TW200817432A

TW200817432A - Amidated insulin glargine

Info

Publication number: TW200817432A
Application number: TW096124846A
Authority: TW
Inventors: Paul Habermann; Frank Zocher
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland
Priority date: 2006-07-11
Filing date: 2007-07-09
Publication date: 2008-04-16
Also published as: US20090176692A1; DE102006031962A1; JP2009542741A; WO2008006496A1; AR061866A1; EP2041169B1; JP5325778B2; ATE522545T1; EP2041169A1; US8048854B2

Description

200817432 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】敘述本發明是關於甘精膜島素經酸胺化修飾，特別是在 Gly(A21)，Arg(B31)，Arg-醯胺(B32)人類胰島素（甘精騰島素醯胺）。【先前技術】 10 15 世界上大約有1.77億名糖尿病患者，其中一億七千萬人是屬於第一類型糖尿病，取代其所缺乏之胰島素分泌是目前唯一可行的治療方法，那些患者需要依賴通常一天要好〃幾次的胰島素注射，終其一生。不同於第一型糖尿病，第二型糖尿病並非總是缺乏胰島素，但是在大部分的木例中尤其疋在後期階段，用胰島素和口服抗糖尿病猝結合的治療被認為是最有力的治療類型。市健康的人之中，騰臟貝他細胞(bda⑶η)所釋放 2二、,血液中葡萄糖濃度有著嚴謹的關聯。A糖濃度提 ====生的㈣，純速的被料量提升分= —會; 島素敏感之哭官盥&础卞行、貝仏、、、口匍甸搪至胰低產量。通常持肝臟中葡萄糖於素分泌，多半無素取代内生性的騰島切契合，一曰樓尸/二*液中葡甸糖生理調控的品質密 —搪尿病患者錯誤地調節各別的情況，血液中 20 200817432 葡萄糖含量升降的擾動便會顯得頻繁，然而，除此之外，血中葡萄糖含量長年升高，既使沒有初始徵兆，也代表健康上相當大的危機。在美國大規模的糖尿病控制及併發症臨床研究計畫（DCCT) (The Diabetes Control and 5 Complications Trial Research Group (1993) Ν· Engl· J· Med· 329, 977-986)清楚地證實，慢性血糖含量的提升與後期糖尿病併發症有實質上的關聯。微血管或大企管病變屬於晚 f 期糖尿病併發症，在一些情形中會造成如視網膜病變 (retinopathy)、腎病變（naphropathy)、神經病變 10 (neur〇pathy)，會導致失明、腎衰竭、失去四肢，此外也與增加心血管疾病的風險相關。因此，可以推斷一個改進的糖尿病治療法必須主要針對於盡可能保持血糖在生理的範圍之内。改進的胰島素治療策略試圖藉由一天注射許多次速效與緩效型胰島素調劑已達成此目的。速效型的配 15 $是在用餐時間針，以求補償用餐過後提升的血糖。緩 ( 效型基本胰島素則是用於確保基本量騰島素的供應，特別是在夜間，避免造成低血糖。胰島素是由一段51個魏酸所分成之兩段胺基酸鏈所構成之多肽鏈：A鏈具有21個胺基酸，而b鍵呈有％ 2〇 _基酸，兩條鏈由二個雙琉鍵相連結。為了糖尿病的户療，胰島素製備已被使用了好幾年，此外，不只是使用^ 然之胰島素’還包括近年來許多胰A素⑽生物或類似物。胰島素類似物是天然姨島素，亦即人類胰島素或動物 200817432 胰島素的類似物，差別在於以其他胺基酸取代至少一個天然的胺基酸，或是增加/刪除至少一個胺基酸在相對應的位置，否則就完全相同的天然胰島素上。例如美國專利第 5656722號是描述甘精胰島素（Arg(B31)，Arg(B32)， Gly(A21)人類胰島素），那些添加或取代的胺基酸可能也不是自然發生者。胰島素衍生物是天然胰島素或類胰島素的衍生物，其一個或多個胺基酸或A鏈與b鏈的N端或C端被其他官能基所取代’而官能基是由下列基團所選出，其包括醯胺基、胺基、羧基、烷基、醇基以及烷氧基。一種有效率的胰島素療法使用所謂的基本胰島素 (basal insulin)，此模式使緩慢而持續釋放外加調控胰島素成為可能。如此一來，糖尿病患者體内的基本胰島素濃度可達到對生理有利的情況很長一段時間。理想上，胰島素影響的起始點可以延後’時間與影響力的關係曲線可以儘可能平缓，如此一來，短期血糖缺乏的危險可以明顯降低，並可在先前未進食的情況下進行調控。重組類胰島素Arg(B31)，Arg(B32)，Gly(A21)人類胰島素（甘精胰島素；US5656722)是與許多每24小時，也就是每天只有一次需要供給的病人相聯結，為了達到基本的影響，對血糖的控制有所改善，例如導致醣化血色素 (Hbalc)含量的減少。如今，一個驁人的發現顯示甘精胰島素B32位置之精胺酸文醯胺化所產生所謂甘精胰島素醯胺（insulin 200817432 ΤΙ7^7Τ^ ίΓ11" ^ ^fa1 ^m Μ # 3"11 ^ ^ 低沒有標定的^ 有利。在初始時，血糖濃度的降音氐點（耶出1〇,此顯示經醯胺化之甘精胰島 ^ 的敏感度具有驚人的優異品質。在低血糖調控一、二因此減少。投予蘭德仕醯胺（Lantus amide)建立、正㊆血糖值為7G_11G毫克/百毫升_萄糖。此外，經驢之Γ精胰島素相較甘精胰島素具有更驚人長效的影曰if發明因此與經醯胺化之甘精胰島素有關。 ίο 二ί "亥項技藝的工作者因此對經醒胺化之甘精胰島 =與鲁，配方的_很清楚。這意指—個醫藥混合物在調以最好的方式，最佳的展現經醯胺化之甘精胰島素的心音力。以水溶液作為此聯結的基礎，其餘組成份必須是適合溶混的。製備中不包含任何成分是來自動物性來源，此乃一大利處，病毒污染的危險因而減少，加入防腐劑是對阻止微生物污染更有益的方式，可能可以透過添加等滲劑以補償調節位置組織細胞之生理狀態的負面影響，添加魚精蛋白（protamine)可能具有穩定的效果，因此可以規劃魚精蛋白的添加以製備無鹽胰島素，添加酚類組成物可導致類胰島素中六聚體結構的穩定，因此有利於對作用起始的遲延’經醯胺化之甘精胰島素的供給可與速效型胰島素並行’例如Apidra®、NovoRapid®，Humalog®或胰島素衍生物’以相同的時間/活動量表曲線經歷發展與規劃。為此，熟悉該項技藝的工作者能清楚認知適當地製備個別胰島素組成分子之混合物也可被用在此目的，醯胺可以更佳地 200817432 被使用如Exubera®等吸入式胰島素的人所取得，經醯胺化之甘精胰島素可進一步用於醫藥上的製備，包含一段被描述為活性可與GLP-1 (似騰高血糖激素-1)相比擬的多肽鏈，此多肽鏈可例示於 GLP-1(7_37)，Exenatide (Byetta®)， 5 或是製備法被描述於WO 2006/058620、WO 2001/04156 與WO 2004/005342等專利申請案之胜肽。與本案同日申請之標題為“製備具有二元B鏈端的胰 , 島素類似物之方法”之專利申請案主要是描述經醯胺化之甘精胰島素之製備方法，利用胰蛋白酶催化接合精胺醯胺 10 (argininamide)到 Gly (A21)，Arg(B31)人類胰島素，可以獲得很高的產量。在這個例子中，可能可以控制反應，以得到胰島素類似物Gly(A21)，Arg(B31) , Arg (B32)-醯胺等較佳的產物，在文獻中有些描述特別提到，保護後的精胺酸衍生物在許多溶劑内常常都不穩定，對產率有正面幫 15 助的方法可能可以藉由改變保護基或醯胺基等方式改變反應條件，這些對技術人員是很熟悉的，亦與本發明有、關。US 5,656,722是描述表現以微小前胰島素 (miniproinsulin)為組成分子之融合蛋白質的pB40盘 PINT91d等質體，將胰島素A鏈之21號位置天門冬胺酸 20 以甘胺酸取代，使得Arg(B31)，Gly (A21)迷你胰島素前驅物直接由融合蛋白質中製備出來，而其可藉由胰蛋白酶消化直接轉變為經酿胺化之甘精胰島素的前驅物。相對應的融合蛋白質不需要細胞中製備，熟練的技術人員能清楚，胰島素前驅物之相似物可藉由細菌表現及隨後分泌至 9 200817432 膜周圍及培養上清液中’以歐洲專利申請案Ηρ-A 1 364 029為例子來描述此方法。此發明同時也與人類胰島素前驅物Arg(B31)，Gly (A21)人類胰島素前驅物的使用有關，其可直接透過此頡細菌方法表現來產生。 5 胰島素類似物的醯胺化可普遍發生在許多方面。C端羧基受醯胺化之甘精胰島素稱為甘精胰島素醯胺。更讓熟練的技術人員熟悉的是，經由此例所描述的表：現系統僅代表宿主/載體系統為製備嵌合蛋白質的小片段，宿主/載體系統允許製備目標多肽鏈因此也成為這個 10 發明的一個部分。【發明内容】本發明因此是關於經醯胺化之甘精胰島素，特別是經醯胺化之甘精胰島素 Gly(A21)，Arg (B31)，Arg(B32)-NH2 15 人類胰島素的型式（甘精胰島素醯胺）。本發明更進一步與經醯胺化之甘精胰島素製備之方 \ 法有關，特別是甘精胰島素醯胺，經醯胺化之甘精胰島素的前驅物為形式Gly(A21)，Arg (B31)的人類胰島素被重組製備，在具有胰蛋白酶活性的酵素存在下，與精胺醯胺 20 (argininamide)的偶合發生，P遺後甘精胰島素醯胺便得以被純化出來。本發明進一步關於甘精胰島素醯胺於製造用於治療糖尿病，特別是第一型或第二型糖尿病之醫藥品之用途。本發明又進一步關於一包含甘精胰島素醯胺之藥 200817432 物，特別是水性調配物或粉末。此藥物是一醫藥製劑，其較佳以溶液或懸浮物型態存在，有助於注射的目的；其特徵在於至少有一種醯胺化之甘精胰島素，特別是甘精胰島素醯胺，及/或是至少一種 5 在溶解狀態、非結晶狀態，及/或是結晶狀態-較佳的型態為溶解狀態之生理上可耐受性的鹽類。此製劑較佳的pH值介於約2.5至8.5,特別是介於約 , 4.0到8·5之間，包含一個合適的強化劑（tonicity agent)， 10 適合的防腐劑和適當缓衝液，較佳也使用某一辞離子濃度，整個自然地在無菌水溶液中。除活性成分外，製劑的載體形成一個整體的製劑成分。 15 適合的強化劑為例如甘油、葡萄糖、甘露醇、氯化納、鈣或鎂化合物如氯化鈣等。經醯胺化之甘精胰島素或其生理上可耐受性的鹽類之溶解度受在弱酸性pH值的強化劑和/或防腐劑的選擇之影響。 20 合適的防腐劑為，例如酚，間-甲苯酚，苄醇和/或對 -羥基苯曱酸酯。缓衝物質，可以使用特別設置pH值介於約4.0和8.5 之間者，例如醋酸鈉、擰檬酸鈉、磷酸鈉等，否則，接受生理可接受稀釋酸(典型為鹽酸）或鹼(典型為氫氧化鈉）， 11 200817432 也適合用於設立pH值。古^果^含有鋅’其含量為從1微克/毫升至2毫克/ 笔升f i尤其是從5微克到200微克鋅/毫升較佳。 . 心/、\發明製劑之不同活性成分，它也可能是混合了未二之月島素，較佳是牛、豬或人胰島素，特別是人胰島 ”或胰島素類似物與其街生物，它同樣可能混合一個或多個exendm-4彳叮生物或胜肽，其特點在於其相較於 f GLP-IQ員騰南企糖激素力之活性，本發明同樣涉及到這種藥物（製劑）。 1〇優選的活性成分的濃度是那些大約相當於 1 - 1500，車乂么疋約5 - 1〇〇〇，特別是約4〇 _ 4〇〇國際單位/毫升。【實施方式】本發明以如下實例加以更詳細的描述，但不因此受到 15 限制。 \ 例子1 ·麵包酵母菌之分泌水蛭素Arg(B31)，Giy(A21)胰島素融合蛋白質的基因序列。專利申請案EP-A 1 364 032建議用水蛭素作為融合夥伴’在酵母菌中表現和分泌醫藥上有興趣的蛋白質。專利申請案EP-A 1 364 032的例子1描述了用來製備水蛭素衍生物和微小前胰島素所組成的融合蛋白之宿主_ 載體系統。此系統可用於製備微小前胰島素，其為所請之甘精胰島素醯胺的前驅物。 12 200817432 表現載體的建構為專利申請案EP-A 1 364 032中例子的類似物，將引子insncolrev置換，因而改變其位置 A21的基因密碼。以下的引子是合成來製備由微小前胰島素（與 5 Gly(A21)，Arg(B31)人類胰島素，隨後由微小前胰島素產生）構成之融合蛋白質的基因序列。 , ins 一 gly—a21 一 rev TTTTTTCCATGGGTCGACTATCAGCCACAGTAGTTTTC 10 CAGCTGG (SEQ ID NO·: 1) 引子在這各例子完全覆蓋了胰島素類似物之胺基酸 A15-A21基因片段密碼，合併此引子與專利申請案EP-A 1 364 032例子1的引子SEQ ID NO: 4，並以質體 15 pADH2HirJns為模板，透過PCR來產生DNA片段，經過限制酶ΚρηΙ與Kcol的切割作用之後，嵌入相對應地打開的表現載體而組成需要的融合蛋白質。此載體命名為pADH2Hir_ins_glyA21，此融合蛋白的表現是根據專利申請案EP-A 1 364 032的例子3來進行， 20 並根據例6進行至Gly(A21)-微小前胰島素，並使用陽離子交換層析法來進行純化。如本發明例5，含有微小前胰島素部分的物質是用來製備Gly(A21)，Arg(B31)， Arg(B32)-NH2人類胰島素。 13 200817432 例子2 ··以麵包酵母菌直接分泌之Gly(A21)，Arg(B31)人類胰島素前驅物的基因序列。描述於 EP-A 1 364 032 之例子 7 的 pADH2Hir_ins_glyA21質體DNA，被用來製備直接分泌 5 Gly(A21)，Arg(B31)人類胰島素之載體。下述之引子被合成： # alpha_insfl 5，-TTTTTTGGATCCTTTGGAATAAAAGATTTGTTAACC 10 AACACTTGTGTG-3,（SEQ ID NO·: 2) 其涵盍編碼alpha因子之C端的序列，Lys-Arg以及微小前胰島素序列N端的基因編碼。 15 ins—gly—rev2 5’ - TTTTTTCCAT GGGTCGCTAT CAGCCACAGT AGTTTTCCAG CTGG -3’（SEQ ID NO·: 3) 此引子能與胰島素類似物序列的3,端雜交，將其選殖 20 入質體pADH2Hir—ins—glyA2卜使用PCR(標準條件）產生一段DNA序列，經過限制酶尺卩“與Kc〇I的切割作用，嵌入對應解開的表現載體而組成需要的融合蛋白質。在酵母菌株Y79之勝任細胞進行轉型作用，轉型物接著由上述專利申請案之例子7的描述來表現。 14 200817432

Gly(A21) ’ Arg(B31)-微小前胰島素根據 EP-A 0 347 781的例子9進行濃縮，經胰蛋白酶的切割之後，使用陽離子交換樹脂層析純化。如本發明例5，含有微小前胰島素部分的物質是用於製備Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32) 人類胰島素。例子3 ·酵母（pichia pastoris)分泌之水蛭素_Gly(A21)， Arg(B31)人類胰島素融合蛋白的基因序列。表現載體選殖的發生與專利申請案EP-A 1 364 032 類似。不疋使用序列引子pichia_H_Irev2，在這個案例中，是由引子ins—gly—rev2來建構及以後可利用PCR產物來表現Gly(A21)人類胰島素： 5’_TTTTTGGCGCCGAATTCACTACTATTAGCCACAGTA 15 GTTTTCCAGCTGG - 3f (SEQ ID NO.:4) % 所產生的質體被命名為pPich_Hir_ins-GlyA21，純化 Gly(A21)，Arg(B31)•微小前胰島素作為起始物，並根據上述描述來進行。 20 例子4 :酵母（pichia pastoris)直接分泌之Gly(A21)， Arg(B31)前驅物的基因序列。

適合的表現載體的建構與專利申請案EP-A 1 364 032 的例子 7 類似，質體 pPich—Hir_ins-GlyA21 之 DNA 15 200817432 以及兩段引子 pich_insgly_dirf 以及 pich一insgly—dirrev 是被需要的。 pich_insgly_dirf

5 5，-TTTTTTCTCGAGAAAAGATTTGTTAACCAACACTIGI GTG_3,（SEQ ID NO·: 5) f pich」nsgly_dirrev 5，-TTTITT GGCGCCGAATTCACTACTATTAGCCAC-3, 10 (SEQ ID NO.: 6) 純化Gly(A21)，Arg(B31)-微小前胰島素作為起始物的方法如上所述。例子5 ··由Gly(A21)，Arg(B31)人類胰島素前驅物與精胺醯胺偶合來製備 Gly(A21)，Arg(B31)， Arg(B32)-NH2-人類胰島素。將例子1-4已製備好的1〇〇毫克的Gly(A21)，Arg(B31) 人類騰島素>谷解於0·95宅升精胺酿胺溶液(446克/升），並加入0.13毫升醋酸鈉緩衝液(ρΗ5·8)及2毫升二曱基曱醯胺，將反應混合物冷卻至12°C，並加入0.094毫升胰蛋白酶(0·075毫克，羅氏診斷）開始反應。經8小時後’加入三氟乙酸至pH值2.5來進行反應的終止，並以HPLC來分析。有大於6〇%之Gly(A21)， 16 200817432

Arg(B31)，Arg(B32)人類胰島素形成，加入與US 5,656,722 相似的胰蛋白酶抑制劑溶液來純化經醯胺化的類似物（甘精胰島素醯胺）。 5 例6:麵包酵母菌直接分泌之Lys(B31)前驅物的基因序列。兩條引子被合成並被用來引發出序列Ala(B30)， Ala(Cl)，Lys(C2): a29—a30一k31f

10 5丨-GTTTCTICTACACTCCAAAGGCGGCTAAAGGTATCG TTGAACAATGTTG-3，(SEQ ID NO·: 7) 以及 a29__a30—k3 lrev 5f-CAACATTGTT CAACGATACC TTTAGCCGCC 15 TTTGGAGTGT AGAAGAAAC -3f (SEQ ID NO·: 8) 弓j 子 alpha_insfl 5’-TTITTIGGATCCTTIGGAATAAAAGATTTGTTAACCA ACACTTGIGTG-3,（SEQ ID NO·: 9) 20 涵蓋alpha因子C端之序列，Lys-Arg密碼子，以及微小前胰島素N端之序列。專利申請案W0 02/070722A1例子 1中質體pADH2Hirjns之DNA作為兩個聚合酶連鎖反應的模板。在反應1中，使用引子a29_a30_k31f以及 17 200817432 insncolrev (SEQ ID NO.: 6 來自 WO 02/070722A1)，而反應2中，則是使用a29^a30_k31re以及alpha_insfl，執行標準反應並純化產生之DNA片段，將兩產物合併後，便成為反應3的模板，以insncolrev及W0 02/070722A1 5 之SEQ ID NO.·· 6為引子。所產生之PCR產物如例子8 所描述的方式選殖並表現。產物為Ala(B31)，Ala(Cl)， Lys(C 1 )-miniproinsulin，乃是以賴胺酿肽鏈内切酶（lysyl , endopeptidase)裂解 B(l-29)-A (1-21)胰島素所轉變成，並當作目標蛋白質之中間產物。 10 例7 :以賴胺醯肽鏈内切酶與Thr_Arg(Boc)_Arg(Boc)-NH2 進行反應胰島素前驅物以DE3844211描述之方式，以賴胺醯肽鏈内切酶(LEP)及胰蛋白酶進行反應並純化（例1)。為此 15 目的，將10毫克的胰島素前趨物溶解於Tris緩衝液 (ρΗ8·0)，並加入來自 Lysobacter enzymogenes 的 LEP(0.01 V 毫升，1毫克/毫升濃度，溶於水中，Merckbiosciences)。在室溫中培養2小時，並以RP-HPLC (Nucleosil 120-5管柱）進行純化。Gly(A21)B(l-29)-A(l-20)分裂胰島素前驅 20 物與根據 DE3844211 的 Thr-Arg(Boc)-Arg(Boc)-NH2 進行反應。為此目的，將10毫克desThr-胰島素前驅物溶於 0.25毫升10莫耳濃度醋酸中，加入0.7毫升溶於 DMSO/l，3- 丁二醇（1:1)之 1·5 莫耳濃度 Thr-Arg(Boc)-Arg(Boc)-NH2,然後是 0.15 毫升 LEP(15 毫 18 200817432 克/毫升，溶於水），此混合物在室溫培養2小時，蛋白質隨後以甲醇/曱基第三丁基醚(v/v= 1:4)沉澱並乾燥，保護基隨後以1莫耳濃度鹽酸/醋酸移除及培養於0°C下。 5 例8 :低血糖對甘精胰島素醯胺的影響對低血糖的影響以健康雄性小獵犬進行研究，以0.3 IU/體重（公斤）的劑量進行皮下注射，在控制組中，狗被處理相同劑量的甘精胰島素，而其他組被注射無胰島素之安慰劑，注射後頭兩小時，每半小時，取每隻動物的血進行 10 血糖濃度檢測，而隨後每一小時取一次，持續八小時，此顯示甘精胰島素醯胺與甘精胰島素延遲時間/影響的趨勢曲線，但醯胺之曲線明顯較具優勢，因為在反應起始時，血糖濃度的下降沒有到明顯的低點（最低點），此結果描述於圖1中。 15 19 200817432 序列列表 <110> Sanofi-Aventis Deutschland GmbH <120>經醯胺化之甘精胰島素 5 <130> DE2006/026 <140> 10 2006 031 962.1 <141> 2006-07-11 <160> 9 <170>專利版本3.3 10 <210> 1 <211>45 <212> DNA <213〉人工的 <220> 15 <223> 引子 ins—gly—a21—rev <400> 1 45

ttttttccat gggtcgacta tcagccacag tagttttcca gctgg <210> 2 <211>48 20 <212〉DNA <213>人工的 <220> <223〉引子 alpha—insfl <400> 2 20 200817432 ttttttggat cctttggaat aaaagatttg ttaaccaaca cttgtgtg 48 <210> 3 <211>44 <212> DNA 5 <213〉人工的 <220> <223> 引子 ins—gly—rev2 <400> 3 ttttttccat gggtcgctat cagccacagt agttttccag ctgg 44 10 <210〉 4 <211> 49 <212> DNA <213>人工的 <220> 15 <223〉引子 ins—gly—rev2 <400> 4 / % A ^ tttttggcgc cgaattcact actattagcc acagtagttt tccagctgg 49 <210> 5 <211>40

20 <212〉DNA <213〉人工的 <220> <223〉引子 pich—insgly—dirf <400> 5 21 200817432 ttttttctcg agaaaagatt tgttaaccaa cacttgtgtg 40 <211> 33 <212> DNA <213〉人工的 5 <220〉 <223> 弓j 子 pich_insgly一dirrev <400> 6 ttttttggcg ccgaattcac tactattagc cac 33 <210> 7 10 <211>49 <212> DNA <213>人工的 <220> <223〉引子 a29__a30_k31f 15 <400> 7 gtttcttcta cactccaaag gcggctaaag gtatcgttga acaatgttg 49 <210> 8 <211>49 <212> DNA 20 <213〉人工的 <220> <223〉引子 a29__a30_k31rev <400> 8 caacattgtt caacgatacc tttagccgcc tttggagtgt agaagaaac 49 22 200817432 <210> 9 <211> 48 <212> DNA <213>人工的 5 <220> <223〉引子 alpha—insfl <400> 9 48 ttttttggat cctttggaat aaaagatttg ttaaccaaca cttgtgtg 23 200817432 【圖式簡單說明】圖1:各類胰島素類似物對狗的降糖作用，RR-COOH= 甘精肤島素;RR-NH2=甘精姨島素酿胺。【主要元件符號說明】無 24

Claims

200817432 十、申請專利範圍： 1· 一種經醯胺化之甘精胰島素。 2·根據申請專利範圍第1項所述之經醯胺化之甘精胰島素’其係以 Gly(A21)，Arg(B31)，Arg-NH2(B32)人類胰 5 島素（甘精胰島素醯胺）之型式。 3· —種製備根據申請專利範圍第1或2項之經醯胺化之甘精騰島素之方法。 4·根據申請專利範圍第3項之製備申請專利範圍第2項之甘精胰島素酿胺之方法，其中甘精胰島素酸胺的前驅物 10 Gly(A21)、Ar§ (B31)的人類胰島素之形式被重組製備，在具有胰蛋白酶活性的酵素存在下，與精胺醯胺 (argmmamide)的偶合發生，隨後將甘精胰島素醯胺單離。 5· —種根據權利要求第丨項之甘精胰島素醯胺的用途，其係用於製備用以治療糖尿病之醫藥品。 15 6.根據中請專利範圍第5項之用途，其中甘精胰島素酸胺係用於製備用以治療第I型或第Η型糖尿病之醫藥品。 ‘ 7. 一種藥物，其包含甘精胰島素醯胺。 8. 根據巾請專利範圍第7項之藥物，其係以水性調配物呈現。 9. 根據申請專利範圍第7項之藥物，其係以粉末呈現。 20 10.根據=請專利範圍第8項之藥物，其中甘精騰島素酸胺係以各解狀態，結晶狀態和/或非結晶狀態存在。 11.，據巾請專利範圍第8項之藥物，其額外的包含一種或多種exendin-4衍生物或胜肽，其特徵在於其相較於 GLP-1(類胰高|糖激素_ι)之活性。 25