE選擇具有至少90%之 純度的整合素批次。 細胞株 人類慢性骨髓性白血病細胞株K562(ATCC寄存編號： CCL-243)與纖維結合蛋白之黏附僅由α5β1整合素介導 (16)。此細胞株用於纖維結合蛋白介導之黏附檢定中以用 於初始功能篩選。藉由FACS分析使用抗體ΙΙΑ1檢測來證 明α5β1整合素之存在（圖1A)。 分化細胞淘選策略之先決條件為模型系統，其中所關注 之標靶在靶向陰性細胞株上過渡表現。出於此目的，選擇 人類結腸癌細胞株HT29(ATCC寄存編號：ΗΤΒ-38)，其表 現βΐ整合素鏈但不表現α5-鏈（圖1B)。使用脂質胺 (Lipofectamine)根據製造商之說明，將α5鏈之互補DNA轉 染於親本ΗΤ29-細胞中。藉由FACS篩選使用小鼠單株抗體 IIA1以特異性標記表面表現之α5β1整合素來選擇穩定α5過 渡表現株（圖1C)。 黏附檢定 使用僅表現人類α5β1整合素之Κ562細胞株確立用於功能 篩選之敏感性黏附檢定。出於此目的，以1 pg/ml人類纖維 120159.doc •19- 200817433 結合蛋白或BSA作為非黏附基質來塗佈96孔平板以測定檢 定之整體背景。由於整合素與ECM分子之黏附依賴於 Ca2+/Mg2+之存在，因此使用10 mM EDTA來測定纖維結合 蛋白獨立於整合素之背景結合。功能阻斷抗體IIA1用作參 比且未阻斷抗α5β1整合素小鼠單株抗體（VC5)充當陰性抗 體對照。如所預期，EDTA、IIA1(5 pg/ml)及BSA塗層抑制 K5 62介導之黏附之結合，而VC5(5 pg/ml)並不干預細胞黏 附（圖2)。 〇 1.3抗體噬菌體呈現及淘選策略 以HuCAL®-GOLD庫根據文獻（17-20)中描述之方案進行 用於鑑定完全人類抗α5β1整合素抗體之抗體噬菌體呈現。 應用下列淘選策略且並行運作（表1): 淘選子碼 第一輪 第二輪 第三輪 1298.1-3 α5β1整合素固相 α5β1整合素固相 α5β1整合素固相 1298.4-6 α5β1整合素固相 Κ562細胞 α5β1整合素固相 1299.1-3 Κ562細胞 α5β1整合素固相 Κ562細胞 1321.1-3 α5β1整合素固相 ΗΤ29α5細胞 α5β1整合素固相 1322.1-3 ΗΤ29α5細胞 p.a. HT29wt α5β1整合素固相 ΗΤ29α5細胞 1322.4-6 ΗΤ29α5細胞 p.a. HT29wt ΗΤ29α5細胞 p.a. HT29wt ΗΤ29α5細胞 1324.1-3 HDMVEC α5β1整合素固相 HDMVEC 1369.1-2 α5β1整合素固相 ΗΤ29α5細胞 p.a. HT29wt α5β1整合素固相 1371.1-2 ΗΤ29α5細胞 p.a. HT29wt α5β1整合素固相 ΗΤ29α5細胞 p.a. HT29wt 表1 :概述淘選方法 p.a :以HT29wt吸附（以降低非特異性細胞表面結合）後 AL W_ · 結呆· 120159.doc -20- 200817433 在淘選1298-1324期間，篩選數千株。儘管應用各種顯 示策略，屢次分離出一在ELISA及FACS中具有選擇性之株 (MOR04055)。除明顯結合優勢免疫抗原決定基之 MOR04055 外，確定出 4 種其他株（MOR04139、04141、 04160、04568)。為進一步增加選擇更多種且更具特異性 之整合素結合劑的機會，進行2種其他淘選（1369.1-2及 1371.1-2)。此處，在噬菌體呈現期間添加10 pg/ml MOR04055-Fab以抑制優勢株MOR04055之富集。儘管Fab f》 競爭，遍及淘選1369發現所有特異性結合劑再次為 MOR04055。在淘選1371中，鑑定出一種其他個別結合劑 (MOR04624) 〇 1.4功能測試Fab抗體 黏附檢定 根據功能阻斷效能於預篩選實驗中將由第一淘選方法獲 得之抗體排列如下：MOR04624>MOR04055>MOR04141 = MOR045 68=MOR04160 〇 MOR0413 9稍微受抑但未達到 50% 〇 抑制。K562黏附檢定中不同濃度抗體之劑量依賴型再測試 證實預篩選實驗之結果，一例外為：MOR04139並未展示 任何劑量依賴型抑制。不再進一步研究此抗體（圖3)。 誘導細胞凋亡 進一步評估由第一淘選方法獲得之抗體的細胞凋亡誘導 特性。因此，在37°C下以0.2及0.4 pg/ml纖維結合蛋白將96 孔平板塗佈1小時，且以2% BSA阻斷。將lxl〇4 HUVEC細 胞與相應抗體一起在不含血清之用於内皮細胞培養之介質 120159.doc -21 - 200817433 中培育（Gibco)。18小時後，根據製造商描述之程序 (Caspase Glo 3/7 ; Promega)將卡斯蛋白酶3/7檢定套組用 於細胞溶解及卡斯蛋白酶活性之量化。單價Fab MOR04055及04624以100 pg/ml之濃度於HUVEC細胞中如 二價參比IgG IIA1在10 pg/ml般強烈地誘導卡斯蛋白酶3/7 活性（圖4)。在此檢定中所有其他Fab為陰性。 藉由FACS滴定量測親和力 為分析原生α5β1整合素之結合效能，藉由FACS滴定測 Ο 試α5β1陽性HUVEC細胞上的所有抗體（表2)。MOR04055具 有最高結合親和力（〇·9 ηΜ)且展示二聚IgG形式增加。對於 MOR04624，發現單價Fab之低奈莫耳範圍之KD及二聚IgG KD之增加。 MOR KD(nM)單價 Fab KD IgG 04055 0.9 0.5 04139 無rel.擬合 n.d. 04624 7.5 3.1 IgGIIAl - 0.6/1.0

表2 :藉由FACS滴定單價Fab及IgG之親和力測定結果 Fab及IIA1之競爭FACS 為研究Fab抗體是否與IIA1共有或未共有相同抗原決定 基，僅以0.5 pg/ml Fab或連同1 〇 pg/ml IIA1 —起培育 ΗΤ29α5細胞。以用於FACS分析之山羊抗人類Fab特異性 PE結合物偵測與細胞結合之人類Fab。圖7展示僅Fab染色 (黑線）與Fab + IIA1 (綠線）之交疊。因此，添加ΠΑ1使得 MOR04624染色強度明顯降低。所有其他Fab未受ΠΑ1影 120159.doc -22- 200817433 響。此結果指示IIA1與MOR04624彼此競爭與相同或覆蓋 型抗原決定基結合，而其他4個Fab與無關抗原決定基結 合。 1.5親和力成熟作用：分析Fab及IgG抗體

Fab MOR04055及04624經受一輪親和力成熟。因此，藉 由使VL-CDR3或VH-CDR2隨機化自親本Fab建構子庫 (17)，且在純化之α5β1及ΗΤ29α5細胞上使其經受噬菌體呈 現選擇。在黏附檢定中於ΗΤ29α5細胞上進一步分析此篩 選之陽性結合劑，且根據其抑制活性排列。發現 MOR04624之衍生物具有最佳抑制潛能。MOR04055、 MOR04568、MOR04141之衍生物僅展示中等或未展示顯 著抑制提高。基於此等株之輕及重鏈，選殖VL_CDR3與 VH-CDR2之12種新組合以進一步優化（所謂的"X選殖”）。 表現最佳抑制株及來自X選殖之株且純化且活體外比較以 便鑑定最終7種具有改良之功能阻斷活性的固結獨特結合 劑以用於進一步深入分析（MOR04971、72、74、75、77、 85 、 87) ° 誘導細胞凋亡 藉由卡斯蛋白酶活性及細胞存活率量測對HUVEC細胞 之活體外細胞凋亡誘導（圖6及圖7)。兩種檢定中，單價Fab MOR04974、04975及04977之功效與二價小鼠單株參比抗 體IIA1可比。 120159.doc -23- 200817433 •^50 (MQ/ml) IC50 (nM) IIA1 0.05 0.3 MOR04624 11.25 225.0 MOR04985 0.09 1,8 MOR04987 0.12 2.4 MOR04977 0.09 1.9 MOR04975 0.09 18 MOR04974 0.06 1.2 MOR04055 1.87 37.3 MOR04971 0.21 4,3 MOR04972 0.67 13.3 表3 : XTT增生檢定中Fab抗艎之IC50值 與親本Fab相比，親和力成熟抗體顯著改良（高達190之 因子）。單價Fab之增生抑制功效比二價參比抗體IIA1小4 倍。 免疫沈殺 為證明Fab抗體之特異性，以與磁性Dyna珠粒偶合之Fab 培育表面生物素化ΗΤ29α5及HT29wt細胞之NP-40胞溶物。 IIA1用作參比抗體。加強洗滌後，在還原條件下使沈澱於 SDS-PAGE樣品緩衝液中沸騰，轉潰至PVDF膜且以抗生蛋 白鏈菌素（streptavidine)-AP探測。所有抗α5β1整合素抗體 均使對應於預期分子量之整合素鏈α5及βΐ之約135 kDa之 蛋白質雙重k帶特異性地沈澱（圖11)且HT29wt細胞溶胞物 中未發現此情形。ΠΑ1發現相同雙帶。不相關Fab MOR03207用作負對照且其並不使此雙帶沈澱。此結果證 明Fab抗體之高特異性。

於HUVEC黏附檢定中優化IgG 為研究上文描述之Fab抗體之活體外效能以二聚形式是 120159.doc -24- 200817433 否進一步提高，根據標準技術使用MorphoSys HuCAL IgG 載體套組（MorphoSys AG，Munich; Germany)將抗體轉化為 全部IgGl分子，且藉由HUVEC黏附檢定（圖8)、HUVEC生 存力檢定（圖9)及HUVEC細胞凋亡檢定（圖1〇)與參比抗體 IIA1相比較進行分析。 最重要地，IIA 1作為參考點包括於全部實驗中。在此方 面，MOR04974、75及77之IgG轉化得到與IIA1具有極相似 IC5〇之HuCAL IgG，指示與單價Fab形式相比轉化實際上導 致約2倍增加。

於HUVEC生存力檢定中優化IgG 觀察到IgG轉化後，與Fab形式相比，5種結合劑具有約2 倍增加之IC50值。在降低HUVEC生存力中，MOR04974、 75及77展不與參比IgG IIA1極相似的功效。

於HUVEC細胞阔亡檢定中優化igG 自卡斯蛋白酶3、7檢定中引導IgG之分析可推斷出 MOR(M974、75及77誘導與參比抗體^八丨十分相當之細胞 凋亡。 1.6深入分析親和力優化之抗整合素IgG抗體 親和力優化之抗整合素抗體之特異性 藉由FACS分析HT29wt對ΗΤ29α5細胞，測試IgGl形式之 親和力成熟抗體之結合特異性。HT29wt為α5陰性但含有 βΐ整合素鏈。如螢光位移（圖12)所指示，IgG1抗整合素抗 體及參比抗體ΠΑ1特異性地識別ΗΤ29α5但非HT29wt細 胞。非特異性抗體同型對照並不與細胞結合且所量測螢光 120159.doc -25- 200817433 中未觀察到位移。該等實驗證明主要候選抗體特異性地識 別α5整合素且以如參比抗體IIA1般相同的特異性來結合。 親和力成熟且再選殖入IgG形式後，抗α5ρΐ整合素抗體之 抗原決定基特異性保留 FACS競爭實驗展示Fab抗體MOR04624及其衍生物與參 比抗體IIA1競爭與覆蓋型抗原決定基之結合。轉化成IgGl 形式後，再次測試抗α5β1整合素抗體與IIA1之結合競爭。 IgGl 抗 α5β1 整合素抗體 MOR04974、75、77、85 及 MOR04624與ΗΤ29α5細胞之結合使得螢光移動，當以ΙΙΑ1 預培養細胞時其完全受抑。此結果證實ΙΙΑ1與IgGl抗α5β1 整合素抗體之抗原決定基競爭（圖13)。 抗α5β1整合素IgGl抗艎於管形成血管生成檢定中之定性 分析 認為新形成血管由活化内皮細胞之阻斷為抗α5 β 1整合素 抗體之關鍵抑制活性之一。對於全面表徵，與參比抗體 ΙΙΑ1相比較，在HUVEC管形成檢定中分析親和力優化之 IgGl抗α5β1整合素抗體。 在此檢定中，將2χ104人類内皮靜脈臍細胞（HUVECs #2519，Promocell)接種於 EBM-2 介質（Clonetics #CC3156) 中虽含生長因子之 Matrigel(Becton Dickinson #354234) 上。15分鐘以後添加抗體（6 nM、3 nM、600 pM、300 pM、60 PM)且在3 7°C使管形成18-24 h。隨後將細胞固定 及以抗CD3 1染色以用於照片證明管形成。 孔中所形成複合網之視覺分析揭示所有具有與參比抗體 120159.doc -26- 200817433 相似之效能的MOR04624衍生之抗α5β1整合素抗體之管形 成阻斷活性（圖14)。在高濃度下，亦發現人類及鼠類IgG1 同型對照之管形成之抗體阻斷。然而在低抗體濃度（下降 至3 00 pM)下，觀察到管形成僅在以特異抗體處理之孔中 阻斷，但在未處理孔或以抗體同型對照處理或弱功能阻斷 抗體MOR04624處理之孔中未阻斷的活性窗。 於遷移檢定中分析抗(χ5β1整合素IgG抗體 血管生成過程中，活化之内皮細胞在主要由纖維結合蛋 白（FN)組成之血管生成特異性臨時基質上向血管生成刺激 物遷移。在跨孔遷移檢定中分析優化之抗“卩丨整合素IgG 抗體，且發現所有抗α5β1抗體以與ΠΑ1相同數量級之功效 (1-10 pg/ml)的α5β1纖維結合蛋白依賴型HUVEC遷移之阻 斷活性。 抗(χ5β1整合素抗體之反應性 對腫瘤及内皮細胞株之反應性 藉由FACS結合實驗對各種内皮及腫瘤細胞株測試抗 α5β1整合素抗體之反應性（表4)。觀察到除已知為α5鏈陰 性之HT29wt細胞外與所有測試内皮及腫瘤細胞株之結 合。與參比抗體IIA1相比，引導候選抗體同樣與所有測試 細胞株結合且所得螢光位移與所有抗體相似。同型對照抗 體並未結合。總而言之，抗α5β1整合素抗體在facs細胞 結合實驗中展示相當於IIA1之反應性。 120159.doc -27- 200817433 抗·α5β1* MOR04624 +++ X + ++ ++ +++ + +++ + + + ++ 1 + MOR04985 + +++ +++ ++ - + + + ++ 1 +++ 1 MOR04977 | +++ + ++ +++ ++ +++ i +++ + ++ ++ 1 +++ MOR04975 - +++ ++ - ++ + ++ +++ + ί ++ 1 + MOR04974 + +++ + + 1 1 + ++ +++ ++ +++ ++ + + ++ ++ 1 +++ 1 ΠΑ1 1 ί +++ +++ + 1 1 ++ + ++ ++ +++ + ++ + ++/+++ ++ ++ 暫 - 丨VC5丨 ++ + + ί + +++ ++ ++ 1 抗 _αΥβ5 1 + ep 1 ++ ++ + + + 抗-αΥβ3 + ++ 1 1 1 + ί + + 1 i 組織 人類皮膚微脈管内皮 細胞 人類乳房上皮細胞 (epithel) 人類肺動脈内皮 人類臍靜脈内皮細胞 小鼠胰腺内皮 豬主動脈内皮細胞 人類腫瘤内皮 惡性黑色素瘤 人類肺癌 人類腺癌 人類前列腺癌 結腸直腸癌 纖維肉瘤 人類乳癌 人類乳房癌 人類前列腺腺癌 人類惡性膠質瘤 人類腺癌 以a5鏈轉染之HT29 細胞株 HDMYEC HMEC HPAEC HUVEC MS-1 PAEC hTumorend A375 A549 C〇1〇205 DU145 |HCT116 | |HT-1080 | MCF-7 MDA-MB- 231 PC-3 |U251 HT29 HT29a5 ssuisnPHguA ϋ^^φ^1CQ.S 赳 if^^^:(N6lo(Nqew#esis^usco.AS^:t17 5 7s3#tIsis3HQ 19/lsauMI ^^:实^鹬^:^#瓣^珑叫經敦齊鲽娄^10311111^1031111》袈欹||^蜱^*:(^锏碱敦 ^«飨漶坶 + + +二采艄碱溆1)«飨漉++，«飨嗎"+。±1、熒^83\^>卷驾1'*4葙鲴^^^撫1^^>^:寸< 120159.doc -28- 200817433 抗a5pl抗體對正常及腫瘤組織切片之反應性_免疫組織化學 在免疫組織化學實驗中對不同組織切片分析親和力優化 之抗α5β1整合素抗體，且抗整合素抗體對個別組織之特異 反應性概況極其類似於ΙΙΑ1染色。總而言之，推斷出抗 α5β1整合素抗體展示與ΙΙΑ1相當之染色圖案（圖16)。 活體内表徵親和力優化之抗α5ρι整合素IgG抗體異種移植 裸鼠中活艘内乾向之證明 在具有ΗΤ29α5細胞之異種移植物的裸鼠中比較與HA}相 比優化之抗α5β 1整合素抗體的活體内乾向特性。 以碘125根據碘化法根據標準程序進行優化之抗“…整 合素抗體（IgG4-Pro)之放射性標記，歷時丨分鐘。在細胞結 合檢定（’’Lindmo檢定”）中量測免疫反應性。在4〇c以增加數 目（0.25至10 Mio)之α5β1整合素陽性細胞將5〇叫放射性標 記之抗體培育2 h。隨後洗滌細胞且在閃爍計數器中測定 結合放射活性。將總計數/結合計數之商相對於丨/細胞數作 圖，且以非線性回歸模型擬合數據。自與y軸之交點計算 無限抗原雄、度之剩餘免疫反應性且對於所有抗α 5 β 1整合素 抗體而言發現其為75-80%。 除MOR(M975在48小時後迅速下降至72 h後小於5% ID/g 外’對於所有分析之抗體而言，自24小時人類抗α5 β 1整合 素抗體以>10%ID/g累積至ΗΤ29α5異種移植物，持續％小 時。48小時後MOR04974以18% ID/g達到其峰值，且72 h 後MOR04977以18% ID/g達到其峰值。相比較而言，鼠類 ΠΑ1抗體自24 h在ΗΤ29α5異種移植物上以>i〇%iD/g累積， 120159.doc -29- 200817433 持、冋達96 h。對於非特異性抗溶菌酶抗體M〇R〇32〇7而 言，發現任何時間點均小於3%m/g。自此等結果，可推斷 陽性ΗΤ29α5異種移植物之特異靶向。抗必…整合素 抗體m〇R04974& MOR04977之活體内靶向與πα丨類似且在 單一時間點，甚至更優。 抗α5β1整合素抗體自血管生成替代動物模型之活體内功效 一如參比抗體ΙΙΑ1，抗〇1501整合素抗體不會與小鼠及大 鼠α5β1整合素交叉反應。因此在動物模型中分析活體内治 Γ 療效能且證明特異性活體内抗血管生成作用係具有難度 的’且必須在血管生成之替代模型中進行。 已在血官生成之3D活體内球狀體替代模型中進行抗 整合素IgG抗體與ΠΑ1之活體内比較（圖ι8)。 對於此模型，將規定内皮細胞數目之球狀體與允許在24 孔平板中聚合之膠原蛋白混合。隨後將在matHgel栓塞中 含有VEGF及FGF2之EC球狀體皮下植入SCID小鼠中，其中 C/ 所刺激之EC形成與小鼠維管結構交織之人類毛細管之複合 三維網路。抗α5β1整合素抗體（200 μ§)每週給予兩次，歷 時3週。在第21天終止研究，移除matrigei栓塞並檢查血管 么度。至於參比抗體ΠΑ1，以優化之抗α5βΐ整合素IgG抗 體MOR04974及MOR04975處理，以每平方毫米2至約2〇個 微管之因子降低matrigei栓塞中之微管密度，而以不相關 人類抗溶菌酶抗體MOR03277處理，以使得每平方毫米降 低約40個微管。 基於此結果，可推斷出優化之人類抗α5β1整合素抗體 120159.doc -30- 200817433 MOR04974及MOR04975在血管生成之3D活體内球狀體替 代模型中具有與IIA1可比之活體内抗血管生成功效。 結論：

在活體外實驗中，發現MOR04974、75、77之Fab以及 IgGl形式之最佳抑制特性具有一致性。所有3種IgG與參比 mAb IIA1相當。此等結合劑係MOR04624之衍生物。在活 體内實驗中，證明完全人類及優化之IgG MOR04974、 75、77在裸鼠及血管生成之3D球狀體模型中可有效地靶向 腫瘤異種移植物，MOR04974及MOR04975如參比抗體IIA1 般有效。 上述抗體之V鏈的胺基酸序列展示於表4中： 親本 MOR04624 最終 hlgGl κ VH_h-IgGl-載體 VL-h-κ-載體 MOR04974 MOR04985 MOR04990 MOR04975 MOR04985 MOR04991 MOR04977 MOR04987 MOR04989 MOR04985 MOR04985 MOR04624 MOR04624 VLk (SEQ ID NO:1) diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgissnlnwyqqkpgkapklliyaasnlqsgpsrfsgsgsgtdftltisslq pedfavyycqqysdqsytfgqgtkveikrt VH (SEQ ID NO: 2) qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssygmswvrqapgkglewvssisysdsntyyadsvkgrftisrdns kntlylqmnslraedtavyycarglgdyghhhglsgifdywgqgtlvtvss MOR04055 VLA3 (SEQ ID NO: 3) dieltqppsvsvapgqtariscsgdsigeqyahwyqqkpgqapvlviyddnkrpsgiperfsgsnsgntatltis gtqaedeadyycgsytltntasvfgggtkltvlg VH3 (SEQ ID NO: 4) qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsnyamnwvrqapgkglewvsrisysgsdtyyadsvkgrftisrdns kntlylqmnslraedtavyycaregefgfmystlvfdswgqgtlvtvss 120159.doc -31 · 200817433 MOR04971 VLA3 (SEQ ID NO: 5) dieltqppsvsvapgqtariscsgdsigeqyahwyqqkpgqapvlviyddnkrpsgiperfsgsnsgntatltis gtqaedeadyycssytyssdasvfgggtkltvlg VH3 (SEQ ID NO: 6) qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsnyamnwvrqapgkglewvsaihdnghtyypdsvkgrftisrdns kntlylqmnslraedtavyycaregefgfmystlvfdswgqgtlvtvss MOR04974 VLk (SEQ ID NO: 7) diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgissnlnwyqqkpgkapklliyaasnlqsgpsrfsgsgsgtdftltisslq pedfatyycqqyasprqtfgqgtkveikrt VH (SEQ ID NO: 8) qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssygmswvrqapgkglewvsgirakqsgyatdyaapvkgrftisrd 〇 nskntlylqmnslraedtavyycarglgdyghhhglsgifdywgqgtlvtvss MOR04975 VLk (SEQ ID NO: 9) diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgissnlnwyqqkpgkapklliyaasnlqsgpsrfsgsgsgtdftltisslq pedfatyycqqyefgiqtfgqgtkveikrt VH (SEQ ID NO: 10) qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssygmswvrqapgkglewvsgirakqsgyatdyaapvkgrftisrd nskntlylqmnslraedtavyycarglgdyghhhglsgifdywgqgtlvtvss MOR04977 VLk (SEQ ID NO: 11) diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgissnlnwyqqkpgkapklliyaasnlqsgpsrfsgsgsgtdftltisslq pedfatyycqqyssnpqtfgqgtkveikrt VH (SEQ ID NO: 12) qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssygmswvrqapgkglewvsfiepkwrggathyaasvkgrftisrd nskntlylqmnslraedtavyycarglgdyghhhglsgifdywgqgtlvtvss MOR04985 VLk (SEQ ID NO: 13) diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgissnlnwyqqkpgkapklliyaasnlqsgpsrfsgsgsgtdftltisslq pedfavyycqqysdqsytfgqgtkveikrt VH (SEQ ID NO: 14) qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssygmswvrqapgkglewvsgirakqsgyatdyaapvkgrftisrd nskntlylqmnslraedtavyycarglgdyghhhglsgifdywgqgtlvtvss 120159.doc -32- 200817433 2.結論： 抗α5β1整合素功能阻斷抗體僅以嵌合抗體形式可用。* 全人類化之方法已失效。該等抗體於臨床環境中之應用7 誘導人類患者之免疫反應。尤其對於長期應用抗血管生^ 化合物而言，此可導致增加之給藥或甚至可導致治療早期 終止之嚴重副作用。 已鑑別具有優良生物概況之完全人類α 5 β 1整合素功处阻 斷抗體。歸因於保證在臨床環境中盡可能無副作用之完八 人性，對於已存在鼠類及嵌合抗體係有利的。預期相對於 此分子以嚴重副作用及/或增加之劑量誘導免疫反應的可 能性較低。因此此等分子更適用於人用醫藥，例如對於户 療實體腫瘤。 參考文獻： 1) Carmeliet Ρ及 Jain RK (2000) Nature 407: 249-257 ; 2) Kim S等人（2002) J Clin Invest 1 10: 933-941 ; 3) Kim S 等人（2002) Am J Pathol 156: 1345-1362 ; 4) Kim S 等人（2002) J Biol Chem 275: 33920-33928 ; 5) Cheresh DA 及 Stupack DG (2002) Nat Med 8: 193、 194 ； 6) George EL 等人（1993) Development 119:1079-1091 ; 7) George EL 等人（1997) Blood 90: 3073-3081 ; 8) Yang等人（1993) Development 1 19: 1093-1 105 ; 9) Goh KL等人（1997) Development 124: 4309-4319 ; 10) Taverna D及 Hynes RO (2001) Cancer Res 61: 5255、 120159.doc -33- 200817433 5261 ； 11) Francis SE 等人（2002) Artherioscler Thromb Vase Biol 22: 927-933 ； 12) McDonald D 及 Choyke PL (2003) Nat Med 9: 713-725 ； 13) Bakfe MM等人（2002) Nat Med 8: 995-1003 ; 14) Finck B (2004) SRI conference MAngiogenesis: New Opportunities And Solutions For Drug Development’’， Cambridge, MA ； 15) Symington BE (1989) J Biol Chem 264: 13258-13266 ； 16) Knappik A等人（2000) J Mol Biol 296: 57-86 ; 17) Krebs B 等人（2001) J Immunol Methods 254: 67-84 ; 18) Rauchenberger R等人（2003) J Biol Chem 278: 38194-38205 ； 19) Lohning C? United States Patent 6,753,136 ； 20) Magnussen 等人（2005) Cancer Research 65: 2712-2721 ； 21) Yao 等人（2006) Cancer Research 66: 2639-2649 o 【圖式簡單說明】 圊1 A : K562細胞之α5表現的FACS分析： 以功能阻斷抗α5β1整合素小鼠單株抗體IIA1證明人類 α5β1整合素於活K562細胞之細胞表面上的表現（14)。對於 此目的，如MorphoSys提供之HuCAL® GOLD手冊中所描述 使用標準FACS程序。 120159.doc -34· 200817433 圖1B :人類結腸癌細胞株HT29並未表現α5整合素鏈。 FACS分析證明HT29細胞並未表現α5整合素鏈，而βΐ鏈 以高密度存在於細胞表面上。為此，ΗΤ29細胞極適於以 α5整合素鏈轉染。 圖1C:以α5整合素cDNA轉染後人類結腸癌細胞株ΗΤ29 表現α5β1整合素。以α5整合素鏈轉染後，藉由FACS分析 使用功能阻斷小鼠抗人類α5β1整合素單株抗體IIA1作為參 比’證明α5β1整合素在HT29cx5細胞之表面上的同源表 〇 現。 圖2 :對Κ562細胞與纖維結合蛋白塗佈之培養平板黏附 的抑制在功能阻斷（ΙΙΑ1)或未阻斷（VC5)抗α5β1整合素小鼠 單株抗體存在下，培育預加載鈣黃綠素之Κ562細胞。使用 10 mM EDTA測定Κ562細胞與纖維結合蛋白之獨立於整合 素之背景結合。在不支持K562細胞與培養平板之表面黏附 的BSA阻斷孔中測定檢定之整體背景。將黏附細胞（洗滌 ◎ 後）溶解且測定螢光。 圖3 : Fab介導之K562細胞對纖維結合蛋白之劑量依賴 型抑制作用 測試抗人類α5β1特異性Fab抑制螢光染料負載之K562細 胞與固定纖維結合蛋白之結合的能力。黏附後，將細胞溶 解且作為黏附細胞之量測測定螢光。僅纖維結合蛋白指示 隶大黏附，而對B S A包覆之細胞測定檢定之整體背景。 圖4 :抗α5β1功能阻斷抗體誘導内皮細胞細胞阔亡。 使用HUVEC細胞於不含血清之内皮細胞介質中測定呈 120159.doc -35- 200817433 單價形式之純化之Fab的卡斯蛋白酶3/7活化之誘導。使用 市售化學發光檢定系統（Caspase Glo, PROMEGA)根據製造 商之說明測定卡斯蛋白酶活性。

圖5 ·· Fab及IIA1之競爭FACS FACS競爭指示MOR04624與ΗΤ29α5細胞上之參比抗體 ΙΙΑ1之抗原決定基競爭。可推斷兩種抗體共有類似抗原決 定基，而所有其他Fab與α5 β 1整合素上之無關結合位點反 應。（黑線-Fab結合，綠線-當與參比抗體ΙΙΑ1競爭時之Fab 結合）。 圖6 :親和力成熟抗<*5β1功能阻斷抗體有力地誘導内皮 細胞細胞凋亡 使用HUVEC細胞於不含血清之内皮細胞介質中測定呈 單價形式之純化之Fab的卡斯蛋白酶3/7活化之誘導。使用 市售化學發光檢定系統（Caspase Glo，PROMEGA)根據製造 商之說明測定卡斯蛋白酶活性。 圖7 :親和力成熟抗〇t5pi功能阻斷Fab抗體抑制内皮細胞 增生 在指示量之純化Fab或參比抗體IIA1存在下將黏附 HUVEC細胞於不含血清之内皮細胞介質中培育48小時。 以市售XTT檢定根據製造商之說明測定增生細胞。測定 IC50值且概括於表4中。

圖8 :於HUVEC黏附檢定中優化IgG 藉由α5β 1功能阻斷IgG抗體抑制HUVEC細胞與纖維結合 蛋白之黏附。IgG MOR04974、MOR04975、MOR04977、 120159.doc -36- 200817433 MOR04985以與IIA1類似之IC50值阻斷黏附。Fab向IgG之 轉化導致約2倍增加。 圖9 ·· HUVEC生存力檢定抗α5β1整合素IgG之分析 α5β1功能阻斷IgG抗體抑制HUVEC細胞之生存力。將 HUVEC細胞平皿接種於纖維結合蛋白塗佈之平板上，以 增加濃度之IgG抗體培育且48 h後量測存活率。IgG MOR04974、MOR04975、MOR04977、MOR04985 以與 IIA1類似之IC50值阻斷黏附。Fab向IgG之轉化導致約2倍 增加。 圖10 :抗α5ρΐ整合素IgG之HUVEC卡斯蛋白酶檢定 使用HUVEC細胞於不含金清之内皮細胞介質中測定 α5β1功能阻斷IgG抗體對卡斯蛋白酶3/7活化之誘導。使用 市售化學發光檢定系統（Caspase Glo, PROMEGA)根據製造 商之說明測定卡斯蛋白酶活性。MOR04974、MOR04975、 MOR04977及MOR04985與參比抗體ΠΑ1之活性相似。 圖11 :親和力成熟Fab特異性地使α5β1整合素自生物素 化細胞溶胞物之表面沈澱 以與磁性Dyna珠粒偶合之Fab培育ΗΤ29α5及HT29wt之表 面生物素化NP40溶胞物。將免疫沈澱物轉移至pvDF薄膜 且以鏈黴抗生素蛋白鹼性磷酸酶（AP)。所有pab均特異性 地使與參比抗體IIA1相當預期尺寸之蛋白質自ΗΤ29α5溶胞 物沈澱出，而HT29wt溶解物中無蛋白質可摘測到。不相 關Fab MOR03207並未特異性地使任何蛋白質沈澱。 圖12·抗α5β1整合素IgG(實例MOR04974)與HT29-wt及 120159.doc -37· 200817433 HT29a5(FACS量測）之結合特異性 在10 pg/mL以5xl05 HT29wt及ΗΤ29α5細胞培育親和力 成熟IgG抗體。以Cy3標記之二級抗體偵測特異性結合之抗 體。上圖：以HT29wt(左）或ΗΤ29α5細胞（右）培育之ΠΑ1， 下圖：IgGl MOR04974。螢光遷移指示與α5整合素特異性 結合且發現MOR04975、MOR04977、MOR04985及MOR04624 螢光遷移。抗體同型對照為陰性（黑線）。抗整合素抗體以 與參比抗體IIA1相同之特異性與α5鏈轉染之細胞結合。 圖13 : ΗΤ29α5細胞上之抗α5β1整合素IgG(實例MOR04974) 與IIA1之競爭結合（FACS量測）。抗α5β1整合素IgG與 IIA1競爭覆蓋型抗原決定基。 在1 pg/mL以5x 105以20 pg/mL IIA1預培育或未預培育之 ΗΤ29α5細胞培育内部產生之抗α5β1整合素抗體。藉由以 山羊抗小鼠-FITC偵測來證明ΙΙΑ1結合之存在（左圖）。藉由 以山羊抗人類-FITC二級抗體偵側來展示人類抗體 (MOR04974)之結合及競爭（右圖）。此實例展示MOR04974

Q 競爭。發現MOR04975、MOR04977、MOR04985、MOR04624 具有相同結果。 圖14 :於管形成檢定（實例MOR04974)中分析IgGl抗 α5β1整合素抗體。親和力優化之抗α5β1整合素IgGl抗體 如IIA1般有效地阻斷管形成。 在60-80%融合收集早期傳代人類内皮靜脈臍細胞 (HUVECs #2519)且將2xl〇4細胞接種於於EBM-2介質 (Clonetics #CC3156)中含有 Matrigel(Becton Dickinson 120159.doc -38- 200817433 #354234)之孔中。15分鐘以後添加抗體，且在37°C使管形 成進行18-24 h。隨後將細胞固定（4%福馬林）、滲透、阻斷 且以抗 CD31染色。以 6 nM、3 nM、600 pM、300 pM及 60 pM施加抗體。展示300 pM A :未處理樣品；B :人類IgGl 抗溶菌酶 MOR03207 ; C : IgGl MOR04624 ； D ： IgGl MOR04974 ; E : IIA1 ; F :鼠類IgGl之作用的代表性影 像。發現MOR04975及MOR04977亦具有相同結果。 圊15 :親和力優化之抗(χ5β1整合素IgG抗體於跨孔遷移 〇 檢定中之活性。 於96孔跨孔遷移微板（8 μπι孔，#35 1 163 Falcon/BD)中， 以纖維結合蛋白作為唯一刺激物進行遷移檢定。在37°C以 2 pg/mL纖維結合蛋白將fluoroblok膜之下側塗佈1 h且在 37°C以2% BSA阻斷30分鐘。將含有0.1% BSA之不含人類 内皮血清之介質（Invitrogen)在上部及下部腔室中用作遷移 緩衝液。將抗α5β1整合素抗體（0.6-10 pg/mL)添加至各孔 之上部腔室中，添加早期傳代HUVEC(2xl04)且在37°C使 J 細胞遷移4 h。隨後將膜下側之遷移細胞鈣黃綠素染色， 且以 Perkin Elmerl220 Victor計數器在 485 nm激發及 535 nm發射光測定所得螢光。A :在10 pg/mL抗體濃度獲得所 展示之影像。MOR04974、MOR04975、MOR04977如 IIA1 般有效地抑制HUVEC遷移。 B : MOR04974、75、77(IgG4-Pro抗體同型）之抗遷移活 性之劑量-反應。IC50(MOR04974 : 1 pg/ml ; MOR04975 : 1.5 pg/ml ; MOR04977 ·· 1 pg/ml ; IIA1 : 2 pg/ ml) 120159.doc -39- 200817433 圖16 :結腸癌組織上親和力優化之IgGl抗α5β1整合素抗 體之IHC染色圖案。 在結腸癌之連續組織切片上滴定放大10倍之生物素化抗 體。以鏈黴抗生素蛋白鹼性磷酸酶進行偵測。例如展示所 獲得濃度為2 · 5 pg/mL之免疫組織化學切片。對於π A1及 MOR04974，發現小至中等尺寸血管及基質分隔之染色。 黑色箭頭展示由2種抗體染色之相同血管。發現MOR04975 及MOR04977具有類似染色圖案。藍色箭頭指示經染色之 血管。可推斷優化之抗α5β1整合素抗體展示與IIA1相當之 染色圖案。 圖17 :親和力優化之抗α5β1整合素抗體（IgG4-Pro)之腫 瘤把向。 以碘125放射性標記抗α5β1整合素抗體（1分鐘，lodogen 方法）。經測定剩餘免疫反應性為75-80%，且將3 pg標記 之抗體注入ΗΤ29α5異種移植裸鼠。 A :腫瘤吸收IgGl MOR04974、MOR04975及對照（參比 抗體IIA1及抗溶菌酶MOR03207) ; B :腫瘤吸收IgGl MOR04977及對照。 抗α5β1整合素抗體之抗體吸收與IIA1類似，且顯著高於 不相關IgGl MOR03207。由此結果推斷出抗α5β1整合素抗 體可特異性地靶向α5β 1整合素陽性ΗΤ29α5異種移植。 圖18 :於血管生成之3D活鱧内球狀體替代模型中分析優 化之抗a5pl整合素IgG抗體。 將含有規定内皮細胞數目之球狀體與VEGF及FGF2之 120159.doc -40- 200817433

I

Matrigel栓塞皮下植入SCID小鼠中。以優化之人類抗α5β1 整合素抗體及對照抗體治療後，分析具有小鼠維管結構之 複合網路之EC-萌發及血管形成。人類IgG MOR04974及 MOR04975如 IIA1 般有效。 120159.doc -41 - 200817433

序列表 <110〉 1.德商拜耳先靈製藥公司 2.德商莫菲西斯公司 <120〉 具有降低免疫性之高親和力人類及人類化抗α5β1整合素功能阻斷抗體 <130〉 53407AWO <140〉 <141> 096118587 2007-05-24 <150> ΕΡ06010779.4 <151> 2006-05-24 <160〉 14 o <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 108 <212> PRT <213>人工 <220> <221> DOMAIN <222> a) · · α〇8) 〇 <223> VLk <400> 1

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Gly lie Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu val Thr val ser ser 115 120 125 120159.doc 13-

Claims (1)

1. 200817433 十、申請專利範圍： 1 · 種人類或人類化抗體或其抗原結合片段，其以$ i 00 nM之親和力與a5pi整合素結合，且其在活體外及活體内 可抑制表現α5β1整合素之細胞至其受體之黏附作用。 2 _如明求項1之抗體或片段，其以$ 1 〇 ηΜ之親和力與 整合素結合。 3·如請求項1或2之抗體或抗體片段，其在活體外抑制Κ562 細胞株之黏附作用。 ί、 4.如請求項1至3中任一項之抗體或抗體片段，其包含： Ο) VH區域，其選自 ⑴胺基酸序列 SEQ ID NO: 1(MOR04624)、SEQ ID NO: 3(MOR04055)或該等VH區域中之一者的至 少一個H-CDR1、H-CDR2及 / 或 H-CDR3區域；或 (Η)藉由更改至少一個H-CDR區域而獲自（i)之序列的 胺基酸序列；及/或 (b) VL區域，其選自 ϋ (0 胺基酸序列 SEQ ID NO: 2(MOR04624)、SEQ ID NO: 4(MOR04055)或該等VL區域中之一者的至少 一個 L-CDR1、L-CDR2及/或 L-CDR3 區域；或 (ii)藉由更改至少一個L-CDR區域而獲自（i)之序列的 胺基酸序列。 5·如請求項4之抗體或抗體片段，其包含藉由使該H-CDR2 區域隨機化而衍生自（a)(i)之VH區域的VH區域。 6.如請求項4或5之抗體或抗體片段，其包含藉由使該L-120159.doc 200817433 CDR3區域隨機化而衍生自（b)(i)之VL區域的VL區域。 7·如請求項4至6中任一項之抗體或抗體片段，其包含藉由 使抗體鏈改組而衍生自（a)(i)之VH區域及/或（b)(i)之VL 區域的VH及/或VL區域。 8. 如請求項4至7中任一項之抗體或抗體片段，其包含： (a) VH區域，其選自胺基酸序列SEQ ID NO: 5 (MOR04971)、SEQ ID NO: 7(MOR04974)、SEQ ID NO: 9(MOR04975)、SEQ ID NO: 11(MOR04977)及 SEQ ID NO: 11(MOR04985)或該等VH區域之至少一 個 H-CDR1、H-CDR2及 /或 H-CDR3 區域；及 /或 (b) VL區域，其選自胺基酸序列SEQ ID NO: 6 (MOR04971)、SEQ ID NO: 8(MOR04974)、SEQ ID NO: 10(MOR04975)、SEQ ID NO: 12(MOR04977)及 SEQ ID NO: 14(MOR04985)，或該等VL區域之至少 一個 L-CDR1、L-CDR2 及/或 L-CDR3 區域。 9. 一種抗體或抗體片段，其包含SEQ ID NO: 1之VH區域及 SEQ ID NO : 2(MOR04624)之VL區域，或其至少一個11-CDR1、H-CDR-2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2 或 L-CDR3 區 〇 10· —種抗體或抗體片段，其包含SEQ ID NO: 3之VH區域及 SEQ ID NO: 4(MOR04055)之 VL區域，或其至少一個11-CDR1、H-CDR-2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2 或 L-CDR3 區 〇 11· 一種抗體或抗體片段，其包含SEQ ID NO: 5之VH區域及 120159.doc -2- 200817433 SEQ ID NO : 6(MOR04971)之VL區域，或其至少一個仏 CDR1、H-CDR-2、H-CDR3、L-CDRl、L_CDR2 或 L-CDR3區域。 12· —種抗體或抗體片段，其包含SEQ ID N〇: 7之VH區域及 SEQ ID NO: 8(MOR04974)之 VL區域，或其至少一個H_ CDR1、H-CDR-2、H-CDR3、L-CDRl、L_CDR2 或 L-CDR3區域。 13. —種抗體或抗體片段，其包含SEQ ID NO: 9之VH區域及 (' SEQ ID NO: 10(MOR04975)之VL區域，或其至少一個仏 CDR1、H-CDR-2、H-CDR3、L-CDRl、l_CDR2 或 L- CDR3 區 或。 14. 一種抗體或抗體片段，其包含SEQ ID NO: 11之VH區域 及SEQ ID NO: 12(MOR04977)之VL區域，或其至少一個 H-CDR1、H-CDR-2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2 或 L- CDR3區域。 15· —種抗體或抗體片段，其包含SEQ ID NO: 13之VH區域 u 及SEQ ID NO : 14(MOR04985)之VL區域，或其至少一個 H-CDR1、H-CDR-2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2 或 ίο DR3 區域t 〇 16. 如請求項1至15中任一項之抗體或抗體片段，其為IgG抗 體，例如人類或人類化IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗體或 其片段，例如Fab、Fab·或F(ab)2片段。 17. 如請求項1至1 5中任一項之抗體或抗體片段，其為重組 抗體，例如單鏈（sc)抗體，或其片段，例如sc Fv片段。 120159.doc 200817433 18.如請求項1-17中任一項之抗體或抗體片段，其係以與治 療劑之結合物形式呈現。 19·如請求項18之抗體或抗體片段，其中該治療劑係選自放 射治療劑及化學治療劑。 20·如请求項19之抗體或抗體片段，其中該放射治療劑為 I125、I131 或 Y90。 21.如請求項1_17中任一項之抗體或抗體片段，其係以融合 多狀形式呈現。 ί 22·如請求項21之抗體或抗體片段，其為與細胞激素之融合 多肽或為雙特異性抗體。 23.如請求項1-17中任一項之抗體或抗體片段，其係以與可 偵測標記基團之結合物形式呈現。 24_如請求項23之抗體或抗體片段，其中該可偵測標記基團 係選自放射性、NMR、染料、酶及螢光標記基團。 25. 如請求項24之抗體或抗體片段，其中該可偵測放射性標 記基團係選自I125、I131或γ9〇。 CJ 26. —種醫藥組合物，其包含如請求項i至25中任一項之抗 體或抗體片段作為活性劑。 27. 如請求項26之組合物，其用於預防或治療過度增生病 症。 28·如請求項26或27之組合物，其用於預防或治療癌症。 29.如請求項26或27之組合物，其用於預防或治療結腸癌。 30·如請求項26或27之組合物，其用於預防或治療腫瘤。 31· —種診斷組合物，其包含如請求項卜厂或以。#中任一項 120159.doc 200817433 之抗體或抗體片段作為診斷試劑。 32. 如請求項3 j之組合物，盆 八用於移斷過度增生病症或具有 該傾向病症。 33. 如請求項32之組合物，其用於診斷癌症或具有該傾 症。 34. 如睛求項26至33中任一項夕έ日人；^ 甘to Τ 1 項之組合物，其用於人用藥物。 35· —種核酸，其編碼如請求項1至17或2丨至u中任一項之 抗體或抗體片段。 f 36·如明求項35之核酸，其與表現控制序列可操作地連接。 37· —種載體或載體系統，其包含如請求項”或“之核酸。 38· —種細胞，其係經如請求項35或36之核酸或如請求項w 之載體轉型。 39· —種非人類生物體，其係經如請求項”或％之核酸或如 請求項37之載體轉型。 4〇·種用於製備如請求項1-17或21-22中任一項之多肽的方 Q 法’其中在該多肽得以表現且所表現之多肽得以回收的 條件下培養如請求項38之細胞或如請求項39之非人類生 物體。 41·如晴求項1至25中任一項之多肽的用途，其用於製造供 預防或治療α5β1整合素相關病症或具有該傾向病症之藥 劑。 42·如請求項41之用途，其用於製造供預防或治療癌症之藥 劑。 43·如睛求項1至25中任一項之多肽的用途，其用於製造供 120159.doc 200817433 診斷α5β1整合素相關病症或具有該傾向病症之試劑。 44.如請求項43之用途，其用於製造供診斷癌症之試劑。 〇 120159.doc