MX2008010511A

MX2008010511A - Modulacion de la formacion osea.

Info

Publication number: MX2008010511A
Application number: MX2008010511A
Authority: MX
Inventors: Julia Billiard; Yan Liu
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2006-02-17
Filing date: 2007-02-16
Publication date: 2008-11-18
Also published as: CA2638803A1; JP2009527485A; KR20080095269A; SV2009002997A; PA8715601A1; TW200800266A; RU2008131052A; BRPI0707864A2; WO2007098198A2; US20090047287A1; PE20071309A1; EP1984395A2; AR060104A1; ECSP088682A; CR10212A; WO2007098198A3; AU2007217779A1; NO20083497L; IL193271A0

Abstract

Esta invención se relaciona con modular actividad Ror (por ejemplo, actividad de la proteína Ror2) o 14-3-3 ß para afectar la formación o la resorción ósea. La invención se relaciona además con composiciones y métodos para la selección, diagnóstico y desarrollo de terapias para trastornos relacionados con huesos tal como osteoporosis y fracturas de hueso. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo dirigidos a la proteína Ror2 son particularmente útiles para originar la dimerización de las proteínas Ror2, conduciendo de esta manera la activación del Ror2.

Description

MODULACIÓN DE LA FORMACIÓN ÓSEA Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reivindica prioridad bajo el 35 U.S.C. § 1 19(e) a las solicitudes de patente provisionales U.S., USSN 60/774,534, presentadas en febrero 17, 2006, y USSN 60/844,239, presentada en septiembre 13, 2006, que se incorpora aquí como referencia.

Antecedentes de la Invención El tema de los trastornos y enfermedades relacionados con huesos ha ganado considerable atención durante los pasados años. Los trastornos relacionados con los huesos se caracterizan por la pérdida ósea que resulta de un desbalance entre la resorción ósea y la formación ósea. A través de la vida, hay una remodelación constante del hueso del esqueleto. En este proceso de remodelación, existe un balance delicado entre la resorción ósea por los osteoclastos y la formación ósea por los osteoblastos. Los osteoblastos, involucrados en la osificación intracartilaginosa e intramembranosa, son las células especializadas en el tejido óseo que hacen las proteínas de ¡a matriz que resultan en la formación de nuevo hueso. La formación ósea, es decir, la osteogenia, es esencial para el mantenimiento de la masa ósea en el esqueleto. A diferencia de los osteoblastos, los osteoclastos se asocian con la resorción y remoción ósea. En el hueso normal, el balance entre la formación ósea mediada por osteoblasto como la resorción ósea mediada por osteoclasto se mantiene a través de interacciones complejas reguladas.

Existen muchas deficiencias, enfermedades, y trastornos asociados con el sistema del esqueleto. Ejemplos de unos pocos incluyen, pero no se limitan a, la osteoporosis, el cáncer de hueso, la artritis, raquitismo, fractura ósea, enfermedad periodontal, defectos óseo segmentarios, enfermedad ósea osteolítica, hiperparatiroidismo primario y secundario, enfermedad de Paget, osteomalacia, hiperostosis, y osteopetrosis. La identificación de los mecanismos involucrados en la diferenciación osteogénica y los procesos de renovación son cruciales para el entendimiento de la fisiología ósea y los trastornos del esqueleto tal como la osteoporosis. Estos trastornos pueden involucrar formación ósea deficiente debido a la maduración defectuosa de los progenitores osteoblásticos putativos.

Subsiste la necesidad de desarrollar métodos para tratar enfermedades o trastornos asociados con la resorción y formación ósea, métodos para promover la formación ósea, métodos para identificar agentes que modulen (incrementen o disminuyan) la formación ósea, métodos para identificar agentes que modulen (incrementen o disminuyan) la resorción ósea, y métodos para identificar genes o sus productos de proteína asociados con los trastornos relacionados con el hueso.

La identificación de los mecanismos involucrados en la formación ósea y la resorción ósea son cruciales para el entendimiento de la fisiología ósea y los trastornos del esqueleto, tal como la osteoporosis. Los genes o sus productos de proteína que están asociados con los trastornos relacionados con el hueso se pueden utilizar para la elucidación de los mecanismos moleculares de la formación ósea, la resorción ósea, para seleccionar y desarrollar nuevos fármacos, para diagnóstico, pronóstico, prevención y tratamiento del desarrollo óseo y de los trastornos de pérdida ósea, y la evaluación de terapias para trastornos relacionados con el hueso tal como la osteoporosis. Las proteínas y los genes identificados también pueden ser útiles en la búsqueda de agentes farmacéuticos que modulen la formación ósea. Una de tales proteínas que se ha identificado recientemente es la proteína Ror2. La regulación por disminución de la expresión del gen Ror2 inhibe la diferenciación osteogénica inducida por la dexametasona de las células madre mesenquimales humanas (Figura 1) mientras que la sobreexpresión del Ror2 promueve la diferenciación osteogénica de estas células (Billiard ef al., Solicitud de Patente U.S. U.S.S.N. 10/823,998, presentada en abril 14, 2004; incorporada aquí como referencia). Por lo tanto, el Ror2 y la ruta del Ror2 son objetivos adecuados para modular la formación ósea.

Breve Descripción de la Invención La presente invención suministra un sistema para modular la formación ósea. El sistema se basa en el descubrimiento del papel del Ror2 en la diferenciación del osteoblasto. En particular, la activación de la proteína Ror2 conduce a la formación ósea mineralizada. Se ha encontrado que es crucial la expresión del Ror2 en la diferenciación osteogénica de las células madre mesenquimales. También se ha encontrado que la sobreexpresión del Ror2 inhibe la diferenciación de las células madre mesenquimales en adipocitos. También se ha encontrado que la activación de la proteína Ror2 conduce a la fosforilación del 14-3-3ß. Se ha encontrado que la regulación por disminución del 1 -3-3ß incrementa la formación de matriz mineralizada en células madre mesenquimales humanas. Estos descubrimientos con relación a la proteína Ror2, su interacción con la proteína 14-3-3ß, y la regulación por disminución del 14-3-3ß hacen el Ror2, 14-3-3ß, y otras biomoléculas de señalización en la dirección 3' objetivos principales en la búsqueda de agentes novedosos que modulen la formación ósea. Los agentes que activan la proteína Ror2, inhiben la proteína 14-3-3ß, o modulan la actividad de otros objetivos en la dirección 3' que son útiles en el tratamiento y prevención de trastornos relacionados con los huesos, particularmente trastornos asociados con la pérdida ósea. Estos agentes también son útiles en promover la diferenciación de osteoblasto y en promover la formación de matriz mineralizada. Alternativamente, estos agentes también pueden encontrar uso al inhibir la diferenciación de las células madre en adipocitos y pueden ser útiles en tratar la obesidad, trastornos metabólicos, o diabetes.

La presente invención suministra agentes que activen la proteína Ror2. En ciertas modalidades, los agentes originan la dimerización de la proteína Ror2 conduciendo de esta manera la activación del Ror2. La dimerización de la proteína Ror2 conduce a una actividad de quinasa incrementada y la posterior fosforilación de los compañeros de unión del Ror2 que incluye la proteína 14-3-3ß. El agente también conduce a la promoción del crecimiento óseo.

En otro aspecto, la invención suministra agentes que inhiben la regulación por disminución de la actividad 14-3-3, específicamente 14-3-3ß o 14-3-3?. Estos agentes pueden actuar en el ADN o a nivel de proteína para reducir la actividad del 14-3-3 en las células. En ciertas modalidades, el agente es dirigido a las células involucradas en la formación ósea tal como los osteoblastos, las células madre mesenquimales, las células madre embriónicas, las células madre fetales, las células osteo-progenitoras, los pre-osteoblastos, los osteoblastos maduros, o cualquier otra célula en el linaje del osteoblasto. En otras modalidades, los agentes se dirigen a las células involucradas en la formación de adipocito. Por ejemplo, el agente se puede conjugar a un grupo funcional bifosfonato para dirigir al hueso. La regulación por disminución del 14-3-3ß se ha encontrado que incrementa la formación de matriz mineralizada. Los agentes que dirigen al 14-3-3 o a las isoformas especificas del 14-3-3 se pueden utilizar en conjunto con los agentes que activan la proteína Ror2 (por ejemplo, agentes que originan la dimerización de la proteína Ror2). Tal combinación puede tener efectos sinérgicos en la promoción de la formación ósea.

En aún otros aspectos, la invención suministra agentes que regulan otros elementos en la dirección 3' de la ruta Ror2/14-3-3 que se ha encontrado que es importante en la regulación de la formación ósea. Estos agentes se pueden utilizar solos o en combinación con otros agentes descritos aquí.

Los agentes de la invención pueden ser cualquier tipo de compuesto químico aunque se prefieren las proteínas, péptidos, polinucleótidos, y moléculas pequeñas. En ciertas modalidades, el agente es un anticuerpo o un fragmento de éste que promueve la dimerización de la proteína Ror2. El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal; sin embargo, los anticuerpos monoclonales humanizados se prefieren típicamente para el tratamiento de sujetos humanos. El anticuerpo o fragmento de éste puede ser cualquier isotipo; sin embargo, el isotipo IgG se generalmente preferido. En ciertas modalidades, el agente es un fragmento de anticuerpo bivalente o multivalente dirigido a la proteína Ror2. En otras modalidades, el agente es una construcción ARNL siARN, o shARN específico de 14-3-3ß.

En un aspecto, un agente que activa la proteina Ror2 o inhiba la actividad 14-3-3ß se administra a un sujeto para promover la formación ósea. En ciertas modalidades, una combinación de un agente que active la proteína Ror2 y un agente que inhiba la actividad 14-3-3ß se administra a un sujeto. Específicamente, la administración del agente promueve la diferenciación del osteoblasto o incrementa la formación de matriz mineralizada o ambos. El sujeto puede sufrir de o estar en riesgo a cualquier trastorno relacionado con los huesos incluyendo osteoporosis, cáncer óseo, artritis, raquitismo, fractura de hueso, enfermedad periodontal, defectos óseo segmentarios, enfermedad ósea osteolítica, hiperparatiroidismo primario y secundario, enfermedad de Paget, osteomalacia, e hipertrosis. El agente es particularmente útil para tratar enfermedades asociadas con la pérdida ósea. En un aspecto, el agente promueve la dimerización de la proteína Ror2, activando de esta manera la proteína Ror2. El agente puede ser cualquier tipo de compuesto químico; sin embargo, las moléculas pequeñas, polinucleótidos, proteínas, y péptidos son particularmente útiles. En ciertas modalidades, el agente es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo dirigido a la proteína Ror2. Los anticuerpos monoclonales humanizados se prefieren generalmente dado el uso exitoso de los anticuerpos monoclonales humanizados en el tratamiento de enfermedades humanas tales como, por ejemplo, la enfermedad de Crohn y la esclerosis múltiple. En ciertas modalidades, el agente regula hacia abajo la expresión del 14-3-3, específicamente la expresión del 14-3-3ß o 14-3-3?. En ciertas modalidades particulares, el agente es un ARNi, shARN o siARN específico del 14-3-3ß. Los agentes de la invención también se pueden utilizar para tratar la obesidad, los trastornos metabólicos, o la diabetes al promover la diferenciación del osteoblasto a costa de la diferenciación de adipocito.

En otro aspecto, la célula es puesta en contacto con un agente que activa la proteína Ror2 o inhiba la actividad 14-3-3ß para promover la diferenciación del osteoblasto o la diferenciación osteogénica. La célula que es puesta en contacto típicamente expresa la proteína Ror2 o la proteína 14-3-3ß y es capaz de sufrir diferenciación del fenotipo del osteoblasto. En ciertas modalidades, la célula es una célula madre, por ejemplo, una célula madre mesenquimal. La célula se puede poner en contacto con el agente in vivo o in vitro. La célula también se puede poner en contacto con el agente ex vivo y luego introducirse a un sujeto necesitado de ello (por ejemplo, un sujeto que sufre de un trastorno relacionado con los huesos, particularmente uno asociado con la pérdida ósea).

La sobreexpresión del Ror2 y la inhibición del 14-3-3ß también se ha encontrado que inhiben la diferenciación adipogénica. Por lo tanto, los agentes que activan la proteína Ror2 o inhiben la actividad 14-3-3ß también son útiles para inhibir la diferenciación adipogénica. Los agentes de la invención son por lo tanto particularmente útiles para inhibir la diferenciación adipogénica de las células madre, por ejemplo, las células madre mesenquimales. Con base en este descubrimiento, los activadores del Ror2 o los reguladores hacia abajo 14-3-3ß pueden ser útiles en el tratamiento o prevención de la obesidad, diabetes, u otros trastornos metabólicos.

La presente invención también incluye un sistema para identificar agentes que modulan la actividad Ror2 o la expresión o modulen la fosforilación de la proteína 14-3-3ß. El sistema de selección incluye poner en contacto la proteína Ror2 con un agente y detectar un efecto del agente sobre la actividad o expresión del Ror2. La detección de un incremento en la actividad o la expresión del Ror2 es indicativa de un agente que es útil para promover la formación ósea, promover la diferenciación de osteoblasto, o inhibir la diferenciación adipogénica. En ciertas modalidades, la actividad de la proteína Ror2 se ensaya al determinar la extensión de la dimerización de la proteína Ror2. En otras modalidades, la actividad Ror2 se evalúa al determinar el estado de fosforilación de la proteína Ror2 misma o del 14-3-3ß. En otras modalidades, la actividad quinasa del Ror2 se mide, por ejemplo, utilizando 32P ? ATP o la inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo de anti-fosfotirosina. En ciertas modalidades, el ensayo es un ensayo basado en célula que utiliza una proteína Ror2 que expresa célula. En otras modalidades, el ensayo está libre de célula, y se utiliza proteína Ror2 purificada o semi-purificada. Los agentes identificados que utilizan los métodos de selección de la invención y las composiciones farmacéuticas de éstos son particularmente útiles en los métodos de tratamiento de la invención descritos aquí.

La presente invención también suministra un ensayo para identificar agentes que promueven la dimerización de la proteína Ror2. El ensayo es particularmente adecuado para técnicas de alta producción para seleccionar grandes números de compuestos prospecto. Un receptor quimérico que consiste del dominio extracelular de la proteína Ror2 se fusiona al dominio intracelular del TrkB. Los agentes que dimerizan los dominios Ror2 extracelulares activan la ruta de señalización TrkB que resulta en un incremento en la actividad promotora CRE. Un gen indicador tal como la luciferasa operablemente ligada al promotor CRE se puede utilizar entonces para identificar los compuestos que dimerizan el Ror2. El ensayo de quimera Ror2-TrkB se ha validado utilizando los anticuerpos anti-Ror2 que han sido previamente mostrados que dimerizan el Ror2. Los anticuerpos específicos del Ror2 originan un incremento dependiente de dosis en la actividad de luciferasa observada cuando se comparan con las células tratadas con un IgG no específico (ver Figura 12). El ensayo suministra un ensayo de alto rendimiento y alta sensibilidad rápido para identificar agentes que activen el Ror2. Como se apreciaría por aquellos expertos en la técnica, otros dominios intracelulares además del TrkB se pueden utilizar para preparar la quimera. Un promotor diferente operablemente ligado al gen indicador se puede entonces necesitar en el ensayo. Los agentes identificados como activadores o dimerizadores del Ror2 mediante el ensayo de la invención también se consideran parte de la presente invención.

Definiciones Las siguientes definiciones se suministran para un entendimiento completo de los términos y abreviaturas utilizados aquí.

Como se utiliza aquí y en las reivindicaciones finales, las formas singulares "un", "una", y "el" incluyen las referencias plurales a menos que el contexto claramente indique otra cosa. Así, por ejemplo, una referencia a "una célula" incluye una pluralidad de tales células, y una referencia a "un anticuerpo" es una referencia a uno o más anticuerpos y equivalentes de éstos conocidos por aquellos expertos en la técnica, y así sucesivamente. Las abreviaturas en la especificación corresponde a las unidades de medida, técnicas, propiedades o compuestos como siguen: "g" significa gramo(s), "mg" significa miligramo(s), "ng" significa nanogramo(s), "kDa" significa kilodalton(s), "°C" significa grado(s) Celsius, "cm" significa centímetro(s), "s" significa segundo(s), "min" significa minuto(s), "h" significa hora(s), "I" significa litro(s), "mi" significa mililitro(s), "µ?" significa microlitro(s), "pl" significa picolitro(s), "M" significa molar, "mM" significa milimolar, "mmol" significa milimol(es), "kb" significa kilobase(s), "bp" significa par(es) de base, y "TA" significa temperatura ambiente.

"Cromatografía líquida de alto desempeño" se abrevia HPLC.

"Estructura de lectura abierta" se abrevia ORF.

"Espectroscopia de masa" se abrevia MS.

"Espectroscopia de masa en Tándem" se abrevia MS/MS.

"Electroforesis de gel de poliacrilamida" se abrevia PAGE.

"Reacción en cadena de polimerasa" se abrevia PCR. "reacción en cadena de polimerasa de transcriptasa inversa" se abrevia RT-PCR.

"Dodecil sulfato de sodio" se abrevia SDS.

"Electroforesis de gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio" se abrevia SDS-PAGE.

"Traslocador 2 del nucleótido adenina" se abrevia como proteína portadora ADP/ATP.

"Densidad del Mineral Óseo" se abrevia BMD.

"ARN ribosómico" se abrevia rARN".

"Región no traducida" se abrevia UTR.

En el contexto de esta descripción, se deben utilizar un número de términos. Como se utiliza aquí, el término Ror se refiere a una familia de los receptores huérfanos similares a la tirosina quinasa receptora. La "molécula Ror" se refiere a los polipéptidos Ror, proteínas Ror, péptidos Ror, fragmentos, variantes, y mutantes de éstos así como también a ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos Ror, proteínas Ror, péptidos Ror y fragmentos o variantes o mutantes de éstos. La "molécula Ror" también se refiere a los polinucleótidos Ror, genes y variantes y mutantes de éstos. La "molécula Ror" y "Ror" se refiere tanto a las moléculas Ror1 como Ror2.

La "molécula Ror objetivo" se refiere a una molécula Ror cuya actividad se modula por un agente de la presente invención. La molécula Ror objetivo puede ser un polipéptido Ror, homólogos, derivados o fragmentos o variantes o mutantes de éstos. La molécula Ror de interés también puede ser ácido nucleico (oligonucleótido o polinucleótido de ARN o ADN). Por ejemplo, si las proteínas de los genes Ror son de interés en un experimento, las moléculas Ror objetivo serían las proteínas. Se debe entender que el término molécula Ror objetivo se refiere tanto a las moléculas de longitud completa como a fragmentos, variantes, y mutantes de éstos, tal como un epítopo de una proteína. La molécula Ror objetivo puede ser cualquier molécula Ror1 o molécula Ror2 o ambas. En ciertas modalidades particulares, la molécula Ror objetivo es la proteína Ror2.

El término "14-3-3" se refiere a una familia de proteínas que está involucrada en la transducción de señal. Las proteínas 14-3-3 tienen un gran número de compañeros de unión y están involucradas en un grupo grande y diverso de procesos celulares. Las proteínas 14-3-3 ejercen sus efectos al unirse a su objetivo y hacer (1 ) cambios conformacionales; (2) oclusión física de características de proteína específica de secuencia o estructurales; y/o (3) andamiaje. Varios artículos de revisión sobre la estructura y la función de las proteínas 14-3-3 son Bridges y Moorhead, "14-3-3 Proteins: A Number of Functions for a Numbered Proteín", Sci. STKE re10, 2004; Mackintosh, "Dynamic ¡nteractions between 14-3-3 proteins and phosphoproteins regúlate diverse cellular processes", Biochem. J. 381 :329-42, 2004; cada una de las cuales se incorporan aquí como referencia. "14-3-3" puede referirse a los polipéptidos 14-3-3, las proteínas 14-3-3, los péptidos 14-3-3, los fragmentos 14-3-3, las variantes 14-3-3, y los mutantes 14-3-3 de éstos así como también a los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos 14-3-3, las proteínas 14-3-3, los péptidos 14-3-3, los fragmentos 14-3-3, las variantes 14-3-3, o los mutantes 14-3-3 de éstos. Varias isoformas del las proteínas 14-3-3, los péptidos 14-3-3, los fragmentos 14-3-3, las variantes 14-3-3, y los mutantes 14-3-3 se han identificado incluyendo ß, e, ?, ?, t, ?, y s. Se ha encontrado que la activación de la proteína Ror2 conduce a la fosforilación de la isoforma 14-3-3ß. Tanto el 14-3-3ß como el 14-3-3? se ha encontrado que interactúan con el Ror2. En ciertos casos, se hace referencia específica a la 14-3-3ß. En ciertos otros casos, se hace referencia específica a la 14-3-3?.

El término "molécula de ácido nucleico" se refiere a una forma de éster de fosfato de los ribunocleótidos (moléculas de ARN) o desoxiribunocleótidos (moléculas de ADN), o cualquier análogo de fosfodiéster, en su forma de cadena única, o una hélice de doble cadena. Las hélices de ADN-ADN, ADN-ARN y ARN-ARN de doble cadena son posibles. El término molécula de ácido nucleico, y en particular molécula de ADN o ARN, se refiere a la estructura primaria o secundaria de la molécula, y no la limita a ninguna forma terciaria particular. Así, este término incluye ADN de doble cadena encontrado, inter alia, en moléculas de ADN lineales (por ejemplo, fragmentos de restricción) o circulares, plásmidos, y cromosomas. Para discutir las estructuras de las moléculas de ADN de doble cadena particulares, se pueden describir secuencias de acuerdo con la convención normal para dar solamente la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la cadena no trascrita de ADN (es decir, la cadena que tiene una secuencia homologa al mARN).

Una "molécula de ácido nucleico recombinante" es una molécula de ácido nucleico que ha sufrido una manipulación biológica molecular, es decir, una molécula de ácido nucleico de ocurrencia no natural o una molécula de ácido nucleico trabajada por ingeniería genética. Adicionalmente, el término "molécula de ADN recombinante" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que no es de ocurrencia natural, o que se puede hacer mediante la combinación artificial de dos segmentos separados de otra manera de la secuencia de ácido nucleico, es decir, al ligar juntas las piezas de ADN que no son normalmente continuas. Por "recombinantemente producido" se significa la combinación artificial a menudo lograda por medios de síntesis química, o medíante la manipulación artificial de los segmentos aislados de los ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética que utilizan enzimas de restricción, ligasas, y técnicas recombínantes similares como se describe por, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainwíew, N.Y.; (989), o Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols (1989), y DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes I y II (ed. D. N. Glover) IREL Press, Oxford, (1985); cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia.

Tal manipulación se puede hacer para reemplazar un codón con un codón redundante que codifica el mismo o un aminoácido conservador, aunque introduciendo o removiendo típicamente un sitio de reconocimiento de secuencia. Alternativamente, se puede desarrollar para unirse junto a segmentos de ácido nucleico de funciones deseadas para generar una entidad genética única que comprende una combinación deseada de funciones no encontradas en las formas naturales comunes. Los sitios de reconocimiento de enzima de restricción son a menudo el objetivo de tales manipulaciones artificiales, pero otros objetivos específicos de sitio, por ejemplo, promotores, sitios de replicación de ADN, secuencias de regulación, secuencias de control, estructuras de lectura abierta, u otras características útiles se pueden incorporar mediante diseño. Ejemplos de una molécula de ácido nucleico recombinante incluyen vectores recombinantes, tales como vectores de clonación o de expresión que contienen las secuencias de ADN que codifican las proteínas de la familia Ror o las proteínas de inmunoglobulina que están en la orientación 5' a 3' (codificante) o en una orientación 3' a 5' (anticodificante).

Los términos "polinucleótido", "secuencia de nucleótido", "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico", "secuencia de ácido nucleico", y "oligonucleótido" se refiere a una serie de bases de nucleótido (también denominadas "nucleótidos") en ADN y ARN, y significan cualquier cadena de dos o más nucleótidos. Los polinucleótidos pueden ser mezclas quiméricas o derivadas o versiones modificadas de éstos, de cadena simple o de cadena doble. El oligonucleótido se puede modificar en el grupo funcional base, el grupo funcional de azúcar, o la estructura de fosfato, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la molécula, sus parámetros de hibridación, etc. El oligonucleótido anticodificante puede comprender un grupo funcional base modificado que se selecciona del grupo que incluye pero no se limita a 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-triouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metil éster de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, 5-metil-2-tioruracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, y 2,6-diaminopurina. Una secuencia de nucleótido típicamente lleva información genética, que incluye la información utilizada por la maquinaria celular para hacer las proteínas y enzimas. Estos términos incluyen genómico de cadena doble o única y cADN, ARN, y cualquier polinucleótido sintética y genéticamente manipulados, y tanto polinucleótidos codificante como anticodificante. Éste incluye moléculas de cadena única y doble, es decir, híbridos de ADN-ADN, ADN-ARN y ARN-ARN, así como también "ácidos nucleicos de proteina" (PNA) formados al conjugar las bases a una estructura de aminoácido. Esto también incluye ácidos nucleicos que contienen las bases modificadas, por ejemplo, tiouracilo, tio-guanina, y fluoro-uracilo, o que contienen carbohidratos, o lípidos.

Los polinucleótidos de la invención se pueden sintetizar mediante métodos estándar conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado (tal como aquellos que sean comercialmente disponibles de Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Como ejemplos, se pueden sintetizar oligonucleótidos de fosforotioato mediante el método de Stein et al., Nucí. Acids Res., 16, 3209, (1988), los oligonucleótidos de metil fosfonato se pueden preparar al utilizar un soporte de polímero de vidrio de poro controlado (Sarin et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 85, 7448-7451 , (1988), etc. Se han desarrollado un número de métodos para suministrar ADN o ARN contrasentido a las células, por ejemplo, las moléculas anticodificante se pueden inyectar directamente en el sitio del tejido, o las moléculas anticodificante modificadas, designadas para apuntar a las células deseadas (anticodificante ligadas a péptidos o anticuerpos que se unen específicamente a receptores o antígenos expresados sobre la superficie de la célula objetivo) se pueden administrar sistémicamente. Alternativamente, las moléculas de ARN se pueden generar mediante la trascripción in vitro e in vivo de las secuencias de ADN que codifican la molécula de ARN anticodificante. Tales secuencias de ADN se pueden incorporar en una amplia variedad de vectores que incorporan promotores de polimerasa de ARN adecuados tales como los promotores de polimerasa T7 o SP6. Alternativamente, las construcciones de cADN anticodificante que sinteticen el ARN anticodificante constitutivamente o induciblemente, dependiendo del promotor utilizado, se pueden introducir establemente en las líneas celulares. Sin embargo, es difícil a menudo lograr las concentraciones intracelulares del anticodificante suficiente para suprimir la traducción de los mARN endógenos. Por lo tanto una aproximación preferida utiliza una construcción de ADN recombinante en la cual el oligonucleótido anticodificante se coloca bajo el control de un promotor fuerte. El uso de tal construcción para transfectar las células objetivo en el paciente dará como resultado la trascripción de cantidades suficientes de los ARN de cadena única que formarán pares de base complementarias con los transcriptos del gen objetivo endógeno y evitarán de esta manera la traducción del gen objetivo mARN. Por ejemplo, se puede introducir un vector in vivo de tal forma que éste se toma por una célula y dirigir la trascripción del ARN anticodificante. Tal vector puede permanecer episómico o volverse cromosómicamente integrado, en tanto éste se pueda trascribir para producir el ARN anticodificante deseado. Tales vectores se pueden construir mediante métodos estándar de tecnología de ADN recombinante en la técnica. Los vectores pueden ser plásmidos, virus, u otros conocidos en la técnica, utilizados para la replicación y expresión en células de mamífero. La expresión de la secuencia que codifica el ARN anticodificante puede ser mediante cualquier promotor conocido en la técnica para actuar en un mamífero, preferiblemente células humanas. Tales promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Tales promotores incluyen pero no se limitan a: la región promotora temprana SV40 (Bernoist y Chambón, Nature, 290, 304-310 (1981), el promotor contenido en la repetición terminal longitudinal 3' del virus del sarcoma Rous, Yamamoto et al., Cell, 22, 787-797, (1980), el promotor de timidina quinasa de herpes, Wagner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78, 1441-1445, (1981 ), las secuencias regulatorias del gen de metalotioneina Brinster et al., Nature 296, 39-42, (1082), etc. Cualquier tipo de plásmido, cósmido, cromosoma artificial de levadura o vector viral se puede utilizar para preparar la construcción de ADN recombinante que se pueden introducir directamente en el sitio del tejido. Alternativamente, los vectores virales se pueden utilizar los cuales infectan selectivamente el tejido deseado, en cuyo caso la administración se puede lograr mediante otra ruta (por ejemplo, sistémicamente).

Los polinucleótidos pueden estar flanqueados por secuencias regulatorias naturales (control de expresión), o estar asociados con secuencias heterólogas, que incluyen promotores, sitios de entrada de ribosoma interno (IRES) y otras secuencias del sitio de unión de ribosoma, mejoradores, elementos de respuesta, supresores, secuencias de señal, secuencias de poliadenilación, intrones, regiones no codificantes 5' y 3' , y similares. Los ácidos nucleicos también se pueden modificar por muchos medios conocidos en la técnica. Ejemplos no limitantes de tales modificaciones incluyen mutilación, "caps", sustitución de uno o más nucleótidos de ocurrencia natural con un análogo, y modificaciones de internucleótido tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosforoamidatos, carbamatos, etc.)y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.). Los polinucleótidos pueden contener uno o más grupos funcionales covalentemente ligados adicionales, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-L-lisina, etc), intercaladotes (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), quemadores (por ejemplo, metales, metales radioactivos, hierro, metales oxidantes, etc.), y alquiladores. Los polinucleótidos se pueden derivar mediante la formación de un enlace metil o etil fosfotriéster o alquil fosforoamidato. Adicionalmente, los polinucleótidos aquí también se pueden modificar con una marca capaz de suministrar una señal detectable, directa o indirectamente. Marcas de ejemplo incluyen radioisótopos, moléculas fluorescentes, biotina, y similares.

El "trascripto de ARN" se refiere a un producto que resulta de la trascripción catalizada por polimerasa de ARN de una secuencia de ADN. Cuando el trascripto de ARN es una copia complementaria de la secuencia de ADN, ésta se denomina como el trascripto primario o puede ser una secuencia de ARN derivada del procesamiento post-transcripcional del trascripto primario y se denomina como el ARN maduro. "ARN mensajero (mARN)" se refiere al ARN que está sin los intrones y se puede traducir en polipéptidos mediante la célula. "cARN" se refiere al ARN complementario, trascrito de una plantilla de cADN recombinante. "cADN" se refiere al ADN que es complementario a y derivado de una plantilla de mARN. El cADN puede ser de cadena simple o convertido a forma de doble cadena utilizando, por ejemplo, el fragmento Klenow de la polimerasa I de ADN.

Una secuencia "complementaria" a una porción de ARN, se refiere a una secuencia que tiene una complementariedad suficiente para ser capaz de hibridar con el ARN, formar un dúplex estable; en el caso de los ácidos nucleicos anticodificante de doble cadena, una cadena simple de ADN dúplex se puede probar así, o se puede ensayar la formación triplex. La capacidad para hibridar dependerá tanto del grado de la complementariedad como la longitud del ácido nucleico anticodificante. En general, entre más largo sea el ácido nucleico hibridizante, más serán las faltas de coincidencias de base con el ARN que éste puede contener y aún formar un dúplex estable (o triplex, según sea el caso). Un experto en la técnica puede establecer un grado tolerable de falta de coincidencia mediante el uso de procedimientos estándar para determinar el punto de fusión del complejo hibridado.

Los términos "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico", "fragmento de ácido nucleico" o "polinucleótido" se pueden utilizar intercambiablemente con "gen", "mARN codificado por un gen" y "cADN".

El término "polipéptido que codifica un polinucleótido" comprende un polinucleótido que puede incluir solamente la secuencia codificante así como también un polinucleótido que puede incluir codificación adicional o secuencia no codificante.

Una molécula de ácido nucleico es "hibridable" a otra molécula de ácido nucleico, tal como un cADN, ADN genómico, o ARN, cuando la forma de cadena simple de la molécula de ácido nucleico puede hibridar a otra molécula de ácido nucleico bajo las condiciones apropiadas de temperatura y de concentración iónica de solución, Sambrook, J. et al. eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d Ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Vols. 1-3 (ISBN 0-87969-309-6). Las condiciones de temperatura y concentración iónica determinan la "exigencia" de la hibridación. Para la selección preliminar de los ácidos nucleicos homólogos, las condiciones de hibridación de baja exigencia, que corresponden a un Tm de 55 °C, se pueden utilizar, por ejemplo, 5x SSC, 0.1 % SDS, 0.25% de leche, y sin formamida; o 30% de formamida, 5x SCC, 0.5% SDS. Las condiciones de hibridación de exigencia moderada corresponden a un Tm mayor, por ejemplo, 40% de formamida, con 5x o 6x de SSC. Las condiciones de hibridación de alta exigencia corresponden al Tm más alto, por ejemplo, 50% de formamida, 5x o 6x SSC. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la exigencia de la hibridación, las faltas de coincidencia entre las bases son posibles. La exigencia apropiada para hibridar ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y el grado de complementación, variables bien conocidas en la técnica. El mayor grado de similitud u homología entre dos secuencias de nucleótido, el mayor valor del Tm para híbridos de ácidos nucleicos que tienen aquellas secuencias. La estabilidad relativa (que corresponde a un Tm mayor) de las hibridaciones de ácido nucleico disminuye en el siguiente orden: ARN:ARN, ADN:ARN, ADN:ADN. Para los híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud, las ecuaciones para calcular el Tm han sido derivadas, Sambrook, et al. eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d Ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Vols. 1-3 (ISBN 0-87969-309-6), (9.50-9.51 ). Para la hibridación de ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos, la posición de las faltas de coincidencia se vuelve más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad, Sambrook, et al. eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d Ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Vols. 1 -3 (ISBN 0-87969-309-6, 1 1.7-1 1.8).

El término "complementariedad" se utiliza para describir la relación entre las bases de nucleótidos que son capaces de hibridar una a la otra. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenosina es complementaria a la timina y la citosina es complementaria a la guanina.

"Identidad" o "similitud", como se conoce en la técnica, son las relaciones entre dos o más secuencias de polipéptido o dos o más secuencias de polinucleótido, como se determina al comparar las secuencias. En la técnica, la identidad también significa el grado de relación de secuencia entre las secuencias de polipéptido o polinucleótido, según sea el caso, como se determina por la coincidencia entre las cuerdas de tales secuencias. Tanto la identidad como la similitud se pueden calcular fácilmente mediante métodos conocidos tales como aquellos descritos en: Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed. Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, part I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds. Humana Press, New Jersey, 1994; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991. Los métodos comúnmente empleados para determinar la identidad o similitud entre las secuencias incluyen, pero no se limitan a, aquellas descritas en Carrillo, H., y Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988). Los métodos para determinar la identidad y similitud se codifican en programas de computadora públicamente disponibles. Los métodos del programa de computadora preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programa GCG, Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1), 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, y FASTA Atschul, S. F. et al., J Molec. Biol., 215, 403 (19990)).

"Homólogo" se refiere al grado de similitud de secuencia entre dos polímeros (es decir, moléculas de polipéptido o moléculas de ácido nucleico). Las figuras porcentuales de homología a que se hace referencia aquí reflejan la homología máxima posible entre dos polímeros, es decir, el porcentaje de homología cuando dos polímeros se alinean para tener el número mayor de posiciones coincidentes (homologas).

El término "homología porcentual" se refiere a la extensión de la identidad de la secuencia del aminoácido entre los polipéptidos. La homología entre dos polipéptidos es una función directa del número total de aminoácidos coincidentes en una posición dada en cualquier secuencia, por ejemplo, si la mitad del número total de los aminoácidos en cualquiera de las secuencias es la misma entones las dos secuencias se dice que exhiben el 50% de homología.

El término "fragmento", "análogo", y "derivado" cuando se refiere a polipéptidos se refiere a un polipéptido el cual puede retener esencialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido original. Así, un análogo incluye una proteína precursora que se puede activar mediante clivaje de la porción de la proteína precursora para producir un polipéptido maduro activo. El fragmento, análogo, o derivado del polipéptido puede ser uno en el cual uno o más de los aminoácidos se sustituyen con unos residuos de aminoácido conservados o no conservados y tales residuos de aminoácido puede ser o no aquellos codificados por el código genético, o aquellos en los cuales uno o más residuos de aminoácido incluyen un grupo sustituyente, o aquellos en los cuales el polipéptido se fusiona con un compuesto tal como polietilenglicol para incrementar la vida media del polipéptido, o aquellos en los cuales los aminoácidos se fusionan al polipéptido tal como un péptido de señal o una secuencia tal como una etiqueta de polihistidina que se emplea para la purificación del polipéptido o de la proteína precursora. Tales fragmentos, análogos, o derivados se consideran que están dentro del alcance de la presente invención.

Residuos "conservados" de una secuencia de polinucleótido son aquellos residuos que ocurren de manera no alterada en la misma posición de dos o más secuencias relacionadas que se comparan. Los residuos que son relativamente conservados son aquellos que se conservan entre las secuencias más relacionadas que los residuos que aparecen en cualquier parte en las secuencias.

Los polinucleótidos relacionados son polinucleótidos que comparten una proporción significativa de residuos idénticos.

Diferentes polinucleótidos "corresponden" a cada uno si uno es finalmente derivado del otro. Por ejemplo, el ARN mensajero corresponde al gen del cual se trascribe. El cADN corresponde al ARN del cual éste se ha producido, tal como mediante una reacción de trascripción inversa, o mediante síntesis química de un ADN basado en el conocimiento de la secuencia de ARN. El cADN también corresponde al gen que codifica el ARN. Los polinucleótidos también "corresponden" uno al otro si ellos sirven a una función similar, tal como codificar un polipéptido relacionado en diferentes especies, cepas o variantes que se comparan.

Un "análogo" de un ADN, ARN o un polinucleótido, se refiere a una molécula que semeja los polinucleótidos de ocurrencia natural en la forma y/o la función (por ejemplo, en la capacidad a acoplar la unión de hidrógeno específica de la secuencia a los pares base sobre una secuencia de polinucleótido complementaria) pero que difiere del ADN o ARN en, por ejemplo, la posesión de una base inusual o no natural o una estructura alterada. Ver por ejemplo, Uhlmann et al., Chemical Reviews 90, 543-584, (1990).

Una "secuencia codificante" o una secuencia "que codifica" un producto de expresión, tal como un ARN, polipéptido, o proteina, es una secuencia de nucleótido que, cuando se expresa, da como resultado la producción de ese ARN, polipéptido, o proteína (por ejemplo, enzima), es decir, la secuencia de nucleótido codifica una secuencia de aminoácido para aquel polipéptido o proteína. Una "porción sustancial" de una secuencia de aminoácido o nucleótido es una porción que comprende suficiente de la secuencia de aminoácido de un polipéptido o la secuencia de nucleótido de un gen para identificar putativamente ese polipéptido o gen, mediante la evaluación manual de la secuencia por un experto en la técnica, o por una comparación de secuencia automatizada por computadora y la identificación utilizando algoritmos tales como BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410, (1993); ver también www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

De acuerdo con esto, una "porción sustancial" de una secuencia de nucleótido comprende suficiente de la secuencia para identificar y/o aislar específicamente un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia. El experto, que tiene el beneficio de las secuencias como se reportan aquí, puede utilizar ahora toda o una porción sustancial de las secuencias descritas para propósitos conocidos por aquellos expertos en la técnica.

"Genes sintéticos" se pueden ensamblar de los bloques de construcción de oligonucleótido que son químicamente sintetizados utilizando los procedimientos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Estos bloques de construcción están ligados e hibridados para formar segmentos de gen que se ensamblan entonces enzimáticamente para construir el gen completo. "Químicamente sintetizados", relacionado con una secuencia de ADN, significa que los nucleótidos componentes se ensamblaron in vitro. La síntesis química manual del ADN se puede logar utilizando procedimientos bien conocidos, o la síntesis química automatizada se puede desarrollar utilizando uno de un número de máquinas comercialmente disponibles. De acuerdo con esto, los genes se pueden ajustar para la expresión óptima del gen con base en una optimización de la secuencia de nucleótido para reflejar la presión del codón de la célula huésped. El experto apreciará la probabilidad de éxito de la expresión del gen si el uso del codón es empujado hacia aquellos codones favorecidos por el huésped. Determinar los codones preferidos se puede basar en una inspección de genes derivados de la célula huésped donde está disponible la información de secuencia.

El "gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, que incluye secuencias regulatorias que preceden (secuencias no codificantes 5') y que siguen (secuencias no codificantes 3' ) la secuencia codificante. El "gen nativo" se refiere a un gen tal como se encuentra en la naturaleza con su propias secuencias regulatorias. El "gen quimérico" o la "construcción quimérica" se refieren a cualquier gen o construcción, no un gen nativo, que comprende secuencias regulatorias y codificantes que no se encuentran juntas en la naturaleza. De acuerdo con esto, un gen quimérico o una construcción quimérica puede comprender secuencias regulatorias y secuencias codificantes que se derivan de diferentes fuentes, o secuencias regulatorias y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de manera diferente de aquellas encontradas en la naturaleza. El "gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su localización natural en el genoma de un organismo. Un gen "extraño" se refiere a un gen normalmente no encontrado en el organismo huésped, pero que se introduce en el organismo huésped por transferencia de gen. Los genes extraños pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo, o genes quiméricos. Un "transgen" es un gen que se ha introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación.

Las "secuencias regulatorias" se refieren a secuencias de nucleótido localizadas dirección 5' (secuencias no codificantes 5'), dentro, o dirección 3' (secuencias no codificantes 3' ) de una secuencia codificante, y que influencie la trascripción, procesamiento de ARN o estabilidad, o traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias regulatorias pueden incluir promotores, secuencias líderes de traducción, intrones, y secuencias de reconocimiento de poliadenilación.

"Secuencia de control de gen" se refiere a las secuencias de ADN requeridas para iniciar la trascripción de gen más aquellas requeridas para regular la tasa en la cual ocurre la iniciación. Así, una secuencia de control de gen puede consistir del promotor, donde los factores de trascripción general y el montaje de polimerasa, más todas las secuencias regulatorias a las cuales se unen las proteínas regulatorias del gen para controlar la tasa de estos procesos de montaje en el promotor. Por ejemplo, las secuencias de control que son adecuadas para los procariotas pueden incluir un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión de ribosoma. Las células eucarióticas pueden utilizar promotores, mejoradores, y/o señales de poliadenilación.

"Promotor" se refiere a una secuencia de nucleótido capaz de controlar la expresión de una secuencia codificante o el ARN funcional. En general, una secuencia codificante está localizada 3' a una secuencia promotora. La secuencia promotora consiste de elementos en la dirección 5' próximos y más distantes, los últimos elementos a menudo denominados como mejoradores. De acuerdo con esto, un "mejorador" es una secuencia de nucleótido que puede estimular la actividad promotora y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para mejorar el nivel de expresión o la especificidad de tejido de un promotor. Los promotores se pueden derivar en su totalidad de un gen nativo, o estar compuestos de elementos diferentes derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o aún comprender segmentos de nucleótido sintéticos. Se entiende por aquellos expertos en la técnica que promotores diferentes puede dirigir la expresión de un gen en tejidos diferentes o tipos de célula, o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales.

Las "secuencias no codificantes 3' " se refieren a secuencias de nucleótidos localizadas corriente debajo de una secuencia codificante e incluyen las secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras señales regulatorias que codifican la secuencia capaces de afectar el procesamiento del mARN o la expresión del gen. La señal de poliadenilación se caracteriza usualmente por afectar la adición de los tractos de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor mARN.

La "secuencia líder de traducción" se refiere a la secuencia de nucleótido localizada entre la secuencia promotora de un gen y la secuencia codificante. La secuencia líder de traducción está presente en la dirección 5' de mARN completamente procesada de la secuencia de inicio de la traducción. La secuencia líder de la traducción puede afectar el procesamiento del trascripto primario al mARN, la estabilidad del mARN o la eficiencia de traducción.

El término "operativamente ligado" se refiere a la asociación de dos o más fragmentos de ácido nucleico sobre un fragmento de ácido nucleico simple de tal forma que la función de uno se afecta por el otro. Por ejemplo, un promotor está operativamente ligado con una secuencia codificante cuando éste es capaz de afectar la expresión de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante esté bajo el control trascripcional del promotor). Las secuencias codificantes se pueden ligar operativamente a las secuencias regulatorias en orientación codificante o anticodificante. El término "promotor operable en células óseas" se refiere a un promotor que es reconocido por la ARN polimerasa de la célula ósea.

El "trascripto de ARN" se refiere al producto que resulta de la trascripción catalizada de la ARN polimerasa de una secuencia de ADN. Cuando el trascripto de ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, ésta se denomina como el trascripto primario o puede ser una secuencia de ARN derivada de un procesamiento post-trascripcional del trascripto primario y se denomina como el ARN maduro. "ARN mensajero (mARN)" se refiere al ARN que está sin intrones y que se puede traducir en polipéptido. El "cADN" se refiere a un ADN de doble cadena que es complementario a y derivado del mARN. El ARN "codificante" se refiere a un trascripto de ARN que incluye el mARN y así se puede traducir en un polipéptido mediante la célula. "ARN anticodificante" se refiere a un trascripto de ARN que es complementario a todo o parte de un trascripto primario objetivo o mARN que bloquea la expresión de un gen objetivo (ver Patente U.S. No. 5,107,065, incorporada aquí como referencia). La complementariedad de un ARN anticodificante puede estar con cualquier parte de la secuencia de nucleótido específica, es decir, en la secuencia no codificante 5', la secuencia no codificante 3' , intrones, o secuencia codificante. "ARN funcional" se refiere a un ARN codificante, ARN anticodificante, ARN de ribozima, u otro ARN que pueda no ser traducido pero que aún tiene un efecto sobre los procesos celulares.

El término "expresión" se refiere a la trascripción y a la acumulación estable del (mARN) codificante o el ARN anticodificante derivado del fragmento de ácido nucleico de la invención. La expresión también puede referirse a una traducción de mARN en un polipéptido. "Inhibición anticodificante" se refiere a la producción de trascriptos de ARN anticodificante capaces de suprimir la expresión de la proteína objetivo.

"Sobreexpresión" se refiere a la producción de un producto de gen en un organismo que excede los niveles de producción en organismos normal o no transformado. "Supresión" se refiere a suprimir la expresión de los genes extraños o endógenos o los trascriptos de ARN.

"Niveles alterados" se refieren a la producción de producto(s) de gen en organismos en cantidades o proporciones que difieren de aquellas de los organismos normales o no transformados. La sobreexpresión del polipéptido de la presente invención se puede lograr al construir primero un gen quimérico o una construcción quimérica en la cual la región codificante esté operablemente ligada a un promotor capaz de dirigir la expresión de un gen o construcción en los tejidos deseados en la etapa deseada de desarrollo. Por razones de conveniencia, el gen quimérico o la construcción quimérica puede comprender secuencias promotoras y secuencias líderes de traducción derivadas de los mismos genes. Las secuencias no codificantes 3' que codifican las señales de terminación de la trascripción también se pueden suministrar. El presente gen quimérico o construcción quimérica también puede comprender uno o más intrones con el fin de facilitar la expresión del gen. Los vectores de plásmido que comprenden el gen quimérico presente o la construcción quimérica se pueden entonces construir. La elección del vector del plásmido depende del método que se utilizará para transformar las células huéspedes. El experto está bien enterado de los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector del plásmido con el fin de transformar exitosamente, seleccionar y propagar las células huéspedes que contienen el gen quimérico o la construcción quimérica. El experto también reconocerá que diferentes eventos de transformación independientes darán como resultado diferentes niveles y patrones de expresión, Jones et al., EMBO J., 4,241 1-2418, (1985); De Almeida et al., Mol. Gen. Genetics, 218, 78-86, (1989), y así múltiples eventos se deben seleccionar con el fin de obtener líneas que desplieguen el nivel y patrón de expresión deseados. Tal selección se puede lograr por análisis southern del ADN, análisis northern de la expresión del mARN, o análisis western o inmunocitoquímico de la expresión de proteína, o análisis fenotípico.

Los términos "variante" o "variantes" se refieren a las variaciones de las secuencias de ácido nucleico o aminoácido de la molécula Ror. Comprendido dentro del término "variante(s)" están las sustituciones de nucleótido y aminoácido, las adiciones, o supresiones de las moléculas Ror. También, comprendidas dentro del término "variante(s)" están las moléculas Ror naturales y sintéticas químicamente modificadas. Por ejemplo, la variante puede referirse a polipéptidos que difieren de un polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias entre el polipéptido que difiere en la secuencia de aminoácido del polipéptido de referencia, y el polipéptido de referencia están limitadas de tal forma que las secuencias de aminoácido de la referencia y la variante son cercanamente similares en total y, en algunas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácido por una o más sustituciones, supresiones, adiciones, fusiones y truncamientos que puedan ser conservadores o no conservadores y puedan estar presentes en cualquier combinación. Por ejemplo, las variantes pueden ser aquellas en la cual varias, por ejemplo de 50 a 30, de 30 a 20, de 20 a 10, de 10 a 5, de 5 a 3, de 3 a 2, de 2 a 1 o 1 aminoácido se inserte, sustituya, o suprima, en cualquier combinación. Adicionalmente, una variante puede ser un fragmento de un polipéptido de la invención que difiere de la secuencia de polipéptido de referencia que es más corta que la secuencia de referencia, tal como mediante una supresión terminal o interna. Una variante de un polipéptido de la invención también incluye un polipéptido que retiene esencialmente la misma función o actividad biológica que tal polipéptido, por ejemplo, las proteínas precursoras que se pueden activar mediante clivaje de la porción precursora para producir un polipéptido maduro activo. Estas variantes pueden ser variaciones alélicas caracterizadas por las diferencias en las secuencias de nucleótido del gen estructural que codifica para la proteina, o puede involucrar empalmes diferenciales o modificaciones post-transduccionales. Las variantes también pueden incluir una proteína relacionada que tenga sustancialmente la misma actividad biológica, pero obtenida de especies diferentes. El experto puede producir variantes que tienen sustituciones de aminoácido simples o múltiples, supresiones, adiciones, o reemplazos. Estas variantes pueden incluir, entre otros: (i) uno en el cual uno o más de los residuos de aminoácido se sustituyen con un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un residuo de aminoácido conservado) y tal residuo de aminoácido sustituido puede o puede no codificarse por un código genético, o (ii) uno en el cual uno o más aminoácidos se supriman del péptido o proteína, o (iii) uno en el cual uno o más aminoácidos se agregan al polipéptido o la proteína, o (iv) uno en el cual uno o más de los residuos de aminoácido incluyen un grupo sustituido, o (v) uno en el cual el polipéptido maduro se fusiona con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (vi) uno en el cual los aminoácidos adicionales se fusionan al polipéptido maduro tal como una secuencia líder o secretoria o una secuencia que se emplea para la purificación del polipéptido maduro o una secuencia de proteína precursora. Una variante del polipéptido también puede ser una variante de ocurrencia natural tal como una variante alélica de ocurrencia natural, o puede ser una variante que no sea conocida por ocurrir de manera natural. Todas las tales variantes definidas anteriormente se consideran que están dentro del alcance de las enseñanzas de la técnica.

Los polipéptidos y los polinucleótidos de la presente invención se suministran preferiblemente de una forma aislada, y se pueden purificar hasta homogeneidad. Los polipéptidos y los polinucleótidos en ciertos casos son por lo menos 90% puros, por lo menos 95% puros, por lo menos 98% puros, o por lo menos 99% puros.

El término "aislado" significa que el material se remueve de su ambiente original o nativo (por ejemplo, el ambiente natural si éste es de ocurrencia natural). Por lo tanto, un polinucleótido o polipéptido de ocurrencia natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado por intervención humana de alguno o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, se aisla. Por ejemplo, un "fragmento de ácido nucleico aislado" es un polímero de ARN o ADN que es de cadena simple o doble, que contiene opcionalmente bases de nucleótido sintéticas, no naturales o alteradas. Un fragmento de ácido nucleico aislado en la forma de un polímero de ADN se puede comprender de uno o más fragmentos de cADN, ADN genómico o ADN sintético y combinado con carbohidrato, lípido, proteína u otros materiales. Tales polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o tales polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición, y aún ser aislados porque tal vector o composición no es parte del ambiente en el cual éste se encuentra en la naturaleza. De maneara similar, el término "sustancialmente purificado" se refiere a una sustancia, que se ha separado o removido de otra manera, a través de intervención humana, desde el ambiente químico intermedio en el cual éste ocurre en la Naturaleza. Los polipéptidos sustancialmente purificados o los ácidos nucleicos se pueden obtener o producir mediante cualquiera de un número de técnicas y procedimientos generalmente conocidos en el campo.

El término "purificación" se refiere a incrementar la actividad especifica o la concentración de un polipéptido particular o polipéptidos en una muestra. En una modalidad, la actividad específica se expresa como la proporción entre la actividad del polipéptido objetivo y la concentración del polipéptido total en la muestra. En otra modalidad, la actividad específica se expresa como la proporción entre la concentración del polipéptido objetivo y la concentración del polipéptido total. Los métodos de purificación incluyen pero no se limitan a diálisis, centrifugación, y técnicas de cromatografía de columna, que son procedimientos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Young et al., 1997, "Production of biopharmaceutical proteins in the milk of transgenic dairy animáis," BioPharm 10(6): 34-38.

Los términos "sustancialmente puro" y "aislado" no pretenden excluir mezclas de polinucleótidos o polipéptidos con sustancias que no están asociadas con los polinucleótidos o polipéptidos en la naturaleza.

Los términos "célula", "línea celular", y "cultivo celular" se pueden utilizar intercambiablemente. Todos estos términos también incluyen su progenie, que es cualquiera y todas las generaciones posteriores. Se entiende que toda la progenie puede no ser idéntica debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. En el contexto de expresar una secuencia de ácido nucleico heterólogo, "célula huésped" se refiere a una célula procariótica o eucariótica (por ejemplo, células bacterianas tales como E. coli, células de levadura, células de mamífero, células de ave, células de anfibio, células de plantas, células de pez, y células de insecto), sean localizadas in vitro o in vivo. Por ejemplo, el huésped puede incluir cualquier organismo transformable que sea capaz de replicar unas células que se puedan localizar en un animal transgénico. La célula huésped se puede utilizar como un receptor para vectores y/o expresar un ácido nucleico heterólogo codificado por un vector.

Los métodos generales para expresar y recuperar la proteína extraña producida por un sistema de célula de mamífero se suministra mediante, por ejemplo, Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture," in Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996). Las técnicas estándar para recuperar la proteína producida mediante un sistema bacteriano se suministra por, por ejemplo, Grisshammer et al., "Purification of over-produced proteins from E. coli cells," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), páginas 59-92 (Oxford University Press 1995). La transformación de células de insecto y la producción de polipéptidos extraños allí se describen por Guarino et al., US5162222 y la publicación WIPO WO94/06463. Los métodos para aislar proteínas recombinantes de un sistema de baculovirus también se describe por Richardson (ed.), "Baculovirus Expression Protocols" (The Humana Press, Inc. 1995). En una modalidad, los polipéptidos de la invención se pueden expresar utilizando un sistema de expresión de baculovirus (ver, Luckow et al., Bio/Technology, 1988, 6, 47, "Baculovirus Expression Vectors: a Laboratory Manual", O'Rielly et al. (Eds.), W. H. Freeman y Company, New York, 1992, US4,879,236, cada uno de los cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad). Además, el sistema de expresión de baculovirus completo MAXBAC.TM. (Invitrogen) puede, por ejemplo, utilizarse para la producción de células de insecto.

Los polipéptidos de la presente invención también se pueden aislar mediante la explotación de propiedades particulares. Por ejemplo, cromatografía de adsorción de ión de metal inmovilizado (IMAC) se puede utilizar para purificar las proteínas ricas en histidina, incluyendo aquellas que comprenden etiquetas de polihistidína. En resumen, un gel se carga primero con iones de metal divalente para formar un quelato (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985)). Las proteínas ricas en histidina serán adsorbidas a esta matriz con diferentes afinidades, dependiendo del ión de metal utilizado, y se eluirán mediante elusión competitiva, bajando el pH, o uso de agentes quelantes fuertes. Otros métodos de purificación incluyen la purificación de proteínas glicosiladas mediante cromatografía de afinidad de lectina y cromatografía de intercambio de ión (M. Deutscher, (ed.), Meth. Enzymol. 182:529 (1990)). Dentro de las modalidades adicionales de la invención, una fusión del polipéptido de interés y una etiqueta de afinidad (por ejemplo, proteina de unión de maltosa, un dominio de inmunoglobulina) se pueden construir para facilitar la purificación.

Las células huéspedes de la invención se pueden utilizar en métodos para la producción a gran escala de polipéptidos Ror en donde las células crecen en un medio de cultivo adecuado y los productos de polipéptido deseados se aislan de las células, o del medio en el cual las células crecen, mediante métodos de purificación conocidos en la técnica, por ejemplo, métodos cromatográficos convencionales que incluyen cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de afinidad de receptor, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad de lectina, filtración de exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio de catión o anión, cromatografía líquida de alta presión (HPLC), HPLC de fase inversa, y similares. Otros métodos de purificación incluyen aquellos métodos en donde la proteína deseada se expresa y se purifica como una proteína de fusión que tiene una etiqueta específica, marca, o grupo funcional quelante que se reconoce por un compañero o agente de unión específica. La proteína purificada se puede clivar para producir la proteína deseada, o se puede dejar como una proteína de fusión intacta. El clivaje del componente de fusión puede producir una forma de la proteína deseada que tiene los residuos de aminoácido adicionales como resultado del proceso de clivaje.

El término "in vitro" se refiere a un ambiente artificial y a reacciones o procesos que ocurren dentro de un ambiente artificial. Los ambientes in vitro incluyen, pero no se limitan a, tubos de ensayo y cultivos de célula. El término "in vivo" se refiere al ambiente natural (por ejemplo, un animal o célula) y a procesos de reacción que ocurra dentro de un ambiente natural.

Los métodos de la presente invención se pueden desarrollar in vitro utilizando células (células cultivadas) y lisados de células, que incluyen extractos nucleares. Ejemplos de células contempladas para identificar agentes que modulan la formación ósea incluyen, pero no se limitan a, células de calvario, osteoblastos, osteoclastos, condorcitos, y células precursoras pluripotentes, tales como células estromales de médula ósea multipotentes. Los ejemplos específicos de las líneas celulares precursoras de osteoblasto y osteoclasto incluyen MC3T3-E1 , C2C12, células MG-63, células U20S, células UMR106, células ROS 17/2.8, células SaOS-2, y las similares que se suministran en el catálogo del ATCC (WO 01/19855) asi como también las lineas celulares HOB descritas en Bodine PV, Vernon SK, Komm BS., Endrocrinology, 137, 4592-4604, (1996), Bodine PVN, TrailSmith M, Komm BS., J Bone Min Res, 1 1 , 806-819, (1996), Bodine PV, Green J, Harris HA, Bhat RA, Stein GS, Lian JB, Komm BS., J Cell Biochem, 65, 368-387, (1997), Bodine PV, Komm BS., Bone, 25, 535-43 (1999)), Bodine PVN, Harris HA, Komm BS., Endocrinology, 140, 2439-2451 (1999), Prince M, Banerjee C, Javed A, Green J, Lian JB, Stein GS, Bodine PV, Komm BS, J Cell Biochem, 80, 424-40, (2001 ). Los métodos de la presente invención también se pueden desarrollar utilizando un sistema libre de células.

El término "sistema de expresión" se refiere a una célula huésped y a un vector compatible bajo condiciones adecuadas, por ejemplo, para la expresión de una proteína codificada por un ADN extraño llevado por el vector e introducido en la célula huésped. Los sistemas de expresión comunes incluyen las células huéspedes de E. coli y los vectores de plásmido, las células huéspedes de insectos y los vectores de Baculovirus, y las células y vectores huéspedes de mamífero.

"Transformación" se refiere a la transferencia del fragmento de ácido nucleico en el genoma de un organismo huésped, que da como resultado la herencia genéticamente estable. Los organismos huéspedes que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados que se denominan como organismos "transgénicos".

El término "diferenciado" se refiere a tener un carácter o función diferente del tipo de tejidos o células originales. Así, "diferenciación" es el proceso o acto de diferenciar.

El término "diferenciación de osteoblasto" se refiere al proceso en el cual una célula desarrolla funciones especializadas durante la maduración en una célula de osteoblasto. La diferenciación del osteoblasto puede incluir pre-osteoblasto, osteoblasto temprano y maduro, etapas de pre-osteocito y osteocito maduro (Bodine et al, Vitamins and Hormones 65, 101-151 (2002), Stein et al. Endocrine Reviews 14, 424-442 (1993), y Lian et al. Vitamins and Hormones 55, 443-509 (1999)).

El término "proliferación" se refiere al crecimiento y producción de células similares.

El término "fenotipo" se refiere al carácter observable de una célula o un organismo. Tal carácter observable puede involucrar la apariencia física, así como también un nivel de las composiciones fisiológicas particulares presentes en la célula u organismo. El fenotipo osteoblástico incluye la expresión de varias proteínas marcadoras tales como el factor de trascripción específica de hueso Cbfal ; el colágeno tipo I; la fosfatasa alcalina, la osteocalcina; y la sialoproteína ósea.

Como se utiliza aquí, el término "compañero de unión" o "proteínas interactuantes" se refieren a una molécula capaz de unirse a otra molécula con especificidad, como por ejemplo, un antígeno y un anticuerpo específico de antígeno o una enzima y su inhibidor. Los compañeros de unión pueden incluir, por ejemplo, biotina y avidina o estreptavidina, IgG y proteína A, parejas de receptor-ligando, interacción proteína-proteína, y hebras de polínucleótido complementario. El término "compañero de unión" también se puede referir a polipéptidos, lípidos, moléculas pequeñas, o ácidos nucleicos que se unen a las quinasas en las células. Un cambio en la interacción entre una quinasa y un compañero de unión puede manifestar en si mismo una probabilidad creciente o disminuida de que se formen interacciones, o una concentración incrementada o disminuida de un complejo compañero de unión de quinasa. Por ejemplo la proteína Ror1 o Ror2 se puede unir con otra proteína o polipéptido y formar un complejo que pueda resultar en modular la actividad Ror1 o Ror2.

El término "senda de transducción de señal" se refiere a las moléculas que propagan una señal extracelular a través de la membrana celular para convertirse en una señal intracelular. Esta señal puede estimular entonces una respuesta celular. Las moléculas de polipéptido involucradas en los procesos de transducción de señal pueden ser proteínas tirosina quinasas receptoras y no receptoras.

El "receptor" se refiere a una estructura molecular dentro de una célula o sobre la superficie de la célula que se caracteriza de manera general por la unión selectiva de una sustancia específica. Los receptores de ejemplo incluyen los receptores de superficie celular para las hormonas de péptido, los neurotransmisores, los antígenos¡ los fragmentos de complemento y las ¡nmunoglobulinas así como también los receptores citoplasmáticos para las hormonas esteroides.

El término "modular" se refiere a la supresión, mejoramiento, o inducción de una función. Por ejemplo, la "modulación" o "regulación" de la expresión del gen se refiere a un cambio en la actividad del gen. La modulación de la expresión puede incluir, pero no se limita a, la activación del gen y la represión del gen. "Modular" o "regular" también se refiere a los métodos, condiciones, o agentes que incrementen o disminuyan la actividad biológica de una proteína, enzima, inhibidor, transductor de señal, receptor, activador de trascripción, co-factor, y similar. Este cambio en la actividad se puede incrementar o disminuir de la traducción de mARN, la trascripción de ADN y/o la degradación de mARN o proteína, que puede a su vez corresponder a un incremento o disminución en la actividad biológica. Tal mejoramiento o inhibición puede ser contingente luego de la ocurrencia de un evento específico, tal como la activación de una ruta de transducción de señal y/o se puede manifestar solamente en tipos de células particulares.

"Actividad modulada" se refiere a cualquier actividad, condición, enfermedad o fenotipo que se module mediante una forma biológicamente activa de una proteína. La modulación se puede afectar al afectar la concentración de la proteína biológicamente activa, por ejemplo, al regular la expresión o degradación, o por efecto agonista o antagonista directo como, por ejemplo, a través de la inhibición, activación, unión, o liberación del sustrato, modificación químicamente o estructuralmente, o mediante la interacción directa o indirecta que pueda involucrar factores adicionales.

"Modulador" se refiere a cualquier agente que altere la expresión de una actividad específica, tal como la formación ósea o la expresión de la molécula Ror. Por ejemplo, un agente que modula la formación ósea altera o cambia (incrementa o disminuye) la formación ósea. El modulador pretende comprender cualquier compuesto, por ejemplo, anticuerpo, molécula pequeña, péptido, oligopéptido, polipéptido, o proteína.

"Célula de plasma" se refiere a un linfocito maduro B que se especialice para la producción de anticuerpo (inmunoglobulina). Las células de plasma se encuentran raramente en la sangre periférica. Ellas comprenden de 0.2% a 2.8% del conteo de célula blanca de la médula ósea. Las células de plasma maduras son a menudo ovales o en forma de ventilador, midiendo 8-15 µp? El núcleo es de forma excéntrica y oval.

El término "molécula pequeña" se refiere a un compuesto químico sintético o de ocurrencia natural, por ejemplo un péptido u oligonucleótido que pueda opcionalmente derivarse, producto natural o cualquier otro compuesto orgánico, bioinorgánico o inorgánico de bajo peso molecular (típicamente de menos de aproximadamente 5 kDalton), de cualquier origen natural o sintético. Tales moléculas pequeñas pueden ser sustancias terapéuticamente suministrables o se pueden además derivar para facilitar el suministro.

Como se utiliza aquí, el término "inductor" se refiere a cualquier agente que induzca, mejore, promueva o incremente una actividad específica, tal como la formación ósea, o la expresión de la molécula Ror.

Como se utiliza aquí el término "inhibidor" o "represor" se refiere a cualquier agente que inhiba, suprima, reprima, o disminuya la actividad específica, tal como la formación ósea, o la expresión de la molécula Ror.

Como se utiliza aquí, el término "agente" o "agente de prueba" se refiere a cualquier compuesto o molécula que se va a probar. Ejemplos de agentes de la presente invención incluyen pero no se limitan a péptidos, moléculas pequeñas, y anticuerpos. Los agentes se pueden seleccionar aleatoriamente o seleccionar o designar racionalmente. Como se utiliza aquí, un agente se dice que es "aleatoriamente seleccionado" cuando el agente se escoge aleatoriamente sin considerar la interacción específica entre el agente y el compuesto o sitio objetivo. Como se utiliza aquí, un agente se dice que es "racionalmente seleccionado o designado", cuando el agente se escoge sobre una base no aleatoria que toma en cuenta la interacción específica entre el agente y el compuesto o sitio objetivo y/o la conformación en relación con la acción del agente.

Como se utiliza aquí, el término "anticuerpo" se refiere a una molécula de inmunoglobulina o a una porción inmunológicamente activa de éste (por ejemplo, porción de unión de antígeno). El anticuerpo se produce naturalmente o completa o parcialmente producido de manera sintética. Ejemplos de la porción inmunológicamente activa de las moléculas de inmunoglobulina incluyen los fragmentos F(ab), Fv, y F(ab') que se pueden generar al clivar el anticuerpo con una enzima tal como pepsina. Todos los derivados de éstos que mantienen la capacidad de unión específica también están incluidos en el término. El término también cubre cualquier proteína que tiene un dominio de unión que es homologa o principalmente homologa a un dominio de unión de inmunoglobulina. Estas proteínas se pueden derivar de fuentes naturales, o parcial o completamente producidas sintéticamente. Un anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede ser un miembro de cualquier clase de inmunoglobulina, que incluye cualquiera de las clases humanas: IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE. Los derivados de la clase IgG, sin embargo, son generalmente preferidos en la presente invención.

El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a cualquier derivado de un anticuerpo que es menor de la longitud completa. Preferiblemente, el fragmento de anticuerpo retiene por lo menos una porción significativa de la capacidad de unión específica del anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, el diacuerpo dsFv, y Fd. El fragmento de anticuerpo se puede producir por cualquier medio. Por ejemplo, el fragmento de anticuerpo puede ser enzimática o químicamente producido mediante la fragmentación de un anticuerpo intacto, o se puede producir recombinantemente de un gen que codifica la secuencia de anticuerpo parcial. Alternativamente, el fragmento de anticuerpo se puede producir completa o parcialmente de manera sintética. El fragmento de anticuerpo puede ser opcionalmente un fragmento de anticuerpo de cadena simple. Alternativamente, el fragmento puede comprender cadenas múltiples que están ligadas juntas, por ejemplo, por enlaces disulfuro u otros enlaces más estables. El fragmento también puede ser opcionalmente un complejo multimolecular. Un fragmento de anticuerpo funcional típicamente comprenderá por lo menos 50 aminoácidos y más típicamente comprenderá por lo menos 200 aminoácidos. En ciertas modalidades, el fragmento de anticuerpo tiene por lo menos dos sitios de unión de antígeno. En ciertas modalidades preferidas, el fragmento de anticuerpo tiene exactamente 2, 3, 4, o 5 sitios de unión de antígeno. Los fragmentos con dos sitios de unión de antígeno son particularmente útiles en la presente invención. Tales agentes dimerizan el Ror2 sin la formación de los complejos multiméricos.

Las cadenas simples Fvs (scFvs) son fragmentos de anticuerpo recombinantes que consisten de solamente la cadena ligera variable (VL) y la cadena pesada variable (VH) covalentemente conectada una a la otra mediante un ligador de polipéptido. El VL o el VH puede ser el dominio terminal NH2. El ligador polipéptido puede ser de longitud variable y la composición tan larga como dos dominios variables son puestos en puente sin interferencia estérica seria. Típicamente, los ligadores están comprendidos principalmente de porciones de glicina y de residuos de serina con algo de ácido glutámico o residuos de lisina intercalados para solubilidad.

Los diacuerpos son scFvs diméricos. Los componentes de los diacuerpos tienen típicamente ligadores de péptido más cortos que la mayoría de los scFvs, y ellos muestran una preferencia para asociación como dímeros.

Un fragmento Fv es un fragmento de anticuerpo que consiste de un dominio VH y uno VL mantenidos juntos por interacciones no covalentes. El término dsFv se utiliza aquí para referirse a un Fv con un enlace disulfuro intermolecular trabajado por ingeniería unido para estabilizar el par VH-VL.

Un fragmento F(ab')2 es un fragmento de anticuerpo esencialmente equivalente a aquel obtenido de las inmunoglobulinas (típicamente IgG) por digestión con una enzima pepsina a un pH 4.0-4.5. El fragmento se puede producir de manera recombinante.

Un fragmento Fab es un fragmento de anticuerpo esencialmente equivalente a aquel obtenido por la reducción del puente o los puentes disulfuro que unen las dos piezas de cadena pesada en el fragmento F(ab')2. El fragmento Fab' se puede producir recombinantemente.

Un fragmento Fab es un fragmento de anticuerpo esencialmente equivalente a aquel obtenido por la digestión de las inmunoglobulinas (típicamente IgG) con la enzima papaína. El fragmento Fab se puede producir recombinantemente. El segmento de cadena pesada del fragmento Fab es la pieza Fd.

El término "gen indicador", como se utiliza aquí, se refiere a cualquier gen cuya expresión fenotípica es fácil de monitorear. El uso de los genes reporteros es particularmente útil en la selección para determinar que agentes de prueba activan una ruta de señalización. El gen indicador está operablemente ligado a un promotor o a otro elemento regulatorio que se controla por la ruta de señalización. En ciertas modalidades, se hace una construcción de ADN recombinante en la cual el gen indicador está funcionalmente unido a una región promotora u a otra región regulatoria de interés particular, y la construcción es transfectada a una célula u organismo. Ejemplos de genes reporteros comúnmente utilizandos incluyen luciferasa (LUC), proteína fluorescente verde (GFP), ß-galactosidasa (GAL), ß-glucuronidasa (GUS), y cloramfenicol acetilfransferasa (CAT).

Como se utilizan aquí, los términos "tratamiento", "tratar", y "terapia" se refieren al tratamiento terapéutico y profiláctico, o a manipulaciones preventivas, o manipulaciones que estimulan la diferenciación de la célula ósea o la formación ósea, posponen el desarrollo de los síntomas de trastornos óseos, y/o reducen la severidad de los trastornos óseos y/o tales síntomas que se espera que se desarrolle de un trastorno óseo. Los términos incluyen además mejorar los síntomas de trastornos óseos existentes, evitar síntomas adicionales, mejorar o evitar causas metabólicas subyacentes de los síntomas, evitar o reversar causas metabólicas de los síntomas, o, evitar o promover crecimiento óseo. Así, los términos denotan que un resultado benéfico se ha conferido a un sujeto con un trastorno óseo, o con el potencial a desarrollar tal trastorno. Adicionalmente, el término "tratamiento" se define como la aplicación o administración de un agente (por ejemplo, agente terapéutico o composición terapéutica) a un sujeto, o un tejido aislado o línea celular de un sujeto, que puede tener una enfermedad, un síntoma de enfermedad o una predisposición hacia una enfermedad, con el propósito de curar, aliviar, alterar, remediar, mejorar, o afectar la enfermedad, los síntomas de la enfermedad o la predisposición hacia la enfermedad. Como se utiliza aquí, un "agente terapéutico" se refiere a cualquier sustancia o combinación de sustancias que ayudan al tratamiento de una enfermedad, por ejemplo, modulan la actividad de la formación ósea e inducen la nueva formación ósea. De acuerdo con esto, un agente terapéutico incluye, pero no se limita a, moléculas pequeñas, péptidos, anticuerpos, ribozimas y oligonucleótidos anticodificante.

El agente terapéutico o las composiciones terapéuticas también pueden incluir un compuesto en una forma farmacéuticamente aceptable que evite y/o reduzca los síntomas de una enfermedad particular. Por ejemplo una composición terapéutica puede ser una composición farmacéutica que evite y/o reduzca los síntomas de un trastorno relacionado con el hueso. Se contempla que la composición terapéutica de la presente invención se suministrará en cualquier forma adecuada. La forma de la composición terapéutica dependerá de un número de factores, que incluye el modo de administración. La composición terapéutica puede contener diluyentes, adyuvantes, y excipientes, entre otros ingredientes.

La resistencia ósea se puede determinar por la densidad ósea (grs de minerales/cm3 de volumen) y la calidad del hueso (mineralización, arquitectura ósea, giro óseo, micro fracturas). Como una medida para la resistencia del hueso, usualmente se utiliza la Densidad del Mineral Óseo (BMD). Por ejemplo, un hueso se puede declarar osteoporósico si éste BMD excede 2.5 desviaciones estándar por debajo de la media de BMD de mujeres adultas blancas jóvenes (Organización Mundial de la Salud, 1994, Evaluación del Riesgo de Fractura y su Aplicación para Seleccionar Osteoporosis Postmenopáusica. Techincal Report Series 843. Ginebra: Organización Mundial de la Salud).

El "Tejido óseo" se refiere a los tejidos calcificados (por ejemplo, bóveda craneana, tibia, fémures, vértebra, dientes), trabéculos óseos, la cavidad de la médula ósea, que es la cavidad diferente a los trabéculos óseos, el hueso cortical, que cubre las periferias exteriores de los trabéculos óseos y la cavidad de la médula ósea, y similares. El tejido óseo también se refiere a las células óseas que están generalmente localizadas dentro de una matriz de colágeno mineralizado; vasos sanguíneos que suministran nutrición para las células óseas; aspirados de médula ósea: fluidos de articulaciones: células óseas que se derivan de tejidos óseos; y pueden incluir médula ósea grasa. Los tejidos óseos incluyen productos óseos tales como huesos completos, secciones de huesos completos, pedazos de hueso, polvo de hueso, biopsia de tejido óseo, preparaciones de colágeno, o mezclas de éstos. Para los propósitos de la presente invención, el término "tejido óseo" se utiliza para comprender todos los tejidos y productos óseos anteriormente mencionados, sean humanos o animales, a menos que se establezca otra cosa.

Como se utiliza aquí, "actividad relacionada con el hueso" incluye actividad formadora de hueso y actividad de resorción de hueso. La actividad formadora de hueso se puede inducir al incrementar la actividad osteoblástica, la diferenciación osteoblástica de las células osteoprogenitoras, y la proliferación osteoblástica, al disminuir la apoptósis del osteoblasto y mediante cualquier combinación de éstos. Además, la actividad de resorción ósea se puede suprimir al disminuir la actividad de osteoclasto, la diferenciación de osteoclasto y la proliferación, al incrementar la apoptosis del osteoclasto y mediante cualquier combinación de éstos. La actividad de formación del hueso se puede inducir en varios tejidos o células óseas.

Como se utiliza aquí, la frese "modular la formación ósea" se refiere a incrementar o disminuir la formación ósea. La "formación ósea incrementada" significa el reclutamiento de los osteoblastos o los precursores de osteoblastos a un sitio del hueso, que da como resultado la diferenciación de las células de los osteoblastos no maduros y su secreción de matriz de colágeno que mineraliza en la materia ósea e incrementa la masa ósea en el sitio. El término también comprende la producción creciente y la secreción de matriz de colágeno por osteoblastos maduros. La formación ósea creciente se puede determinar por vía de uno o más de una disminución en la tasa de fractura, un incremento en la densidad ósea aérea, un incremento en la densidad ósea mineral volumétrica, un incremento en la conectivídad trabecular, un incremento en la densidad trabecular, un incremento en la densidad cortical o el grosor, un incremento en el diámetro óseo, y un incremento en el contenido óseo inorgánico. La formación ósea creciente puede dar como resultado la unión incrementada, la proliferación, la supervivencia y/o la diferenciación de las células óseas, por ejemplo, osteoblastos, y la posterior mineralización ósea.

"Trastornos relacionados con el hueso" incluyen trastornos de la formación ósea y la resorción del hueso. Estas enfermedades y condiciones incluyen, pero no se limitan a, raquitismo, osteomalasia, osteopenia, osteoesclerosis, osteodistrofia renal, osteoporosis (que incluye osteoporosis senil y post-menopáusica), enfermedad de Paget, metástasis de hueso, hipercalcemia, hiperparatiroidismo, osteopetrosis, periodontitis, y cambios anormales en el metabolismo óseo que pueden acompañar la artritis reumatoide y la osteoartritis. Algunos de estas enfermedades se caracterizan por la formación insuficiente de hueso o la pérdida ósea, aunque otros involucran el engrosamíento anormal o el endurecimiento del tejido. Ejemplos de enfermedades que se beneficiarían de inhibir el engrosamíento anormal del hueso incluyen pero no están limitadas a la osteopetrosis y la osteoesclerosis.

Los "Agentes relacionados con el hueso" se refieren a los agentes que influencian la formación del hueso o la resorción del hueso. Los "agentes relacionados con el hueso" pueden inducir efectos anabólicos o catabólicos, pueden inhibir la resorción ósea y dar como resultado una densidad mineral ósea creciente, pueden incrementar la formación ósea, o puede mantener el balance entre la formación ósea y la resorción de hueso.

Los términos "compuesto" o "agente" se utilizan intercambiablemente aquí para referirse a una compuesto o compuestos o a la composición de materia que, cuando se administra a un sujeto (humano o animal) induce un efecto farmacológico o fisiológico o ambos por una acción local o sistémica o ambas.

El término "sujeto" se refiere a cualquier mamífero, que incluye un humano, o sujeto no humano. Los sujetos no humanos pueden incluir animales experimentales, de prueba, agrícolas, de entretenimiento o de compañía. Un sujeto puede ser un humano. Un sujeto puede ser un animal doméstico, tal como un perro, gato, vaca, cabra, oveja, cerdo, etc. Un sujeto puede ser un animal experimental, tal como un ratón, rata, conejo, mono, etc.

El término "muestra biológica" se define ampliamente por incluir cualquier célula, tejido, fluido biológico, órgano, organismo multi-celular, y similar. Una muestra biológica se puede derivar, por ejemplo, de cultivos de células o tejido in vitro. Alternativamente, una muestra biológica se puede derivar de un organismo vivo o de una población de organismos de células únicas. Una muestra biológica puede ser un tejido vivo tal como un hueso vivo. El término "muestra biológica" también pretende incluir muestras tales como células, tejidos o fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como también muestras presentes dentro del sujeto. Esto es, el método de detección de la invención se puede utilizar para detectar mARN de Ror, proteína, ADN genómico, o actividad en una muestra biológica in vitro así como también in vivo. Por ejemplo, las técnicas in vitro para la detección del mARn del Ror incluye el análisis Taiman, la hibridación northem, y la hibridación in situ. Las técnicas in vitro para la detección de la proteína Ror incluye los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA), western blots, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Las técnicas in vitro para la detección del ADN genómico Ror incluyen hibridación southern.

Breve Descripción de los Dibujos La invención puede ser más completamente entendida de la siguiente descripción detallada de las figuras que acompañan que forman parte de esta solicitud.

La Figura 1 muestra que la regulación por disminución de la expresión Ror2 inhibe la diferenciación osteogénica inducida por dex de las células madre mesenquimales humanas (hMSC). El MSC humano se infectó con vectores de expresión adenoviral que contienen shARN específico de Ror2 o shARN especifico de EGFP (control) e incubado en medio de crecimiento MSC (MSCGM) suplementado con ácido ascórbico 0.05 mM, 10 mM de ß-glicerofosfato (ß-GP) y 100 nM de dexametasona (dex). Después de 9 días de incubación, los extractos de proteína de célula completa (50 µg/carril) se sometieron a inmunoelectrotransferencia para la proteína Ror2 endógena o la ß-actina como control de carga (A). Después de 11 días de incubación, se desarrolló el teñido de alizarina rojo-S (B) y se cuantificó (C) para evaluar la extensión de la formación de matriz mineralizada. En C, la cantidad de alizarina rojo-S incorporada en la presencia del shARN del EGFP se estableció como el 100%. Los resultados en B y C son representativos de tres experimentos independientes (Figura 1 referida en el Ejemplo 1).

La Figura 2 muestra que la sobreexpresión del Ror2 inhibe la diferenciación adipogénica del hMSC. Los MSC humanos se infectaron con ß-galactosidasa (ß-gal), Ror2, o Ror2KD e incubados en MSCGM suplementado con un cocktail adipogénico durante 8 días. El ARN celular total se aisló y se sometió a un análisis de RT-PCR en tiempo real para los factores de trascripción adipogénica C/???a y PPARy utilizando los cebadores y las sondas obtenidas de Applied Biosystems. Los niveles de mARN se normalizaron a la expresión de ciclofilin B en cada muestra y la expresión de mARN relativa en las células infectadas con ß-gal se ajustó al 100%. B. Los MSC humanos se infectaron con ß-gal, Ror2, o Ror2KD, incubados en MSCGM suplementado con coctel adipogénico durante 21 días y sometido luego a un teñido con aceite rojo O (Figura 2 referida en el Ejemplo 2).

La figura 3 muestra que la sobreexpresión de la proteína Ror2 incrementa el área total del hueso, pero no el número de osteoblastos en cavidades craneanas de ratón neonatal. Los huesos de la cavidad craneana de carnadas de ratones de 4 días de edad se dejaron sin infectar (control) o se infectaron con adenovirus que codifica para la ß-galactosidasa (ß) o el Ror2 humano (R2). Después de 7 días de incubación en presencia del adenovirus, las cavidades craneanas se tiñeron con hematoxilina y eosina antes de evaluar el área ósea total y el número de osteoblastos. Los valores obtenidos en cultivos no infectados se ajustaron al 100%. Los resultados son las medias V SE de 4-5 cavidades craneanas por condición (*- P<0.01 comparado con la infección con ß-galactosidasa). Esta gráfica es representativa de 3 experimentos independientes (Figura 3 mencionada en el Ejemplo 3).

La Figura 4 demuestra que la proteína Ror2 se une al 14-3-3ß y lo fosforiliza sobre tirosina(s). Las células U20S se infectaron con los adenovirus ß-gal (ß), Ror2 (R2), o Ror2KD (KD) y 24-48 h más tarde los lisados de célula completos se prepararon y se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-bandera (A), anti-14-3-3p (B), o anti-fosfotirosina (C). Los inmunoprecipitados se analizaron mediante inmunoelectrotransferencia con los anticuerpos indicados (Figura 4 referida en el Ejemplo 4).

La Figura 5 muestra que la proteína Ror2 endógena media la fosforilación 14-3-3ß in vivo. Las células U20S fueron transitoriamente trasfectadas con siARN de Ror2 o un siARN no específico y 48 h más tarde los extractos de proteína celular total se sometieron a inmunoelectrotransferencia para la proteína Ror2 endógena o ß-actina (control de carga) utilizando 50 µg de extracto por carril (A). Los mismos lisados también se analizaron por el anticuerpo 14-3-3ß directamente (20 µg/carril) o después de inmunoprecipitación con el anticuerpo anti-fosfotirosina (B) (Figura 5 referida en el Ejemplo 4).

La Figura 6 muestra el dominio citosolico de la proteína Ror2 se une a y fosforiliza directamente el 14-3-3ß in vitro. A. Un dominio citosolico marcado GST para el Ror2 (GST-R2c) o GST solo se une a microesferas de glutatión sefarosa y se incuban con el 14-3-3ß traducido in vitro durante 4 h a 4 °CI El material unido se analizó con un anticuerpo anti-14-3^. B. El ensayo de quinasa in vitro desarrollado como se describe en "Métodos Generales" con un dominio citosolico recombinante purificado de la proteína Ror2 (GST-R2c, Invitrogen) y el GST-14-3-3P recombinante purificado (Biomol, Inc.) (Figura 6 referida en el Ejemplo 4).

La Figura 7 demuestra que el anticuerpo específico Ror2 origina la dimerización y la activación del receptor Ror2. A. Para demostrar la dimerización, de las células U20S se transfectaron con los plásmidos de expresión Ror2 marcados con el terminal COOH con la Bandera (R2-F) o la etiqueta del epítopo His (R2-H). Veinticuatro horas más tarde, las células se trataron con un IgG policlonal de cabra específico de Ror2 o un IgG de cabra no específico durante 1 h a 37 C y los extractos de proteina de célula completa se prepararon y se inmunoprecipitaron sobre la agarosa con afinidad de anti-Flag. Los precipitados se analizaron mediante inmunoelectrotransferencia con un anticuerpo anti-His (panel superior). El panel inferior muestra la misma membrana resondeada con el anticuerpo anti-Flag para el control del nivel de precipitación. B. Para demostrar la activación, las células U20S no transfectadas se trataron con un anticuerpo específico Ror2 o el IgG de control como en A, y los extractos de célula completa se precipitaron sobre un anticuerpo de anti-fosfotirosina y analizados con Ror2 o anticuerpo 14-3-3ß (Figura 7 referida en el Ejemplo 5).

La Figura 8 muestra que el anticuerpo Ror2 origina la formación de matriz mineralizada en el hMSC. Los MSC humano se incubaron en MSCGM que contienen 0.05 mM de ácido ascórbico, 10 mM de ß-GP y 100 nM de dex suplementado con IgG de cabra no específico, el IgG de cabra específico de Ror1 (50 µg/ml cada uno), o concentraciones crecientes del IgG de cabra específico de Ror2. La proporción de la mineralización de la matriz se evaluó después de 9 días de incubación por teñido con alizarina rojo-S (Figura 8 referida en el Ejemplo 6).

La Figura 9 demuestra que la mineralización hMSC inducida por el anticuerpo Ror2 es mediada a través de Ror2. A. Los hMSC se infectaron con los vectores de expresión adenovirales que contienen shARN específico para Ror2 o para EGFP (control) e incubados en MSCGM suplementado con 0.05 mM de ácido ascórbico, 10 mM de ß-GP y 100 nM de dex. Después de 9 días de incubación, la proporción de la mineralización de la matriz se evaluó mediante teñido con alizarin rojo-S. B. Los MSC Humanos se infectaron con adenovirus Ror2 durante 24 h y luego incubados en MSCGM que contiene 0.05 mM de ácido ascórbico, 10 mM de ß-GP e IgG de cabra específico de Ror2 o IgG de carba específico durante 19 días antes del teñido con alizarin rojo-S (Figura 9 referida en el Ejemplo 6).

La Figura 10 demuestra que la regulación por disminución del 14-3-3ß mejora la formación de matriz mineralizada en hMSC. Los MSC humanos se infectaron con vectores de expresión adenoviral que contienen shARN revueltos; shARN específico de 14-3-3ß; cartuchos o casetes de sobreexpresión de ß-galactosidasa (ß-gal); o un cásete de sobreexpresión de Ror2 e incubado en MSCGM suplementado con ácido ascórbico 0.05 mM, 10 mM de ß-GP y 100 nM de dex. Después de 9 días de incubación, 50 µg de los extractos de proteína de célula completa se sometieron a inmunoelectrotransferencia para la proteína 14-3-3ß endógena (A). Después de 12 días de incubación, el teñido con alizarina rojo-S se desarrollo (B) para evaluar la proporción de la formación de matriz mineralizada (Figura 10 referida en el Ejemplo 7).

La Figura 1 1 demuestra que el tratamiento del anticuerpo Ror2 y la regulación por disminución del 14-3-3ß promueve la nueva formación ósea ex vivo. Los huesos de cavidades craneanas de ratón se infectaron con adenovirus que contienen shARN revueltos (ser) o shRAN específico para 14-3-3ß; y 48 h más tarde se trataron con 12 µg/ml de anticuerpo anti-Ror2 o IgG no específico en la presencia de calceína. Después de 7 días de incubación con los adenovirus y anticuerpos, las cavidades craneanas se tiñeron con hematoxilin-eosin y el área ósea total (barras abiertas) y el número de osteoblastos (barras sólidas) se determinó. Los valores obtenidos en los cultivos infectados con shARN revuelto y tratados con IgG se ajustaron al 100%. Los resultados son las medias V SE de 4 cavidades craneanas por condición (* - p<0.05) (Figura 1 1 referida en el Ejemplo 8).

La Figura 12 ilustra la generación de un ensayo de alta sensibilidad, alto rendimiento para la actividad Ror2. A. La representación esquemática del ensayo que utiliza la ruta de señalización del receptor TrkB. El receptor TrkB se activa mediante la homo-dimerización inducida por ligando que origina fosforilación del Erk y estimulación del elemento de respuesta cAMP (CRE) en el promotor de genes objetivo. Generamos un receptor quimérico que consiste del dominio extracelular de Ror2 (aa 1-407) fusionado a los dominios intracelulares y de transmembrana del TrkB (aa 432-822). Cuando se utiliza esta quimera, los agentes que originan la dimerización del Ror2 activan la ruta de señalización TrkB y su activación se puede evaluar mediante un ensayo indicador de luciferasa -promotor CRE. B. las células HEK293 se transfectas establemente con la quimera Ror2-TrkB y los plásmidos luciferasa se CRE, se tratan con las cantidades indicadas del anticuerpo anti-Ror2 o IgG no especifico durante 24 h, y se evalúa la actividad luciferasa. La actividad luciferasa observada luego del tratamiento con el IgG no específico se establece en 1. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes (significa V SE; n=4; *-p<0.05) (la figura 12 se refiera a en el ejemplo 9).

Descripción Detallada de Ciertas Modalidades Preferidas de la Invención La presente invención proviene del descubrimiento del papel de la familia R o r y sus biomoléculas de señalización en la dirección 3' en el metabolismo óseo, particularmente la diferenciación de osteoblastos. Ver las solicitudes de patente U.S.S.N. 10/823,998, 60/463,364 Y 60/501 ,340, cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia. Los solicitantes han descubierto que las regulación por disminución para la expresión Ror2 inhiben la diferenciación osteogénica inducida por dexametasona de células madre mesenquimales humanas (figura 1 ). En contraste, la sobreexpresión del Ror2 inhibe la diferenciación adipogénica de las células madre mesenquimales humanas (figura 2). los solicitantes también han mostrado que la regulación por disminución de la expresión 14-3-3ß mejora la formación de la matriz mineralizada en células madre mesenquimales humanas (figura 10). Adicionalmente, la sobreexpresión Ror2 y la inhibición 14-3-3ß inducen la mayor mineralización de la matriz a diferencia de ella solo (figura 10). Basado en estos descubrimientos, los agentes que modulan la actividad Ror2 en el nivel de proteína o modulan la actividad 14-3-3ß, o las composiciones farmacéuticas de éstos, son útiles en el tratamiento de enfermedades óseas y/o trastornos metabólicos tal como obesidad o diabetes. De hecho, un agente que incrementa la actividad de la proteica Ror2 promoverá la diferenciación de osteoblastos e incrementará por lo tanto la formación ósea mineralizada (figuras 8 y 9). También un agente que inhibe la actividad del 14-3-3ß promoverá a la diferenciación de osteoblastos e incrementara por lo tanto la formación ósea mineralizada (figura 10).

En un aspecto, la invención suministra agentes que modulan (incrementa o reducen) la actividad de la proteína Ror2. En ciertas modalidades, los agentes incrementan la actividad de la proteína Ror2. En otras modalidades, los agentes reducen la actividad de la proteína Ror2. Típicamente, estos agentes trabajan en el nivel de proteína que incrementa o reduce el nivel de actividad de la proteína Ror2. Como se discute aquí, los agentes que incrementan la actividad Ror2 son útiles en promover la formación ósea mineralizada y la diferenciación osteogénica. Estos agentes también pueden ser útiles en el tratamiento de la obesidad al inhibir la diferenciación adipogénica (figura 2). Sin desear estar unido por cualquier teoría particular, la actividad Ror2 incrementada parece promover la diferenciación osteogénica mientras que inhibe la diferenciación adipogénica.

Estos agentes que modulan la actividad Ror2 pueden ser de cualquier tipo de compuesto químico que incluyen moléculas pequeñas, polinucleótidos, proteínas, péptidos, etc. En ciertas modalidades, el agente es una proteína. En otras modalidades, el agente es un péptido. En a un otras modalidades, el agente es un polinucleótido. En todavía otras modalidades, el agente es una molécula pequeña (por ejemplo, con un peso molecular menor de 1500 g/mol). Preferiblemente, el agente es específico para la proteína Ror2 y no se une a otras biomoléculas. En particular, en ciertas modalidades, el agente no se une a otros miembros de la familia Ror2. En otras modalidades, puede haber reactividad cruzada con otras biomaléculas o miembros de la familia Ror2; sin embargo, la afinidad de la gente para estas otras moléculas es menor que para la proteína Ror2.

En ciertas modalidades particulares, el agente actúa al originar la dimerización de las dos proteínas Ror2. La dimerización de las proteínas Ror2 se considera que conduce a la activación de los receptores Ror2. La activación de la activada de la quinasa Ror2 conduce a la fosforilación de sus compañeros de unión que incluyen la proteína 14-3-3ß. Otros compañeros de unión Ror2 incluyen, pero no se limitan a, proteína portadora ADP/ATP, UDP-glucosa ceramida glucosiltransferasa - similar a 1 , gamo proteína 14-3-3, riboforin I, N-metiltransferasa arginina 1 , proteína de susceptibilidad de apoptosis celular, proteína NOTCH2, y proteína LIM 3 músculo esquelética humana (Billiard et al., solicitud de patente U.S.S.N. 10/823, 998, presentada Abril 14, 2004). el agente incluye típicamente por lo menos dos dominios de unión dirigidos a la proteína Ror2. En ciertas modalidades, el agente tiene exactamente dos dominios de unión dirigidos a la proteína Ror2, que es, el agente bivalente. Otros agentes que son multivalentes también son útiles en la presente invención. En ciertas modalidades, el agente es una molécula pequeña o polinucleótido que promueve la dimerización de la proteína Ror2. En otras modalidades, el agente es una proteína o péptido.

En ciertas modalidades, el agente es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, diacuerpo) dirigido a la proteína Ror2. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo se puede dirigir a cualquier región de la proteína Ror2; sin embargo, el sitio de unión a antígeno es preferiblemente no dirigido a cualquier región de la proteína Ror2; sin embargo, el sitio de unión a antígeno no se dirige preferiblemente a una región que pueda interferir con la actividad biológica del Ror2 (por ejemplo, actividad quinasa) o interferir con la dimerización de las dos proteína. La unión de dos proteínas Ror2 por el anticuerpo o fragmento de anticuerpo promueve la dimerización de las proteína Ror2 y por lo tanto su activación. El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal. El anticuerpo puede ser de cualquier isotipo; sin embargo, el isotipo IgG es generalmente preferido. El anticuerpo se puede derivar de cualquier especie; sin embargo, para uso en humanos, el anticuerpo es típicamente de origen humano o se ha humanizado. Si el anticuerpo es para ser utilizado en otras especies, el anticuerpo se puede adaptar a esas especies. En ciertas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado. En otras modalidades el anticuerpo es un anticuerpo completamente humano. En ciertas modalidades específicas el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

En ciertas modalidades, un anticuerpo dirigido a la proteína Ror2 se prepara al inmunizar un mamífero tal como un conejo u otro roedor con proteína Ror2 humana purificada o péptidos derivados de la proteína Ror2. Después de inmunización, los anticuerpos que producen células tal como células B o células de plasma se recolecta y utilizan para prepara hibridomas que luego se seleccionan para la producción de anticuerpos dirigidos a la proteína Ror2. En ciertas modalidades, los anticuerpos de seleccionan por su capacidad para dimerizar y/o activar la proteína Ror2. Una vez se identifica una célula B que produce los anticuerpos deseados, la célula B se puede inmortalizar. El hibridoma resultante se puede utilizar luego para producir el anticuerpo monoclonal deseado. El anticuerpo producido por el hibridoma se puede caracterizar y modificar adicionalmente. Por ejemplo, en ciertas modalidades, el anticuerpo puede ser humanizado de tal manera que la administración del anticuerpo aun sujeto humano no conduce a una reacción adversa, que puede variar de depuración incrementada del anticuerpo terapéutico a anafilaxis fatal. En ciertas modalidades particulares, las regiones del anticuerpo que reconocen la proteína Ror2 (es decir, las regiones que determinan la complementariedad) se utiliza para remplazar los CDR de un anticuerpo humano de especificad diferente. Las técnicas para construir con ingeniería y preparar anticuerpos se conocen en la técnica y se describen en la patente U.S. No 4,816,567, publicada en Marzo 28, 1989; patente U.S. No 5,078,998, publicada en Enero 7, 1992; patente, U.S. No 5,091 ,513, publicada en Febrero 25, 1992; patente U.S. No 5,225,539, publicada en Julio 6, 1993; patente U.S. No 5,585,089, publicada en Diciembre 17, 1996; patente U.S. No 5, 693,761 , publicada en Diciembre 2, 1991 ; patente U.S. No 5,693,762, publicada en Diciembre 2, 1997; patente U.S. No 5,869,619, publicada 1991 ; patente U.S. No 6,180,370, publicada en Enero 30, 2001 ; patente U.S. No 6,548,640, publicada en Abril 19, 2005; patente U.S. No 6,982,321 , publicada en Enero 3,2006; incorporado aquí como referencia. En otras modalidades, el anticuerpo se hace evolucionar y/o modificar para alcanza un anticuerpo con una mayor especificidad y/o afinidad para la proteína Ror2.

En otras modalidades, el agente comprende un fragmento de un anticuerpo dirigido a la proteína Ror2. Se pueden utilizar uno o más fragmentos del anticuerpo dirigido a la proteina Ror2. Típicamente el fragmento incluye las regiones que determinan complementariedad (CDR) responsable de la afinidad de los anticuerpos para la proteína Ror2. Con el fin de dimerizar la proteína Ror2, son necesarios por lo menos dos sitios de unión para la proteína Ror2; por lo tanto, el agente puede ser de dos anticuerpos ligados uno al otro. Los fragmentos se pueden ligar juntos covalentemente o no covalentemente. Por ejemplo, el agente puede ser de dos fragmento Fab ligados covalentemente. El agente también puede ser un anticuerpo. En ciertas modalidades, el agente puede incluir más de dos fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, el agente puede incluir tres, cuatro, cinco o seis sitios de unión a antígeno dirigidos a la proteína Ror2.

En otras ciertas modalidades, el agente puede ser una proteína, péptido, o molécula pequeña que imite un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo dirigido a una proteína Ror tal como proteína Ror2. Estos agentes se pueden designar o identificar in silico basado en la estructura del sitio de unión a antígenos del anticuerpo dirigido a la proteína Ror2. Los agentes se pueden probar luego en varios ensayos in vitro para evaluar la capacidad de la gente para dimerizar y/o activar la proteína Ror2. Los agentes también se pueden identificar utilizando métodos de selección de alto rendimiento utilizando colecciones de moléculas pequeñas, péptidos o polinucleótidos.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos para utilizar los agentes de la invención en la modulación de la actividad Ror. Un agente que modula la actividad de la proteína Ror, particularmente la proteína Ror2, es útil en modular la actividad relacionada con los huesos. Estos agentes también pueden ser útiles en la modulación de la diferenciación de adipocitos en el tratamiento de la obesidad, diabetes, u otros trastornos metabólicos. Existen muchas enfermedades y afecciones caracterizadas por la necesidad de modular la actividad relacionada con los huesos, por ejemplo, mejorar la formación ósea. Lo más obvio es el caso de las fracturas óseas, en donde sería deseable estimular el crecimiento óseo y para acelerar y completar la reparación ósea. Por ejemplo, los agentes que mejoran la formación ósea pueden ser potencialmente útiles en los procedimientos de reconstrucción facial o procedimientos ortopédicos. Otras condiciones de déficit óseo incluyen pero no se limitan a, defectos óseo segmentarios, enfermedades periodónticas, enfermedades periodónticas, enfermedades óseo metastásicas, enfermedades óseo osteolíticas, y afecciones en donde la reparación del tejido conectivo seria benéfico, tal como curación o regeneración de defectos de cartílago o lecciones. También es de gran significancia la afección de la osteoporosis, que incluye osteoporosis relacionada con la edad y osteoporosis asociada con estado hormonal post-menopáusico. Otras afecciones caracterizadas por la necesidad de crecimiento óseo incluyen hiperparatiroidismo primario y segundario, osteoporosis relacionada con diabetes, osteoporosis por inactividad, y osteoporosis relacionada con glucocorticoides.

Se pueden utilizar agentes de incrementa la actividad Ror2 para promover la formación ósea mineraliza. Estos agentes también se pueden utilizar para promover la diferenciación osteoblástica. La promoción de la diferenciación osteoblástica puede ser hecha a expensas de la diferenciación adipogénica. Los agentes también se pueden utilizar para promover la formación de matriz mineralizada.

En otro aspecto, la invención proporciona agentes que modulan (incrementan o reducen) la actividad de 14-3-3 (por ejemplo, 14-3-3ß, 14-3-3?, etc.). En ciertas modalidades, los agentes inhiben la actividad de 14-3-3. En otras modalidades, los agentes incrementan la actividad de 14-3-3. El agente puede trabajar en el ácido nucleico o en el nivel de proteína. En ciertas modalidades, el agente reduce la expresión de 14-3-3ß. Como se discute aquí, los agentes que inhiben la actividad 14-3-3ß son útiles en promover la formación ósea mineralizada y la diferenciación osteogénica. En ciertas modalidades, el agente reduce la expresión de 14-3-3ß. Estos agentes también pueden ser útiles en el tratamiento de la obesidad, diabetes, y otros trastornos metabólicos al inhibir la diferenciación adipogénica. Sin desear estar unido por cualquier teoría particular, la regulación por disminución de la expresión 14-3-3, particularmente 14-3-3ß, parece promover la diferenciación osteogénica mientras que inhibe la diferenciación adipogénica.

Estos agentes que modulan la actividad 14-3-3 pueden ser de cualquier tipo de compuesto químico que incluye moléculas pequeñas, polinucleótidos, proteínas, péptidos, etc. en ciertas modalidades, el agente es una proteína. En otras modalidades, el agente en un péptido. En a un otras modalidades, el agente es un polinucleotido. En todavía otras modalidades, el agente es una molécula pequeña. En ciertas modalidades, el agente es un polinucleotido. En ciertas modalidades, el agente es un ADN. En otras modalidades el agente es un ARN. En ciertas modalidades el agente es un ARNi 14-3-3-especifico. En ciertas modalidades particulares, el agente es un ARNi 14-3-3ß-específico. En ciertas modalidades particulares, el agente es un siARN 14-3-3-especifico. En ciertas modalidades, el agente es un siARN 14-3^-especifico. En ciertas modalidades particulares, el agente es un shARN 14-3-3-especifico. En ciertas modalidades el agente es una shARN 14-3^-especifico. En otras modalidades el agente es específico para 14-3-3?. En particular, en ciertas modalidades, el agente objetiva específicamente el 14-3-3 encontrado en células madres mesenquimales o células óseas tal como osteoblastos. Por ejemplo en ciertas modalidades, el agente incluye un grupo funcional objetivo. En ciertas modalidades, el agente objetivo es un bisfosfonato u otro agente objetivo de órgano óseo.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos para utilizar agentes de la invención en modular la actividad 14-3-3. Un agente que modula la actividad del 14-3-3, particularmente 14-3-3ß, es útil para modular la actividad relacionada con los huesos. Estos agentes también pueden ser útiles en modular la diferenciación de adipocitos en el tratamiento de trastornos de obesidad, diabetes u otros trastornos metabólicos. Existen muchas enfermedades y afecciones caracterizadas por la necesidad de modular la actividad relacionada con los huesos, por ejemplo, mejorar la formación ósea. La más obvia es el caso de las fractura de huesos, en donde sería deseable estimula el crecimiento óseo y acelerar y completar la reparación ósea. Por ejemplo, los agentes que mejoran la formación ósea se pueden utilizar potencialmente en procedimientos de reconstrucción facial u otros procedimientos ortopédicos. Otras afecciones de déficit óseo incluyen, pero no se limitan a, defectos óseos segmentarios, enfermedades periodónticas, enfermedades óseas metastásicas, enfermedades óseas osteolíticas, y afecciones en donde la reparación del tejido conectivo seria benéfico, tal como curación o regeneración de defectos de cartílagos o lesión. También es de gran significancia la afección de la osteoporosís, que incluye osteoporosis relacionada con la edad y osteoporosis relacionada con el estado hormonal post-menopáusico. Otras afecciones caracterizadas por la necesidad de crecimiento óseo incluyen hiperparatiroidismos primario y segundario, osteoporosis relacionada con la diabetes, osteoporosis por inactividad, y osteoporosis glucocorticoides.

Los agentes que reducen la actividad del 14-3-3 se pueden utilizar para promover la formación ósea mineralizada. Estos agentes también pueden ser utilizados para promover la diferenciación osteoblástica. La promoción de la diferenciación osteoblástica se puede hacer a expensas de la diferenciación adipogénica. Los agentes también se pueden utilizar para la formación de matriz mineralizada.

Los agentes para uso en los métodos de la invención se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para administración a un sujeto. Como se utiliza aquí, el agente puede ser cualquier compuesto identificado (por ejemplo, moléculas orgánicas, oralmente activas, pequeñas; proteínas; inmunoglobulinas, fragmentos de inmunoglobulinas; péptidos) que modulan la actividad de la molécula Ror (por ejemplo, proteína Ror2) o la actividad 14-3-3 (por ejemplo 14-3-3ß, 14-3-3?). Tales composiciones comprenden típicamente el compuesto y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones de la presente invención pueden contener uno o más agentes en combinación con uno o más agentes conocidos por modular la actividad relacionada con los huesos. Por ejemplo, un agente que promueve la actividad Ror o inhibe la actividad 14-3-3 se puede combinar con agentes que inhiben la resorción ósea como estrógenos, bisfosfonatos o estrógenos selectivos de tejido (por ejemplo, moduladores del receptor de estrógeno selectivo (SERMs)). Los agentes de la invención se pueden combinar con otros agentes que promueven la formación ósea.

Se utiliza un o más agentes en una dosis terapéuticamente efectiva. Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere aquella cantidad de agente que es suficiente para mostrar un beneficio (por ejemplo, una reducción en un signo y/o síntoma asociada con el trastorno, enfermedad, o afección que se trata). Cuando se aplica a un ingrediente individual, administrada solo, el término se refiere aquel ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, el término se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes que resultan en el beneficio, cuando se administra combinación, seriamente o simultáneamente. Por ejemplo, una cantidad efectiva para usos terapéuticos en la cantidad de la composición que comprende un agente que suministra un incremento clínicamente significativo en la velocidad de curación en la reparación de fractura; la reversión de la perdida ósea y la prevención de fracturas en sujetos osteoporósicos; la reversión de los trastornos o defectos de cartílago; prevención o retraso del inicio de la osteoporosis; prevención de perdida ósea adicional asociada con osteoporosis; estimulación y/o inhibición de la formación ósea en fractura sin unión y osteogenia por distracción; incremento y/o reducción en el crecimiento óseo en dispositivos protésicos; reparación de defectos dentales, y similares. Tales cantidades efectivas se determinaran utilizando las técnicas de optimización de rutina y son dependientes de la afección particular a ser tratada, la condición del paciente; la ruta de administración, la formulación, y el juicio del médico y otros factores evidentes para aquellos expertos en la técnica. La dosificación requerida para los compuestos de la invención (por ejemplo, en osteoporosis cuando se desea un incremento en la formación ósea) es la dosificación que asegura una diferencia estadísticamente significativamente en la masa ósea entre grupos de control y tratamiento. Esta diferencia en la masa ósea se puede ver, por ejemplo, como un incremento del 5-20% o más en la masa ósea en el grupo de tratamiento. Otras mediciones de incrementos clínicamente significativos en la curación pueden incluir, por ejemplo, pruebas de tensión y resistencia a la ruptura, torsión y resistencia a la ruptura, doblez de cuatro puntos, conectividad incrementada en biopsias óseas, y otras pruebas bioquímicas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. La guía general para los regímenes de tratamiento se puede obtener de experimentos llevados a cabo en modelos animales de la enfermedad de interés.

La toxicidad y eficacia terapéutica de los agentes se puede determinar por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar el LD5o (la dosis letal al 50% de la población) y el ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). La proporción de dosis entre el efecto toxico y el terapéutico es el índice terapéutico y este se puede expresar como la proporción LD50/ED50. Se prefieren agentes o compuestos que exhiben grandes índices terapéuticos. Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivos celulares y los estudios en animales se pueden utilizar en la formularon de un rango de dosificación para uso en humanos. La dosificación de tales agentes o compuestos puede estar dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen el ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de éste rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada.

Para cualquier agente utilizado en el método de la invención, la dosificación terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir del ensayo de cultivos celular. Por ejemplo, una dosis de puede formular en modelos animales para logra un rango de concentración en plasma circulante que incluye el ED50 según se determina en cultivo celular o estudios animales (es decir, la concentración del compuesto de prueba que alcanza una dimerización máxima media de la proteína Ror2). Tal información se puede utilizar para determinar más exactamente las dosis útiles en humanos. Los niveles de plasma se pueden medir, por ejemplo, por HPLC. La dosificación se puede seleccionar por médicos en vista de la condición del paciente. El médico que atiende puede saber cómo y cuándo terminar, interrumpir, o ajustar la administración, Por el contrario, el médico que atiende también sabría ajustar el tratamiento a niveles mayores de respuesta clínica cuando sea adecuado (evitando la toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en el manejo del trastorno de interés variara con la severidad de la afección a ser tratada, la severidad de la afección puede, por ejemplo, ser evaluada, en parte, por métodos de evolución de pronostico estándar. Adicionalmente, la dosis y quizás las frecuencias de dosis también variara de acuerdo con la edad, peso corporal y respuesta del paciente individual. Un programa comparable aquel discutido anteriormente se puede emplear en medicina veterinaria.

La determinación de la dosis apropiada para una situación particular esta dentro de la habilidad del experto en la técnica. Generalmente, el tratamiento se inicia con dosificaciones más pequeñas que son menores que las dosis óptimas del compuesto. Después de esto, la dosificación se puede incrementar en incrementos pequeñas hasta que se alcanza el efecto óptimo según las circunstancias. Por ejemplo, la dosificación diaria total se puede dividir y administra en porciones durante día, si se desea. Una dosificación diaria se puede dividir en dos, tres o cuatro porciones, cada una de las cuales se administra durante un periodo de 24 horas.

En el caso de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo como el agente que se administra, el agente se administra típicamente por vía de infusión intravenosa. La dosificación puede variar de 1-25mg/kg cada 1-6 semanas. En ciertas modalidades, la dosificación puede variar de 1-10mg/kg cada 1-6 semanas. En ciertas modalidades, 1-10mg/kg del agente se suministra por infusión intravenosa cada 3-6 semanas. En otras modalidades, 3-6 mg/kg del agente se suministra por infusión intravenosa cada 4 semanas.

Dependiendo de las condiciones especificas a ser tratadas, los agentes se pueden formular y administrar sistémicamente o localmente. Una composición farmacéutica de la invención se formula para ser compatible con su ruta de administración propuesta. Las técnicas para la formulación y administración se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1990). Las rutas adecuadas pueden incluir administración oral, rectal, vaginal, transdérmica, transmucosal, o intestinal; suministro parental, que incluye inyecciones intramusculares, subcutáneas e intramedulares; así como también inyecciones intratecales, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, o intraocular, solo por mencionar unos pocos. Algunos métodos de suministro que se pueden utilizar incluyen aquellos que no se limitan a encapsulación en liposomas, incorporación en dispositivos protésicos, transducción por vectores retrovirales, y transfección de células ex vivo con posterior reimplantación o administración de células transfectadas.

Cuando las composiciones se utilizan farmacéuticamente, ellas se combinan con un "portador farmacéuticamente aceptable" para uso diagnóstico y terapéutico. La formulación de tales composiciones es bien conocida por aquellos expertos en este campo. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender uno o más agentes adicionales y, preferiblemente, incluyen un portador farmacéuticamente aceptable.

Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados y/o diluyentes incluyen cualquiera y todos los disolventes convencionales, medios de dispersión, llenadores, portadores sólidos, soluciones acuosos, recubrimientos, agentes antifúngicos y antibacterianos, agentes retrasantes de la absorción y agentes isotónicos, y similares. El término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador que no origina una reacción alérgica u otro efecto inconveniente en pacientes a quienes esta se administra. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, por ejemplo, uno o más de agua, solución salina, solución salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como también combinaciones de estos. Los Portadores farmacéuticamente aceptables pueden comprender adicionalmente cantidades menores de sustancias auxiliares tal como agentes emulsificantes o humectantes, conservantes o amortiguadores, que mejoran la vida de almacenamiento o la efectividad de uno o más de los agentes de la composición. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente aceptables es bien conocido en la técnica.

Las soluciones o suspensiones utilizadas para aplicación parenteral, intradérmica, o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tal como alcohol bencílicos o metil parabenos; antioxidantes tal como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes de quelación tal como ácido etilenodiaminotetraacético; amortiguadores tal como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tal como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tal como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral se puede incluir en ampollas, jeringas desechables o frascos de múltiples dosis hechos de vidrio o plástico. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para inyecciones incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables o dispersiones. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacterioestática, Cremofor EL® (BASF, Parsippany, N.J.), o solución salina amortiguada con fosfato. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de estos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensoactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede lograr mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, ser á preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o polialcoholes tal como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede originar al incluir en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Adicionalmente, los agentes para tratar enfermedades y afecciones identificadas por la presente invención también se pueden coadministrar con otros agentes terapéuticos que se seleccionan para su utilidad particular contra la afección que se trata. Por ejemplo, los agentes se pueden combinar con estrógeno o compuestos relacionados con estrógenos u otros inhibidores de resorción ósea. Los compuestos de estrógenos incluyen pero no se limitan a estrógenos conjugados, estradiol, y análogos de estos. Otros compuestos terapéuticos relacionados con los huesos incluyen, pero no se limitan a, bifosfonatos y compuestos relacionados (tal como aquellos establecidos en la patente U.S. No. 5,312,814), complementos de calcio (Prince, R. L. et al, N. Engl. J. Med. 325, 1 189, (1991) , complementos de vitamina D (Chapuy M. C. et al., N. Engl. J. Med. ull, 1637, (1992) , fluoruro de sodio (Riggs, B. L. et al, N. Engl. J. Med., 327, 620, (1992), andrógeno (Nagent de Deuxchaisnes, C, in Osteoporosis, a Multi-Disciplinary Problem, Royal Society of Medicine International Congress and Symposium Series No. 55, Academic Press, London, p. 291 , (1983), y calcitonína (Christiansen, C, Bone 13 (Suppl. 1):S35, (1992).

En otro aspecto, la presente invención proporciona un sistema para identificar agentes que activan la proteína Ror. Los métodos para determinar si un agente altera la actividad de una proteína Ror2 incluye desarrollar análisis y ensayos bien conocidos por el experto en la técnica. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, análisis histoquímica, análisis de inmuno transferencia, ELISA, ensayos de enzimas (ensayos de quinasa), y análisis funcionales que incluyen, por ejemplo, medición del alcance de la fosforilación Ror o 14-3-3ß (estados mayores de fosforilación que reflejan mayor actividad). En ciertas modalidades, la actividad del Ror, específicamente proteína Ror2, se evalúan al determinar el estado de fosforilación del 14-3-3ß, que se mostrado por unir la proteína Ror2 y se puede fosforilar por la proteína Ror2. La fosforilación de la proteína 14-3-3ß se puede ensayar utilizando cualquier técnica conocida en el arte. En particular, la inmunoprecipitacion utilizando anticuerpos anti-fosfotirosina se puede utilizar para seguir la fosforilación de la proteína 14-3-3ß. Alternativamente, también se pueden utilizar isótopos radioactivos de fósforo (por ejemplo, 32P-y-ATP).

La presente invención también proporciona un método para identificar agentes que modulan la actividad relacionada con los huesos. En donde un incremento o reducción en la actividad de una molécula Ror (por ejemplo, proteína Ror2) indica que el agente modula la actividad relacionada con los huesos.

En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un método de ensayo para identificar agentes que promueven la dimerización de Ror2 utilizando un receptor quimérico (por ejemplo, Ror2/TrkB) y un gen indicador, tal como luciferasa, regulado por la dimerización de Ror2. En ciertas modalidades, una célula que expresa un receptor quimérico que comprende el dominio extracelular de Ror2 fusionado al dominio intracelular de TrkB se utiliza en el ensayo de la invención. En ciertas modalidades particulares, los aminoácidos 1-407 del dominio extracelular de la proteína Ror2 se fusionan a los dominios intracelulares y de transmembranas del TrkB (aminoácidos 432-822). En otras modalidades, un dominio intracelular diferente se utiliza en la construcción de la quimera. Por ejemplo, cualquier dominio intracelular que se activa luego de la dimerización se puede utilizar en lugar del dominio TrkB. Preferiblemente, el dominio intracelular es de un receptor de transmembrana de tramo único, y la ruta de señalización se conoce. Ejemplos no limitantes de otros dominios intracelulares que se pueden utilizar en la preparación de receptores quiméricos incluyen el dominio intracelular de TrkA, TrkC, EGFR, PDGFR, y FGFR. El dominio intracelular se activa luego de la dimerización del dominio extracelular y enciende una cascada de señalización que conduce eventualmente a la regulación por incremento de un gen indicador. Por ejemplo, los agentes que dimerizan los dominios Ror2 extracelulares del receptor quimérico originan la activación de la ruta de señalización TrkB en el caso de la quimera Ror2/TrkB. La activación de la ruta de señalización TrkB se evalúa mediante el uso del elemento de respuesta cAMP del sistema de gen indicador-promotor (CRE). La activación de otra ruta de señalización tal como EGFR requeriría otro sistema de gen indicador tal como uno basado en elementos de unión STAT, que se enciende por la ruta EGFR. La activación de la ruta TrkB origina la estimulación del promotor CRE que a su vez incrementa la expresión de cualquier gen indicador bajo su control. Los indicadores ensayados fácilmente tal como la luciferasa (LUC), proteína fluorescente verde (GFP), ß-galactosidasa (GAL), ß-glucuronidasa (GUS), acetiltransferasa cloranfenicol (CAT), etc. se pueden colocar bajo el control del promotor CRE y utilizar en el ensayo de la invención. En ciertas modalidades, se utiliza la luciferasa como el gen indicador. En otras modalidades, la proteína fluorescente verde se utiliza como un gen indicador. En ciertas modalidades, la construcción del indicador-promotor CRE sobre un plásmido se transfecta en la célula que expresa el indicador quimérico. En otras modalidades, la construcción es parte del genoma de la célula. En ciertas modalidades, la construcción se transfecta establemente en la célula. El sistema de ensayo de la invención que se basa en la quimera Ror2/TrkB se ha validado utilizando un anticuerpo Ror2-específico mostrado aquí parta dimerizar Ror2. El anticuerpo Ror2-específico origina un incremento dependiente de la dosis en la actividad observada del indicador {Es decir, luciferasa). Ver Figura 12.

El sistema de ensayo de receptor quimérico de la invención se puede modificar utilizando diferentes dominios intracelulares apareados con un sistema promotor correspondiente. Ejemplos de otros dominios intracelulares incluyen dominio intracelular del TrkA, TrkC, EGFR, PDGFR, y FGFR. Un promotor correspondiente modulado por el dominio intracelular podría ser utilizado luego en el sistema indicador. Por ejemplo, un elemento de unión STAT se puede utilizar en un sistema utilizando un receptor quimérico con el dominio intracelular EGFR.

La presente invención incluye kits para desarrollar el ensayo del receptor quimérico de la invención. Estos kits incluyen algunos o todos los componentes necesarios para seleccionar agentes de prueba utilizando el ensayo de la invención. En ciertas modalidades, los componentes del kit se empacan convenientemente para uso por un investigador. Los kits pueden incluir cualquiera de todos de los siguientes: construcciones de ADN, líneas celulares, amortiguadores, enzimas, placas multipozo, controles positivos y negativos, medio, antibióticos, nucleótidos, instrucciones, etc. En ciertas modalidades, el kit incluye una línea celular que expresa el receptor quimérico Ror2/TrkB. En otras modalidades, el kit incluye una construcción de ADN que codifica el receptor quimérico Ror/TrkB. En otras modalidades, el kit incluye un gen indicador ligado operablemente al promotor CRE. En ciertas modalidades, el kit incluye un gen de luciferasa ligado operablemente al promotor CRE. El gen indicador/construcción de promotor CRE puede ser un plásmido.

La presente invención incluye un receptor quimérico con el dominio Ror2 extracelular utilizado en el ensayo de la invención descrito anteriormente. Una secuencia de aminoácido de un receptor Ror2/TrkB quimérico es como sigue. La secuencia de aminoácido derivada de la proteína Ror2 se muestra en letras mayúsculas; la secuencia de aminoácido derivada de la proteína TrkB se muestra en minúsculas.

MAROSALPRRPLLCIPAV AAAALLLSVSRTSOEVEVLDPNDPLGPLD NDAPVVQEPRRIIIRKTEYGSRIJUQDLDTTO TGVLFVIU.GPTHSPNHNFQDDYHEDGFCQPYRGUCARFIG RTIYVD SLQMQGEIENRITAAITMIGTSTHI^ APKPRE1XRDECEVLESDLCRQEYTIARSNPLILMRLQLPKCEALP PE SPDAANCMRIGIPAERLGRYHQCY GSGMDYRGTASTTKSGHQCQPW ALQHPHSHHLSSTDFPELGGGHAYCRNPGGQMEGPWCFTQNKNVRM ELCDVPSCSPRDSSKMGILYbvyavvviwvvgfclh ddd$a£plhhisngsntp$s$eggpda^ gafgkvflaecynlcpeqdldlvavkt^ ymkhgd!nJ lrahgpdavlmaegnppteltqsqmlW^ vkigdfgmí vystdy rvgghtmlpirw^ nneviecitqgrvlqrprtcpqevye Irolgcwqrephmrkni kgi tl Jqnlakaspvyldilg (SEQ I O: 4) Como se podrá apreciar por el experto en la técnica, varias mutaciones, eliminaciones, sustituciones, etc. se pueden hacer en la proteína quimérica de la invención sin apartarse de esta. En ciertas modalidades, la proteína quimérica es por lo menos 99%, 98%, 95%, 90%, 80%, o 70% homologa a la secuencia de aminoácido anterior. En ciertas modalidades, el receptor quimérico activa una ruta de señalización tal como la ruta TrkB luego de dimerización, que se origina por la dimerización de los dominios Ror2 extracelulares del receptor quimérico. Como se apreciará por aquellos expertos en esta técnica, varios cambios a la secuencia de la proteína anterior se pueden hacer sin cambiar la actividad del receptor. Estas variantes del receptor quimérico se consideran están dentro del alcance de la invención. La presente invención también incluye secuencias de polinucleótidos que codifican el receptor quimérico o variantes de este. La secuencia de codificación se liga operablemente y opcionalmente a un promotor, mejoradores, elementos reguladores, etc. que modulan la expresión y/o traducción de una proteína quimérica. La presente invención también incluye células que incluyen la secuencia de polinucleótido de la invención que codifica el receptor quimérico.

Los métodos de la presente invención se pueden modificar o desarrollar en cualquier formato disponible, que incluye ensayos de alto rendimiento. Los ensayos de alto rendimiento son útiles para seleccionar un gran número de agentes de prueba en un periodo de tiempo. En otra modalidad, se desarrollan ensayos utilizando selección basada en células. La patente U.S. No. 6,103,479, publicada en Agosto 15, 2000, incorporada aquí como referencia, describe métodos de ensayo celular miniatura y aparatos para selección basados en células. Los métodos se han descrito para hacer ensayos de micropatrones de células para otras aplicaciones, por ejemplo fotolitografía resistente a fotoquímicos ( rksich and Whitesides, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 25, 55-78, (1996)). La Patente U.S. no. 6,096,509, publicada Agosto 1 , 2000, se incorporada aquí como referencia, proporciona un aparato y método para medición en tiempo real de una respuesta celular para un agente de prueba sobre una suspensión de células que fluyen, en la que una suspensión homogénea de cada miembro de una serie de tipos de células se combina con un compuesto de prueba en una concentración específica, dirigida a través de una zona de detección, y una respuesta celular de células vivas se mide en tiempo real ya que las células en la mezcla de prueba están fluyendo a través de la zona de detección. La patente describe el uso del aparato en la selección automatizada de colecciones de agentes de prueba (por ejemplo, moléculas pequeñas). Los métodos descritos aquí en estas patentes U.S. se pueden modificar para determinar si los agentes de prueba modulan la expresión o actividad de la molécula Ror utilizando células tal como células osteoblásticas (osteoblatos primarios, células osteoblásticas humanas tal como TE-85, U20S, SaOS-2 o HOB, células osteoblásticas de rata tal como UMR 106 o ROS 17/2.8, células osteoblásticas de ratón tal como MC3T3, u otras), células no osteoblásticas (COS-7 y otras), células madre (células madre mesenquimales, células madre embriónicas), células progenitoras, o células construidas con ingeniería que contienen secuencias de nucleótidos Ror. En otras modalidades, se desarrollan ensayos basados en ensayos de enzima (por ejemplo, ensayos de quinasa).

Los agentes de prueba identificados como útiles en la modulación de la actividad de la proteina Ror se pueden luego ensayar adicionalmente. En ciertas modalidades, los agentes se prueban en otros ensayos basados en células u otros ensayos no basados en células. Los compuestos se pueden probar en modelos animales de varias enfermedades que incluyen modelos animales de varias enfermedades óseas y trastornos. Por ejemplo, los agentes se pueden probar en modelos animales de fracturas óseas, osteoporosis, cánceres de hueso, pérdida ósea etc.

La presente invención incorpora como referencia métodos y técnicas bien conocidos en el campo de la biología molecular y celular. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan a técnicas descritas en las siguientes publicaciones: Oíd, R. W. & S. B. Primrose, Principies of Gene Manipularon: An Introduction To Genetic Engineering (3d Ed. 1985) Blackwell Scientific Publications, Boston. Studies in Microbiology; V.2:409 pp. (ISBN 0-632-01318-4), Sambrook, J. et al. eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d Ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Vols. 1-3. (ISBN 0-87969-309-6), Miller, J. H. Se M. P. Calos eds., Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (1987) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. 169 pp. (ISBN 0-87969-198-0).

Ejemplo La presente invención se define adicionalmente en los siguientes ejemplos, en los cuales todas las partes y porcentajes son por peso y los grados son Celsius, a menos que se establezca otra cosa. Se podrá entender que estos ejemplos, mientras indican modalidades preferidas de la invención, se dan solo por vía de ilustración. De la anterior discusión, modalidades, y estos ejemplos, un experto en la técnica apreciará fácilmente que son posibles muchas modificaciones en las modalidades de ejemplo sin apartarse materialmente de las enseñanzas novedosas de estas invenciones, y sin apartarse del espíritu y alcance de estas. Adicionalmente, uno puede hacer varios cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a varios usos y condiciones. De acuerdo con lo anterior, todas tales modificaciones están destinadas a estar incluidas dentro del alcance de esta invención como se define en las siguientes reivindicaciones.

Las patentes, solicitudes, métodos de prueba, y publicaciones mencionadas aquí se incorporan como referencia en su totalidad.

Métodos generales Materiales y cultivo de tejidos Excepto cuando se anota, los reactivos de cultivo de tejido se compran de Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA); otros reactivos y químicos se compran de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) o Invitrogen. El dominio citosólico etiquetado GST del Ror humano recombinante se obtiene de Invitrogen y el 14-3-3ß humano recombinante etiquetado GST es de Biomol International, LP (Plymouth Meeting, PA). El anticuerpo monoclonal de ratón Anti-Flag M2, agarosa de afinidad anti-Flag M2, Y anticuerpo monoclonal de ratón anti-p-actina de ratón se obtienen de Sigma; el anticuerpo policlonal de cabra antihumano Ror2 se compra de R&D Systems (Minneapolis, MN); los anticuerpos policlonales anti-14-3-3 y anti-His de conejo son de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). El anticuerpo de anti-fosfotirosina azarosa- conjugado y no conjugado (4G10) se obtienen de Upstate Cell Signaling solutions (Charlottesville, VA); el anticuerpo P-Tyr-100 fosfotirosina inmovilizado es de Cell Signaling Technologies (Beverly, MA); la proteína A sefarosa y glutationa sefarosa se compran de Amersham Biosciences (Buckinghamshire, England). Los anticuerpos secundarios de peroxidasa (HRP)-conjugados de rábano son de Santa Cruz Biotechnology.

Las células madre mesenquimales humanas (hMSC) se compran de Cambrex, Inc. (Baltimore MD) y se mantienen a 37° C en 5% de C02-95% de aire humidificado en incubadora utilizando medio de crecimiento hMSC (MSCGM, Cambrex). Las células de osteosarcoma humanas U20S se mantienen a 37° C en medio modificado 5A de McCoy, que contiene 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 1 % de penicilina-estreptomicina, y 2 mM de glutaMAX-l.

Plásmidos v Adenovirus La generación de plásmidos Ror2-Flag se ha descrito previamente (Billiard and Bodine, Solicitud de patente U.S. U.S.S.N. 10/823,998, presentada Abril 14, 2004; Billiard el al. Mol Endo 19, 90-101 , 2005). La construcción Ror2-His se genera al reemplazar la etiqueta del epítopo Flag en el terminal COOH del Ror2-Flag con la secuencia de codificación para 6 histidinas. La fusión GST de dominio citosólico de Ror2 (GST-Ror2c) se obtiene al insertar el dominio intracelular del Ror2 humano (que codifica para los aminoácidos 428-944) en la siguiente estructura la etiqueta GST en el vector pGEX-4T-2 (Amersham).

El cADN del 14-3-3ß de longitud completa se compra de Open Biosystems (Huntsville, AL) y se subclona en el vector de expresión bacteriana pET28a.

Adenovirus que contienen receptor de adenovirus coxsackie humano (hCAR), shARN específico Ror2 y shARN específico de EGFP se obtienen de Galápagos, Inc. (Mechelen, Bélgica). La generación de adenovirus Ror2, Ror2KD y ß-galactosidasa (ß-gal) se han descrito (Billiard and Bodine, solicitud U.S. U.S.S.N. 10/823,998, presentada Abril 14, 2004, incorporada aquí como referencia).

Cultivo de órgano Calvárico e infección Se cortan células craneanas de ratones de carnadas de 4 días de edad, el corte a lo largo de la sutura sagital se incuba durante 24 h en medio BGJ libre de suero que contiene 0.1 % BSA. Cada mitad del cráneo se coloca luego con la superficie cóncava hacia abajo sobre una reja de acero inoxidable (Small Parts Inc, Miami, Fl) en un pozo de placa de 12 pozos. Cada pozo contiene 1 mi de medio BGJ con 1% FBS, con o sin adenovirus ß-gal o Ror2 (3.75 mln de partículas virales/pozo). La células de cráneo se incuban en una incubadora de aire modificado de 5% C02-95% humedad y/o medio y el adenovirus se cambia después de 4 días.

Después de 7 días de incubación en la presencia de adenovirus, los cráneos se fijan en 10% de formaldehído amortiguado con fosfato neutro a TA durante 72 horas, luego se descalcifica durante 6 horas en 10% de EDTA en PBS. Los cráneos en cada grupo se sumergen en paralelo en el mismo bloque de parafina, y se tiñen secciones de 4 µ?? con hematoxilin-eosina. Las áreas óseas consistentes (200 pm de suturas frontales) se seleccionan para análisis histomorfométrico. En resumen, una rejilla de 200 pm cuadrada se coloca cada cráneo y se determina el número de osteoblastos y el área ósea total con el Osteomeasure System (Osteometric Inc, Atlanta, GA).Todas las células de la superficie o sea se cuentan como osteoblastos. El medio de calcio se mide utilizando el kit Calcium Diagnostics (sigma) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Infección Viral Se siembran MSC humanas a 6,000/cm2 en placa de 12-, o 6- pozos y se le permite adherir y proliferar durante la noche. Las células se infectan durante 24 h en 0.4 ml/cm2 MSCGM utilizando adenovierus Ror2, Ror2KD, o ß-gal en multiplicidad de infección (MOI)=750 en presencia de hCAR (MOI=750) para mejorar la eficiencia de infección. Después de 24 h, las células se lavan una vez en PBS y MSCGM, MSCGM se complementa con 0.05 mM de ácido ascórbico y 10Mm se agrega ß-glicerofosfato o MSCGM que contienen complementos adipogénicos (pt-3004, Cambrex). Donde se indique, se agrega 100 nM de dexametasona (dex) y/o los anticuerpos idénticos al medio. Para infección shARN, las células se cultivan a 6.000/cm2 en placas de 12 o 6 pozos y se les permite adherir y proliferar durante 3 días. Las células se infectan durante 72 h en 0.4 ml/cm2 de MSCGM utilizando adenovirus que codifican para Ror2 especifico shARN O shARN especifico de EGFP a 4.000 partículas virales por célula (basado en la densidad de siembra original) en la presencia de hCAR (MOI=750). Después de 72 h, las células se lavan una vez en PBS, y MSCGM o MSCGM complementado con 0.05 mM de ácido ascórbico, se agrega 10mM de ß-glicerofosfato. Donde se indique se agrega 100 mM de dex y/o anticuerpos específicos. Cada 5 días, el medio completo o ½ de este se remplaza con medio fresco.

Las células U20S se siembran a 75,000/cm2 en placas de 6 pozos y se infectan 24 h después con adenovirus Ror2, Ror2KD, o ß-gal en MOI=100. La Infección se le permite proceder durante 24 h y los extractos celulares se recolectan otras 24 h después.

Teñido Histoquímico Roio-S Alizarin La formación de módulos mineralizados por hMSC se determina en placas de 12 pozos por teñido histoquímico rojo-S alizarin. Las células y la matriz se fijan a TA durante 1 h con 70% (v/v) etanol, se lavan con agua des-ionizada y se tiñen durante 10 min a TA con 40mM de rojos-S alizarin, pH 4.2. La matriz teñida se lava con agua des-ionizada y se fotografía. Para cuantificar el nivel de teñido rojo-S alizarin, el tinte se diluye con 1 ml/pozo de 10% (w/v) de cloruro de cetilpiridinio. El rojo-S alizarin en las muestras eluadas se cuantifica (versus una curva estándar de 0-800 µ? de tinte) a 562 nm con un lector de microplaca.

Teñido Histoquímico rojo O aceite Se monitorea la adipogénia en hHSC en placas de 12 pozos por teñido histoquímico O rojo y aceite. Las células se fijan a TA durante 2 h con 10% de formalina amortiguada neutra, se lava con PBS y se tiñe durante 10 min a TA con 18mg/mL de O rojo de aceite en 60% de isopropano, pH 7. Las células teñidas se lavan con PBS y se fotografían.

Aislamiento de ARN y Análisis PCR en Tiempo Real Se aisla el ARN celular total utilizando en kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante y sometido a análisis RT-PCR de tiempo real utilizando el sistema de detección de secuencia ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Todos los niveles de mANR se normalizan a los niveles de un gen domestico, ciclofilina B. Las sondas y cebadores para C/???a y PPARy humanos se compran de Applied Biosystems; los cebadores y las ondas para la ciclofelina B humana son como sigue: 5'CACCAACGGCTCCCAGTT -3'(cebador delantero, 438-455, SEQ ID NO:1 ), 5'AACACCACATGCTTGCCATCT -3'(Cebador inverso, 486-506, SEQ ID NO:2) Y 5'TTCATCACGACAGTCAAGACAGCCTGG -3' (Sonda, 457-483, SEQ ID NO:3).

Transfecciones transitorias Para las transfecciones de plásmido Ror2, se siembran células U20S en densidad ~80% confluentes y se transfectan 24 h después con 1 1 µg de ADN de plásmido total por 19.6 cm2 utilizando el reactivo de transfección fugene 6 (Roche Applied Science, Indianápolis, IN) según instrucciones del fabricante. Para las transfecciones siARN, se colocan en placas de 6 pozos células U20S a 52,000 células/cm2 y se transfectan 24 h después con 25 nM de siARN Ror2 o siARN no especifico (de Dharmacon Inc., Lafayette, CO) utilizando 10 µ? de reactivo lipofectamina 2000 según instrucciones del fabricante.

Inmunoprecipitación e Inmunotransferencia Western Se solubilizan las células en amortiguador de lisis (150 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI, pH 7.5, 1 mM EDTA, 1% Tritón X 100) complementado con cócteles de inhibidor de fosfato y proteasa (sigma) y los extracto se clarifican por centrifugación a 10,000 xg durante 10 min a 4o C. Para la inmunoprecipitación Flag, 1 mg de los lisatos celulares totales se incuba con 30 µ? de azarosa de afinidad M2 Flag (sigma) durante 1 h con rotación a 4o C. Se recolectan los glóbulos por centrifugación y se lavan tres veces en amortiguador de lisis que contiene 350 mM NaCI y tres veces en amortiguador de lisis. Para la precipitación 14-3-3ß, se incuban 15 µ? de anticuerpo 14-3-3ß con 30 µ? de sefarosa proteína A en 1 mi de amortiguador de lisis durante la noche a 4°C y se recolectan los glóbulos por centrifugación y se lavan en amortiguador de lisis antes de la adición de 1 mg de lisatos celulares totales. La reacción de unión se lleva a cabo durante 2 h a 4°C con rotación suave y los glóbulos se recolectan y lavan como para la presión Flag. Para la precipitación de fosfotirosina, 1mg (para detectar proteínas sobre-expresadas) o 1.5 mg (para detectar proteínas endógenas) de extractos celulares se agregan a 100 µ? de G410 y se le permite adherir durante 3 h a 4°C. En este momento, el anticuerpo inmovilizado P-Tyr-100 (100 µ?) se agrega a la mezcla para 3 h adicional. Todos los glóbulos se recolectan por centrifugación y se lavan para precipitación Flag. Al final de todas las reacciones de inmunoprecipitación, los glóbulos se hacen hervir en 30-50 µ? de amortiguador 2XLDS-PAGE con agente de reducción (Invitrogen), y las proteínas solubilizadas se separan por SDS-PAGE. Los geles se transfieren sobre membrana de 0.45 µ?? de nitrocelulosa antes de detección con cada anticuerpo especifico.

Para inmunotransferencia sin precipitación, las cantidades indicadas de lisatos celulares totales se redisuelven por SDS-PAGE bajo condiciones de reducción y desnatularización antes de transferencia sobre membranas 0.45 pm nitrocelulosa y la detección con cada anticuerpo especifico.

Ensayo de Quinasa In vitro y GST pool-down El 14-3-3ß esta in vitro traducido de 14-3-3 -pET28a utilizando el sistema de síntesis de proteína in vitro expressway™ (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante en una reacción de 50 µ?.

El GST-Ror2c en pGEX-4T-2 o pGEX-4T-2 (que codifica solo para GST) se transforma en la cepa BL21 (DE3) de escherichia coli. Se hacen crecer cultivos a un A600 de 0.7 y se induce para expresar proteínas recombinantes por la adición de isopropil-1 -tio- -D-galactopiranosida (sigma; concentración final de 1 Mm) e incubación durante 4 h. Los gránulos bacterianos se cosechan por centrifugación, se lavan en PBS, y se resuspenden en 30 mi de cócteles inhibidores de proteasa y fosfatasa (sigma). Las células se lisan al pasar dos veces a través de una prensa de células de Presión Francés (Spectronic Instuments, Rochester, NY) a 16,000 p.s.L, y los residuos bacterianos se remueven por centrifugación. Las proteínas GST o GST-Ror2c se incuban con sefarosa glutationa durante 4 h a 4°C. Los glóbulos se lavan, se resuspenden en 1 mi PBS y 50 µ? completo de reacción de translación in vitro 14-3-3ß se agregan durante 4 h a 4o C. Al final de esta incubación, los glóbulos se lavan 3 veces en PBS, se hierven en amortiguador 2xLDS-PAGE con agente de reducción (Invitrogen), y las proteínas solubilizadas se separan por SDS-PAGE. Los geles se transfieren sobre membrana de 0.45 pm de nitrocelulosa antes de detección con cada anticuerpo especifico.

Para el ensayo de quinasa in vitro, 6.5 pg de GST-14-3-3P (Biomol) humano recombinante purificados se resuspende en 25 µ? de amortiguador de reacción de quinasa (10 mM MgCI2, 50 mM Tris-HCI pH 7.5, 1 mM ditiotrietol (DTT), 1 mM ATP) con o sin la adición de 0.9 pg de GST-R2c humano recombinante purificado (Invitrogen). La reacción de quinasa se le permite proceder durante 30 min a 37° C y se detiene al hervir en 1XLDS de amortiguador con agente de reducción (Invitrogen). Las proteínas se resuelven por SDS-PAGE, se transfieren a membranas de nitrocelulosa de 0.45 pm y se detecta con anticuerpo de fosfotirosina. Posteriormente la membrana se pela y se sondea de nuevo con anticuerpo 14-3-3ß para verificar la carga igual.

Análisis Estadístico Los datos se presentan como media ± DE. La significancia estadística se determina utilizando la prueba t test Student's o ANOVA de una vía. Los resultados se consideran estadísticamente diferentes cuando P<0.05.

EJEMPLO 1 El Ror2 endógeno juega un papel en la diferenciación del Hmsc Hemos mostrado previamente que la expresión Ror2 se incrementa durante la diferenciación osteogénica del hMSC (Billiard et al, solicitud de patente U.S.S.N. 10/823,998, presentado Abril 14, 2004; Billiard et al, Mol Endo 19,90-101 ,2005; cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia). para evaluar si el incremento en la expresión Ror2 durante la diferenciación del hMSC es crítico para la osteoblastogenia, desarrollamos diferenciación inducida por dex cuando se inhibe la expresión Ror2. para este fin, se infecta el hMSC con adenovirus que contiene shARN especifico para Ror2, que de hecho inhibe fuertemente el incremento inducido por dex en la expresión de la proteína Ror2 cuando se compara con shARN de control especifico para EGFP (FIGURA 1A). La infección con shARN Ror2 casi abroga completamente la capacidad del dex para inducir la mineralización de matriz (figuras 1 B y C), que sugieren que el aumento en Ror2 al menos en parte media la diferenciación osteoblástica inducida por dex del hMSC.

EJEMPLO 2 La Sobreexpresión de Ror2 Suprime la Diferenciación Adipogénica del hMSC También hemos mostrado previamente que la sobreexpresión del Ror2 inicia la presentación de el MSC al linaje osteoblástico así como también promueve la diferenciación en etapas anteriores y posteriores de la osteoblastogenia (Billiard et al., solicitud de patente U.S.S.N. 10/823,998, presentada Abril 14, 2004; incorporada aquí como referencia). Y valuamos ahora los efectos del Ror2 en el alcance alterno del hMSC, adipogénia, inducida por incubación en cóctel adipogénico que contiene indometacina y IBMX. El MSC humano se infecta con adenovirus que codifican el Ror2 tipo silvestre o el mutante de dominio quinasa (Ror2KD), cada uno contiene una etiqueta de epítopo flag. En el Ror2KD, tres lisinas en las posiciones 504 (en el dominio de unión ATP putativo), 507, y 509 se remplaza con isoleucinas que resultan en una actividad quinasa tirosína significativamente reducida (Hikasa et al. Development 129, 5227-5239,2002; Billiard et al, U.S. solicitud de patente U.S.S.N 10/823,998, presentada abril 14,2004; billiard et al. Mol Endo 19,90-101 , 2005). para el control, se infecta hMSC con el cásete de expresión ß-galactosidasa (ß-gal) en el mismo fondo adenoviral. El Ror2 y Ror2KD mutante inhiben la expresión de los factores de transcripción adipogénicos principales, la proteína a de unión CCAAT/mejorador (C/???a) y el receptor activado por proliferador de peroxisoma ? (PPARy) (figura 2A) Y reducción marcada originada en la capacidad del hMSC para formar adipocitos que producen lípidos O-positivos rojo aceite (Figura 2B). Tomadas con nuestros resultados anteriores (Billiard et al., U.S. solicitud de patente U.S.S.N. 10/823,998, presentada Abril 14, 2004; incorporada aquí como referencia), estos datos indican que el Ror2 altera el destino celular del MSC al cambiar el balance de los factores de trascripción a favor de la osteoblastogenia.

EJEMPLO 3 Ror2 Incrementan el Área Ósea Total de Cráneo de Ratón. Probamos luego si el efecto in vitro de Ror2 en la diferenciación del hMSC se traduce en la formación ósea incrementada en cultivos de órgano ex vivo. Huesos de cráneo de ratones de 4 días de edad se dejan sin infectar o infectar con adenovirus ß-gal o Ror2. Después de 7 días de cultivo en la presencia de adenovirus, se tiñen los huesos con hematoxilin-eosina y se someten en secciones de 200 µ?t?2 consistentes (200 pm de suturas frontales) para análisis histomorfométrico utilizando Osteomeasure System. Bajo control, las condiciones no infectadas, sección de 200 µ?t?2 de cráneo contienen 2171 ±235 µ?t?2 de área ósea y 84±6.5 osteoblastos. La infección con el virus Ror2 origina 50% de incremento en el área total de hueso sin afectar el número de osteoblastos que indican que los osteoblastos activan el Ror2 para producir más matriz ósea (Figura 3).

EJEMPLO 4 14-3-3B Es el Primer Substrato Identificado de la Quinasa Ror2 Hemos reportado previamente la identificación de los 9 factores potenciales de unión Ror2 en células de osteosarcoma U20S por espectrscopiedad de masa (Billiard et al., U.S. solicitud de patente U.S.S.N. 10/823,998, presentada Abril 14, 2004; incorporada aquí como referencia). De éstos, las proteínas 14-3-3 se han mostrado que juegan un papel en la diferencian y progresión de ciclo celular (Mackintosh, Biochem j 381 ,329-342,2004) y se selecciona 14-3-3ß para los siguientes estudios. Confirmamos primero la interacción observada por espectroscopia de masa utilizando técnicas de inmunoprecipitación.

Las células U20S se infectan con adenovirus ß-gal, Ror2, o Ror2KD y las proteínas celulares totales se aislan y se someten a inmunoprecipitación sobre agarosa de afinidad anti-flag seguida por inmunotransferencia con anticuerpo anti-14-3-3 (Figura 4A, panel superior) una cantidad muy baja de 14-3-3ß se precipita bajo condiciones de control (células ß-gal-infectadas), pero una cantidad significativa co-precipitada sobre la expresión Ror2. La formación de complejo es a un más fuerte con el mutante Ror2KD que indica que la actividad quinasa conduce a la disociación de complejo. Niveles de precipitación iguales se verifican por inmunotransferencia con anticuerpo anti-flag (Figura 4A, panel inferior). La interacción entre 14-3-3ß y Ror2 se confirman adicionalmente al precipitar 14-3-3ß en anticuerpo 14-3-3ß especifico y verificar la presencia de Ror2 en el complejo por inmunotransferencia anti-flag (Figura 4b).

Para evaluar si el Ror2 origina fosforilación de 14-3-3ß, nosotros sondeamos nuevamente el blot en la figura 4A con anticuerpos anti-fosfotirosina. Este anticuerpo identifica una proteína fosforilada que migra en el mismo peso molecular como el 14-3-3ß y solo está presente en células que expresan el Ror2 tipo silvestre, pero no el ß-gal o el mutante inactivo quinasa (Figura 4A, panel medio). Esto sugiere que el Ror2, directa o indirectamente, fosforila el 14-3-3ß en los residuos tirosina. Esta hipótesis se confirman al inmunoprecipitar todas las proteína tirosina fosforiladas en extractos U20S en anticuerpo anti-fosfotirosina y observar un incremento significativo en la cantidad de ??8??-14-3-3ß sobre la sobreexpresión del Ror2 (figura 4C).

Para probar si el Ror2 endógeno media la fosforilación de fondo del 14-3-3ß observado en la figura 4C, inhibimos la expresión Ror2 en células U20S mediante siARN Ror2 especifico.

Como se muestra en la figura 5A, la transfección con siARN Ror2 especifico resulta en la inhibición casi completa de la expresión de la proteína Ror2 cuando se compara con SiARN de control mezclado. La reducción en la expresión Ror2 no ha tenido efecto en la cantidad de la proteína 14-3-3ß en células U20S, pero origina regulación por disminución significativa de su fosforilación tirosina (Figura 5b). El incremento evidente en el alcance de la fosforilación de fondo del 14-3-3ß comparado con la figura 4C resulta de un mayor tiempo de exposición utilizado aquí.

Para evaluar si la unión de del Ror2 a y la fosforilación del 14-3-3ß es directa desarrollamos experimentos in vitro con proteínas recombinantes purificadas. Para el experimento de unión, la fusión GST del dominio citosólico del Ror2 humano (GST-Ror2c) se expresa en células bacterianas, se precipita en sefarosa glutationa e incuba con 14-3-3ß traducido in vitro. Como se muestra en la Figura 6A, la unión del 14-3-3ß al GST-Ror2c, pero no al GST solo, lo que indica que el 14-3-3ß se une directamente al dominio citosólico de Ror2. En razón a que la síntesis de proteína Expresswaytm contiene el 14-3-3ß traducido in vitro el amortiguador en incompatible con el ensayo de. quinasa, compramos el 14-3-3ß etiquetado GST recombinante purificado y desarrollamos el ensayo de quinasa in vitro con GST-Ror2 recombinante purificado (Invitrogen). Como se muestra en la Figura 6B, El Ror2c fosfolirado 14-3-3ß y éste mismo confirma que el 14-3-3ß es un substrato directo para la tirosina quinasa Ror2.

EJEMPLO 5 Anticuerpo Ror2 Especifico Dimeriza y Activa del Receptor Ror2 Se ha mostrado que varios receptores de la tirosina quinasa se dimerizan y activan por anticuerpos (Spaargaren et al. J.Biol. Chem. 266, 1733-1739,1991 ; Fuh et al. Science 256, 1677-1680, 1992; cada una de las cuales se incorporan aquí como referencia). Por lo tanto probamos un anticuerpo específico Ror2 que surge contra el dominio extracelular completo del Ror2 humano por su capacidad de dimerizar y activar la tirosina quinasa del receptor Ror2. para evaluar la dimerización, se expresan construcciones del receptor Ror2 etiquetado His y etiquetados flan en células U20S y las células se tratan durante 1 H 37°C con IgG policlonal de cabra especifico Ror2 (que surge contra el dominio extracelular de Ror2 humano, R&D Systems, AF2064) o con IgG de cabra no especifico de control (R&D Systems). Luego de incubación, se extraen el total de proteínas celulares, se precipitan en agarosa de afinidad anti-flag y se someten a inmunotransferencia con anticuerpo anti-His. Como se muestra en el panel superior de la figura 7A, bajo las condiciones de control de tratamiento IgG no especifico, no hubo asociación entre los receptores Ror2 etiquetados flan y etiquetados His que indiquen que las formas Ror2 homodímeras sobre la sobreexpresión en las celular U20C. Esta formación de homodimero se mejora fuertemente luego del tratamiento con anticuerpo Ror2 que confirma que el anticuerpo puede dimerizar el receptor Ror2. El diseño experimental se valida por el hecho de que el anticuerpo anti-flag falla en inmunoprecipitar el Ror2-H¡s en ausencia del Ror2-flag y que el anticuerpo anti-His no reconoce la proteína Ror2-flag (Figura 7A, panel superior). niveles iguales de precipitación se verifican por inmunotransferencia con anticuerpo anti-flag (Figura 7A, panel inferior).

Para saber si el anticuerpo activa la tirosina quinasa de Ror2 tratamos las células U20S con el anticuerpo Ror2-especifico o el IgG de control durante 1 h a 37°C, se aislan los estratos de proteína de células completas y se precipitan todas las proteínas tirosina fosforiladas en anticuerpo de fosfotirosina. La Figura 7B ilustra que el tratamiento con anti cuerpo anti-Ror2 resulta en autofosforilación significativa de la quinasa Ror2 así como también en la fosforilación de su substrato, proteína 14-3-3ß. Estos dados suministran evidencia fuerte de que el anticuerpo anti-Ror2 dimeriza y activa el receptor tirosina quinasa Ror2.

EJEMPLO 6 Anticuerpo De Activación Ror2 Especifico Promueve la Mineralización del Hmsc.

Nos preguntamos si la dimerización y activación inducida por anticuerpo de Ror2 tendrá consecuencias funcionales en la diferenciación osteogénica del hMSC. En razón a que el hMSC no expresa el Ror2 a menos que lo diferencie hacia el fenotipo osteogénico (Billiard and Bodine, solicitud de patente U.S.S.N. 10/823,998, presentada Abril 14, 2004; Billiard et al. Mol Endo 19,90-101 ,2005; cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia), inducimos la expresión Ror2 mediante tratamiento con cóctel osteogénico (MSCGM complementado con 0.05 mM ácido ascórbico, 10 mM de ß-gliserofosfato, y 100 nM dex) y se agregan cantidades incrementadas de IgG de cabra Ror2 especifico o IgG de cabra no especifico. Después de 9 días de incubación, el grado de formación de matriz mineralizada se evalúa con alizarin rojo-S teñido histoquímico. Como se muestra en la Figura 8, el anticuerpo, anti-Ror2 dependiente de la dosis incrementa el alcance de la formación de matriz calcificada en hMSC. El IgG de cabra no específico no tiene efectos sobre la mineralización de la matriz en todas las concentraciones probadas, excepto una ligera inhibición observada en la dosis mayor de 100 pg/ml. Para claridad, solo una dosis de IgG no específico (50 g/ml) se muestra en la Figura 8. Un anticuerpo policlonal de cabra surge contra el dominio extracelular completo del Ror1 (R&D Systems, AF2000) también sin efecto (Figura 8). El efecto anti-Ror2 se media a través del receptor Ror2, en razón a que éste desaparece cuando la expresión Ror2 en hMSC se inhibe por el shARN especifico de Ror2 (Figura 9A). Adicionalmente, el anticuerpo anti-Ror2 induce la formación de matriz calcificada a un en ausencia de dex si las células se inducen para expresar Ror2 a través de infección de adenovirus (Figura 9B). Así el anticuerpo Ror2 específico se puede dimerizar y activar el receptor Ror2 y promover la formación de matriz calcificada mediada por Ror2 en células madre mesenquimales, lo que sugiere que una activación del anticuerpo Ror2 puede suministrar terapia efectiva para osteoporosis y otras enfermedades óseas.

EJEMPLO 7 La Inhibición del 14-3-3S Mejora la Mineralización del hMSC.

Para probar si el 14-3-3ß juega un papel en la diferenciación osteogénica, inhibimos la expresión 14-3-3ß en ausencia y presencia de la sobreexpresión del Ror2. Para este fin se infecta hMSC con shARN 14-3-3p-especifico, que de hecho sub regula fuertemente la expresión de proteína endógena cuando se compara con shARN de control mezclado (Figura 10A). Cuando el hMSC se infecta con dos virus de control, que contiene shARN mezclado y ß-galactosidasa, observamos un bajo alcance de mineralización de matriz (Figura 10B), lo que sugiere que la infección dual por si misma media osteogenia leve en cultivo hMSC como se observo anteriormente (Billiard et al., solicitud de patente U.S.S.N. 10/823,998, presentada Abril 14, 2004), la infección con adenovirus Ror2 promueve fuertemente la formación de matriz mineralizada. Para nuestra sorpresa, la regulación por disminución del 14-3-3ß también incrementa grandemente el alcance de la mineralización (Figura 10B). Ambos, la sobreexpresión del Ror2 y la inhibición de 14-3-3ß induce la mineralización de matriz más fuerte que lo que lo hace una sola (Figura 10B). Esta es la primera evidencia que sugiere que las proteínas de andamio 14-3-3ß ejercen efectos inhibidores sobre la diferenciación esteogénica del hMSC.

EJEMPLO 8 Activación Ror2 Inducida por Anticuerpo e Inhibición de 14-3-3B Promueve la Nueva Formación Ósea en Cultivos de Cráneos Ex vivo.

Probamos luego si los efectos in vitro de la activación Ror2 y la inhibición 14-3-3ß traducida dentro de la formación ósea incrementada en cultivos de órganos ex vivo. Huesos de cráneo de 4 días de ratones viejos se infectan con adenovirus que contiene shARN mezclado o shARN 14-3-3ß especifico en 5X107 partículas vilares/ml; y 48 h después de tratan con 12 g/ml de anticuerpo anti-Ror2 o IgG no especifico en presencia de 15 pg/ml de calceina. Después de 7 días de cultivo con adenovirus y anticuerpos, los huesos se tiñen con hematoxilina-eosina y son consistentes con estiramientos de 300 µ?t? (450 µ?? lejos de la sutura frontal) se someten a análisis histomorfométrico utilizando bioquant-NOVA MR 5.50.8 (Nashville, TN). Bajo condiciones de control de infección de shANR mezclado y tratamiento IgG, 600 Mm de longitud de cráneo contiene 9394± 1333 im2 de área ósea y 39.5±7.4 osteoblastos. La inhibición del 14-3-3ß por shARN específico origina 60% de incremento en el área toral de hueso y 50% de incremento en el número de osteoblastos, lo que indica que la proteína 14-3-3ß inhibe los conteos de osteoblastos y/o la actividad (Figura 1 1 ). El tratamiento de huesos de cráneo con anticuerpo anti-Ror2 resulta en incremento del 85% en el numero de osteoblastos y 50% de incremento en el área ósea total, una vez de nuevo sugiere que una activación del anticuerpo Ror2 puede suministrar terapias efectivas para osteoporosis y otras enfermedades óseas. Sin embargo, la combinación de la infección de shARN 14-3-3ß con el tratamiento de anticuerpo Ror2 no produce un efecto aditivo, lo que resulta en una respuesta ligeramente pequeña comparada con el tratamiento solo (Figura 1 1 ). En razón a nuestra experiencia los incrementos observados del 50-80% no alcanzan saturación en este sistema de ensayo, se especula que Ror2 y 14-3-3ß están en la misma ruta que controla la diferenciación y/o función de los osteoblastos.

EJEMPLO 9 Desarrollo de Ensayo de Alta Sensibilidad, Rendimiento para Actividad Ror2 Como se muestra en la Figura 12A, el ensayo utiliza la ruta de señalización del receptor de TrkB bien caracterizada. El receptor TrkB se activa por homo-dimerización inducida por ligando que originan fosforilación de Erk y estimulación del elemento de respuesta Camp (CRE) en el promotor de genes objetivo. Generamos un receptor quimérico que consiste del domino extracelular de Ror2 (aa 1-407) fusionado a los dominios de transmembrana e intracelulares del TrkB (aa 432-822). Hacemos la hipótesis de que cuando se utiliza esta quimera, los agentes que originan la dimerización del Ror2 activaran la ruta de señalización TrkB y resultara en incrementos en la actividad promotora CRE. Para probar esta hipótesis, el receptor quimérico se transfecta establemente dentro de las células HEK293A que sobre expresan el plásmido CRE-liciferasa (HEK-CRE) obtenido del doctor Seungeun Cho (wyeth Research, Princeton, NJ). La quimera Ror2-TrKB en pcADN3.1 (+)-higro se eletropora en las células HEK-CRE utilizando el eletroporador ECM 600 (BTX, San Diego, CA) y se hacen crecer las células con 350 g/ml higromicina hasta que se forman colonias aisladas de células resistentes a la higromicina. Las colonias se tripsinizan y se transfiere una por pozo a placas de 96 pozos. Las colonias se hacen crecer a 37°C Mg/ml de higromicina y los niveles de expresión Ror2-TrkB se evalúan mediante inmunotransferencia western e inmunocitoquímica. Las células HER-CRE que expresan la quimera Ror2-TrkB se tratan con anticuerpos anti-Ror2 que se ha mostrado previamente para dimerizar Ror2 (ver ejemplo 5). Como se muestra en la Figura 12, el anticuerpo Ror2-especifico origina un incremento robusto dependiente de la dosis en la actividad luciferasa observada cuando se compara con células tratada con IgG no específico. Así hemos desarrollado un ensayo altamente sensible y de alto rendimiento para medir la capacidad de agentes (que incluye, pero no se limitan a, moléculas pequeñas, péptidos, proteínas, o anticuerpos) para inducir activación y dimerización de Ror2.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar o prevenir un trastorno relacionado con los huesos que comprende administrar a un sujeto con un trastorno relacionado con los huesos una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente capaz de activar la proteína Ror2.

2. El método de la reivindicación 1 , en donde el trastorno relacionado con los huesos se asocia con pérdida ósea.

3. El método de la reivindicación 1 , en donde el trastorno se selecciona del grupo que consiste de osteoporosis, cáncer de hueso, artritis, raquitismo, fractura ósea, enfermedad periodontal, defectos óseo segmentarios, enfermedad osteolítica ósea, hiperparatiroidismo primario y secundario, enfermedad de Paget, osteomalacia, e hiperostosis.

4. El método de la reivindicación 1 , en donde el sujeto es humano.

5. El método de la reivindicación 1 , en donde en donde el agente origina la dimerización de la proteína Ror2.

6. El método de la reivindicación 1 , en donde el agente es una molécula pequeña.

7. El método de la reivindicación 1 , en donde el agente es una proteína.

8. El método de la reivindicación 1 , en donde el agente comprende un anticuerpo dirigido a la proteína Ror2.

9. El método de la reivindicación 1 , en donde el agente comprende un anticuerpo monoclonal dirigido a la proteína Ror2.

10. El método de la reivindicación 1 , en donde el agente es un humano o anticuerpo monoclonal humanizado dirigido a Ror2.

11. El método de la reivindicación 8,9 o 10, en donde el anticuerpo es del isotipo IgG.

12. El método de la reivindicación 1 , en donde el agente comprende un fragmento de anticuerpo dirigido a la proteína Ror2.

13. El método de la reivindicación 1 , en donde el agente comprende un fragmento Fab dirigido a la proteína Ror2.

14. El método de la reivindicación 1 , en donde el agente comprende por lo menos dos fragmentos de anticuerpo dirigidos a la proteína Ror2, en donde los fragmentos de anticuerpo se ligan covalentemente.

15. El método de la reivindicación 1 , en donde el agente se administra parenteralmente.

16. El método de la reivindicación 1 , en donde en donde el agente se administra intravenosamente.

17. El método de la reivindicación 1 , en donde el agente se administra oralmente.

18. Un método para incrementar la diferenciación de osteoblasto que comprende poner en contacto células que expresan Ror2 con un agente capaz de activar el Ror2.

19. El método de la reivindicación 18, en donde el agente es una proteína

20. El método de la reivindicación 18, en donde el agente es una molécula pequeña.

21. El método de la reivindicación 18, en donde el agente es un anticuerpo.

22. El método de la reivindicación 21 , en donde el agente es un anticuerpo dirigido a la proteína Ror2.

23. El método de la reivindicación 18, en donde el agente origina la dimerización de la proteína Ror2.

24. El método de la reivindicación 18, en donde el agente incrementa la fosforilación del 14-3-3ß mediante la proteína Ror2.

25. El método de la reivindicación 18, en donde las células son células humanas,

26. El método de la reivindicación 18, en donde las células son células madre.

27. El método de la reivindicación 18, en donde las células son células madre mesenquimales.

28. El método de la reivindicación 18, en donde la etapa de poner en contacto se desarrolla ex vivo.

29. El método de la reivindicación 18, en donde la etapa de poner en contacto se desarrolla in vivo.

30. Un método para inhibir la diferenciación adipogénica que comprende poner en contacto una célula con un agente que incrementa la expresión o actividad de la proteína Ror2.

31. Un método de selección de un agente que incrementa la actividad del Ror2 que comprende las etapas de: poner en contacto células que expresan la proteína Ror2 con un agente de prueba; y determinar si se incrementa la actividad Ror2.

32. El método de la reivindicación 31 , en donde Ror2 es el dominio celular de Ror2.

33. El método de la reivindicación 31 , en donde el Ror2 es el dominio cinasa de Ror2.

34. El método de la reivindicación 31 , en donde la etapa de determinación comprende evaluar la actividad cinasa de la proteína Ror2.

35. El método de la reivindicación 34, en donde la etapa de evaluación de la actividad cinasa de la proteína Ror2 comprende evaluar el estado de fosforilación de la proteína Ror2.

36. El método de la reivindicación 31 , en donde la etapa de determinación comprende evaluar los niveles de expresión de la proteína Ror2 o del polinucleótido

37. El método de la reivindicación 31 , en donde la etapa de determinación comprende evaluar el estado de fosforilación de la proteína 14-3-3ß.

38. El método de la reivindicación 31 , en donde la etapa de determinación comprende determinar el nivel de formación de la matriz mineralizada.

39. Un agente identificado por el método de la reivindicación 31.

40. Un anticuerpo dirigido a Ror2, por lo que el anticuerpo origina la activación de la proteína Ror2.

41. El anticuerpo de la reivindicación 40, en donde el anticuerpo origina la dimerización de la proteína Ror2.

42. El anticuerpo de la reivindicación 40, en donde el anticuerpo es policlonal.

43. El anticuerpo de la reivindicación 40, en donde el anticuerpo es monoclonal.

44. El anticuerpo de la reivindicación 40, en donde el anticuerpo es humano.

45. El anticuerpo de la reivindicación 40, en donde el anticuerpo es humanizado.

46. El anticuerpo de la reivindicación 40, en donde el anticuerpo es del isotipo IgG.

47. El anticuerpo de la reivindicación 40, en donde el anticuerpo comprende un fragmento de anticuerpo.

48. El anticuerpo de la reivindicación 40, en donde el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab.

49. El anticuerpo de la reivindicación 40, en donde el anticuerpo tiene por lo menos dos sitios de unión para la proteína Ror2.

50. El anticuerpo de la reivindicación 40, en donde el anticuerpo tiene exactamente dos sitios de unión para la proteína Ror2.

51. Un método para tratar o prevenir un trastorno relacionado con los huesos que comprende administrar a un sujeto con un trastorno relacionado con los huesos una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente capaz de inhibir la actividad 14-3-3ß.

52. El método de la reivindicación 51 , en donde el agente regula por disminución la expresión 14-3-3ß.

53. El método de la reivindicación 51 , en donde el agente es un siARN o shARN específico a 14-3-3ß.

54. Un método para identificar agentes que promueven la dimerización de la proteína Ror2, el método comprende las etapas de: suministrar una célula que expresa un receptor quimérico que incluye el dominio extracelular del Ror2 y el dominio intracelular del TrkB, en donde la célula comprende una construcción de gen indicador ¡gado operablemente a un promotor de elemento de respuesta cAMP (CRE); poner en contacto la célula con un agente de prueba; y determinar el nivel de expresión del gen indicador en la célula.

55. El método de la reivindicación 54, en donde el gen indicador es luciferasa.

56. El método de la reivindicación 54, en donde la célula comprende un plásmido que incluye un gen que codifica la luciferasa ligado operablemente al promotor CRE.

57. Una proteína de secuencia de aminoácido: MARGSALPRRPLLCIPAVWAAAALLLSVSRTSGEVEVLDPNDPLGPLD GQDGPIPTL GYFLNFLEPV ITIVQGQTAILHCI VAGNPPPNVRWLK DAPVVQEPRRIIIR TEYGSRUUQDU>TTD^ TGVLFVRLGPTHSPNHNFQDDYHEDGFCQPYRGIACARF1GNRTIYVD SLQM(^EIE>miTAAITTvnGTSTHLSDQCSQFAIPSFCHFVFPLCDARSR APKPRELCRDECEVLESDIXIRQEYTIARSNPLILMRLQLPKCEALPMPE SPDAANCMRIGIPAERLGRYHQCY GSGMDYRGTASTT SGHQCQPW ALQHPHSHHLSSTDFPELGGGHAYCRNPGGQMEGPWCFTQNKNVRM ELCDWSCSPRDSSKMGILYlsvyavvvÍasvvgfc-^^ dddsaspl hisngsntpssseggpdaviigmtki^ gafgkvflaecyidcpeqdldlvavl tlkdasdnairkdfhivaelftnlqhe yrokhgdlnkflrahgpdavlmaegnppteltqsqml^ vkígdfgmsitivystdyyivgghtmlpirwm i ev¡ ;itqgrvlqrprtcpqevyelnilgcwqre ph mrknikgíhtllqnlakaspvyldilg (SEQ ID NO: 4); o una secuencia de aminoácido por lo menos 90% homologa a la SEQ ID NO: 4. La proteína de la reivindicación 57, en donde la secuencia de aminoácido es: MARGSALPRRPLLCIPAVWAAAALLLSVSRTSOEVEVLDPNDPLGPLD GQDGPIPTLKGYFLNFLEPVWITIVQGQ^ NDAPVVQEPRRIIIR TEYGSRLRIQDLDTTDTGYYQCVATNG KTITA TGVLFVRLGPTHSPNHNFQDDYHEDGFCQPYRGIACARFIGNRTIYVD SLQMQGEIENRÍTAAFTMIGTSTHLSDQCSQFAIPSFCHFVFPLCDARSR APKPRELC DECEVLESDL^RQEYTLARSNPLILMRLQLP CEALPNfPE SPPAANC ^G-PAERLGRYHC^YNGSGMDYRGTASTT SGHQCQPW ALQHPHSHHl^STDFPELG K}HAYCRNPGGQMEGPWCFTO^ ELCDWSCSPRDSSKMGILY-Svya>^iaswgfcllvmlfllklar skfgmkgpasvi5^ dddsasplhhisngsn^ssscggpdaviigmtkipvienpqy^^ gafgkvflaccyrücpeqdkilvavktlkdasdnaikdfhxeaellmlqhehivkfy ymkhgdlnkflj^gpdavlmaegnppte^sqmlh vkigdfgmsrdvysldyyrvgghtmlpirwmppesimy^^ nneviecitqgrvlqrprtcpqevyclinlgcwqreph mrknikgihtllqnlakaspvyldüg (SEQ ID NO: 4); o una secuencia de aminoácido por lo menos 95% homologa a ja SEQ ID NO: 4. La proteína de la reivindicación 57, en donde la secuencia de aminoácido es: MARGSALPRRPLLCIPAVWAAAALLLSVSRTSGEVEVLDPNDPLOPH) GQDGPIPTL GYFLOTLEPVhíNITIVQGQTAILHCKVAGNPPPNVRWLK ND AP WQEPRRJMR TE YGSRLRIQDLDTTDTGYYQCV ATNGMICnTA TGVLFVRLGPTHSPNH FQDDYHEDGFCQPYRGTACARFIGNRnYVD SLQMQGEIE RTTAAITTdlGTSmLSIXÍCSQFAIPSPCHFVFPLCDA^ APKPRELCRDECEVLESDLCRQEYTTARS PLILMRLQLPKCEALPMPE SPDAANCMRJG1PAERLGRYHQCYNGSGMDYRGTASTTKSGHQCQPW ALQHPHSHHLSSTDFPELGGOHA YCR POGQMEGPWCFTQNK VR ELCDVPSCSPRDSSKMGILYIsvyavvviasvvgfcllYmlfUW^ dddsa^lhhisngsntpssseggpdaviigmtki^ g^gkvflaecynlcpeqdkilvavktlkdas to^ vkigdfgmsidvyírtdyyrvgghtmlpú nneviecitqgrvlqrprtcpqevyelmlgcwqreph mrknikgihtllqnlakaspvylílilg (SEQ ID NO: 4).