BRPI0711796A2

BRPI0711796A2 - anticorpos de bloqueio de função de integrinas anti-alfa5beta1 humanos e humanizados com imunogenicidade reduzida

Info

Publication number: BRPI0711796A2
Application number: BRPI0711796-5A
Authority: BR
Inventors: Andreas Menrad; Joerg Willuda; Klaus Bosslet; Dieter Zopf; Heike Petrul; Stefan Steidl; Josef Prassler; Corinne Petit-Frere
Original assignee: Bayer Schering Pharma Aktiendesellschaft; Morphosys Ag
Priority date: 2006-05-24
Filing date: 2007-05-21
Publication date: 2011-12-06
Also published as: MA30425B1; WO2007134876A2; AU2007253586A1; KR20090027218A; EP2032605A2; NO20085362L; CN101495515A; DOP20070101A; WO2007134876A8; JP2009537158A; US20090081207A1; WO2007134876A3; TNSN08469A1; CA2652886A1; PE20080100A1; DOP2007000101A; AR061107A1; TW200817433A; UY30362A1; ZA200810850B

Abstract

ANTICORPOS DE BLOQUEIO DE FUNçãO DE INTEGRINAS ANTI-ALFA5BETA1 HUMANOS E HUMANIZADOS COM IMUNOGENICIDADE REDUZIDA. Trata-se de polipeptídeos recombinantes humanos ou humanizados que se ligam à integrina de <244>5<225> com alta afinidade e função de bloqueio. Ademais, são descritas aplicações diagnósticas e farmacêuticas dos polipeptídeos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR- POS DE BLOQUEIO DE FUNÇÃO DE INTEGRINAS ANTI-ALFA5BETA1 HUMANOS E HUMANIZADOS COM IMUNOGENICIDADE REDUZIDA".

A presente invenção refere-se a polipeptídeos humanos ou hu- manizados recombinantes que se ligam à integrin α5β1 com alta afinidade e função de bloqueio. Ademais, o diagnóstico e aplicações farmacêuticas dos polipeptídeos são descritos.

A angiogênese é o processo por meio do qual novos vasos san- güíneos se desenvolvem a partir dos vasos preexistentes. O crescimento de novos vasos sangüíneos promove o desenvolvimento embriônico, cura de feridas, e o ciclo reprodutivo feminino. Essa também exerce uma função im- portante no desenvolvimento patológico de cânceres sólidos e outras doen- ças, por exemplo, hemangiomas, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade, psoríase, artrite reumatóide e possivelmente osteoartri- te e doença inflamatória do intestino (1).

Os fatores de crescimento liberados pelo tecido tumoral hipóxico estimulam o crescimento de novo vasos sangüíneos. Embora os fatores de crescimento e seus receptores exerçam funções importantes em desenvol- vimento angiogênico, a adesão à matriz extracelular (ECM) também é um regulador importante de angiogênese. A adesão promove a sobrevivência de células endoteliais, bem como a proliferação e migração endotelial (2-5). Uma proteína de ECM em particular, fibronectina, é expressa em matrizes provisórias (tumor) e proporciona sinais proliferativos às células vasculares (2,3). De forma notável, os camundongos sem fibronectina morrem preco- cemente no desenvolvimento de uma coleta de defeitos, que inclui uma vas- culatura impropriamente formada (6,7).

Estudos em modelos animais experimentais e em camundongos mutantes indicam que a integrina α5β1 que é o receptor mais importante de fibronectina exerce uma função importante na regulação de angiogênese. A deleção embriônica dessa integrina induz anormalidades mesequimais pre- coces e letais, que incluem falhas na organização da vasculatura emergente (8,9) e falhas na capacidade de células endoteliais de formar estruturas tipo vaso in vitro (10,11).

A expressão da integrina α5β1 está especificamente associada à angiogênese: não é detectável no endotélio quiescente, porém expressa em resposta aos fatores de crescimento angiogênico (3,4) in vitro ou dentro da vasculatura angiogênica de um tumor em desenvolvimento in vivo (12, 20, 21).

Kim et al. (3) poderia demonstrar que o anticorpo de bloqueio IIA1 de função de integrinas anti-αδβΐ de camundongo inibe tanto a angio- gênese induzida por fator de crescimento como tumoral in vivo. Estudos dos sinais transduzidos quando essa integrina for antagonizada indicam que o receptor não-ligado ativa PKA, que então ativa caspase 3 e 8 e induz apop- tose (2,13).

Tentativas foram feitas para preparar derivados humanizados do anticorpo IIA1 de camundongo (BD Pharmingen Cat. No. 555614). Como resultado, um anticorpo monoclonal lgG4 quimérico 82% de humano/18% de camundongo chamado M200, foi gerado. Ademais, um fragmento-Fab mo- novalente de M200, chamado F200, foi gerado e testado de maneira bem sucedida em um modelo de macaco caranguejeiro para degeneração macu- lar. Tentativas adicionais de se preparar derivados de anticorpo completa- mente humanizados de M200, entretanto, resultaram em uma perda subs- tancial de bioatividade (14).

Qualquer aplicação de anticorpos atualmente conhecida contra integrina α5β1, tal como, M200 ou F200 em medicina humana apresenta o risco de induzir uma resposta imunogênica ao anticorpo humano antiquimé- rico (HACA) em pacientes humanos. Assim, um objetivo da presente inven- ção é proporcionar anticorpos humanos de integrinas anti-αδβΐ que possu- em imunogenicidade reduzida comparada com anticorpos quiméricos exis- tentes ao mesmo tempo em que mantêm especificidade almejada e alta bio- atividade e afinidade.

De acordo com a presente invenção, os anticorpos completa- mente humanos no formato Fab foram isolados de uma biblioteca de anti- corpo HuCAL(B)-Gold por exibição de fagos utilizando células transfectadas de integrina α5β1. Esses anticorpos mostram alta atividade in vitro embora se possa esperar baixa imunogenicidade em pacientes humanos devido à origem completamente humana.

Assim, um primeiro aspecto da presente invenção é um anticor- po humano ou humanizado ou um fragmento de ligação de antígeno desse que se (i) liga à integrina α5β1 com uma afinidade de 100 nM e, de prefe- rência, > 10 nM e (ii) inibe a adesão de células que expressam integrina α5β1 a seu receptor in vitro e in vivo.

O polipeptídeo da presente invenção é um anticorpo humano ou humanizado ou um fragmento de ligação de antígeno desse. O termo "anti- corpo humano" de acordo com a presente invenção se refere às moléculas de anticorpo que possuem domínios variáveis substancialmente humanos ou completamente humanos e, se presentes, domínios constantes humanos. O termo "humano" como usado no presente pedido se refere às seqüências que podem ser formadas em serem humanos individuais ou pelo uso de se- qüências consenso resultantes dessas, por exemplo, como descrito no com- pêndio correspondente por Kabat et al. (1991 ), Seqüências of Proteins of immunological Interest, 5 Edition, NIH Publication no. 91-3242, US Depart- ment of Health and Human Services, Washington, DC, que está aqui incor- porado a título de referência. O termo "substancialmente humanas" se refere às seqüências que podem se diferir de seqüências "completamente huma- nas", como descrito por Kabat et al. em até 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos. Mais particularmente, os anticorpos ou fragmentos de anticorpo de acordo com a presente invenção compreendem regiões de estruturas variáveis substancial ou completamente humanas nas cadeias de imunoglobulina pesadas (H) e leves (L). O termo "anticorpo humanizado" no sentido da presente invenção se refere a moléculas de anticorpo que possuem domínios variáveis subs- tancialmente murinos ou completamente murinos e domínios constantes humanos ou substancialmente humanos, e que são > 82%, de preferência, pelo menos 90%, e especialmente, de preferência, pelo menos 98% huma- nos. O termo "murino" como usado no presente pedido se refere às seqüên- cias que podem ser formadas em roedores individuais ou pelo uso de se- qüências consenso resultantes dessas. O termo "substancialmente murinas" se refere às seqüências que podem se diferir de seqüências "completamente murinas" em até 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos.

De preferência, o anticorpo ou fragmento de anticorpo desse é um anticorpo IgG, por exemplo, um anticorpo IgGI , lgG2, lgG3 ou lgG4 humano ou humanizado ou um fragmento desse, por exemplo, fragmento Fab, Fab' ou (Fab)2. A presente invenção, entretanto, também se refere a anticorpos recombinantes que possuem seqüências humanas, por exemplo, anticorpos de cadeia simples (sc) ou fragmento desses, por exemplo, frag- mentos de scFv.

Os anticorpos ou fragmentos de anticorpo da presente invenção contêm um ou mais sítios de ligação de antígeno que interagem especifica- mente com a integrina α5β1. De preferência, essas propriedades de ligação de antígeno são obtidas ao combinar uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL). Uma região de VH ou VL inclui regiões de estrutura (FR1, FR2, FR3 e FR4) e regiões de CDR media- doras de ligação de antígeno (H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3 para a região VH e L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 para a região VL).

O anticorpo humano ou humanizado ou fragmento de anticorpo da invenção possui, de preferência, uma afinidade de integrina α5β1 corres- pondente a um valor K0 de ^ 100 nM, de preferência, < 10 nM e, com mais preferência, ^ 1 nM, em que a afinidade é determinada por titulação-FACS em células HUVEC humanas positivas de α5β1 como descrito nos Exemplos ou por medida de BIAcore de competição ou ELISA de competição.

Ademais, os polipeptídeos da invenção inibem a adesão de uma célula tumoral humana que expressa integrina α5β1, como descrito nos E- xemplos, por exemplo, a célula K562 (número de acesso ATCC: CCL-243) estudada por Lozzio et al. (1979), Leukemia Research, 3: 363-370, in vitro. De preferência, o anticorpo ou fragmento de anticorpo mostra 50% de inibi- ção de adesão celular a uma concentração (IC50) de ^ 10 nM e, de prefe- rência, ^ 5 nM.

Ademais, os polipeptídeos da invenção são, de preferência, ca- pazes de induzir a atividade da caspase em células HUVEC. O valor de IC50 com relação à viabilidade de HUVEC é, de preferência, £ 10 nM, com mais preferência, £ 5 nM, em que o valor de IC50 (50% de viabilidade) é determi- nado como descrito nos Exemplos.

Ademais, os polipeptídeos, anticorpos e fragmentos de anticorpo da invenção podem ser, de preferência, usados para a diagnose e para a prevenção e tratamento de tumores e câncer, especialmente carcinoma de cólon.

Os ditos polipeptídeos, anticorpos e fragmentos de anticorpo podem ser conjugados com grupos de marcação detectáveis, tais como, grupos de marcação radioativos, NMR, corantes, enzima e fluorescentes. Os grupos radioativos podem ser, por exemplo, I125, 1131 ou Y90.

De preferência, o anticorpo ou fragmento de anticorpo da inven- ção compreende:

(a) uma região de VH selecionada entre

(i) seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 1 (MOR04624), SEQ ID NO: 3 (MOR04055) ou pelo menos uma região H-CDR1, H-CDR2 e/ou H- CDR3 de uma das ditas regiões de VH, ou

(ii) uma seqüência de aminoácido derivada de uma seqüência de

(i) pela alteração de pelo menos uma região H-CDR, e/ou

(b) uma região de VL selecionada entre

(i) seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 2 (MOR04624), SEQ ID NO: 4 (MOR04055) ou pelo menos uma região L-CDR1, L-CDR2 e/ou L- CDR3 de uma das ditas regiões de VL, ou

(ii) uma seqüência de aminoácido derivada de uma seqüência de

(i) pela alteração de pelo menos uma região de L-CDR.

Um anticorpo ou fragmento de anticorpo especialmente preferido compreende uma região de VH derivada de uma região de VH de (a) (i) co- mo descrito acima por randomização da região de H-CDR2.

Em outra modalidade especialmente preferida o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende uma região de VL derivada de uma re- gião de VL de (b) (i) como descrito acima por randomização da região de L- CDR3.

Ainda em outra modalidade especialmente preferida o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende uma região de VH e/ou VL derivada de uma região de VH de (a) (i) e/ou uma região de VL de (b) (i) por mistura das cadeias de anticorpo.

As sub-bibliotecas de H-CDR2 e L-CDR3 são geradas pela troca de H-CDR2 e L-CDR3, respectivamente, com repertórios de CDR humanos por métodos de engenharia de proteína (17).

Por exemplo, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende

uma região de VH e/ou VL derivada da região de VL e/ou VH como descrito na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 (MOR04624). Um polipeptídeo especi- almente preferido compreende:

(a) uma região de VH selecionada a partir da seqüência de ami- noácido SEQ ID NO: 5 (MOR04971), SEQ ID NO: 7 (MOR04974), SEQ ID NO: (MOR04975), SEQ ID NO: 11 (MOR04977), e SEQ ID NO. 11 (MOR04985) ou pelo menos uma região de H-CDR1, H-CDR2 e/ou H-CDR3 das ditas regiões de VH e/ou

(b) uma região de VL selecionada a partir da seqüência de ami- noácido SEQ ID NO: 6 (MOR04971), SEQ ID NO: 8 (MOR04974), SEQ ID NO: 10 (MOR04975), SEQ ID NO: 12 (MOR04977) e SEQ ID NO: 14 (MOR04985), ou pelo menos uma região de L-CDR1, L-CDR2 e/ou L-CDR3 da dita região de VL.

Exemplos específicos de polipeptídeos da presente invenção são os seguintes:

Um anticorpo ou fragmento de anticorpo que compreende a re- gião de VH de SEQ ID NO: 1 e a região de VL de SEQ ID NO: 2 (MOR04624) ou pelo menos uma região de H-CDR1-, H-CDR-2, H-CDR3-, L-CDR1-, L-CDR2- ou L-CDR3 desse.

Um anticorpo ou fragmento de anticorpo que compreende a re- gião de VH de SEQ ID NO: 3 e a região de VL de SEQ ID NO: 4 (MOR04055) ou pelo menos uma região de H-CDR1-, H-CDR-2, H-CDR3-, L-CDR1-, L-CDR2- ou L-CDR3 desse. Um anticorpo ou fragmento de anticorpo que compreende a re- gião de VH de SEQ ID NO: 5 e a região de VL de SEQ ID NO: 6 (MOR04971) ou pelo menos uma região de H-CDR1-, H-CDR-2, H-CDR3-, L-CDR1-, L-CDR2- ou L-CDR3 dessa. Um anticorpo ou fragmento de anti- corpo que compreende a região de VH de SEQ ID NO: 7 e a região de VL de SEQ ID NO: 8 (MOR04974) ou pelo menos uma região de H-CDR1-, H- CDR-2, H-CDR3-, L-CDR1-, L-CDR2- ou L-CDR3 desse.

Um anticorpo ou fragmento de anticorpo que compreende a re- gião de VH de SEQ ID NO: 9 e a região de VL de SEQ ID NO: 10 (MOR04975) ou pelo menos uma região de H-CDR1-, H-CDR-2, H-CDR3-, L-CDR1-, L-CDR2- ou L-CDR3 desse.

Um anticorpo ou fragmento de anticorpo que compreende a re- gião de VH de SEQ ID NO: 11 e a região de VL de SEQ ID NO: 12 (MOR04977) ou pelo menos uma região de H-CDR1-, H-CDR-2, H-CDR3-, L-CDR1 -, L-CDR2- ou L-CDR3 desse.

Um anticorpo ou fragmento de anticorpo que compreende a re- gião de VH de SEQ ID NO: 13 e a região de VL de SEQ ID NO: 14 (MOR04985) ou pelo menos uma região de H-CDR1, H-CDR-2, H-CDR3-, L- CDR1 -, L-CDR2- ou L-CDR3 desse.

A invenção também se refere a anticorpos ou fragmentos de an- ticorpo que são direcionados contra o mesmo epítopo sobre o antígeno co- mo os anticorpos preferidos e/ou exemplificados ou fragmentos de anticorpo mencionados acima.

A cadeia de VH e VL do polipeptídeo compreende as seguintes regiões:

A cadeia de VH de MOR04624, MOR04055 e derivados (es- quema de numeração de acordo com (17)):

- A região de estrutura 1 se estende a partir do aminoácido 1 ao 30aa

- A região de CDR1 se estende a partir do aminoácido 31 a 35 aa

- A região de estrutura 2 se estende a partir do aminoácido 36 ao 49aa

- A região CDR2 se estende a partir do aminoácido 50 ao 65aa

- A região de estrutura 3 se estende a partir do aminoácido 66 ao 94aa

- A região CDR3 se estende a partir do aminoácido 95 ao 102aa

- A região de estrutura 4 se estende a partir do aminoácido 103 ao 113aa

Cadeia VLkI de MOR04624 e derivados (esquema de numera- ção de acordo com (17)):

A região de estrutura 1 se estende a partir do aminoácido 1 ao 23aa

A região de CDR1 se estende a partir do aminoácido 24 ao 35aa A região de estrutura 2 se estende a partir do aminoácido 36 ao

50aa

A região de CDR2 se estende a partir do aminoácido 51 ao 57aa

A região de estrutura 3 se estende a partir do aminoácido 59 ao 89aa

A região de CDR3 se estende a partir do aminoácido 90 ao 98aa A região de estrutura se estende a partir do aminoácido 99 ao 109aa

Cadeia de VLkI de MOR04055 e derivados (esquema de nume- ração de acordo com (17)):

A região de estrutura 1 se estende a partir do aminoácido 1 ao 23aa

A região CDR1 se estende a partir do aminoácido 24 ao 35aa

A região de estrutura 2 se estende a partir do aminoácido 36 ao 50aa

A região de CDR2 se estende a partir do aminoácido 51 ao 57aa A região de estrutura 3 se estende a partir do aminoácido 58 ao 89aa

A região de CDR3 se estende a partir do aminoácido 90 ao 98aa A região de estrutura 4 se estende a partir do aminoácido 99 ao 109aa

As regiões de estrutura da cadeia de VH e/ou VL podem ser al- teradas pela troca de um ou mais aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos. Por exemplo, a região de estrutura 3 da cadeia de VLkI pode ser alterada em elementos da família MOR04624. De preferência, o aminoá- cido na posição 85 da seqüência Fab é trocável, sendo que uma troca de valina (MOR04624, MOR04985) por treonina (MOR04974, -75, -77) é espe- cialmente preferida. Ademais, a região de estrutura 1 da cadeia de VH pode ser alterada. Em uma modalidade preferida, o aminoácido na posição 3 de cada seqüência Fab de VH pode ser trocado. Uma troca especialmente pre- ferida é glutamina (q) por ácido glutâmico (e) que, por exemplo, ocorre du- rante a clonagem. O polipeptídeo da invenção é adequado para aplicações terapêuticas ou diagnosticas, por exemplo, para aplicações diagnosticas in vitro ou in vivo.

Para aplicações terapêuticas, o anticorpo ou fragmento de anti- corpo pode ser usado como tal. Alternativamente, o polipeptídeo pode estar sob a forma de um conjugado com um agente terapêutico, por exemplo, se- lecionado a partir de agentes radioterapêuticos ou quimioterapêuticos, por exemplo, agentes citostáticos ou citotóxicos biológicos de baixo peso mole- cular. O agente terapêutico pode ser conjugado com o anticorpo ou fragmen- to de anticorpo de acordo com métodos conhecidos, de preferência, através de uma ligação covalente a grupos amino reativo, carbóxi, hidróxi e/ou sulfi- dril do polipeptídeo, utilizando opcionalmente Iigantes homo ou hetero- bifuncionais.

Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo pode estar sob a forma de uma proteína de fusão que compreende um domínio de anticorpo ou fragmento de anticorpo e um domínio de fusão heteróloga, por exemplo, uma citocina, tal como, IL-2, IL-12 ou TNF-α. Outros parceiros de fusão tera- peuticamente relevantes dos anticorpos ou fragmentos de anticorpo de a- cordo com a invenção compreendem partes Fc IgG engenheiradas para re- crutamento celular imunoefetor aumentado ou reduzido, toxinas de proteína, tais como, RNAses ou ETA, pequenas moléculas de fármaco, tais como, derivados de maitansina ou auristatina, enzimas para ativação de pró- fármaco, proteínas de fusão com outros antagonistas de bloqueio de função de integrinas, ou proteínas de fusão com enzimas que possuem atividade antiangiogênica, tal como, MMP-2 ou MMP-9 (15). Ademais, a proteína de fusão pode estar sob a forma de um anticorpo biespecífico que compreende pelo menos um domínio de ligação de integrina α5β1 como descrito acima e um domínio de ligação específico para um antígeno adicional. Por exemplo, o segundo domínio de ligação de antígeno pode ser direcionado contra a- gentes quelantes para radionucleotídeos diagnósticos e/ou terapêuticos, por exemplo, alfa, beta ou gamma radionuclídeos, tais como, 90Y, corantes diag- nósticos NIR(infravermelho próximo), corantes terapeuticamente ativos, mo- léculas de superfície sobre células efetoras imunológicas, por exemplo, célu- las NK, células T citotóxicas ou células-T NK1 domínios de ligação anti- VEGF de bloqueio funcionais e domínios de ligação de bloqueio de função contra receptor VEGF 1, 2 e 3 e citocinas, tais como, interleucinas.

Para aplicações diagnosticas, o polipeptídeo pode estar sob a forma de um conjugado com um grupo de marcação detectável, por exem- plo, um grupo de marcação para uma aplicação diagnostica in vitro ou in vi- vo. Por exemplo, o grupo de marcação detectável pode ser selecionado en- tre grupos de marcação radioativos, NMR, corante, enzima e fluorescentes (por exemplo, fluorescente NIR).

Para aplicações terapêuticas, o polipeptídeo é, de preferência, formulado em uma composição farmacêutica que pode compreender adicio- nalmente ingredientes ativos e/ou veículos, diluentes e/ou adjuvantes farma- ceuticamente aceitáveis. A composição farmacêutica compreende o agente ativo em uma dose terapeuticamente ativa, que pode ser determinada por um versado na técnica de acordo com métodos padrão, por exemplo, por experimentos in vitro ou em modelos animais. A composição é, de preferên- cia, administrada por infusão, injeção ou inalação. A dose do ingrediente ati- vo é determinada de acordo com o tipo e a gravidade do distúrbio e a condi- ção do paciente que será tratado. De preferência, a composição terapêutica é administrada em diversas doses durante um período de pelo menos 2 a 4 semanas. Nesse aspecto, essa é referida a protocolos conhecidos para a administração de anticorpos ou conjugados de anticorpo, por exemplo, como descrito em Ferrara et al. Nature Reviews Drug Discovery, Vol. 3, May 2004, 391-400 and Salgaller, Current Opinion in Molecular Therapeutics, 2003, 5(6), 657-667 ou a protocolos para a administração de anticorpos farmacêu- ticos como Rituximab, Campath, Remicade etc.

Ademais, a invenção se refere a uma composição diagnostica que compreende um anticorpo ou fragmento de anticorpo, como descrito acima, como um reagente diagnóstico. A composição diagnostica pode compreender ainda reagentes, veículos, diluentes e/ou adjuvantes diagnos- ticamente aceitáveis. A composição diagnostica compreende o polipeptídeo em uma quantidade suficiente para permitir a detecção diagnostica no res- pectivo formato de análise, por exemplo, em um formato de análise diagnos- tica in vivo ou in vitro.

A composição pode ser usada para aplicações terapêuticas ou diagnosticas em distúrbios associados à integrina α5β1. Por exemplo, esses distúrbios podem ser distúrbios hiperproliferativos, por exemplo, distúrbios associados com angiogênese e/ou metástase, particularmente, câncer. Os cânceres que podem ser tratados pela composição de acordo com a inven- ção compreendem particularmente todos os tipos de tumores sólidos, por exemplo, cânceres do cólon, rim, pulmão, próstata, mama, cérebro, estôma- go, fígado ou pele. Alternativamente, as composições podem ser emprega- das no tratamento de cânceres hematológicos com angiogênese. Outros distúrbios associados com a neovascularização compreendem, porém sem caráter limitativo, endometriose, hemangioma, artrite reumatóide, osteoartri- te, placas arterioscleróticas, doença inflamatória do intestino, doença infla- matória do CNS, Psoríase, distúrbios oculares, tais como, retinopatia diabé- tica ou doença macular relacionada à idade e cicatrizes hipertróficas. Em uma modalidade preferida, a atividade antiangiogênica da composição é in- dependente de fatores de crescimento.

A composição pode compreender um ou vários anticorpos ou fragmentos de anticorpo, por exemplo, uma combinação de anticorpos ou fragmentos de anticorpo que se ligam a domínios diferentes de integrina α5β1. A composição também pode conter fármacos de moléculas pequenas para terapia de combinação. A composição é adequada para aplicação em medicina humana e veterinária. Uma aplicação especialmente preferida é em medicina humana.

Ademais, a presente invenção se refere a um ácido nucléico que codifica um anticorpo ou fragmento de anticorpo ou polipeptídeo de fusão, como descrito acima. O ácido nucléico pode ser, por exemplo, um DNA ou RNA de cadeia simples ou cadeia dupla.

De preferência, o ácido nucléico é ligado de modo operacional a uma seqüência de controle de expressão, que permite a expressão em uma célula hospedeira ou organismo hospedeiro adequado. O ácido nucléico po- de estar presente em um vetor ou um sistema de vetor, (ou sejam uma plu- ralidade de vetores) que pode ser introduzido em uma célula hospedeira ou organismo hospedeiro. O vetor pode ser um vetor procariótico adequado para células procarióticas, por exemplo, plasmídeo ou bacteriófago. Ade- mais, o vetor pode ser um vetor eucariótico de células hospedeiras eucarió- ticas ou organismos hospedeiros, por exemplo, um plasmídeo, um cromos- somo artificial ou um vetor viral. Os vetores adequados são descritos, por exemplo, em Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, a Laboratory Ma- nual, Cold Spring Harbor Laboratory Press and Ausubel et al. (1989), Cur- rent Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons.

A presente invenção também se refere a uma célula, por exem- plo, uma célula procariótica ou uma célula eucariótica, tal como, uma célula humana que é transformada com um ácido nucléico ou um vetor como des- crito acima. Ademais, a invenção se refere a um organismo não-humano, por exemplo, um animal transgênico, tal como, um mamífero não-humano transgênico, que é transformado com um ácido nucléico ou vetor, como des- crito acima. O termo "transformação" inclui todos os métodos para introduzir ácidos nucléicos estranhos em uma célula ou um organismo que inclui trans- fecção ou infecção.

O polipeptídeo pode ser preparado ao cultivar uma célula ou um organismo não-humano, como descrito acima sob condições em que o poli- peptídeo é expresso e o polipeptídeo expresso é recuperado, por exemplo, da célula, meio de cultura, organismo ou produtos de excreção do organis- mo.

Ademais, a presente invenção deve ser explicada em detalhes nas seguintes Figuras e Exemplos:

Figura 1A: Análise FACS de células K562 para expressão de a5: A expressão da integrina humana α5β1 sobre a superfície celular de células K562 vivas foi mostrada com anticorpo IIA1 monoclonal de camundongo de integrina anti-αδβ1 de bloqueio de função (14). Para esse propósito, os pro- cedimentos FACS padrão foram usados, como descrito em HuCAL® GOLD Manual fornecido por MorphoSys.

Figura 1B: A linhagem celular HT29 do carcinoma de cólon hu- mano não expressa a cadeia de integrina α5.

A análise FACS mostrou que as células HT29 não expressam a cadeia de integrina α5, considerando que a cadeia β1 está presente sobre a superfície celular em uma alta densidade. Por esse motivo, as células HT29 são adequadas de forma excelente para a transfecção com a cadeia de in- tegrina α5.

Figura 1C: A linhagem celular HT29 do carcinoma de cólon hu- mano expressa a integrina α5β1 após a transfecção com o cDNA da integri- na α5. Após a transfecção com a cadeia de integrina α5, a expressão homo- gênea da integrina α5 sobre a superfície das células HT29α5 foi mostrada por análise FACS utilizando anticorpo monoclonal IIA1 da integrina α5β1 anti-humano de camundongo de bloqueio de função como a referência.

Figura 2: Inibição da adesão de células K562 às placas de cultu- ra revestidas com fibronectina As células K562 pré-carregadas com Calceí- na foram incubadas na presença de anticorpos monoclonais de camundongo de integrina anti α5β1 de bloqueio (IIA1) ou não-bloqueio (VC5) de função. A ligação do cenário independente de integrina de células K562 à fibronectina foi determinada utilizando 10 mM de EDTA. O cenário total da análise foi determinado em poços bloqueados por BSA que não suportam a adesão de células K562 à superfície das placas de cultura. As células aderentes (após a lavagem) foram Iisadas e a fluorescência foi determinada.

Figura 3: Inibição dependente de dose mediada por Fab de célu- las K562 à fibronectina

Fab específica de α5β1 anti-humana foi testada por sua capaci- dade de inibir a ligação de células K562 carregadas com corante fluorescen- te à fibronectina imobilizada. Após a adesão, as células foram Iisadas e a fluorescência foi determinada como uma medida de células aderentes. A fibronectina sozinha indica a adesão máxima considerando que o cenário total da análise foi determinada em células revestidas com BSA.

Figura 4: Anticorpos de bloqueio de função anti α5β1 induzem apoptose em células endoteliais.

A indução de ativação de caspase 3/7 de Fab purificado no for- mato monovalente foi determinada utilizando células HUVEC em meio de células endoteliais isento de soro. A atividade da caspase foi determinada utilizando um sistema de análise quimioluminescente comercialmente dispo- nível (Caspase Glo, PROMEGA) de acordo com as instruções do fabricante. Figura 5: FACS de Competição de Fab e IIA1 A competição FACS indica que MOR04624 compete com o epí- topo do anticorpo de referência IIA1 em células HT29a5. Pode-se concluir que ambos os anticorpos compartilham o epítopo similar, considerando que todos os outros Fab reagem com sítios de ligação não-relacionados na inte- grina α5β1. (linha preta - ligação Fab, linha verde - ligação Fab quando competiu com o anticorpo de referência IIA1).

Figura 6: Anticorpos de bloqueio de função anti α5β1 maduros por afinidade induzem potencialmente apoptose em células endoteliais

A indução de atividade de caspase 3/7 de Fab purificados no formato monovalente foi determinada utilizando células HUVEC em meio de células endoteliais isento de soro. A atividade da caspase foi determinada utilizando um sistema de análise quimioluminescente comercialmente dispo- nível (Caspase Glo, PROMEGA) de acordo com as instruções do fabricante.

Figura 7: Anticorpos Fab de bloqueio de função anti α5β1 madu- ros por afinidade inibem a proliferação de células endoteliais

As células HUVEC aderentes em meio de células endoteliais isento se soro foram incubadas durante 48 horas na presença da quantidade indicada de Fab purificado ou anticorpo de referência IIA1. As células em desenvolvimento foram determinadas com uma análise XTT comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante. Os valores de IC50 foram determinados e resumidos na Tabela 4.

Figura 8: IgGs otimizados em análise de adesão de HUVEC Inibição de adesão de células HUVEC à fibronectina por anticor- pos IgG de bloqueio de função de α5β1. IgG MOR04974, MOR04975, MOR04977, MOR04985 bloqueiam a adesão com um IC50 similar a IIAI. A conversão de Fab em IgG resultou em um aprimoramento de aproximada- mente 2 vezes.

Figura 9: Ensaio-análise de viabilidade de HUVEC de IgGs de integrina anti-αδβΐ

Inibição de viabilidade de células HUVEC por anticorpos IgG de bloqueio de função de α5β1. As células HUVEC foram semeadas em placas revestidas com fibronectina, incubadas com concentração crescente de anti- corpos IgG e a sobrevivência calculada após 48 h. IgG MOR04974, MOR04975, MOR04977, MOR04985 bloqueiam a adesão com um IC50 si- milar a IIA1. A conversão de Fab em IgG resultou em um aprimoramento de aproximadamente 2 vezes.

Figura 10: Análise de Caspase de HUVEC de IgGs de integrina anti-αδβ1

A indução de ativação de caspase 3/7 pelos anticorpos IgG de bloqueio de função de α5β1 foi determinada utilizando células HUVEC em meio de células endoteliais isento de soro. A atividade da caspase foi deter- minada utilizando um sistema de análise quimioluminescente comercialmen- te disponível (Caspase Glo, PROMEGA) de acordo com as instruções do fabricante. MOR04974, MOR04975, MOR04977 e MOR04985 são ativos similares como o anticorpo de referência IIA1.

Figura 11: Fab maduro por afinidade precipita especificamente a integrina α5β1 de Iisados celulares biotinilados na superfície

Os Iisados NP40 biotinilados na superfície de HT29a5 e HT29wt foram incubados com Fab acoplado a microesferas magnéticas de tamanho grande (Dynabeads). Os imunoprecipitados foram transferidos para mem- branas de PVDF e analisados com estreptavidina fosfatase alcalina (AP). Todos Fab precipitaram especificamente uma proteína do tamanho espera- do comparável com o anticorpo de referência IIA1 fora do Iisado HT29a5 considerando que nenhuma proteína foi detectável no Iisado HT29wt. O Fab irrelevante MOR03207 não precipitou especificamente nenhuma proteína.

Figura 12: Especificidade de ligação do IgG de integrina anti- α5β1 (exemplo MOR04974) a HT29-wt e HT29a5 (medida de FACS)

Os anticorpos IgG maduros por afinidade foram incubados em pg/mL com células 5x105 HT29wt e HT29a5. Os anticorpos especifica- mente ligados foram detectados com um anticorpo secundário marcado por Cy3. Painel superior: IIA1 incubado com células HT29wt (esquerda) ou HT29a5 (direita), painel inferior: IgGI MOR04974. A mudança de fluorescên- cia indica ligação específica à integrina a5 e foi obtida para MOR04975, MOR04977, MOR04985 e MOR04624. Os controles de isotipo de anticorpo são negativos (linhas pretas). Esses anticorpos anti-integrina se ligam às células transfectadas de cadeia a5 com a mesma especificidade que o anti- corpo de referência IIA1.

Figura 13: Ligação de competição do IgG de integrina anti-αδβΐ (exemplo MOR04974) em células HT29a5 com IIA1 (medida de FACS). O IgG de integrina anti-αδβΐ compete com IIA1 por um epítopo sobreposto.

Os anticorpos de integrina anti-αδβΐ produzidos internamente foram incubados em 1 pg/mL com células 5x105 HT29a5 que foram, ou não, pré-incubadas com 20pg/mL de IIA1. A presença da ligação de IIA1 é mos- trada por detecção com FITC de cabra anti-camundongo (painel esquerdo). A ligação e competição do anticorpo humano (MOR04974) são mostradas por detecção com o anticorpo secundário de FITC de cabra anti-humano (painel direito). Esse exemplo mostra a competição de MOR04974. Esse resultado foi obtido por MORQ4975, MORQ4977, MORQ4985, MQR04624. Figura 14: Análise dos anticorpos da integrina anti-αδβΐ de IgGI na análise de formação de tubo (Exemplo MOR04974). Os anticorpos IgGI da integrina anti-a5pi otimizados por afinidade bloqueiam a formação de tubo de maneira tão eficiente quanto o IIA1.

As células endoteliais de veia umbilical humana de passagem precoce (HUVECs #2519) foram colhidas em 60 a 80% de confluência e 2 χ 104 células foram inoculadas em Matrigel (Becton Dickinson #354234) que contém poços em meio EBM-2 (Clonetics #CC3156). Os anticorpos foram adicionados 15 min depois e a formação de tubo foi permitida para proceder durante 18 a 24h a 37°C. Então, as células foram fixadas (4% de formalina), permeabilizadas, bloqueadas e coloridas com anti-CD31. Os anticorpos fo- ram aplicados em 6nM, 3nM, 600pM, 300pM, e 60pM. As imagens represen- tativas são mostradas para o efeito em 300pM A: amostra não-tratada, B: MOR03207 anti-lisozima de IgGI humano, C: MOR04624 de IgGI, D: MOR04974 de IgGI, Ε: IIA1 , F: IgGI de murino. O mesmo resultado tam- bém foi obtido por MOR04975 e MOR04977.

Figura 15: Atividade dos anticorpos IgG da integrina anti-αδβΐ na análise de migração em câmaras bipartites (transwell).

A análise de migração é realizada em uma microplaca de migra- ção transwell de 96 poços (poros de 8pm, #351163 Falcon/BD), com fibro- nectina como o único estímulo. A parte inferior da membrana fluoroblok foi revestida com 2 pg/mL de fibronectina durante 1h a 37°C e bloqueada com 2% de BSA durante 30 min a 37°C. O meio isento de soro endotelial humano (Invitrogen) que contém 0,1% de BSA foi usado como tampão de migração na câmara superior e inferior. Os anticorpos de integrina anti-D5D1 (0,6 a 10 pg/mL) foram adicionados à câmara superior de cada poço, HUVEC de pas- sagem precoce (2 χ 104) foram adicionadas e a migração de células foi per- mitida para proceder durante 4h a 37°C. As células migradas sobre a parte inferior das membranas foram então coloridas com calceína e a fluorescên- cia resultante foi determinada com um contador Perkin Elmerl 220 Victor em 485nm de excitação e 535nm de emissão.

A: As imagens mostradas foram obtidas em 10pg/mL de concen- tração de anticorpo. MORÜ4974, MOR04975, MOR04977 inibiram a migra- ção de HUVEC de modo tão eficaz quanto IIA1.

B: Dose-resposta de atividade anti-migratória de MOR04974, - 75, -77 (isotipo de anticorpo lgG4-Pro). IC50s (MOR04974:1 μg/ml, MOR04975: 1,5μg/ml, MOR04977: 1 μg/ml, IIA1: 2μg/ml)

Figura 16: Padrão de coloração de IHC de anticorpos de integri- na anti-α5β1 IgG1 otimizados por afinidade no tecido do carcinoma de cólon.

Os anticorpos biotinilados com ampliação de 10x foram titulados em seções de tecido em série do carcinoma de cólon. A detecção foi reali- zada com estreptavidina fosfatase alcalina. Como um exemplo são mostra- das seções imunohistoquímicas obtidas com uma concentração de 2,5 μg/mL. Para IIA1 e MORCI4974, a coloração de recipientes de tamanho pe- queno e médio e do compartimento estromal foi obtida. As setas pretas mos- tram os mesmo recipientes coloridos por ambos os anticorpos. Um padrão de coloração similar foi obtido para MOR04975 e MOR04977. As setas azuis indicam recipientes coloridos. Pode-se concluir que os anticorpos de integri- na anti-α5β1 otimizados mostram padrões de coloração comparáveis com IIA1.

Figura 17: Marcação de Tumor dos anticorpos de integrina anti- α5β1 otimizados por afinidade (lgG4-Pro).

Os anticorpos de integrina anti-α5β1 foram radiomarcados com iodo-125 (1 min, método de lodogen). A imunorreatividade restante foi de- terminada para ser 75 a 80% e 3μg de anticorpo marcado foram injetados em camundongos sem pêlo xenoenxertados com HT29a5.

A: Absorção de tumor de IgG1 MOR04974, MOR04975 e contro- les (anticorpo de referência IIA1 e MOR03207 anti-lisozima), B: Absorção de tumor de MOR04977 de IgG1 e controles.

A absorção de anticorpo dos anticorpos de integrina anti-α5βΐ foi similar àquela de IIA1 e significativamente maior comparada com o MOR03207 de IgG1 irrelevante. Conclui-se a partir desse resultado que os anticorpos de integrina anti-α5β1 almejam especificamente os xenoenxertos de HT29α5 positivas de integrina α5β1. Figura 18: Análise dos anticorpos IgG de integrina anti-αδβΐ oti- mizados no modelo substituto esferóide 3D in vivo de angiogênese.

Plugs de Matrigel que contêm esferóides de número de célula endotelial definida juntamente com VEGF e FGF2 foram implantados de maneira subcutânea em camundongos SCID. O desenvolvimento de EC e formação de vaso de uma rede complexa com a vasculatura do camundon- go foram analisados após o tratamento com os anticorpos de integrina anti- α5β1 humanos otimizados e anticorpos de controle. O MOR04974 e MOR04975 de IgG humano foram tão eficazes quanto o IIA1.

A invenção é adicionalmente ilustrada nos Exemplos. Os seguin- tes Exemplos não devem ser, entretanto, interpretados como uma limitação. Exemplos

1. Geração de Anticorpos de Integrina anti-a531 de bloqueio de função 1.1 Estratégias de exame

O anticorpo IIAI monoclonal de camundongo se liga a um epíto- po adaptável de integrina α5β1 que está presente apenas sobre as células vivas ativadas (endoteliais). Para tratar tanto a seletividade como a atividade funcional, uma trajetória de análise composta de pannings* alternados sobre o antígeno isolado e as células que expressam antígenos em combinação com análises de triagem à base de células funcionais foi estabelecida para a identificação de candidatos de anticorpo de derivação derivados de HuCAL® GOLD no formato Fab:

1. Seleção de fragmentos de anticorpo Fab de ligação de inte- grina anti-αδβΐ por exibição de fago utilizando a Biblioteca HuCAL(B)-GoId (MorphoSys). Experimentos tipo panning foram realizados em antígeno iso- lado e células que expressam antígenos. Baseado nas seqüências de ami- noácido as melhores sub-bibliotecas de clones de anticorpo foram geradas por randomização tanto de VL-CDR3 como VH-CDR2 utilizando seqüências de CDR humanas e a partir das quais em experimentos tipo panning adicio- nais até aglutinantes avançados foram selecionados. Os clones adicionais foram obtidos ao clonar combinações de cadeias leves e pesadas que con- têm VL-CDR3 e VH-CDR2 interessantes em uma molécula de anticorpo ("clonagem Χ").

2. A análise de anticorpos Fab enriquecidos foi realizada da se- guinte maneira. Os aglutinantes de todos os pannings foram testados para ligação ELISA em células positivas de integrina α5β1 e células negativas de integrina α3β1. Os clones positivos de ELISA foram então adicionalmente analisados para ligação celular em experimentos FACS sobre células de su- perexpressão de a5 e células negativas a5. Os clones adequados foram en- tão analisados em análises funcionais para i) adesão celular à fibronectina ii) indução de apoptose de HUVEC (células endoteliais de veia umbilical hu- mana) e/ou HDMVEC (células endoteliais vasculares dérmicas humanas) iii) Medida de afinidade e análise de competição de FACS com anticorpo de referência IIA1 e iv) reatividade cruzada de espécies.

1.2 Geração de ferramenta e desenvolvimento de análise cDNA de cadeia de integrina a5

O cDNA da cadeia de a5 humana foi adquirido junto à RZPD (IMAGE-ID 6821577) e clonado no vetor de expressão de pcDNA3 (INVI- TROGEN) de acordo com métodos padrão.

Receptores de integrina purificados

Os receptores de integrina α5β1 humanos solubilizados com detergente (Chemicon CC1052) e α3β1 (Chemicon CC1092) foram adquiri- dos junto à CHEMICON INTERNATIONAL (Temecula, CA, USA). Para exi- bição de fago em fase sólida, análises ELISA e BiaCore, lotes de integrina com uma pureza de pelo menos 90% foram selecionadas por SDS-PAGE não-desnaturante.

Linhagens celulares

A adesão da linhagem celular K562 de leucemia mielóide crôni- ca humana (número de acesso ATCC: CCL-243) à fibronectina é mediada apenas pela integrina α5β1 (16). Essa linhagem celular foi usada na análise de adesão mediada por fibronectina para triagem funcional inicial. A presen- ça da integrina α5β1 foi mostrada pela análise de FACS utilizando o anticor- po IIA1 para detecção (Figura 1A).

Um prerrequisito de estratégias de panning celular diferencial é um sistema modelo, onde o alvo de interesse é superexpresso em uma li- nhagem celular negativa de alvo. Para esse propósito, foi selecionada a li- nhagem celular HT29 de carcinoma de cólon humano (número de acesso ATCC: HTB-38) que expressa a cadeia de integrina β1, porém não a cadeia a5 (Figura 1 Β). O cDNA da cadeia de a5 foi transfectado nas células HT29 de origem utilizando Lipofectamina de acordo com a instrução do fabricante. Um clone de superexpressão de a5 estável foi selecionado por análise de FACS utilizando o anticorpo monoclonal IIA1 de camundongo para a marca- ção específica de integrina α5β1 expressa na superfície (Figura 1 C).

Análise de adesão

Uma análise de adesão sensível para análise funcional foi esta- belecida utilizando a linhagem celular K562 que expressa apenas a integrina α5β1 humana. Para esse propósito, placas de 96 poços foram revestidas com 1 pg/ml de fibronectina humana ou BSA como um substrato não- adesivo para determinar o cenário total da análise. Visto que a adesão de integrinas às moléculas de ECM é dependente da presença de Ca2VMg2+, 10 mM de EDTA foram usados para determinar a ligação anterior indepen- dente de integrina sobre fibronectina. O anticorpo de bloqueio de função IIAI foi usado como uma referência e um anticorpo monoclonal (VC5) de camun- dongo de integrina anti-αδβΐ de não-bloqueio serviu como o controle de an- ticorpo negativo. Como esperado, tanto EDTA, IIA1 (5 pg/ml) como revesti- mento de BSA inibiram a ligação de adesão mediada por K562, consideran- do que VC5 (5 Mg/ml) não interferiu na adesão celular (Figura 2).

1.3 Exibição de faqos de anticorpo e estratégias de pannina

A exibição de fagos de anticorpo para a identificação de anticor- pos de integrina βηίΐ-αδβΐ completamente humanos foi realizada com uma biblioteca de HuCAL®-GOLD de acordo com os protocolos descritos na lite- ratura (17-20). As seguintes estratégias de panning foram aplicadas e exe- cutadas em paralelo (Tabela 1): Tabela 1: Síntese de abordagens de pannina

<table>table see original document page 23</column></row><table>

p.a: pós-adsorção com HT29wt (para reduzir a ligação de superfície celular não-específica)

Resultados:

Durante os pannings 1298-1324, milhares de clones foram avali- ados. Apesar do fato de várias estratégias de exibição serem aplicadas, um clone (MOR04055) que foi seletivo em ELISA e FACS foi repetidamente iso- lado. Além de MOR04055 que se liga aparentemente a um epítopo imuno- dominante, 4 clones adicionais foram identificados (MOR04139, 04141, 04160, 04568). Para aumentar adicionalmente a chance de selecionar aglu- tinantes de integrina mais diversos e específicos, 2 pannings adicionais (1369.1-2 e 1371.1-2) foram realizados. Aqui, 10 pg/ml de MOR04055-Fab foram adicionados durante a exibição de fagos para suprimir o enriqueci- mento do clone dominante de MOR04055. Apesar da competição de Fab, todos os aglutinantes específicos encontrados ao longo de pannings 1369 eram novamente MOR04055. Em pannings 1371, um aglutinante individual adicional (MOR04624) foi identificado. 1.4 Anticorpos Fab de teste funcionais

Análise de adesão

Os anticorpos obtidos a partir da primeira abordagem de panning foram classificados de acordo com sua potência de bloqueio de função em um experimento de pré-avaliação como se segue: MOR04624>MOR04055>MOR04141 =MOR04568=MOR04160. MOR04139 foi levemente inibidor, porém não atingiu 50% de inibição. O re-teste dose dependente dos anticorpos em concentrações diferentes na análise de ade- são de K562 confirmou o resultado do experimento de pré-avaliação com uma exceção: MOR04139 não mostrou nenhuma inibição dose-dependente. Esse anticorpo não foi adicionalmente investigado (Figura 3).

Indução de apoptose

Os anticorpos obtidos a partir da primeira abordagem de panning foram adicionalmente avaliados para as propriedades de indução de apopto- se. Portanto, placas de 96 poços foram revestidas com 0,2 e 0,4 pg/ml de fibronectina durante 1 hora a 37°C e bloqueadas com 2% de BSA. As célu- las 1x104 HUVEC foram incubadas juntamente com o respectivo anticorpo em meio isento de soro para cultura de células endoteliais (Gibco). Após 18 horas, um kit de análise de caspase 3/7 foi usado para Iise celular e quantifi- cação de atividade de caspase de acordo com o procedimento descrito pelo fabricante (Caspase Glo 3/7; Promega). Em uma concentração de 100 pg/ml o MOR04055 Fab monovalente e 04624 induziram atividade de caspase 3/7 em células HUVEC de modo tão forte quanto o IIA1 IgG de referência biva- Iente em 10 pg/ml (Figura 4). Todos os outros Fab são negativos nessa aná- lise.

Medidas de afinidade por titulação de FACS

Para analisar a potência de ligação sobre integrina nativa α5β1, todos os anticorpos foram testados em células HUVEC positivas de α5β1 por titulação de FACS (Tabela 2). MOR04055 possui máxima afinidade de ligação (0,9 nM) e mostrou um aumento no formato de IgG dimérico. Para MOR04624 um KD na baixa faixa nanomolar de Fab monovalente, e um aumento no KD do IgG dimérico foi obtido.

Tabela 2: Resultado de determinação de afinidade de Fabs monovalentes e IaGs por titulação de FACS

<table>table see original document page 25</column></row><table>

FACS de Competição de Fab e IIA1

Para investigar se os anticorpos de Fab compartilham ou não o mesmo epítopo com IIAI, as células HT29a5 foram incubadas tanto com 0,5 Mg/ml de Fab separadas ou juntamente com 10 pg/ml de IIA1. Os Fabs hu- manos que se ligam às células foram detectados com conjugado de PE es- pecífico de Fab anti-humano para análise de FACS. A Figura 7 mostra ape- nas uma sobreposição de coloração de Fab (linhas pretas) e Fab + IIAI (li- nhas verdes). Como resultado, a adição de IIA1 resulta em uma redução visível na intensidade de coloração por MOR04624. Todos os outros Fabs não foram afetados por IIA1. Esse resultado indica que IIA1 e MOR04624 competem um com o outro para a ligação a um epítopo idêntico ou de so- breposição, enquanto os outros 4 Fabs se ligam a epítopos não- relacionados.

1.5 Amadurecimento por afinidade: Análise de Fab e anticorpos IgG

Os Fabs MOR04055 e 04624 foram submetidos a uma sessão de amadurecimento por afinidade. Portanto, as sub-bibliotecas foram cons- truídas a partir do Fab de origem tanto por randomização de VL-CDR3 como VH-CDR2 (17) e submetidas a seleções de exibição de fagos sobre células α5β1 e HT29a5 purificadas. Os aglutinantes positivos dessa triagem foram adicionalmente analisados em uma análise de adesão sobre as células HT29a5 e classificados de acordo com sua atividade inibidora. O melhor po- tencial inibidor foi obtido por derivados de MOR04624. Os derivados de MOR04055, MORQ4568, MORQ4141 mostraram apenas aprimoramento sig- nificativo moderado ou nenhum em inibição. Baseado nas cadeias leves e pesadas desses clones 12 novas combinações de VL-CDR3 e VH-CDR2 foram clonadas para otimização adicional (autodenominadas "clonagem X"). Os melhores clones inibidores e clones de clonagem X foram expressos e purificados e comparados in vitro de modo que eventualmente 7 aglutinantes exclusivos consolidados com atividades de bloqueio aprimoradas sejam i- dentificados para análise aprofundada adicional (MOR04971, -72, -74, -75, - 77, -85, - 87).

Indução de apoptose

A indução de apoptose sobre células HUVEC in vitro foi medida por atividade de caspase e sobrevivência celular (Figura 6 e Figura 7). Em ambas as análises a eficácia do Fab MOR04974, 04975 e 04977 monova- Iente foi comparável com o anticorpo de referência monoclonal bivalente Il- A1de camundongo.

Tabela 3: Valores de IC50 de anticorpos Fab na análise de proliferação de XTT

<table>table see original document page 26</column></row><table>

Em comparação com o Fab de origem, os anticorpos maduros por afinidade foram significativamente aprimorados (até um fator de 190). A inibição de proliferação do Fab monovalente foi 4 vezes menos eficaz do que o anticorpo de referência bivalente IIA1.

Imunoprecipitação Para demonstrar a especificidade dos anticorpos Fab1 Iisados NP-40 de células HT29a5 e HT29wt biotiniladas na superfície foram incuba- dos com Fab acoplado a microesferas magnéticas. IIA1 foi usado como um anticorpo de referência. Após lavagem intensiva os precipitados foram fervi- dos em tampão de amostra SDS-PAGE sob condições de redução, man- chados com membranas PVDF e sondado com estreptavidina-AP. Todos os anticorpos de integrina anti-αδβΐ precipitaram especificamente uma banda k dupla de proteína de -135 kDa que corresponde ao peso molecular espera- do das cadeias de integrina a5 e β1 (Figura 11) e não foi encontrada no Iisa- do de célula HT29wt. A mesma banda dupla foi obtida com IIA1. O Fab MOR03207 irrelevante foi usado como um controle negativo e não precipitou essa banda dupla. Esse resultado demonstra a alta especificidade dos anti- corpos Fab.

IgGs otimizados na análise de adesão de HUVEC

Para investigar se a potência in vitro dos anticorpos Fab descri- tos acima foi adicionalmente aprimorada no formato dimérico os anticorpos foram convertidos em moléculas de IgGI totais de acordo com tecnologias padrão que utilizam o Kit de Vetor de IgG MorphoSys HuCAL (MorphoSys AG, Munich; Germany) e foram analisados por análise de adesão de HU- VEC (Figura 8), análise de viabilidade de HUVEC (Figura 9) e análise de apoptose de HUVEC (Figura 10) em comparação com o anticorpo de refe- rência IIA1.

Com a máxima importância, IIA1 foi incluído em cada experi- mento como ponto de referência. Nesse aspecto a conversão de IgG de MOR04974, -75 e -77 resultou em IgGs de HuCAL com um IC50 muito simi- lar ao IIA1, indicando que a conversão de fato resultou em um aprimoramen- to de ~2 vezes comparado com o formato de Fab monovalente. IqGs otimizados em análise de viabilidade de HUVEC

Foi observado que após a conversão de IgG cinco aglutinantes apresentaram valores de IC50 ~2 vezes aprimorados comparados com o formato de Fab. MOR04974, -75 e -77 mostrou uma eficácia muito similar na redução de viabilidade de HUVEC como IgG IIA1 de referência. IqGs otimizados em análise de apoptose de HUVEC

A partir da análise de IgGs de derivação na análise de Caspase 3,7 pode-se concluir que MOR04974, -75 e -77 induziram apoptose de ma- neira bem comparável como o anticorpo de referência IIA1.

1.6 Análise aprofundada de anticorpos IaG anti-intearina otimizados por afi- nidade

Especificidade dos anticorpos anti-inteqrina otimizados por afinidade

Os anticorpos maduros por afinidade do formato IgG1 foram tes- tados por sua especificidade de ligação por análise de FACS em células HT29wt vs. HT29a5. As células HT29wt são a5-negativas, porém contêm a cadeia da integrina β1. ΗΤ29α5, porém as células HT29wt não são especifi- camente reconhecidas pelos anticorpos anti-integrina IgG1 e o anticorpo de referência IIA1 como indicado pelo desvio de fluorescência, (figura 12). Um controle de isotipo de anticorpo não-específico não se liga às células e ne- nhum desvio na fluorescência medida foi observado. Esses experimentos mostram que os anticorpos de derivação candidatos reconhecem especifi- camente a integrina a5 e se ligam com a mesma especificidade que o anti- corpo de referência IIA1.

A especificidade de epítopo de anticorpos de integrinas anti- α5β1 é mantida após o amadurecimento por afinidade e re-clonagem no formato de IgG

Foi mostrado por experimentos de competição de FACS que o anticorpo Fab MOR04624 e seus derivados competem com o anticorpo de referência IIA1 pela ligação a um epítopo de sobreposição. Após a conver- são no formato de IgG1, os anticorpos de integrina anti-αδβΐ foram testados novamente para competição de ligação com o IIA1. A ligação dos anticorpos de integrina anti-αδβΐ MOR04974, - 75, -77, -85 e MOR04624 às células HT29a5 resultou em um desvio de fluorescência que foi completamente ini- bido quando as células foram pré-incubadas com IIA1. Esse resultado con- firmou a competição de epítopo de IIA1 e os anticorpos de integrina anti- α5β1 IgG1 (Figura 13).

Análise Quantitativa dos anticorpos de integrina anti-α5β1 IgG1 na análise de angiogênese de formação de tubo.

O bloqueio de vasos recentemente formados de células endote- liais ativadas é considerado uma das atividades inibidoras principais dos an- ticorpos de integrina anti-a5β1. Para caracterização completa foram analisa- dos os anticorpos de integrina anti-a5β1 IGgI otimizados por afinidade em comparação com o anticorpo de referência IIA1 em uma análise de forma- ção de tubo de HUVEC.

Nessa análise, as células endoteliais de veia umbilical humana 2 x 104 (HUVECs #2519, Promocell) foram semeadas em Matrigel rico em fa- tor de crescimento (Becton Dickinson #354234) em meio EBM-2 (Clonetics #CC3156). Os anticorpos (6nM, 3nM, 600pM, 300pM, 60pM) foram adicio- nados 15 min depois e a formação de tubo foi permitida durante 18 a 24 h a 37°C. As células foram então fixadas e coloridas com anti-CD31 para foto- documentação da formação de tubo.

Análise visual das redes complexas formadas nos poços revelou atividade de bloqueio de formação de tubo para todos os anticorpos de inte- grina anti-a5β1 derivados de MOR04624 com potência similar à do anticorpo de referência (Figura 14). Em altas concentrações, o bloqueio de anticorpo de formação de tubo também foi obtido para controles de isotipo de IgGI humanos e murinos. Em concentrações menores de anticorpo (abaixo de 300pM), entretanto, uma janela de atividade foi observada onde a formação de tubo foi apenas bloqueada em poços tratados com o anticorpo específico, porém não em poços não-tratados ou poços tratados com o controle de iso- tipo de anticorpo ou o anticorpo MOR04624 bloqueio de função fraca.

Análise dos anticorpos IqG de integrina anti-a531 na análise de Migração

Durante o processo angiogênico, as células endoteliais ativadas migram em direção a um estímulo angiogênico sobre uma matriz provisória específica de angiogênese que consiste principalmente em fibronectina (FN). Foram analisados os anticorpos IgG de integrina anti-αδβΐ otimizados na análise de migração transwell e obtiveram atividade de bloqueio de mi- gração de HUVEC dependente de fibronectina de α5β1 para todos os anti- corpos anti-αδβΐ com uma eficácia na mesma ordem de magnitude (1 a 10μg/ml) como IIA1 (Figura 15).

Reatividade de anticorpos de inteqrina anti-α5β1

Reatividade em linhagens de células tumorais e endoteliais

A reatividade dos anticorpos de integrina anti-αδβ1 foi testada em várias linhagens de células endoteliais e tumorais por experimentos de ligação de FACS (tabela 4).

A ligação a todas as linhagens de células endoteliais e tumorais testadas exceto de células HT29wt, que são conhecidas como negativas de cadeia a5, foi observada. Em comparação com o anticorpo de referência IIA1, os anticorpos de derivação candidatos ligados igualmente bem a todas as linhagens celulares testadas e o desvio resultante em fluorescência foi similar em todo os anticorpos, os anticorpos de controle de isotipo não se ligaram. Em suma, os anticorpos de integrina anti-αδβ1 mostram reatividade equivalente a IIA1 em experimentos de ligação celular de FACS. Tabela 4: Reatividade de FACS de anticorpos de integrina anti-αδβ1 em vá- rias linhagens celulares.+= fraco desvio, ++ forte desvio (1 log de fluores- cência), +++ desvio muito forte (2 Iog de fluorescência); mlgG1 e hulgGI como controles de anticorpo foram usados como controles padrão e ligação foi negativa; Material de anticorpo: chemicon CD51/61 #CBL 544 anti- humano, chemicon #Mab 20192 anti-αvβδ, anticorpo de integrina α5β1 de não bloqueio de função VC5 Pharmingen #555650, anticorpo de integrina anti-αδβΐ IIA1 Pharmingen #5δδ61 <table>table see original document page 31</column></row><table>

Legenda: Linhagem celular / tecido / Células endoteliais microvasculares dérmicas humanas / Epitélio mamário humano / Endotélio arterial pulmonar humano / Células endoteliais de veia umbilical humana / Endotélio do pân- creas de camundongo / Células endoteliais da aorta de porco / Endotélio tumoral humano / Melanoma maligno / Carcinoma pulmonar humano / Ade- nocarcinoma humano / Carcinoma de próstata humano / Carcinoma colorre- tal / Fibrosarcoma / Careinoma de mama humano / Adenoeareinoma de próstata humano / Glioblastoma humano / Adenoeareinoma humano / Transf. HT29 com cadeia a-5 Reatividade de anticorpos de anti-a531 em seções de tecido normal e tumo- ral - Imuno-histoquímica

Os anticorpos de integrina anti-αδβΐ otimizados por afinidade foram analisados em experimentos de imuno-histoquímica em seção de te- cido diferente e o perfil de reatividade dos anticorpos anti-integrina sobre os respectivos tecidos é muito similar à coloração de IIA1. Em suma, conclui-se que os anticorpos de integrina anti-aõpi dessa invenção mostram padrões de coloração comparáveis com IIA1 (Figura 16).

Caracterização in vivo dos anticorpos IqG de integrina anti-a5B1 otimizados por afinidade

Demonstração de marcação in vivo em camundongos sem pêlos xenoenxer- tados

As propriedades de marcação in vivo dos anticorpos de integrina anti-a531 otimizados em comparação com IIAI foram comparadas em ca- mundongos sem pêlos que conduzem xenoenxertos de células HT29a5.

A radiomarcação dos anticorpos de integrina anti-a5pi otimiza- dos (lgG4-Pro) foi realizada com iodo-125 de acordo com o método de iodo- gen durante 1 min de acordo com procedimentos padrão. A imunorreativida- de foi medida em uma análise de ligação celular ("análise de Lindmo"). 50ng de anticorpo radiomarcado foram incubados com números crescentes (0.25 a 10 Mio) de células positivas de integrina α5β1 durante 2h a 4°C. Então, as células foram lavadas e a radioatividade ligada foi determinada em um con- tador de cintilação. O quociente de contagens totais/contagens ligadas foi representado contra número 1/célula e os dados foram ajustados com um modelo de regressão não-linear. A partir da interseção com o eixo geométri- co y a imunorreatividade restante em densidade de antígeno infinita foi cal- culada e considerada como 75 a 80% em todos os anticorpos de integrina anti-αδβ1. Os anticorpos de integrina βηίί-αδβΐ humanos acumulados den- tro de 24 horas em xenoenxertos de HT29a5 com >10% de ID/g com dura- ção de 96 horas para todos os anticorpos analisados, exceto MOR04975 que diminuiu rapidamente após 48 horas para menos de 5% de ID/g após 72h. MOR04974 atingiu um valor de pico após 48 horas com 18% de ID/g e MOR04977 após 72h com 18% de ID/g. Em comparação o anticorpo IIA1 murino acumulado dentro de 24h em xenoenxertos de HT29a5 com >10% de ID/g com duração de até 96 h. Para o anticorpo MOR03207 anti-lisozima não-específico, menos de 3% de ID/g foram obtidos em qualquer ponto de tempo. A partir desses resultados uma marcação específica de xenoenxer- tos de HT29a5 postivas de α5β1 pode ser concluída. A marcação in vivo dos anticorpos MOR04974 e MOR04977 de integrina anti-a5pi é similar a IIA1 e em pontos de tempo únicos até superiores.

Eficácia in vivo de anticorpos de integrina anti-a531 a partir de modelos ani- mais substitutos de angioqênese

Como o anticorpo de referência IIAI, os anticorpos de integrina anti-αδβΐ não possuem reatividade cruzada com integrina de α5β1 de ca- mundongo e rato. Portanto, a análise da eficácia terapêutica in vivo e a de- monstração do efeito antiangiogênico in vivo específico em modelos animais é difícil e deve ser realizada em modelos substitutos de angiogênese.

A comparação in vivo dos anticorpos IgG de integrina anti-αδβΐ com IIAI foi realizada no modelo substituto de esferóide 3D in vivo de angi- ogênese (Figura 18).

Para esse modelo, esferóides de número de células endoteliais definido foram misturados com colágeno que foi permitido para se polimeri- zar em uma placa de 24 poços. Esferóides EC em plugs de matrigel que contêm VEGF e FGF2 foram então implantados de maneira subcutânea em camundongos SCID onde os ECs estimulados formaram uma rede tridimen- sional complexa de capilares humanos que se juntam por anastomose com a vasculatura do camundongo. Os anticorpos de integrina anti-αδβΐ (200 pg) foram administrados duas vezes por semana durante três semanas. No 21Q dia o estudo foi concluído, os plugs de matrigel foram removidos e examina- dos para densidade de vasos sangüíneos. Conforme para o anticorpo de referência IIA1 o tratamento com os anticorpos IgG de integrina anti-α5β1 otimizados MOR04974 e MOR04975 reduziram a densidade microvascular nos plugs de matrigel por um fator de dois a aproximadamente 20 microva- sos por mm2, enquanto que o tratamento com o anticorpo MOR03277 anti- lisozima humano irrelevante resultou em cerca de 40 microvasos por mm2.

Baseado nesse resultado pode-se concluir que os anticorpos de integrina anti-α5β1 MOR04974 e MOR04975 humanos otimizados possuem eficácia antiangiogênica in vivo comparável como IIA1 no modelo substituto de esferóide in vivo 3D de angiogênese.

Conclusão:

Em experimentos in vitro as melhores propriedades inibidoras em Fab bem como o formato de IgGI foram consistentemente obtidas para MOR4974, -75, -77. Todos os três IgGs são comparáveis com IIA1 mAb de referência. Esses aglutinantes são derivados de MOR04624. Em experimen- tos in vivo MOR04974 IgG1 -75, -77 completamente humanos e otimizados demonstraram marcar de forma eficaz xenoenxertos de tumor em camun- dongos sem pêlos e no modelo de esferóide 3D de angiogênese MOR04974 e MOR04975 foram tão eficazes quanto o anticorpo de referência IIA1.

As seqüências de aminoácido das cadeias V dos anticorpos a- cima são mostradas na Tabela 4:

MOR04624 de origem

<table>table see original document page 34</column></row><table>

MOR04624

VLK (SEQ ID NO: 1)

diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgissnlnwyqqkpgkapklliyaasnlqsgpsrfsgsgsgtdftlti sslq pedfavyycqqysdqsytfgqgtkveikrt

VH (SEQ ID NO: 2) qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssygmswvrqapgkglewvssisysdsntyyadsvkgrftis

rdns kntlylqmnslraedtavyycarglgdyghhhglsgifdywgqgtlvtvss

MQR04055

VLA3 (SEQ ID NO: 3)

Dieltqppsvsvapgqtariscsgdsigeqyahwyqqkpgqapvlviyddnkrpsgiperfsgsnsgnta tltis

gtqaedeadyycgsytltntasvfgggtkltvlg VH3 (SEQ ID NO: 4)

qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsnyamnwvrqapgkglewvsrisysgsdtyyadsvkgrftisr

dns

kntlylqmnslraedtavyycaregefgfmystlvfdswgqgtlvtvss MORQ4971

VLA3 (SEQ ID NO: 5) Dieltqppsvsvapgqtariscsgdsigeqyahwyqqkpgqapvlviyddnkrpsgiperfsgsnsgnta tltis

gtqaedeadyycssytyssdasvfgggtkltvlg VH3 (SEQ ID NO: 6)

qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsnyamnwvrqapgkglewvsaihdnghtyypdsvkgrftisr dns

kntlylqmnslraedtavyycaregefgfmystlvfdswgqgtlvtvss MORQ4974

VLk (SEQ ID NO: 7)

Diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgissnlnwyqqkpgkapklliyaasnlqsgpsrfsgsgsgtdftlti sslq

pedfatyycqqyasprqtfgqgtkveikrt VH (SEQ ID NO: 8)

Qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssygmswvrqapgkglewvsgirakqsgyatdyaapvkgr ftisrd

nskntlylqmnslraedtavyycarglgdyghhhglsgifdywgqgtlvtvss MORQ4975

VLk (SEQ ID NO: 9)

Diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgissnlnwyqqkpgkapklliyaasnlqsgpsrfsgsgsgtdftlti sslq

pedfatyycqqyefgiqtfgqgtkveikrt VH (SEQ ID NO: 10) Qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssygmswvrqapgkglewvsgirakqsgyatdyaapvkgr ftisrd

nskntlylqmnslraedtavyycarglgdyghhhglsgifdywgqgtlvtvss MOR04977

VLk (SEQ ID NO: 11) Diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgissnlnwyqqkpgkapklliyaasnlqsgpsrfsgsgsgtdftlti sslq

pedfatyycqqyssnpqtfgqgtkveikrt VH (SEQ ID NO: 12) qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssygmswvrqapgkglewvsfiepkwrggathyaasvkgrf tisrd

nskntlylqmnslraedtavyycarglgdyghhhglsgifdywgqgtlvtvss MORQ4985

VLk (SEQ ID NO: 13) Diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgissnlnwyqqkpgkapklliyaasnlqsgpsrfsgsgsgtdftlti sslq

pedfavyycqqysdqsytfgqgtkveikrt VH (SEQ ID NO: 14) Qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssygmswvrqapgkglewvsgirakqsgyatdyaapvkgr ftisrd

nskntlylqmnslraedtavyycarglgdyghhhglsgifdywgqgtlvtvss 2. Conclusão:

Os anticorpos de bloqueio de função de integrina anti-αδβΐ es- tão disponíveis apenas em um formato de anticorpo quimérico. As aborda- gens de uma humanização total falharam. A aplicação de tais anticorpos no ambiente clínico pode induzir uma resposta imune em pacientes humanos. Especialmente para um composto antiangiogênico cronicamente aplicado isso pode resultar em dosagem aumentada ou ainda em efeito colateral se- vero que pode resultar no término precoce do tratamento.

Foram identificados anticorpos de bloqueio de função de integri- na de α5β1 completamente humanos com um excelente perfil biológico. É vantajoso ter anticorpos murinos e quiméricos devido à sua natureza com- pletamente humana que irá garantir o quanto possível a ausência de efeitos colaterais em ambientes clínicos. Espera-se que a probabilidade de induzir uma resposta imune contra essa molécula com efeitos colaterais severos e/ou doses aumentadas seja muito menor. Portanto, essas moléculas são muito mais adequadas para a aplicação em medicina humana, por exemplo, para o tratamento de tumores sólidos. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft

<120> HIGH AFFINITY HUMAN AND HUMANIZED ANTI-A5B1 INTEGRIN FUNCTION BLOCKING ANTIBODIES WITH REDUCED IMMUNOGENICITY

<130> 53407AWO

<150> EP06010779 . 4

<151> 2006-05-24

<160> 14

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(108)

<223> VLk

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asp Gln Ser Tyr Thr 85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 2 <211> 126 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(126) <223> VH

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Tyr Ser Asp Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Leu Gly Asp Tyr Gly His His His Gly Leu Ser Gly Ile

100 105 110

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 3

<211> 109

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..{109) <223> <400> Asp Ile 1

Thr Ala

His Trp

Asp Asp 50

Asn Ser 65

Asp Glu

Ser Val

<210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <223> <400> Gln Val 1

Ser Leu Ala Met Ser Arg

VLlambda3

3

Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

5 10 15

Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Glu Gln Tyr Ala

20 25 30

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45

Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

55 60

Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu

70 75 80

Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Tyr Thr Leu Thr Asn Thr Ala

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105

4

124 PRT

Artificial

DOMAIN (1)··(124) VH3 4

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 5

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro 35 40

Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Asp

Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 30

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 45

Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Glu Phe Gly Phe Met Tyr Ser Thr Leu Val Phe Asp

100 105 110

Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 109

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(109)

<223> VLlambda3

<400> 5

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Glu Gln Tyr Ala

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Asp Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Tyr Ser Ser Asp Ala

85 90 95

Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 6 <211> 123

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1) .. (123)

<223> VH3

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile His Asp Asn Gly His Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Glu Gly Glu Phe Gly Phe Met Tyr Ser Thr Leu Val Phe Asp Ser

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 7

<211> 108 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(108) <223> VLk

<400> 7

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Ser Pro Arg Gln Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105

<210> 8 <211> 128 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(128) <223> VH

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Arg Ala Lys Gln Ser Gly Tyr Ala Thr Asp Tyr Ala Ala 50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Gly Asp Tyr Gly His His His Gly Leu Ser

100 105 110

Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 9

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(108)

<223> VLk

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Phe Gly Ile Gln Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 <210> 10

<211> 128

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(128)

<223> VH

<400> 10

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Arg Ala Lys Gln Ser Gly Tyr Ala Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Gly Asp Tyr Gly His His His Gly Leu Ser

100 105 110

Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 11

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(108) <223> VLk

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Asn Pro Gln Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105

<210> 12 <211> 128 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(128) <223> VH

<400> 12

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Phe Ile Glu Pro Lys Trp Arg Gly Gly Ala Thr His Tyr Ala Ala 50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Gly Asp Tyr Gly His His His Gly Leu Ser

100 105 110

Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 13

<211> 108 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(108) <223> VLk

<400> 13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asp Gln Ser Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 14

<211> 128 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(128) <223> VH

<400> 14

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Arg Ala Lys Gln Ser Gly Tyr Ala Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Gly Asp Tyr Gly His His His Gly Leu Ser

100 105 110

Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

Claims

1. Anticorpo humano ou humanizado ou um fragmento de liga- ção de antígeno desse que se liga à integrina α5β1 com uma afinidade de ^ -100 nM e que inibe a adesão de células que expressam integrina α5β1 a seu receptor in vitro e in vivo.

2. Anticorpo ou fragmento, de acordo com a reivindicação 1, que se liga à integrina α5β1 com uma afinidade de ^ 10 nM.

3. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivin- dicação 1 ou 2, que inibe a adesão da linhagem celular K562 in vitro.

4. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, que compreende: (a) uma região de VH selecionada entre (i) seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 1 (MOR04624), SEQ ID NO: 3 (MOR04055) ou pelo menos uma região H-CDR1, H-CDR2 e/ou H- CDR3 de uma das ditas regiões de VH, ou (ii) uma seqüência de aminoácido derivada de uma seqüência de (i) pela alteração de pelo menos uma região H-CDR, e/ou (b) uma região de VL selecionada entre (i) seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 1 (MOR04624), SEQ ID NO: 4 (MOR04055), ou pelo menos uma região de L-CDR1, L-CDR2 e/ou L-CDR3 de uma das ditas regiões de VL, ou (ii) uma seqüência de aminoácido derivada de uma seqüência de (i) pela alteração de pelo menos uma região de L-CDR.

5. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivin- dicação 4, que compreende uma região de VH derivada de uma região de VH de (a) (i) por randomização da região de H-CDR2.

6. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivin- dicação 4 ou 5, que compreende uma região de VL derivada de uma região de VL de (b) (i) por randomização da região de L-CDR3.

7. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, que compreende uma região de VH e/ou VL derivada de uma região de VH de (a) (i) e/ou de uma região de VL de (b) (i) por mistura das cadeias de anticorpo.

8. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, que compreende (a) uma região de VH sele- cionada a partir da seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 5 (MOR04971), SEQ ID NO: 7 (MOR04974), SEQ ID NO: 9 (MOR04975), SEQ ID NO: 11 (MOR04977), e SEQ ID NO. 11 (MOR04985) ou pelo menos uma região de H-CDR1, H-CDR2 e/ou H-CDR3 das ditas regiões de VH e/ou (b) uma regi- ão de VL selecionada a partir da seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 6 (MOR04971), SEQ ID NO: 8 (MOR04974), SEQ ID NO: 10 (MOR04975), SEQ ID NO: 12 (MOR04977) e SEQ ID NO: 14 (MOR04985), ou pelo menos uma região de L-CDR1, L-CDR2 e/ou L-CDR3 das ditas regiões de VL.

9. Anticorpo ou fragmento de anticorpo que compreende a regi- ão de VH de SEQ ID NO: 1 e a região de VL de SEQ ID NO: 2 (MOR04624) ou pelo menos uma região de H- CDR1-, H-CDR-2, H-CDR3-, L-CDR1-, L- CDR2- ou L-CDR3 desse.

10. Anticorpo ou fragmento de anticorpo que compreende a re- gião de VH de SEQ ID NO: 3 e a região de VL de SEQ ID NO: 4 (MOR04055) ou pelo menos uma região de H-CDR1-, H-CDR-2, H-CDR3-, L-CDR1-, L-CDR2- ou L-CDR3 desse.

11. Anticorpo ou fragmento de anticorpo que compreende a re- gião de VH de SEQ ID NO: 5 e a região de VL de SEQ ID NO: 6 (MOR04971 ) ou pelo menos uma região de H-CDR1-, H-CDR-2, H-CDR3-, L-CDR1-, L- CDR2- ou L-CDR3 desse.

12. Anticorpo ou fragmento de anticorpo que compreende a re- gião de VH de SEQ ID NO: 7 e a região de VL de SEQ ID NO: 8 (MOR04974) ou pelo menos uma região de H- CDR1-, H-CDR-2, H-CDR3-, L-CDR1-, L-CDR2- ou L-CDR3 desse.

13. Anticorpo ou fragmento de anticorpo que compreende a re- gião de VH de SEQ ID NO: 9 e a região de VL de SEQ ID NO: 10 (MOR04975) ou pelo menos uma região de H- CDR1-, H-CDR-2, H-CDR3-, L-CDR1-, L-CDR2- ou L-CDR3- desse.

14. Anticorpo ou fragmento de anticorpo que compreende a re- gião de VH de SEQ ID NO: 11 e a região de VL de SEQ ID NO: 12 (MOR04977) ou pelo menos uma região de H- CDR1-, H-CDR-2, H-CDR3-, L-CDR1-, L-CDR2- ou L-CDR3 desse.

15. Anticorpo ou fragmento de anticorpo que compreende a re- gião de VH de SEQ ID NO: 13 e a região de VL de SEQ ID NO: 14 (MOR04985) ou pelo menos uma região de H-CDR1-, H-CDR-2, H-CDR3-, L-CDR1-, L-CDR2- ou L-CDR3 desse.

16. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 15, que é um anticorpo IgG, por exemplo, um anticorpo IgGI, lgG2, lgG3 ou lgG4 humano ou humanizado ou um o desse, por exemplo, um fragmento de Fab, Fab1 ou F(ab)2.

17. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 15, que é um anticorpo recombinante, por exemplo, um anticorpo de cadeia simples (sc), ou um fragmento desse, por exemplo, fragmento sc Fv.

18. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 17, sob a forma de um conjugado com um agente terapêutico.

19. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com a rei- vindicação 18, em que o agente terapêutico é selecionado entre agentes radioterapêuticos e agentes quimioterapêuticos.

20. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com a rei- vindicação 19, em que o agente radioterapêutico é I125,1131 ou Y90.

21. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 17, sob a forma de um polipeptídeo de fu- são.

22. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com a rei- vindicação 21, como um polipeptídeo de fusão com uma citocina ou como um anticorpo biespecífico.

23. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 17, sob a forma de um conjugado com um grupo de marcação detectável.

24. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com a rei- vindicação 23, em que o grupo de marcação detectável é selecionado entre grupos de marcação radioativos, NMR, corante, enzima e fluorescentes.

25. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com a rei- vindicação 24, em que o grupo de marcação radioativo detectável é selecio- nado entre I125, I131 ou Y90.

26. Composição farmacêutica que compreende como um agente ativo um anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25.

27. Composição, de acordo com a reivindicação 26, para a pre- venção ou tratamento de distúrbios hiperproliferativos.

28. Composição, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, para a prevenção ou tratamento de câncer.

29. Composição, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, para a prevenção ou tratamento de carcinoma de cólon.

30. Composição, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, para a prevenção ou tratamento de tumores.

31. Composição diagnostica que compreende como um reagen- te diagnóstico um anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 17 ou 23 a 24.

32. Composição, de acordo com a reivindicação 32, para a diag- nose de distúrbios hiperproliferativos ou uma predisposição para esses.

33. Composição, de acordo com a reivindicação 32, para a diag- nose de câncer ou uma predisposição para isso.

34. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 33, para uso em medicina humana.

35. Ácido nucléico que codifica um anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17 ou 21 a 22.

36. Ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 35, que é li- gado de modo operacional a uma seqüência de controle de expressão.

37. Vetor ou sistema de vetor que compreende um ácido nucléi- co, de acordo com a reivindicação 35 ou 37.

38. Célula que é transformada com um ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 35 ou 36 ou com um vetor, de acordo com a reivindica- ção 37.

39. Organismo não-humano que é transformado com um ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 35 ou 36 ou com um vetor, de acor- do com a reivindicação 37.

40. Método para preparar um polipeptídeo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 17 ou 21 a 22, em que uma célula, de a- cordo com a reivindicação 38 ou um organismo não-humano, de acordo com a reivindicação 39 é cultivado sob condições, sob as quais o polipeptídeo é expresso e o polipeptídeo expresso recuperado.

41. Uso de um polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, para a fabricação de um medicamento para a preven- ção ou tratamento de distúrbios associados à integrina de α5β1 ou uma pre- disposição para esses.

42. Uso, de acordo com a reivindicação 41, ou a fabricação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de câncer.

43. Uso de um polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, para a fabricação de um reagente para a diagnose de distúrbios associados à integrina de α5β1 ou uma predisposição para es- ses..

44. Uso, de acordo com a reivindicação 43, para a fabricação de um reagente para a diagnose de câncer.