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DE10108100A1 - Verwendung supersekretierbarer Peptide in Verfahren zu deren Herstellung und paralleler Verbesserung der Exportate eines oder mehrerer anderer Polypeptide von Interesse - Google Patents

Verwendung supersekretierbarer Peptide in Verfahren zu deren Herstellung und paralleler Verbesserung der Exportate eines oder mehrerer anderer Polypeptide von Interesse

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Publication number
DE10108100A1
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Authority
DE
Germany
Prior art keywords
protein
codon
dna sequence
hirudin
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE10108100A
Other languages
English (en)
Inventor
Paul Habermann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Original Assignee
Aventis Pharma Deutschland GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pharma Deutschland GmbH filed Critical Aventis Pharma Deutschland GmbH
Priority to DE10108100A priority Critical patent/DE10108100A1/de
Priority to PE2002000083A priority patent/PE20020875A1/es
Priority to JP2002566335A priority patent/JP4243103B2/ja
Priority to IL15741502A priority patent/IL157415A0/xx
Priority to CN02806848A priority patent/CN100575493C/zh
Priority to PCT/EP2002/001306 priority patent/WO2002066628A2/en
Priority to NZ527641A priority patent/NZ527641A/en
Priority to HK04108554.7A priority patent/HK1065818B/xx
Priority to MXPA03007115A priority patent/MXPA03007115A/es
Priority to AU2002247696A priority patent/AU2002247696B2/en
Priority to BR0207385-4A priority patent/BR0207385A/pt
Priority to PT02716745T priority patent/PT1364030E/pt
Priority to ES02716745T priority patent/ES2258619T3/es
Priority to KR1020037010738A priority patent/KR100858008B1/ko
Priority to AT02716745T priority patent/ATE320498T1/de
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Priority to DK02716745T priority patent/DK1364030T3/da
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Priority to EP02716745A priority patent/EP1364030B1/de
Priority to US10/076,631 priority patent/US7638618B2/en
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Priority to NO20033671A priority patent/NO331375B1/no
Priority to CY20061100751T priority patent/CY1105696T1/el
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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf eine Expressionskassette der Form P¶x¶-S¶x¶-B¶n¶-(ZR)-Transportpeptid-(Z¶1¶Z¶2¶)-Protein(Y)-(Z¶1¶Z¶2¶)-Protein DOLLAR A (Y¶m¶)-T; wobei die Expressionskassette dadurch gekennzeichnet ist, daß sie für den Transportpeptid kodiert, das über eine Sequenz Z¶1¶Z¶2¶ mit einem zweiten Protein verbunden ist, das wiederum über Z¶1¶Z¶2¶ mit einem Protein Y1, das entweder Y entspricht oder von Y verschieden sein kann, verbunden ist und das Transportpeptid die Sekretionsrate von Y bzw. Y¶m¶ verbessert, wobei P¶x¶ einer beliebigen Promotor-DNA-Sequenz, die so ausgewählt wird, das optimale Ausbeuten an Wertprotein erzielbar werden; Sx einer beliebigen DNA, die entsprechend eine beliebige Signal- bzw. Leadersequenz, die optimale Ausbeuten erlaubt, kodiert; B¶n¶ 1-15 genetisch kodierbaren Aminosäuren oder einer chemischen Bindung; Z dem Codon einer Aminosäure ausgewählt aus Lys bzw. Arg; Z¶1¶ dem Codon einer Aminosäure ausgewählt aus Lys bzw. Arg; Z¶2¶ dem Codon einer Aminosäure ausgewählt aus Lys bzw. Arg; Y¶m¶ einer DNA-Sequenz, die ein beliebiges in Hefe herstellbares und sekretierbares Protein kodiert (M = 1-5) bzw. einer chemischen Bindung (m = 0); R einem Codon für Arginin; Transportpeptid einer DNA-Sequenz, die ein effizient transportierbares und membrangängiges Peptid kodiert; Protein Y einer DNA-Seuquenz, die ein beliebiges in Hefe herstellbares und sekretierbares Protein kodiert und dessen biologische Aktivität dann, wenn Y¶m¶ von einer chemischen ...

Description

Verfahren zur Herstellung pharmazeutisch relevanter Proteine müssen unter dem Aspekt der Wirtschaftlichkeit zu biologisch aktiven möglichst reinen Produkten führen. Die Expression solch relevanter Proteine in Hefen findet dabei breite Anwendung. Die Herstellung von Proteinen wie Insulin, GM-CSF (Leukine ®) und Hirudin (Refludan®) sind Beispiele für die erfolgreiche Entwicklung gentechnischer Verfahren, die die Synthese des jeweiligen Proteins oder Vorläufern davon in Hefe als Grundlage haben. Besonders Hirudine lassen sich allgemein durch Hefen mit guten Ausbeuten, die bei Verwendung von Hansenula polymorpha (Weydemann et al., Appl. Microbiol Biotechnol. 44: 377-385, 1995) oder Pichia pastoris (Rosenfeld et. al., Protein Expr. Purif: 4, 476-82, 1996) sich im Grammaßstab bewegen, direkt synthetisieren.
EP-A 0 324 712 beschreibt das Hirudinderivat (Refludan®), das N-terminal die Aminosäure Leucin trägt und dessen konstitutive Expression in dem Saccharomyces cerevisiae Stamm Y79. EP-A 0 347 781 beschreibt ein Miniproinsulin und beispielhaft dessen Expression in Bäckerhefe. Zur Herstellung von Refludan® und Insulin werden zwei voneinander getrennte Expressionen durchgeführt.
Es wurde nun gefunden, daß sich Hirudinderivate und Miniproinsulinderivate aus einem gemeinsamen Vorläuferprotein gewinnen lassen, wenn man das Vorläuferprotein an eine Signal bzw. Leader-Sequenz, die von Hefen als Sekretionssignal erkannt wird, über ein basisches Dipeptid bevorzugt Lys-Arg fusioniert und zwischen dem N-terminal angeordneten Hirudinderivat und dem Miniproinsulinderivat ebenfalls eine Spaltstelle einführt, die von einer Endoprotease der Hefe erkannt wird. Bevorzugt ist auch hier ein di-basisches Peptid z. B. Lys- Arg. Nach Expression findet man im Überstand ein um Lys-Arg verlängertes Hirdinderivat und das mit der ersten Aminosäure einer Insulin-B-Kette beginnende Miniproinsulinderivat. Überraschend wurde dabei gefunden, daß sich die Ausbeute an Miniproinsulin deutlich gegenüber der mit der direkten Signal-Miniproinsulin Expression erzielbaren Ausbeute verbessert, während die Ausbeute an dem Hirudinderivat nahezu gleich bleibt. Überraschend wirkt also Hirudin als eine Art "Enhancerpeptid" bezüglich der Ausbeute an Miniproinsulin.
Als Enhancerprotein können allgemein solche Peptide wirken, die relativ klein sind und natürlich in kurzer Zeit in großen Mengen z. B. aus Drüsengewebe ausgeschieden werden. Solche Peptide zu denen z. B. Schlangengifte oder Eglin C oder TAP (Tick antikoagulant peptide) zu zählen sind, zeichnen sich durch extrem gute Exportkompatibilität aus. Solche Proteine sind auch Gegenstand der Erfindung.
Ein weiterer Vorteil kann sich ergeben, wenn das Hirudinderivat gegenüber dem in Arzneimittel bereits verwendeten Hirudin pharmazeutisch gleiche oder bessere Eigenschaften aufweist. Dann eröffnet sich die Möglichkeit, aus ein und derselben Fermentation zwei oder sogar mehrere Arzneimittel herzustellen. Als Folge wird weniger Fermentationsbetriebskapazität benötigt. Dies wirkt sich direkt positiv auf die Herstellkosten aus.
Die Herstellung von mehreren Produkten ist aber optional. Der Mengenbedarf an Refludan ist z. B. geringer als der für Insulin, so daß man auch zu Verfahren gelangt, bei denen einer der pharmazeutisch interessanten Stoffen verworfen wird.
Zur Verbesserung der Ausbeute kann wie in der Patentanmeldung EP-A 0 200 655 vorgeschlagen eine kurze Peptidsequenz über Lys-Arg dem Hirudinderivat N- terminal als Brückenglied zur Signal- bzw. Leadersequenz vorgeschaltet sein. Auch ist dem Fachmann klar, daß die Wahl der Signal- bzw. Leadersequenz einen direkten Einfluß auf die Ausbeute an Wertprotein hat. Die Auswahl einer solchen Sequenz ist Gegenstand weiterer Optimierungen. Auch hat die am 3'-Ende der Expressionskassette gelegene Sequenz über die Beeinflussung der mRNA-Stabilität direkten Einfluß auf die Ausbeute. Auch hierzu ist dem Fachmann klar, daß diese Sequenz auf das jeweils zu exprimierende Wertprotein maßgeschneidert werden kann. Dies gilt auch für die Wahl eines geeigneten Promotors. Dieser kann induzierbar oder konstitutiv aktiv sein. Die Wahl des Vektorsystemes und des Wirtssystemes ist genauso bedeutsam für die Ausbeute. So können anstelle der beispielhaft verwendeten Bäckerhefe auch die Hefen Pichia pastoris, Hansenula polymorpha oder K. lactis mit den jeweils auf die unterschiedliche Physiologie maßgeschneiderten Vektor bzw. Expressionskassetten eingesetzt werden.
Der Vorteil von Verfahren, die die Sekretion in das Medium erlauben, liegt auch in der leichteren proteinchemischen Aufarbeitung des Wertproteins. Überraschend wurde dabei gefunden, daß Miniproinsulin durch Filtration durch Membranen mit einer Ausschlußgrenze von Molekülen mit einem Molekulargewicht größer 10 Kd in Gegenwart von Hirudin angereichert werden kann. Die Moleküle werden dabei fast ausschließlich im Retentat gefunden. Es ist dem Fachmann klar, daß Verfahren zur Reinigung stets durch die Entwicklung neuer Trennmethoden und durch neue Kombination von Verfahrensschritten verbessert werden können. Dies wirkt sich direkt positiv auf die Ausbeute und damit auf die Herstellkosten aus.
Gegenstand der Erfindung ist also eine Expressionskassette der Form:
Px-Sx-Bn-(ZR)-Transportpeptid-(Z1Z2)-Protein(Y)-(Z1 Z2)Protein(Ym)-T; wobei die Expressionskassette dadurch gekennzeichnet ist, daß sie für ein Transportpeptid kodiert, das über eine Sequenz Z1Z2 mit einem zweiten Protein verbunden ist, das wiederum über Z1Z2 mit einem Protein Y1, das entweder Y entspricht oder von Y verschieden sein kann verbunden ist und das Transportpeptid die Sekretionsrate von Y bzw. Ym verbessert. Dabei gilt:
Px entspricht einer beliebigen Promotor-DNA-Sequenz, die so ausgewählt wird, das optimale Ausbeuten an Wertprotein erzielbar werden;
Sx entspricht einer beliebigen DNA die entsprechend eine beliebige Signal bzw. Leadersequenz, die optimale Ausbeuten erlaubt, kodiert;
Bn entspricht 1-15 genetisch kodierten Aminosäuren oder einer chemischen Bindung;
Z entspricht dem Codon einer Aminosäure ausgewählt aus Lys bzw. Arg;
Z1 entspricht dem Codon einer Aminosäure ausgewählt aus Lys bzw. Arg;
Z2 entspricht dem Codon einer Aminosäure ausgewählt aus Lys bzw. Arg;
R entspricht einem Codon für Arg;
Transportpeptid entspricht einer DNA-Sequenz, die ein effizient transprotierbares und membrangängiges Peptid kodiert wie z. B. Hirudin oder ein Derivat des Hirudin;
Protein Y entspricht einer DNA-Sequenz, die ein beliebiges in Hefe herstellbares und sekretierbares Protein kodiert;
Protein Ym entspricht einer DNA-Sequenz, die ein beliebiges in Hefe herstellbares und sekretierbares Protein kodiert (m = 1-5) bzw. eine chemischen Bindung (m = 0) entspricht;
T entspricht einer nicht translatierten DNA-Sequenz, die sich vorteilhaft auf die Expression auswirkt.
Bevorzugt als Protein Y sind Polypeptide wie Proinsulinderivate, Interleukine oder Lymphokine bzw. Interferone.
Blutegel vom Typ Hirudo entwickelten z. B. verschiedene Isoformen des Thrombinhibitors Hirudin. Durch künstliche Variation des Moleküls, z. B. Austausch der N-terminalen Aminosäure, wurde Hirudin für pharmazeutisch technische Anforderungen optimiert (z. B. EP 0 324 712). Die Erfindung beinhaltet die Verwendung von Hirudin und Hirudinvarianten. In besonderen Ausführungsformen der Erfindung wird eine der natürlichen Isoformen des Hirudins (die natürlichen Isoformen werden zusammen als "Hirudin" bezeichnet) verwendet. Eine natürliche Isoform ist z. B. Val-Val-Hirudin oder Ile-Thr-Hirudin. In anderen Ausführungsformen der Erfindung wird eine Variante einer natürlichen Hirudin Isoform eingesetzt. Eine Variante leitet sich von einer natürlichen Isoform des Hirudins ab, enthält aber z. B. zusätzliche Aminosäuren und/oder Aminosäuredeletionen und/oder Aminosäureaustausche im Vergleich zu der natürlichen Isoform. Eine Variante von Hirudin kann alternierend Peptidabschnitte natürlicher Isoformen des Hirudins und neue Aminosäuren enthalten. Varianten des Hirudins sind bekannt und z. B. in DE 34 30 556 beschrieben. Varianten des Hirudins sind als Protein kommerziell erhältlich (Firma Calbiochem Biochemicals (Cat.no. 377-853, 950-960). Als Hirudinderivat werden Sequenzen bezeichnet die mindestens 40% Homologie zu natürlichem Hirudin aufweisen.
Die Expressionskassette wird vorzugsweise in Hefen wie S. cerevisiae, K. lactis, H. polymorpha oder P. pastoris eingeführt. Dabei kann sie stabil in einer oder mehren Kopien in das jeweilige Hefegenom integriert sein oder extrachromosomal auf einem "Multi-copy vector" vorliegen. Es ist dem Fachmann klar, daß sich dies auch auf andere Systeme wie animale Zellkultur oder Pflanzenzellen übertragen läßt. Dies ist auch Gegenstand der Erfindung.
Das im folgenden beschriebene Expressionssystem dient dafür als Beispiel. Es ist dem Fachmann klar, daß, um die Expressionskassette in dieses ausgewählte System einzuführen, je nach Art des ausgewählten Wirtssystems die entsprechenden Konstruktionen rekombinanter DNA vorzunehmen sind. Entsprechend kann die großtechnische Fermentation im Hinblick auf das ausgewählte Wirts/Vektorsystem optimiert werden. Demgemäß wirken die Beispiele nicht beschränkend.
Beispiel 1 Konstruktion eines Hefeexpressionsplasmides das Hirudin (Refludan)- LyArg-Miniproinsulin kodiert
Ausgangsmaterialien sind die Plasmide pK152 (PCT/EP00/08537), pSW3 (EP-A 0 347 781) und das Derivat des rekombinanten Hefeplasmides, das für Rinderinterleukin 2 kodiert (Price et al., Gene 55, 1987). Das Hefeplasmid zeichnet sich dadurch aus, daß es die α-Faktor Leader Sequenz unter Kontrolle des Hefe- ADH2-Promotors steht. Angeschlossen über eine KpnI- Restriktionsenzymerkennungsstelle findet sich die cDNA-Sequenz für Rinderinterleukin 2, die im nicht translatierten 3'-Ende nach Manipulation eine für den Vektor singuläre Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym NcoI enthält. Somit kann die cDNA Sequenz über KpnI/NcoI-Spaltung leicht aus dem Plasmid entfernt werden. Da gute Expressionsausbeuten beschrieben werden, kann man davon ausgehen, daß die verbleibende 3'-Interleukin 2 Sequenz stabilisierend (als T) auf die mRNA wirkt und somit nicht ausgetauscht werden muß. Das Plasmid pK152 trägt die DNA Sequenz, die für Leu-Hirudin (Refludan) kodiert und das Plasmid pSW3 trägt die DNA-Sequenz für Miniproinsulin. Die Gensequenz, die Hirudin-Lys-Arg-Miniproinsulin kodieren soll, wird zunächst mittels PCR- Technologie hergestellt. Dazu werden 4 Primer mit Hilfe des Expedite™ DNA- Synthese-Systems hergestellt:
  • a) hir_insfkr (SEQ ID NO: 1, kodierter Proteinabschnitt: SEQ ID NO: 2)
  • b) hir_insrevkr (SEQ ID NO: 3)
  • c) hirf1 (SEQ ID NO: 4, kodierter Proteinabschnitt: SEQ ID NO: 5)
  • d) insnco1rev (SEQ ID NO: 6)
Primer hir_insfkr beschreibt den Übergang der Codone für die letzten Aminosäuren des Hirudin (59-65) über das Brückenglied Lys-Arg zu der Inulinsequenz B1-B7. Primer hir_insrevkr ist dazu 100% komplementär. Primer hrif1 kodiert für den Anfang des Hirudingens verlängert bis zu der KpnI-Schnittstelle wie in EP-A 0 324 712 beschrieben. Primer insncoirev markiert das 3'- Ende des synthetischen Mini- Proinsulins gemäß EP-A 0 347 781. Zwei Standard Polymerase Kettenreaktionen werden mit den Primerpaaren hirf1/hir_insrevkr mit DNA des Plasmides pK152 als Matrize und hir_insfkr/insncoirev mit DNA des Plasmides pSW3 als Matrize durchgeführt. Die Reaktionen werden in 100 µl PCR-Puffer mit jeweils 200 nMol Primer und 1 µl Polymerase und 100 ng Vektor durchgeführt. Schritt 1 besteht aus einer 2-minütigen Inkubation bei 95°C. Dann folgen 25 Zyklen der Form 30" bei 95°C, 30" bei 55°C und 30" bei 72°C. Nach dem letzten Zyklus wird 3 Minuten bei 72°C inkubiert und anschließend die Reaktion gestoppt.
Da die Primer hir_insrevkr und hir_insfkr zu 100% komplementär sind, überlappen die DNA-Produkte der beiden Produkte entsprechend dieser Sequenz, so daß in einer dritten Reaktion mit den Produkten aus den beiden ersten Reaktionen als Matrize und den Primer hirf1 und insncoirev ein DNA-Fragment bildet, das Hirudin und Miniproinsulin getrennt durch LysArg kodiert. Das PCR-Fragment wird mit den Enzymen KpnI und NcoI verdaut und anschließend in den KpnI/NcoI geöffneten Vektor pαADH2 in einer T4-Ligasereaktion eingesetzt. In Analogie zu Beispiel 7 aus EP-A 0 347 781 werden anschließend kompetente Zellen des E. coli Stammes MM294 mit dem Ligationsgemisch transformiert. Zur Charakterisierung mittels DNA- Sequenzanalyse wird anschließend aus zwei Klonen Plasmid-DNA isoliert. Nach Bestätigung der insertierten DNA-Sequenz wird DNA einer Plasmidpräparation dazu verwendet entsprechend dem genannten Beispiel, Zellen des Bäckerhefestammes Y79 zu transformiert. Zum Unterschied wird aber bei Verwendung des pαADH2 Vektors auf Komplementation der trp1-1 Mutation nach Einführung des Vektors selektioniert. Zur erneuten Kontrolle wird aus Hefetransformanten Plasmid DNA reisoliert und mittels Restriktionsanalyse analysiert. Der konstruierte Expressionsvektor erhält die Bezeichnung pADH2Hir_KR_Ins. Die Expression erfolgt gemäß Beispiel 4.
Beispiel 2
Konstruktion eines Hefeexpressionsplasmides das Hirudin (Refludan)- LysArg-Insulin - B Kette-LysArg - Insulin A-Kette kodiert
In der Patentanmeldungsschrift EP-A 0 195 691 werden Proinsulinderivate beschrieben, die αls Bindeglied zwischen B und A-Kette des Insulins das Di-Peptid XY, mit X oder Y entspricht jeweils Lys oder Arg tragen können. Das folgende Beispiel beschreibt die Herstellung eines Expressionsvektors für solche Proinsulinderivate. Beispielhaft ausgewählt und entsprechend synthetisiert wird eine DNA-Sequenz, die für ein Proinsulinderivat der Form B-LysArg-A-Kette kodiert.
Die Synthese des Genabschnittes erfolgt entsprechend Beispiel 1. Verwendet werden die Oligonukleotidsequenzen hirf1 und insncoirev. Neu synthetisiert werden die Oligonukleotide B_KR_Af1 und B_KR_Arev1.
B_KR_Af1 hat die Sequenz (SEQ ID NO: 7)
und B_KR_Arev1 die Sequenz (SEQ ID NO: 8)
Der fett gedruckte Teil der beiden dargestellten Primer markiert die sich partiell überlappende Sequenz. Beide Primer paaren bis auf die unterstrichenen 6 Nukleotide exakt mit der Sequenz des Miniproinsulingens aus EP-A 0 347 781. Der unterstrichene Teil entspricht den Kodonen für Lys und Arg. DNA des gemäß Beispiel 1 konstruierten Plasmides pADH2Hir_KR_Ins dient als Matrize für die PCR.
Wie in Beispiel 1 beschrieben werden zwei Polymerase Kettenreaktionen mit den Primerpaaren hirf1/B_KR_Arev und insncoirev/B_KR_Af1 durchgeführt. Als Matrize dient jeweils DNA des in Beispiel 1 konstruierten Plasmides pADH2Hir_KR_Ins. Die Produkte beider Reaktionen dienen in einer dritten PCR mit dem Primerpaar hirf1 und insnco1 als Matrize. Das Reaktionsprodukt aus PCR 3 wird mit NcoI/SalI gespalten und in den geöffneten Vektor pαADH2 eingesetzt. Nach Sequenz- und Restriktionsanalyse erhält das richtige Plasmid die Bezeichnung pADHHirKR_B_KR_A.
Beispiel 3 Konstruktion eines Hefeplasmides, das für Hirudin-LysArg- Affenproinsulin kodiert
Die Patentanmeldung EP-A 489 780 beschreibt ein Plasmid plNT90d, das cDNA des Affenproinsulins (Wetekam et al., Gene 19, p.179-183, 1982) enthält. DNA dieses Plasmides und DNA des Plasmides pK152 dienen als Matrize. Verwendet wird der in Beispiel 1 beschriebene Primer hirf1. Drei weitere Primer werden synthetisiert.
Primer insncorev bindet revers an die 3'Region des in plNT90d klonierten Insulingens. Er hat die Sequenz:
Die unterstrichene Sequenz markiert die Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym NcoI.
Primer hir_insfkr hat die Sequenz:
Die fettgedruckten Nukleotide beschreiben dabei das LysArg Bindeglied zwischen Hirudin und Proinsulin.
Zu Primer hir_inskr vollständig komplementär ist der Primer hir_insrevkr mit der Sequenz:
Entsprechend Beispiel 1 werden zwei Polymerasekettenreaktionen durchgeführt. Das Primerpaar hirf1/hir_insrevkr wird mit DNA des Plasmides pK152 und das Primerpaar hir_insfkr/insncorev wird mit DNA des Plasmides plNT90d umgesetzt. Wie ins Beispiel 1 beschrieben dienen die Produkte beider Reaktionen in einer dritten PCR mit dem Primerpaar hirf1/insncorev als Matrize. Das DNA-Produkt dieser Reaktion umfaßt die Sequenz für Hirudin_LysArg_Proinsulin. Es wird mit den Enzymen NcoI und KpnI nachgespalten und entsprechend Beispiel 1 in das Plasmid pαADH2 eingesetzt.
Beispiel 4 Expression der rekombinanten Produkte
Die Expression gliedert sich in zwei Phasen. Zunächst wird eine Vorkultur in Hefeminimalmedium angezogen. Das Medium hat pro 1 L die Zusammensetzung:
6,7 g: Yeast Nitrogen Base (ohne Aminosäuren)
5,0 g: Casamino acids (frei von Vitamin)
0,008%: Adenin
0,008%: Uracil
2%: Glukose
Die Haupt- bzw. Expressionskultur wird mit einem Aliquot der Vorkultur beimpft.
Das Medium der Hauptkultur enthält pro Liter:
10 g: Yeast Extract
20 g: Peptone
0,008% Adenin 0,008%: Uracil
4%: Glukose
Unter Verwendung der beschriebenen Medien wird die Expression im Schüttelkolben so durchgeführt, daß 0,3 ml einer Vorkultur, die über Nacht angezogen wurde, mit 80 ml vorgewärmtes Medium verdünnt wird und ca. 24 h unter starkem schütteln bei 30°C inkubiert wird. Je 1 ml der so entstandenen Kultur wird dann nach Bestimmung der optischen Dichte zentrifugiert und der Überstand nach Abtrennen der Zellen lyophilisiert und mittels SDS-PAGE analysiert. Zur Bestimmung des Gehaltes an biologisch aktivem Hirudin wird ein Trombinhemmtest durchgeführt.
Ein alternatives Fermentationsprotokoll sieht das Abtrennen der Zellen durch Filtration oder vorsichtige Zentrifugation vor. Während aus dem Medium Wertprotein isoliert wird, werden die Zellen mit frischem vorgewärmten Mediumder Hauptkultur, das als Kohlenstoffquelle Alkohol und maximal bis 0,5% Glukose enthält, versorgt und so die Fermentation kontinuierlich weitergeführt. Dieser Schritt kann bis zu 5 mal wiederholt werden.
Beispiel 5 Thrombinhemmtest
Die Bestimmung der Hirudinkonzentration wird entsprechend der Methode von Grießbach et al. (Thrombosis Research 37, 347-350, 1985) durchgeführt. Dazu werden definierte Mengen eines Refludanstandards zur Erstellung einer Eichkurve in die Meßreihe mit einbezogen. Damit kann die Ausbeute direkt in mg/l angegeben werden.
Beispiel 6 Klonierung und Expression des Hirudin-Lys Arg-Miniproinsulin- Fusionsproteins im P. pastoris-System
Die Firma Invitrogen vertreibt kommerziell einen Klonierungs und Expressionskit zur Herstellung rekombinanter Proteine mit P. pastoris als Wirtssystem System. Dabei wird ein genaues Arbeits- bzw. Technikprotokoll bzgl. der Herstellung und anschließenden Expression eines P. pastoris Systems zur Produktion eines gewünschten rekombinanten Proteins geliefert, so daß, wenn man diesen Protokollen folgt nur die Konstruktion des das gewünschte Protein kodierenden Expressionsvektors beschrieben werden muß. Verwendet wird der EasySelect™0 Pichia Expression Kit (Catalog No. K1740-01).
Bestandteil des Kits ist der Vektor pPICZαA. Öffnet man den Vektor mit den Restriktionsenzymen XhoI und SacII, so kann man eine Protein von Interesse ähnlich Beispiel 1 an die alpha-Faktor Leader Sequenz anschließen und auf Sekretion in den Überstand testen. Zur Klonierung werden zwei Primer benötigt. Primer pichia_H_If1 (SEQ ID NO: 12) hat die Sequenz:
Primer pichia_H_Irev2 (SEQ ID NO: 13) hat die Sequenz:
Als Matrize verwendet man DNA des Plasmides pADH2Hir_KR_Ins. Führt man eine Standard PCR mit beiden Primer aus, so erhält man ein DNA-Produkt, daß die Sequenz Hirudin-Lys ARG-Miniproinsulin verlängert um die XhoI bzw. SacII Integrationsstelle enthält. Spaltet man das DNA-Produkt entsprechend und isoliert das Fragment, so kann es in einer T4-DNA Ligase Reaktion in die geöffnete Vektor-DNA eingesetzt werden. Abweichend vom Protokoll der Hersteller wird der in Beispiel 1 beschriebene E.coli Stamm MM294 mit dem Ligationsgemisch transformiert und auf Zeocin-Selektionsplatten rekombinante Kolonien gesucht. Plasmid DNA wird von Klonen reiosliert und anschließend mittels Restriktions- und DNA-Sequenzanalyse charakterisiert. Entsprechend der Angaben der Hersteller wird dann unter Verwendung des so konstruierten Plasmides ein P. pastoris Expressionsklon zur Produktion der Peptide hergestellt.
Beispiel 7 Reinigung von Miniproinsulin und Hirudin
Die Reinigung erfordert die Separation beider Proteine zu einem frühen Zeitpunkt. Am Ende der Expression wird das Medium mittels analytischer RP-HPLC analysiert. Beide Proteine Hirudin und Miniproinsulin werden bei einem pH von 2,5-3 im Gegensatz zu den meisten übrigen Polypeptiden, die sich im Überstand - sei es durch spontane Lyse von Hefezellen oder Sekretion - finden, nicht ausgefällt. Das Kulturmedium wird daher entsprechend angesäuert und anschließen nach Abschluß der Fällung, wird der Niederschlag und die Zellen abzentrifugiert. Nach Zentrifugation wird das Medium auf pH 3,5-7 eingestellt und die beiden Komponenten Hirudin und Miniproinsulin mittels hydrophober Interaktionschromatographie z. B. unter Verwendung einer mit Diaion HP20® Material gefüllten Chromatographiesäule voneinander getrennt. Aus den Hirudin bzw. Miniproinsulin haltigen Fraktionen kann dann Hirudin gemäß EP-A 0 549 915 bzw. Insulin gemäß EP-A 0 347 781 isoliert werden.
Beispiel 8 Herstellung von Insulin aus Miniproinsulin
Am Ende des Expressionsabschnittes wird das Kulturmedium auf pH 6,8 eingestellt und anschließend Trypsin eingerührt, so daß eine Endkonzentration von 4-8 mg pro Liter eingestellt wird. Nach Inkubation über ca. 4 Stunden wird die so behandelte Fermentationsbrühe auf pH 2,5-3 eingestellt. Nach 1-6 Stunden der Fällung wird das Präzipitat abgetrennt. Das entstandene Mono-Arg-Insulin wird anschließend über Ionentauscherchromatographie beispielhaft an S-Sepharose® in einem Puffer aus 50 mM Milchsäure und 30% Isopropanol (pH 3,5) isoliert. Die Elution erfolgt mittels eines NaCL-Gradienten von 0,05-0,5 M Salz. Die produkthaltigen Fraktionen werden 1 : 1 mit H2O und anschließend mit ZnCl2 versetzt, so daß eine 0,1%-ige ZnCl2 Lösung entsteht. Bei pH 6,8 fällt Mono-Arg-Insulin aus. Dies wird beispielhaft entsprechend EP-A 0 324 712 zu Insulin umgewandelt.
Beispiel 9 Herstellung von Insulin aus Miniproinsulin nach Filtration
Am Ende des Expresionsabschnittes werden Zellen und Überstandskomponenten nach Fällung bei pH 2,5 bis 3 abgetrennt. Anschließend erfolgt die Konzentration des Mediums über eine Filtration über Membranen mit einer Ausschlußgrenze von 10 kD. Miniproinsulin wird wie auch das Hirudinderivat quantitativ im Retentat gefunden und kann dann entsprechend Beispiel 8 zu Insulin prozessiert werden.

Claims (2)

1. Expressionskassette der Form:
Px-Sx-Bn-(ZR)-Transportpeptid-(Z1Z2)-Protein(Y)-(Z1Z2)-Protein(Ym)-T; wobei die Expressionskassette dadurch gekennzeichnet ist, daß sie für ein Transportpeptid kodiert, das über eine Sequenz Z1Z2 mit einem zweiten Protein verbunden ist, das wiederum über Z1Z2 mit einem Protein Y1, das entweder Y entspricht oder von Y verschieden sein kann verbunden ist und das Transportpeptid die Sekretionsrate von Y bzw. Ym verbessert, wobei
Px einer beliebigen Promotor-DNA-Sequenz, die so ausgewählt wird, das optimale Ausbeuten an Wertprotein erzielbar werden;
Sx einer beliebigen DNA, die entsprechend eine beliebige Signal bzw. Leadersequenz, die optimale Ausbeuten erlaubt, kodiert;
Bn 1-15 genetisch kodierbaren Aminosäuren oder einer chemischen Bindung;
Z dem Codon einer Aminosäure ausgewählt aus Lys bzw. Arg;
Z1 dem Codon einer Aminosäure ausgewählt aus Lys bzw. Arg;
Z2 dem Codon einer Aminosäure ausgewählt aus Lys bzw. Arg;
Ym einer DNA-Sequenz, die ein beliebiges in Hefe herstellbares und sekretierbares Protein kodiert (m = 1-5) bzw. einer chemischen Bindung (m = 0);
R einem Codon für Arginin;
Transportpeptid einer DNA-Sequenz, die ein effizient transportierbares und membrangängiges Peptid kodiert;
Protein Y einer DNA-Sequenz, die ein beliebiges in Hefe herstellbares und sekretierbares Protein kodiert und dessen biologische Aktivität dann, wenn Ym von einer chemischen Bindung verschieden ist, durch die Verlängerung um ein di- basisches Peptid nicht beeinträchtigt wird bzw. den Abbau der Verlängerung durch Carboxypeptidasen erlaubt;
T entspricht einer nicht translatierten DNA-Sequenz, die sich vorteilhaft auf die Expression auswirkt;
entspricht.
2. Expressionskassette gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Transportprotein Hirudin oder einem Derivat des Hirudins entspricht.
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