TW200800266A - Modulation of bone formation - Google Patents

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200800266 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域3 參考相關文件 本申請案係根據35 U.S· C· § 119(e)主張美國臨時專 5利申請案，2006年2月17日申請之USSN 60/774,534及2006 年9月13曰申請之USSN 60/884,239之權先權，該等臨時專 m 利申請案在此併入本案以為參考資料。 本發明係有關於骨形成之調節。 • 【先前技術】 !〇 發明背景 15 20 多年來骨關聯性病症及疾病之話題已獲得相當多的g 意。骨關聯性病症之特徵為由於骨質再吸收及骨形成間戈 失衡導致之骨質流失n中，骨胳的骨有恆定的重呢 復作用。在該重修復過程中，由料細胞產生之骨質再受 收與由成骨細胞產生之骨形成之間有微妙的平衡。涉及車 骨内骨化及膜时化之射細胞為骨組織之蚊細胞，^ 可製造能導致新骨形成之基質蛋白f。骨形成，亦即骨^ 成(osteogenesis)’對維持骨路中之骨質量是絕對必要的 不像成骨城，_細祕與骨質再魏及贿有關。知 常的骨中’藉成骨細胞媒介之骨形成與藉料細胞媒介之$ 質再吸Μ之平㈣經由㈣㈣節性交互相而维持。 有許多與骨㈣統有關之缺乏症、疾病，及病症。j 中一些之實例包括’但不限於：骨質疏鬆症、骨癌、關a 炎、佝僂症、骨折、牙周病1分段缺陷、溶骨性骨疾 5 200800266 原發性及繼發性副甲狀腺機能亢進、潘吉德氏症(paget，s disease)、骨軟>^症、骨肥大症，及骨質石化症。涉及成骨 性分化及重生過程之機制的鏗定對骨生理學及骨骼病症， 諸如骨質疏鬆症，之瞭解具重要性。這些病症可包括由於 5假定存在的成骨祖細胞之成熟不全所導致的骨形成缺陷。 有需要研發治療與骨質再吸收及形成有關之疾病或病 症的方法、促進骨形成之方法、確認能調節（增加或減少） 骨形成之藥劑的方法、確認能調節（增加或減少）骨質再吸收 之藥劑的方法，及確認與骨關聯性病症有關之基因或其蛋 10 白質產物的方法。 涉及骨形成與骨質再吸收之機制的鑑定對骨生理學及 骨絡病症，諸如骨質疏鬆症，之瞭解具重要性。與骨關聯 性病症有關之基因或其蛋白質產物可用於解釋骨形成、骨 質再吸收之分子機制，可用於篩檢及研發新藥物，可用於 15 診斷、預測、防止，及治療骨形成與骨質流失症狀，及評 估用於骨關聯性病症，諸如骨質疏鬆症，之療法。該等經 確認之基因及蛋白質亦可用於研究可調節骨形成之藥劑。 最近業經確認之一種此蛋白質為R〇r2蛋白質。R〇r2基因表 現性之下調作用可抑制人類間質幹細胞之經地塞米松 20 (dexamethasone)誘發的成骨性分化（第1圖），然而Ror2過度 表現性可促進這些細胞之成骨性分化(Billiard等人，2004年 4月14日申請之美國專利申請案U.S.S.N· 10/823,998 ;其在 此併入本案以為參考資料）。因此，Ror2及該R〇r2路徑為用 於調節骨形成之合適標的。 200800266 t發明内容;j 發明概要 本發明提供-種用於調節骨形成之系統。本系統係基 於版2在成骨細胞分化作用中之作用的發現。更詳細地，

5該版2蛋白質之活化作用可導致確質化骨形成。R〇r2表現 性業經發現對間質幹細胞之成骨性分化作用具重要性。 R〇r2過度表現性亦業經發現可抑制間質幹細胞分化成脂肪 細胞。«經發現Ror2蛋白質之活化作用可導致14_3部之 喊I化反應14 3 3/?之下调作用業經發現可增加人類間質 1〇幹細胞中之礦質化基質形成。這些有關於㈣蛋白質，立 與M-3-3錄白質之交互作用，及14句之下調作用的發 現可以使W 14,3·3/3，及其訂游傳訊生物分子成為研 究可調節骨形成之新賴藥劑的主要標的。可活狀的蛋白 質、抑制i4-3邻蛋白質或調節其它下游標的之活性的華劑 15可用以治療及預防骨關聯性病症，特別為與骨質流失有關 之病症。這些藥劑亦可用以促進成骨細胞分化並促進礦質 化基質形成。或者，這些藥劑亦可用於抑制幹細胞分化成 脂肪細胞且可用以治療肥胖症、代謝雜或糖尿病。 本發明提供可活化Μ蛋白質之藥劑。在特定實施例 20中’該等藥劑可導致-2蛋白質之二聚合反應，藉以導致 R〇r2活化仙。該R。·白質之二聚合反應可導致激酶活 性增加及後續Ror2之結合伴但，其包括14-3-3石蛋白質，的 鱗酸化反應。該藥劑亦可促進骨形成。 本發明另-方面係提供可抑制或下調〗4·3_3活性，特別 7 200800266 為14-3-3/3或14、3 1 下，這些7活性，之_。於DNA或蛋白質層次 , 用以減少細胞内之14-3-3活性。在特定#y 例中，該藥劑可影㈣在特疋貝她 間質幹細胞、料〜 成之細胞，諸如成骨細胞、 ;骨細胞、成熟的成ΐ，、胎兒幹細胞、骨、祖細胞、前成 細胞。在复它条/、、、田胞或該成骨細胞譜系中之任何其它 成之細胞。例中’該等藥劑可影響涉及脂肪細胞形 頭。該14-3-3;^樂劑可結合至雙膦酸鹽分子團以影響骨 影響14-3-3或14、3下調業經發現可增加礦質化基質形成。能 活化Ror2蛋白_ 3之特定異構型之該等藥劑可以併用能 反應的藥劑）。=藥劑（例如能導致蛋白質之二聚合 本發明又另 對促進骨形成有增效作用。 成具重要性之^方面係提供可調節業經發現對調節骨形 劑。這些藥劑二 =-3 15 本發明藥匈 與文中所述其它藥劑一起使用。 ^可以是任何類型之化學化合物，但是較佳 為蛋白質、胜肽疋罕乂仏 該荜劑為可促1 ’及小分子。在特定實施例中， =1"是多株或單株抗㈣-就人類患者ί 任ίτη型物办化抗雜典型上較佳。該抗雜或其月段可以 疋任何同型物；鈇 ^ 、、、，1較乜為QG同型物。在特定實施 例中，«_她。咖細鳩體^: 在其它實施例中，該藥劑為l4_3_3yS·專-性RNAi、siRNA 或shRNA結構物。 在一方面中，係對患者投予可活化R〇r2蛋白質或抑制 20 200800266 14-3-3沒活性之藥劑以促進骨形成。在特定實施例中，係對 患者投予可活化R〇r2蛋白質之藥劑及可抑制14冬3石活性 之藥劑的組合。更明確地，該藥劑之投予可促進成骨細胞 分化及/或增加礦質化基質形成。該患者可能罹患或處於 5任何骨關聯性病症之危險，該等骨關聯性病症包括骨質疏 鬆症、骨癌、關節炎、佝僂症、骨折、牙周病、骨分段缺 fe /容月性骨疾、原發性及繼發性副甲狀腺機能亢進、潘 口 “氏症、月軟化症，及骨肥大症。該藥劑特別可用以治 療與骨流失有關之疾病。在_方面中，該藥劑可促進心2 10蛋白貝之一聚合反應，藉以活化該Ror2蛋白質。該藥劑可 以是任何類型之化合化合物；然而，小分子、多核普酸、 蛋白質，及胜肽特別有用。在特定實施例中，該藥劑為針 對R〇r2蛋白質之抗體或抗體片段。就成功地使用人源化單 株抗體以進行人類疾病，諸如克隆氏症(Cr〇hn，s dis㈤及 多發性硬化，之治療而言，通常較佳為人源化單株抗體。 在特定實施例中，該藥劑可下調14_3_3表現性，更明確地， 14-3-3/3或14-3-3 r表現性。在特殊實施例中，該藥劑為 14-3-3/3-專一性1^八卜8111^八或41^八。本發明藥劑亦可 用以治療肥胖症、代謝病症或糖尿病，其係藉在損害脂肪 20細胞分化作用之情況下，促進成骨細胞分化作用。 在另一方面中，細胞係與能活化R〇T2蛋白質或抑制 14-3-3/3活性之藥劑接觸以促進成骨細胞分化或成骨性分 化。被接觸之細胞典型上可表現R〇r2蛋白質或14_3_3石蛋白 質且可進行分化，轉化成成骨細胞表現型。在特定實施例 9 200800266 中，該細胞為幹細胞，例如間質幹細胞。可以使用該藥劑 活體内或活體外接觸該細胞。亦可以使用該藥劑活體外接 觸該細胞，然後將其導入需要其治療之患者(例如罹患骨關 聯性病症，特別為與骨質流失有關之病症，之患者)體内。 5 R〇r2過度表現性及14-3-3 /3抑制作用亦業經發現可抑 制脂肪生成的分化。因此，可活化Ror2蛋白質或抑制14-3-3 /5活性之藥劑亦可用以抑制脂肪生成的分化。因此，本發 明藥劑特別可用以抑制幹細胞，例如間質幹細胞，之脂肪 生成分化作用。基於本發明，R〇r2活化劑或14-3-3召下調劑 1〇可用以治療或預防肥胖症、糖尿病或其它代謝病症。 本發明亦包括一種用於鑑定可調節尺01*2活性或表現 性’或調節14-3-3石蛋白質之填酸化作用之藥劑的系統。該 篩檢系統包括使用藥劑接觸R〇r2蛋白質並檢測該藥劑對 Ror2活性或表現性之影響。Ror2活性或表現性增加之檢測 15 係表示藥劑可用以促進骨形成，促進成骨細胞分化或抑制 脂肪生成分化。在特定實施例中，係藉測定Ror2蛋白質本 身或14-3-3 /3之磷酸化反應狀態而評估R0r2活性。在其它實 施例中，係，例如使用32PyATP或使用抗磷酸酪胺酸抗體 之免疫沉澱法以測定Ror2激酶活性。在特定實施例中，該 20 分析為使用細胞表現性Ror2蛋白質之以細胞為主的分析。 在其它實施例中，該分析無細胞，並使用純化或半純化R〇r2 蛋白質。使用本發明篩檢方法所鑑定之藥劑及其藥學組成 物特別適用於文中所述本發明治療法。 本發明亦提供一種用於鑑定可促進Ror2蛋白質之二聚 200800266 合反應之藥劑的分析。該分析特別適用於篩檢大量可能有 用的化合物之高通過料量技術。由該尺01>2蛋白質之細胞外 結構域所組成之嵌合型受體係與TrkB之細胞内結構域融 合。可一聚合該等細胞外Ror2結構域之藥劑可活化該丁化6 5傳訊路徑，導致CRE促進子活性之增加。然後可使用能合 適地連接至該CRE促進子之報告基因，例如蟲螢光素酶， 以鑑定能二聚合Rod之化合物。已使用先前業經證明可二 聚合Rot2之抗Ror2抗體證實該R0r2-TrkB嵌合體分析。當與 經非專一性IgG處理之細胞比較時，R〇r2專一性抗體可導致 10所觀測蟲螢光素酶活性之劑量依存性增加（見第12圖）。該分 析可提供用於鑑定可活化Ror2之藥劑的快速、高通過料量 及高靈敏性分析。如熟悉本項技藝者可知，可使用除了 TrkB. 以外之其它細胞内結構域以製備該嵌合體。然後可在本分 析中使用經合適連接至該報告基因之不同促進子。經本發 15明分析鍛定為R〇r2之活化劑或二聚合作用劑的藥劑亦被視 為本發明之一部份。 定義 提供以下定義以徹底瞭解文中使用之名詞及縮寫。 如文中及附加申請專利範圍中所使用，除非本文另有 20明確指定該單數型“一，，，及“該，，包括複數參考。因此，例 如凡提到“一細胞，，係包括多個此等細胞，且凡提到“一抗 體”意指一或多種抗體及其為熟悉本項技藝者已知之同等 物等。 相當於測量、技術、性質或化合物之單位的本專利說 200800266 明書中之縮寫如下：“g”意指克數，“mg”意指毫克數，“ng” 意指毫微克數，“kDa”意指千道爾頓數，“°C ”意指攝氏度數， “cm”意指厘米數，“s”意指秒數，“min”意指分鐘數，“h”意 指時數，“Γ意指升數，“ml”意指毫升數，“ # 1”意指微升數， 5 “ρΓ意指微微升數，“M”意指莫耳濃度，“mM”毫莫耳濃度， “mmole”意指毫莫耳數，“kb”意指千鹼基數，“bp”意指鹼對 數，“RT”意指室溫。 “高效液相層析法”之縮寫為HPLC。 “開放式閱讀架構”之縮寫為ORF。 10 “質譜學”之縮寫為MS。 “串列質譜學’’之縮寫為MS/MS。 “聚丙烯基醯胺凝膠電泳”之縮寫為PAGE。 “聚合酶鏈鎖反應”之縮寫為PCR。 “逆轉錄酶聚合酶鏈鎖反應”之縮寫為RT-PCR。 15 “十二烷基硫酸鈉”之縮寫為SDS。 “十二烷基硫酸鈉-聚丙烯基醯胺凝膠電泳，，之縮寫為 SDS-PAGE。 “腺嘌呤核苷酸易位子2”之縮寫為ADP/ATP載體蛋白 質。 20 “骨礦質密度”之縮寫為BMD。 “核糖核蛋白體RNA”之縮寫為rRNA。 “未轉譯區域”之縮寫為UTR。 就本揭示内容而言，應該使用許多名詞。如文中使用， 該名詞Ror係指似受體酪胺酸激酶之孤受體族。“R〇r分子” 12 200800266 係指Ror多胜肽、R〇r蛋白質、R0r胜肽、其片段、變異體及 突變體以及可將Ror多胜肽、Ror胜肽及其片段或變異體或 突變體編碼之核酸。“Ror分子，，亦指R0r多核苷酸、基因及 其變異體與突變體。“Ror分子”及“R0r”係兼指R〇rl及R〇r2 5 分子。 “目標Ror分子”係指其活性係藉本發明藥劑而調節之 Ror分子。該目標Ror分子可以是R〇r多胜狀、同系物、衍生 物或其片段或變異體或突變體。重要的Ror分子亦可以是核 酸(RNA或DNA之募核苦酸或多核苦酸）。例如若具有該等 10 Ror基因之蛋白質在實驗中具重要性，則該等目標R〇r分子 可以是該等蛋白質。應瞭解該名詞目標Ror分子係兼指全長 分子及其片段、變異體，及突變體，諸如蛋白質之抗原決 定位。該目標Ror分子可以是Rorl分子或R0r2分子或兩者。 在特定實施例中，該目標Ror分子為Ror2蛋白質。 15 該名詞“14-3-3”係指涉及信號轉導之蛋白質族。該等 14-3-3蛋白質具有許多結合伴呂且其包含在細胞過程之大 及不同基團内。該等14-3-3蛋白質係藉結合至彼等之目標並 導致（1)構形變化；（2)序列專一性或結構蛋白質特性之物理 性包含；及/或(3)架構產生而發揮作用。有關於14-3-3蛋 20 白質之結構及機能之幾篇評論論文為Bridges and Moorhead，“14-3-3 Proteins: A Number of Functions for a Numbered Protein，” Sci. STKE re 10，2004; Mackintosh， “Dynamic interactions between 14-3-3 proteins and phosphoproteins regulate diverse cellular processes，” 13 200800266

Biochem· J. 381: 329_42, 2004;其各在此併入本案以為參考 資料。“14-3-3”可意指14-3-3多胜肽、14-3-3蛋白質、14_3_3 胜肽，及其14-3-3片段、14-3-3變異體，與14-3-3突變體， 及可將14-3-3多胜肽、14_3_3蛋白質、14-3-3胜肽及其14-3-3 5片段或14_3_3變異體或14-3-3突變體編碼之核酸。幾種 14-3-3之異構型業經確認’其包括石、£、^；、/^、1、（， 及σ。該R〇f2蛋白質之活化作用業經發現可導致該異構型 14-3-3 Θ之磷酸化反應。14-3-3/5及14-3-3 r皆業經發現可 以與Ror2交互作用。在特定實例中，係明確地指14_3_3冷。 10 在確定的其它實例中，係明確地指ΐ4-3-3γ。 該名詞“核酸分子”係指核糖核苷酸(RN A分子）或去氧 核糖核苷酸(D N A分子）之磷酸酯型或以單股型或雙股螺旋 之任何填酸二醋類似物。合適為雙股dna_dna、DNA_RNa 及RNA-RNA螺旋結構。該名詞核酸分子，且特別為dna* 15 RNA分子，係指該分子之一級及二級結構，且不限於任何 特殊三級型。因此該名詞包括特別在線型（例如限制性片段） 或圓形DNA分子、質體，及染色體中所發現之雙股dna。 在討論特殊雙股DNA分子之結構時，可根據僅在沿著DNA 之非轉錄股（亦即該具有類似於mRNA的序列之股）之5，至3, 20方位提供該序列之慣例描述序列。 重組型核酸分子，，為已進行分子生物學操作之核酸分 子，亦即非天然發生之核酸分子或遺傳學管理之核酸分 子。而且，該名詞“重組型DNA分子”係指非天然發生之核 酸序列或可藉人工方式組合核酸序列之兩刀離的片段，亦 14 200800266

即藉將非一般連續之DNA片段連接在一起’而製成之核酸 序列。“重組性產生，，係意指人工組合法，其通常附帶使用 化學合成法或核酸之單離片段的人工處理法，例如藉使用 限制性酶、連接酶之遺傳學管理技術，及如藉以下參考文 5 獻所述之類似重組技術：例如Sambrook等人，Molecular Cloning ’ 第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview， Ν·Υ·; (1989)或Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols( 1989)，及 DNA Cloning: A Practical Approach，Volume I 及 Π (ed. D· N· Glover) IREL 10 Press，Oxford，（1985);其各在此併入本案以為參考資料。 可進行此操作法以使用可將相同或保留性胺基酸編碼 之多餘密碼子取代一密碼子，並典型上導入或移除序列辨 識部位。或者可進行該操作法以將具有所欲機能之核酸片 &連接在一起以產生含有一段天然型未能發現之所欲機能 15 、且口的單一基因性實體。限制性酶辨識部位通常為此等人 ^呆作法之目標’但是可藉設計而併人其它部位專一性目 才不例如促進子、厕八複製部位、調節序列、控制序列、 開放式閱讀架構或其它有用特徵。重組型核酸分子之實例 匕括重組型載體，諸如含有可將位於5，至3，(訊息）定向或 20至5(反訊息）定向之R〇r族蛋白質或免疫球蛋白蛋白質編碼 之DNA序列的選殖載體或表現性載體。 八該以詞“多核聽，，、“核倾序列，，、“核酸，，、“核酸 ! 核酸序列”，及“寡核苦酸，，係指職及祖中之一 糸列核苦酸驗基(亦稱為“核苦酸”，且意指具有2或多個核普 15 200800266 酸之任何鏈。該等多核苷酸可以是嵌合型混合物或其衍生 物或改質物、單股或雙股。該寡核苷酸可以於該鹼基分子 團、糖分子團或璘酸鹽主鏈經改質以改良，例如分子安定 性，其雜交反應參數等。該反訊息寡核苷酸可包含一經改 5 質鹼基分子團，其係選自以下群組，但不限於：5_氟尿嘧 啶、5-溴尿嘧啶、5-氣尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃 嘌呤、4-乙醯基胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧基甲 胺基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲胺基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧 啶、）S-D_半乳糖Q核苷（beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、 10 N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二

甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、 5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲胺基甲基 尿嘧啶、5-甲氧基胺基甲基-2-硫嘧啶、yS-D-甘露糖Q核苷、 5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫-N6-15 異戊稀基腺σ票呤、威布托普(wybutoxosine)、假尿。密咬、Q 核苦、2-硫胞u密σ定、5-甲基-2-硫尿定、2-硫尿ΰ密咬、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧 啶-5_氧基乙酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶-3-(3_胺基-3-Ν-2-羧基丙 基)尿嘧啶，及2,6-二胺基嘌呤。核苷酸序列典型上可傳遞 20 基因訊息，其包括藉製造蛋白質及酶之細胞系統所使用之 訊息。這些名詞包括雙-或單-股基因組及cDNA、RNA、任 何合成及遺傳學上可處理之多核苷酸、訊息及反訊息多核 苷酸。其包括單-及雙-股分子，亦即DNA_DNA、DNA-RNA， 及RNA-RNA雜化物，以及藉使鹼結合至胺基酸主鏈而形成 16 200800266 之“蛋白質核酸，，(pna)。其亦包括含經改質鹼，例如硫-尿 嘧啶、硫-鳥嘌呤，及氟-尿嘧啶，或含碳水化合物或脂質之 核酸。 本發明之多核苷酸可藉本項技藝中已知之標準方法而 5 合成，亦即藉使用自動化DNA合成器（諸如得自Biosearch， Applied Biosystems等之市售自動化DNA合成器）。作為實 例，可藉Stein等人，Nucl. Acids Res·，16, 3209, (1988)之方

法而合成磷酸硫醇鹽寡核苷酸，可藉使用受控性細孔玻璃 聚合物載體（Sarin等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 10 7448-7481，（1988)等）而製成膦酸甲酯募核苷酸。許多方法 業經研發以將反訊息DNA或RNA遞送至細胞，例如可直接 將反訊息分子注射入組織部位内或可全身性投予用以將所 欲細胞定標之經改質反訊息分子（反訊息連接至可專一性 結合表現在該目標細胞表面上之受體或抗原的胜肽或抗 15體）或者，可藉旎將該反訊息RNA分子編碼之DNA序列的 活體外及雜__產生RNA分子。此等】通序列可併 入多種能合併合適RNA聚合酶促進子，諸如T7或SP6聚合酶 20 促進子’之載體内。或者，可财地將反訊息_Α結構來 (其根據所錢促料呵顧性或誘導性合献訊息麗 導入細胞_。“’通諸難獲得足以抑_源性抓皿 讀譯的該反訊息之細軸濃度。因此難方法係使用童 、、且型DNA結構物，其中係使該反訊息募核聽 好。使用此結構物以轉移感染患者之目標細胞可轉 置之單股RNAS，其可以細馳目標基_錄物形成互補 17 200800266 性鹼對，藉此可防止該目標基因mRNA之轉譯。例如可活 體内導入載體，藉此其可經細胞吸收並指揮反訊息^^八之 轉錄。此載體可維持游離體狀態或變成具染色體整合性， 其限制條件為該載體可轉錄以產生所欲反訊息尺^^入。可藉 5本項技藝常用之重組型DNA技術方法而構成此等載體。載 體可以是供哺乳動物細胞内之複製及表現使用之質體、病 毒或本項技藝中已知之其它物質。可將該反訊息RNA編碼 之該序列的表現性可以是本項技藝中已知可作用於哺乳動 物(較佳為人類細胞)之任何促進子。此等促進子可以具誘導 10性或原構性。此等促進子包括，但不限於：SV40早期促進 子區域（Bernoist and Chambon，Nature，290，304-310, (1981)) ; Rous肉瘤病毒，Yamarn〇t〇等人，Cell，22, 787-797, (1980)之3’長末端重覆單位所含之促進子；疱疹胸腺核苷激 酶促進子，Wagner等人，proc· Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, I5 1441-1445,（1981)，金屬疏肽(metallothionein)基因之調節序 列，Brinster等人，Nature 296, 39·42(1982)等。可使用任何 類型之質體、黏接質體(cosmid)、酵母人造染色體或病毒載 體以製備可直接導入組織部位内之該重組型DNA結構物。 或者，可使用能選擇性傳染所欲組織之病毒載體，在該情 20況下，可藉另一種方式（例如全身性）而完成投藥。 該等多核苷酸兩側可含有天然調節的（表現性控制）序 列或可以與異種序列，其包括促進子、内核糖體進入部位 (IRES)及其它核糖體結合部位序列、增強其因、反應元素、 抑制基因、信號序列、多腺苷酸化序列、插入序列、5，-至 18 200800266 3’-非密碼區域等，結合。亦可藉本項技藝中已知之任何方 法而改質該等核苷酸。此等改質法之非限制性實例包括甲 基化作用、“蓋罩(caps)，，、以類似物取代一或多種天然產生 之核苷酸、核苷酸内改質法，諸如使用不帶電的鍵合物(例 5如膦酸甲酯、磷酸三酯、醯胺酸磷酸酯、胺基曱酸酯等）及 使用V電的鍵合物(例如鱗酸硫醇鹽、鱗酸二硫醇鹽等)所進 行之核苦酸内改質法。多核普酸可含有一或多種附加的共 價鍵結分子團，諸如蛋白質（例如核酸酶、毒素、抗體、信 號胜肽、聚賴胺酸等）、層間化合物（例如吖啶、補骨脂 1〇 素(Psoralen)等）、螯合劑（例如金屬、放射性金屬、離子、 氧化金屬等）’及烧化劑。可以藉甲基或乙基碟酸三酯或石舞 酸醯胺酸烷酯鍵合物之形成而衍生多核苷酸。此外，文中 該等多核苷酸亦可經能提供可直接或間接偵測信號之標記 而改質。標記之實例包括放射性同位素、螢光分子、生物 15 素等。 “RNA轉錄物”係指自DNA序列之經RNA聚合酶催化的 轉錄作用所形成之產物。當該RNA轉錄物為DNA序列之互 補性複製物時，其較佳作為主要轉錄物或其可以是衍生自 該主要轉錄物之轉錄後處理的RNA序列，且稱為成熟 20 RNA。“信使RNA(mRNA)”係指不含插入序列且可藉該細胞 而轉譯入多胜肽内之RNA。“cRNA”係指自重組型cDNA模 板轉錄之互補RNA。“cDNA”係指與mRNA模板互補且自其 衍生之DNA。該cDNA可以是單股型或可使用，例如DNA 聚合酶I之Klenow片段轉化成雙股型。 19 200800266 與RNA之一部份“互補，，的序列係指具有足夠的互補性 以和該RNA雜交而形成穩定雙股rNA之序列；就雙股反訊 息核酸而言，該雙股DNA之單一股因此可經測試，或可分 析三股形成。該雜交作用可取決於互補性程度及該反訊息 5核酸之長度。一般而言，該雜交之核酸愈長，則與rnA失 配之鹼更多，且仍可形成穩定的雙股（或三股，視情況而 定）。熟悉本項技藝者藉使用標準程度可確定失配的对受程 度以測定該雜交複合物之熔點。 該等名詞“核酸”或“核酸序列，，、“核酸分子，，、“核酸片 10段”或“多核苷酸”可以與“基因”、“藉基因而編碼之mRNA” 及“cDNA”交換使用。 該名詞“可將多胜肽編碼之多核苷酸，，包括可僅包含該 密碼序列之多核苷酸以及可包含另一密碼或非密碼序列之 多核芽酸。 I5 當於合適的溫度及溶液離子強度之條件下，一核酸分 子之單股型可黏接其它核酸分子時，則該核酸分子係“可雜 交”成另一核酸分子，諸如cDNA、基因組DNA或RNA，見 Sambrook，J 等人 eds·，Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2d Ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, 20 NY· Vols 1-3(ISBN 0-87969-309-6)。該等溫度及離子強度之 條件可決定該雜交作用之“嚴密性(stringency)”。為了同源 性核酸之預備篩檢，可使用低嚴密性雜交條件，其相當於 較高Tm，例如具有5x或6xSSC之40%曱醯胺。高嚴密性雜 交條件相當於最高Tm，例如具5x或6xSSC之50%甲醯胺。 20 200800266 雖然根據雜交反應之嚴密性，鹼群之間可能有失配，但是 雜交反應要求這兩種核酸含有互補序列。用於雜交核酸之 合適嚴密性係取決於該等核酸之長度、互補程序，及本項 技藝熟知之變數。兩種核苷酸序列之相似度或同源性程度 5 愈高，具有此等序列之核酸的雜化物之Tm值愈大。核酸雜 交反應之相對安定性（相當於較高Tm)按以下順序降低： RNA : RNA、DNA : RNA、DNA : DNA。就長度大於 1〇〇 個核普酸之雜化物而言，用以計算Tm之方程式業經導出， 見 Sambrook 等人 eds·，Molecular Cloning: A Laboratory 10 Manual(2d Ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY· Vols. 1-3(ISBN 0-87969-309-6)，9.50-9.51。就使用較短 核酸’亦即募核苦酸’所進行之雜交反應而言，失配之位 置變得更重要，且該寡核苷酸之長度可決定其專一性，見 Sambrook 專人 eds·，Molecular Cloning: A Laboratory 15 Manual(2d Ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Vols. 1-3。（ISBN 0-87969-309-6, 11·7-11·8)。 該名詞“互補性”係用以描述可彼此雜交之核苦酸驗群 間的關係。例如就DNA而言，腺苷係與胸腺嘧啶互補，而 胞嘧啶係與鳥嘌呤互補。 20 如本項技藝中已知之“同一性，，或“相似性，，為2或多種 多胜肽序列或2或多種多核苷酸序列間之關係，其係藉比較 該等序列而測定。在本項技藝中，同一性亦意指多胜肽或 多核苷酸(可視情況而定）間之序列相關性程度，其係藉此等 序列之線形結構間之相配性而測定。同一性及相似性皆很 21 200800266 容易藉如以下參考文獻中所述之已知方法而計算： Computational Molecular Biology，Lesk，A· M·，ed·，Oxford University Press， New York， 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W·，ed·， 5 Academic Press，New York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G·，Academic Press，1987; Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A. M·， and Griffin，H· G·，eds·，Humana Press，New Jersey，1994 ;及 Sequence Analysis Primer，Gribskov，Μ· and Devereux，J.， 10 eds” M Stockton Press，New York，1991。習用以測定序列間 之同一性或相似性的方法包括，但不限於揭示在Carillo, Η.， and Lipman，D·，SIAM J Applied Math·，48: 1073(1988)中之

方法。測定同一性及相似性之方法係編纂在可公開取得之 電腦程序内。測定兩序列間之同一性及相似性的較佳電腦 15 程式方法包括，但不限於：GCG程序套裝軟體，Devereux J 等人，Nucleic Acids Research，12(1)，387(1984); BLASTP、 BLASTN，及FASTAAtschul，S. F·等人，J Molec· Biol.，215, 403(1990)。 同源性係指兩聚合物（亦即多胜肽分子或核酸分子） 20之序列相似度。文中所指之同源性百分比數字係表示兩聚 合物之可能最大同源性，亦即當這兩種聚合物之取向可具 有最大數量之相配（同源性)位置時之同源性百分比。 孩名詞同源性百分比”係指多胜肽群之胺基酸序列同 一性的程度。任兩多胜肽之同源性為在任一序列之特定位 22 200800266 置之相配胺基酸總數之直接機能，例如若在任一種序列中 之胺基酸總數的一半皆相同，則兩序列據稱具有5〇%同源 性。 當涉及多胜肽時，該等名詞“片段，，、‘‘類似物，，，及“衍 5生物”係指可實質上保有與原有多胜肽相同之生物機能或 活性的多胜肽。因此，一類似物包括可藉先質蛋白質部份 之分割而活化以產生活性成熟多胜肽之先質蛋白質。該多 胜肽之片段、類似物或衍生物可以是其中一或多種胺基酸 • 經保留性或非保留性胺基酸殘基取代之化合物，且此等胺 10基酸殘基可以是或可不是藉該遺傳密碼而編碼之殘基；或 其中一或多種該等胺基酸殘基包括取代基之化合物；或其 中該多胜肽係與化合物（諸如聚乙二醇）融合以增加該多胜 肽之半生期的化合物；或其中另外胺基酸係與多胜肽(諸如 信號胜肽）或序列（諸如用於純化該多胜肽或先質蛋白質之 15聚組胺酸標記物）融合之化合物。此等片段、類似物或衍生 物被視為屬於本發明之範圍。 • 乡核㈣序列之“保留性，’殘基為此等未改變地出現在 欲比較之2或多種相關系列之相同位置中的殘基。具相當保 留性之殘基為在相關序列之間比出現在該等序列中之別處 2〇的殘基更具保留性之殘基。 相關多核苷酸為共享大比例之相同殘基的多核苷酸。 若一多核苷酸最終係衍生自另一多核苷酸，則該等不 同之多核苷酸彼此“相符合”。例如信使^^八相當於其所轉 錄之基因。cDNA相當於，諸如已藉逆轉錄反應或藉根據 23 200800266 RNA序列之瞭解所進行dnA之化學合成法而產生該cDNA 之RNA。cDNA亦相當於可將該狀八編碼之基因。若多核苷 酸可提供類似機能，諸如將欲比較之不同物種、品系或變 異體中之相關多胜肽編碼，則該等多核苷酸亦彼此“相符 5 合”。 DNA、RNA或多核苷酸之“類似物，，係指除了在，例如 具有不尋常或非天然鹼或經改變主鏈之DNA或RNA不同 外’在形式及/或機能(例如可在互補性多核苦酸序列上進 行氫與驗對之序列專一性鍵結的能力）上類似天然產生之 10多核普酸的分子。見’例如Uhlmann等人，Chemical Reviews 90, 543-584, （1990)。 “密碼序列”或可將表現性產物，諸如RNA、多胜肽或 蛋白質，“編碼”之序列為當表現時可產生該RNA、多胜肽 或蛋白質（例如酶)之核苷酸序列，亦即該核苷酸序列可將該 15多胜肽或蛋白質之胺基酸序列編碼。 胺基酸或核苷酸序列之“重要部份，，為包含足夠多胜肽 的該胺基酸序列或基因之該核苷酸序列的部份，其可藉熟 悉本項技藝者之人工評估序列的方法或藉使用演算法，諸 如 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool; Altschul，S. 20 F” 等人，J· Mol· Biol. 215，403-410，（1993);亦見 www.ncbi.nlm.nih_g〇v/BLAST)，進行電腦自動化序列比較 及鑑定而推定地確認該多胜肽或基因。 因此，一核苷酸序列之“重要部份，，包含可專一性確認 及/或離析含該序列之核酸片段的足夠序列。根據如文中 24 200800266 所述該等序列之好處，熟練的技術人員現在可在熟悉本項 技藝者已知之應用上使用該等揭示序列之所有或重要部 份。 可自使用熟悉本項技藝者已知之程序以化學方法合成 5之募核普酸石切塊(building block)組裳“合成基因”。這些石切塊 經連接並黏合以形成基因片段，然後使其經酶催組裝以建 構該整體基因。與DNA之序列有關之“化學合成法，，意指該 等組份核苷酸係經活體外組裝。可使用皆已熟知之程序進 行DNA之人工化學合成法，或可使用許多市售機器中之一 10種進行自動化之化學合成法。因此，可根據核苷酸序列之 最佳化的最佳基因表現而修飾該等基因以表示宿主細胞之 密碼子影響。熟練的技術人員可知若密碼子用法影響由該 侣主所提供之密碼子，則有成功的基因表現。可根據衍生 自該宿主細胞（其中序列資訊係可獲得）之基因的調查而決 15 定較佳密碼子。 “基因’’係指可表現特定蛋白質之核酸片段，其包括在 該密碼序列前(5,非密碼序列）及後(3,非密碼序列）之調節序 列° “天然基因，，係指如在自然界所發現之具有其自己的調 節序列之基自。“嵌合型基因，，或“嵌合型結構物，，係指含在 20自然界尚未—起發現之調節序列及密碼序列的非天然基因 之任何基因或結構物。因此，嵌合型基因或嵌合型結構物 可包含衍生自不同來源之調節序列及密碼序列，或衍生自 相同來源之調節序列或密碼序列，這些序列之排列方法不 同於自然界中所發現之序列。“内源性基因”係指在有機體 25 200800266 之基因組内之天錄置的天然基因。“外源性，，基因係指通 常未在宿主有機體内發現而係藉基因轉移劑而導入該^主 有機體内之基因。外源性基因可包含插入非天然有機體内 之天然基因，或嵌合型基因。“轉基因”為已藉轉形程序而 5 導入·亥基因組内之基因。 “調節序列，，係餘於密碼序列之上游(5，非密碼序 列）、其中或下游(3,非密碼序列)之核芽酸序列可影 響相關密碼序列之轉錄、RNA加工4理或安定性，或轉譯。 調節序列可包括促進子、轉譯前導序列、插入序列，及聚 10 腺苷酸化辨識序列。 ♦ “基因控制序列，，係指引發基因轉錄及調節引發速率所 需之DNA序列。因此基因控制序列可以由該促進子其中 -般轉錄因及該聚合酶係聚集’加上與基因調節蛋白質結 合以控制該促進子之這些總成枝的速率之所有調節序: 所組成。例如適料核生物之該等控制序列可包括促進 子、視需要選狀操縱基因，及核糖體結合部位。真核細 胞可利用促進子、增強子，及/或聚腺«化信號。田 15 20 促進子’’係指能控制密碼序列或機能性RNa之表現性 的核荅|文序列。-般而言，密碼序闕位於促進子序列之 γ位置。該促進子序關由近端及更遠端之上游元素(其中 该等更遠端上游元素通常稱為增強子)所組成。因此，“增 強子”為可刺練進子活性之核㈣序列且可以是該促= 子之固有元素或插从增強促進子之表雜或組織專—性 的異種元素。促進子可全部衍生自天然基因或可以由衍生 26 200800266 自自然界中所發現之不同促進子的不同元素所組成或甚至 包含合成核皆酸片段。熟悉本項技藝者應瞭解不同促進子 可官理一基因在不同組織或細胞類型中或於發育之不同階 段下或回應不同環境條件之表現性。 5 该“3’非密碼序列”係指核苷酸序列位於密碼序列之下 游且包括聚腺苷酸化辨識序列及將能影響㈤^^入加工處理 或基因表現之調節信號編碼之其它序列。該聚腺苷酸化信 就之特徵通常為可影響聚腺苷酸來添加至該11111]^八先質之 3’端。 〇 该“轉譯前導序列”係指位於一基因之促進子序列與該 途碼序列間之核苷酸序列。該轉譯前導序列係存在於該轉 譯啟動序列之經完全處理的mRNA上游中。該轉譯前導序 歹J~T衫響mRNA之初級轉錄物的處理、mRNA安定性或轉譯 效率。 該名詞“操作性連接，，係指單一核酸片段上之2或多個 核酸片段之結合，藉此其中一個之機能受另一個影響。例 如促進子係與一密碼序列操作性連接，藉此該促進子可影 響该密碼序列之表現性（亦即該密碼序列受該促進子之轉 錄控制）。密碼序列可以以訊息或反訊息定向與調節序列操 作性連接。該名詞“可在骨細胞内操作之促進子”係指藉骨 細胞之RNA聚合酶而辨識之促進子。 “RN A轉錄物”係指該RN A轉錄物為DN A序列之完美互 補性複製物，其較佳為該初級轉錄物或其可以是衍生自該 初級轉錄物之後轉錄處理的^^八序列，且較佳為成熟 27 200800266 RNA。“信使RNA(mRNA)”係指不需要插入序列且可轉譯成 多胜肽之RNA。“cDNA”係指與mRNA互補並自其衍生之雙 股DNA。“信息RNA”係指包括該mRNA且可藉該細胞轉譯 成多胜肽之RNA轉錄物。“反訊息RNA”係指與目標初級轉 5 錄物或mRNA之全部或部份互補且可阻斷目標基因之表現 性的RNA轉錄物（見美國專利第5，107,065號，其在此併入本 案以為參考資料）。反訊息RNA之該互補性可以具有該專一 性核苷酸序列之任何部份，亦即於該5,非密碼序列、3,非密 碼序列、插入序列或該密碼序列之部份。“機能性RNA”係 10指信息RNA、反訊息RNA、核酶RNA或可未經轉譯，但是 仍對細胞過程有影響之其它RNA。 該名詞“表現性”係指衍生自本發明核酸片段之訊息 (mRNA)或反訊息RNA的轉錄及安定聚集。表現性亦可指 mRNA轉譯成多胜肽之作用。“反訊息抑制作用，，係指可抑制 15該目標蛋白質之表現性的反訊息RNA轉錄物之產生。 “過度表現性”係指在基因產物在有機體内之產生量超 過在正常或非經轉形之有機體内之產生量。“抑制作用，，係 指抑制外源性或内源性基因或RN A轉錄物之表現性。 經改變含量”係指在基因產物（群)在有機體内之產量 2〇或比例不同於在正常或未經轉形之有機體内之產量或比 例。獲得本發明多胜肽之過度表現性的步驟為首先建構嵌 合型基因或叙合型結構物，其中該密碼區域係操作性連接 至可管理所欲組織於所欲發育階段下之基因或結構物的表 現性之促進子。為方便起見，該嵌合型基因或嵌合型結構 28 200800266 物可包含何生自相同基因之促進子序列及轉譯前導序列。 亦可提供將轉錄終止5虎編碼之3，非密碼序列。該嵌合型基 因或嵌合型結構物亦可包含一或多個插入序列以助長基因 表現性。然後可建構含該礙合型基因或欲合型結構物之質 5體载體。該質體載體之選擇係取決於可用以將宿主細胞轉 形之方法。鱗的技術人員彼清楚為了成功地轉形、選擇 亚增殖含該嵌合型基因或嵌合型結構物之宿主細胞，該基 因凡素必需存在於該質體载體上。熟練的技術人員亦瞭解 不同的獨立轉形事件可導致不同的表現程度及模式，見 10 Jones等人，ΕΜΒΟ J·，4, 2411-2418, (1985) ; De Almeida等 人，Mol· Gen. Genetics, 218, 78-86,（1989)，因此，必需篩 檢多次事件以獲得可顯示所欲表現程度及模式之方式。此 篩檢可藉以下分析而完成：DNA之南方分析法、mRNA表 現性之北方分析法、蛋白質表現性之西方或免疫細胞化學 15 分析法或表型分析法。 該等名詞“變異體”或“變異體群”係指R〇r分子之核酸 或胺基酸序列之變異性。該名詞“變異體(群)，，包括R〇h分子 之核苷酸及胺基酸取代、加成或刪除。該名詞“變異體(群)，， 亦包含化學性改質之天然及合成Ror分子。例如變異體可指 20 不同於指示多胜肽之多胜肽。一般而言，在胺基酸序列方 面不同於指示多胜肽之該多胜肽與該指示多胜肽之差異有 限，因此該指示多胜肽與變異體之胺基酸序列大體上很類 似且在某些區域上係相同。變異體R指示多胜肽在胺基酸序 列方面可差別一或多種可以具保留性或非保留性且可存在 29 200800266 於任何組合内之取代、刪除、加成、融合及截斷。例如變 異體可以是其中插入、取代或刪除幾個，例如自5〇至如個、 自30至20個、自20至10個、自10至5個、自5至3個、自狂2 個、自2至1個或1個，胺基酸之任何組合的變異體。另外 5變異體可以是本發明多胜肽之一片段，其與參考多胜肽序 列之差異在於比該參考序列還短，諸如差別為一末端或内 刪除。本發明多胜肽之變異體亦包括保有本質上與此多胜 肽相同之生物機能或活性的多胜肽，例如前質蛋白質，其 可藉該先質部份之分割而活化以產生活性成熟多胜肽。這 10些變異體可以是對偶基因的變異體，其特徵為在將該蛋白 質編碼之結構基因的核苷酸序列上有差異，或其可咆括差 別接合或後轉譯改質。變異體亦包括具有實質上相同生物 活性但卻得自不同物種之相關蛋白質。熟練的技術人員可 製造具有單一或多胺基酸置換、删除、加成或取代之變異 15體。這些變異體可特別包括：⑴一種變異體，其中一或多 種胺基酸殘基係經保留性或非保留性胺基酸殘基(較佳為 保留性胺基酸殘基）取代且此種經取代胺基酸殘基可或可 不經该遺傳密碼編瑪，或(ii)一種變異體，其中一或多種胺 基酸係自該胜肽或蛋白質刪除，或(iii)一種變異體，其中一 2〇或多種胺基酸係添加至該多胜肽或蛋白質，或(iv)—種變異 體，其中一或多種胺基酸殘基包括取代基，或(v) —種變異 體，其中該成熟多胜肽係與另一化合物，諸如可增加該多 胜肽之半生期的化合物（例如聚乙二醇），融合，或(vi)一種 k異體，其中該等另外胺基酸係與該成熟多胜肽，諸如前 30 200800266 導或分泌序列或用於純化該成熟多胜肽或先質蛋白質序列 之序列，融合。該多胜肽之變異體亦可以是自然產生之變 異體，諸如自然產生之對偶基因變異體，或其可以是已知 不旎自然產生之變異體。以上定義之所有此等變異體被視 5 為屬於本項技藝中之教示範圍。 本發明該等多胜肽及多核苷酸較佳以單離形式提供且 可以純化至均質程度。在特定實例中，該等多胜肽及多核 芽酸之純度為至少90/>、至少95%、至少98%或至少99%。 該名詞“單離”意指該物質係自其原有或天然環境（例 1〇如其自然產生的天然環境)移除。因此，存在於活動物中之 自然產生的多核苷酸或多胜肽並未經單離，但是藉人為干 預而自天然系統中之部份或所有共存物質所分離之相同多 核苷酸或多胜肽係經單離。例如“單離核酸片段，，為單_或雙_ 股且可選擇性含有合成、非天然或經改變之核苷酸鹼的 15 RNA或DNA之聚合物。hdna聚合物之形式的單離核酸片 段可以包含cDNA、基因組的DNA或合成DNA之一或多個片 段並合併碳水化合物、脂質、蛋白質或其它物質。此等多 核苷酸可以是載體之一部份及/或此等多核苷酸或多胜肽 可以是組成物之一部份，仍具單離性，因為此等載體或組 20成物並非其在自然界中被發現的環境之一部份。類似地， 該名詞“實質上純化，，係指經由人類干預法而自直接的化學 環境所分離或移除之物質，其中該物質係在自然界中產 生。可藉本領域中習知之任何技術及程序而獲得或製成實 質上純化多胜肽或核酸。 31 200800266 該名詞“純化”係指增加特定多胜肽或多胜肽群在試樣 中之比活性或濃度。在一實施例中，比活性係以該試樣中 之目標多胜肽之活性與總多胜肽之濃度的比率表示。在另 一實施例中，比活胜係以該目標多胜肽之濃度及總多胜肽 5 之濃度的比率表示。純化方法包括，但不限於透析技術、 離心技術’及柱式層析技術，其皆為熟悉本項技藝者熟知 之程序。見，例如 Young等人，1997，“Production of biopharmaceutical proteins in the milk of transgenic dairy animals，”BioPharm 10(6): 34-38。 〇 該等名詞“實質上純的，，及“單離的，，並無意排除多核苷 酸或多胜肽及未與自然界中之該等多核苷酸或多胜肽結合 之物質的混合物。 15 20 戎#名阑“細胞”、“細胞株，，，及“細胞培養物，，可互換使 用。所有這些名詞亦包括彼等之後代，其係為任一代及所 有後績代。已知由於故意的或非故意的突變，所以所有後 代可不相同。就表現異種核酸序列而言，“宿主細胞”係指 不管位於活體外或活體内之原核性或真核性細胞（例如細 菌細胞，諸如大腸桿g、_細胞、輕動物細胞、鳥類 細胞、兩棲動物細胞、植物細胞、.魚細胞、及昆蟲細胞)。 例如宿主可包括能複製位於轉殖基_動物内之細胞的任 何可轉形有機體。宿主細胞可作為用於载體之受體及，或 表現藉載體而編碼之異種核酸。 用於表現並回收藉哺乳動物細胞系統而產生之夕卜源性 蛋白質的通用方法係藉以下參考文獻而提供：例如 32 200800266

Etcheverry, “Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture/9 in Protein Engineering: Principles and Practice，Cleland 等人(eds·)，第 163 頁（Wiley-Liss，Inc. 1996)。用於回收藉細菌系統而產生之蛋白質的標準技術係 5 藉以下參考文獻而提供：例如Grisshammer等人， “Purification of over-produced proteins from E. coli cells，’’in DNA Cloning 2: Expression Systems，第 2版，Glover 等人 (eds.)，第 59至92頁（Oxford University Press 1995)。昆蟲之 轉形及文中外源性多胜肽之產生係藉Guarino等人，US 10 5162222及WIPO專利公開案WO 94/06463而揭示。用於自桿 狀病毒系統離析重組型蛋白質之方法亦藉以下參考文獻而 描述：Richardson(ed·)，“Baculovirus Expression Protocols” (The Human Press，Inc· 1995)。在一實施例中，可使用桿狀 病毒表現系緣表現本發明該等多胜肽（見，Luckow等人， 15 Bio/Technology，1988，6，47， “Baculovirus Expression Vectors: a Laboratory Manual”，O’Rielly等人（Eds·)，W.H· Freeman and Company，New York，1992, US4,879,236，其全 文各在此併入本案以為參考資料）。此外，可，例如使用 MAXBAC.TM·完全桿狀病毒表現系統(Invitrogen)以製造昆 20 蟲細胞。 亦可藉特殊性質之利用而離析本發明該等多胜肽。例 如可使用固定化金屬離子吸附(IMAC)層析法以純化室組胺 酸蛋白質，其包括含多組胺酸標記物之蛋白質。簡言之， 凝膠首先帶有二價金屬離子以形成螯合物（Sulkowski， Γα 33 200800266

Trends in Biochem· 3:1(1985))。根據所使用金屬離子，富組 胺酸之蛋白質可以以不同親和力吸附至該基質，且可藉競 爭性溶析、降低pH或使用強螯合劑而溶析。其它純化方法 包括藉外源凝集素親和性層析法及離子交換層析法而純化 5 醣基化蛋白質（M· Deutscher，（ed·)，Meth· Enzymoi· 182: 529(1990))。在本發明之另外實施例中，可建構相關多胜肽 及親和性標記物(例如麥芽糖結合性蛋白質、免疫球蛋白結 構域)之融合物以促進純化。 本發明之宿主細胞可用於大規模製造R〇r多胜肽之方 1〇法，其中該等細胞係在合適培養基中生長且所欲多胜肽產 物係自該等細胞離析或藉本項技藝中已知之純化方法，例 如省知層析法（其包括免疫親和性層析法、受體親和性層析 法、疏水性相互作用層析法、外源凝集素親和性層析^、 尺寸排斥過遽法、陽離子或陰離子交換層析法、高壓液相 15層析法(HPLC)、逆相Ηριχ等），自生長該等細胞之培養基 離析。其它純化法包括其中該所欲蛋白質係經表現且純化 以壬具有專-性標記物、標記或螯合部份之可藉專一性結 ^伴但或藥_識的融合蛋白質形式的方法。該純化蛋白 質可經分割以得到所欲蛋白質或可以呈完整融合蛋白質形 式邊下"亥融合組份之分割由於該分割方法可產生具有另 外胺基酸殘基之所欲蛋白質形式。 該名词活體外”係指非天然環境及在非天然環境内所 $生之反應或製程。活體外環境包括，但不限於：試驗試 e及、、、田胞培養物。該名詞“活_，，係指天然環境(例如動物 34 200800266 或細胞)及在天然環境内所發生之方法或反應。 可以使用細胞(經培養之細胞)及細胞溶解產物（其包括 核萃取物）活體外進行本發明該等方法。可調節骨形成之鑑 疋劑所涵蓋的細胞實例包括，但不限於：顱蓋細胞、成骨 5細胞、蝕骨細胞、軟骨細胞，及多能性先質細胞，諸如能 產生多種效果之骨髓基質細胞。成骨細胞及成骨細胞先質 細胞株之特定實例包括MC3T3-E1、C2C12、MG-63細胞、 U20S細胞、UMR106細胞、ROS 17/2.8細胞、SaOS-2細胞 等’該等細胞株係提供在得自ATCC(WO 01/19855)之目錄 10 以及以下參考文獻中所述之HOB細胞株：Bodine PV、 Vernon SK、Komm BS·，Endocrinology，137，4592-4604, (1996)，Bodine PVN，TrailSmith M，Komm BS·，J Bone Min Res，11，806-819,（1996)，Bodine PV，Green J，Harris HA， Bhat RA，Stein GS，Lian JB，Komm BS·，J Cell Biochem，65, 15 368-387, (1997)，Bodine PV，Komm BS·，Bone，25, 535-43(1999)，Bodine PVN，Harris HA，Komm BS·， Endocrinology，140,2439-2451，(1999)，Prince M，Banerjee C， Javed A, Green J，Lian JB，Stein GS，Bodine PV，Komm BS， J Cell Biochem，80, 424-40,（2001)。亦可使用無細胞系統以 20 進行本發明該等方法。 該名詞“表現性系統”係指於合適條件下之宿主細胞及 可相容載體，其可用於，例如表現藉該載體帶有之外源性 DNA而編碼之蛋白質並導入該宿主細胞内。一般表現性系 統包括大腸桿菌宿主細胞與質體載體、昆蟲宿主細胞與桿 35 200800266 狀病毒載體，及哺乳動物宿主細胞與載體。 “轉形”係指—核酸片段轉化成宿主有機體之基因組， 形成基因上穩定的遺傳。含有該轉形核酸片段之宿主有機 體稱為“轉殖基因的”有機體。 5 該名詞“分化，，係指具有不同於原有組織或細胞類似之 性質或機能。因此，“分化作用，，為分化之過程或作用。 該名詞“成骨分化作用，，係指於成熟以形成成骨細胞期 間，細胞產生特定機能之過程。成骨細胞分化作用可包括 預成骨細胞、早期及成熟成骨細胞、預骨細胞及成熟骨細 H)胞階段（Bodine 等人，Vitamins — H_〇nes 65 10M51(2002)，Stdn 等人，Endocrine Reviews M 424·442(1993)，及Lian等人，Vitamins and H贿。⑽ ％ 443-509(1999)) 〇 該名詞“增生”係指類似細胞之生長及產生。 15 $名^表現型係指細胞或有機體之看得到的性質。 此看得到的性質可包括物理外觀，以及特殊生理組成物存 在於該細胞或有機體中之含量。成骨型表現型包括幾種標 諸蛋白質，諸如骨專-性轉錄因子Cbfa卜第j型膠原、驗 性構g复酶、骨卡勒森，及骨唾液酸蛋白質，之表現性。 20 如文中使用，该名詞“結合伴侣，，或“交互作用蛋白質” 係指可結合另-具專-性之分子，例如抗原及抗原專一性 抗體或酶及其抑制劑，的分子。結合伴侶可包括 ，例如生 物素及抗生物素蛋白或鏈黴菌卵蛋白（streptavidin) 、IgG及 蛋白質A、父體-配位體偶合物、蛋白質蛋白質交互作用， 36 200800266 及互補性多核苷酸股。該名詞“結合伴侣，，亦可指可結合至 細胞内之激酶的多胜肽、脂質、小分子或核酸。激酶與結 合伴侣之交互作用的變化本身可表示該等交互作用形成之 機率增加或降低或激酶結合性伴侣複合物之濃度增加或降 5低。例如Rorl或Ror2蛋白質可以與另一蛋白質或多胜肽結 合並形成可調節Rorl或R〇r2活性之複合物。 -亥名詞仏號轉導路徑”係指可經由細胞膜傳播細胞外 仏5虎以蜒成細胞内信號之分子。該信號接著可刺激細胞反 應。涉及信號轉導過程之該等多胜肽分子可以是受體及非 1〇受體蛋白質路胺酸激酶。 文體係指一細胞内或該細胞表面上之分子結構，其 通系之特徵為可選擇性結合專一性物質。受體實例包括用 於胜肽激素、神經遞質、抗原、補體片段及免疫球蛋白之 細胞表面受體以及用於類固醇激素之細胞質受體。 15 該名詞“調節”係指機能之抑制、增強或誘導。例如基 因表現性之“調節，，或“調整，，係指基因活性之改質。表現性 之調節可包括，但不限於：基因活化作用及基因阻遏作用。 “調節”或“調整”亦指可增加或降低蛋白質、酶、抑制劑、 信號傳導劑、受體、轉錄活化劑、辅因子等之生物活性的 2〇方法、條件或藥劑。該活性之改變可以是mRNA轉譯、DNa 轉錄，及/或mRNA或蛋白質降解之增加或降低，其本身 可相當於生物活性之增加或降低。此增強作用或抑制作用 可取決於特定事件之發生，諸如信號傳導路徑之活化及/ 或僅在特定細胞類型中顯現。 37 200800266 μ即〇讀”係域生物活性之蛋白質形式而調節 之任何活性、病症、疾錢表現型。可藉影響生物活性蛋 白貝之/辰度，例如n調節表現性或降解作m經由基 質之抑制作用、活化作用、結合作用或釋放、化學性或結 5 構性改質法；或藉直接或間接交互個（其可包括額外因子) 而進行調節。 “調節劑”仙可改變特定活性之表現性，諸如骨形成 或Ror分子表現性，之任何藥劑。例如可調節骨形成、可改 變或更改(增加或降低)骨形成之_。節騎劃包括任 1〇何化合物，例如抗體、小分子 '胜肽、寡胜肽、多胜肽或 蛋白質。 “漿細胞”係指可特定用於抗體（免疫球蛋白）製造之成 熟B淋巴細胞。漿細胞很少在周邊血液中發現。其包含自 0.2%至2.8%骨髓白細胞數。成熟漿細胞通常呈橢圓形成傘 15形，長為8至15微米。其核呈偏心圓或橢圓形。 該名詞“小分子”係指合成或天然產生之化學化合物， 例如可選擇性經衍化之胜肽或寡核苷酸、天然產物或天然 或合成來源之任何其它低分子量（典型上小於約5 kDalt〇n) 有機、生物無機或無機化合物。此等小分子可以是治療上 20 可遞送之物質或可進一步經衍化以加速遞送。 如文中使用，該名詞“誘導劑，，係指可誘發、增強、促 進或增加特定活性’諸如骨形成或Ror分子表現性，之任何 藥劑。 如文中使用’該名詞“抑制劑”或“阻遏劑，，係指可抑 38 200800266 阻遏或降低特定活性，諸 現性，之任何藥劑。 砜式刀于衣 如文中使用，分々 5 10 15 20 之任何化合物或4^“藥劑’’或“試驗藥劑”係指欲測試 胜肽、小分發明之藥劑實例包括，但不限於： 藥劑。如文中使用二可任意選擇或合理地選擇或設計 部位之於、，"在不需考慮該藥顯目標化合物或 意選擇互作用下任意選擇藥劑時，該藥讎稱具“任 物或部位之特::::，當以必需考慮該藥劑與目標化合 之特疋父互作用及/或與該藥 _，該一:=: 如文中使用，該名詞“抗體，，係指免疫埭蛋白或其免产 活I·生射”（例如抗原結合部份)。該抗體可天'=

，成製成。免疫球蛋白分子之免疫活性部份之= 括可糟使_，諸如胃蛋白酶，裂解該抗體而產生之F

Fv，W㈣片段。可_專〜性結合能力之其所有街生物 亦涵盍在該名詞中。該名詞亦涵蓋具有與免疫球蛋白結合 =、、、D構域同源或大部份同源之結合性結構域的任何蛋白 質。这些蛋白質可衍生自天然來源或部份或全部合成製 成。抗體可以是單株或多株抗體。該抗體可以是許多任$

免疫球蛋白軸，其包括下述人類種射之任—種：Ig(J 柳、IgA、IgD，及IgE。然而就本發明而言，通= 該IgG種類之衍生物。 土马 該名詞“抗體片段，，係指低於全長之一抗體的任何衍生 39 200800266 物。該抗體較佳可保有至少大部份該全長抗體之專一性結 合能力。抗體片段之實例包括，但不限於：Fab、Fab，、 F(ab’)2、scFv、Fv、dsFv雙鏈抗體，及Fd片段。可藉任何方 法而製成該抗體片段。例如可藉一完整抗體之斷碎而酶催 5性或化學性製成該抗體片段，或其可自將該部份抗體序列 編碼之基因重組性製成。或者，可全部或部份合成性製成 該抗體片段。該抗體片段可選擇性為單鏈抗體片段。或者， 忒片段可包含，例如藉二硫化物鍵合物或其它更合適鏈合 物而鍵結在一起之多鏈。該片段亦可選擇性為多分子複合 10物。一機能性抗體片段典型上可包含至少約50個胺基酸， 且更典型上可包含至少約200個胺基酸。在特定實施例中， 該抗體片段精確地具有2、3、4或5個抗原結合部位。具有2 個抗原結合部位之片段特別適用於本發明。在不會形成多 聚物複合物之情況下，此等藥劑可二聚合R〇r2。 15 單鏈Fvs(scFvs)為僅由藉多胜肽交聯劑而彼此共價結 合之可變輕鏈(vL)及可變重鏈(VH)所組成的重組型抗體片 段。VL或VH可以是NH2·末端結構域。該多胜肽交聯劑可以 具可變長度及組成物，其限制條件為這兩種可變結構之橋 接不會發生嚴重位阻干擾。典型上，該等交聯劑主要由夾 20 雜一些麩胺酸或賴胺酸殘基以方便溶解之甘胺酸及絲胺酸 殘基的片段所組成。 雙鏈抗體為二聚合scFvs。該等雙鏈抗體之組份典型上 比大部份scFvs還短之胜肽交聯劑，且其可優先結合以作為 二聚物。 40 200800266

Fv片段為由非共價交互作用而結合在一起之一γΗ及一 VL結構域所組成。文中使用該名詞dsFv以指具有可安定化 該Vh-Vl對之經安排分子内二硫化物鍵的FV。 F(ab’)2片段為本質上相當於於1>114.〇至4.5下藉酶（胃蛋 5白酶）消化而得自免疫球蛋白（典型上為IgG)之抗體片段。該 片段可以經重組性製成。

Fab片段為本質上相當於藉連結該F(ab，)2中之兩重鏈 片段之該二硫化物橋基或橋基群之還原反應而獲得的抗體 片段。該Fab之片段可經重組性製成。 10 Fab片段為本質上相當於藉使用該酶（胃蛋白酶）消化免 疫球蛋白（典型上為IgG)而獲得之抗體片段。該触片段之重 鏈嵌段為該Fd片段。 如文中使用，該名詞“報告基因”係指其表現型表現很 谷易I測之任何基因。在篩檢時，特別可使用報告基因以 15測疋那一些試驗藥劑可活化傳訊路徑。該報告基因係操作 I*生連接至藉該傳訊路徑而控制之促進子或其它調節元素。 疋貝知例中，係製成重組型DNA結構物，其中該報告 $因係機能性連接至促進子區域或特別重要之其它調節區 j且该結構物係轉移感染入細胞或有機體内。習用之報 2〇 口基因的實例包括蟲螢光素酶（LUC)、綠色螢光蛋白質 2 )冷-半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖苷酸酶(GUS)，及 氯挺素乙酿基轉移酶(CAT)。 如文中使用，該等名詞“治療法，，、“治療，，，及“療法，， 係七可刺激骨細胞分化或骨形成、延緩骨病症症狀之形 41 200800266 成，及/或降低骨病症之嚴重性及/或預期可自典疒疒/ 成之此等症狀的治療性療法及預防性或防止性操作法或操 作法。該等名詞進-步包括改善現存的骨病症症狀、預^ 另外症狀、改善或預防症狀之根本代謝病因、預防或逆轉 5症狀之代謝病因或預防或促進骨生長。因此，該等名1表 示已帶給罹患骨病症或可能得到此病症之患者有利^結 果。而且，該名詞“治療法”之定義為對患者或得自羅患: 病、疾病之症狀或易患病之體質的患者之單離組織或細胞 株施用或投予藥劑（例如治療劑或治療組成物）以治療、治 10癒、舒緩、改變、消除、改善、改進或影響該疾病、疾病 之症狀或易患病之體質。如文中使用，“治療劑，，係指有助 於治療疾病，例如調節骨形成活性或誘發新骨形成，之任 何物質或物質之組合。因此，治療劑包括，但不限於：小 分子、胜肽、抗體、核酶及反訊息寡核苷酸。 15 治療劑或治療組成物亦可包括以可預防及/或減少特 定疾病之症狀的藥學上可接受形式之化合物。例如治療組 成物了以疋犯預防及/或減少骨關聯性病症之症狀的藥學 組成物。已預期本發明該治療組成物可以以任何合適形式 提供。該治療組成物之形式係取決於許多因素，其包括用 2〇藥方式。該治療組成物可含有稀釋劑、佐劑及賦形劑成份。 可藉骨密度（礦物之克數/體積之厘米3)及骨性質（礦 貝化作用、骨構造、骨更新、細微骨折）而測定骨強度。通 常使用骨礦質密度(BMD)作為測定骨強度之方法。例如若 骨之BMD低於年青白種成年婦女之BMD平均值2.5個標準 42 200800266 偏差以下者則可表示該骨得到骨質疏鬆症（World Health Organization，1994，Assessment of Fracture Risk and it’s

Application to Screening for Postmenopausal Osteoporosis. Technical Report Series 843. Geneva: World health 5 Organization) o “骨組織”係指鈣化組織(例如顱蓋、脛骨、股骨、椎骨、 牙#)、骨小樑、骨髓腔(其係為非該骨小樑之腔）、骨皮質（其 覆蓋該骨小樑及骨髓腔之外周）等。骨組織亦指通常位於礦 • 質化膠原之基質内的骨細胞；提供該等骨細胞之營養的血 10官；骨髓抽吸物；關節流體；衍生自骨組織之骨細胞；且 了包括月曰肪骨髓。骨組織包括骨產物，諸如全骨、全骨之 刀片月碎片、骨粉、骨組織活體切片、膠原製劑或彼等 之混合物。就本發明而言，除非另有指定，該名詞“骨組織,， 係用以包含所有上述之不論是人類或動物的骨組織及產 15 物。 - 如文中使用，“骨關聯性活性，，包括骨形成活性及骨質 2吸收雜。可藉增加成骨細胞活性、得自骨粗細胞之成 二細胞分化，及成骨細胞的增生；藉降低成骨細胞肩零及 =彼等之任何M合而誘發骨形成活性。此外，可藉降低姓 2〇骨=胞活性、餘骨細胞分化及增生；藉增加蚀骨細胞调零 及错彼等之任何組合而抑制骨質再吸收活性。 7 交、文中使用，該詞語“調節骨形成，，係指骨形成之增加 =降低。#加骨形成”係意指補充成骨細胞或成骨細胞先 質至骨部位，其可導致該等細胞分化成為成熟的成骨細胞 43 200800266 且其分泌之膠原性質質可礦質化内部骨物質並增加該部位 之骨質。該名詞亦涵蓋藉成熟的成骨細胞而導致膠原性基 質之產生及分泌增加。可藉以下一或多種方式而測定增加 的骨形成：骨折速率之降低、區域性骨密度之增加、體積 5的破質骨密度之增加、小樑接合性之増加、小襟密度之增 加、皮質密度或厚度之增加、骨直徑之增加，及無機骨含 量之增加。增加的骨形成可起因於骨細胞，例如成骨細胞， 之增加的附著、增生、殘活及/或分化，及後續之骨礦質 化作用。 10 15 “骨關聯性病症”包括骨形成及骨再吸收之病症。這此 疾病及病症包括，但不限於：佝僂症、骨軟化症、骨質減 少症、骨硬化症、腎性骨營養不良、骨質疏鬆症（其包括老 年及停經後的骨質疏鬆症）、潘吉德氏症、骨轉移、血鈣過 高症、副曱狀腺機能亢進、骨石化症、牙周炎，及骨代、 之異常變化，其可和風濕性關節炎及骨關節炎一起發生 這些疾病之一部份的特徵為不足夠的骨形成或骨質流失 但是其它則包括骨組織之異常增厚或硬化。可彳 件W於抑制 月之異常增厚的疾病實例包括，但不限於骨石化症 化症 及骨石更 “骨關聯性藥劑”係指可影響骨形成或骨再吸收之p 劑。“骨關聯性藥劑，，可誘發合成代謝或分解代謝作用，/、 抑制骨再吸收並導致骨礦質密度增加，可增加骨形成或口 維持骨形成與骨再吸收之平衡。 $可 二乂指化 該等名詞“化合物”或“藥劑，，在文中係交換使用 44 200800266 合物或化合物群或物質組成物，其當對患者（人類或動物） 投予時可藉局部及/或全身性作用而誘發所欲藥理及/或 生理作用。 該名詞“患者”係指任何哺乳動物，其包括人類或非人 . 5類病患。非人類病患可包括實驗、試驗、農業、娛樂或伴 侣動物。患者可以是人類。患者可以是馴化動物，諸如狗、 貓、牛、山羊、羊、豬等。患者可以是實驗動物，諸如小 鼠、大鼠、兔子、猴子等。 鲁 该名同“生物試樣”廣義上包括任何細胞、組織、生物 1〇流體、器官、多細胞有機體等。生物試樣可衍生自，例如 細胞或活體外組織培養物。或者，生物試樣可衍生自活有 機體或衍生自單細胞有機體之群體。生物試樣可以是活組 織，諸如活骨。該名詞“生物試樣，，亦有意包括以下試樣， 諸如自患者離析之細胞、組織或生物流體，以及存在於患 - 15者體内之試樣。亦即可使用本發明該檢測法以檢測活體外 及活體内之生物試樣中之R〇r mRNA、蛋白質、基因組DNA _ 或活性。例如用於檢測Ror mRNA之活體外技術包括

TaqMan分析、北方雜交反應，及原位雜交反應。用於檢測 Ror蛋白質之活體外技術包括酶聯免疫吸附分析法 20 (ELISA)、西方墨點法、免疫沉澱法及免疫螢光法。用於檢 測Ror基因組DNA之活體外技術包括南方雜交反應。 圖式簡單說明 自上述詳細說明及可形成本發明之一部份之附圖可更 詳細瞭解本發明。 45 200800266 第1圖係表示下調R〇r2表現性可抑制人類間質幹細胞 (hMSC)之經dex誘發的骨生成分化。使人類MSC經含Ror2-專一性shRNA或EGFP-專一性shRNA(對照物）之腺病毒表 現性載體感染並在經〇.〇5mM抗壞血酸、i〇mM /3-磷酸甘 5 油酯（yS -GP)及ΙΟΟηΜ地塞米松(dex)補充之MSC生長培養 基(MSCGM)中培育。經培育9天後，使全部細胞蛋白質萃 取物（50微克/每道）進行用於作為免荷對照物之該内源性 Ror2蛋白質或/3-肌動蛋白的西方免疫墨點法(A)。經培育11 天後，進行茜素紅-S染色(B)並定量(C)以評估礦質化基質形 10 成之程度。在C中，在EGFP shRNA存在下，茜素紅-S之併 入量被設定為100%。B及C中之結果代表3次獨立之實驗（第 1圖適用於實例1)。 第21係表示R0r2過度表現性可抑制hMSC之脂肪生成 分化。A.使人類MSC經)S -半乳糖苷酶（召_gal)、Ror2或 15 R〇r2KD感染並在經脂肪生成混合劑補充之MSCGM中培育 8天。離析總細胞RNa並使用得自Applied Biosystems之引子 及探針進行脂肪生成轉錄因子C/ΕΒΡα及PPARr之實時 RT-PCR分析。使mRNA之含量與各試樣中之環費林B的表 現性歸一化並將經/3 -gal感染之細胞中的mRNA表現性含 20 量設定為 100%。B·使人類MSC經 yS -gal、R〇r2或Ror2KD 感染’培育在經脂肪生成混合劑補充之MSCGM中，費時21 天’然後進行油紅Ο染色（第2圖適用於實例2)。 第3圖係表示R〇r2蛋白質之過度表現性可增加總骨面 積’但並非增加新生小鼠顱蓋中之成骨細胞數。使4天大的 46 200800266 小鼠同窩動物之顧蓋骨未經感染（對照物）或經將半乳糖 鶴⑹或人齡〇哪2)編碼之腺病毒感染。在腺病毒存在 下培育7天後，以蘇木素及曙紅將顱蓋染色，然後評估總骨 面積及成骨細胞數。在未經感染之培養物中所獲得之值被 5設定為1〇〇〇/0。該等結果為每一狀況4至5個顧蓋的v兕平均 值(與万-半乳糖苷酶感染比較，★-P<〇〇1)。該圖解表示3 次獨立實驗（第3圖適用於實例3)。 第4圖係證明R0r2蛋白質可結合14_3部並在酪胺酸 (群)上將其磷酸化。使112〇3細胞經/5_(/3)、11〇1>2(112)或 10 R〇r2KD(KD)腺病毒感染並在24至28小時後，製備全細胞溶 解產物並使用抗Flag(A)、抗14-3-3 /3 (B)或抗碟酸路胺酸(〇 抗體進行免疫沉澱。藉使用指定之抗體進行免疫墨點法而 分析該等免疫沉澱物（第4圖適用於實例4)。 第5圖係表示内源性R〇r2蛋白質可媒介活體内之14_3-3 15 β墙酸化反應。使U20S細胞短暫地經Ror2 siRNA或非專一 性siRNA轉移感染並在48小時後，使用每道5〇微克萃取物， 使用總細胞蛋白質萃取物進行該内源性Ror2蛋白質或万_ 肌動蛋白（負荷對照物）之西方免疫墨點法(A)。亦直接(20微 克/道)或在使用抗填酸酪胺酸抗體進行免疫沉澱法後，藉 20 14-3-3 /3抗體而分析相同溶胞產物(B)(第5圖適用於實例4)。 第6圖係表示Ror2蛋白質之胞液結構域結合至14_3-3/3 並直接活體外磷酸14-3-3/3。A.使Ror2之經GST標記的胞 液結構域(GST-R2C)或GST單獨連接至麵胱甘肽塞法羅斯 糖粒並於4°C下經活體外轉譯的14-3-3万培育4小時。以抗 47 200800266 14-3-3 /3抗體分析該結合物質。B.使用Ror2蛋白質 (GST_R2c，Invitrogen)之純化重組型胞液結構域及純化重組 型GST-14-3-3yS(Biomol，Inc·)，如“通用方法，，中所述之方法 進行活體外激酶分析（第6圖適用於實例4)。 5 第7圖係表示R〇r2-專一性抗體可導致該R〇r2受體之二 聚合反應及活化作用。A.為說明二聚合反應，使U20S細 胞經於COOH末端經Flag(R2-F)或His(R2-H)抗原決定位標 記物標記之Ror2表現性質體轉移感染。24小時後，於37°C 下使該等細胞經Ror2-專一性山羊多株IgG或非專一性山羊 10 IgG處理，費時一小時，並製備該等全細胞蛋白質萃取物， 然控免疫沉澱在抗Flag親和性瓊脂糖上。藉使用抗His抗體 進行免疫墨點法而分析該等沉澱物（最上面的一組）。最下面 的一組係表示使用抗Flag抗體再探查相同膜之沉澱含量對 照物。B.為說明活化作用，以如A中所述之Ror2·專一性抗 15 體或對照物IgG處理未經轉移感染之U20S細胞，且該等全 細胞萃取物係沉澱在抗磷酸酪胺酸抗體上並經R0r2或 14-3-3々抗體分析（第7圖適用於實例5)。 第8圖係表示R0r2抗體可導致hMSC中之礦質化基質形 成。在經非專一性山羊IgG、該R〇rl-專一性山羊IgG(各50 20 微克/毫升）或漸增濃度之該Ror2-專一性山羊IgG補充之含 0v05mM抗壞血酸、l〇mM y5-GP及lOOnMdex的MSCGM中 培育人類MSC。培育9天後，藉茜素紅-S染色法而評估該基 質礦質化反應之程度（第8圖適用於實例6)。 第9圖係說明經由R0r2而媒介之藉Ror2抗體所誘發的 48 200800266 該hMSC礦質化反應。A•使hMSC經含有對R〇r2或EGFp(對 照物）具shRNA專一性之腺病毒表現性載體感染，並在經 0.05mM抗壞血酸、1〇mMdex補充之 MSCGM中培育。經9天培育後，藉茜素紅—s染色法而評估 5 該基質礦質化之程度。B·使人類MSC經Ror2腺病毒感染24 小¥ ’然後在含有〇·〇5πιΜ抗壞血酸、lOmM /S-GP及Ror2_ •專一性山羊IgG或非專一性山羊igG之MSCGM中培育19 天，接著經茜素紅-S染色（第9圖適用於實例6)。 # 第10圖係說明下調14-3-3 /3可增強hMSC中之礦質化 10 基質形成。使人類MSC經含有雜亂的shRNA ; 14-3-3^-專 一性shRNA ; /3 ·半乳糖苷酶（厶-gal)過度處理性序列盒或 R〇r2過度表現性序列盒之腺病毒表現性載體感染並在經 0.05mM抗壞血酸、l〇mM yS -GP及l〇〇nM dex補充之 MSCGM中培育。經9天培育後，使50微克該等全細胞蛋白 15 質萃取物進行該内源性14-3-3々蛋白質之西方免疫墨點法 (A)。經12天培育後，進行茜素紅-S染色法(B)以評估礦質化 • 基質形成之程度（第10圖適用於實例7)。 第11圖係說明Ror2抗體處理及14-3-3/3下調可促進活 體外新骨形成。使小鼠顱蓋骨經含對14-3-3/3具專一性之雜 20 亂shRNA(scr)或shRNA的腺病毒感染；且48小時後，在卡 勒森存在下經12微克/毫升之抗R〇r2抗體或非專一性IgG 處理。經腺病毒及抗體培育7天後’以蘇木素-曙紅將顧蓋 染色並測定總骨面積（空心條)及成骨細胞數(實心條)。在經 雜亂shRNA感染及經IgG處理之培養物中所獲得之值被設 49 200800266 定為100%。該等結果為每一狀況(*_p<0 〇5)4個顱蓋 SE平均值（第11圖適用於實例8)。 第12圖係闡明形成用於R〇r2活性之高通過料量、高靈 性分析。A·該分析之圖示係利用該TrkB受體之傳訊路徑。 5該了1^6受體係藉經配位體誘發之均二聚合反應而活化，該 經配位體誘發之均二聚合反應可導致Erk之磷酸化反應及 目標基因之促進子中的cAMP反應元素(CRE)之刺激作用。 我們已產生由和該穿透膜融合之R〇r2的細胞外結構域 (aal_407)，及TrkB之細胞内結構域(aa 432-822)所組成之嵌 10合型受體。當使用該嵌合體時，可導致R〇r2二聚合反應之 藥劑能活化TrkB傳訊路徑且可藉cre促進子-蟲螢光素酶 報告基因分析而評估該活化作用。Β·使HEK 293細胞穩定 地經該R〇r2-TrkB嵌合體及CRE-蟲螢光素酶質體轉移感 染，經指定量之該抗Ror2抗體或非專一性igG處理24小時， 15並評估蟲螢光素酶活性。藉經該非專一性IgG處理而觀測之 蟲螢光素酶活性被設定為1。該等結果表示3種獨立實驗(v SE平均值；n=4 ; ★-pCO.OSX第12圖適用於實例9)。 L實施方式3 較佳實施例之詳細說明 本發明係基於Roi*族及其下游傳訊生物分子在骨代 謝，特別為成骨細胞分化，中起作用之發現。見美國專利 申請案U.S.S.N· 10/823,998、60/463,364，及60/501，340，其 各在此併入本案以為參考資料。申請者已發現下調Ror2表 現性可抑制人類間質幹細胞之經地塞米松誘發的骨生成分 50 200800266 化（第1圖）。反之，R〇r2之過度表現性可抑制人類間質幹細 胞之脂肪生成分化（第2圖）。申請者亦已證明下調14-3-3/3 表現性可增強人類間質幹細胞中之礦質化基質形成(第10 圖）。而且，Ror2過度表現性及14-3-3万抑制作用可誘發比 5 單獨之作用更大的基質礦質化反應（第10圖）。基於這些發 現，於蛋白質層次下可調節Ror2活性或調節14-3-3/5活性之 藥劑或其醫藥組成物可用於治療骨疾及/或代謝病症，諸 如肥胖症或糖尿病。的確，可增加R〇r2蛋白質活性之藥劑 能促進成骨細胞分化並藉以增加礦質化骨形成（第8及9 10圖）。同樣，可抑制14-3-3沒活性之藥劑能促進成骨細胞分 化並藉以增加礦質化骨形成（第1〇圖）。 本發明一方面係提供可調節（增加或降低)R〇r2蛋白質 活性之藥劑。在特定實施例中，該等藥劑可增加R〇r2蛋白 質之活性。在其它實施例中，該等藥劑可降低R〇r2蛋白質 15之活性。典型上’這些藥劑係於蛋白質層次下作用以增加 或降低Ror2蛋白質之活性含量。如文中所述，可增加R〇r2 活性之藥劑適用於促進礦質化骨形成及骨生成分化。這些 某4亦可藉抑制脂肪生成分化而適用於治療肥胖症（第2 圖）。不想受限於j壬㈣寺定理論，增加的触2活性似乎可促 20進月生成分化並抑制脂肪生成分化。 可調即Ror2活性之這些藥劑可以是任何化學化合物類 型，其包括小分子、多核苷酸、蛋白質、胜肽等。在特定 貝化例中’该藥劑為蛋白質。在其它實施例中，該藥劑為 肽在又其匕實施例中，該藥劑為多核苷酸。在又其它 51 200800266 實施例中，該藥劑為小分子(例如具有分子量小於1500克/ 莫耳之分子）。該藥劑較佳對Ror2蛋白質具專一性且並不會 結合至其它生物分子。更詳細地，在特定實施例中，該藥 劑並不會結合至其它Ror族成份。在其它實施例中，可能與 5 其它生物分子或Ror族成份進行交錯反應；然而，該藥劑對 這些其它分子之親和力小於對Ror2蛋白質之親和力。-在特定實施例中，該藥劑係藉導致兩Ror2蛋白質之二 聚合反應而作用。該等R〇r2蛋白質之二聚合反應被認為會 導致Ror2受體之活化。該Ror2激酶活性之活化可導致其結 10 合伴侣（其包括14-3-3万蛋白質）之鱗酸化反應。其它Ror2結 合伴侣包括，但不限於：ADP/ATP載體蛋白質、似UDP-葡 萄糖神經醯胺葡萄糖基轉移酶-1、14-3-3蛋白質7、核糖體 結合蛋白（ribophorin) I、精胺酸N-甲基轉移酶1、細胞凋零 易感性蛋白質、NOTCH2蛋白質，及人類骨骼肌以]^·蛋白 15質3(Billiard等人，2004年4月14曰申請之美國專利申請案 U.S.S.N· 10/823,998)。該藥劑典型上包括至少兩個送至 Ror2蛋白質之結合結構域。在特定實施例中，該藥劑精確 地具有兩個送至R〇r2蛋白質之結合結構域，亦即該藥劑具 二價。具多價之其它藥劑亦可用於本發明。在特定實施例 2〇中，該藥劑為可促進Ror2蛋白質之二聚合反應的小分子或 多核苷酸。在其它實施例中，該藥劑為蛋白質或胜肽。 在特定實施例中，該藥劑為針對R〇r2蛋白質之抗體或 抗體片段(例如雙鏈抗體）。該抗體或抗體片段針對R〇r2蛋白 貝之任何區域；然而，該抗原結合部位較佳未送至可能干 52 200800266 擾Ror2之生物活性（例如激酶活性）或干擾這兩種蛋白質之 一聚合反應的區域。藉該抗體或抗體片段而結合兩種R〇r2 蛋白質可促進該等Ror2蛋白質之二聚合反應，並藉以促進 其活化。該抗體可以是多株或單株抗體。該抗體可以是任 5何同型物；然而，通常較佳為IgG同型物。該抗體可衍生自 任何物種；然而，就用於人類而言，該抗體典型上具人類 •起源或業經人源化。若該抗體欲用於其它物種，則可以使 该抗體適應該物種。在特定實施例中，該抗體為人源化單 Φ 株抗體。在其它實施例中，該抗體完全為人類抗體。在特 10 定實施例中，該抗體完全為人類單株抗體。 在特定實施例中，係藉使用純化人類R0r2蛋白質或衍 生自Ror2蛋白質之胜肽將哺乳動物（諸如兔子或其它嚙齒 目動物）免疫而製成針對R〇r2蛋白質之抗體。經免疫後，收 集可產生抗體之細胞，諸如B細胞或漿細胞並用以製備雜種 15 瘤，然後將其篩檢以製備針對R〇r2蛋白質之抗體。在特定 實施例中，係篩檢抗體之二聚合及/或活化R〇r2蛋白質之 ® 能力。一旦鑑定可產生所欲抗體之点細胞時，可以使該b 細胞永生。然可使用所形成之雜種瘤以製造所欲單株抗 體。可進一步特性化並修飾藉該雜種瘤而製成之抗體。例 20 如在特定實施例中，可人源化該抗體，因此對人類病患投 予該抗體時並不會導致逆反應，其範圍為自該治療性抗體 之增加清除率至致命過敏反應。在特定實施例中，係使用 可辨識Ror2蛋白質之該抗體區域（亦即互補性測定區域）以 取代具不同專一性之人類抗體的CDRs。用以設計並製備抗 53 200800266 體之技術在本項技藝係已知且揭示在以下專利中：1989年3 月28日頒予之美國專利第4,816,567號；1992年1月7日頒予 之美國專利第5,078,998號；1992年2月25日頒予之美國專利 第5,091，513號；1993年7月6曰頒予之美國專利第5,225,539 5 號；1996年12月17日頒予之美國專利第5,585,089號；1997 年12月2日頒予之美國專利第5,693,761號；1997年12月2曰 頒予之美國專利第5,693,762號；1991年頒予之美國專利第 5,869,619號；2001年1月30日頒予之美國專利第6，180,370 號；2003年4月15曰頒予之美國專利第6,548,640號；2005 1〇 年4月19日頒予之美國專利第6,881，557號；2006年1月3曰頒 予之美國專利第6,982,321號；這些專利在此皆併入本案以 為參考資料。在其它實施例中，係演化及/或修飾該抗體 以該一抗體對Ror2蛋白質具有較高專一性及/或親和力。 在其它實施例中，該藥劑包含針對Ror2蛋白質之抗體 15 的一片段。可使用送至R〇r2蛋白質之該抗體的一或多片 段。該片段典型上包括負責該等抗體對R〇r2蛋白質之親和 力的互補性測定區域(CDR)。為了將R〇r2蛋白質二聚合， R〇r2蛋白質需要至少兩結合部位；因此，該藥劑可以是兩 彼此連接之抗體片段。該等片段可共價性或非共價性連接 20 在一起。例如該抗體可以是兩共價在連接在一起之Fab片 段。該藥劑亦可以是雙鏈抗體。在特定實施例中，該藥劑 可包括超過兩抗體片段。例如該藥劑可包括3、4、5或6個 送至Ror2蛋白質之抗原結合部位。 在特定實施例中，該藥劑可以是蛋白質、胜肽或可模 54 200800266 擬$至Ror蛋白質（諸如R〇r2蛋白質）之抗體之抗原結合部位 W Η ° 根據送至版2蛋白質之該抗體之抗原結合部 位的、、Ό構以私腦模擬方式設計或鐘定這些藥劑。然後可在 各種活體外分析中測試該等藥劑以評估該藥劑二聚合及/ 5 2活化R〇r2蛋白質之能力。亦可使用利用小分子、胜肽或 夕核苦I之基因庫的高通過料量_檢方法以鑑定該等藥 劑。 本I月之另-方面係提供使用本發明藥劑以調節R〇r 活紅方法。可調節Ror蛋白質（特別為㈢蛋白質）之活性 w的藥劑適用於調節骨關聯性活性。在治療肥胖症 、糖尿病 或其它代謝病症時’這些藥劑亦可用以調節脂肪細胞分 化。有許多以需要調節骨關聯性活性，例如增加骨形成， 為特徵之疾病及病症。最顯著之病症為骨折，其較佳需要 刺激骨生長並加速且完成骨修復。例如可增強骨形成之藥 15劑潛在性可用於臉部重建程序或骨科構形程序。甚它骨缺 陷病症包括，但不限於：骨段缺陷、牙周病、轉移性骨疾、 溶骨性骨疾，及結締組織修復應該有利，諸如軟骨缺陷或 傷害之癒合或再生，之病症。亦重要為骨質疏鬆症，其包 括年齡關聯性骨質疏鬆症及與停經後的激素狀態之骨質疏 2〇鬆症。以需要骨生長為特徵之其它病症包括原發性及繼發 性副甲狀腺機能宄進、糖尿病關聯性骨質疏鬆症、廢用性 骨質疏鬆症，及腎上腺促糖皮質激素關聯性骨質疏鬆症。 可使用能增加活性之_以促進料化骨形成。 亦可使用這些藥劑以促進成骨細胞分化。可以損害脂肪生 55 200800266 成分化之情況下促進成骨細胞分化。亦可使用該等藥劑以 促進礦質化基質形成。 本發明另-方面係提供可調節（增加或降低如冬3(例 如、14_阶等）之活性的藥劑。在特定實施例中， 5該等藥劑可抑制14冬3之活性。在纟它實施例中，該等藥劑 可〜加14-3-3之活性。該藥劑彳以於該核酸或蛋白質層次下 作用。在特定實施例中1等藥劑可降低⑹部之表現 文中所述，月匕抑制14·3·3万活性之藥劑可用以促進礦 貝化月形成及骨生成分化。在特定實施例中，該藥劑可降 10低14-3 Α之表現性。這些藥劑亦可藉抑制脂肪生成分化而 適用於治療肥胖症、糖尿病或其它代謝性病症。不想受限 於任何特定理論，下調14叫特別為Μ·3部）表現性似乎 可促進月生成分化並抑制_肪生成分化。 可調節M·3·3活性之這些藥劑可以任何化學化合物類 15型，其包括小分擬、多核替酸、蛋白質、胜肽等。在特定 貝施例中錢劑為蛋自質。在其它實施例巾，該藥劑為 胜狀。在又其它實施例中，該藥劑為多核芽酸。在又复它 實施例中，該藥劑為小分子。在特定實施例中，該藥劑為 夕核苦酉夂。在特定實施例中，該藥劑為dna。在其它實施 20例巾ΰ亥藥劑為_八。在特定實施例中，該藥劑為 專一性RNAi。在特定實施例中，該藥劑為專—性 RNAi在特疋貫施例中，該藥劑為14-3-專一性siRNA。在 特定實施例中，該藥劑為14-3-3/S-專一性siRNA。在特定 實施例中，該藥劑為14_3-3_專一性shRNA。在特定實施例 56 200800266 中，該藥劑為14-3-3 0-專一性shRNA。在其它實施例中， 該藥劑對14-3-3 7具專一性。更詳細地，在特定實施例中， 該藥劑可專一性地將間質幹細胞或骨細胞（諸如成骨細胞) 中所發現之14-3-3作為目標。例如在特定實施例中，該藥劑 5 包括制訂目標之分子團。在特定實施例中，該制定目標劑 為雙膦酸鹽或其它骨器官制定目標制。 本發明另一方面係提供使用本發明藥劑以調節14-3-3 活性之方法。能調節14-3-3(特別為14-3-3々）活性之藥劑可 用以調節骨關聯性活性。這些藥劑亦可用以調節脂肪細胞 10 分化。有許多以需要調節骨關聯性活性，例如增加骨形成， 為特徵之疾病及病症。最顯著之病症為骨折，其較佳需要 刺激骨生長並加速且完成骨修復。例如可增強骨形成之藥 劑潛在性可用於臉部重建程序或骨科矯形程序。甚它骨缺 陷病症包括，但不限於：骨段缺陷、牙周病、轉移性骨疾、 15 溶骨性骨疾，及結締組織修復應該有利，諸如軟骨缺陷或 傷害之癒合或再生，之病症。亦重要為骨質疏鬆症，其包 括年齡關聯性骨質疏鬆症及與停經後的激素狀態之骨質疏 鬆症。以需要骨生長為特徵之其它病症包括原發性及繼發 性副甲狀腺機能亢進、糖尿病關聯性骨質疏鬆症、廢用性 20 骨質疏鬆症，及腎上腺促糖皮質激素關聯性骨質疏鬆症。 可使用能降低14-3-3活性之藥劑以促進礦質化骨形 成。亦可使用這些藥劑以促進成骨細胞分化。可以損害脂 肪生成分化之情況下促進成骨細胞分化。亦可使用該等藥 劑以促進礦質化基質形成。 57 200800266 (例如一質㈣或14:3^ 活性之任何經確認化合物 14'3'3 7 } 白質.免Π蛋白.A 服活性有機分子；蛋 i型上包St二 白片段;胜肽)。此等組成物 絲可人ΓΙΐ劑上可接受本發明該等組 、壬…… 或多種已知可調節骨關聯性 活性之㈣1。例如缺杨师或娜4·3韻性之藥劑 10 可口併I抑制似月貝再吸收雌激素、雙膦酸鹽或組織選擇 性雌激素(亦即選擇性雌激素受體調節綱職)）。本發明 藥劑可合併能促進㈣成之其它藥劑。 /使用/π療上有效劑置之_或多種藥劑。治療上有效劑 里係‘足以顯不益處(例如與經治療之病症、疾病或病症有 關之徵兆及/或症狀之減少）之該藥賴量。當適用於個別 15成份(單獨投予）時，該名詞係指單獨成份。當適用於-組合 時’该名詞係指可得到益處之該等成份的組合數量(不論係 一起、連績或同時投予）。例如治療用途之有效量為含可提 供以下益處之藥劑之組成物的數量：骨折修復之癒合率的 臨床上顯著增加；骨質疏鬆患者之骨質流失的逆轉及骨折 20的預防；軟骨缺陷或病症之逆轉；骨質疏鬆症發作之預防 或延緩；與骨質疏鬆症有關之進一步骨質流失的預防；骨 折接合不全及骨折分離牽開術骨生成中之骨形成的刺激及 /或抑制；彌補裝置内骨生長之增加及/或降低；牙缺陷 之修補等。可使用例行最佳化技術以測定此等有效量，且 58 200800266 其係取決於欲治療之特定病症、患者之身體狀況、用藥方 式、配方、開業醫生之判斷及熟悉本項技藝者已知之其它 因素。本發明該等化合物之所需劑量(例如就骨形成之增加 為所欲之骨質疏鬆症而言）為可嫁保治療組與對照組之骨 5質Ϊ有統計學的顯著差異之劑量。在治療組中可發現骨質 里之差異為5身/。或更多。在癒合時臨床上顯著增加之其它 ’則疋法包括例如用於斷裂強度及拉力、斷裂強度及扭力、 4點彎曲、骨活性切片中之增加連接性之試驗，及熟悉本項 技藝者熟知之其它生物機械試驗。治療方式之一般指導可 10得自以罹患該相關疾病之動物模式所進行之實驗。 可藉標準藥學程序在細胞培養物或實驗動物中測定藥 劑之毒性及治療效力，例如測定LD4可以使5〇%該群體死 亡之劑量）及ED%(對5〇%該群體治療上有效之劑量）。毒性 與治療效果之劑量比為治療指數且其可以以LD5G/ED5〇表 15不。較佳為具有大治療指數之藥劑或化合物。得自細胞培 養物分析及動物研究之資料可用以調配適用於人類之一系 列劑量。此等藥劑或化合物之劑量可以在包括具有幾乎無 毒性之ED5〇的一系列循環濃度内。根據所使用之劑型及使 採用之投藥方式，該劑量可以在該範圍内不等。 20 就用於本發明方法之任何藥劑而言，該治療上有效劑 量可以先自細胞培養物分析進行估計。例如可以以動物模 式調配一劑量以獲得包括如在細胞培養物或動物研究中所 測得之ED5 〇的循環血漿濃度範圍（亦即可以使R 〇 r2蛋白質 進行半最大二聚合反應之該試驗化合物的濃度）。可使用此 59 200800266 資訊以更準確地狀適用於人類之劑量。例如可藉HPLC而 測定血漿^之含量。可藉個別豐師根據患者之病症而選擇 d里Ww師可知如何且什麼時候終止、間斷或調整投 藥。反之’該巡診1師亦知若臨麵應料合it(不包括毒 性），則可將療法調整至較高層次。就相關病症之管理而 σ投予心之大小可隨欲治療病症之嚴重性而不同。可， 例如部份藉鮮預_估方⑽評傾触之嚴重性。而 且，該劑量及可能的劑量頻率亦可根據個別業者之年齡、 體重及反應。相當於上述之計劃可用於獸醫學。 10 彼狀況之合適劑量的狀法屬於本項技藝之技術。 1而5 ’紐用小於該化合物之最佳劑量的較小劑量進 订療法。其後，可藉小增量而增加該劑量，直到於該等環 境下達到最佳效果為止。例如可細分總每日劑量且若必 要，於治療當天期間-份—份地投予。每日劑量可分成2、 15 3或4份，其各於24小時期間投予。 就作為欲投予之藥劑的抗體或抗體片段而言，該藥劑 典型上係藉靜脈注射而投予。該劑量範圍可以是每隔_ k自至25毛克/么斤。在特定實施例中，該劑量範圍可以 疋每隔1至6週自1至1〇宅克/公斤。在特定實施例中，每隔 2〇 3至5個藉靜脈注射而遞送m毫克，公斤之該藥劑。在其 它實施例中，係每隔4週藉靜脈注射而遞送㈤毫克/公 之該藥劑。 根據欲治療之特定病，可調配藥劑並全身性投予或口 服。本發明藥劑組成物經調配可以與計狀投藥方式相 60 200800266 容。用於調配及投藥之技術可以在以下參考文獻中找到：

Remington’s Pharmaceutical Sciences，第 18 版，Mack Publishing Co” Easton，Pa.(1990)。合適的方式可包括口 服、直腸投藥、陰道投藥、經皮投藥、經黏膜投藥或腸投 5藥；非經腸遞送，其包括肌内注射、皮下注射及髓内注射； 以及椎管内注射、直接心室内注射、靜脈注射、腹膜内注 射、鼻内注射或眼内注射，這只是其中一些。可使用之一

些遞送方法包括，但不限於··在脂質體内包封、併入彌補 裝置中、藉反轉錄病毒載體的轉導，及活體外轉移感染細 10胞，並接著再植入或投予該等經轉移感染細胞。 當藥學上使用該等組成物時，其係併用“藥學上可接受 載劑”以進行診斷及治療用途。此等組成物之配方為熟悉本 領域者所熟知。本發明之藥學組成物可包含一或多種另外 藥劑且較佳包括藥學上可接受載劑。 15 20 合適的藥學上可接受載劑及/或稀釋劑包括任一種及 所有習知溶劑、分散介f、填料、固體鶴、水性溶液、 塗膜、抗細菌劑、抗真菌劑，等滲壓劑、吸收延緩劑等。 該名詞“藥學上可接受_，，係料會導致其所投予之患者 的過敏反應或其它不良作用。合適的藥學上可接受载:包 括，例如水、鹽液、磷酸鹽緩衝鹽液、右旋糖、甘油Y乙 醇等中之-❹種以及彼等之組合。藥學上可接受載劑可 進一步包含可增強該組成物中之-或多種_之擱置壽命 或有效性的少量輔助物質，諸如潤濕劑或乳化劑、防= 或缓衝劑。祕藥學上可接受物f之此等介質及藥劑的二 61 200800266 途在本項技藝中已為吾人所熟知。 5 10 15 20 用於非經腸、經皮或皮下投藥之溶液或懸浮液可包括 以下組份：無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽液、固定、、由 聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細菌劑，諸 如节醇或對錄苯甲酸甲目旨；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或 亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；緩衝劑，諸如 乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及調節滲性之藥劑，諸如氯 化納或右旋糖。pH可經酸或驗，諸如鹽酸或氫氧化鈉，二周 整。該非經腸製劑之封人安瓶、拋棄式注射器或由玻璃或 塑膠製成之多劑量小玻㈣。細於注射之藥學組成物包 括無菌水性溶液（就水溶性而言）或分散液及用於無菌可注 射溶液或分散〉夜之臨時性製劑之無菌散劑。就靜脈投藥而 言/合適的載劑包括生理鹽液、制菌水、Crem〇ph〇r E1®(BASF，parsippany，Ν· j·)或磷酸鹽緩衝鹽液。該載劑可以 是溶劑或含，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇， 及液體聚乙二醇等），及彼此之合適混合物的分散液介質。 可，例如藉使用塗膜(諸如卵磷脂）、藉維持所需粒度（就分 月欠液而言）及藉使用表面活化劑而維持合適流動性。可藉各 種抗細菌劑及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、 酚、抗壞血酸、硫抑汞(thimerosal)等，而預防微生物之作 用。在許多情況下，該組成物較佳包括該等滲劑，例如糖 或♦醇(諸如甘露醇 '山梨糖醇）、氯化鈉。可藉包含能延緩 吸收作用之藥劑（例如單硬脂酸鋁及明膠）在該組成物中而 延長該等可注射組成物之吸收作用。 62 200800266 而且，用於治療藉本發明而確認之疾病及病症的該等 藥劑亦可以與經選用可特別對抗欲治療之病症的其它治療 劑共投予。例如該等藥劑可合併雌激素或雌激素關聯性化 合物或其它骨再吸收抑制劑。雌激素化合物包括，但不限 5 於：結合雌激素、雌二醇，及彼等之類似物。其它骨關聯 性治療化合物包括，但不限於：雙膦酸鹽及其相關化合物 (諸如美國專利第5,312,914號中所揭示之化合物）、鈣補充物 (Prince，R丄·等人，N· Engl· J· MecL 325, 1189,（1991))、維 生素D補充物(ChapuyM.C·等人，Ν· Engl. J· Med. 327, 1637, 10 (1992))、氟化鈉(RiggS，B L 等人，N Engl. J. Med.，327, 620, (1992)、雄激素(Nagent de Deuxchaisnes，C·，in Osteoporosis，a Multi-Disciplinary Problem, Royal Society of Medicine

International Congress and Symposium Series No. 55,

Academic Press，London，p. 291，（1983)，及降辦素 15 (calcitonin)(Christiansen，C·，Bone 13(Suppl· 1): S35,（1992)) 〇 本發明另一方面係提供一種用於鑑定可活化R0r蛋白

質之藥劑的系統。用於測定藥劑是否可改變R〇r2蛋白質活 性之方法包括進行熟練的技術人員已熟知之分析及化驗。 實例包括，但不限於：組織化學分析法、西方墨點分析法、 20 ELISA、酶分析法(例如激酶分析法）、及機能性分析法，其 包括，例如Ror或14-3-30磷酸化反應程序之測定(較高之磷 酸化狀態表示較高的活性）。在特定實施例中，係藉測定業 經證明可結合Ror2蛋白質並欲藉Ror2蛋白質而填酸化之 14-3-3 /5的磷酸化狀態而評估該Ror(特別為R0r2蛋白質）之 63 200800266 活性。可使財項技藝巾已知之任何技術崎估i4叫蛋 白貝之知酸化反應。更詳細地，在14_3,蛋白質之鱗酸化 反應後可使用利用抗碟酸酪胺酸抗體進行之免疫消殿 法。或者，亦可使用嶙之放射性同位素(例如32ρ个Ατρ)。 5 本發明亦提供一種用於鏗定可調節骨關聯性活性之藥 劑的方法’其中R0r分子(例如R〇r2蛋白質）活性之增加或降 低表示該藥劑可調節骨關聯性活性。 在特定實施例中，本發明提供一種鑑定可使用藉R〇r2 之一聚合反應而調節之嵌合型受體(例如R〇r2/TrkB)及報告 10基因（諸如蟲螢光素酶）以促進R0r2之二聚合反應的藥劑之 方法。在特定實施例中，可表現含R〇r2之細胞外結構域融 合至TrkB之細胞内結構域的嵌合型受體之細胞係用於本發 明分析中。在特定實施例中，R0r2蛋白質之細胞外結構域 的胺基酸1至407係融合至TrkB之穿透膜及細胞内結構域 15 (胺基酸432至822)。在其它實施例中，不同的細胞内結構域 係用以建構該嵌合體。例如可使用藉二聚合反應而活化之 任何細胞内結構域以取代該TrkB結構域。該細胞内結構域 較佳得自單跨距穿透膜受體，且該傳訊路徑係已知。可用 以製備該嵌合型受體之其它細胞内結構域的非限制性實例 20 包括TrkA、TrkC、EGFR、PDGER，及FGFR之細胞内結構 域。該細胞内結構域係藉該細胞外結構域之二聚合反應而 活化且啟動傳訊連鎖反應，其最終可導致一報告基因之上 調。例如就該Ror2/TrkB嵌合體而言，可二聚合該嵌合型受 體之細胞外Ror2結構域的藥劑可導致該TrkB傳訊路徑之活 64 200800266 化忒TrkB傳訊路徑之活化係藉使用cAMp反應元素(cre) 促進子報口基因系、统而評估。另一傳訊路徑，諸如， 之活化需要另-報告基因系統，諸如奶皿結合元素為主 之系統’其接著增加受其控制之位何報告基因的表現性。 可以使令易經分析之以告基因，諸如蟲螢光素酶(Luc)、綠 色螢光蛋白質(GFP)、半乳糖苦酶(GAL)u萄糖苦 fecSf(GUS)、氯彳放素乙酿基轉移酶(CAT)等，受到該促 進子之控制並用於本發明分析中。在特定實施例中，蟲螢 光素酶係作為該報告基因。在其它實施例中，綠色螢光蛋 °白貝係作為该報告基因。在特定實施例中，質體上之CRE 促進子-報告基因結構物係轉移感染入可表現該嵌合型受 體之細胞内。在其它實施例中，該結構物為該細胞基因組 之一部份。在特定實施例中，該結構物係穩定地轉移感染 入該細胞内。使用文中所示可二聚合R〇r2之R〇r2-專一性抗 15體已證實以該Ror2/TrkB嵌合體為主之本發明分析系統有 效。該Ror2-專一性抗體可導致所觀測報告基因（亦即蟲螢光 毒酶)活性之劑量依存在增加。見第12圖。 可使用和對應促進子系統配對之不同細胞内結構域修 飾本發明嵌合型受體分析系統。其它細胞内結構域之實例 20包括TrkA、TrkC、EGFR、PDGEH，及FGFR之細胞内結構 域。然後藉該細胞内結構域而調節之對應促進子可用於該 報告基因系統中。例如STAT結合元素可用於使用具有該 EGFR細胞内結構域之嵌合型受體的系統内。 本發明包括用於進行本發明嵌合型受體分析之套組。 65 200800266 這些套組包括使用本發明分析以篩檢試驗劑所需之部份或 所有組份。在特定實施例中，該套組之組份係經合適包裝 以方便研究者使用。該套組可包括任一種或所有以下組 伤· DNA結構物、細胞株、緩衝劑、酶、多井平皿、正及 5負對照物、介質、抗體、核苷酸、用法說明等。在特定實 施例中，該套組包括一可表現該Ror2/TrkB嵌合型受體之細 胞株。在其它實施例中，該套組包括可將該Ror2/TrkB嵌合 型受體編碼之DNA結構物。在其它實施例中，該套組包括 可操作性連接至CRE促進子之報告基因。在特定實施例 10中’該套組包括可操作性連接至CRE促進子之蟲螢光素酶 基因。該報告基因/CRE促進子結構物可以是質體。 本發明包括用於上述本發明分析之具有細胞外Ror2結 構域之該嵌合型受體。嵌合型R〇r2/IYkB受體之胺基酸實例 如下。衍生自該Ror2蛋白質之胺基酸序列係以大寫字母表 15 示；衍生自該TrkB蛋白質之胺基酸序列係以小寫字母表示。 MARGSALPRRPLLCIPAVWAAAALLLSVSRTSGEVEVLDPNDPLGPLDGQ DGPIPTLKGYFLNFLEPV匪ITIVQGQTAILHCKVAGNPPPNVRWLKNDAP VVQEPRRIIIRKTEYGSRLRIQDLDTTDTGYYQCVATNGMKTITATGVLFV RLGPTHSPNHNFQDDYHEDGFCQPYRGIACARFIGNRTIYVDSLQMQGEIE 20 NRITAAFTMIGTSTHLSDQCSQFAIPSFCHFVFPLCDARSRAPKPRELCRDE CEVLESDLCRQEYTIARSNPLILMRLQLPKCEALPMPESPDAANCMRIGIP AERLGRYHQCYNGSGMDYRGTASTTKSGHQCQPWALQHPHSHHLSSTD FPELGGGHAYCRNPGGQMEGPWCFTQNKNVRMELCDVPSCSPRDSSKM GILYlsvyavvviasvvgfcllvmIfllklarhskfginkgpasvisndddsasplhhisn gsntpssseggpdaviigmtkipvienpqyfgitnsqlkpdtfvqhikrhnivlkrelge gafgkvflaecynlcpeqdkilvavktlkdasdnarkdfhreaelltnlqhehivkfygv cvegdplimvfeymkhgdlnkflrahgpdavlmaegnppteltqsqmlhiaqqiaagmvy lasqhfvhrdlatrnclvgenllvkigdfgmsrdvystdyyrvgghtmlpirwmppesim yrkfttesdvwslgvvlweiftygkqpwyqlsnneviecitqgrvlqrprtcpqevyelm lgcwqrephmrknikgihtllqnlakaspvyldilg(序列辨識編號：4) 66 200800266 如熟悉本項技藝者所知， 之#八梨蛋白曾由 /、要不延月本务明，本發明 / 、可以有各種突變、刪除、取代等作用。 在特定實施例中，缔山人α 八寻作用 ^甘入a里蛋白質和上述胺基酸序列至少 ^ 90% ^8〇%47〇〇/^^ ° 二Π:該物受趙可活化傳爾，諸如 二 〃係藉§亥嵌合型受體之細胞外Ror2結構域的

10 一承°反"而^起。如熟悉本項技藝者所知，只要不改變 該受體之利生’上述蛋白質序列可以有各種改變。該嵌合 型文體之，些變異體被視為屬於本發明之範圍。本發明亦 包括可將4合型受體或其變異體編碼之多核魏序列。 該密碼序列可視需要操作性連接至促進子、增強子、調節 ^素等’因此可調節該歲合型蛋白質之表現性及/或轉 f本么月亦包括包含可將該嵌合型受體編碼之本發明多 核4酸序列的細胞。 15 柄◎等方法可以在任何可用之方式（其包括高通

過料5析法）巾經修飾或進行。高通過料量分析法可用於 在特疋日守間内檢檢大量試驗藥劑。在另一實施例中，係進 4亍使以細胞為主之篩檢的分析法。2〇〇〇年8月15日頒予之美 國專利第6，1Ό3,479號(其在此併人本案以為參考資料)揭示 2〇用於進行以細胞為主之筛檢的微小型細胞排列法及裝置。 已描述用於製備適於其它應用之均勻微圖案化細胞排列的 方法’例如光化學光阻光蝕刻法(Mrksich and whitesides， Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 25, 55-78, (1996)) ° 2000 年8月1曰頒予之美國專利第6,〇96,5〇9號（其在此併入本案 67 200800266 以為參考資料）提供一種用於實時測定對於一流動細胞懸 浮液上之試驗藥劑的細胞反應之裝置及方法，其中一系列 細胞類型之各成員的均質懸浮液係於特定濃度下與試驗化 合物組合，經由檢測區引導，並在該試驗混合物中之細胞 5流經該檢測區時，以實時測定該等活細胞之細胞反應。該 專利揭示該裝置在自動化篩檢試驗藥劑（例如小分子y之基 因庫的用途。可修飾這些美國專利中所揭示之方法以測定 試驗藥劑是否可調節使用細胞，諸如成骨細胞(原發性成骨 細胞、人類成骨細胞，諸如TE_85、U20S、SaOS-2或HOB ; 10 大鼠成骨細胞，諸如UMR 106或ROS 17/2·8 ;小鼠成骨細 胞，諸如MC3T3，或諸如此類）、非成骨細胞(COS-7及諸如 此類）、幹細胞（間質幹細胞、胚胎幹細胞）、祖細胞或含Ror 核苷酸序列之經設計細胞，所產生之R〇r分子的表現性或活 性。在又其它實施例中，係進行以酶分析（例如激酶分析） 15 為主之分析。 然後可進一步測試經確認可用於調節Ror蛋白質活性 之試驗藥劑。在特定實施例中，在其它以細胞為主之分析 法或以非細胞為主之分析法中測試該等藥劑。可以以罹患 各種疾病之動物模式，其包括罹患各種骨疾及病症之動物 20模式，進行該等化合物之測試。例如可以以罹患骨折、骨 質疏鬆症、骨癌、骨質流失等之動物模式進行藥劑之測試。 本發明可將分子及細胞生物學領域中皆已熟知之方法 及技術併入以為參考資料。這些技術包括，但不限於以下 公開案中所述之技術：Old，R· w. & s. B· Primrose， 68 200800266

Principles of Gene Manipulation: An Introduction To Genetic Engineering(第 3 版，1985 年）Blackwell Scientific Publications, Boston. Studies in Microbiology； V. 2: 409 pp. (ISBN 0-632-01318-4)，Sambrook，J.等人，eds·，Molecular 5 Cloning: A Laboratory Mannual(第 2版，1989年）Cold Spring Harbor Laboratory Press， NY. Vols. 1-3. (ISBN 一 0-87969-309-6)，Miller，J· Η. & M. R Calos eds.，Gene

Transfer Vectors For Mammalian Cells(1987) Cold Spring • Harbor Laboratory Press， NY. 169 pp. (ISBN 10 0-87969-198-0)。 實例 本發明進一步以下述實例定義，其中除非另有指定， 所有份數及百分比為重量比，且度數為攝氏度數。應瞭解 這些實例，雖然表示本發明較佳實施例，僅用以闡明。自 15上述討論、實施例，及這些實例，.熟悉本項技藝者可輕易 瞭解只要實質上不違背本發明之新穎教示及不違背其精神 及範圍，在作為例證之實施例中可以有許多修飾。而且， 操作者可以對本發明進行各種改變及修飾以使本發明適於 各種用法及條件。因此，所有此等修飾皆計劃包括在如以 20下申請專利範圍中所定義之本發明範圍内。 文中提及之專利、申請案、試驗方法，及公開案之全 文在此併入本案以為參考資料。 通用方法 物質及組織培養 69 200800266 除了另有指定，組織培養試劑係購自Invitrogen Corporation(Carlshad，CA);其它試劑及化學品係購自Sigma Chemical Co.(St. Louis，MO)或Invitrogen。重組型人類R〇r2 之經GST標記的胞液結構域係得自Invitrogen，而經GST標 5 記之重組型人類14-3-3万係得自Biomol International， LP(Plymouth Meeting，PA)。抗Flag M2小鼠單株抗體、抗 Flag M2親和性瓊脂糖，及抗点-肌動蛋白小鼠單株抗體係 得自Sigma ;抗人類Ror2山羊多株抗體係購自R & D Systems(Minneapolis，MN);抗 14-3-3 /5 及抗His兔多株抗體 10 係得自 Santa Cruz Biotechnology，Inc(Santa Cruz，CA)。非結 合及經瓊脂糖結合之抗磷酸酪胺酸抗體（4G10)係得自 Upstate Cell Signaling Solutions(Charlottesville，VA);固定 化磷酸酪胺酸抗體P-Tyr-100係得自Cell Signaling Technologies(Beverly，MA);蛋白質A塞法羅斯糖(sepharose) 15 及麵胱甘肽塞法羅斯糖係購自Amersham Biosciences(Buckinghamshire，England)。經辣根過氧化物酶 (HRP)結合之次級抗體係得自Santa Cruz Biotechnology。 人類間質幹細胞（hMSC)係購自Cambrex， Inc.(Baltimore MD)且於37°C下維持在使用hMSC生長培養 20 基（MSCGM，Cambrex)之5°C Corps%增濕性空氣培養器 内。U20S人類骨肉瘤細胞係於37°C下保存在含10%熱失活 性牛之胎兒血清(FBS)、1%青黴素-鏈黴素，及2mM gluta MAX· I之馬可依氏5A改質培養基(McCoy’s 5A Modified Medium)内0 70 200800266 質體及腺病毒 先前已描述人類R〇r2-Flag表現性質體之製法（Billiard and Bodine，2004年4月14日申請之美國專利申請案u.s.S.N. 10/823,998 ; Billiard等人，Mol Endo 19, 90-101，2005)。該 5 Ror2-His結構物係藉使用可將6個組胺酸編碼之序列取代位 於該Ror2-Flag之COOH端基的Flag抗原決定位標記而製 成。藉將人類R〇r2之細胞内結構域（其可將胺基酸428,944 編碼）插入pGEX-4T_2載體(Amersham)内之GST標記後的架 構内而使該R〇r2之胞液結構域進行GST融合(GST-Ror2c)。 10 全長人類14-3-3 β cDNA係購自Open

Biosystems(Huntsville，AL)且亞選殖入pET28a細菌表現性 載體内。 含人類科沙奇(coxsachie)腺病毒受體(hCAR)、Rot2-專 一性shRNA及EGFP-專一性shRNA之腺病毒係得自 15 Galapagos，Inc· (Mechelen，Belgium)。R〇r2、Ror2KD&^- 半乳糖苷酶（万-gal)腺病毒之製法業經描述(Billiard and Bodine ’ 2004年4月14曰申請之美國專利申請案u s s N 10/823,998，其在此併入本案以為參考資料）。 頭頂器官培卷及威染 2〇 自4天大的小鼠同寫動物切除顱蓋，沿著該矢狀缝合切 告1J並在含0· 1 %BSA之無血清的BGJ培養基内培育24小時。將 顱蓋之各半部以凹表面向下放在12井平皿之井中的不銹鋼 栅（Small Parts Inc，Miami，F1)上。各井含有1毫升具有 1%FBS之BGJ培養基，並具或未具冷_ga^R〇r2腺病毒(3.75 71 200800266 min病毒顆粒/井）。在5%(：〇2_95%增濕空氣培養機中培育 顱蓋並在4天後更換培養基及腺病毒。 在腺病毒存在下培育7天後，於rt下將顱基因定在10% 天然磷酸鹽緩衝生甲醛中，然後在EDTA之PBS 10%溶液中 5去的化’費時6小時。使各組中之顱蓋平行地包埋在相同石 犧塊内，且以蘇木素_曙紅將4微米切塊染色。選用一致的 骨面積(離額縫200微米遠）以進行組織形態測量分析。簡言 之’將200微米方形柵放在各顧蓋上並以⑴⑽脱狀⑽

System (Osteometries Inc，Atlanta，GA)測定成骨細胞數及 10總骨面積。骨表面上之所有細胞視為成骨細胞。根據製造 者之規定’使用Calcium Diagnostics Kit(Sigma)以測定介質 !弓0 病毒感染 以6,000個/厘米2之速率在12-或6-井平狐中接種人類 15 MSC並使其黏附且增生，費時一夜。在hCAR(MOI=750)存 在下，以750之感染相重數(MOI)使用R〇r2、R〇r2KD或卢_gal 腺病毒在0·4毫升/厘米2MSCGM中感染該等細胞，費時24 小時以改良感染效率。24小時後，在PBS及MSCGM中清洗 細胞一次並以0·05ιηΜ抗壞血酸及1 〇mM万-磷酸甘油g旨補 2〇充MSCGM或添加含脂肪生成補充物(PT-3004, Cambrex)之 MSCGM。若需要，則添加i〇〇nM地塞米松 (dexamethasone)(dex)及/或指示抗體至該培養基内。就 shRNA感染而言，係以6,000個/厘米2之速率在12·或6·井 平皿中接種細胞並使其黏附且增生，費時3天。在 72 200800266 hCAR(MOI=750)存在下，以每井4,〇〇〇個病毒顆粒之速率 (根據原有接種密度)使用可將R〇r2_專一性shRNA或EGFP-專一性shRNA編碼之腺病素，使細胞在〇 4毫升/厘米2之 MSCGM中感染72小時。72小時後，在PBS内清洗細胞一次 5並添加MSCGM或經〇.〇5mM抗壞血酸、10mM 填酸甘油 醋補充之MSCGM。若需要，則添加10〇11]^ dex及/或專一 性抗體。每隔5天，使所有培養基或其一半經新培養基替換。 以75,000個/厘米2之速率在6_井平皿内接種u2〇s細 _ 胞，其後以10〇之MOI使其經R〇r2、R〇r2KD或石-gal腺病毒 10感染24小時。使感染進行24小時並再經24小時後收集細胞 萃取物。 舊素紅-S組皺化學毕多.法 藉茜素紅-S組織化學染色法在12井平皿上測定經 hMSC而形成之礦質化小結。於RT下以70%(v/v)乙醇固化該 . 15 等細胞及基質，經去離子水清洗並於RT下經40mM茜素紅 _S(pH 4.2)染色，費時1〇分鐘。以去離子水清洗該經染色之 • 基質並照相。為定量茜素紅-S染色之程度，以1毫升/井之 10%(w/v)鯨蠟基氯化吡錠溶析該染劑。於562奈米下以微量 盤讀數器定量（對照0-800 // Μ染劑之標準曲線)該經溶析試 2〇 樣中之茜素紅-S。 油紅(oilred)O組織化輋染色法 藉油紅Ο組織化學染色法而在12-井平皿上之hMSC中 監測脂肪生成。於RT下以10%天然緩衝性福馬林(formalin) 固定該等細胞，費時2小時，經PBS清洗並於RT下在60%異 73 200800266 丙醇(pH 7)中經18毫克/毫升油紅0染色，費時10分鐘。以 PBS清洗該染色細胞並照相。 RNA分籬法及膏瞎PCR分析法 遵照製造商之指示使用RNeasy Kit(Qiagen、Valencia， 5 CA)分離總細胞 RNA 並使用 ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(Applied Biosystems，Foster City, CA)進行 實時RT-PCR分析。使所有mRNA含量與看家基因（環費林 (cyclophilin)B)之含量歸一化。人類C/ΕΒΡα及PPARy之引 子及探針係購自Applied Biosystems;人類環費林B之引子及 10 探針如下：5’-CACCAACGGCTCCCAGTT-3’(正向引子，438-455， 序列辨識編號：1)、5’-AACACCACATGCTTGCCATCT-3,(逆 向引子，486-506，序列辨識編號：2)，及 5’-TTCATCACGACAGTCAAGACAGCCTGG-3’（探針， 457-483，序列辨識編號：3)。 15 暫時性轉移感染 就Ror2質體轉移感染而言，係以〜80%群集密度接種 U20S細胞且其後遵照製造商之指示使用FUgene6轉移感染 試劑（Roche Applied Science, Indianapolis, IN)每 19.6厘米2 經11微克總質體DNA轉移感染24小時。就siRNA轉移感染 20 而言，係以52,000個細胞/厘米2之速率將U20S細胞接種在 6-井平皿上且其後遵照製造商之指示使用1〇微升 Lipofectamine 2000試劑經25nM之R〇r2 siRNA或非專一性 siRNA(其皆得自 Dharmacon Inc” Lafayett，CO)轉移感染， 費時24小時。 74 200800266 免疫沉殿法及西方免疫墨點法 使細胞溶解在經蛋白酶及磷酸酶抑制劑混合劑（S i g m a) 補充之溶胞緩衝劑（150mMNaC卜 50mMTris-HCl(pH7.5)、 ImM EDTA、l%Triton xlOO)内並藉於下以 l〇,〇〇〇xg進 5 行離心處理而澄清萃取物，費時l〇分鐘。就Flag免疫沉澱 法而言，於4°C在旋轉下，以30微升之M2 Flag親和性瓊脂 糖(Sigma)培育1毫克總細胞溶解產物，費時一小時。藉離心 處理而收集小粒並含350 mM NaCl之溶胞缓衝劑中清洗3 天。接著在溶胞緩衝劑中清洗3次。就14-3-3/3沉澱法而言， 10係於4°C下在1毫升溶胞緩衝劑中以30微升蛋白質A法羅斯 糖培育15微升之14-3-3 /3抗體’費時一夜，並藉離心處理而 收集小粒，然後在溶胞緩衝劑中清洗，其後添加丨毫克總細 胞溶解產物。於4°C在溫和旋轉下進行結合反應，費時2小 時，並如Flag沉澱法所述，收集並清洗該等小粒。就磷酸 15 酪胺酸沉澱法而言，係添加1毫克（用於檢測過度表現性蛋 白質）或1·5毫克（用於檢測内源性蛋白質）細胞萃取物至1〇〇 微升G410小粒内並於4°C下使其附著，費時3小時。現在， 添加P-Tyr-100固定化抗體（1〇〇微升）至該混合物内，費時3 小時。藉離心處理而收集所有小粒並如Flag沉澱法所述， 20進行清洗。於所有免疫沉澱反應結束時，使用還原劑 (Invitrogen)在30至50微升2XLDS-PAGE緩衝劑内將該等小 粒煮沸，並藉SDS-PAGE而分離該等溶解蛋白質。將該等凝 膠移至0·45微米硝基纖維素膜上，然後使用各專一性抗體 進行檢測。 75 200800266 就未使用沉澱法之免疫墨點法而言，係在變性及還原 條件下，藉SDS-PAGE而分解指定量之總細胞溶解產物，然 後移至0.45微米硝基纖維素膜上並使用各專一性抗體進行 檢測。 5 GST向下匯集及活體外激酶分析 遵照製造商之指示，在50微升反應物内使用

Expressway™活體外蛋白質合成系統(Invitrogen)自14-3-3 /3 -pET28a 活體外轉譯 14-3-3 /5。使 pGEX-4T»2 或 pGEX-4T-2(可僅將GST編碼）中之GST-Ror2c在大腸桿菌之 10 BL21(DE3)菌株内轉形。使培養物生長至〇·7之A600並藉添 加異丙基-1-硫基-石-D-半乳糖吡喃糖苷（Sigma ;最終濃度 為ImM)誘導而表現重組型蛋白質並培育4小時。藉離心處 理而採集細菌小粒，在PBS内清洗，並再懸浮於30毫升經蛋 白酶及磷酸酶抑制劑混合劑（Sigma)補充之PBS内。藉以 15 16,〇〇〇 p.s.i 使細胞通過 French Pressure Cell press (Spectronic Instruments，Rochester, NY)兩次而溶解該等細 胞，並藉離心處理而移除細菌碎屑。於4。〇下以麩胱甘肽塞 法羅斯糖培育所產生之GST-R〇r2c或GST蛋白質，費時4小 時。清洗小粒，使其再懸浮於1毫升PBS中並於代下添加總 20共50微升14_3-3万活體外轉譯反應物，費時4小時。於該培 育步驟結束時，在PBS中清洗該等小粒共3次，使用還原劑 (Invitrogen)在2xLDS-PAGE内將其煮沸，並藉SDS_PAGE分 離經溶解蛋白質。將該等凝膠移至〇·45微米硝基纖維素膜 上，然後以各專一性抗體進行檢測。 76 200800266 就活體外激酶分析而言，係在添加或未添加0·9微克純 化重組型人類GST-R2c(Invitrogen)之情況下，使6.5微克純 化重組型人類GST-14-3-3 /3 (Biomol)再懸浮於25微升激酶 反應缓衝劑（10mM MgCl2、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1 mM 5 二硫代蘇糖醇C〇TT)、1 mM ATP)中。於37°C下使該激酶反 應進行30分鐘，並藉使用還原劑(invitr0gen)在1XLDS緩衝 劑中煮沸而中止反應。藉SDS-PAGE而分解蛋白質，將其移 至〇·45微米硝基纖維素膜上並經磷酸酪胺酸抗體檢測。其 後，剝除該膜並再經14-3-3/3抗體探測以證實相等的負荷。 10 魅計學的分析 數據係a±SE平均值表示。使用單程ANOVA或史丟登 氏之t試驗(Student’s t test)測定統計學的顯著性。當ρ<〇·〇5 時，結果被視為具統計學上的不同性。 15 ίϋ原性Ror2在hMSC分化中起作用 我們先前已證明於hMSC之骨生成分化期間，R0r2表現 性增加(Billiard等人，2004年4月14日申請之美國專利申請 案U.S.S.N. 10/823,998 ; Billiard等人，Mol Endo 19,90-101， 2005，其各在此併入本案以為參考資料）。為評估於hMsc 20分化期間，R〇r2表現性之增加是否對成骨細胞生成作用具 重要性，當Ror2表現性經抑制時，我們進行經加&誘發之分 化。為此目的，hMSC係經含R0r2-專一性shRNA之腺病毒 感染，與EGFP-專一性對照shRNA比較，其的確可強烈抑制 Ror2蛋白質表現性之經dex誘發性增加（第ία圖）。經尺〇1>2 77 200800266 shRNA感染幾乎可完全去除dex誘發基質礦質化之能力（第 1B及C圖），其表示R〇r2之增加至少可部份媒介11]^3(：：之經 dex誘發的成骨細胞之分化。 實例2 5 RQr2過度表現性可抑制hMSC之脂肪生成6^^ 我們先iil亦已證明R〇r2過度表現性可誘發msc對成骨 細胞譜糸的幫助以及促進於成骨細胞生成之前期及後期的 分化(Billiani等人，2004年4月14曰申請之美國專利申請案 U.S.S.N. 10/823,998，其在此併入本案以為參考資料）。我 10們已評估R〇r2對藉在含i π朵美辛之脂肪生成混合 劑中培育而誘之hMSC的交替演化(脂肪生成）之影響。使人 類MSC經將野生型Ror2或激酶結構域突變體(R〇r2KD)(其 各含COOH-末端flag抗原決定位標記物）編碼之腺病毒感 染。在該Ror2KD中，於504(在該一般認定的ATP結合結構 15域中）、507，及509位置之3個賴胺酸係經異亮胺酸取代以 $致顯者減少的赂胺酸激酶活性(Hikasa等人，Devei〇pment 129, 5227-5239, 2002 ; Billiard等人，Mol Endo 19, 90-101， 2005)。就對照物而言，在相同腺病毒背景中，使以^^^經 冷-半乳糖苷酶（点-gal)表現性序列盒感染。Ror2及R0r2KD 20突變體皆可抑制主要脂肪生成轉錄因子，CCAAT/增強基 因-結合性蛋白質a(C/EBPa)及過氧化物酶體增生劑活化 之受體r(PPARy)，之表現性（第2A圖），並導致hMSC形成 油紅〇-正性脂質產生脂肪細胞之能力的明顯降低（第2B 圖）。併用先前之結果(Billiard等人，2004年4月14日申請之 78 200800266 美國專利申請案U.S.S.N· 10/823,998 ;其在此併入本案以為 參考資料）可知這些資料表示藉改變轉錄因子之平衡而改 變MSC之細胞演化有助於成骨細胞生成。 實例3 5 R〇ll可增加小蓋之總骨面積 我們接下來測試R0r2對hMSC分化之活體外影響是否 可轉換成在活體外器官培養物中之增加骨形成。使4天大之 小鼠同窩動物之頭蓋骨未經感染或經冷-gal4Ror2腺病毒 感染。在腺病毒存在下培養7天後，以蘇木素-曙紅將骨頭 10 染色並使用Osteomeasure System使一放性200微米2切段(離 額缝200微米遠）進行組織形態測定分析。在控制性未經感 染條件下，頭蓋之2〇〇微米2切段含有5171±235微米之骨面 積及84±6·5個成骨細胞。在不會影響該成骨細胞數之情況 下’經Ror2病毒感染會導致該總骨面積增加5〇%，其表示 15 Ror2可活化成骨細胞以產生更多骨基質（第3圖）。 實例4 14-3-3/3為該R〇r?激酶之第一種經確認的某皙 我們先前已報告藉質譜法鑑定U 2 Ο S骨肉瘤中之9個可 能的Ror2結合因子(Billiard等人，2004年4月14日申請之美 20國專利申請案U.S.S.N· 10/823,998;其在此併入本案以為參 考資料）。其中，14-3-3蛋白質業經證明在細胞循環過程及 分化中起作用（Mackintosh，Biochem J 381，329-342，2004) 且我們選擇14-3-3 /5以進行後續研究。我們首先確認使用免 疫沉澱技術藉質譜法而觀測之相互作用。 79 200800266 使U20S細胞經石-ga卜Ror2或R〇r2KD腺病毒感染並分 離總細胞蛋白質，然後在抗Flag親和性瓊脂糖上進行免疫 沉澱，繼而使用抗14-3-3召抗體進行免疫墨點法（第4A圖， 最上面的一組）。於對照條件（經点-gal感染之細胞)下沉殿極 5 少量14-3-3 ，但是藉Ror2過度表現性而共沉澱大量14-3-3 冷。使用該Ror3KD突變體甚至可形成更多的複合物，其表 示該激酶活性可導致複合物解離。藉使用抗Flag抗體進行 之免疫墨點法而證實等量之沉澱作用（第4A圖，最下面的一 組）。進一步藉將14-3-3 0沉澱在14-3-3/5-專一性抗體上而 10 確認14-3-3点與Ror2之相互作用並藉抗Flag免疫墨點法而 證實Ror2存在於該複合物内（第4B圖）。 為評估Ror2是否會導致14-3-3点之磷酸化反應，我們再 使用抗磷酸酪胺酸抗體探查第4A圖中之墨點。該抗體可確 認能夠以和14-3_3 /5相同之分子重量遷移的麟酸化蛋白質 15 且該磷酸化蛋白質僅存在於能表現野生型Ror2但非表現万 -gal或該激酶失活性突變體（第4A圖，中間的一組），其表示 Ror*2可直接或間接地將酪胺酸殘基（群）上之14_3-3点填酸 化。該假定係藉以下步驟而確認：將U20S萃取物中之所有 酪胺酸填酸化蛋白質免疫沉澱在抗麟酸酪胺酸抗體上並藉 20 R〇r2過度表現性而觀測磷酸-14-3-3/3數量大量增加（第4C 圖）。 為測試内源性Ror2是否能媒介第4C圖中所發現之 14-3-3/3的背景磷酸化反應，我們藉11〇1>2_專一性8丨111^入而 抑制U20S細胞中之R〇r2表現性。如第5A圖所示，當與雜亂 80 200800266 對照物siRNA比較時，經R〇r2-專—性siRNA轉移感染可導 致R〇r2蛋白質表現性之幾何完全抑制。版2表現性之降低 對U20S細胞中之14-3-3 /3蛋白質含量並無影響，但是會導 致其酪胺酸破酸化反應之顯著下調（第56圖）。與得自文中 5使用之較長曝露時間之第4C圖比較，14-3-3/3之背景磷酸 化反應明顯增加。 為評估Ror2是否直接結合至14-3-3 /3而導致磷酸化反 應，我們使用重組型純化蛋白質進行活體外實驗。就該結 合性實驗而言，人類Ror2之胞液結構域的GST融合 10 (GST-Ror2c)係在細菌細胞内表現，沉殿在麩胱甘肽塞法羅 斯糖並經活體外轉譯之14-3-3/3培育。如第6A圖中所示， 14-3-3 0係結合至GST-Ror2c，而非僅結合至GST，其表示 14-3-3 yS可直接結合至R〇r2之胞液結構域。由於活體外轉譯 之14-3-3冷含有與該激酶分析不相容之Expressway™蛋白 15質合成緩衝劑，所以我們購買純化重組型GST-標記性 14-3-3^並使用純化重組型GST-Ror2c(Invitrogen)進行活體 外激酶分析。如第6B圖中所示，R〇r2c可將14-3-3/5及其本 身磷酸化，其證實14-3-3 /3為用於該Ror2酪胺酸激酶之直接 基質。 20 實例5

Ror2-專一性抗體可二聚合及活化該R〇r2受體 幾種受體酪胺酸激酶業經顯示欲經抗體二聚合並活化 (Spaargaren等人，J. Biol. Chem· 266, 1733-1739, 1991; Fuh 等人，Science 256, 1677-1680, 1992 ;其各在此併入本案以 81 200800266 為參考資料）。因此，我們測試可對抗人類汉01>2之全部細胞 外結構域的R〇r2-專一性抗體之二聚合並活化該以〇1>2受體 酪胺酸激酶之能力。為評估二聚合作用，使經Flag標記及 經His標記之Ror2受體結構物在U20S細胞内表現並於”它 5下使細胞經R〇r2_專一性山羊多株IgG(其可對抗人類汉沉2之 細胞外結構域，R & D Systems，AF2064)或非專一性山羊 IgG對照物(R&D Systems)處理，費時一小時。藉培育而萃 取總細胞蛋白質，沉澱在抗Flag親和性瓊脂糖上並使用抗 His抗體進行免疫墨點法。如第7A圖之最上面的一組所示， 10 於非專一性IgG處理之對照物條件下，經His標記之R0r2受 體與該Flat標記之Ror2受體有部份結合現象，其表示藉在 U20S細胞内之過度表現性，該Ror2可形成均二聚物。一旦 經Ror2抗處理時，可強烈地增強該均二聚物之形成，其證 實該抗體可二聚合該R〇r2受體。藉以下事實而證實該實驗 15 設計有效：在無R〇r2-Flag之情況下，抗Flag抗體不能免疫 沉澱Ror2-His且抗His抗體不能辨識該R〇r2-Flag蛋白質（第 7A圖，最上面的一組）。藉使用抗Flag抗體進行免疫墨點法 而證實相等的R〇r2-Flag沉澱量（第7A圖’最下面的一組）。 為了瞭解該抗體是否可活化Ror2酪胺酸激酶，我們於 20 37°C下使用該R〇r2-專一性抗體或IgG對照物處理U20S細 胞，費時一小時，離析全細胞蛋白質萃取物並將所有酪胺 酸磷酸化蛋白質沉澱在磷酸酪胺酸抗體上。第7B圖係闡明 經抗Ror2抗體處理可導致該Ror2激酶之顯著自攝酸化反應 以及其基質，14-3-30蛋白質，之磷酸化反應。這些資料有 82 200800266 力地證明抗Ror2抗體可二聚合並活化該Ror2酪胺酸激酶受 體。 實例6

Ror2-專一性活化杭體可促進hMSC礦質化反應 5 接下來，我們詢問R〇r2之經抗體誘發的二聚合反應及 活化作用是否對hMSC之骨生成分化具有機能性的影響。除 非不同於骨生成表現型，否則hMSC並不能表現 Ror2(Billiard and Bodine，2004年4月14曰申請之美國專利 申請案U.S.S.N. 10/823,998 ; Billiard等人，Mol Endo 19, 10 90-101，2005;其各在此併入本案以為參考資料），所以我們 藉使用骨生成混合劑（經0.05mM抗壞血酸、10mM yS-磷酸 甘油酯，及lOOnMdex補充之MSCGM)進行處理並添加漸增 量之Ror2-專一性山羊IgG或非專^一性山羊IgG而誘發R〇r2 表現性。經9天培育後，使用茜素紅-S組織化學染色法評估 15 礦質化質基之形成程度。如第8圖中所示，抗Ror2抗體可劑 量依存性增加hMSC中之鈣化基質形成的程度。除了於1〇〇 微克/毫升之最高劑量下發現輕微抑制作用外，於所有測 試濃度下非專一性山羊IgG對基質礦質化反應並無影響。為 清楚起見，第8圖僅顯示一種非專一性IgG之劑量(50微克/ 20 毫升）。可對抗人類Rorl之全部細胞外結構域之山羊多株抗 體(R & D Systems，AF2000)亦無影響（第8圖）。該抗R0r2抗 體影響係經由該R〇r2受體而媒介，因為當hMSC中之Ror2 表現現經Ror2-專一性shRNA而抑制時，其會消失（第9A 圖）。而且，若該等細胞藉腺病毒感染而經誘發以表現R〇r2 83 200800266 時，甚至在無dex之情況下’抗R〇r2抗體可誘發約化基質之 形式（第9B圓）。因此，R〇r2-專一性抗體可二聚合並活化R0r2 受體並促進間質幹細胞内之經R〇r2媒介的鈣化基質形成，其 表示一活化Ror2抗體可有效地治療骨質疏鬆症及其它骨疾。 5 實例7 14-3-3 /3之抑制作用可增強hMSC礦質化及龐 為測試14-3-3/3在骨生成分化中是否起作用，我們在 R〇r2過度表現性存在及不存在下，抑制14-3-3/3表現性。為 此目的，使11]^(：經該14-3-3/3-專一性8111^八感染，其當與 10 雜亂對照物shRNA比較時’的確可強力地下調内源性蛋白 質表現（第10A圖）。當hMSC經兩種含雜亂性shRNA及/3 -半 乳糖苷酶之對照物病毒感染時，我們發現低程度之基質礦 質化（第10B圖），其表示雙感染單獨可媒介hMSC培養物中 之溫和骨生成作用。如前述(BilHard等人，2004年4月14曰 15申請之美國專利申請案U.S.S.N· 1〇/823,998)，經Ror2腺病 毒感染可強力地促進礦質化基質之形成。令我們驚訝的是， 14-3-3/S之下調亦可大大地增加礦質化程度（第1〇]3圖）。尺〇『2 過度表現及14-3-3/3抑制作用一起比單獨任一種更能誘發 基質礦質化反應（第10Β圖）。其係為表示14_3-3万架構蛋白質 20對111^8<::之骨生成分化有抑制性影響之第一種證據。 實例8

體_外顧盖培卷物中之新骨質形成 接下來我們測試R0r2活化作用及J 4·3_3万抑制作用之 84 200800266 影響是否能轉換成活體外器官培養物中增加之骨質形成。 以5xl07個病毒顆粒/毫升之速率，使4天大的小鼠同窩動 物之顱蓋骨經含雜亂性shRNA或14-3-3 -專一性shRNA之 腺病毒感染；並在48小時後於15微克/毫升之卡勒森 5 (calcein)存在下，經12微克/毫升之抗R0r2抗體或非專一性 • IgG處理。經腺病毒及抗體培養7天後，以蘇木素_曙紅將該 等骨染色並使用 Bioquant-NOVA MR 5.50.8(Nashville，TN) 使一致性300微米片段(離額縫450微米遠）進行組織形態測 定分析。於雜亂性shRNA感染及IgG治療之對照條件下，_ 10微米長之顧蓋含有9394±1333微米2之骨面積及39·5±7 4成 骨細胞。藉該專一性shRNA而進行之14-3-3/3的抑制作用可 導致總骨面積增加60%及成骨細胞數增加5〇%，甘表示 14-3-3%蛋白質可抑制成骨細胞數及/或活性（第丨丨圖）。使 用抗Ror2抗體處理顧蓋骨可導致成骨細胞數增加及總 15骨面積增加50%，且再一次表示一活化Ror2抗體可有效地 治療骨質疏鬆症及其它骨疾。然而’合併該14-3-3 /5 shRNA 感染及Ror2抗體療法並不會產生附加效用，其與單獨的療 法比較，導致甚至稍小之反應（第11圖）。在我們的經驗中， 由於所發現50至80%之增加量在本分析系統中並未達到飽 20和’所以正嘗试推測R〇r2及14·3_3 /5皆可用於相同路徑控制 成骨細胞分化及/或機能。 ΨΡΙ9 研發用於Rod活性之高通過料量、高撰擇柹公也 如第12A圖中所示’該分析係使用經良好說明之tab 85 200800266 受體傳訊路徑。該TrkB受體係藉經配位體誘發之均二聚合 反應而活化，該均二聚合反應會導致ErK之磷酸化反應及目 標基因之促進子中之cAMP反應元素(CRE)的刺激作用。我 們產生一由與該穿透膜融合之Ror2細胞外結構域（aa 5 1-407)，及TrkB之細胞内結構域(aa 432-822)所組成之嵌合 型受體。我們假設當使用該嵌合體時，可導致R〇r2二聚合 反應之藥劑能活化TrkB傳訊路徑並導致CRE促進子活性之 增加。為測試該假設，將該嵌合型受體安定地轉移感染入 可過度表現得自 Dr· Seongeun Cho(Wyeth Research， 10 Princeton，NJ)之 CRE-蟲螢光素酶質體（HEK_CRE)的 HEK293A細胞内。使用ECM 600電子穿孔器（BTX，San Diego，CA)將pcDNA 3.1(+)_hygro 中之該R〇r2-TrkB嵌合體 穿第HEK-CRE細胞内並使用350微克/毫升潮黴素生長該 等細胞，直到形成抗潮黴素細胞之單離菌落為止。將菌落 15 胰蛋白酶化並以每一井一個之速率轉移至96井平皿上。於 37°C下使用350微克/毫升潮黴素生長菌落並藉西方免疫 墨點法及免疫細胞化學法而評估R〇r2-TrkB表現性之含 ΐ。以先别業經證明可·一聚合R〇r2之抗R〇r2抗體處理能表 現Roi^-TrkB肷合體之该專HEK-CRE細胞（見實例5)。如第 2〇 12圖中所示，當與經非專一性IgG處理之細胞比較時，R〇r2-專一性抗體可導致所觀測之蟲螢光素酶活性之大量的劑量 依存性增加。因此，我們已研發用於測定該等藥劑（其包 括，但不限於：小分子、胜肽、蛋白質或抗體)誘發R〇r2: 聚合反應及活化作用之能力的快速、高通過料量之高靈敏 200800266 性分析。 L圖式簡單說明2 第1圖係表示下調Ror2表現性可抑制人類間質幹細胞 (hMSC)之經dex誘發的骨生成分化。使人類MSC經含R〇r2-5專一性shRNA或EGFP_專一性shRNA(對照物）之腺病毒表 現性載體感染並在經〇.〇5mM抗壞血酸、i〇mM磷酸甘 ’ 油酯（/3 -GP)及1〇〇ηΜ地塞米松(dex)補充之MSC生長培養 基(MSCGM)中培育。經培育9天後，使全部細胞蛋白質萃 泰 取物（50微克/每道）進行用於作為免荷對照物之該内源性 10 R〇r2蛋白質或/3-肌動蛋白的西方免疫墨點法(α)〇經培育11 天後，進行茜素紅-S染色(Β)並定量(C)以評估礦質化基質形 成之程度。在C中，在EGFP shRNA存在下，茜素紅-S之併 入量被設定為100%。B及C中之結果代表3次獨立之實驗（第 1圖適用於實例1)。 15 第2圖係表示Ror2過度表現性可抑制hMSC之脂肪生成 分化。A·使人類MSC經半乳糠苷酶（冷-gal)、Ror2或 • R〇r2KD感染並在經脂肪生成混合劑補充之MSCGM中培育 8天。離析總細胞RNA並使用得自Applied Biosystems之引子 及探針進行脂肪生成轉錄因子C/ΕΒΡα及PPARr之實時 20 RT-PCR分析。使mRNA之含量與各試樣中之環費林B的表 現性歸一化並將經-gal感染之細胞中的㈤^^八表現性含 量設定為100%。B.使人類MSC經/5-gal、Ror2或Ror2KD 感染，培育在經脂肪生成混合劑補充之MSCGM中，費時21 天，然後進行油紅Ο染色（第2圖適用於實例2)。 87 200800266 第3圖係表示蛋白f之過度表現性可增加總骨面 積，但並非增加新生小鼠顱蓋中之成骨細胞數。使4天大的 小鼠同窩動物之顱蓋骨未_染（對照物）祕”·半乳糖 苷酶⑹或人類R0r2(R2)編碼之腺病毒感染。在腺病毒存在 5下坨月7天後，以蘇木素及曙紅將顱蓋染色，然後評估總骨 面積及成骨細胞數。在未經感染之培養物中所獲得之值被 没疋為1〇〇%。該等結果為每一狀況4至5個顱蓋的v SE平均 值(與/3-半乳糖苷酶感染比較，★_?<〇·〇〗）。該圖解表示3 次獨立實驗（第3圖適用於實例3)。 10 第4圖係證明R〇r2蛋白質可結合14_3_3万並在酪胺酸 (群)上將其碗酸化。使U20S細胞經召-gai(y5 )、Ror2(R2)或 Ror2KD(KD)腺病毒感染並在24至28小時後，製備全細胞溶 解產物並使用抗Flag(A)、抗14-3-3 /5 (B)或抗鱗酸酪胺酸(C) 抗體進行免疫沉澱。藉使用指定之抗體進行免疫墨點法而 15 分析該等免疫沉澱物（第4圖適用於實例4)。 第5圖係表示内源性R〇r2蛋白質可媒介活體内之14-3-3 冷磷酸化反應。使U20S細胞短暫地經Ror2’siRNA或非專一 性siRNA轉移感染並在48小時後，使用每道50微克萃取物， 使用總細胞蛋白質萃取物進行該内源性Rod蛋白質或y3-2〇 肌動蛋白（負荷對照物）之西方免疫墨點法(A)。亦直接(20微 克/道)或在使用抗磷酸酪脍酸抗體進行免疫沉澱法後，藉 14-3-3 抗體而分析相同溶胞產物(B)(第5圖適用於實例4)。 第6圖係表示R〇r2蛋白質之胞液結構域結合至14-3-3石 並直接活體外磷酸I4-3-3/5。九使Ror2之經GST標記的胞 200800266 液結構域(GST-R2C)或GST單獨連接至麩胱甘肽塞法羅斯 糖粒並於4°C下經活體外轉譯的14-3_3沒培育4小時。以抗 14-3-3 /3抗體分析該結合物質。β·使用Ror2蛋白質 (GST-R2C，Invitrogen)之純化重組型胞液結構域及純化重組 5型GST-14-3-3/3 (Biomol，Inc.)，如“通用方法，，中所述之方法 進行活體外激酶分析（第6圖適用於實例4)。 第7圖係表示Rot2-專一性抗體可導致該R〇r2受體之二 聚合反應及活化作用。A_為說明二聚合反應，使U20S細 胞經於COOH末端經Flag(R2-F)或His(R2_H)抗原決定位標 10 記物標記之R〇r2表現性質體轉移感染。24小時後，於37〇c 下使該等細胞經R〇r2-專一性山羊多株igG或非專一性山羊 IgG處理，費時一小時，並製備該等全細胞蛋白質萃取物， 然控免疫沉澱在抗Flag親和性瓊脂糖上。藉使用抗His抗體 進4亍免疫墨點法而分析遺專沉殿物（最上面的^一組）。最下面 15的一組係表示使用抗Flag抗體再探查相同膜之沉澱含量對 照物。B·為說明活化作用，以如A中所述之R〇r2-專一性抗 體或對照物IgG處理未經轉移感染之U20S細胞，且該等全 細胞萃取物係沉澱在抗磷酸酪胺酸抗體上並經R〇r2或 14-3-3沒抗體分析（第7圖適用於實例5)。 20 第8圖係表示R〇r2抗體可導致hMSC中之礦質化基質形 成。在經非專一性山羊IgG、該Rorl-專一性山羊IgG(各50 微克/毫升）或漸增濃度之該R〇r2-專一性山羊IgG補充之含 0.05mM抗壞血酸、l〇mM 厶-GP及lOOnMdex的MSCGM中 培育人類MSC。培育9天後，藉茜素紅-S染色法而評估該基 89 200800266 質礦質化反應之程度（第8圖適用於實例6)。 第9圖係說明經由Ror2而媒介之藉Ror2抗體所誘發的 該1^%礦質化反應。A·使hMSC經含有對Ror2或EGFP(對 照物）具shRNA專一性之腺病毒表現性載體感染，並在經 5 〇.〇5mM抗壞血酸、i〇mM 0 _GP及l〇〇nM dex補充之 MSCGM中培育。經9天培育後，藉茜素紅_S染色法而評估 該基質礦質化之程度。B.使人類MSC經Ror2腺病毒感染24 小時，然後在含有〇.〇5mM抗壞血酸、10mM y3-GP及Ror2· 專一性山羊IgG或非專一性山羊lgG之MSCGM中培育19 10 天，接著經茜素紅-S染色（第9圖適用於實例6)。 第10圖係說明下調14-3-3/3可增強hMSC中之礦質化 基質形成。使人類MSC經含有雜亂的shRNA ; 14-3-3/3 -專 一性shRNA ;点-半乳糖苷酶（石-gai)過度處理性序列盒或 Ror2過度表現性序列盒之腺病毒表現性載體感染並在經 15 〇.〇5mM 抗壞血酸、lOmM /3 -GP 及 lOOnM dex 補充之 MSCGM中培育。經9天培育後，使50微克該等全細胞蛋白 質萃取物進行該内源性14-3-3 /5蛋白質之西方免疫墨點法 (A)。經12天培育後，進行茜素紅-S染色法(B)以評估礦質化 基質形成之程度（第10圖適用於實例7)。 20 第11圖係說明Ror2抗體處理及14-3-3/3下調可促進活 體外新骨形成。使小鼠顱蓋骨經含對14-3-3/3具專一性之雜 亂shRNA(scr)或shRNA的腺病毒感染；且48小時後，在卡 勒森存在下經12微克/毫升之抗R〇r2抗體或非專一性IgG 處理。經腺病毒及抗體培育7天後，以蘇木素-曙紅將顧蓋 90 200800266 染色並測定總骨面積（空心條)及成骨細胞數(實心條）。在經 雜亂shRNA感染及經IgG處理之培養物中所獲得之值被設 定為100%。該等結果為每一狀況（*_p<〇〇5)4個顱蓋 SE平均值（第11圖適用於實例8)。 5 第12圖係闡明形成用於R〇r2活性之高通過料量、高靈 性分析。Α·該分析之圖示係利用該TrkB受體之傳訊路徑。 該TrkB受體係藉經配位體誘發之均二聚合反應而活化，該 經配位體誘發之均二聚合反應可導致Erk之磷酸化反應及 目標基因之促進子中的(^]^1>反應元素(CRE)之刺激作用。 1〇我們已產生由和該穿透膜融合之R0r2的細胞外結構域 (aal-407)，及TrkB之細胞内結構域(aa 432_822)所組成之嵌 合型叉體。當使用該嵌合體時，可導致Ror2二聚合反應之 藥劑能活化TrkB傳訊路徑且可藉cre促進子-蟲螢光素酶 報告基因分析而評估該活化作用。Β·使HEK 293細胞穩定 15地經该Ror2_TrkB*合體及CRE-蟲螢光素酶質體轉移感 染，經指定量之該抗Ror2抗體或非專一性IgG處理24小時， 並评估蟲螢光素酶活性。藉經該非專一性IgG處理而觀測之 蟲螢光素酶活性被設定為1。該等結果表示3種獨立實驗(V SE平均值；n==4 ; ★_1><0.〇5)(第12圖適用於實例9)。 20 【主要元件符號說明】 (無） 91

Claims (1)

1. 200800266 十、申請專利範圍： 1. 一種治療或預防骨關聯性病症之方法，其包含對一罹患 骨關聯性病症之患者投予一治療上有效量之可活化 Ror2蛋白質的藥劑。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該骨關聯性病症係 與骨質流失有關。 3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該病症係選自由以 下所組成之群組：骨質疏鬆症、骨癌、關節炎、佝僂症、 骨折、牙週病、骨分段缺陷、溶骨性骨疾、原發性及繼 發性副甲狀腺機能亢進、潘吉德氏症、骨軟化症，及骨 肥大症。 4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該患者為人類。 5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該藥劑可導致Ror2 蛋白質之二聚合反應。 6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該藥劑為小分子。 7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該藥劑為蛋白質。 8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該藥劑包含針對 Ror2蛋白質之抗體。 9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該藥劑包含一針對 Ror2蛋白質之單株抗體。 10. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該藥劑為針對R〇r2 之人類或人源化單株抗體。 11. 如申請專利範圍第8、9或10項之方法，其中該抗體為IgG 同型物。 92 200800266 12. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該藥劑包含一針對 Ror2蛋白質之抗體片段。 13. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該藥劑包含一針對 Ror2蛋白質之Fab片段。 14. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該藥劑包含至少兩 個針對Ror2蛋白質之抗體片段，其中該等抗體片段係共 價性連接在一起。 15. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該藥劑係非經腸道 方式投予。 16. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該藥劑係靜脈内投 〇 17. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該藥劑係口服投予。 18. —種增加成骨細胞分化之方法，其包括以一可活化該 Ror2之藥劑接觸表現Ror2之細胞。 19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該藥劑為蛋白質。 20. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該藥劑為小分子。 21. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該藥劑為抗體。 22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該藥劑為針對Ror2 蛋白質之抗體。 23. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該藥劑可導致Rot2 蛋白質之二聚合反應。 24. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該藥劑可增加由 Ror2蛋白質所致之14-3-3石的磷酸化反應。 25. 如申請專利範圍第18項之方法，其該細胞為人類細胞。 93 200800266 26. 如申請專利範圍第18項之方法，其該細胞為幹細胞。 27. 如申請專利範圍第18項之方法，其該細胞為間質幹細 胞。 28. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該接觸步驟係活體 外進行。 29. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該接觸步驟係活體 内進行。 30. —種抑制脂肪生成性分化的方法，其包括以一可增加 Ror2蛋白質之表現或活性之藥劑接觸細胞。 31. —種篩檢可增加Ror2活性之藥劑的方法，其包括以下步 驟： 以一試驗藥劑接觸表現Ror2蛋白質之細胞；以及 測定Ror2活性是否增加。 32·如申請專利範圍第31項之方法，其中該Ror2為Ror2之細 胞性結構域。 33. 如申請專利範圍第31項之方法，其中該Ror2為Roi*2之激 酶結構域。 34. 如申請專利範圍第31項之方法，其中該測定步驟包括評 估Ror2蛋白質之激酶活性。 35. 如申請專利範圍第34項之方法，其中該評估Ror2蛋白質 之激酶活性的步驟包括評估Ror2蛋白質之磷酸化反應 狀態。 36. 如申請專利範圍第31項之方法，其中該測定步驟包括評 估Ror2蛋白質或多核苷酸之表現位準。 94 200800266 37. 如申請專利範圍第31項之方法，其中該測定步驟包括評 估14-3-3/3蛋白質之磷酸化反應狀態。 38. 如申請專利範圍第31項之方法，其中該測定步驟包括測 定礦質化基質形成之位準。 39. —種藉申請專利範圍第31項之方法所鑑別出之藥劑。 40. —種針對Ror2之抗體，藉此該抗體可導致Ror2蛋白質之 ^ 活化作用。 41. 如申請專利範圍第40項之抗體，其中該抗體可導致Ror2 Φ 蛋白質之二聚合反應。 42. 如申請專利範圍第40項之抗體，其中該抗體為多株抗 體。 43. 如申請專利範圍第40項之抗體，其中該抗體為單株抗 體。 44. 如申請專利範圍第40項之抗體，其中該抗體為人類抗 一 體。 45. 如申請專利範圍第40項之抗體，其中該抗體為人源化抗 • 體。 46. 如申請專利範圍第40項之抗體，其中該抗體為該IgG同 型物。 47. 如申請專利範圍第40項之抗體，其中該抗體包含一抗體 片段。 48. 如申請專利範圍第40項之抗體，其中該抗體片段為一 Fab片段。 49. 如申請專利範圍第40項之抗體，其中該抗體具有至少兩 95 200800266 個Ror2蛋白質之結合部位。 50. 如申請專利範圍第40項之抗體，其中該抗體恰具有兩個 Ror2蛋白質之結合部位。 51. —種治療或預防一骨關聯性病症之方法，其包括對一罹 患骨關聯性病症之患者投予一治療上有效量之可抑制 14-3-3/3活性的藥劑。 52. 如申請專利範圍第51項之方法，其中該藥劑可下調 14-3-3/3 表現。 53. 如申請專利範圍第51項之方法，其中該藥劑為一 14-3-3 点-專一性 siRNA或 shRNA。 54. —種鑑別可促進Ror2蛋白質之二聚合反應之藥劑的方 法，該方法包含以下步驟： 提供一表現包括Ror2之細胞外結構域及TrkB之細 胞内結構域的嵌合型受體之細胞，其中該細胞包含一可 操作性連接至cAMP反應元(CRE)促進子促進子之報告 基因建構體； 以一試驗藥劑接觸該細胞；以及 測定該報告基因在該細胞内之表現位準。 55. 如申請專利範圍第54項之方法，其中該報告基因為蟲螢 光素酶。 56. 如申請專利範圍第54項之方法，其中該細胞包含一包括 編碼可操作性連接至該CRE促進子促進子之蟲螢光素 酶之基因的質體。 57. —種具以下胺基酸序列之蛋白質： 96 200800266

   MARGSALPRRPLLCIPAVWAAAALLLSVSRTSGEVEVLDPNDPLGPLDGQDGPI PTLKGYFLNFLEPVNNITIVQGQTAILHCKVAGNPPPNVRWLKNDAPVVQEPRR IIIRKTEYGSRLRIQDLDTTDTGYYQCVATNGMKTITATGVLFVRLGPTHSPNH NFQDDYHEDGFCQPYRGIACARFIGNRTIYVDSLQMQGEIENRITAAFTMIGTS THLSDQCSQFAIPSFCHFVFPLCDARSRAPKPRELCRDECEVLESDLCRQEYTI ARSNPLILMRLQLPKCEALPMPESPDAANCMRIGIPAERLGRYHQCYNGSGMDY RGTASTTKSGHQCQPWALQHPHSHHLSSTDFPELGGGHAYCRNPGGQMEGPWCF TQNKNVRMELCDVPSCSPRDSSKMGILYlsvyavvviasvvgfcllvmlfllkl arhskfgmkgpasvisndddsasplhhisngsntpssseggpdaviigmtkipv ienpqyfgitnsqlkpdtfvqhikrhnivlkrelgegafgkvflaecynlcpeq dkilvavktIkdasdnarkdfhreaelltnlqhehivkfygvcvegdplimvfe ymkhgdlnkfIrahgpdavlmaegnppteltqsqmlhiaqqiaagmvylasqhf vhrdlatrnclvgenllvkigdfgmsrdvystdyyrvgghtmlpirwmppesim yrkfttesdvwslgvvlweiftygkqpwyqlsnneviecitqgrvlqrprtcpq evyelmlgcwqrephmrknikgiht llqnlakaspvyldilg (序列辨識編 號：4);或 一至少90%類似於序列辨識編號：4之胺基酸序列。 58.如申請專利範圍第57項之蛋白質，其中該胺基酸序列 為： MARGSALPRRPLLCIPAVWAAAALLLSVSRTSGEVEVLDPNDPLGPLDGQDGPI .PTLKGYFLNFLEPVNNITIVQGQTAILHCKVAGNPPPNVRWLKNDAPVVQEPRR IIIRKTEYGSRLRIQDLDTTDTGYYQCVATNGMKTITATGVLFVRLGPTHSPNH NFQDDYHEDGFCQPYRGIACARFIGNRTIYVDSLQMQGEIENRITAAFTMIGTS THLSDQCSQFAIPSFCHFVFPLCDARSRAPKPRELCRDECEVLESDLCRQEYTI ARSNPLILMRLQLPKCEALPMPESPDAANCMRIGIPAERLGRYHQCYNGSGMDY RGTASTTKSGHQCQPWALQHPHSHHLSSTDFPELGGGHAYCRNPGGQMEGPWCF TQNKNVRMELCDVPSCSPRDSSKMGILYlsvyavvviasvvgfclivmIfllkl arhskfgmkgpasvisndddsasplhhisngsntpssseggpdavi igmtkipv ienpqyfgitnsqlkpdtfvqhikrhnivikreIgegafgkvflaecynlcpeq dkilvavktIkdasdnarkdfhreaelltnlqhehivkfygvcvegdplimvfe ymkhgdlnkflrahgpdavlmaegnppteltqsqmlhiaqqiaagmvylasqhf vhrdlatrnclvgenllvkigdfgmsrdvystdyyrvgghtmlpirwmppesim yrkfttesdvwslgvvlweiftygkqpwyqlsnneviecitqgrvlqrprtcpq evyelmlgcwqrephmrknikgiht llqnlakaspvyldilg (序列辨識編 97 200800266 號：4);或 一至少95%類似於序列辨識編號：4之胺基酸序列。 59·如申請專利範圍第57項之蛋白質，其中該胺基酸序列 為： MARGSALPRRPLLCIPAVWAAAALLLSVSRTSGEVEVLDPNDPLGPLDGQDGPI PTLKGYFLNFLEPV丽ITIVQGQTAILHCKVAGNPPPNVRWLKNDAPVVQEPRR IIIRKTEYGSRLRIQDLDTTDTGYYQCVATNGMKTITATGVLFVRLGPTHSPNH NFQDDYHEDGFCQPYRGIACARFIGNRTIYVDSLQMQGEIENRITAAFTMIGTS THLSDQCSQFAIPSFCHFVFPLCDARSRAPKPRELCRDECEVLESDLCRQEYTI ARSNPLILMRLQLPKCEALPMPESPDAANCMRIGIPAERLGRYHQCYNGSGMDY RGTASTTKSGHQCQPWALQHPHSHHLSSTDFPELGGGHAYCRNPGGQMEGPWCF TQNKNVRMELCDVPSCSPRDSSKMGILYlsvyavvviasvvgfcllvmlfllkl arhskfgmkgpasvisndddsasplhhisngsntpssseggpdavi igmtkipv ienpqyfgitnsqlkpdtfvqhikrhnivlkrelgegafgkvflaecynlcpeq dkilvavktlkdasdnarkdfhreaelltnlqhehivkfygvcvegdplimvfe ymkhgdlnkflrahgpdavlmaegnppteltqsqmlhiaqqiaagmvylasqhf vhrdlatrnclvgenllvkigdfgmsrdvystdyyrvgghtmlpirwmppesim yrkfttesdvwslgvvlweiftygkqpwyqlsnneviecitqgrvlqrprtcpq evyelmlgcwqrephmrknikgihtllqnlakaspvyldilg (序列辨識編 號：4)〇 98