TW200402424A

TW200402424A - A novel G protein-coupled purinergic receptor, GAVE17

Info

Publication number: TW200402424A
Application number: TW092108056A
Authority: TW
Inventors: Haifeng Eishingdrelo; Theresa Kuntzweiler; Paul Weissensee; Jidong Cai; Johann Gassenhuber
Original assignee: Aventis Pharma Inc
Priority date: 2002-04-10
Filing date: 2003-04-09
Publication date: 2004-02-16
Also published as: AR039284A1; US20030215878A1; GB0226102D0

Description

200402424 A7 B7 五、發明說明（！） ' 〜- 發明背景 ^蛋自偶較體(GPCR)為參與細齡_導的一個大 =整口膜蛋白家族。GPCR對多種胞外信號作出反應所，號包括神經遞質、激素、有味物質和光，且能夠轉導 =號以啟動胞内的第二信使反應。許多治療藥物靶向 gpcR’這是因為這些受體介導了廣泛的生理反應包括炎症、i管舒張、轉、支氣管舰、内分泌和螺動。、GPCR以胞外結構域、七個跨膜結構域和胞内結構域為特徵。受體執行的一些功能，如與配體結合及與G蛋白 1〇的相互作用，與關鍵部位存在的某些胺基酸有關\GPCR 包括視紫紅質家族、分泌/胰高血糖素家族、谷氨酸家族和資訊素家族。例如，多種研究已經證實，GpCR中胺基酸序列的差異是導致其對天然配體、小分子激動劑或拮抗劑的親和力差異的原因。換言之，序列的微小差異就可造 15成結合親和力和活性差異。（例如參見，Meng等，生物化經濟部智慧財產局員工消費合作社印製學雜誌(J Bio Chem) (1996) 271(50):32016-20 ; Burd 等，生物化學雜誌(J Bio Chem) (1998) 273(51):34488_95;和 Hurley 等，J Neurochem (1999) 72(1)··413-21)。特別是，研究已表明’第三胞内結構域中的胺基酸序列差異可導致不同的活 20 性。Myburgh等發現促性腺激素釋放激素的受體的胞内第三個環的261位丙氨酸對G蛋白偶聯和受體的内在化至關重要（生物化學雜誌(Biochem J) (1998) 331 (第3部分):893-6)。Wonerow等研究了促甲狀腺素受體，並證明第三胞内環中的缺失導致了組成型受體活性（生物化學雜誌（J Bio ϊδί 杢纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 92162a 200402424 Α7 Β7 五、發明說明（2)

Chem) (1998) 273(14):7900-5)。通常，内源配體與受體的結合作用將導致受體的胞内結構域構象發生改變，此改變使得此胞内結構域可以和胞内成分（一種G蛋白）發生偶聯。存在有幾種g蛋白， 5 如 Gq、Gs、Gi、Gz 和 G。（如參見，Dessauer 等，Clin Sci (Colch) (1996) 91(5):527-37)。受體的 IC-3 環以及叛基端與G蛋白相互作用（Pauwels等，分子神經生物學（Mol

Neurobiol) (1998) 17(1-3):109-135 和 Wonerow 等，同上）〇一些GPCR相對G蛋白而言是“混雜的”，即一種GPCR 10 可與一種以上的G蛋白相互作用（如參見Kenakin，生命科學(Life Sciences) (1988) 43:1095)。配體啟動的GPCR與G蛋白偶聯將起始信號級聯過程 (稱為“信號轉導”）。此信號轉導最終導致細胞啟動或細胞抑制。 15 GpCR存在於細胞膜中，在兩種不同的構象之間保持經濟部智慧財產局員工消費合作社印製平衡，所述構象為“失活的”和“活性的，，狀態。處於失活狀態的受體不能連結胞内信號轉導通路以產生生物反應 (存在例外情況，如在轉導的細胞中受體過度表現時，如參見，mwxreighton.edu/Pharmacoln^y/inverse.htm.) 〇將 20構象調整到活性狀態後可允許連結轉導通路（通過G蛋白）並產生生物反應。激動劑結合後造成活性構象有大得多的可能性出現。但有時，如果在缺乏任何激動劑時受體已存在相當大的反應’則此類受體被έ忍為具有組成型活性（即，已處於活性 -4- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規‘（210x297公爱了經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 200402424 Α7 Β7 五、發明說明（3) 構象或不依賴配體的或自主的活性狀態）。當將激動劑加入此系統時，可例行觀察到增強的反應。然而，當加入經典拮抗劑時，其與此類分子的結合並不產生作用。另一方面，某些拮抗劑可引起受體組成型活 5 性的抑制，這提示後一類藥物在技術上並非拮抗劑，而是具有負的内在活性的激動劑。這些藥物被稱為反向激動劑 (inverse agonisOwwwxreighton.edu/Pharmacology/inverse.htm. ° 傳統受體研究的進行基於這樣的假設，即在發現受體前，首先鑑定出内源配體可促進拮抗劑和其他受體效應分 10 子的鑑定。甚至當拮抗劑已被首先發現時，教條的反應仍是鑑定内源配體(WO 00/22131)。但是，由於活性狀態對於試驗篩選目的最有用，故獲得此類組成型受體（特別是 GPCR)將在缺乏有關内源配體的資訊時，使得激動劑、部分激動劑、反向激動劑和拮抗劑的分離變得容易。此 15 外，在受體活性紊亂導致的疾病中，抑制組成型活性的藥物，或更具體地，減小有效啟動受體濃度的藥物可通過應用處於自主活性狀態的受體進行試驗而得以更容易地發現。例如，當受體可轉染到患者中以治療疾病時，此受體的活性可用該試驗發現的反向激動劑進行精細調節。 20 諸如哮喘、節段性回腸炎、癌症、多發性硬化和類風濕性關節炎(RA)等疾病一般被認為具有細胞和免疫學病因。目前利用皮質類固醇實行的抗炎療法對哮喘是有效的，但伴有代謝及内分泌副作用。可由肺或鼻粘膜吸收的吸入製劑也可能出現同樣的情況。目前仍缺乏用於r A、紙張尺度週用Y國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐）

BnBo

200402424 A7 發明說明（4) 節段性回腸炎和類似疾病的滿意口服治療方法。鑒於GPCR在疾病t的_以及通過娜Gpc 5 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 能夠治療疾病這H對先前未知的GpcR進行鐘定和表徵將為開韻雜合物以轉GpcR活性的疾病狀態提供條件。令興本發明鑑定和表徵了一種新型GPCR，即GAVE17 表現、，並提供了制此發現鑑定和治療相_病的組合物和方法。GAVE17在淋巴組織中表現，如外周白細胞、單核細胞、脾細胞、腦和脾。GAVE17對核苷酸（且特別是 ATP)具有親和力，並可能為核苷酸受體ρ2γ家族中的一個成員。在NIH 3Τ3細胞中表現的GAVE 17與Gq蛋白相互作用。發明概述本發明涉及一種新鑑定的G蛋白偶聯受體，此處稱為 GAVE17 〇在一個實施方案中，GAVE17衍生自無内含子的結構基因，該基因編碼SEQ ID NO:2中所示的約333 個胺基酸。在一相關的方面，考慮SEQ ID ΝΟ··1中所示的多核苷酸。在另一方面，本發明涉及選自以下的分離的核酸：編碼具有SEQ ID ΝΟ:2中所示胺基酸的脊椎動物蛋白質、及保留GAVE17活性的該蛋白質的變體、突變體和片段的分離核酸：以及包含SEQ ID N〇:l中所示的核苷酸序列、其編碼具有GAVE17活性的多肽的變體、突變體和片段的分 -6** 本紙張尺度適用中晒家標準(CNS)A4規格（21Gx297公£7 200402424 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（5) 離核酸。此外，本發明涉及可與SEQ ID N〇:1結合的核酸雜交探針和互補片段，或可與編碼SEQ ID NO:2中所示胺基酸序列的核酸結合的雜交探針和互補片段。此外，本發明還涉及與SEQ ID ΝΟ:1有約30%到約99%—致性的核 5酸，包括與編碼SEQ ID NO:2中所示胺基酸序列的分離核酸具有約30%到約99% —致性的核酸。在一相關的方面，此寡核苷酸包含至少8個核苷酸，且雜交方法預期包括步驟··使互補寡核苷酸與核酸或其基本等價物在允許互補物與核酸雜交的條件下進行接觸，所述核酸包含SEQIDNO:l所示的核苷酸。此外’互補片段可作為反義寡核苷酸用於體内和體外抑制GAVE17表現的方法中。該方法可包括如下步驟：提供由SEQ ID ΝΟ:1中所示核苷酸的互補物組成的寡核苷酸序列，提供含有如下mRNA的人類細胞，所述mRNA包含SEQ ID ΝΟ:1中所示的核苷酸序列，以及將該募核苷酸導入細胞，細胞中GAVE17的表現由此將通過一些機制被抑制’所述機制包括抑制轉譯、形成三股螺旋和/或活化核酸酶導致胞内mRNA降解。本發明還涉及選自如下的分離的多肽：具有SEQ NO:2中所示的胺基酸序列的純化多肽、其變體、突變_ 和片段；以及提供GAVE17的功能性質的具有額外胺基酸殘基的純化多肽。結構域的片段是有益的。本發明還涉及與表現控制元件可操作地連接的核酸，包括含有所述分離核酸的載體。本發明還涉及經轉染或轉 10 15 20 ID 體參計線 200402424 A7 B7 五、發明說明（6) 形含有本發明核酸的培養細胞。本發明還涉及用於製備多肽的方法，包括步驟：培養含本發明核酸的轉形細胞、允终在表現控制元件下進行表現，以及從細胞或細胞培養基中純化多肽。 5 本發明再一方面包括可與本發明的多肽結合的分離抗體，所述抗體包括早株和多株抗體。此外，在一相關的方面，公開了生產抗體的方法和應用與GAVE17結合的抗體治療GAVE17相關疾病的方法。抗體也可用於鑑定在無結合配體時能活化GAVE17的分子。 10 本發明再一方面包括用於診斷目的以確定生物和/或組織樣本中是否存在GAVE17的方法。在本發明另一方面，公開了用於調整GAVE17信號轉導的治療方法，包括向需要其的患者施用肽、激動劑、拮抗劑、反向激動劑和 /或抗體。 15 在本發明另一方面，公開了用於鑑定GAVE17的調節經濟部智慧財產局員工消費合作社劑的方法，包括㈣：提供化學部分，提絲現g細口的細胞和判定化學部分是否調節GAVE17的信號活性，包括在内源配體存在或不存在的條件下該調節作用是否發生。在一相關的方面，化學部分可包括但不限於，肽、抗 20體、激動劑、反向激動劑和拮抗劑。几在另-方面’本發明描述了用於判定候選化合物是否為反向激動劑的方法，其中所述候選化合物在缺乏内源配體、經典激動劑或經典拮抗劑的條件下接觸組成型受體，此組成型活性將被反向激動劑抑制。

200402424 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（7) 本發明另一方面包括治療組合物，其中該組合物包括核酸、抗體、多肽、激動劑、反向激動劑和拮抗劑。此外，本發明的方法也包括通過向需要其的患者施用該治療組合物來治療疾病狀態，以及調節GAVE17信號活性的方 5 法。本發明的這些和其他方面將參考以下的詳細描述和附圖得以彰顯。此外，以下列出的各種參考文獻更為詳細地描述了某些程式和組合物。特此每一參考文獻均在此引入作為參考就如同一一指明進行引入一樣。 10 附圖簡述圖 1 為 hGAVE17 的 DNA 序列（SEQIDNO:l)。圖2為hGAVE17的胺基酸序列(SEQIDNO:2)。圖3 (a-d)為一激動劑試驗結果的圖表顯示，該試驗在 15 以下進行描述，其應用了 FLIPR和經含SEQ ID ΝΟ:1的 PEAK8表現載體轉染的NIH313細胞系。ATP (圖3a)、 ADP (圖3b)、UTP (圖3c)和UDP (圖3d)顯示有激動劑活性。在圖3 a-d中，X轴為所檢測的激動劑的摩爾濃度的 log值，且y軸為FLIPR單位。 20 圖4 (a和b)為激動劑试驗結果的圖表顯示，試驗在以下進行描述，其應用了 FLIPR和經含SEQ ID N0:1的 PEAK8表現載體轉染的HEK293T (PSC)細胞系。2-曱硫基，ATP (2meS-ATP)(圖 4a)和 2-疏基 ADP (2S-ADP)(圖 4b) 顯示有激動劑活性。圖4a和4b中，X軸為所檢測的激動 -9· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公楚）

200402424 A7 B7 五、發明說明（8) 劑的摩爾濃度的l〇g值，且y軸為FLIpR單位。發明詳述本發明基於對編碼人GAVE17 (hGAVE17)的cDNA分 5子的發現，該分子是與核苷酸受體類似的G蛋白偶聯受體超豕族中的一個成員。此處應用的術語激動劑”指與受體結合時能啟動胞内反應或促進GTP與膜結合的部分（例如，但不限於配體和候選化合物）。 1〇此處應用的術語“部分激動劑”是指這樣的部分（例如，但不限於配體和候選化合物），其與受體結合時啟動細胞反應的程度/範圍比激動劑所引起的小，或促進與膜結合的程度/範圍比激動劑所引起的小。此處應用的術語“拮抗劑”指在同一位點上與激動劑 15競爭結合受體的部分（例如，但不限於配體和候選化合物）。但是，拮抗劑並不活化由受體的活性形式啟動的胞内反應，並由此可抑制激動劑和部分激動劑引起的胞内反經濟部智慧財產局員工消費合作社印製應。在一相關的方面，拮抗劑在缺乏激動劑或部分激動劑時並不降低基線胞内反應。 2〇此處應用的術語“候選化合物，，是指易接受筛選技術處理的部分（例如，但不限於化學化合物）。在—個實施方案中，此術語不包括公知屬於選自以下的化合物的化人物：激動劑、部分激動劑、反向激動劑或拮抗劑。那此化合物是通過傳統的藥物開發方法鑑定的，所述方法涉&為 -10-

200402424 A7 B7 五、發明說明（9) 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 體特異的内源配體的鑑定和/或拮抗受體的候選化合物的篩選，其中此篩選需用競爭試驗來評估功效。此處應用的術語“組成型啟動的受體，，或“自主啟動的受體”可互換，指在缺乏配體時啟動的受體。在一相關的方面，此組成型活性受體可為内源或非内源的；即，可通過重組方法修飾GPCR以產生野生型 GPCR的組成型突變形式（例如，見EP 1071701、WO 00 /22129、WO 00/22131，以及美國專利 Nos· 6，150,393 和6，140,509，在此並入作為參考）。此處的術語“組成型受體啟動”指通過非受體與内源配體或其化學等價物結合的方式使受體穩定在活性狀態。此處的術語“反向激動劑”指能與組成型活性受體結合並抑制基線胞内反應的部分（例如，但不限於配體和候選化合物）。基線反應由受體的活性形式啟動，低於在缺乏激動劑、部分激動劑時觀察到的正常基礎活性量，或減少的GTP與膜的結合。此處的術語配體指能結合另一分子的部分，其中所述部分為，例如但不限於，激素或神經遞質，且進一步地所述部分以立體選擇性方式結合受體。例如，配體可為在動物中天然與GPCR嚙合的分子。能與GPCR結合引起反應的各種實體可與配體為競爭性或非競爭性關係。術語“家族”，當指本發明的蛋白質和核酸分子時，意指這樣的兩種或多種蛋白質或核酸分子，這些分子具有 .11. 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐）計線 200402424 A7 B7 五、發明說明（10) 看上去共同的結構域並具有充分的胺基酸或核苷酸序列一致性（見本文定義）。該家族成員可天然存在，且可來自同一或不同的物種。例如，一個家族可包含人類來源的第一種蛋白質和鼠類來源的該蛋白質的同系物 5 (homol〇gue)，以及人類來源的第二種不同蛋白質和鼠類來源的該第二種蛋白質的同系物。家族的成員也可具有共同的功能特徵。編碼人GAVE17蛋白質的核苷酸序列在圖1 (SEq ID NQ:1)中顯示。GAVE17蛋白質的胺基酸序列在圖1 (SEQ 10 IDNO:2)中顯示。圖1 (SEQ ID ΝΟ:1)的GAVE17 cDNA編碼一種無内含子的蛋白質，長度為約333個胺基酸，分子量為約34 kD 〇用Northern印潰試驗，約5 kb的GAVE17的mRNA 15 轉錄本在某些組織中表現。Northern印潰結果表明主要在白細胞、單核細胞、樹突細胞前體、巨噬細胞前體、骨趙和脾細胞中檢測出GAVE17的表現。GAVE17也在腦、肝、肺、脊髓、小腸、胎盤和胸腺中表現。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 GAVE17存在於多種免疫系統細胞，包括抗原呈遞細 20 胞中，這表明其在免疫功能中具有重要的作用，所述免疫功能為如炎症、哮喘、過敏症、類風濕性關節炎、多發性硬化、對病原體的低反應性等。 GAVE17的配體為核苷酸和核苷酸衍生物。例如， ATP、UTP、UDP、ADP 和 GDP 啟動 GAVE17 〇在轉形的 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） O i ·> 200402424 A7 B7 五、發明說明（11)

NIH 3T3細胞中其對ATP的親和力為8〇〇 nM、對UTP為 6·9 μΜ、對 UDP 為 1〇 μΜ、對 ADP 為 26 μΜ 且對 GDP 為 65 μΜ 〇在一個實施方案中，GAVE17蛋白質包含如下第三胞 5内環結構域’該結構域與具有GAVE17活性的SEQ ID NO:2的第三胞内環結構域具有至少約65%，優選至少約 75%，且更優選約85%、95%、98%或100%的胺基酸序列一致性。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製此處的術語“等價胺基酸殘基，，指當兩段或更多的序 10列比對用於分析時，在蛋白質序列中佔據基本上同一位置的胺基酸。本發明優選的GAVE17多肽具有與SEQ ID NO:2的第三胞内環結構域的胺基酸序列充分相同的胺基酸序列。此處應用的術語“充分相同，，是指第一胺基酸或核苷酸序列含有足夠或最小數目的與第二胺基酸或核苷酸 15 序列相同或相當（例如，具有類似的側鏈）的胺基酸殘基或核苷酸。此第一和第二胺基酸或核苷酸序列具有共同的結構域和/或共同的功能活性。例如，包含如下共同結構域的胺基酸或核苷酸序列在此處被定義為充分相同，所述結構域與GAVE17活性具有約55%的一致性，優選65%的 20 一致性，更優選75%、85%、95%或98%的一致性。其他目的結構域包括，但不限於，跨膜(TM)結構域 (TM1從約第24位到約49位胺基酸殘基；TM2從約第59 位到約80位胺基酸殘基；TM3從約第100位到約118位胺基酸殘基；TM4從約第141位到約160位胺基酸殘基； -13- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200402424 A7 B7 五、發明說明（12) TM5從約第191位到約211位胺基酸殘基；TM6從約第 236位到約255位胺基酸殘基；且TM7從約第281位到約 299位胺基酸殘基，見SEQ ID ΝΟ··2中所示）、細胞質（胞内的）（1C)結構域(IC1從約第50位到約58位胺基酸殘 5基；IC2從約第119位到約140位胺基酸殘基；IC3從約第212位到約235位胺基酸殘基；且IC4從約第300位胺基酸到末端，見SEQ ID ΝΟ:2中所示）以及胞外(EC)結構域(EC1從約第1位到約23位胺基酸殘基；EC2從約第81 位到約99位胺基酸殘基；EC3從約161位到約190位胺 10基酸；且EC4從約第256位到約280位胺基酸殘基，見 SEQIDNO:2中所示）。在一相關的方面，目的結構域也包括，但不限於，共有糖基化位點（如N-連接的糖基化位點）、脂結合位點和鱗酸化位點（如通過蛋白激酶C或蛋白激酶A)。 15 “GAVE17活性”、“GAVE17的生物活性，，或經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 “GAVE17的功能活性”在本文中可互換應用，指由 GAVE17蛋白質、多肽或核酸分子對GAVE17效應細胞施加的活性’這可以根據標準技術在體内或體外測定。 GAVE17活性可為直接活性，如與第二蛋白質的結合或斜 20第二蛋白質的酶促活性，或為間接活性，如由GAVE17蛋白質和第二蛋白質相互作用而介導的細胞信號轉導活性。在一優選的實施方案中，GAVE17活性包括至少一個或多個以下的活性：⑴與GAVE17信號途徑中的蛋白質相互作用的能力；（ii)與GAVE17配體，即核苷酸相互作用的能 -14- 本紙張尺度通用T國圏豕稞準(CNS)A4規格（210x297公釐） ?17 200402424 A7 B7 五、發明說明（13) 力；以及(iii)與胞内靶蛋白相互作用的能力。一個此類相互作用可以是與陽離子門控通道的相互作用。因此’本發明另一實施方案描述了具有GAVE17活性的分離的GAVE17蛋白質和多肽。 5 本發明的各種方面在以下的部分中進一步詳細描述。分離的核酸分子

本發明的一個方面涉及編碼GAVE17蛋白質或其生物 10活性部分的分離的核酸分子。此核酸分子或其部分足以用作雜交探針以鑑定編碼GAVE17-的核酸（例如，GAVE17 mRNA)。適當的核酸還可用作PCr引子用於GAVE17核酸分子的擴增或突變。如此處所用，術語“核酸分子，，意指包括DNA分子(例如，cdnA或基因組DNA)和RNA分子 15 (例如，mRNA)和應用核苷酸類似物產生的DNA或RNA 類似物。核酸分子可為單鏈或雙鏈，但優選地為雙鏈 DNA。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 “分離的”核酸分子是指與其天然來源中存在的其他核酸分子分離開的核酸分子。優選地，“分離的，，核酸不含有 20 天然在其來源的生物體的基因組DNA中位於編碼 GAVE17的核酸兩側的序列（即，位於該核酸y和31端的序列）。例如，由於GAVE17位於人類3號染色體長臂的 3q25.1區域，在各種實施方案中，分離的GAVE17核酸分子可含有少於約 5 kb、4 kb、3 kb、2 kb、1 kb、0.5 kb 或 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200402424 A7 B7 五、發明說明（14) 0.1 kb的如下核苷酸序列，所述核苷酸序列天然在所述核酸的來源細胞的基因組DNA中位於該核酸分子的兩側。此外’ ‘分離的’核酸分子，例如cDNA分子，當通過重組技術產生時，可基本不帶有其他細胞材料或培養基，或當 5其通過化學合成時可基本不帶有化學前體或其他化學物本發明的核酸分子，如具有SEQ ID ΝΟ:1核苷酸序列或該核苷酸序列的任一個片段或互補體的核酸分子，可應用標準的分子生物學技術以及此處提供的序列資訊進行分 10 離。用SEQ ID ΝΟ:1核酸序列的全部或部分作為雜交探針，GAVE17核酸分子可應用標準的雜交和選殖技術進行分離。（參見，如，Sambrook等，編，分子選殖：實驗指南（Molecular Cloning: A Laboratory Manual)，第二版， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 15 NY, 1989) 〇經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本發明的核酸分子可應用cDNA、mRNA或基因組 DNA作為模板並應用合適的寡核苷酸引子根據標準的 PCR擴增技術進行擴增。例如，該引子可包括，但不限於 5，-ATGAACACCACAGTGATGCAAG-3,（SEQ ID NO:3)和 20 5’_GCCTAAGGTTATGTTGTCTGTC-3’（SEQ ID NO: 4) 〇由此擴增的核酸可選殖於合適的載體中，並通過DNA序列分析進行表徵。此外，與GAVE17核苷酸序列相應的募核苷酸可通過標準的合成技術製備，例如，應用自動化 DNA合成儀合成。 -16- ^紙張尺度適用中國國家標準(⑶幻从規格（210x297公釐） 200402424 Α7 Β7 五、發明說明（ls) 在另一優選的實施方案中，本發明分離的核酸分子包含與SEQ ID N0:1中所示核苷酸序列或其GAVE17特異部分具有互補性的核酸分子。與給定核苷酸序列互補的核酸分子是指該分子與給定核苷酸序列充分互補以致可以與 5此給定的核苷酸序列雜交由此形成可分離或可檢測的雙鏈經濟部智慧財產局員工消費合作社印製此外’本發明的核酸分子可僅包含編碼GAVE17的核酸序列的一部分，例如，可用作探針或引子的片段或編碼 GAVE17生物活性部分的片段。例如，該片段可包括，但 10不限於’編碼如下結構域的區域：細胞外結構域、或結合核苷酸的結構域、或編碼SEQ ID NO:2中約第212位到約 235位胺基酸殘基的胞内結構域。由人GAVE17基因的選殖體所測定到的核苷酸序列使得可以製備探針和引子用於從其他細胞類型中（例如，其他組織）以及從其他哺乳動 15 物中鑑定和/或選殖GAVE17的同系物。探針/引子一般包含基本純化的寡核苷酸。該寡核苷酸一般包含如下核苷酸序列區域，該區域在嚴緊的條件下可以與SEQ ID NO: 1 或SEQ Π) NO: 1天然突變體的正義或反義序列中的至少約 12，優選約 25，更優選約 50、75、1〇〇、125、150、 20 175、200、250、300、350或400個連續核苷酸進行雜交。基於人類GAVE17核苷酸序列的探針可用於檢測編碼相似或相同蛋白質的轉錄本或基因組序列。該探針可包含與其相連的標記基團’例如’放射性同位素、螢光化合物、酶或酶輔因子。該探針可用作診斷試劑盒的一部分， -17- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） r W. Λ 匕u) ζ υ 200402424 A7 B7 五、發明說明（16) 以鑑定不能適當表現GAVE17蛋白質的細胞或組織。例如’這可通過測量來自患者的樣本細胞中編碼GAVE17的核酸的量（例如，檢測GAVE17 mRNA量）或測定基因組 GAVE17基因是否存在突變或缺失來完成。 5 編碼“GAVE17生物活性部分，，的核酸片段的製備可通過如下方式進行：分離SEQ ID ΝΟ:1中編碼具有GAVE17 生物活性的多肽的部分、表現此GAVE17蛋白質編碼部分 (例如’通過體外重組表現）以及評估此GAVE17編碼部分的活性。例如，編碼GAVE17生物活性部分的核酸片段 10包括第三胞内環結構域，例如，SEQ ID NO:2中所示的約第212位到約235位胺基酸殘基。本發明還包括由於遺傳密碼的簡併性而與SEQ ID ΝΟ:1中的核苷酸序列不同但由此與SEQ ID ΝΟ:1中所示核苷酸序列編碼相同的GAVE17 蛋白質的核酸分子。 15 除了在SEQ IDNO:l中所示的人類GAVE17核苷酸序經濟部智慧財產局員工消費合作社印製列外，本領域的技術人員將理解導致GAVE17胺基酸序列變化的DNA序列多態性可能在群體（例如，人類群體）中存在。GAVE17基因中的該遺傳多態性可由於天然等位基因變異在群體的個體中存在。等位基因是可替代出現於 20給定遺傳座位上的一組基因中一個。如此處所應用，術語基因和重組基因”指含編碼GAVE17蛋白質的開放閱讀框的核酸分子，所述蛋白質優選地為哺乳動物GAVE17蛋白質。如此處所應用，短語“等位基因變體，，指出現在 GAVE17座位上的核苷酸序列，或由此核苷酸序列編碼的 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公楚) 17 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 200402424 A7 B7 五、發明說明（夕肤。可替代出現的等位基因可通過對許多不同個體中的目的基因進行測序來鑑定。這可通過應用雜交探針在多個個體中鑑定同一遺傳位點來容易地進行。GAVE17中作為天然等位基因變異的結果且不影響GAVE17的功能活性的 5任何以及全部的此類核菩酸變化和其導致的胺基酸多態性或變化，都曰在包括在本發明的範圍之内。此外，編碼來自其他物種的GAVE17蛋白質(GAVE17 同系物）且核苷酸序列不同於人的GAVE17序列的核酸分子也旨在包括在本發明的範圍之内。相應于本發明的天然 10等位基因變體和GAVE17 dDNA的同系物的核酸分子可以基於與此處公開的人類GAVE17核酸的一致性，應用人 cDNA或其部分作為雜交探針根據標準的雜交技術在嚴緊的雜交條件下進行分離。因此’在另一實施方案中，本發明的分離的核酸分子 15 的長度為至少 300、325、350、375、400、425、450、 500、550、600、650、700、800、900、1000 或 1100 個核苷酸，且其在嚴緊的條件下與含SEQ ID ΝΟ:1或其互補體的核苷酸序列的核酸分子雜交，所述核苷酸序列優選地為編碼序列。 20 如此處所應用，術語“在嚴緊條件下雜交，，意在描述用於雜交和洗滌的條件，在此條件下，彼此至少55%、 60%、65%、70%且優選75%或更多地互補的核苷酸序列一般仍保持雜交狀態。該嚴緊的條件對本領域的技術人員是公知的’並可在以下文獻中查詢，即“Current Protocols -19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公爱）

200402424 A7 _ B7 五、發明說明（18) m Molecular Biology，，，J〇hn wiley & sons，Ν·Υ· (1989)， 6·3· 1-6.3.6。嚴緊雜交條件的一個優選的、非限制性實例為在6X氣化鈉/擰檬酸鈉（ssc)中約45它交，隨後在 0·2Χ SSC、0·1% SDS中在50-65。(：洗滌一或多次。優選 5地，在嚴緊的條件下與SEQ ID Ν0··1序列或其互補體雜交的本發明的分離核酸分子相應于天然存在的核酸分子。如此處所用’“天然存在，，的核酸分子是指具有自然界中存在的核苷酸序列(例如，編碼天然蛋白質）的RNA或DNA分子。本領域技術人員將理解，可根據序列特異性變數（例 10如，長度、G-C豐度等）對條件進行修正。如在本領域内所公知的，雜交條件可進行修正。本發明考慮包括如下GAVE17的核酸片段，所述片段可診斷具有類似特性的GAVE17樣分子。診斷片段可源自 GAVE17基因的任何部分，包括兩翼序列。片段可用作實 15踐已知方法的基因庫探針。片段可由已知的方法製備。除了可能存在于人群中的天然GAVE17序列等位基因變體外，本領域技術人員還將理解，可通過突變將變化導入SEQ ID ΝΟ:1的核苷酸序列中，由此導致編碼的經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 GAVE17蛋白質的胺基酸序列發生改變但不實質上改變 20 GAVE17蛋白質的生物活性。例如，可進行核苷酸替代，從而在“非必需，，的胺基酸殘基處引入胺基酸替代。“非必需，，胺基酸殘基為可以在 GAVE17的野生型序列（例如，SEq ID N〇:2的序列）中發生改變’但此改變基本上不影響生物活性的殘基。“必需，， •20- +紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇 X 297公楚） 200402424 A7

5 胺基酸殘基為基本生物活性所必需的殘基。例如，在不同物種的GAVE17中非保守或半保守的胺基酸殘基對活性而 δ可此疋非必需的’因此將可能成為改造的乾標。作為備選，在不同物種的GAVE17蛋白質中保守的胺基酸殘基對活性而言可能是必需的，因此將可能不成為改造的乾標。 10 因此，本發明的另一方面涉及編碼在活性非必需的胺基酸殘基處含有變化的GAVE17蛋白質的核酸分子。該 GAVE17蛋白質與SEQ ID ΝΟ:2在胺基酸序列上不同，但保留有生物活性。在一個實施方案中，分離的核酸分子包括編碼如下蛋白質的核苷酸序列，所述蛋白質含有與SEq ID NO:2的胺基酸序列至少約55%，65%、75%、85%、 95%、98%、99%或100%—致的胺基酸序列。 15 編碼具有不同於SEQ ID NO:2的序列的GAVE17蛋白質的分離核酸分子可通過如下方式進行製備··在SEq ID ΝΟ:1的核苷酸序列中導入一個或多個核苷酸替代、添加或缺失，以致將一個或多個胺基酸替代、添加或缺失導入編碼的蛋白質中。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製突變可由標準技術導入，例如定點誘突和PCR介導的誘突。優選保守胺基酸替代在一個或多個預測的非必需 20 胺基酸殘基處進行。“保守胺基酸替代”為一個胺基酸殘基被具有相似側鏈的胺基酸殘基替代。本領域内定義了具有相似側鏈的胺基酸殘基家族。這些家族包括具有驗性側鏈的胺基酸(例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸）、具有酸性側鏈的胺基酸(例如，天門冬氨酸和谷氨酸）、具有不帶電荷 •21- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNSM4規格（210 X 297公釐） 200402424 A7 B7 五、發明說明（2〇 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 極性側鏈的胺基酸(例如，甘氨酸、天門冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和半胱氨酸）、具有非極性側鏈的胺基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸）、具有分支側鏈的胺基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸和異亮氨酸)和具有芳香侧鍵的胺基酸(例如’絡氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和組氨酸）。這樣，預測的GAVE17中的非必需胺基酸殘基可以優選地被來自相同側鏈家族的另外胺基酸殘基替代。作為備選，突變可以沿所有或部分的GAVE17編碼序列隨機導入（例如通過飽和誘變），且產生的突變體可經 GAVE17生物活性篩選以鑑定出保留活性的突變體。誘變之後，可重組表現編碼的蛋白質，並可以測定蛋白質的活性。在一優選的實施方案中，可以分析突變GAVE17蛋白質：（1)與GAVE17信號轉導途徑中的蛋白質形成蛋白質·· 蛋白質相互作用的能力；（2)結合GAVE17配體的能力；或 (3)結合胞内把蛋白的能力。而在另一優選的實施方案中，對於突變GAVE17可以檢測其調整細胞增殖或細胞分化的能力。本發明包括反義核酸分子，即，與編碼蛋白質的有義核酸互補的分子’例如’與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補或與mRNA序列互補的分子。因此，反義核酸可與有義核酸通過風鍵結合。本發明的反義核酸可斑完整的Gave 17 編碼鍵互補或僅與其一部分互補，例如，與蛋白質編碼區 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X297公釐）

200402424 A7 B7 五、發明說明（η) 域（或開放閱讀框）的全部或部分互補。反義核酸分子可與編碼GAVE17的核苷酸序列的編碼鏈的非編碼區域反義。非編碼區(“5’和3’非轉譯區”)為位於編碼區側翼的5，和 3’序列，其不能被轉譯成胺基酸，但可能具有調節作用。 5此側翼位點可以位於這樣的位置，在此處GAVE 2的正常表現可以遭到破壞。根據此處公開的編碼GAVE17的編碼鏈序列（例如， SEQ ID ΝΟ:1)，本發明的反義核酸可根據Wats〇I^ Crick 域基配對原則設計。反義核酸分子可與GAVE17 mRNA的 10完整編碼區互補，但更優選僅與AVE17 mRNA的部分編碼區或非編碼區的寡核苷酸反義。例如，反義寡核苷酸可與GAVE17 mRNA轉譯起始位元點附近的區域互補。例如，可應用具有 5’-GCACCCTGGCAGCTCAGAGCTT_3, (SEQIDNO:5)序列的寡核苷酸。反義寡核苷酸的長度可為 15 約 5、10、15、20、25 ' 30、35、40、45 或 50 個核苷經濟部智慧財產局員工消費合作社印製酸。本發明的反義核酸可應用本領域已知的方法通過化學合成和酶促連接反應構建。例如，化學合成反義核酸(如反義寡核苷酸)可應用天然存在的核苷酸或設計的各種修飾的核菩酸，修飾核苷酸的設計意在增加分子的幹生物活 20 性或增加反義和有義核酸間形成的雙鏈體的物理穩定性，如可應用硫代填酸S旨衍生物、膦酸s旨衍生物和p丫咬取代的核苷酸。可用於產生反義核酸的修飾核苷酸的實例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氣尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嗓 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐）

Q/S 200402424 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社五、發明說明（22) 呤、黃嘌呤、4_乙醯胞嘧啶、5_(緩基羥甲基)尿嘧啶、5•羧基甲氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲氨基甲基尿嘧啶、二氫尿鳴淀、β-D-半乳糖基qUeosine、次黃嗓呤核糖苷、N6·異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、甲基次黃嘌呤核糖苷、 5 2,2-一甲基鳥嗓吟、2-甲基腺嗓吟、2-甲基鳥嗓吟、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6_腺嘌呤、7_甲基鳥嘌呤、孓甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基_2_硫尿嘧啶、p_D_甘露糖基qxieosine、5-甲氧基羧基曱基尿嘧啶、5_曱氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5_氧基乙酸、 10 wybutoxosine、假尿嘧啶、que〇sine、厶硫代胞嘧啶、孓甲基-2-硫尿哺咬、2-硫尿喷唆、4-硫尿嘴咬、5-甲基尿哺啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5_氧基乙酸、5_甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶和2,6_ 二氨基嘌呤。備選地，反義核酸可應用表現載體進行生物 15製備，所述載體中已反向亞選殖了一段核酸（即，來自插入核酸的RNA轉錄本對於目的靶核酸將是反義向的）。本發明的反義核酸分子一般施用給物件或在原位產生，以便雜交或結合編碼GAVE17蛋白質的細胞mRNA 和/或基因組DNA，由此通過如抑制轉錄和/或轉譯來 20抑制該蛋白質的表現。雜交的方式可以是常規的核菩酸互補以形成穩定的雙鏈體，或，例如，對於與雙鏈體結合的反義核酸分子，可以通過在雙螺旋大溝處的特異相互作用，結合GAVE17的調節區域。本發明反義核酸分子的施用途徑的一個實例包括直接 -24- 200402424 A7 B7 五、發明說明（23) 在組織部位元注射。備選地，可修飾反義核酸分子使其把向選擇的細胞，然後系統施用。例如，用於系統施用時，可修飾反義分子以使分子特異結合所選細胞表面上表現的抗原或受體，例如，這可以通過將反義核酸分子連接到能 5結合細胞表面受體或抗原的肽或抗體上來實現。也可應用此處描述的載體將反義核酸分子遞送給細胞。為獲得足夠的反義分子胞内濃度，可以將反義核酸分子置於強啟動子的控制下，優選pol II或pol III啟動子。本發明的反義核酸分子可為α_異核酸（a_an〇meric 10 nudeicacid)分子。α-異核酸分子與互補RNA形成特異的雙鏈雜合體’雜合體中兩條鏈走向相互平行。（Gaultier 等，核酸研究（Nucleic Acids Res) (1987)15:6625_6641)。反義核酸分子也可包含曱基核糖核苷酸(Inoue等，核酸研究（Nucleic Acids Res) (1987) 15:6131-6148)或嵌合 RNA-15 DNA 類似物(Inoue 等，FEBS Lett (1987) 215:327-330)。本發明可包括核酶。核酶為具有核糖核酸酶活性的、能夠剪切單鏈核酸的催化RNA分子，所述單鏈核酸分子為與核酶雜交的分子，如mRNA。這樣，核酶(例如，錘經濟部智慧財產局員工消費合作社印製頭核酶(在 Haselhoff 等，自然（Nature) (1988) 334:585-20 591)中描述)可用於催化剪切GAVE17 mRNA轉錄本，由此抑制GAVE17 mRNA的轉譯。對GAVE17編碼核酸具有特異性的核酶可基於此處公開的GAVE17 cDNA的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO: 1)進行設計。例如，可構建四膜蟲 L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性位點的核苷酸序列與 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200402424 Δ7 Α7 Β7 五、發明說明（24) 編碼GAVE17的mRNA中的待剪切核苷酸序列互補，見，例如美國專利Nos· 4,987,071和5，116,742。備選地。可應用GAVE17mRNA從RNA分子庫中選擇具有特異核糖核酸酶活性的催化RNA，例如見，Bartel等，科學 5 ( Science) (1993) 261:1411-1418。本發明還包括可形成三股螺旋結構的核酸分子。例如，GAVE17的基因表現可通過如下方式抑制，即，將核香酸序列定向互補到GAVE17的調節區域(如GAVE17啟動子和/或增強子)上以形成三股螺旋結構來防止GAVE17 10基因在靶細胞中轉錄，一般參見Helene, Anticaneer Dmg Des (1991) 6(6):569 ； Helene Ann NY Acad Sci (1992) 660:27 和 Maher，Bioassays (1992) 14(12):807。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在優選的實施方案中，本發明的核酸分子可在域基部分、糖部分或雄酸骨架處進行修飾以提高分子的，例如， 15 穩定性、可雜交性或溶解度。例如，可修飾核酸的脫氧核糖填酸骨架以產生狀核酸（見Hyrup等，Bioorganic & Medicinal Chemistry (1996) 4:5)。如此處所應用，術語“肽核酸”或“PNA”指核酸類比物，如DNA類比物，其中脫氧核糖磷酸骨架由假肽骨架替代並僅保留四種天然核鹼基。 20 已顯示，在低離子強度條件下PNA的中性骨架使得其可以與DNA和RNA特異雜交。可應用標準的固相肽合成方法合成PNA寡聚體，如在Hyrup等，（1996)同上；Perry-O’Keefe 等，美國科學院院刊（proc Natl Acad Sci USA) (1996) 93:14670中所描述的方法。 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公爱） 200402424 A7 --- B7__ 五、發明說明（25) GAVE17的PNA可用於治療和診斷應用。例如，pNA 了用作反義劑或抗基因劑（antigene agent)以序列特異地調節基因表現，所述調節可以通過如誘導轉錄或轉譯停滯或抑制複製來實現。GAVE17的PNA還可以有其他用途。 5例如，PNA可用于分析基因中的單域基對突變（通過如 PNA指導的PCR箝位（ciamp));與其他酶如S1核酸酶聯合時用作人工限制性酶，（Hyrup等，（1996)同上）；或作為探針或引子用於DNA測序和雜交(Hyrup等，（1996)同上；Perry-O’Keefe 等，（1996)同上）。 10 在另一實施方案中，可修飾GAVE17的PNA以便例如，提高穩定性、特異性或細胞攝入，所述修飾可通過將親脂或其他輔助基團連接到PNA上、通過形成PNA-DNA 嵌合體或通過應用脂質體或本領域内已知的其他藥物遞送技術來進行。PNA-DNA嵌合體的合成可按以下文獻描述 15 的方法進行，Hyrup等.(1996)同上、Finn等，核酸研究 (Nucleic Acids Res) (1996) 24(17):3357-63、Mag 等，核酸研究（Nucleic Acids Res) (1989) 17:5973 和 Peterser 等，Bioorganic Med Chem Lett (1975) 5:1119 〇經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 分離的GAVE17蛋白質和抗GAVE17的抗體本發明的一個方面涉及分離的GAVE17蛋白質及其生物活性部分，以及適用作免疫原以引起抗GAVE17抗體的多肽片段。在一個實施方案中，可應用標準的蛋白質純化技術通過適當的純化方案從細胞或組織來源中分離天然 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公愛） 200402424 A7 B7 五、發明說明（26) GAVE17蛋白質。在另外的實施方案中，GAVE17蛋白質可通過重組DNA技術製備。作為重組表現的備選方案，可應用標準肽合成技術化學合成GAVE17蛋白質或多肽。 “分離的”或“純化的”蛋白質或其生物活性部分基本上 5 不含有來自GAVE17蛋白質的來源細胞或組織的細胞材料或其他污染蛋白質，或基本上不含有化學合成時的化學前體或其他化學物質。短語“基本上不含有細胞材料”包括GAVE17蛋白質製品，其中該蛋白質與細胞的細胞性成分分離，所述細胞為 10 分離或重組產生該蛋白質的來源細胞。這樣，基本上不含有細胞材料的GAVE17蛋白質包括這樣的GAVE17蛋白質製品，其含少於約30%、20%、10%、5%或更低(按幹重計) 的非GAVE17蛋白質(在此也稱為“污染蛋白質”）。重組產生GAVE17蛋白質或其生物活性部分時，還優 15 選其基本上不含有培養基，即，培養基在蛋白質製品中所佔有的體積少於約20%、10%、5%或更少。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製化學合成GAVE17蛋白質時，優選其基本上不含有化學前體或其他化學物，即，蛋白質從參與蛋白質合成的化學前體或其他化學物中分離出來。因此，此GAVE17蛋白 20質製品含有少於約30%、20%、10%、5%或更低(按幹重計) 的化學前體或非GAVE17的化學物質。 GAVE17蛋白質的生物活性部分包括這樣的肽，其含有與GAVE17蛋白質的胺基酸序列(如在SEQ ID N〇:2中顯示的胺基酸序列）充分相同或來源於該序列的胺基酸序 -28-

A〆w 200402424 A7 B7 五、發明說明（27) 列，並包括比全長GAVE17蛋白質少的胺基酸且至少顯示 GAVE17蛋白質的一種活性。一般地，生物活性部分包含具有至少一種GAVE17蛋白質活性的結構域或基序。 GAVE17蛋白質的生物活性部分可為長例如，1〇、25、 5 50、100或更多個胺基酸的多肽。優選的生物活性多肽包括一個或多個已鑑定的GAVE17結構域，例如，第三胞内環結構域(如SEQ ID NO:2)。此外，其他的生物活性部分（其中蛋白質的其他區域已缺失）可通過重組技術製備並相對于天然GAVE17蛋白 10 質的一個或多個功能活性進行評價。優選的GAVE17蛋白質具有SEQIDNO:2中所示的胺基酸序列。其他有用的GAVE17蛋白質基本與SEQ ID NO:2相同，且保持了 SEQ ID NO:2蛋白質的功能活性，但由於天然等位基因變異或誘變，其胺基酸序列與SEQ 15 ID NO:2存在差異。例如，該GAVE17蛋白質和多肽擁有至少一項此處描述的生物活性。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

因此，有用的GAVE17蛋白質是這樣的蛋白質，其包含與SEQ ID NO:2胺基酸序列的一致性為至少約45%，優選 55%、65%、75%、85%、95%、99%或 100%的胺基酸 20 序列，且持有SEQ ID NO:2的GAVE17蛋白質的功能活性。在其他實例中，該GAVE17蛋白質是具有與GAVE17 第三胞内環結構域(SEQ ID NO:2)的一致性為55%、65%、 75%、85%、95%、99%或100%的胺基酸序列的蛋白質。在優選的實施方案中，GAVE17蛋白質保持有SEQ ID -29- 尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210x297公釐） 200402424 A7 B7 五、發明說明（28) NO:2的GAVE17蛋白質的功能活性。為測定兩個核酸或兩段胺基酸序列的一致性程度，比對序列以便實現最佳比較的目的（例如，可在第一胺基酸或核酸序列的序列中引入缺口，以便獲得與第二胺基酸或 5 核酸序列的最佳比對和最大序列一致性）。然後比較相應胺基酸或核苷酸位置上的胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列的一個位置上佔據的胺基酸殘基或核苷酸與第二序列的相應位置上的相同，則認為該位置上這兩個分子一致。兩序列間的一致性百分數為兩序列共有的相同位置的個數的 10 函數（即，一致性百分數=相同位置的個數/總位置數（例如，重疊的位置）X 100)。在一個實施方案中，兩段序列的長度相同。測定兩序列間的一致性百分數可應用數學運算法則進行。用於比較兩序列的一個優選、非限定的數學運算法則 15 實例為Karlin等的運算法則（Karlin等，美國科學院院刊 (Proc Natl Acad Sci USA) (1990) 87:2264，在 Karlin 等，美國科學院院刊（Proc Natl Acad Sci USA ) (1993) 90:5873_5877中進行了修正）。該運算法則被加入到經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Altschul 等的 NBLAST 和 XBLAST 程式中（Altschul 等， 20 分子生物學雜誌（J Mol Bio) (1990) 215:403)。可應用 NBLAST程式（例如，得分=1〇〇、字長=12)進行BLAST 核苷酸檢索，以獲得與本發明的GAVE17核酸分子同源的核苷酸序列。可應用XBLAST程式（得分=50、字長=3) 進行BLAST蛋白質檢索，以獲得與本發明的GAVE17蛋 -30- 本紙張尺度週用中國國家標準((^3)八4規格（210x297公釐） ---- 200402424 A7 B7 五、發明說明（29) 白質分子同源的胺基酸序列。為獲得缺口比對以用於比較目的，可應用在Altschul等，核酸研究（Nucleic Acid Res) (1997) 25:3389 —文中描述的缺口 BLAST。備選地，可應用PSI-Blast進行重複檢索以檢測分子間的距離 5 關係。Altschul等，（1997)同上。在應用BLAST、缺口 BLAST和PSI-Blast程式時，可應用各程式(如XBLAST 和 NBLAST)的默認參數，見 1 http://www.ncbi.nlm.nih.gov ° 用於序列比較的另一優選、非限定的數學運算法則實例為Myers等的運算法則（Myers等，CABIOS (1988) 10 4:11-17)。該運算法則被加入到ALIGN程式(2.0版）中，該程式為GCG序列比對套裝軟體的一部分。當應用 ALIGN程式比較胺基酸序列時，可應用PAM120權重殘基表，12的缺口長度罰分且4的缺口罰分。兩序列間的一致性百分數可用與以上描述類似的技術 15 測定，其時可允許或不允許缺口。在計算一致性百分數時，僅計算精確匹配數。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本發明也提供了 GAVE17的後合或融合蛋白質。此處應用的GAVE17“嵌合蛋白”或“融合蛋白，，包括與非 GAVE17多肽可操作地連接的GAVE17多肽。“GAVE17多 2〇肽”指具有與GAVE17相對應的胺基酸序列的多肽。‘‘非 GAVE17多肽”指具有實質上不同於GAVE17蛋白的蛋白質的相應胺基酸序列的多肽，例如，所述蛋白質可以是與 GAVE17蛋白質不同且來源於相同或不同的生物體的蛋白質。 -31- I I , 200402424 A7 B7 五、發明說明（3〇) GAVE17融合蛋白内，GAVE17多肽可對應於 GAVE17蛋白質的全部或一部分，優選對應於GAVE17蛋白質的至少一個生物活性部分。在融合蛋白内，術語“可操作地連接”意指GAVE17多肽和非GAVE17多肽相互以 5 符合閱讀框的形式融合。非GAVE17多肽可與GAVE17多肽的N-末端或C-末端融合。 GST-GAVE17為一有用的融合蛋白，其中（JAVE17序列與麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)的C-末端融合。該融合蛋白質可利於重組GAVE17的純化。在一優選的實施方案中， 10 本發明的第三胞内環(IC3或ILC3)(即，SEQ ID NO:2中所示約第202位到約219位胺基酸)通過PCR擴增IC3並將產物亞選殖到載體（如pGEX-2T)中得以和GST融合。可將構建產物導入宿主細胞(如大腸桿菌）並由適當的小分子(如異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷)誘導所述構建體表現， 15 隨後進行純化(例如參見，Lee等，生物化學雜誌（j Biol Chem) (1996) 271(19):11272-11279)。在某些宿主細胞(如哺乳動物宿主細胞）中，通過應用異源信號序列可增加GAVE17的表現和/或分泌。例如，桿狀病毒包膜蛋白的gp6分泌序列可用作異源信號序列 20 (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 等，編，

John Wiley & Sons，1992)。真核異源信號序列的其他實例包括峰毒肽和人胎盤鹼性填酸酶的分泌序列（Strata gene; La Jolla，California)。而在另一實例中，有用的原核異源信號序列包括phoA分泌信號(Sambrook等，同上)和蛋白質 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） Λ A、r .ti· 錦· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 200402424 A7 B7 五、發明說明（3i) A 分泌信號（Pharmacia Biotech; Piscataway，New Jersey)。而在另一實施方案中，融合蛋白為GAVE17-免疫球蛋白融合蛋白，其中GAVE17的全部或一部分與來自免疫球蛋白家族成員的序列進行融合。本發明的GAVE17-免疫球 5蛋白融合蛋白可摻入到藥物組合物中並給患者施用以抑制 GAVE17配體與細胞表面的GAVE17蛋白質的交互作用，由此抑制體内GAVE17介導的信號轉導。GAVE17-免疫球蛋白融合蛋白可用於影響GAVE17關聯配體的生物利用率。可以通過抑制GAVE17配體與GAVE17的交互作用治 10療增生性和分化性紊亂及調節（如促進或抑制）細胞的存活。此外，本發明的GAVE17-免疫球蛋白融合蛋白可作為免疫原用以在患者體内引起抗-GAVE17的抗體，純化 GAVE17配體，以及在篩選試驗中鑑定抑制GAVE17與 GAVE17配體之間交互作用的分子。 15 優選地，本發明的GAVE17嵌合或融合蛋白通過標準經濟部智慧財產局員工消費合作社印製的重組DNA技術製備。例如，編碼不同多狀序列的dna 片段可根據常規技術以符合閱讀框的方式連結在一起，所述技術有例如，應用鈍末端或粘末端連接、限制性酶消化產生合適的末端、適當時填平粘端、鹼性磷酸酶處理以避 20 免不需要的接合以及酶促連接。在另一實施方案中，融合基因可由常規技術合成，包括DNA自動合成儀。備選地，可應用錨定引子進行基因片段的PCR擴增，導致在兩連續的基因片段間產生互補突出端，隨後可以進行退火及重新擴增以產生嵌合基因序列(例如參見Ausubel等，同 -33- 張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐）一 ---- 200402424 A7 B7 五、發明說明（32) 上）。此外，許多商售的表現載體已編碼有融合部份（如 GST多肽）。編碼GAVE17的核酸可選殖到此類表現載體中，以使融合部分與GAVE17蛋白質以符合閲讀框的形式連接一體。 5 本發明還涉及GAVE17蛋白質的變體（即具有不同於 GAVE17胺基酸序列的序列的蛋白質）。此變體可行使 GAVE17激動劑（類比物，mimetics)或GAVE17拮抗劑的功能。GAVE17蛋白質的變體可通過誘變產生，例如 GAVE17蛋白質的不連續點突變或截短。此GAVE17蛋白 10質的激動劑可持有與天然存在的GAVE17蛋白質基本相同的生物活性或其部份生物活性。此GAVE17蛋白質的拮抗劑可以，例如通過競爭性結合包括GAVE17蛋白質在内的細胞信號級聯的下游或上游成員，抑制天然形式的 GAVE17蛋白質的一種或多種活性。因此，可以用具有有 15限功能的變體進行處理來引發特異的生物效應。相對于用天然形式的GAVE17蛋白質進行治療，用具有天然蛋白質的部分生物活性的變體對患者進行治療將在患者中產生較小的副作用。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製行使GAVE17激動劑(類比物）或GAVe17拮抗劑功能 20的GAVE17蛋白質變體可通過針對GAVE17激動劑或拮抗劑活性篩選GAVE17蛋白質的突變體組合庫進行鑑定，例如，所述組合庫可以為截短突變體庫。在一個實施方案中，通過在核酸量上進行組合誘變，產生由多樣化基因庫編碼的多樣化GAVE17變體庫。例如，多樣化GAVE17變 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 200402424 Α7 Β7 五、發明說明（33) 體庫可通過如下方式製備：將合成的寡核苷酸混合物酶促連接至基因序列以使一組簡併的潛在GAVE17序列表現為單獨的多肽，或備選地，表現為其中含有該組GAVE17序列的一組較大融合蛋白（例如，噬菌體展示）。有各種方 5法可用于從簡併的寡核苷酸序列產生潛在GAVE17變體庫。可在DNA自動合成儀上進行簡併基因序列的化學合成，然後將合成基因連入合適的表現載體。一組簡並基因的應用使得可以在一個混合物中提供編碼一組所需的潛在 GAVE17序列的所有序列。用於合成簡並寡核苷酸的方法 10 在本領域内是公知的（例如參見，Narang，Tetrahedron (1983) 39:3 ; Itakura 等，Ann Rev Biochem (1984) 53:323 ; Itakura 等，科學（Science) (1984) 198:1056 ; Ike 等，核酸研究 (Nucleic Acid Res) (1983) 11:477). 此外，GAVE17蛋白質編碼序列片段庫可用於產生多 15 樣化的GAVE17片段群，以篩選及隨後挑選出GAVE17蛋白質的變體。在一個實施方案中，可通過用核酸酶處理 GAVE17編碼序列的雙鏈PCR片段（在所述處理進行的條件下，在每個分子中僅發生大約一次切割）、將雙鏈DNA 變性、使DNA複性形成雙鏈DNA(此雙鏈DNA中可以包 20括來自不同切割產物的有義/反義對）、用S1核酸酶處理以從新形成的雙鏈體中除去單鏈部分，然後將產生的片段庫連入表現載體，由此產生編碼序列片段庫。用該方法可形成表現庫，該庫編碼GAVE17蛋白質不同大小的N-末端及内部片段。 -35- 尽紙張尺度遇用1P國國豕標準(CNS)A4規格（21〇 x 297公爱) .rVr%

^^->0 200402424 A7 B7 五、發明說明（34) 用於篩選組合庫基因產物以及用於篩選cDNA庫以獲得具有所選性質的基因產物的一些技術在本領域内是公知的，其中所述組合庫是通過點突變或截短產生的。這些技術可經修改而適於快速篩選由GAVE17蛋白質的組合誘變 5產生的基因庫。最為廣泛應用的適於高通量分析以篩選大型基因庫的技術一般包括將基因庫選殖體到可複製的表現載體中’用所獲載體庫轉形適宜細胞並表現組合基因，在該表現條件下對所需活性的測試將利於檢測到的基因產物的編碼載體的分離。 10 遞迴總體誘變（Recursive ensemble mutagene sis， REM)為增加庫中功能性突變體的頻率的技術，可與篩選試驗聯合應用以鑑定GAVE17變體(Arkin等，美國科學院院刊（Proc Natl Acad Sci USA) (1992) 89:7811-7815 ;

Delgrave 等’蛋白質工程（pr〇tein Engineering) (1993) 15 6(3):327-331) 〇經濟部智慧財產局員工消費合作社印製分離的GAVE17蛋白質、其部分或片段可用作免疫原通過標準的多株和單株抗體製備技術產生結合GAVE17的抗體。可使用全長GAVE17蛋白質或備選地本發明提供的 GAVE17抗原性肽片段作為免疫原。GAVE17的抗原性肽 20包含SEQ ID NO:2所示胺基酸序列中的至少8個（優選 10、15、20、30或更多個）胺基酸殘基，並包括GAVE17 的表位以致抗該肽產生的抗體可與GAVE17形成特異的免疫複合體。在一相關的方面。抗原性肽包含的表位位於GAVE17 -36- 尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210x297公釐） 200402424 ______B7 五、發明說明（35 ) 蛋白質表面的區域，例如親水性區域。對人GAVE17蛋白質序列的疏水性分析表明，SEQ ID N0:2中約1位到約第 23位胺基酸、約第81位到约99位胺基酸、約第161位到約190位胺基酸以及約第256位到約280位元胺基酸之間 5的區域尤其是親水的，因此可能編碼對定向抗體的生成有用的表面殘基。 GAVE17免疫原一般通過用免疫原免疫適宜物件的方式（如兔子、山羊、小鼠或其他哺乳動物）來製備抗體。適當的免疫原性製劑可包含，如重組表現的GAVE17蛋白 10 質或化學合成的GAVE17多肽。製劑可進一步包含佐劑，如弗氏完全或不完全佐劑或類似的免疫刺激劑。用免疫原性GAVE17製劑對適宜的物件進行免疫將引起多株抗_ GAVE17抗體應答。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製因此，本發明另一方面涉及抗-GAVE17抗體。此處應 15用的術語“抗體”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子中具有免疫學活性的部分，即含有與抗原（如GAVE17)特異結合的抗原結合部位的分子。特異結合GAVE17的分子為與天然含有GAVE17的樣本（例如生物樣本）中的 GAVE17結合、但基本不與其他分子結合的分子。免疫球 20蛋白分子的免疫學活性部分的實例包括F(ab)和F(ab.)2片段’所述片段可通過用如胃蛋白酶處理抗體而產生。本發明提供了結合GAVE17的多株和單株抗體。此處應用的術語“單株抗體”或“單株抗體組合物，，。是指僅含有一種抗原結合部位、可與GAVE17特定表位進行免疫反應的抗體分 -37-

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子群因而單株抗體組合物一般表現出對特定的GAVE17 蛋白質表位的單一結合親合力。 10 15 可如以上所描述，通過應用GAVE17免疫原免疫合適的物件來製備多株抗-GAVE17抗體。免疫物件體内的抗_ GAVE17抗體滴度可利用標準技術隨時進行檢測，所述標準技術有例如用固定的GAVE17進行的酶聯免疫吸附試驗 (ELISA)。如果需要，抗GAVE17的抗體分子可從哺乳動物（例如’從血液）中分離出來，並進一步經公知的技術 (如蛋白質A層析法）純化以獲得igG部分。在免疫後的適當時間，例如當抗_GAVE17抗體的滴度為最高時，可從免疫物件獲得生產抗體的細胞然後可以應用標準技術和這些細胞製備單株抗體，所述標準技術為例如Kohler等 (Kohler 等，自然（Nature) (1975) 256:495-497)首先描述的融合瘤技術、人B細胞融合瘤技術（Kohler等， Immunol Today (1983) 4:72)、EBV 融合瘤技術(Cole 等，單株抗體和癌症治療（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，（1985)，Alan R. Liss，Inc” pp· 77-96)或 trioma 技術。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製製備融合瘤的技術為公知的（一般參見Current 20 Protocols in Immunology (1994) Coligan 等，編，John Wiley & Sons，Inc·，紐約，NY)。簡言之，永生細胞系（一般為骨髓瘤）與淋巴細胞（一般為脾細胞)融合，所述淋巴細胞來自用如上描述的GAVE17免疫原免疫的哺乳動物，並篩選產生的融合瘤細胞的培養物上清以鑑定出生產結合 -38- -本紙張尺度適用中國國家標準(CNQA4規格（210 x 297公釐） 200402424 ___B7_ 五、發明說明（37 ) " GAVE17的單株抗體的融合瘤。用於將淋巴細胞和永生細胞系融合的多種已知方法中的任一種都可用於產生抗-GAVE17的單株抗體（例如參見，Current Protocols in Immunology，同上；Galfre 等， 5 自然（Nature) (1977) 266:550-552 ; Kenneth，單株抗體：生物分析的新平臺（in Monoclonal Antibodies: A New

Dimension In Biological Analyses)，Plenum 出版公司，紐約，Ν·Υ· (1980);和 Lerner，Yale J Biol Med (1981) 54:387- 402)。此外，本領域的普通技術人員將理解，這些方法的 10 多種變異形式也是有用的。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製一般地，永生細胞系（如骨髓瘤細胞系）與淋巴細胞來自同一哺乳動物物種。例如，可通過將本發明免疫原性製劑免疫的小鼠的淋巴細胞與小鼠永生細胞系融合來製備鼠融合瘤，其中所述永生細胞系可以是例如對含次黃嘌呤、 15 氨甲蝶呤和胸腺嘧啶的培養基(“HAT培養基”)敏感的骨髓瘤細胞系。多種骨髓瘤細胞系均可根據標準技術用作融合夥伴（partner)，例如 P3-NSl/l-Ag4-l、P3-x63-Ag8.653 或Sp2/〇-Agl4骨髓瘤細胞系。骨髓瘤細胞系可從ATCC 獲得。 20 —般地，對HAT敏感的小鼠骨髓瘤細胞借助聚乙二醇(“PEG”)與小鼠脾細胞融合。然後用HAT培養基篩選融合產生的融合瘤細胞，所述HAT培養基可殺死未融合的及非生產性融合的骨髓瘤細胞（未融合的脾細胞由於未被轉形將在幾天後死亡）。產生本發明單株抗體的骨髓瘤細 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200402424 ____B7 五、發明說明（38) —- 胞通過篩選骨髓瘤細胞培養物上清液中結合GAVEi7的抗體進行檢測（例如應用標準的ELISA試驗）。作為製備分泌單株抗體的融合瘤的備選方案，可以廣用GAVE17篩選重組組合免疫球蛋白質庫(如抗體噬菌體 5展不庫），由此得以分離結合GAVE17的免疫球蛋白庫成員，從而鑑定和分離到抗-GAVE17的單株抗體。用於產生和筛選嗟菌體展示文庫的試劑盒可從供應商處獲得（例如，Pharmacia重組噬菌體抗體系統，目錄號27 94〇〇_ 01 ;以及Strata gene SurfZAP^噬菌體展示試劑盒，目錄號 10 240612)。此外，特別適於產生和篩選抗體展示庫的方法和試劑的實例可在以下文獻中查詢，例如美國專利號5,223,409; PCT 公開 No· WO 92/18619 ; PCT 公開 No· WO 91/ 17271 ; PCT 公開 No· WO 92/20791 ; PCT 公開 No· WO 15 92/15679; PCT 公開 No· WO 93/01288 ; PCT 公開 No· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 WO 92/01047 ; PCT 公開 No· WO 92/09690 ; PCT 公開 No· WO 90/02809 ; Fuchs 等，Bio/Technology (1991) 9:1370-1372 ; Hay 等，Hum Antibody Hybridomas (1992) 3:81-85 ; Huse 等，科學(Science)(1989) 246:1275-1281 和 20 Griffiths 等，EMBO J (1993) 25(12):725-734。此外，重組抗GAVE17抗體，如嵌合的和人源化的單株抗體（同時包含人的和非人的部分）可以使用標準重組 DNA技術製備。該嵌合和人源化單株抗體可以通過本領域已知的重組DNA技術產生，例如使用如下文獻中描述 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200402424 A7 B7 五、發明說明（39)

的方法：PCT公開No. WO 87/02671 ;歐洲專利申請No· 184，187;歐洲專利申請No. 171,496;歐洲專利申請价· 173,494 ; CT 開 No. WO 86/ 01533 ; U.S·專利 No· 4,816,567 ;歐洲專利申請 No· 125,023 ; Better 等，Science 5 (1988) 240:1041-1043; Liu 等，Proc Natl Acad Sci USA (1987) 84:3439-3443; Lin 等，J Immunol (1987) 139:3521-3526; Sun 等，Proc Natl Acad Sci USA (1987) 84:214-218; Nishimura 等，Cane Res (1987) 47:999-1005; Wood 等， Nature (1985) 314:446-449; Shaw 等，J Natl Cancer Inst 10 (1988) 80:1553-1559; Morrison, Science (1985) 229:1202- 1207; Oi 等，Bio/Techniques (1986) 4:214; U.S· Pat· No. 5,225,539; Jones 等，Nature (1986) 321:552-525; Verhoeyan 專 ’ Science (1988) 239:1534; and Beidler 等，J Immunol (1988) 141:4053-4060。 15 特別需要完全人抗體以用於治療人類患者。該抗體可經濟部智慧財產局員工消費合作社印製應用轉殖基因小鼠製備，所述轉殖基因小鼠不能表現内源免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因，而能夠表現人的重鏈和輕鏈基因。該轉殖基因小鼠可以用選擇的抗原（如GAVE17的全部或一部分）以標準方式進行免疫。 20 定向對抗抗原的單株抗體可由常規的融合瘤技術獲得。位於轉殖基因小鼠中的人免疫球蛋白轉殖基因在B細胞分化過程中進行重排，並隨後經歷類型切換和體細胞突變〇這樣，應用該表位可鑑定出抑制GAVE17活性的抗 -41-

r-r rv. Α Λ 200402424 五、發明說明（40) 5 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 20 體。選殖體非人抗體的重鏈和軔鍵並用於構建嗟菌體展示的Fab片段。例如，可將重鏈基因選殖體到質粒載體中， =細菌分泌线。可將輕鏈基因制韻體外殼蛋sr:隼：人其可表現於物表面。使用與人輕鏈庫 (_收集)融合㈣隨❹表現非人重鏈的 2倾菌體展示雜合抗趙（人輕鏈/非人重鏈）。利用从擇的抗原陶選能結合所選抗原的嗤菌體。可能需要幾輪師選以鑑定出該噬菌體。從選出的結合所選抗原的嗟菌體中分離人輕鏈基因。然後利用選出的人輕鏈基因指導人重鏈基因的篩選如以下所述。將選出的人輕鏈基因插入細菌表現載體。表現選出的人輕鏈的細_融合了人重鍵庫㈣菌體進行感染。產生的子代噬菌體展示人抗體（人輕鏈/人重鏈）。接著，使用選出的抗原陶選可結合選擇抗原的噬菌體。選出的韻體展示完全人抗體，該抗體識別的表位與最初選擇的非人單株抗體所識別的表位相同。分離同時編碼重鏈和輕鏈的基因，並可進一步操作用於製備人抗體。該技術參見 Jespers 等的描述（Bio/ Technol〇gy (1994) 12:899-903)。抗-GAVE17抗體(如單株抗體)可通過標準技術（如親和層析或免疫沈澱）用來分離GAVE17。抗—GAVE17抗體可以促進從細胞中純化天然的GAVE17和表現於宿主細胞中的重組產生的GAVE17。此外，抗-GAVE17抗體可用於 -42-

本紙張尺度適用中國國家標準(CJNS)A4規格（210x297公爱) 〇明3 200402424 A7

檢測GAVE17蛋自胃(如在細胞裂解物或細虹清液評估GAVEH蛋白f的表現豐度和表財式。抗·㈣抓抗體可用于診斷上作為臨床試驗方法的一部分來監測組織中的蛋白質量’以便例如，確定特定治療方式的療效。 5 豸抗體與可檢測的物質偶聯可促進檢測的進行。可檢

測物質的實施例包括各種酶、輔基、螢光材料、發光材料、生物發光材料和放射性材料。合適的酶的實例包括辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶。合適的輔基複合物的實例包括鏈黴親和素/生物素和 10抗生物素蛋白/生物素。合適的螢光材料的實例包括散形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、二氣三畊基胺螢光素、丹％醯氯或藻紅蛋白。發光材料的實例為魯米諾。生物發光材料的實例包括螢光素酶、蟲螢光素和水母發光蛋白。合適的放射性材料的實例包括nq、Ull、35S 重組表現載體和宿主細胞經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本發明另一方面涉及含編碼GAVE17(或其一部分）的核酸的載體，優選表現載體。如此處所用，術語“載體，，指 20能夠運輸與其相連的另一核酸的核酸分子。載體的一個類型為“質粒”，是指可連入額外DNA區段的環狀雙鏈 DNA。載體的另一類型為病毒載體，其中可以將額外的 DNA區段連入病毒基因組。某些載體可在宿主細胞中自主複氣（例如，具有細滅複製起點的細滅載體和游離型哺 -43- 200402424 A7 B7 五、發明說明（42 礼動，載體）。其他的載體(如非游離型的哺乳動物載體)在導入布主細胞内時整合到宿主細胞基因組中，並因此隨宿主基因組一同複製。此外，某些載體（表現載體）能夠指導與其可操作地連接的基因的表現。通常，重組 DNA技 5術:應用的表現載體經常為質粒(載體)形式。然而，本發 =意在包括其他形式的表現載體，如可執行等價功能的病毒載體(如複製缺陷逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒）。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本發明重組表現載體包含本發明的核酸，所述核酸以適於在宿主細胞内表現的形式存在。這意味著重組表現載 1〇體包括-段或多段以用於表現的宿主細胞為基礎進行筛選的雛序列，該序列可操作地連接待進行表現的核酸。在重組表現載體内，“可操作地連接，，意指目的核苷酸序列連接到調控序列上，其連接方式允許該核苷酸序列表現(例如，在體外轉錄/轉譯系統中或當載體導入宿主細胞時在 15該宿主細胞中）。術語“調控序列，，旨在包括啟動子、增強子和其他表現控制元件(如多聚腺苷酸化信號）。該調控序列在如Goeddel，基因表現技術：酶學方法（ Expression Technology： Methods in Enzymology) y〇i. 185, Academic press，San Diego, CA (1990)中有描述。調控序列 20包括那些指導核苷酸序列在多種宿主細胞中進行組成型表現的序列（如組織特異的調控序列）。本領域内的技術人員應當理解，表現載體的設計將依賴於選擇的進行轉形的宿主細胞、所需蛋白質的表現量等因素。可以將本發明的表現載體可導入宿主細胞中以產生此處描述的核酸編碼的蛋 -44- 本紙張尺度適用T國國家標準(CNS)A4規格（21〇 χ 297公釐） ------ 200402424 A7 B7 五、發明說明（43) 白質或肽(如GAVE17蛋白質、突變體形式的GAVE17和融合蛋白等）。本發明的重組表現載體可設計用於在原核或真核細胞中表現GAVE17 ’所述細胞有例如，細菌細胞（如大腸桿 5菌）、昆蟲細胞（用桿狀病毒表現載體）、酵母細胞或哺乳動物、、、田胞。合適的布主細胞在之前的Goebel的文獻中有討論。備選地，重組表現載體可應用如噬菌體轉錄調控元件和蛋白質在體外進行轉錄和轉譯，其中所述元件和蛋白質如T7啟動子和/或T7聚合酶。 10 蛋白質在原核細胞内的表現大都在大腸桿菌中使用載經濟部智慧財產局員工消費合作社印製體進行，所述載體含有指導融合或非融合蛋白表現的組成型或誘導型啟動子。融合載體在其編碼的蛋白質上添加了一些胺基酸，這些胺基酸通常添加到重組蛋白的氨基端。該融合載體一般有三種用途：^提高重組蛋白的表現；2) 15提高重組蛋白的溶解度；和3)在親和純化中作為配體協助重組蛋白的純化。通常，融合表現載體中在融合部分和重組表現蛋白的連接處導入有一個蛋白水解切割位點，從而使得可以在純化融合蛋白後使重組蛋白得以和融合部分分離。此類酶和關聯識別序列包括Xa因數、凝血酶和腸激 20酶。典型的融合表現載體包括PGEX (Pharmacia Biotech

Inc ; Smith 等，基因（Gene)(1988) 67:3M0)、PMAL (New England Biolabs，Beverly，MA)和 pRiTS (Pharmacia，

Piscataway，NJ)，三者分別將麩胱甘肽5_轉移酶(GST)、麥穿糖E結合蛋白質或蛋白質a融合到乾重組蛋白上。 -45- 張尺度週用甲國國豕標準(CNS)A4規格（210x297公釐）

雜S 200402424 A7 B7 五、發明說明（44) 合適的誘導型非融合大腸桿菌表現載體的實例包括 pTrc (Amann 等，基因（Gene)(1988) 69:301-315)和 pET lid (Studier等，基因表現技術：酶學方法（Gene Expression Technology: Methods in Enzymology), Academic Press，San 5 Diego, California (1990) 185:60-89)。pTrc 載體上靶基因的表現依賴于宿主RNA聚合酶從雜合trp-lac融合啟動子起始轉錄。使大腸桿菌中重組蛋白表現最大化的一個策略是在蛋白水解切割重組蛋白的能力被削弱的宿主中表現蛋白 10 (Gottesman，基因表現技術：酶學方法，Academic Press， San Diego, California (1990) 185:119-128)。另一策略是改變待插入表現載體的核酸的核酸序列，以使編碼每一胺基酸的各密碼子都為優選在大腸桿菌中應用的密碼子(Wada 等，核酸研究(Nucleic Acids Res)(1992) 20:2111-2118)。對本 15 發明核酸序列進行此類改變可通過標準的DNA合成技術完成。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在另一實施方案中，GAVE17表現載體為酵母表現載體。用於在酵母（如釀酒酵母（S· cerevisiae))中表現的載體的實例包括 pYepSecl (Baldari 等，EMBO J (1987) 20 6:229_234)、pMFa (Kurjan 等，細胞（cell)(1982) 30:933· 943)、pJRY88 (Schultz 等，*0(Gene)(1987) 54:113， 123)、pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego，CA)和 pPicZ (Invitrogen Corp，San Diego, CA) 〇備選地，GAVE17可應用杆狀病毒表現載體在昆蟲細 -46- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200402424 A7 B7 五、發明說明（45 ) 胞中表現。現有可用于在培養的昆蟲細胞(如Sf 9細胞）中表現蛋白的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等，分子細胞生物學(Mol Cell Biol)(1983) 3:2156-2165)和 pVL 系列 (Lucklow 等，病毒學(Virology)(1989) 170:31-39)。 5 而在另一實施方案中，本發明的核酸使用哺乳動物表現載體在哺乳動物細胞中進行表現。哺乳動物表現載體的實例包括 pCDM8 (Seed，自然（Nature)(1987) 329:840)和 pMT2PC (Kaufman 等，EMBO J (1987) 6:187-195)。當用於哺乳動物細胞時’表現載體的控制功能常由病毒調控元件 10提供。例如，通常應用的啟動子來自多瘤病毒、腺病毒 2、巨細胞病毒和猿病毒40。對於其他適用于原核和真核細胞的表現系統，見之前Sambrook等的文獻的第16和 17章。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在另一實施方案中，重組哺乳動物表現載體能夠指導 15 核酸優選地在特定的細胞類型中表現(例如，應用組織特異的調控元件表現核酸）。組織特異的調控元件在本領域内是公知的。合適的組織特異性啟動子的非限定實例包括白蛋白啟動子（肝臟特異；Pinkert等，Genes Dev (1987) 1:268-277)，淋巴特異的啟動子(Calame 等，Adv Immunol 20 (1988) 43:235-275)，特別是 T 細胞受體（Winoto 等， EMBO J (1989) 8:729-733)和免疫球蛋白（Banerji 等，細胞 (Cell)(1983) 33:729-740 ; Queen 等，細胞（Cell)(1983) 33:741-748)的啟動子，神經元特異的啟動子（如神經絲蛋白啟動子；Byrne等，美國科學院院刊(Pr〇c Natl Acad USA) -47- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 x 297公釐) 'r-.'A'r Ά 200402424 A7 B7 五、發明說明（46) (1989) 86:5473-5477)，胰腺特異的啟動子(Edlund等科學 (Science)(1985) 230:912-916)和乳腺特異的啟動子（如奶乳清蛋白啟動子；美國專利No. 4,873,316和歐洲申請ν〇· 264，166)。發育調節的啟動子也包括在内，如鼠h〇x啟動 5 子(Kessel 等，科學（Science) (1990) 249:374-379)和曱胎蛋白啟動子(Campes 等，Genes Dev (1989) 3:537-546)。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本發明還提供含本發明的DNA分子的重組表現載體，其中該DNA分子以反義方向選殖在表現載體中。也就是，DNA分子可操作地連接到調控序列上，該連接方 10 式使得可以表現產生與GAVE17 mRNA反義的RNA分子 (通過轉錄該DNA分子）。可以對可操作地連接反向選殖的核酸的調控序列進行選擇以指導反義RNA分子在多種細胞類型中持續表現。例如，可選擇病毒啟動子和/或增強子或調控序列以指導反義RNA實現組成型、組織特異性 15 或細胞類型特異性表現。反義表現載體的形式可為重組質粒、嗤產粒或減毒病毒’其中在南效調控區域的控制下產生反義核酸，其活性由載體導入的細胞的類型決定。反義基因的基因表現調控的討論見Weintraub等（1^¥丨^卜 Trends in Genetics, Vol. 1(1)1986) ° 20 本發明的另一方面涉及已導入本發明的重組表現载體的宿主細胞。術語“宿主細胞”和“重組宿主細胞，，在此處可互換使用。應當理解，該術語不僅指特定的受試細胞，也指該細胞的後代或潛在後代。由於突變或環境影響在傳代過程中可發生某些改變，這樣，後代實際上可能並非與親 -48- ^喪尺度適用I7國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200402424 A7 B7 五、發明說明（47 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製代細胞相同’但其仍包括在此處所用術语的範圍之内。宿主細胞可為任意的原核或真核細胞。例如，GAVE1 蛋白質可在細菌細胞（如大腸桿菌）、昆蟲細胞、酵母或哺乳動物細胞(如NIH 3T3細胞）中表現。其他合適的宿主 5 細胞為本領域内的技術人員公知。載體DNA可通過常規轉形或轉染技術導入原核或真核細胞中。如此處所用，術語“轉形，，和“轉染，，意指本領域内公知的各種將外源核酸 (如DNA)導入宿主細胞的技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沈澱、轉導，DEAE-葡聚糖-介導的轉染，脂轉染或電穿 10 孔。對於哺乳動物細胞的穩定轉染，已知根據應用的表現載體和轉染技術，僅一小部分的細胞可將外源DNA整合到基因組中。為鑑定和篩選整合體，一般將編碼選擇標記的基因（如抗生素抗性基因）與目的基因一同導入宿主細 15胞。優選的選擇標記包括那些可賦予藥物抗性的基因，所述藥物如G418、潮黴素和氨曱蝶呤。編碼選擇標記的核酸可與編碼GAVE17的基因位於同一載體上被導入宿主細胞或可以位於不同的載體上導入。經導入核酸穩定轉染的細胞可通過藥物篩選進行鑑定(例如，摻入了選擇標誌基因的細胞將存活，而其他細胞死亡載體也可帶有内源基因序列來促使向宿主細胞基因組進行同源重組整合。本發明的宿主細胞（如培養的原核或真核宿主細胞）可用於產生（即表現)GAVE17蛋白質。因此，本發明進一 20 ♦ 計線 -49- 200402424 A7 B7 五、發明說明（48) 步提供了通過應用本發明的宿主細胞產生GAVE17蛋白質的方法。在一個實施方案中，該方法包括在合適的培養基中培養本發明的宿主細胞（編碼GAVE17的重組表現載體已經導入了該細胞），由此使GAVE17蛋白質得以產生。 5 在另一實施方案中，該方法還包括從培養基或宿主細胞中分離 GAVE17。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在另一實施方案中，GAVE17被包含在誘導型表現系統中用於其他亞選殖體到修飾表現載體上的蛋白質的重組表現。例如，包含突變G蛋白的宿主細胞(例如，酵母細 10 胞、Y2腎上腺皮質細胞和cyc- S49，見美國專利Nos. 6，168,927 B1，5,739,029 和 5,482,835 ; Mitchell 等，美國科學院院刊（Proc Natl Acad USA)(1992) 89(19):8933-37 和 Katada 等，生物化學雜誌(J Biol Chem)(1984) 259(6):3586-95)用含有編碼GAVE17的核酸序列的第一表現載體進行 15 轉導，其中該GAVE17在宿主細胞中進行功能表現。儘管表現的GAVE17具有組成型活性，但突變的存在不允許信號轉導發生；即，不啟動G-蛋白指導的下游級聯放大(例如，不啟動腺苷環化酶）。隨後，用第二表現載體轉導包含GAVE17的宿主細胞。除待通過此誘導型系統進行表現 20 的目的基因外，第二載體包含與宿主細胞G蛋白突變體互補的結構基因（即，哺乳動物或酵母的功能性Gs、Gi、G。或Gq，例如，見PCT公開No. WO 97/48820 ;美國專利 Nos· 6，168,927 B1、5,739,029 和 5,482,835)。第二載體的互補結構基因為可誘導的；即，處於外源添加的化合物 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200402424 A7 B7 五、發明說明（49) (如四環素、IPTG、小分子等，見之前的Sambrook等的文獻）的控制下，所述化合物可以啟動與所述互補結構基因可操作連接的啟動子。加入誘導劑後，該互補結構基因編碼的蛋白質進行功能性表現，結果具有組成型活性的 5 GAVE17將形成複合體，導致適當的下游通路的啟動（例如，形成第二信使）。第二載體包含的目的基因具有可操作連接的啟動子，所述啟動子可以由合適的第二信使（如 CREB和API元件)啟動。這樣，當第二信使積聚時，目的基因上游的啟動子被啟動以表現所述基因的產物。缺乏 10 誘導劑時，目的基因的表現關閉。在優選的實施方案中，用於此誘導型表現系統的宿主細胞包括但不限於，S49 (cyc〇細胞。儘管本發明考慮包含 G-蛋白突變的細胞系，但也可以人工製備/構建出合適的突變體（見針對酵母細胞的美國專利Nos. 6，168,927 B1、 15 5,739,029 和 5,482,835)。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在相關的方面，細胞用與如下cDNA可操作連接的載體轉形，所述cDNA包含編碼SEQ ID NO:2中所示蛋白質的序列。該系統包含的第一和第二載體可以考慮包括但不限於，pCDM8(Seed，自然（Nature)(1987) 329:840)和 20 pMT2PC (Kaufman 等，EMBO J (1987) 6:187-195)、 pYepSecl (Baldari 等，EMBO J (1987) 6:229-234)、pMFa (Kurjan·，細胞(Cell) (1982) 30:933-943)、pJRY88 (Schultz 等，基因（Gene) (1987) 54:113-123)、pYES2 (Invitrogen Corporation，San Die会〇，CA)和 pPicZ (Ifivitrogen Corp，San -51- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200402424 A7 B7 五、發明說明（50 )

Diego, CA) 〇又，宿主細胞可通過適宜的方法轉染，其中轉染導致了功能性GAVE17蛋白質的表現(例如，Sambrook等，同上和Kriegler，基因轉移和表現：,實驗室指南（Gene 5 Transfer and Expression: A Laboratory Manual) ? Stockton Press, New York，NY，1990)。該“功能性蛋白質”包括但不限於，一經表現即可與G-蛋白形成複合體的蛋白質，其中該G-蛋白調節第二信號的形成。在再一相關的方面，考慮用於目的基因的啟動子包括 10 但不限於，那些來自多瘤病毒、腺病毒2、巨細胞病毒和猿病毒40的啟動子。其他的表現構建體組合也適用於此誘導型系統（見，Sambrook等，同上和Kriegler，同上）。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製表現GAVE17的轉形體可由多種方法鑑定，例如應用特異抗體或利用GAVE17的功能，如在以下進一步詳細描 15述的。這樣，轉形體可通過對核苷酸的親合力進行鑑定。可應用標記的核苷酸評估與表現GAVE17的轉形體的結合。成功的轉形體也可通過結合核苷酸後GAVE17的功能進行鑑定。作為GPCR，GAVE17顯示出已知的GPCR活性，如肌醇的磷酸化、cAMP量的調節或特定蛋白質的鱗 20酸化’其中磷酸化作用使特定的蛋白質活化或失活。此處提供了用於監測配體結合及GAVE17功能的方法，且這些方法在本領域内是公知的。一本發明的宿主細胞也可用於製備非人轉殖基因動物。例如在個實化方案中，本發明的宿主:細胞為受精的印 -52-

200402424 Α7 Β7 五、發明說明（S1 母細胞或胚胎幹細胞，所述細胞已導入編碼GAVE17的序列。然後該宿主細胞可以用於產生基因組中導入了 GAVE17序列的非人轉殖基因動物，或產生其内源 GAVE17序列已發生改變的同源重組動物。該動物用以研 5究GAVE17的功能和/或活性，以及用於鑑定和/或評估 GAVE17活性的調節劑。如此處所用，“轉殖基因動物，，為非人動物’優選地為哺乳動物，更優選地為齧齒類動物如大鼠或小鼠’其中動物的一個或多個細胞包含轉殖基因。轉殖基因動物的其他實例包括非人靈長類、綿羊、狗、 10 牛、山羊、雞和兩棲動物等。轉殖基因是導入細胞且一般導入細胞基因組中，並在細胞發育成轉殖基因動物後保留在成熟動物的基因組内的外源DNA。轉殖基因指導編碼的基因產物在轉殖基因動物的一種或多種細胞類型或組織中表現。如此處所用， 15 同源重組動物”為非人動物，優選地為哺乳動物，更優選地為小鼠，其内源GAVE17基因已通過同源重組發生改變。這在動物發育之前，在内源基因以及導入動物細胞 (如動物的胚胎細胞）的外源DNA分子間完成。本發明的轉殖基因動物可以通過將編碼GAVE17的核 20酸導入（如通過顯微注射或逆轉錄病毒感染）受精卵母細胞的雄性原核、並允許卵母細胞在假孕的雌性代孕動物内發育來產生。GAVE17 cDNA序列（如(SEQ ID ΝΟ··1)中的序列）可作為轉殖基因導入非人動物的基因組中。備選地，人GAVE17基因的非人同系物（如小鼠gavei7美 -53- 本紙張尺度適用甲國國家標準(CNS)A4規格（210χ297公釐）言經濟部智慧財產局員工消費合作社印製線

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 200402424 A7 B7 五、發明說明（52) 一因）可基於與人GAVE17 cDNA雜交進行分離，並用作轉殖基因。内含子序列和聚腺苷酸化信號也可包括在轉殖基因内，以提高轉殖基因的表現效率。組織特異的調控序列可以以可操作方式連接GAVE17轉殖基因以指導GAVE17 5蛋白質在特定細胞内表現。用於通過胚胎操作和顯微注射產生轉殖基因動物（特別是諸如小鼠等動物）的方法是本領域内的常規操作，且可參見如美國專利N〇s· 4,736,866 和 4,870,009、美國專利 Νο· 4,873，191 和 H〇gan，小鼠胚胎的操作（Manipulating the Mouse Embryo) (Cold Spring 10 Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，Ν·Υ·，1986)。相似的方法可以用於產生其他轉殖基因動物，所述轉殖基因動物在基因組中存在轉殖基因和/或在動物的組織或細胞内表現GAVE17 mRNA。起始的轉殖基因動物可用來繁殖其他的攜帶轉殖基因的動物。此外，攜帶編碼GAVE17 15的轉殖基因的轉殖基因動物可進一步被培育成攜帶其他轉殖基因的轉殖基因動物。為生成同源重組動物，製備出含至少部分GAVE17基因（例如，人或非人GAVE17基因同系物，如鼠GAVE17 基因）的載體，所述部分GAVE17基因中已經導入缺失、 20添加或替代因而可以改變GAVE17基因（如功能性破壞）。在優選的實施方案中，設計載體，以致在同源重組後可破壞内源GAVE17基因的功能（即，不再編碼功能蛋白質；也稱為“剔除”載體）。備選地，可設，計載體，以便在同源重組後内源 -54- 本紙張尺度適用中國國家孫準(CNS)A4規格（210x297公楚）

ΰΰΟ / 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 200402424 A7 B7 五、發明說明（53) GAVE17基因發生突變或改變但仍編碼功能蛋白質（例如，可改變上游調控區域由此改變内源GAVE17蛋白質的表現）。在此同源重組載體中，改變的GAVE17基因部分在5, 5和31端被GAVE17基因的其他核酸包圍，從而允許在載體攜帶的外源GAVE17基因和存在於胚胎幹細胞内的内源 GAVE17基因之間發生同源重組。此其他的兩翼GAVE17 核酸的長度應足以使與内源基因的重組成功進行。一般地，載體内包括幾千域基的側翼DNA (5，及3,端）（例如參 10 見’ Thomas等，細胞(Cell) (1987) 51:503中對同源重組載體的描述）。將載體導入(如通過電穿孔)胚胎幹細胞系，且篩選出導入的GAVE17基因與内源GAVE17基因發生同源重組的細胞(例如參見，Li等，細胞(Cell) (1992) 69:915)。然後將 15篩選出的細胞注射到動物（如小鼠）的胚泡中以形成嵌合集合體（例如參見 ’ Bradley，Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cellsi A Practical Approach, Robertson j 編，IRL，Oxford，（1987) pp· 113-152)。然後將嵌合胚胎植入合適的假孕雌性代孕動物，並使胚胎生長足月。在生殖 20 細胞中帶有同源重組DNA的子代可用於繁殖動物，通過轉殖基因的生殖系傳送，所繁殖的動物的所有細胞都將含有同源重組的DNA。用於構建同源重組載體和同源重組動物的方法可以進一步參見 Bradley, Current Opinion in Bio/Technology -55- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐）

200402424 A7 B7 五、發明說明（54) (1991) 2:823-829 和 PCT 公開 Nos· WO 90/11354、WO 91 /01140、WO 92/0968 和 WO 93/04169 中的描述。在另一實施方案，產生的轉殖基因非人動物可含有所選系統以允許調控轉殖基因的表現。，該系統的一個實例為 5 嗟菌體P1的cre/loxP重組酶系統。為對cre/loxP重組酶系統的描述參見如Lakso等，美國科學院院刊(Pr〇c Natl Acad USA))(1992) 89:6232-6236。重組酶系統的另一實例為釀酒酵母（S· cerevisiae)的FLP重組酶系統(O’Gorrnan 等，科學（Science) (1991) 251:1351-1355)。如果 cre/loxP 10 重組酶系統被用於調控轉殖基因的表現，則需要同時含有編碼ere重組酶和選定蛋白的轉殖基因的動物。該動物可通過構建“雙”轉殖基因動物，例如通過兩轉殖基因動物的交配來提供，所述動物中一個含有編碼選定蛋白的轉殖基因而另一個含有編碼重組酶的轉殖基因。 I5 此處描述的非人轉殖基因動物的選殖體可根據以下文獻描述的方法製備，Wilmut等，自然（Nature) (1997) 385:810-813 和 PCT 公開 Nos· WO 97/07668 和 WO 97/ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 07669。簡言之，可以分離轉殖基因動物的細胞（如體細胞），誘導其脫離生長周期並進入G〇期。然後，通過應用 20如電脈衝將此靜止細胞與去除細胞核的卵母細胞融合，所述去核卵母細胞與分離的靜止細胞來自同一動物物種。然後培養重建的卵母細胞以使其發育成桑椹胚或胚細胞，然後將其轉移到假孕的雌性代孕動物體内。雌性代孕動物生月的後代即是所分離的細胞（如體細胞）的來源動物的選本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（2i〇x5 -56- 200402424 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（55) 殖體。藥物組合物本發明的GAVE17核酸分子、GAVE17蛋白質和抗-5 GAVE17抗體（此處也稱作“活性化合物”)可摻入到適於施用的藥物組合物中。該組合物一般包含此核酸分子、蛋白或抗體’以及藥學可接受載體。如此處所用，術語“藥學可接受載體”意在包括任何及所有適合藥物施用的溶劑、分散介質、賦形劑、載體、稀釋劑、包衣材料、抗菌藥和 1〇抗真菌劑、等滲劑和延遲吸收劑等。對藥物活性物質應用這些’I質和藥劑是本領域熟知的。除了與活性化合物不相容的外，任何常規介質或藥劑均可考慮應用在組合物内。還可以將辅助活性化合物摻入組合物中。將本發明的藥物組合物進行配製以使其適合於預定的 15施用途徑。施用途徑的實例包括腸胃外用藥，例如靜脈内、皮内和皮下、經口（如吸入）、經皮（局部的經粘膜和直腸用藥。用於腸胃外、皮内和皮下給藥的溶液或懸液可包括以下成分：無菌稀釋劑（如用於注射的水^睫溶液、不揮發油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合^ 2〇抗菌劑如基醇或經苯甲酸甲醋；抗氧化劑如^二酸或亞硫酸氫納；螯合劑如EDTA ;緩衝液如错‘壞= 檬酸鹽或磷酸鹽以及用於調整滲透壓的試劑如氣化二〆二萄糖。PH的調整可應用酸或域，如Ηα或Na〇ii。或葡外製劑可封閉在安飯瓶、一次性注射器或多劑腸胃瓶（玻

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200402424 A7 B7 五、發明說明（56) 璃或塑膠製成）中用以存儲。適於注射用藥的藥物組合物包括無菌水性溶液（水可混溶的）或分散液，以及用於隨時製備無菌注射液或分散液的無菌粉末。對於靜脈内施用，合適的載體包括生理鹽 5 水、抑 g 水、Cremophor El® (BASF; Parsippany，NJ)或磷酸鹽，衝溶液(PBS)。在所有的情況中，組合物必須無菌且應是易於注射的流體。組合物在生產和儲存條件下必須穩疋且必須避免微生物（如細菌和真菌）的污染。載體可為溶劑或分散介質，含有如水、乙醇、多元醇（如甘 10油丙一醇和液態聚乙二醇等）和其適宜的混合物。適當的流動性可通過例如使用包衣材料（如卵磷脂），在分散齊J的h況下保持所需的粒子大小和應用表面活性劑來維持。夕種抗菌劑和抗真菌劑可用來預防微生物的作用，如對經苯甲酸酷、氯代丁醇、苯盼、抗壞血酸、乙基采硫代 15水揚酸鈉等。在許多情況下，組合物中優選包括等滲劑，例如糖、聚醇（如甘露醇、山梨糖醇）或氯化鈉。可注射組合物的延時吸收可以通過在組合物中加入延緩吸收的試劑實現’所述試劑如單硬脂酸鋁和凝膠。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製無菌注射溶液的製備可以按如下進行：將活性化合物 20 (如GAVEH蛋白質或抗-GAVE17抗體）以所需數量與以上所列成分中的一種或其組合（按需要）摻入到適當的溶劑中，之後過濾除菌。一般地，分散劑的製備方式是將活性化合物摻入到含鹼性分散介質和所需其他成分（來自以上列舉的成分）的無菌賦形藥中。對於配製用於無菌注射溶 -58- ^^尺度適用中國國家蘇商§_)A4規格（210_?分7公楚]---------- 200402424 A7 B7 五、發明説明（57 液的無菌粉末’優選的製備方法是真空乾燥和冷束乾燥，從預先過濾除菌的溶液產生含有活性成分及任何額外所需成分的粉末。口服組合物-般包括惰性稀釋液或可食用的載體。细 5合物可密封於凝膠膠囊中或壓成片劑。為用於口服治療性施用目的，可以將活性化合物加入賦形劑中並以片劑、錠劑或膠囊形式使用。口服组合物也可用流體作漱劑，其中流體載體中的化合物經口應用、漱口然後吐出或咽下。 10 藥學相容的粘合劑和/或輔藥可包括為組合物的部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可含有以下任一種成分或具有類似性質的化合物：粘合劑，如微晶纖維素、黃蓍膠或凝膠；賦形劑如澱粉或乳糖；崩解劑如藻酸，Primogel 或玉米澱粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或Ster〇tes ;助流劑如膠 15體二氧化矽；甜味劑如蔗糖或糖精；或調味劑如薄荷、水楊酸甲基酯或橙味調味品。用於吸入施用時，化合物以氣溶膠喷霧形式遞送，氣溶膠可由含合適推進劑（例如，氣經濟部智慧財產局員工消費合作社印製體如二氧化碳）的加壓容器或分配器（dispenser)或喷霧器產生。 ' 2〇全身施用也可通過經皮或經粘膜途徑進行。對於經皮或經粘膜施用，可將對待滲透的屏障而言適宜的滲透劑用於製劑中。該滲透劑一般在本領域内公知，且包括如用於經粘膜施用的去污劑、膽鹽和梭鏈孢酸衍生物。經粘膜施用可通過應用鼻喷霧或栓劑完成。對於經皮施用，活性化 -59- \纸張尺麟t目目蘇準(cnS)A4 SBbi 200402424 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（58) 合物的劑型可以為本領域内公知的軟膏、油膏、凝膠或霜劑。化合物也可以製備成栓劑（例如，應用常規栓劑基質如可可油或其他甘油酯）或灌腸滯留劑形式直腸遞送。在一個實施方案中，活性化合物應用可以保護化合物 5避免其從體内被快速清除的載體進行配製，例如控釋製劑’包括楂入物和微囊化遞送系統。可以應用可生物降解的生物相谷性聚合物，如乙稀乙酸乙烯酯、聚軒、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。用於製備這些製劑的方法對本領域内的技術人員而言 10是顯而易見的。材料也可從供應商處獲得，如Alza公司和Nova Pharmaceuticals，Inc·。也可用脂質體懸液（包括帶有單株抗體靶向感染細胞的脂質體）作為藥學可接受載體。這些可根據本領域内技術人員公知的方法製備，如參見美國專利Νο·4,522,811中的描述。 15 配製單位劑量形式的口服或腸道外用藥組合物是特別有利的，這可以利於施用及劑量的一致性。此處應用的單位劑量形式指在物理上不連續的適用于作為整體給予待治療患者的單位；每一單位含預定量的活性化合物，該數量的活性化合物與所需的藥物載體聯合可產生所需的治療效 20 應。根據疾病的類型及嚴重程度，施用給患者的起始候選劑量為約 1 pg/kg 到 15 mg/kg (如 0·1_20 mg/kg)的抗體’無論是，例如，通過一次或多次單獨施用或是通過連續輸注。根據以上提及的因素，典型的每日劑量可為約1 Kg/kg到100 mg/kg或更大。對於超過幾天或更長的重 -60- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐）

200402424 ίο 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 發明說明（分）復施用，根據疾病，治療可持續進行直到發生了所需的對疾病症狀的抑制。但是，其他給藥方案也可以使用。治療的進程由常規的技術和試驗可以容易地進行監測。一示例性劑給藥方案在WO 94/04188中公開。用於本發明單位劑量形式的規格決定於且直接依賴於活性化合物的獨特特 f生待獲彳于的具體治療效果以及複合該活性化合物用於個體治療時本領域所固有的限制。可將本發明的核酸分子插入載體並用作基因治療載體。將基因治療載體遞送給患者可通過如靜脈注射、局部施用（美國專利No· 5,328,470)或通過立體定位注射(例如參見 ’ Chen 等’美國科學院院刊(pr〇c Natl Acad USA) (1994) 91:3054-3057)進行。基因治療載體的藥物製劑可以在可接义稀釋劑中包括基因治療載體；或可以包含其中埋植有基因遞送工具的緩釋基質。備選地，當整個基因遞送載體可從重組細胞中完整產生時，例如反轉錄病毒載體，藥物製劑可包括一個或多個產生此基因遞送系統的細胞。藥物組合物可與施用說明書一起包含在容器、包裝或分配器内。本發明的應用和方法此處描述的核酸分子、蛋白質、蛋白質同系物和抗體可用於一種或多種以下的方法中：a)篩選試驗；b)檢測試驗(例如，染色體作圖、組織分型、法醫生物學）；c)預測醫學（例如，診斷試驗、預後試驗、監測性臨床檢查和藥 -61- 本紙張尺度適用中國國冢標準(CNS)A4規格（210x297公釐）計線 200402424 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（60 ) 物基因組學）；和d)治療方法（如治療性和預防性的）。 GAVE17蛋白質與其他細胞蛋白質相互作用，因此可用於 ⑴調節細胞增殖·，（ii)調節細胞分化；和（iii)調節細胞存活。本發明的分離的核酸分子可用于表現GAVEi7蛋白質 5 (例如，在佰主細胞中通過重組表現載體表現用於基因治療）’用於檢測GAVE17 mRNA (如在生物樣本中）或用於檢測GAVE17基因中的遺傳損傷以及用於調節GAVE17活性。此外，GAVE17蛋白質可用於篩選能調節gAVE17活性或表現的藥物或化合物，以及用於治療紊亂，所述紊亂 1〇的特徵為GAVE17蛋白質產生不足或過量，或產生的 GAVE17蛋白質形式與GAVE17野生型蛋白質相比活性降低或異常。此外，本發明抗-GAVE17抗體可用於檢測和分離GAVE17蛋白質，以及用於調節GAVE17活性。本發明進一步涉及通過以上描述的篩選試驗鑑定到的新型藥劑， 15 及其在此處描述的治療中的用途。 A·篩選試驗存在内源配體時啟動G蛋白質受體將允許G蛋白受體複合體形成，由此導致GTP結合G蛋白。G蛋白的 20 GTPase結構域可以將GTP緩慢水解為GDP ,在正常情況下導致受體失活。但組成型啟動的受體會持續將GDp轉變成GTP。 G蛋白的不可水解受質[35S]GTPyS可用於監測G蛋白與胞膜增強的結合作用，其中所述胞膜表現組成型啟動的 -62-

五 61 200402424 受體。Trayn〇r和Nahorski報道’ ps]GTp<yS可用於監測在存在或缺乏配體時與膜偶聯的G蛋白（Μ〇1 (1995) 47(4):848-54)。該試驗系統優選用於候選化合物的起始篩選’因為該系統可通聽所有G蛋白偶聯受體，而 5不必考慮與受體結合的具體G蛋白的種類。

Gao刺激腺苷環化酶，而Gi和G。抑制該酶。如在本領域内所公知的，腺苷環化酶催化ATP向cAMP轉形；因而，偶聯Gs蛋白的組成型活化GPCr將與提高的cAMp 細胞量相關聯。備選地，偶聯Gi(或G。)蛋白的組成型活化 10 GCPRs將與降低的CAMP細胞量相關聯，參見“突觸傳導的間接機制（Indirect Mechanism of Synaptic Transmission ) ”，第8章，從神經元到腦（yd Ed)，

Nichols 等編，Sinauer Associates，Inc” 1992。GAVE17 刺激導致cAMP量降低，因而，GAVE17不與Gs發生相互 15 作用。因此，檢測cAMP的試驗可用於判定候選化合物是否為受體的反向激動劑。本領域内已知的多種測定cAMP 的方法均可以使用。在一個實施方案中，抗-cAMP抗體用於基於ELISA的試驗中。在另一實施方案中，則考慮全細胞第二信使報告系統（見PCT公開No. W0 00/22131)。 20 某些G蛋白，如G。和Gq，與磷脂酶C的啟動相關，所述磷脂酶又可水解磷脂PIP2釋放出兩個胞内信使：甘油二酯(DAG)和1，4,5-三磷酸肌醇(IP3)。IP3積聚的增加與 Gq-相關受體和G。-相關受體的啟動相關聯(PCT公開No. WO 00/22131)。檢測IP3積聚的試驗可用於判定候選化 -63- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 'Λ V 0000

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i=lGq·相關受體或G。-相關受體的反向激動劑。賴"的填Γ，。用AP1報告試驗檢測’該試驗檢測Gq-依疋否引起了含AP1元件的基因的啟動。這 W純态ιηΓ'·相關受體將顯示為該基因表現的增強，而反向激動劑將顯示為該表現的減弱。、里了用於鑑定調節劑的方法(此處也稱作“篩

St ^ 節料綠合G細17蛋自質或對例如選物 10 15 20 現或GAVE17活性具有刺激或抑制效應的候 ^測試化合物或試劑（例如，肽、肽類比 (Ρ_—Μ、小分子或其他藥物）。〜候合物可為核苷酸衍生物，且特別是嗓呤核苷酸何生物。何生物意指修飾的嗓吟核苷酸，其修飾的方式並 ^反向影響其結合和啟動GAVE17的能力而是提供了其他藥理學優點，如血清半衰期延長。在個只鈿方案中，本發明提供用於篩選如下候選或測試化合物的試驗，所述化合物能結合膜結合形式的 GAVE17蛋白質、多肽或其生物活性部分或調節其活性。本發明的測試化合物可應用本領軸公知的組合文庫方法中的？手段之種獲得，包括··生物庫；可空間定址的平行固相或液相庫；需要去褶合（deC〇nv〇lmion)的合成庫方法；“單珠單化合物，，財法；和應用親和層析^ 擇的合成庫方法。生物庫方法限於肽庫，而其他四種方法適用於肽、非肽寡聚體或小分子化合物庫(Lam，抗癌藥物研究（Anticancer Drug Des) (1997) 12:145) 〇 -64- ^^尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公爱） 200402424 A7 B7 五、發明說明（63) 用於合成分子庫的方法的實例可在本領域内發現，例如：DeWitt等，美國科學院院刊（Proc Natl Acad USA) (1993) 90:6909 ; Erb 等，美國科學院院刊(Proc Natl Acad USA) (1994) 91:11422 ; Zuckermann 等，J Med Chem (1994) 5 37:2678; Cho 等，科學(Science) (1993) 261:1303 ; Carrell 等，Angew Chem Int Ed Engl (1994) 33:2059 ; Carell 等， Angew Chem Int Ed Engl (1994) 33:2061 和 Gallop 等，J Med Chem (1994) 37:1233。化合物庫可呈現在溶液中（例如，Houghten Bio / 10 Techniques (1992) 13:412-421)或珠子上（Lam，自然 (Nature)(1991) 354:82-84)、晶片上（Fodor，自然（Nature) (1993) 364:555-556 )、或呈現為細菌（美國專利No· 5.223.409) 、孢子（美國專利 Nos· 5,571，698 ; 5,403,484 和 5.223.409) 、質粒(Cull等，美國科學院院刊（ProcNatlAcad 15 USA) (1992) 89:1865-1869)或噬菌體形式(Scott 等，科學經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (Science) (1990) 249:386-390 ; Devlin，科學（Science) (1990) 249:404-406; Cwirla 等，美國科學院院刊(Proc Natl Acad USA) (1990) 87:6378-6382 ;和 Felici，分子生物學雜誌（JMol Biol) (1991)222:301-310)。 20 在一個實施方案中，試驗為基於細胞的試驗，其中在細胞表面表現膜結合形式的GAVE17蛋白質（或其生物活性部分）的細胞與受試化合物接觸，並測定受試化合物結合GAVE17蛋白質的能力。例如，細胞可為酵母細胞或哺乳動物來源的細胞。測試化合物與GAVE17蛋白質結合能 -65- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200402424 A7 B7 五、發明說明（64 ) 力的測定可以通過例如以下方式進行：將測試化合物與放射性同位素或酶標記偶聯，這樣測試化合物與 GAVE17 蛋 &質或其生物活性部分的結合^通過檢測複合物中的標記北合物進彳丁確定。例如，測試化合物可直接或間接標記 5 ^ 35^ ^ 14λ-^ ji> 3tj ' ^或Η’放射性同位素的檢測可通過直接計數放射置或通過閃爍計數進行。備選地，測試化合物可應用酶標記，如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶或螢光素酶， i酶標記的檢測可通過測定適宜的受質向產物的轉形來實現。 10 在優選的實施方案中，試驗包括將在細胞表面表現膜結合形式的GAVE17蛋白質或其生物活性部分的細胞與結合GAVE17的已知化合物接觸以形成試驗混合物，將試驗混合物與測試化合物接觸並測定測試化合物與GAVE17蛋白質相互作用的能力，其中所述測定測試化合物與 15 GAVE17蛋白質相互作用的能力包括測定測試化合物與已知化合物相比優先與GAVE17或其生物活性部分結合的能力。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在另一實施方案中，試驗為基於細胞的試驗，包括使細胞表面表現膜結合形式的GAVE17蛋白質或其生物活性 20部分的細胞與測試化合物接觸，並測定測試化合物調節 (如刺激或抑制）GAVE17蛋白質或其生物活性部分的活性的能力。測試化合物調節GAVE17或其生物活性部分的活性的能力可通過，例如，測定GAVE17蛋白質結合 GAVE17靶分子或與其相互作用的能力來確定。 -66- 不紙浪人及週用γ ®因豕標準(cnS)A4規格（210x297公釐） 200402424 A7 B7 五、發明說明 65 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 如此處所用，“乾分子”是指天然與GAVE17蛋白質結合或作用的分子，如表現GAVE17蛋白質的細胞的表面分子、在第二細胞表面上的分子、在細胞外周圍區域中的分子、與胞膜内表面關聯的分子或細胞質分子。GAVE17乾刀子不會是GAVE17分子或本發明的GAVE17蛋白質或多肽。在一個實施方案中，GAVE17靶分子為信號轉導途徑的成分，所述途徑促進胞外信號（例如由化合物結合膜結合形式的GAVE17分子所產生的信號)通過胞膜向細胞内轉導。例如，靶分子可為具有催化活性的第二胞内蛋白質或促進下游信號分子與GAVE17關聯的蛋白質。 GAVE17蛋白質與GAVE17靶分子結合或作用的能力可通過以上描述的用於測定直接結合的其中一種方法來測定。在優選的實施方案中，GAVE17蛋白質與GAVE17把分子結合或作用的能力可通過測定靶分子的活性來確定。靶分子活性的測定方法有例如：檢測靶分子對胞内第二信使(如胞内Ca2+、甘油二酯、IP3等）的誘導、檢測靶分；對合適受質的催化/酶促活性、檢測報告基因（例如可操作地連接編碼可檢測標記（如螢光素酶）的核酸的 GAVE17效應調控元件）的誘導或檢測細胞反應，例如細胞分化或細胞增殖。而在另-實施方案中，本發明的試驗為無細胞試驗，包括將GAVE17蛋自質或其生物活性部分_試化合物接觸，並測定測試化合物結合GAVE17蛋白質或其生^活性部分的能力。測試化合物與GAVE17蛋白質的結人可以如 -67- ^紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規袼（21〇 X 297公爱） 200402424 五、發明說明（66) 以上所描述的方式直接或間接進行檢測。在優選的實施方案中’試驗包括將GAVE17蛋自f或其生物活性部分與能結合GAVE17的已知化合物接觸以形成試驗混合物，將試驗混合物與測試化合物接觸並測定測試化合物與gave17 5蛋白質結合的能力，其中對測試化合物與gavei7蛋白質結合的能力的測定包括測定測試化合物與已知化合物相比優先結合GAVE17或其生物活性部分的能力。在另一實施方案中，試驗為無細胞試驗，包括將 GAVE17蛋自料其生物活性部分與賴化合物接觸並測 ίο定測試化合物調節（如刺激或抑制）GAVE17蛋白質或盆生物活性部分的活性的能力。對測試化合物調節抓 $活性的能力的測定可通過，例如利用以上描述的用於測定直接結合的其中一種方法測定GAVE17蛋白質結合 GAVE17靶分子的能力來實現。在備選的實施方案中了二 15測試化合物調節GAVE17活性的能力的測定可通過測定 GAVE17蛋白質進一步調節_17靶分子的能力來實現。例如，可以按前述測絲分子對適當受質的催化/酶促活性。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製而在另一實施方案中，無細胞試驗包括將GAVE17蛋 20白質或其生物活性部分與能結合⑽奶的已知化合物接觸以形成試驗混合物，將試驗混合物與測試化合物接觸並測定測試化合物與GAVE17蛋白f相互作用的能力其中對測試化合物與GAVE17蛋白質相互作用的能力的測定包括測定GAVE17蛋白質優先結合GAVE17乾分子或調節 -68- 本紙張尺度適时關家標準(CNS)A4規格（21Gx297公楚| 200402424 _______B7_ 五、發明說明（67 ) GAVE17靶分子的活性的能力。受體可由非配體分子啟動，所述非配體分子並不一定抑制配體結合但可引起受體結構改變以致造成G蛋白結合或’可Sb的义體集、一聚化或族集’從而引起啟動作 5 用。因此，可以由暴露於細胞表面的GAVE17的多個部位引起抗體。然後’可篩選出經標準試驗（如監測cAMP量或胞内Ca+2量）測定能通過G蛋白級聯啟動細胞的抗 10 抗體可用公知的技術製備。由於涉及分子作圖，特別是表位作圖，單株抗體可能是優選的。單株抗體可由表現於細胞表面的完整受體以及已知在細胞表面形成的肽引起。可應用Geysen等，美國專利No· 5,998,577的方法以獲得大量的相關肽。 15 已發現可啟動GAVE17的抗體可經過修飾以最小化與經濟部智慧財產局員工消費合作社印製啟動GAVE17無關的活性，如補體結合。這樣，可對抗體分子實行截短或突變以使啟動GAVE17以外的活性最小或喪失。例如，對某些抗體，僅需要抗原結合部分。這樣，可移去抗體的Fe部分。 20 將表現GAVE17的細胞暴露於抗體以啟動GAVE17。然後使啟動的細胞暴露于多種分子以期鑑定出那些改變受體活性（無論是提高啟動量還是降低啟動量）的分子。然後可對達此目的的分子在無抗體的情況下在表現GAVE17 的細胞上進行試驗，以觀察對非啟動細胞的效應。然後可 -69- 本紙張尺度適用肀國國家標準(CNS)A4規;^ (210x297公釐） 200402424 A7

以用A决的技術檢測乾分子並將其修飾為候選藥物，用於治療與GAVE17代謝改變相關的纽。、 10 本發明的無細胞試驗適於應用可溶形式和膜結合形式的GAVE17對於包括膜結合形式的⑽抓的無細胞試驗，可能需要利用增溶劑以使膜結合形式的gavei7維持 f綠中。該增_的實例包括_子去污劑，如正辛基葡糖苷正+十一燒基葡糖菩、正十二烧基麥芽糖菩、辛酿基-N-曱基葡糖醯胺、癸醯基况甲基葡糖酿胺、如的n t 刚、Triton X_114、Thesit⑧、異三癸基聚（乙二醇抑、錯酸氣氨基丙基)二曱基錄丙烧(CHAPS)、磺酸j [(3·氯氨基丙基)一甲基銨;|_2_經基小丙烧(CHAps〇)或續酸 N-十二烷基-N，N-二曱基銨· 丙烷。 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在本發明以上試驗方法的不止一個實施方案中，可能需要固定GAVE17或其t分子以易於從非複合形式的一種或全部兩種所述蛋白質中分離出複合形式，以及適於試驗的自動化。在存在或缺乏候選化合物時測試化合物與 GAVE17的結合或GAVE17與靶分子的相互作用可在任何適用於谷納反應物的容器内完成。該容器的實例包括微滴板、試管和微離心管。在一個實施方案中，可提供融合蛋 20白’該融合蛋白質添加有允許其中一種或全部兩種上述蛋白質結合到基質上的結構域。例如可將麩胱甘肽轉移酶 /GAVE17融合蛋白或麩胱甘肽-S_轉移酶/靶融合蛋白吸附到麩胱甘肽 Sephares®(Sigma Chemical，St· Louis，MO) 上。備選地，可應用麩胱甘肽衍生的微滴板，然後使微滴 -70· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200402424 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（69) 板接觸測試化合物，或測試化合物和非吸附靶蛋白或 GAVE17蛋白質，且在利於形成複合物的條件下孵育混合物（例如在生理性鹽和pH條件下）。孵育後，洗滌珠子或微滴板孔以移去任何未結合成分，且直接或間接地測定複 5合體的形成，參見以上描述。備選地，可以使複合物與基質解離，且用標準技術測定GAVE17的結合或活性量。其他用於固定蛋白質於基質上的技術也可用于本發明的篩選試驗。例如，可利用生物素或鏈黴親和素固定 GAVE17或其靶分子。生物素化的GAVE17或靶分子可應 ίο用本領域内公知的技術（如生物素化試劑盒，Pierce

Chemicals，Rockford，IL)從生物素_NHS (N-經基-丁二醯亞胺）製備產生，並固定在鏈黴親和素包被的96孔板(pierce Chemicals)的孔内。備選地，可使用與GAVE17或乾分子反應但不阻礙GAVE17蛋白質結合靶分子的抗體對平板的 15孔進行衍生，通過抗體結合，未結合的把標或GAyE17將被捕獲在孔内。除了以上描述的用於檢測GST_固定的複合物的方法外，用於檢測複合物的方法還包括應用與 GAVE17或靶分子反應的抗體對複合物進行的免疫檢測以及依賴於檢測與GAVE17或靶分子連結的酶促活性的酶聯 20 試驗。在另-實施方案中，GAVE17表現的調節劑的鑑定方法中’使細胞與候選化合物接觸並測定胞内GAVE17 mRNA或蛋白質的表現。將存在候選化合物時GAvm7 mRNA或蛋白質的表現量與缺乏候還化合物時GAv]gi7 -71.

200402424 A7 B7 五、發明說明（70) mRNA或蛋白質的表現量進行比較。然後，基於該比較，可以鑑定候選化合物是否為GAVE17表現的調節劑。例如’當GAVE17 mRNA或蛋白質在存在候選化合物時的表現大於（統計學顯著大於）缺乏該化合物時的表現，則候 5選化合物被鑑定為GAVE17 mRNA或蛋白質表現的刺激劑或激動劑。備選地，當GAVE17 mRNA或蛋白質在存在候選化合物時的表現低於（統計學顯著低於）缺乏該化合物時的表現，則候選化合物被鑑定為GAVE17 mRNA或蛋白質表現的抑制劑或拮抗劑。如果GAVE17活性在存在配體 10或激動劑時減少，或在組成型GAVE17的情況下低於基線，則候選化合物被鑑定為反向激動劑。胞内GAVE17 mRNA或蛋白質的表現量可由此處描述的用於檢測 GAVE17 mRNA或蛋白質的方法進行測定。而在本發明另一方面，GAVE17蛋白質可在雙雜交或 15 三雜交試驗中用作“誘餌蛋白，，(例如參見美國專利No. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5,283,317; Zervos 等，細胞（Cell) (1993) 72:223-232; Madura 等，生物化學雜誌（j Biol Chem ) (1993) 268:12046-12054; Bartel 等，Bio / Techniques (1993) 14:920-924; Iwabuchi 等，致癌基因（Oncogene) (1993) 20 8:1693-1696;和 PCT 公開 No· WO 94/10300)，以鑑定其他與GAVE17結合或作用（“GAVE17結合蛋白，，或 “GAVE17-bp”）並調節GAVE17活性的蛋白質。該 GAVE17-結合蛋白也可能通過作為如GAVE17途徑的上游或下游元件，參予GAVE17蛋白質引起的信號傳播。 -72- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200402424 A7 B7 五、發明說明（71) 由於可製備出大量的純GAVE17，故可以確定出可能功能區域的構象的物理特徵，用於合理的藥物設計。2 如，該分子的IC3區域和EC結構域為特別有意義的區域。一旦確定了區域的形狀和離子構型，可與這些區域作 5用的候選藥物即可成型，然後可以在完整細胞、動物和* 者中進行試驗。能夠獲得此3-D結構資訊的方法包括χς 線晶體學、NMR光譜學、分子建模等。3_D結構也可導致鑑定出其他已知蛋白中的類似構象位點，對於所述蛋白已存在作用於此位點的已知藥物。這些藥物或其衍生物 10 能用於GAVE17。本發明還涉及由以上篩選試驗鑑定到的新藥劑，以及其在此處描述的治療中的應用。 B.檢測試驗 15 此處鑑定的CDNA序列的部分或片段（以及相應完整經濟部智慧財產局員工消費合作社印製的基因序列）可在多種方面用作多核菩酸試劑。例如，序列可用於··⑴在染色體上對相應的基因繪圖並，由此定位與遺傳疾病相關的基因區域；（ii)從微小量樣本中對個體實施鑑疋（組織分型）；和(iii)為生物樣本的法醫鑑定提供幫 20助。這些應用在以下的分段中描述。 1·染色體作圖一旦分離出基因的序列（或序列的_部分），則該序列可用於在染色體（如，3號染色體）上定位GAvm7基因。 -73-

200402424 A7 B7 五、發明說明（72) 因此，此處描述的GAVE17核酸分子或其片段可用於在3 號染色體上作圖定位GAVE17。3號染色體上GAVE17序列的作圖定位是確定序列與疾病相關基因（例如HLA複合物）的關係的重要第一步。 5 簡言之，通過從GAVE17序列中製備PCR引子(優選的長度為15-25 bp)，可以對GAVE17基因在3號染色體上作圖。引子用於含單個人類染色體的細胞雜合體的pCR 筛選。僅有含與GAVE17序列對應的人類基因的那些雜合體能產生擴增片段。 10 通過融合不同哺乳動物細胞來源的體細胞（例如，人和鼠的細胞）製備體細胞雜合體。人和鼠細胞的雜合體在生長和分裂時，一般人的染色體會出現隨機丟失，而鼠染色體保留。通過應用鼠細胞（由於缺乏特定的酶）不能但人細胞可以在其中生長的培養基，含編碼所需酶的基因的經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 15 一條人染色體將得以保留。通過應用多種培養基，可以建立雜合細胞系小組。組内每一細胞系含單一的人染色體或小數目的人染色體及一整套鼠染色體，從而使得可容易地將早獨的基因作圖定位於特定的人染色體上(D’Eustachio 等’科學(Science) (1983) 220:919-924)。還可通過應用帶 20 有易位和缺失的人染色體製備僅含人染色體片段的體細胞雜合體。體細胞雜合體的PCR作圖是將特定序列定位於特定染色體上的快速方法。每台熱迴圈儀每天可定位三段或更多的序列。用GAVH17序列設計募核苷酸引子，用一組3 -74- 本紙張尺度通用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公爱） 200402424 A7 B7 五、發明說明（73 ) 號染色體的片段或涉及其的易位體可進行亞定位。其他作圖策略可同樣用於在3號染色體上對GAVE17序列進行作圖定位，包括原位雜交(描述於Fan等，美國科學院院刊 (Proc Natl Acad USA) (1990) 87:6223-27)、分析資訊家族中 5 的遺傳本質（inheritance in informative families)、用標記的流式分揀染色體預篩選和通過與染色體特異的cDNA庫雜交進行預選擇。可使用DNA序列與中期染色體鋪展物的螢光原位雜交(FISH)—步提供精確的染色體定位。染色體鋪展物的製 10 備可應用被化學物阻滯在分裂中期的細胞進行，所述化學物如可破壞有絲分裂紡錘體的秋水仙域。染色體可以用胰蛋白酶短暫處理然後進行Giemsa染色。每條染色體上會出現亮帶和暗帶圖案，由此可鑑定出單獨的染色體。FISH 技術可應用500或600個域基的DNA序列進行。但是， 15 大於1，000個域基的選殖體更有可能結合獨特的染色體位置並產生足夠用於樣本檢測的信號強度。優選地1，000個域基且更優選地2,000個域基將足以在合理的時間内產生好的結果。參見Verma等的有關該技術的綜述(人類染色體：基礎操作手冊（Human Chromosomes: A Manual 〇f 20 Basic Techniques) (Pergamon Press，New York，1988))。染色體作圖可以在石夕片上（in silico)考慮統計學因素，如優勢對數得分或單純接近度（mere proximity)進行推斷。例如，可以通過矽片上作圖將GAVE17繪製在3號染色體的長臂。 -75- I棋;?疮搞用中固國家標準(CNS)A4規格（210x297公楚） ' ^ •tj. -綿丨經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 200402424 A7 B7 五、發明說明（74) 用於染色體作圖的試劑可單獨應用以標記3號染色體或染色體上的單一位點，或可應用一組試劑用於標記多個位點和/或多條染色體。對作圖目的，實際上優選對靡于 GAVE17基因兩翼區域的試劑。編碼序列在基因家族内更 5 可能保守，因此增加了染色體作圖中交叉雜交的機會。一旦將序列繪製在精確的染色體位置，則可以將序列在染色體上的物理位置與遣傳圖譜資料聯繫起來（該資料存放在例如McKusick，人類的孟德爾遺傳（MendeHan

Inheritance in Man)中，可在線從 Johns Hopkins 大學的 10 Welch醫學圖書館獲得）。基因和繪圖定位於同一染色體區域的疾病之間的關係，可通過連鎖分析進行鑑定（物理上鄰近的基因的共遺傳），如參見Egeland等，自然(Nature) (1987) 325:783-787 中的描述。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製此外，可測定受到或未受到GAVE17相關疾病影響的 15個體間DNA序列的差異。如果在一些或全部的受影響個體中觀察到突變而未在任何未受影響的個體中觀察到此突變，則該突變為可能的特定疾病的致病因數。對受到影變和未受到影響的個體的比較一般包括首先在染色體中結構的改變，如缺失或易位，所述改變可在染色體鋪展物 20中觀察到或可應用基於該DNA序列的pcr檢測到。最終，可對來自幾個個體的基因進行完整測序，以證實突變的存在並將突變與多態性區分開來。 -76-

A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 200402424 五、發明說明（75) 2·組織分型本發明的GAVE17序列也可用於從微小量的生物樣本對個體進行鑑定。例如，美國部隊正考慮將限制性片段長度夕悲性(RFLP)用於人員的鐘定。該技術中，用一種或多 5種限制性酶消化個體的基因組DNA ,在Southern印潰中用探針探測以產生獨特的條帶用於鑑定。該方法避免了目刖身份識別牌（Dog Tags)方法的限制，所述限制酶例如可丟失、轉換或被竊，這使得陽性鑑定變得困難。本發明的序列可用作RFLP的額外DNA標記(在美國專利N〇. 10 5,272,057 中描述）。此外，本發明的序列可用於提供備選的技術以逐個域基確定個體基因組中選定部位的實際DNA序列。這樣，此處描述的GAVE17序列可用於製備針對序列的5，和3，末端的兩段PCR引子。然後可以制引子擴增個體的職 15 並隨後提供其序列。由此方式從個體製備得到的相應DNA序且 f特的個體身份證明，這是因為由於等位基因的差異使得每-個體具有獨特的—套該DNA序列。可應用本發明的序列從個體和組織獲得此身份證明序列。本發明的 2〇 GAVE17軸是人類基因財的—侧特部分。在序列的編碼區有-定程度的等位基因變異，且在非編碼區有程度，高的變異。據估計人類個體間等位元基因變異的頻率為每500個域基約發生一次。此處描述的每個序列均可在某種程度上作為標準，，與來自個體的職比較用於鑑定的、本紙張尺度適用㈣國家標節規格⑽X 297公楚) ----一

200402424 A7 B7 五、發明説明（76) 目的。由於非編碼區有更多數目的多態性，故區分個體所必需的序列就更少。SEQ ID ΝΟ:1的非編碼序列可應用一組約10到10,000個引子（每條引子產生100個域基的非編碼擴增序列）提供陽性的個體鑑定。如果應用預測的編 5碼序列如SEQ ID ΝΟ:1中的那些，用於陽性個體鑑定的更為合適的引子數目將為500-2,000。如果使用來自GAVE17序列的一組試劑（如此處所描述）產生了個體的獨特身份證明資料庫，則同樣的試劑可隨後用於鑑定來自該個體的組織。應用此獨特身份證明資 10料庫，可從極其少量的組織樣本中實現個體（存活的或死亡的）的陽性鑑定。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 3·部分GAVE17序列在法醫生物學中的應用基於DNA的鑑定技術也可用于法醫生物學中。法醫 15生物學為應用對犯罪現場發現的生物證據進行遺傳分型來作為陽性鑑定（如犯罪者）手段的一個科學領域。為進行鑑定，可應用PCR技術擴增取自很少量生物樣本的dna 序列，所述生物樣本如發現於犯罪現場的組織（如頭髮戍皮膚）或體液（如血液、唾液或精液）。然後可與標準口 20比較擴增序列，由此允許鑑定出生物樣本的來源。本發明的序列可用於提供多核苷酸試劑，如乾向人類基因組特定位點的PCR引子，所述試劑可增加基於DNA 的法醫鑑定的可靠性。例如，目的核酸可提供另一“夢定標記”(即，特定個體>斤特有的另一 dna序列）。如以上提 -78- 本纸張尺度通用中國國家標準(CNS)A4_規格（21〇χ297公幻 ---------- 200402424 A7 B7 五、發明說明（77) 到的’實際的域基序列資訊可作為由限制性酶產生的片段圖形的一個精確備選方案用於鑑定目的。靶向SEQ ID ΝΟ:1非編碼區的序列特別適用於此用途，因為該非編碼區存在大量數目的多態性，從而提高了應用該技術區分個 5 體的辨別力。多核苷酸試劑的實例包括GAVE17序列或其部分，例如來自SEQ ID ΝΟ:1非編碼區且長度為至少2〇到30個域基的片段。此處描述的GAVE17序列可用於提供多核苷酸試劑，如被標記的探針或標記探針，所述試劑可甩於如原位雜交 10 技術中以鑑定特定的組織（如腦組織）。這在提供給法醫病理學家的是未知來源的細胞或降解組織的情形下會十分有用。該GAVE17探針組可用於鑑定組織的物種和/或器官類型。 ° 以類似的方式，諸如GAVE17引子或探針等試劑可用 15於篩選污染的組織培養物（即在培養物中篩選不同類型細胞混合物的存在） C·預測醫學經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本發明也涉及預測醫學領域，其中診斷試驗、預後試 20驗、藥物基因組學和臨床監測試驗被用於預後（預測性）目的以預防性治療個體。因此，本發明的一個方面涉及診斷試驗，該試驗用於在生物樣本（如血、尿、糞、痰、血清、細胞和組織）環境中測定GAVE17蛋白質和/或核酸的表現以及GAVE17的活性。可應用此試驗測定個體是否 -79- 7紙張尺度適財國國家標準(CNS)A4規格（2ωχ297公楚） 200402424 A7 B7 五、發明說明（7〇罹患與GAVE17表現或活性異常相關的疾病或紊亂或存在疾病發生危險性。本發明也提供預後（或預測性）試驗，以確定個體是否存在危險發生與GAVE17蛋白質、核酸表現或活性有關 5 的紊亂。例如，可以在生物樣本中測試GAVE17基因中的突變。該試驗可用於預後或預測性的目的，由此可以在以 GAVE17蛋白質、核酸的表現或活性為特徵或與其相關的紊亂發作之前預防性治療個體。本發明另一方面提供了用於測定個體的GAVE17蛋白 10質、核酸的表現或GAVE17的活性以便由此選擇合適的治療性或預防性試劑用於該個體的方法（此處稱為“藥物基因組學”）。藥物基因組學允許基於個體的基因型（如檢查個體基因型以判定個體對特定藥劑的反應能力）選擇藥劑（如藥物）用於治療性或預防性治療個體。 15 而在本發明另外的方面，涉及到在臨床試驗中監測藥劑（如藥物或其他化合物）對GAVE17表現或活性的影響。這些以及其他的試劑在以下的部分中作進一步詳細描經濟部智慧財產局員工消費合作社印製述。 20 1.診斷試驗用於檢測生物樣本中GAVE17存在與否的示例性方法包括··從受試物件中獲得生物樣本，並將生物樣本與可檢測GAVE17蛋白質或編碼GAVE17蛋白質的核酸（如 -80- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 200402424 A7 B7 五、發明說明（79) mRNA或基因組DNA)的化合物或試劑接觸，以檢測生物樣本中GAVE17的存在。用於檢測GAVE17 mRNA或基因組DNA的優選試劑為能夠與GAVE17 mRNA或基因組 DNA雜交的標記核酸探針。核酸探針可為，例如全長 5 GAVE17核酸，如SEQ ID N0:1或其部分的核酸，如長度為至少15、30、50、1〇〇、250、500或更多個核苷酸的寡核苷酸’並且探針能在嚴緊的條件下足以特異雜交到 GAVE17 mRNA或基因組DNA上。用於本發明診斷試驗的其他合適探針在本文中有描述。 1〇用於檢測GAVE17蛋白質的優選試劑為能夠結合 GAVE17蛋白質的抗體，優選地為帶有可檢測標記的抗體。抗體可為多株的或更優選地為單株的。可應用完整的抗體或其片段(例如Fab或F(ab·)2)。對探針或抗體而言，術語“標記”意在包括通過將可檢測物質偶聯（即物理連接）到 15探針或抗體上直接標記探針或抗體，以及通過與直接被標記的另一試劑反應間接標記探針或抗體。間接標記的實例包括用螢光標記的二抗檢測一抗和用末端標記生物素的 DNA探針對螢光標記的鏈黴親合素進行檢測。術語“生物樣本”意在包括從受試物件分離的組織、細胞和生物液 20 體’以及存在於受試物件體内的組織、細胞和液體。即，本發明的檢測方法可用於在體外及體内檢測生物樣本中的 GAVE17 mRNA、蛋白質或基因組DNA。例如，用於體外檢測GAVE17 mRNA的技術包括Northern雜交和原位雜交。用於在體外檢測GAVE17蛋白質的技術包括ELISA、

-81- 200402424 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（8〇) Western印潰、免疫沈澱和免疫螢光。用於體外檢測 GAVE17基因組DNA的技術包括Southern雜交。此外，用於體内檢測GAVE17蛋白質的技術包括向受試者導入標記的抗-GAVE17抗體。例如，可給抗體標記上放射活性標 5誌，其在受試者體内的存在和部位可通過標準成象技術檢測。在一個實施方案中，生物樣本含有來自受試物件的蛋白質分子。或者，生物樣本可以含有來自受試物件的 mRNA分子或來自受試物件的基因組DNA分子。優選的生物樣本是利用常規手段從受試物件分離的外周血白細胞樣本。因此’在開發預後或診斷實驗時，將鑑定核酸或蛋白質的多態性與疾病聯繫起來用於診斷攜帶者或患者可能是有益的。例如，對於免疫細胞紊亂和腦紊亂，例如，類風濕性關節炎、哮喘、節段性回腸炎、多發性硬化和與免疫系統功能障礙及核苷酸代謝障礙有關的其他疾病，具有預後或診斷試驗將是有益的。因此，财受性、自身免疫現象、過敏體質、超敏體質等（尤其是與免疫系統相關時）是適宜的疾病情況。例如，GAVE17代謝的紊亂可以用於診斷節段性回腸炎、哮喘或RA。而且，節段性回腸炎的分子機制可能是可檢測的，例如，可能存在可以在組織樣本(如血液樣本）中檢測到的診斷性SNP、RFLP、表現量的變化性、功能的變化性等等。在另一實施方案中，這些方法還包括：從對照受試者 10 15 20 •82- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐）籲裝計線 200402424 A7 B7 五、發明說明（81) 獲得生物樣本；使對照樣本與能夠檢測GAVE17蛋白質、 mRNA或基因組DNA的化合物或試劑接觸，以便檢測生物樣本中GAVE蛋白質、mRNA或基因組DNA的存在和數量；和將對照樣本中GAVE17蛋白，質、mRNA或基因組 5 DNA的存在和數量與測試樣本中GAVE17蛋白質、 mRNA或基因組DNA的存在和數量進行比較。本發明還包括檢測生物樣本(測試樣本）中GAVE17存在的試劑盒。該試劑盒可以用於確定受試者是否患有或有增加的危險性患有與GAVE17異常表現有關的疾病（例如 10惡性腫瘤）。例如，讓試劑盒可以包含能夠檢測生物樣本中的GAVE17蛋白質或mRNA的標記化合物或試劑以及用於檢測樣本中GAVE17數量的手段(例如，抗GAVE17 抗體或能與GAVE17的編碼DNA(例如SEQ ID NO: 1)結合的募核苷酸探針）。當GAVE17蛋白質或mRNA高於或 15 低於正常量時，試劑盒還可以用於得出指示受試物件是否患者或有危險患有與GAVE17異常表現相關的疾病的結果。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製對於基於抗體的试劑盒’其可以包含例如：（1 )可斑 GAVE17蛋白質結合的第一抗體（例如附著在固相支援物 20上）；和，任選地，（2)可與GAVE17蛋白質或與第一抗體結合並級合有可檢測試劑的第二不同抗體。如果不存在第二抗體，則可以使用能與第一抗體結合並可以被標記的另一分子，或標記該第一抗體。正如本領域已知的，無論如何都應包括被標記的結合部分以充當可檢浪]報道分子。 -83- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200402424 A7 五、發明說明（82) 對於基於募核苷酸的試劑盒，其可以包含，例如可與GAVE17核酸序列雜交的寡核苷酸，例) 的寡核苷酸或(2)可用於擴增以贿核酸分子二：對。卞 5 制盒還可吨含例如緩衝劑、Είτ細或蛋白質穩定 10 ^試劑盒射以包含在探料檢職劑⑽如酶或受。質）時所必需的成分。試劑盒還可以含有可以進行分析和與測 f樣本進行比㈣對照樣本或—系觸照樣本。試劑盒的每一個成分通常裝在不同的容器中，並且所有這些不同容器與用於觀察f試物件是否患有或有危險患有GAVE17表現異常相關疾病的說明書被放在一個包裝中。 2·預後實驗 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 本文中所描述的方法可進一步用作診斷或者預後試驗以鑑定被試者患有或有危險患有與異常GAVE17表現或活性有關的疾病或病症。例如，本文中所描述的試驗，例如前瞻性診斷試驗或後隨試驗，可用於鑑定患有或者有危險患有與GAVE17蛋白、核酸的表現或活性有關的病症的被試者。例如，近來與細菌的接觸或與免疫系統異常有關的炎症可用這個實驗來檢驗。作為一種可選擇方案，可以使用預後试驗鏗定患有或有危險患有此疾病或病症的被試者。因此’本發明提供了一個方法，其中試驗樣本來自被試者，並且檢測GAVE17蛋白戒核酸（例如mRNA或基 -84- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇 χ297公釐） 200402424 A7 B7 五、發明說明（83) 因組DNA)。GAVE17蛋白或核酸的存在可以用於診斷串有或有危險患有與異常GAVE17表現或活性有關的疾病^ 病症的被試者。本文中所用的“試驗樣本”指來自目的被試者的生物樣本。例如，試驗樣本可以是生物液體（例如血清）、細胞樣本或組織。 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 此外，此處所描述的預後試驗可用於判定能否給被試者施用藥劑（例如，激動劑，拮抗劑，肽類比物，蛋白，肽’核酸，小分子或其他候選藥物）以治療與異常 GAVE17表現或活性有關的疾病或病症。例如，這些方法可用於判定特定藥劑或藥劑類（例如降低GAVE17活性的藥劑類）能否有效的治療被試者。因此，本發明提供了 — 種方法，由此可以判定藥劑是否能有效地治療患者的與異常GAVE17表現或活性相關的病症’其中獲取試驗樣本，並檢測GAVE17蛋白或核酸（例如，其中，gavE17蛋白或核酸的存在可以用於診斷被試者是否可以通過給予藥劑以治療與異常GAVE17表現或活性有關的病症）。本發明的方法還可用於檢測GAVE17基因的遺傳損傷或者突變，由此確定帶有損傷基因的被試者是否有出現如下病症的危險性’所述病症的特徵在於異常細胞增殖和 (或）分化。在優選實施方案中，此方法包括在來自被試者的細胞樣本中檢測如下遺傳損傷或突變存在與否，所述損傷或突變的特徵在於存在至少一個影響編碼GAVE17棄白的基因的完整性的改變或者GAVE17基因的錯誤表現。例如，這些遺傳損傷或突變可以通過確定至少一種如下情 -85-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200402424 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（84 ) 況的存在來檢測： 1) GAVE17基因中一個或多個核苷酸的缺失； 2) GAVE17基因中一個或多個核苷酸的增加； 3) GAVEH基因中一個或多個核菩酸的替換； 5 4)涉及GAVE17基因的染色體重排； 5) GAVE17基因的信使RNA轉錄本量的改變； 6) GAVE17基因的異常修飾，例如基因組DNA的甲基化式樣的改變； 7) GAVE17蛋白的非野生型量； 10 8)GAVE17基因的等位基因丟失； 9)GAVE17蛋白的不恰當的轉譯後修飾。如本文所述，在本領域中有大量已知的實驗技術可用於檢測GAVE17基因的損傷。優選的生物樣本是用傳統方法從被試者分離得到的外周血白細胞樣本。 15 在某些實施方案中，損傷的檢測涉及在聚合酶鏈式反

應（PCR)中使用探針/引子（見，例如U.S·專利Nos. 4,683，195和4,683,202)，所述PCR為例如錨定PCR或 RACE PCR，或者，作為一種選擇，連接鏈式反應 (LCR )(見，例如 Landegran 等，Science (1988) 20 241:1077-1080;和 Nakazawa 等，Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91:360-364)，其中後者在檢測GAVE17基因中的點突變時尤其有用（見，例如Abravaya等，Nucleic Acids Res (1995) 23:675-682)。該方法包括如下步驟：從患者收集細胞樣本，分離樣本細胞的核酸（例如，基因組， r -86- 本紙張尺度適用中® ®家標準(CNS#4規格（21〇 X 297公爱) 顧$

200402424 A7 B7 五、發明說明（85) mRNA或者兩者），在一定條件下使核酸樣本與一個或多個可與GAVE17基因特異雜交的引子接觸以實現gavE17 基因（如果存在的話）的雜交和擴增，然後檢測擴增產物的存在與否或者檢測擴增產物的大小並將此長度與對照樣 5 本比較。預期，可能有利的是將PCR和/或LCR用作初步擴增步驟並與本文中描述的用於檢測突變的任何技術相結合。可選擇的擴增方法包括：自動維持序列擴增(Guatelli 等，Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87:1874-1878)，轉錄擴 10 增系統(Kwoh 等，Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:1173-1177)，Q-召複製酶(Lizardi 等，Bio/Technology (1988) 6:1197)或任何其他核酸擴增方法，之後可以用本領域技術人員已知的技術檢測擴增的分子。這些檢測方案對檢測以非常低數量存在的核酸分子尤其有用。 15 在一個備選實施方案中，樣本細胞中GAVE17基因的經濟部智慧財產局員工消費合作社印製突變可以通過限制酶切割式樣的改變而得以鑑定。例如，分離樣本和對照DNA，進行擴增（任選地），用一個或多個限制性内切酶消化，通過凝膠電泳來測定片段的長度尺寸並進行對比。在樣本與對照DNA之間片段長度的差 20 異指示出樣本DNA中有突變。另外，序列特異的核酶 (見，例如U.S· Pat· No. 5,498,531)也可以用於通過核酶切位點的產生或丟失評判特異突變的存在。在另一個實施方案中，可通過樣本和對照核酸（例如 DNA或RNA)與含有成百或上千的寡核苷酸探針的高密 -87- 本紙張尺度適用ΐ國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公爱） 200402424 A7 B7 五、發明說明（86) 度陣列（Cronin 等，Human Mutation (1996) 7:244-255; Kozal 等，Nature Medicine (1996) 2:753-759)雜交的方法來鑑定GAVE17的遺傳突變。例如，GAVE17的遺傳突變可以用含有光刻DNA探針的二維陣列來鑑定，參見如 5 Cronin等，同上。簡言之，第一雜交探針陣列可用於對樣本和對照中的長鏈DNA進行掃描，通過產生順序重疊探針線形陣列來鑑定兩序列間的域基改變。該步驟允許鑑定點突變。這個步驟之後為第二雜交陣列，它通過使用能與所有檢測的變體或突變體互補的較小特異化探針的陣列， 10 使得可以對特異突變進行表徵。每個突變陣列都由平行探針組構成，一個與野生型基因互補而另一個與突變基因互補。在另一個實施方案中，本領域已知的任何一種測序反應都可用於直接地對GAVE17基因測序，以及通過樣本 15 GAVE17序列與相應野生型（對照）序列的比較來檢測突變。測序反應的實例包括以Maxam和Gibert(Proc Natl

Acad Sci USA (1977) 74:560)或者 Sanger(Proc Natl Acad 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Sci USA (1977) 74:5463)開發的技術為基礎的那些反應。也可以考慮利用任何一種自動測序方法實施診斷試驗(所〇 20 /Techniques (1995) 19:448)，包括用質譜進行測序（見，例如，PCT 公開 No· WO 94/16101; Cohen 等，Adv Chromatogr (1996) 36:127-162;和 Griffin 等，Appl Biochem

Biotechnol (1993) 38:147-159)。其他可用于檢測GAVE17基因中的突變的方法包括如 -88- 本紙張尺度適用申國國泰標準(CNS)A4規格（210x297公爱）" ----— 200402424 A7 _B7 五、發明說明（87 )

下方法，在該方法中通過保護作用防止切割劑的切割，得以檢測RNA/RNA或RNA/DNA異源雙鏈中的域基錯配 (Myers 等，Science (1985) 230:1242)。一般，“錯配切割”技術中必須提供由含有野生型GAVE17序列的（標記 5 的）RNA或DNA與獲自組織樣本的潛在突變rnA或 DNA雜交形成的異源雙鏈體。用切割雙鏈體中的單鏈區域的試劑處理雙鏈，所述雙鏈體中的單鏈區域可以因為例如對照與樣本鏈之間的域基對錯配而存在。RNA / DNA 雙鏈可以用RNAase來處理以消化錯配區域，DNA/DNA 10 雜合體可以用S1核酸酶來處理以消化錯配區域。在另一個實施方案中，DNA/DNA或者RNA/DNA雙鏈可以用羥胺或锇酸及呱啶來處理以消化錯配區域。消化錯配區域之後，剩餘物在變性聚丙烯醯胺凝膠上根據大小分離，從而確定出突變的位點。參見，例如Cotton等，Proc Natl 15 Acad Sci USA (1988) 85:4397; Saleeba 等，Methods Enzymol (1992) 217:286-295。在優選實施方案中，可以標記對照DNA或RNA以利於檢測。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在另一個實施方案中，錯配切割反應使用一個或多個能識別雙鏈DNA中錯配域基對的蛋白（所謂的“DNA錯 2〇配修復酶）在規定系統中用以檢測從樣本細胞獲得的 GAVE 17 cDNA中的點突變並對其作圖。例如，大腸桿菌的mutY酶切割G/A錯配處的A，來自Hela細胞的胸苷 DNA糖基化酶切割G / T錯配處的τ (Hsu等， Carcinogenesis (1994) 15:1657-1662)。根據示範實施方 -89- 尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297 ϋ / 200402424 A7 B7 五、發明說明（88) 案，基於GAVE17序列（例如野生型GAVE17序列）的探針與來自測試細胞的cDNA或其他DNA產物雜交。用 DNA錯配修復酶處理雙鏈，切割產物(如果有的話)可以在電泳方案或類似的方案中檢測到，參見，例如u S Pat· 5 No· 5,459,039。在其他實施方案’電泳遷移率的改變可用於鑑定 GAVE17基因中的突變。例如，單鏈構象多態性（sscp) 可用於檢測突變與野生型梭酸之間電泳遷移率的差異 (Orita 等，Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:2766;也見 10 Cotton, Mutat Res (1993) 285:125-144; Hayashi, Genet Anal

Tech Appl (1992) 9:73-79)。使樣本和對照 GAVE17 核酸的經濟部智慧財產局員工消費合作社印製單鏈DNA片段變性然後使之複性。單鏈核酸的二級結構會因序列不同而不同，由此導致的電泳遷移率的改變使得即使單個域基變化也可得以檢測。可以標記DNA片段或 15者用標記的探針進行檢測。使用RNA (比DNA)可以增強試驗的靈敏度，因為RNA二級結構對序列的改變更為敏感。在優選實施方案中，此主題方法基於電泳遷移率的改變，利用異源雙鏈分析來分離異源雙鏈分子。（Keen 等，Trends Genet (1991) 7:5) 20 在另一個實施方案中，用變性梯度凝膠電泳 (DGGE) (Myers 等，Nature (1985) 313:495)來分析突變型或野生型片段在含有遞度變性劑的聚丙烯醯胺凝膠中的運動。當DGGE用作分析方法時，DNA將被修飾以保證它不會完全變性，例如，用PCR添加約40bp的高熔點富 -90- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公if ) 200402424

s GC DNA ’即GC失子。在另一個實施方案巾，用溫度梯度來代替變性梯度以鑑定對照與樣本DNA的遷移率的差、（Rosenbaum 等，Biophys Chem (1987) 265:12753)。、其他可用於檢測點突變的技術的，實例包括但不限於， 5選擇性募核苷酸雜交，選擇性擴增或選擇性引子延伸。例如，可以製備寡核苷酸引子，其中將已知的突變置於中央，然後在只有完全匹配才可發生雜交的條件下，使引子與乾 DNA 雜交（Saiki 等，Nature (1986) 324:163; Saiki 等，Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:6230)。在使這些等 10位特異性寡核苷酸與PCR擴增的靶DNA或者許多不同的犬變體雜交時’可以將寡核苷酸結合在雜交膜上然後與標記的乾DNA雜交。或者，可以在本發明中使用依賴於選擇性PCr擴增的等位特異性擴增技術。在特異擴增中用作引子的寡核苷 15酸可以在分子中央（以至於擴增依賴於差異雜交）（Gibbs 等，Nucleic Acids Res (1989) 17:2437-2448)或在一個引子經濟部智慧財產局員工消費合作社印製的3’最末端（此時，在適合的條件下，錯配能阻止或延緩聚合酶的延伸）（Prossner，Tibtech (1993) 11:238)攜帶令人感興趣的突變。另外，還可能期望在突變區域中引入新的 20 限制性位元點以創造基於切割的檢測（Gasparini等，Mol Cell Probes (1992) 6:1)。預期，在某些實施方案中擴增也可以使用 Taq 連接酶進行(Barany，Proc Natl Acad Sci USA (1991) 88:189)。在這種情況下，只有在5’序列的3’末端有完全的匹配時，連接反應才可以發生，這就使得可以通過 -91. 广本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200402424 A7 B7 五、發明說明（9〇) 〜--- 尋找擴增物的有無來檢測特異位點處已知㈣的存在。此處職料方法可以，例如，使用含有此處所描述批至少—個探針核酸或抗體試_預包裝的診斷試劍盒來執行。此方法和試劑盒可以方便的應用於，例如，臨床條 5件下對顯不出GAVE17基因有關疾病或病症的徵兆或具有該疾病家族史的患者進行診斷。另外見GAVE17的任何細胞類型和組織都可以在此處所描述的預後試驗中使用。 10 3·藥物基因組學經濟部智慧財產局員工消費合作社印製通過本文描述的篩選試驗鑑定的對GAVEl7活性(例如 GAVE17基因表現)具有鑛或抑卿響的制朗節劑，可以施用給個體以治療(預防性或治療性)與GAVEn活性有關的疾病（例如，炎症、節段性回腸炎、RA、多發性硬 15化和其他免疫系統疾病或腦疾病）。可以考慮將此治療與個體的藥物基因組學結合起來，所述藥物基因組學研究^ 是：個體基因型與個體對外來化合物或藥物的反應性2的的關係。對治療物代謝的差異可以通過改變藥理學活物的血液濃度和劑量之間關係，導致嚴重毒性或A療藥 20 敗。因此，個體的藥物基因組學使得可以基於對個發義^ 型的考慮選擇有效的預防或治療藥劑（例如，藥物）。此，物基因組學還可以用於確定適當的劑量和治療方案。藥此，、可以通過確定個體的GAVE17蛋白質的活性 GAVE17核酸的表現或GAVE17基因的突變内容，選擇對 -92- >紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格^210x297公楚） A7 B7 200402424 五、發明說明（91) 個體適宜的治療或預防藥劑。藥物基因組學所處理的問題是，由患者體内改變的藥物處置和異常作用導致的臨床顯著的藥物應答遺傳差異，見，例如，Lmder，Clm Chem (1997) 43(2): 254-266。一 5般，可以區分兩類藥理學遺傳情況（pharmacogenetic conditions)。作為改變藥物作用於身體的途徑的單因素傳遞的遺傳情況，稱作“改變的藥物作用，，。作為改變身體對藥物的作用途徑的單因素傳遞的遺傳情況，稱作“改變的藥物代謝。這些藥理學遺傳情況可以以罕見缺陷或多 10怨性的形式存在。例如，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺陷是常見的遺傳酶病，其中主要的臨床並發症是吞食氧化劑藥物(抗瘧疾藥物、磺醯胺、止痛劑或硝基呋喃）和食用蠶豆後出現的溶血。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製作為舉例說明性實施方案，藥物代謝酶的活性是藥物 15作用強度和持續時間的主要確定因素。對藥物代謝酶(例如N-乙酿轉移酶2(NAT2)和細胞色素p45〇酶，CYP2D6 和CYP2C19)遺傳多態性的發現解釋了，為什麼服用標準和安全藥物劑量後，一些患者不能獲得預期的藥物效果或表現出過度的藥物反應和嚴重毒性。群體中這些多態性表 20現為兩種表型，泛代謝者(extensive metabolizer, EM)和不良代謝者(PM)。PM的普遍性在不同群體之間是不同的。例如，編碼CYP2D6的基因具有高度多態性，在pM中已鑑定到幾種突變，所有均導致CYP2D6功能的缺乏。 CYP2D6和CYP2C19的不良代謝者在接受標準劑量後十 .. -93-

200402424 A7 B7 五、發明說明（92) 分頻繁地出現過度藥物反應和副反應。正如通過可待因的止痛作用（由CYP2D6形成的代謝物嗎啡介導的）所證實的，如果代謝物是活性治療部分，則PM將不會表現出治療反應。另一極端是對標準劑量不起反應的所謂超快代謝 5 者。近來，超快代謝的分子基礎已得以鑑定，其是由 CYP2D6基因擴增導致的。因此，通過確定個體中GAVE17蛋白質的活性、 GAVE17核酸的表現或GAVE17基因的突變内容，可以選擇出對於預防或治療個體適宜的藥劑。此外，可以使用藥 10物基因組學研究，通過對編碼藥物代謝酶的多態性等位基因進行基因分型鑑定個體的藥物應答表型。當使用 GAVE17調節劑(如，通過本文所述其中一種示例性篩選試驗鑑定的調節劑）治療物件時，在給藥或選擇藥物方面，此資訊可以避免不良反應或治療失敗，由此增強治療或預 15 防的功效。 4·在臨床試驗過程中監測效果經濟部智慧財產局員工消費合作社印製藥劑(例如，藥物或化合物)對GAVE17表現或活性的影響（例如’調節異常細胞增殖和/或分化的能力）既可以 20在基礎藥物筛選中也可以在臨床試驗中進行監測。例如，對於藥劑（通過本文描述的篩選試驗確定的）在增加 GAVE17基因表現、蛋白質量或蛋白質活性方面的有效性’可以在表現出降低的GAVE17基因表現、蛋白質量或蛋白質活性的物件上在臨床試驗中進行監琪彳。或者，對於 -94· 本紙張尺度適用中國國家標準(CJNS)A4規格（210x297公釐）'~— 200402424 A7 B7 五、發明說明（93) 藥劑(通過本文描述的篩選試驗確定的)在降低GAVE17基因表現、蛋白質量或蛋白質活性方面的有效性，可以在表現出增加的GAVE17基因表現、蛋白質量或蛋白質活性的物件上在臨床試驗中進行監測。在這些臨床試驗中， 5 GAVE17的表現或活性以及，優選地，其他基因的表現或活性（例如，細胞增殖疾病所涉及的基因）可以用作特定細胞的免疫應答性的標誌。例如，但不限於，可以鑑定當用調節GAVE17活性的藥劑(例如，化合物、藥物或小分子)(例如，本文所述篩選 10試驗鑑定的藥劑）處理時細胞中可以被調節的基因（包括 GAVE17)。因此，例如，在臨床試驗中，為了研究藥劑對細胞增殖疾病的作用，可以分離細胞，製備RNA並分析 GAVE17及參與該疾病的其他基因的表現量。基因表現量 (即’基因運异式樣）可以通過如下方式定量：按本文所述 15進行Northern印潰分析或RT-PCR，或者，作為備選方案，利用本文所述方法之一測量產生的蛋白質的量或測量 GAVE17或其他基因的活性量。以此方式，基因運算式樣可以用作指示細胞對藥劑的生理反應的標誌。由此，可以經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在使用藥劑治療個體之前以及治療過程中的不同點，確定 20 反應狀態。在優選實施方案中，本發明提供了一種方法，由此可以監測使用藥劑(例如，通過本文所述篩選試驗鑑定的激動劑、拮抗劑、肽類比物、蛋白質、肽、核酸、小分子或其他候選藥物）治療受試者的療效，該方法包括步驟： -95- 200402424 A7 B7 五、發明說明（94) 在施用藥劑前從受試者獲得施用前的樣本；（ii)檢測施用前樣本中GAVE17蛋白質、mRNA或基因組DNA的表現量；（iii)從受試者獲得一個或多個施用後樣本；（iv)檢測施用後樣本中GAVE17蛋白質、mRNA或基因組DNA的 5 表現或活性量；（v)對施用前樣本中GAVE17蛋白質、 mRNA或基因組DNA的表現或活性量與一個或多個施用後樣本中GAVE17蛋白質、mRNA或基因組DNA的表現或活性量進行比較；和（vi)據此改變患者的藥劑施用方案。例如，可能期望增加藥劑施用以增加GAVE17的表現 10 或活性量，使之超過所檢測到的量，即，增加藥劑的效力。或者，可能期望降低藥劑施用以降低GAVE17的表現或活性量，使之低於所檢測到的量，即，降低藥劑的效力。 15 D ·治療方法本發明為治療有危險患有（或易感）或已患有與異常 GAVE17表現或活性相關的疾病的患者提供了預防和治療經濟部智慧財產局員工消費合作社印製方法。所述疾病包括，但不限於，例如消化疾病如節段性回腸炎、結腸息肉等。 20 1 ·預防方法一方面，本發明提供預防方法，該方法通過給受試者施用調節GAVE17表現或至少一種GAVE17活性的藥劑’預防受試者患上與異常GAVE17表現或活性有關的疾 -96- 297公釐）本纸張尺度通用_國國家規格（21〇: ΰ Ο » 200402424 A7 B7 五、發明說明（95 ) 病或病症。可以通過，例如，本文所述任一種或組合的診斷或預後試驗，鑑定有危險罹患由異常GAVE17表現活性引起的或促成的疾病的個體。可以在以GAVE17異常為特徵的症狀顯現之前施用預防劑，以便預防疾病或病症，或 5 作為備選方案阻滞疾病或病症的進程。例如’根據 GAVE17異常的類型，可以使用GAVE17的激動劑或 GAVE17的拮抗劑治療個體。適宜的藥劑可以根據本文所述篩選試驗確定。 10 2 ·治療方法經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本發明另一方面涉及調節GAVE17表現或活性用於治療目的的方法。本發明的調節方法涉及使細胞與能調節和細胞有關的一種或多種GAVE17蛋白質活性的藥劑接觸。能夠調節GAVE17蛋白質活性的藥劑可以是本文所述的藥 15劑，例如核酸或蛋白質、GAVE17蛋白質的天然關聯配體、肽、GAVE17肽類比物或其他小分子。在一個實施方案中，該藥劑刺激GAVE17蛋白質的一種或多種生物學活性。此刺激劑的實例包括活性GAVE17蛋白質和已導入細胞中的編碼GAVE17的核酸分子。在另一實施方案中，該 2〇藥劑抑制GAVE17蛋白質的一種或多種生物學活性。此抑制劑的實例包括反義GAVE17核酸分子和抗GAVE17抗體。可以體外（例如，通過使用藥劑培養細胞）或，作為備選方案，體内（例如，通過向患者施用藥劑）執行此調節方法。由此，本發明提供治療罹患疾病或病症（其特徵在於 -97-

200402424 A7 B7 五、發明說明（96 ) GAVE17蛋白質或核酸分子的異常表現或活性）的個體的方法。在一個實施方案中，本方法涉及施用可調節（例如，上調或下調)GAVE17表現或活性的藥劑（例如，通過本文所述師選试驗鑑疋的藥劑）或藥劑組合。在另一實施方案 5中，本方法涉及施用GAVE17蛋白質或核酸分子作為治療物以彌補降低的或異常的GAVE17表現或活性。當GAVE17被異常下調和/或當增加的gave17活性可能具有有益作用時，.刺激GAVE17活性是有利的。相反’當GAVE17被異常上調和/或當降低的gave17活 10性可能具有有益作用時，抑制GAVE17活性是有利的。本發明進一步通過如下實施例進行舉例說明，這些實施例不應理解為是限制性的。在整個本申請中引用的所有文獻、專利和出版的專利申請的内容特此並入作為參考。

15 實施例1選殖hGAVE17 cDNA 在人類基因組庫中尋找GPCR基序。鐘定出 AC024886，一個來自第三號染色體的人類基因組dna。這個基因組DNA及其片段在Northern印潰中用作探針。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製對人脾和外周血白細胞cDNA文庫匯合物進行pcr 20 篩查。用以下序列設計PCR引子：

正向：5，-GAAGCAATGAACACCACAGTG-3，（SEQ ID NO:6)

反向：5，-AGTTGTCAGCCTAAGGTTATG-3，（SEQ ID NO:7) -98- 本紙張尺度適用肀國國家標準(CNS)A4規格（21〇 x297公釐） 200402424 A7 B7 五、發明說明（97) 在熱迴圈儀（thermocycler)中使用如下迴圈：94°C性 30秒，之後55°C火30秒，並在72°C延伸1分鐘。重復此迴圈35次，之後在72°C延伸5分鐘。 PCR之後，把3 μΐ dNTP (每種核苷酸各10mM) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5 (Clontech 目錄號· 7404-i)和 1 μΐ (5 單位)Taq DNA 聚合酶(Qiagen，目錄號· 201223)加入到PCR產物中，混合物在72°C溫育10分鐘。然後PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳。從凝膠上切下含有所要片段的大約1Kb長度的條帶，使用Qiaquick凝膠抽提試劑盒及製造商提供的方案 10 (Qiagen，目錄號· 28704)把其純化。然後將純化的PCR產物亞選殖入pCRII-TOPO載體(Invitrogen，目錄號· K2000-01/40/J10 和 K2030-01/40/J10)。為了把 PCR 產物亞選殖入載體，使用InvitrogenTA選殖載體試劑盒準備連接反應。連接反應包括：5μ1無菌水；Ιμΐ Invitrogen 2X連接 15 緩衝液；2μ1 PCR2.1 載體(25 ng/μΐ); 4 μΐ PCR 產物 DNA (1〇 ng); 4 μΐ (5X)稀釋緩衝液;和1 μΐ T4 DNA連接酶(5單位）。在14°C溫育此反應18小時。用2μ1連接反應混合物與200μ1 INVa F’感受態大腸桿菌細胞(Invitrogen目錄號· C658-00)混合，在冰上溫育30分鐘，在37°C熱激45秒， 20 在冰上溫育2分鐘，之後加入800μ1 LB，由此用連結反應物轉形大腸桿菌。然後細胞在細菌搖床/培養箱中攪動下 37C過夜溫育。過夜溫育後，將200μ1轉形反應混合物鋪在含有lOOpg/ml安比琳的LB瓊脂平板上並37°C過夜溫育。 -99- 本紙張尺度適用〒國國家標竿(CNS)A4規格（210 X 297公釐）一 200402424 A7 B7 五、發明說明（98 ) 溫育之後，挑選殖體並且每單菌落分別在含有5〇〇 W LB (含有100 μ§/ιη1安比琳）的單獨試管中在搖床/培養箱中過夜生長。為了用PCR篩選菌落，使用如下反^ 物· 41·5 μΐ含有一個菌落的LB; 5 μΐ Taq緩衝液(i〇x); 1〇 5 μΐ dNTP (每種核苷酸各1〇 mM); 1〇 μ1正向引子（1〇 mM); 1·〇 μΐ反向引子（10 mM);及〇·5 μΐ Taq DNA聚合酶(5單位 /μΐ)。使用如下的迴圈在熱迴圈儀中溫育反應：94<^2分鐘，94°C30 秒，55°C30 秒，72。(：1 分鐘及 72〇C1〇分鐘，之後冷卻到4°C。 10 為了檢查PCR反應的結果，在1% TAB瓊脂糖凝膠上經濟部智慧財產局員工消費合作社印製用5 μΐ PCR反應溶液電泳。陽性選殖體顯示出有大約的插入。在細菌搖床/培養箱中，使陽性選殖體在5mlLB + 100 pg/ml安比琳中37°C過夜生長。用Qiagen DNA純化柱(Qiagen Catalog No· 12143)根據製造商推薦的方案純 15 化質粒。用 T7 正向引子(5，-TAATACGACTCACTATAGGG-3’） (SEQ ID NO:8)和 M13 反向引子（5，-CAGGAAACAGCTATGAC-3’）（SEQ ID ΝΟ··9)對陽性選殖體測序。DNA測序鑑定分離出含有如圖1所示的DNA序列 (SEQ ID ΝΟ:1)和如圖2所示的胺基酸序列（SEQ ID ΝΟ:2)的 20 cDNA 〇實施例2製備過量表現hGAVE17的哺乳動物細臉為了製備大量的hGAVE17用於進一步試驗，將編碼 hGAVE17的CDNA，選殖體入表現載體並轉染哺乳動物細 -100- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐）

^ i J 200402424 A7 B7 五、發明說明（"）胞，例如，NIH 3T3細胞。為了產生過量表現hGAVE17的哺乳動物細胞，于6 孔35mm組織培養板中，在含有10%胎牛血清(Gibco/ BRL Catalog No· 1600-044)的 2ml D]MEM 培養基(Gibco/ 5 BRL，Catalog No· 11765-054)中接種細胞。（每孔 3 x ίο5 個細胞(ATCC Catalog No· CRL-1573))。然後，在C〇2培養箱中37°C溫育細胞直到細胞達到 50—80%的匯合。hGAVE17的選殖體cDNA核酸序列用上述的方法插入到pcDNA3 · 1選殖體載體中（Invitrogen， 10 Catalog No· V790-20)。在 100 μΐ 無血清的 F12 HAM 培養基中稀釋2pg的DNA。獨立地，在100 μΐ無血清F12 HAM 培養基中稀釋 25 μΐ Lipofectamine 試劑（Life Technologies，Catalog No· 18324_020)。然後把 DNA 溶液與Lipofectamine溶液輕輕地混合，並在室溫下溫育45分 15 鐘以產生DNA-脂複合體。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製用2ml無血清F12 HAM培養基沖洗細胞，對於每個轉染（6_孔板中6個轉染），將0.8ml無血清F12 HAM培養基加入含有DNA-脂複合體的溶液（總體積0.2ml)中’ 並輕輕混合。然後將得到的混合物（此後稱“轉染混合 20 物”）鋪在（0.8ml+0.2ml)沖洗過的細胞的表面。不加入抗菌試劑。然後在C02培養箱中將細胞與脂_DNA複合體在37°C —起溫育16小時，以進行轉染。在溫育期完成後，在沒有首先去除轉染混合物的情沉下，將lml含有10%胎牛血清的F12 HAM培養基鋪在細 -101- 本紙張尺度遇用中關家標準(CNs)A4規格（21〇 x 297公釐） 200402424 Δ7 Α7 ___ Β7 五、發明說明（100) 胞上。轉染後18小時，吸出鋪在細胞上的培養基。然後用 PBS (pH2-4) (Gibco/BRL Catalog No· 10010-023)洗細胞，然後PBS用含有5%血清的F12 HAM培養基（“選擇培養基”）置換。轉染後72小時，在含有400 pg/ml 5 抗細菌劑遺傳黴素(Life Technologies，Catalog No· 11811)的選擇培養基中10倍稀釋細胞。施例3激動劑詖鹼為了篩選人GAVE17的激動劑，人為地使hGAVE17 10 與Gq機制偶聯，Gq機制的啟動刺激胞内肌質網小泡釋放 Ca2+。Ca2+釋放入胞質，在這裏它可以用Ca2+螯合劑來檢測。可以使用螢光成像平板閱讀器或者FLIPR®儀器 (Molecular Devices )監測導致的任何螢光改變。榮光的增強可以反映激動劑的活性。

15 在一個具體的實例中，預改造表現hGAVE17的NIH 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 3T3細胞，以表現Gq蛋白的不加區別形式(Gal6)。為了製備這樣的細胞，從商業途徑獲得偶聯Gal6的NIH 3T3細胞 (Molecular Devices LIVEWARE™ 細胞，目錄號· RD_ HGA16)，之後使用實施例2的方案以便在這些細胞中表現 20 hGAVE17。 37°C及5% C02下F12 Ham培養基中使細胞保持在生長對數期，所述F12 HAM培養基(Gibco/BRL，目錄號· 11765_054)中含有10%胎牛血清、1〇〇 IU/ml青黴素 (Gibco/BRL，目錄號· 15140-148)、100 pg/ml 鏈黴素 -102- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 x 297公爱) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 200402424 A7 B7 五、發明說明（ιοί) (目錄號· 15140-148, Gibco/BRL)、400 gg/ml 遺傳黴素 (G418) (Gibco/BRL，Catalog No. 10131-035)和 200 pg/ ml Zeocin (Invitrogen，Catalog No· R250-05)。試驗前一天，用 Multidrop 裝置(Labsystems，Type 832)以 12,500 細 5 胞/孔把NIH 3T3細胞鋪在384-孔底部透明的試驗板 (Greiner/Marsh，Catalog No· N58102)上，板孔體積為 50 μΐ。在潮濕的5%C02培養箱（Forma Scientific C02水夾套型培養箱3110型）中37°C溫育細胞。製備如下的母液：HEPES(pH7.5) (Gibco / BRL, 10 Catalog No· 15630-080)的 1M 母液；IN NaOH 中丙磺舒 (Sigma，Catalog No· P8761)的 250mM 母液；DMSO(Sigma D2650)中 Fluo 4_AM 染料(Molecular Probes，Catalog No· FI 4202)的ImM母液。用1000ml Hank平衡鹽溶液(Fisher/ Mediatech，Catalog No. MT21023)、20ml 1M HEPES 母液 15 和10ml 250mM丙磺舒母液製備反應緩衝液。為了製備上樣緩衝液，把1.6ml的ImM Fluo 4-AM染料母液與0.32ml pluronic acid(Molecular Probes，Catalog No· P6866)混合，然後與400ml上述反應緩衝液及4ml胎牛血清混合。試驗前1小時，用96/384 Multidrop裝置把50 μΐ新 20 製備的上樣緩衝液加到384-孔板的每個孔中。在潮濕培養箱中37°C溫育細胞以使染料吸收最大化。在試驗即將開始之前，用 384 EMBLA 細胞洗滌儀（Skatron; Model No. 12386)用90 μΐ反應緩衝液洗滌細胞2次，吸頭設置在距離平板底部至少lOttim以上的位置，在每個孔中留45μ1 -103- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐）

A7 B7 200402424 五、發明說明〇2) 緩衝液。 FLIPR® II ( Molecular Devices )儀器的 CCD 相機 (Princeton Instruments)設定為 2.0 的 f-st〇p，〇4 秒的曝光。相機用於監測細胞平板，以得到染料荷載的精確量。 5 在濃度為ίο μΜ的生理鹽緩衝液中測試含有可能激動劑（例如各種嘌呤衍生物或嘌呤類比物）的化合物文庫。加入化合物之前，測量螢光變化ίο秒。加入化合物後，第一分鐘内每秒測一次螢光，之後在3分鐘的全部試驗分析時間中每6秒曝光一次。在第10次掃描後加入1〇〇 μΜ 10 化合物原液的5μ1等分試樣，使細胞上的最終化合物濃度為10 μΜ。記錄前80次掃描的最大螢光變化作為啟動劑動性的測量值，並與1〇 μΜ ATP (Sigma Α9062)所誘導的最大螢光變化比較。利用轉染的ΝΠί 3T3細胞系進行的這個試驗的結果以圖的方式顯示於圖3a-d中。

15 在另一個實例中，改造後表現GAVE17的HEK 293T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製細胞也能用於此試驗。圖4a-b以圖的方式顯示了用此細胞的試驗結果，其中測試了 2-甲硫基-ATP (2mes-ATP) 和2·硫代ADP (2S-ADP)的激動劑活性。圖4a和圖4b 以圖的方式顯示了 2mes-ATP和2S-ADP表現出激動劑活 20 性。實施例4拮抗劑試驗為了篩選人GAVE17的拮抗劑，人為地使hGAVE17 與Gq機制相偶聯。如實施例3中，利用FLIPR®儀器探測 -104- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200402424 A7 B7 五、發明說明（1〇3) 導致的任何螢光改變。螢光的減弱反映拮抗劑的活性。如實施例3中所述，預改造表現hGAVE17的NIH 3T3細胞，以表現Gq蛋白的不加區別的形式(Gal6)。37°C 及5% C02下F12 HAM培養中使細鸠維持在生長對數期。 5 所述 F12 HAM 培養基(Gibco/BRL，目錄號· 11765-054)中含有10%胎牛血清、100 IU/ml青黴素(Gibco/BRL，目錄號· 15140-148)、100 pg/ml 鏈黴素（目錄號· 15140-148, Gibco/BRL)、400 pg/ml 遺傳黴素（G418) (Gibco/ BRL，Catalog No. 10131-035)和 200 pg / ml Zeocin 10 (Invitrogen，Catalog No· R250-05)。試驗前一天，用 96/ 384 Multidrop裝置以12,500個細胞/孔將NIH 3T3細胞鋪在384 —孔底部黑色/透明的試驗板(Greiner/Marsh， Catalog No. N58102)上，板孔體積為50 μΐ。細胞在潮濕 5%C02 中 37〇C 溫育。 15 製備如下的母液：HEPES(pH7.5) (Gibco / BRL，經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Catalog No· 15630-080)的 1M 母液；IN NaOH 中丙磺舒 (Sigma，Catalog No· P8761)的 250mM 母液；DMSO(Sigma D2650)中 Fluo 4_AM 染料(Molecular Probes，Catalog No· FI 4202)的ImM母液；和配體或拮抗劑的母液。用1000ml 20 Hank 平衡鹽溶液（？丨811€1*/¥6(^16(：11，€&1&1〇§1^〇· MT21023)、20ml 1M HEPES 母液、l〇ml 的 250mM 丙磺舒母液和1 mM CaCl2製備反應緩衝液。為了製備上樣緩衝液，把80 μΐ的ImM Fluo 4-AM染料母液與16 μΐ pluronic acid (Molecular Probes，Catalog No· Ρ6866)混合， -105- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200402424 A7 ___ B7 五、發明說明（104) 然後與20 ml上述反應緩衝液及0.2 ml胎牛血清混合。試驗前30分鐘，用96/384 Multidrop裝置把30 μΐ 新製備的上樣緩衝液加到384-孔板的每個孔中。在潮濕 C〇2培養箱中37°C溫育細胞以使染料吸收最大化。在試驗 5 即將開始之前，用384 EMBLA細胞洗滌儀(Skatron;Model No· 12386)及1〇〇 μ1反應緩衝液洗滌細胞3次，吸頭設置在距離平板底部至少40mm以上，在每個孔中留45μ1緩衝液。用 PLATEMATE—384 移液器（matrix)將 5μ1 1〇〇 μΜ 10 拮抗劑化合物（例如嘌呤衍生物或嘌呤類比物）母液加入到細胞中。在溫育步驟中，化合物的濃度約為10 μΜ。將細胞鋪在FLIPR® II上，在第一分鐘内每秒測一次板螢光，之後在3分鐘的全部試驗分析時間内每6秒曝光一次。在第10次掃描後加入拮抗劑或配體（10 μΜ)。每次加 15 入之後，384個吸頭用20 μΐ的0.01% DMSO水溶液洗滌 10次。實施例5受體結合試驗經濟部智慧財產局員工消費合作社印製為了製備含有hGAVE17受體的膜組分，在含有1 mM 20 EDTA的磷酸緩衝鹽溶液(1〇 ml)中孵育以收穫表現或者過量表現hGAVE17的NIH 3T3細胞系。在用5 ml緩衝液A (50 mM Tris-HCl (pH 7.8) (Sigma T6791), 5 mM MgCl2 (Sigma M8266)和 1 mM EGTA (Sigma 0396)重懸細胞之前，細胞在含有1 mM EDTA (10 ml)的鱗酸緩衝鹽溶液中 -106- 一本紙張尺度適用中國國家標準(⑶幻八4規格（210x297公釐） 200402424 A7 B7 五、發明說明（1〇5) 再洗3次。然後’在組織勻漿器（p〇lytr〇n，Kinemetica，Model PT 10/35)中破碎細胞1分鐘。得到的勻衆物在jg〇rvan儀器 RC3B冷;東離心機中49,000 X g，4°C_心20分鐘。得到的 5 沈澱在25ml的緩衝液A中重懸，離心步驟重復3次。最後一次離心之後’沈殿再一次在5ml緩衝液A中重懸，等分試樣，並在-70°C保存。使用膜組分和放射性標記的嘌呤核苷酸或激動劑作為示蹤者，進行受體結合試驗。在96-孔板(Beckman儀器）中 10進行試驗。結合反應物由含有放射性配體或激動劑(〇·〇ι ηΜ-25 ηΜ)、18 pg NIH 3Τ3細胞製品，及〇·ΐ%牛血清清蛋白（Sigma，Catalog No· 34287)的終體積為〇.2 ml的緩衝液 A 組成（見 Im 等,j Biol Chem (2000) 275(19):14281-14286)。在室溫下溫育此反應物丨小時。在多通道收穫器 15 (Brandell)上過渡通過Whatman GF/C渡紙終止反應，所述濾紙之前用〇·3%聚乙稀亞胺(Sigma，Catalog No. P3143) 和0.1%牛血清清蛋白（BSA)處理1小時。將混合物加於濾紙上並溫育1小時。用lml冰冷的 50 mM Tns-HCl，（pH 7·6)洗滌濾紙6次。通過測量放射 2〇性，對於每個示蹤者濃度基於總結合與非特異結合（背景）的差別，計算特異結合。獲取8~ 16個濃度資料點以便確定在配體和受體平衡狀態下配體與受體的結合（平衡結合參數）和與放射性配體或激動劑競爭結合受體所需的非放射性配體或激動劑的量（競爭結合值.)。製作抑制曲 -107- 本紙張Κ度遇用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐）計 4 ·! 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 200402424 ____B7 _ _ 五、發明說明（1〇6) 線以確定抑制50%的結合所需的濃度(ic50)。實施例6 Northern印潰試驗在來自幾個人組織樣本、細胞系和新鮮血液細胞的總 5 RNA或poly A+ RNA上進行Northern印潰分析，以測定這些組織是否表現hGAVE17。所用的探針是標有P32的隨機引發的hGAVE17cDNA或其部分。製備探針經濟部智慧財產局員工消費合作社印製標有P32的hGAVE17 cDNA按如下方法製備：25ng 10 如上所述製備的hGAVE17 cDNA在微量離心管中於45 μΐ 10 mM Tris_HCl，pH 7·5; 1 mM EDTA 中重懸，在 95°C 加熱 5分鐘。然後在冰上驟冷5分鐘。冷卻之後，管中的混合物用45 μΐ GAVE17 cDNA和上面描述的緩衝液重懸，並與 RTS Rad Prime Mix (提供有 RTS Rad Prime DNA 標記系 15 統）（Life Technologies，Catalog No. 10387-017)混合。邊輕柔但徹底混合，邊加入5μ1標有P32的α-dCTP (比活性 3000 Ci/mM) (Amersham，AA0005)。得到的混合物在 37 °C溫育10分鐘。通過加入5 μΐ的0·2 M EDTA (pH 8.0) 來終止溫育。取混合物的5 μΐ等分試樣並通過計數放射性 20 來估計摻入hGAVE17 cDNA的放射性α-dCTP。大約使用 106 cpm的探針。 RNA抽提在培養盤中加入lml Trizol試劑（Life Technologies， Catalog No· 15596)直接裂解感興趣的細胞。用吸管吹吸細 -108- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公爱 1 ' 200402424 Α7 __ Β7 五、發明說明（1〇7) 胞裂解液幾次以勻漿裂解液（之後，把細胞裂解液轉入試管中）。勻漿之後，30°C溫育裂解液5分鐘以允許核蛋白複合體完全解離。溫育之後，以每lml Triz〇1試劑〇 2 ml 氣仿（Sigma，Catalog No· C53 12)的量將氯仿加入裂解液 5中，劇烈震蕩試管15秒。然後裂解液在30°C溫育3分鐘。溫育之後，在4°C以12,000xg離心裂解液15分鐘。付到的水相轉移到新管中並按每lml Trizol試劑0.5ml異丙醇的量加入異丙醇。然後水相樣本在30°C溫育10分鐘’並在4°C，12,000xg離心1〇分鐘，離心之後，棄去上 10清。用70%乙醇洗滌剩下的RNA沈澱。沖過的樣本在4 °C，7500xg離心1〇分鐘，棄去產生的上清。然後乾燥剩下的RNA沈殿，並在無RnaSe的水(Life Technologies， Catalog No· 10977-015)中重懸。將總 RNA 或 poly A+ RNA 用於Northern或者Taqman (下面有描述）試驗。可以購 15買已知的標準品，例如Perkin-Elmer的人腦肌動蛋白。可以從例如Clontech商業上獲得不同組織的人總RNA。凝膠電泳經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在水、5X甲醛凝膠電泳緩衝液（描述如下）和2.2M 甲醛(Sigma，Catalog No· P82031)中融化 2g 瓊脂糖(Sigma， 20 CatalogNo· A0169)，製備瓊脂糖凝膠。 4.5 μΐ (共 5 pg) 2.0 μΐ 3·5 μΐ

凝膠電泳的樣本製備如下 RNA 5Χ甲醛凝膠電泳緩衝液曱醛 -109- 本紙張尽度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200402424 A7 B7 五、發明說明（1〇8) 甲醯胺(Sigma，Catalog No· F9037) 10.0 μΐ 甲醛凝膠電泳緩衝液（5Χ)是0·1Μ的3—（Ν·碼福咁）丙烷磺酸（MOPS ) (pH 7.0) (Sigma，Catalog No· M5162); 40 mM 乙酸鈉（Sigma，Catalog No. S7670);和 5 mM 5 EDTA (PH 8.0) (Sigma，Catalog No· E7889)。樣本在65°C溫育15分鐘，之後在冰上驟冷卻。冷卻之後，樣本離心5秒。然後向樣本中加入2μ1甲醛凝膠上樣緩衝液；50%甘油（Sigma, Catalog No. G5516); 1 mM EDTA (pH 8.0); 0.25% 漠紛藍（Sigma，Catalog No· 18046); 10 〇·250/〇二曱苯氰 ff (Sigma，Catalog No. 335940)。在5 V/cm下預電泳凝膠5分鐘。預電泳之後，將樣本載入到凝膠上。在4 V/cm電泳IX甲醛凝膠電泳緩衝液淹沒的凝膠。2小時後更換緩衝液進行電泳。將RNA從凝膠向硝化纖維素轉移 15 用溴化乙錠(Sigma，Catalog No. E1 385)(在 0·1 Μ 乙酸經濟部智慧財產局員工消費合作社印製銨(Sigma，Catalog No· 09689)中 0·5 pg/ml)對凝膠染色 30 分鐘’以保證RNA不被降解。然後用Sambrook等所描述的方案（Sambrook 等，編，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volume 1, pp.7.46-7.51, Cold Spring Harbor 20 Laboratory Press (1989))把RNA從瓊脂糖凝膠轉移到硝化纖維素膜上(Schleicher & Schuell Inc” Catalog No· 74330-026” 標有P32_cDNA的雜交在 68C 溫育 Clontech ExpressHyb 雜交溶液(Clontech， -110- 本紙張尺度適用中國國冢標準(CNS)A4規格（210x297公爱） A7 B7 200402424 五、發明說明（1〇9)

Catalog Ν〇·8015-1)2小時。溫育之後，將15ml溫的雜交溶液倒在膜上。搖動下，使膜在68°C浸在雜交溶液中。1 小時過去後，加入之前95°C煮沸變性5分鐘的hGAVE17 cDNA探針，濃度為1〇6計數/ml。然後，用雜交溶液覆 5 蓋凝膠在68。(：繼續溫育2小時，直至過夜，其間不停地搖動。從Clontech ExpressHyb雜交溶液中取出膜，並用2X SSPE; 0.01% SDS 在 50°C 洗滌 30 分鐘；用 0.1X SSPE; 0.1% SDS在60〇C洗滌卜J、時。 10 顯像膜在 _70 °C 過夜曝光 Kodak X-OMAT AR (Kodak， Catalog No· 165 1579)膠片，並用標準方法顯像。篩選大量不同組織，在所選組織（例如免疫系統的細胞）中發現一個獨特的大約5kb的mRNA。 15 實施例7PCR Μ舲經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

TaqMan®或即時RT-PCR可檢測樣本中的信使RNA。在PCR過程中，試驗利用AmpliTaq Gold® DNA聚合酶的 5 一核酸酶活性切割TaqMan®探針。TaqMan®探針在探針 20 5端包括報告染料，例如6 — FAM(6-羧基螢光素），並在探針端包括淬滅染料（例如，tamra(卜羧基_n，n，n,， N’·®甲基羅丹明））。料TaqMan®探針使其特異地與正向引子和反向引子位元點之間的目的靶cDNA雜交。當探針是完整時，3飞淬滅染料使5，端報告染料的螢光二滅。 •111- 200402424 Α7 _ Β7 五、發明說明（110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 PCR過程中，AmpliTaq Gold® DNA聚合酶的5，—3,活性導致了端報告染料和3'端淬滅染料之間的探針被切割’從而報告染料被置換出來。一旦被置換出來後，報告染料的螢光就不再被淬滅染料熄滅。因此，可以通過監測報告染料的螢光增強來檢測從靶DNA模板產生的PCR產物的積累。來自 Perkin Elmer Applied Biosystems 的 ABI Prism 序列檢測儀系統(Model No· ABI7700)可用於監測PCR過程中報告螢光的增強。相對無源參照物的釋放標化報告信號。 cDNA模板的製備可以商業上獲得幾種組織的總RNA和poly A+RNA，例如從Clontech獲得。 5gg的總RNA與2 μΐ (50 ng/μΐ)的隨機6聚體引子 (Life Technologies，Catalog No· 18090)混合，使總反應體積 15 為7 μΐ。得到的混合物在70°C加熱10分鐘，並在冰上快速冷卻。把以下試劑加入混合物中：4 μΐ的5X第一鏈緩衝液，2 μΐ 0·1 mM DTT，1 μΐ 10 mM dNTP 和 1 μΐ 水。混合物輕輕混合並在37°C溫育2分鐘，溫育之後，加入5 μΐ 的 Superscript RT-PCR 反轉錄酶(Life Technologies，Catalog 20 No. 18090)。然後混合物在37°C溫育60分鐘。通過加入 Ιμΐ的2.5 mM EDTA終止反應。然後混合物在65°C溫育 10分鐘。 PCR 和 TaqMan®試驗在 96 —孔板 MicroAmp 光學試管（Perkin Elmer， 5 10 • 112- 本紙張尽度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐）計線 200402424 A7 B7 五、發明說明（ill)

Catalog No· N801-0933)中，進行 PCR 和 TaqMan®試驗。反應混合物包括25 μΐ的TaqMan®PCR混合物（Perkin Elmer，Catalog No· N808-0230)，1 μΐ 正向引子（5，-TGGTATTCCCAGCCCTCTACA-3，）（SEQ ID ΝΟ··10)，1 μΐ 反 5 向引子（5’-CAAACACCCACAGAGCCAAA-3，）（SEQ ID NO: 11) ， 1 μΐ 的 TaqMan® 探針（5，_FAM_

TGGTTTTCTTGACCGGCATCCTGC T-TAMRA-3，）（SEQ ID NO:12)，1 μΐ cDNA和21 μΐ水，將其力口入各孑匕中。在不同 cDNA 模板濃度（例如，5, 2, 1，0.5, 0.25, 0.125, 0.0625 10 ng/μΐ (模板cDNA濃度為終濃度））下，對每個組織樣本重復配製兩份TaqMan®樣本。然後用MicroAmp光學8-帶罩(Perkin Elmer，Catalog No· N801-0935)密封平板。用人 β 肌動蛋白（Perkin Elmer，Catalog No· 401846)重復兩次繪製標準曲線。對標準曲線的每個cDNA模板濃 15度，均獲得了大量的擴增分子。一旦獲得已知基因的標準曲線擴增即允許對每個未知靶基因擴增產生的dDNA分子的數量進行確定以及用内對照進行標準化。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製來自上述TaqMan®反應的結果表示為相對于任選組織的調控倍數。作為備選方案，不同組織的已知反應性，例 2〇如β肌動蛋白可用作參考框架。在免疫系統細胞中觀察到南水準的GAVE17 mRNA。用「35S1GTPyS鑑定反向激動劑與激動劑製備含有組成型活性受體的膜，方式是：首先吸出鋪 -113- 本紙張尺度通用中國國家標準(CNs)A4規格（210 X 297公" 200402424 A7 ___ B7 五、發明說明（112) 滿的單層真核細胞（表現GAVE17)中的培養基（細胞可以在瓶中或多孔板中），之後用10ml冷PBS沖洗，再吸出。加入含有 20 mM HEPES 和 10 mM EDTA (pH 7.4)的 5ml緩衝液，以從基底上刮下細胞。將細胞物質轉移到 5 50ml離心管中（4°c，20000rpm離心17分鐘）。之後吸出上清液，得到的沈澱在含有20 mM HEPES和0.1 mM EDTA (pH 7·4)的30ml緩衝液中重懸。之後進行如上的離心。吸出上清液，得到的沈澱在含有20 mM HEPES、 lOOmMNaCl和10mMMgCl2的緩衝液（結合緩衝液）中 10 重懸。然後，懸液用Brinkman polytron®勻漿器勻漿（15 〜20秒的多次衝擊直到所有物質成為均一懸液）以產生膜蛋白製品。用Bradford方法（見PCT公開No. WO 〇〇/ 22131)測定蛋白濃度。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製候選化合物（例如嘌呤衍生物和嘌呤類比物）優選使 15用96孔板形式篩選。在結合緩衝液中將膜蛋白製品稀釋到0·25 mg/ml以在50 μΐ體積中提供終濃度12 5呢/ 孔。將100 μΐ GDP緩衝液（37·5 ml結合緩衝液和2 GDP, Sigma Cat. No· G-7127)加入到每個孔中，之後加入 Wallac ScintistripTM (Wallac)。將 5 μΐ 候選化合物轉移到每 20 個孔中（即，在總試樣體積200 μΐ中的5 μ1，導致i : 4〇的比率，從而候選物的終濃度為10 μΜ)。將5〇 μΐ膜蛋白加入每孔中（包括不含受體的膜對照）並在室溫下預溫5 一 10分鐘。之後，每孔中加入5〇 μΐ含有[35s]GTFyS (〇 6 nM)的結合緩衝液，之後室溫下在搖床上溫育6〇分鐘。用 -114- I紙張尺度適用中關家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐)--------- — 200402424 五、發明說明（⑴） 22°C及4,000 rpm離心平板15分鐘終止試驗。然後板用8 道多孔管吸出上清，用板蓋將板封住並在Wallac 1450™上讀數（參見製造商的說明書）。由與帶子結合的細胞物質數量的變化可以測定出候選者是反向激動劑（與基線相比 5降低）還是激動劑（與基線相比升高）。儘管參照以上的實施例已經詳盡地描述了本發明，但應理解能進行多種改變而不背離本發明精神。因此，明只被下述權利要求所限制。本申請中提及的’ _ 利和出版物完整地並入此處作為參#。 Ή用寻 -115- Υ紙張尺度適財‘豕標準(CNS)A4規叮加⑽公訂《

Claims

200402424 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 1· 一種分離之編碼與核苷酸結合的G蛋白偶聯受體的核酸，其包含GAVE17(SEQ ID N0:1)或GAVE17變體的核苷酸序列。 2· —種分離之編碼與核苷酸結合的G蛋白偶聯受體的核 5 酸，其包含如下序列，所述序列編碼具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的GAVE17多肽。 3·如申請專利範圍第1項的核酸，其中所述核酸選自： RNA、基因組DNA、合成DNA和cDNA。 4· 一種分離之編碼與核苷酸結合的g蛋白偶聯受體的核 10 酸，其包含GAVE17(SEQIDNO: 1)的核苷酸序列的等位基因變體。 5 ·如申明專利範圍第1項的分離的核酸，其中所述變體編碼添加、缺失或替代突變。 6.如申請專利範圍第5項的核酸，其編碼替代突變，其 15 中所述突變在所述序列中提供至少一個功能性等價胺基酸殘基。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 7· —種分離之編碼與核苷酸結合的G蛋白偶聯受體的核酸，其包含在嚴緊條件下可與雜交探針雜交並且與 SEQIDNO· 1互補或與編碼SEqIDn〇: 2的核酸互補 20的序列，其中所述探針包含SEQmN0: i或編碼SEQ ID NO: 2的核酸的片段。 8.-種分離之編碼與核苷酸結合的^蛋白偶聯受體的核酸，其包含編碼具有與SEQ仍N〇:】至少3〇% 一致的胺基酸序列的多肽的序列。 -116 -

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9·—種純化的多肽，其是與核苷酸結合蛋白偶聯受體’其胺基酸序列包含SEQ ID NO: 2。 1〇'種純化的多肽，其包含SEQ ID NO: 2中所示的第三胞内環。 — 種表現載體，其包含與表現控制元件可操作地連接的如申請專利範圍第1項的核酸。 12·如申請專利範圍第11項的表現載體，其中所述表現控制元件選自··組成型、細胞特異性和誘導型調控序列。 10 Β· 一種包含如申請專利範圍第丨丨項的載體的培養細胞。 14· 一種培養細胞，其包含與表現控制元件可操作地連接的如申請專利範圍第丨項的核酸。 15·種用如申請專利範圍第11項的載體轉染或轉形的培養細胞或所述細胞的後代，其中所述細胞表現所述載 15 體包含的核酸所編碼的多肽。 16·如申請專利範圍第13項的培養細胞，其中所述細胞選自·真核細胞和原核細胞。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 17· 一種製備蛋白質的方法，包括：在允許所述載體包含的核酸所編碼的多肽實現表現的條件下，培養如申請 20 專利範圍第13項的細胞。 18· 一種可以特異結合GAVE17的抗體。 19·如申請專利範圍第18項的抗體，其是單株抗體或多株抗體。 2〇· —種用於給需要的患者調節GAVE17的信號活性或信 -117 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200402424 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍號轉導之醫藥組成物，包括給所述患者施用GAVE17 的激動劑、拮抗劑或反向激動劑。 21· —種用於鑑定GAVE17的激動劑的方法，包括：使潛在的激動劑與表現GAVE17的纟弓胞接觸，和確定在所 5 述潛在激動劑存在時GAVE17的信號活性是否相對於無所述潛在激動劑時GAVE17的活性增加。 22· —種用於鑑定GAVE17的反向激動劑的方法，包括：使潛在的反向激動劑與表現GAVE17的細胞接觸，和確定在所述潛在反向激動劑存在時，GAVE17的活性 1〇是否相對於無所述潛在反向激動劑時GAVE17的活性降低，並且在存在内源性配體或激動劑時也降低。 23· —種用於鑑定GAVE17的拮抗劑的方法，包括：使潛在的拮抗劑與表現GAVE17的細胞接觸，和確定在所述潛在拮抗劑存在時GAVE17的信號活性是否相詞 15 存在内源性配體或激動劑時GAVE17的活性降低。 24· —種治療組合物，其包含能夠調節GAVE17的信說活性或轉導的GAVE17的激動劑、拮抗劑或反向數動劑。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 25· —種治療與核苷酸代謝功能障礙有關的疾病的醫藥緩 20 成物，包括給需要治療的患者施用治療組合物，其中所述治療組合物包含能夠調節GAVE17的信號活性或轉導的GAVE17的激動劑、拮抗劑或反向激動劑。 -118 - 本紙張尺度適用中國國家標規格（210 X 297公釐）