HK1119056A - 分泌性神經凋亡抑制蛋白 - Google Patents

Description

分泌性神经凋亡抑制蛋白

本申请是发明人于2004年11月18日递交的题为“分泌性神经凋亡抑制蛋白”的中国专利申请200480037629.8的分案申请。

发明领域

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及能够调节自由基介导的细胞死亡效应的新型神经保护剂的鉴定。

发明背景

Wnt和卷曲蛋白(Frizzled)

作为正常发育期间细胞增殖、迁移、分化以及组织形态发生的诱导剂，胞外信号分子起着根本的作用(Finch等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94：6770-75)。此外，这类分子作为细胞凋亡调节剂发挥着作用，细胞凋亡为在多细胞生物体的正常发育和功能行使中起着重要作用的程序性细胞死亡。当功能失调时，信号传递分子和细胞凋亡参与众多疾病的发病机理，例如参见Thompson，Science(1995)267：1456-1462。

细胞凋亡涉及各种正常和致病的生物学事件，并且可以为许多不相干的刺激所诱导。关于凋亡的最新研究启示，导致细胞死亡的常见代谢路径可能是由多种信号起始的，包括激素、血清生长因子耗竭、化疗剂、致电离辐射和人类免疫缺陷病毒(HIV)感染(Wyllie，Nature(1980)284：555-556；Kanter等人，Bio chem.Biophys.Res.Commun.(1984)118：392-399；Duke& Cohen，Lymphokine Res.(1986)5：289-299；Tomei等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.(1988)155：324-331；Kruman等人，J.Cell.Physiol.(1991)148：267-273；Ameisen & Capron，Immunol.Today(1991)12：102-105以及Sheppard & Ascher，J.AIDS(1992)5：143-147)。因此，影响凋亡生物学调控的试剂对于众多临床适应症均有治疗功用。

虽然最近许多参与凋亡不同阶段的基因和基因家族已经被鉴定和克隆出来，但由于凋亡路径仍不是描述得很清楚，许多参与凋亡过程的新的基因和基因产物仍有待发现。

一组已知在调节细胞发育方面具有重要作用的分子是Wnt蛋白家族。Wnts由大型基因家族编码，其成员见于蛔虫、昆虫、软骨鱼类和脊椎动物。由于许多不同的物种都有多个保存的Wnt基因，所以Wnt蛋白家族被认为在多种发育和生理过程中都起作用(McMahon，Trends Genet.(1992)8：236-242和Nusse & Varmus，Cell(1992)69：1073-1087)。

Wnt基因编码多种分泌性糖蛋白，这些糖蛋白被认为在若干原始细胞类型中起着旁分泌或自分泌信号的作用(McMahon(1992)和Nusse &Varmus(1992)，同前)。在小鼠中，Wnt生长因子家族包括10种以上的基因(Wnt-1、2、3a、3b、4、5a、5b、6、7a、7b、8a、8b、10b、11、12)(例如参见Gavin等人，Genes Dev.(1990)4：2319-2332；Lee等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：2268-2272以及Christiansen等人，Mech.Dev.(1995)51：341-350)，而在人类中包括至少7种基因(Wnt-1、2、3、4、5a、7a和7b)(例如参见Vant Veer等人，Mol.Cell.Biol.(1984)4：2532-2534)。

由于Wnt蛋白相对的不溶性，倾向于与细胞或胞外基质紧密地结合，所以Wnt受体的鉴定受到了牵制。不过，若干观测结果表明，卷曲蛋白(FZ)分子家族的成员可作为Wnt蛋白的受体，或作为Wnt受体复合物的组分起作用(He等人，Science(1997)275：1652-1654)。

FZ受体基因家族的每个成员都编码一个完整的膜蛋白，该膜蛋白具有大型的胞外部分、7个推定的跨膜结构域和一个胞浆尾(例如参见Wang等人，J.Biol.Chem.(1997)271：468-76)。接近胞外部分NH₂-末端处，是在FZ家族其它成员中相当保守的富含半胱氨酸的结构域(CRD)。CRD包含大约110个氨基酸残基，包括10个不变的半胱氨酸，是Wnt配体的推定结合位点(Bhanot等人，Nature(1996)382：25-30)。FZ受体家族中有10个已知的基因。

大多数Wnt-FZ信号是通过糖原合成酶激酶(GSK3β)的抑制和β-连环蛋白在核中的积累来介导的。β-连环蛋白活化c-myc，这可引起某些细胞的凋亡。因此，Wnt通过FZ1和FZ2的信号传递以及β-连环蛋白的维持可以引起细胞的死亡，尤其是小脑中未成熟的细胞。而且，FZ1和FZ2以及β-连环蛋白的过表达可以诱导凋亡。然而，有些Wnt-FZ信号路径并不依赖于β-连环蛋白。

最后，Wnt通过让β-连环蛋白在细胞胞浆中积累而传递其信号。在胞浆中，β-连环蛋白与Tcf-Lef转录因子家族的成员结合，并转移到细胞核中。当Wnt不存在时，β-连环蛋白则与GSK3和多发性结肠腺瘤样息肉(APC)肿瘤阻遏蛋白形成复合物。这种相互作用与β-连环蛋白的磷酸化相关，使之被标记以进行泛素化(ubiquitination)和降解。Wnt通过抑制GSK3的功能而使β-连环蛋白得以积累。

那些具有FZ CRD但不含那7个跨膜基序和胞浆尾的分子的存在，提示存在着作为Wnt活性调节剂起作用的蛋白亚家族。可溶性卷曲相关蛋白(SFRPs)，例如登录号为AF056087的核酸序列，与分泌性凋亡相关蛋白(SARPs)同源，并构成了分泌性分子家族，该家族分子含有与FZ CRD结构域高度同源的CRD结构域(Finch等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94：6770-6775)。SARPs通过与Wnt相互作用或通过与膜结合FZ蛋白形成无功能的同聚复合物而阻断Wnt信号转导。

Wnt路径的失调似乎是异常生长及发育的一个因素。考虑到Wnt和FZ家族多个成员之间相互作用的潜在复杂性，可能存在着其它机制以调节特定发育期或某些组织的疾病发展/损伤期间Wnt所调控的事件(如凋亡)。此类机制的鉴定，尤其是这些机制的效应物的鉴定，对于理解和调节细胞调控过程颇为重要。

自由基神经毒性

一氧化氮(NO)是一种分布广泛的多功能的生物信使分子。NO可能不仅在神经元的生理功能如神经递质释放、神经发育、再生、突触可塑性(synaptic plasticity)和基因表达调控中起作用，而且也在其中过量产生NO导致神经损害的多种神经紊乱中起作用(Yun等人，Mol Psychiatr(1997)2：300-310)。

NO是当L-精氨酸在一氧化氮合成酶(NOS)作用下被氧化为瓜氨酸时而形成的。虽然NO本身是一种自由基，具有一个不成对的电子，但它本身未被察觉参与了任何会造成严重损害的化学反应。然而，当NO与超氧化物阴离子反应时，就形成了反应性极强的氧化剂过亚硝酸盐(ONOO^-)(<www.gsdl.com/news/1999/1990302/index>，末次访问时间是2002年11月12日)。

N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体介导的神经毒性，可能部分地依赖于经NO产生的过亚硝酸盐(OONO^-)(Lipton等人，Nature(1993)364(6438)：626-632)。这种形式的神经毒性被认为在各式各样急性和慢性的神经紊乱中促成了最终共同的损伤路径；这些疾病包括局灶性缺血、外伤、癫痫症、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化症、爱滋病相关的痴呆症(AIDS dementia)以及其它神经退化性疾病(Bonfoco等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：7162-7166)。而且，过亚硝酸盐牵涉到多种破坏性的神经元内事件，包括DNA链断裂、DNA脱氨基作用、包括过氧化物歧化酶在内的蛋白的硝化，以及线粒体复合物I的破坏(www.gsdl.com/news/1999/1990302/index，末次访问时间是2002年11月12日)。确实，ONOO^-已证明可引起神经元死亡。有人认为这种神经元死亡在不同的中枢神经系统紊乱中发生，例如脑缺血、爱滋病相关的痴呆症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症等(Moro等人，Neuropharmacology(1998)37(8)：1071-1079)。此外，通过NMDA受体作用的过量谷氨酸可介导局灶性脑缺血时细胞的死亡(Yun等人(1997)，同前)。谷氨酸的神经毒性也可能在神经退化性疾病如亨廷顿舞蹈症和阿尔茨海默氏病中起部分作用(Yun等人(1997)同前)。

因此，取决于侵袭的具体情况，NMDA或一氧化氮/超氧化物可导致凋亡性神经元细胞的损坏。

业已证明大脑颗粒细胞(CGC)与免疫刺激的小神经胶质细胞的共培养，可增强NMDA受体介导的死亡(Hewett等人，Neuron(1994)13(2)：487-494；Kim等人，J.Neurosci.Res.(1998)54(1)：17-26)，从而暗示了诱导型NOS在该类神经毒性中的作用。而且，NO释放剂3-吗啉斯得酮亚胺(SIN-1)可模拟这种增强作用。此外，这种NMDA神经毒性的增效/增强以及NO发生剂(如SIN-1或S-亚硝基-N-乙酰青霉胺：SNAP)模拟的增强作用，似乎可被NOS抑制剂或抗氧化剂(过氧化物歧化酶/过氧化氢酶)所阻断(Hewett等人(1994)同前；Kim等人(1998)同前)。

与之相反，用NOS抑制剂处理CGCs并不能拯救接触过神经酰胺的这类细胞(Monti等人，Neurochem.Int.(2001)39(1)：11-18；Nagano等人，J.Neurochem.(2001)77(6)：1486-1495)。而且，在接触神经酰胺后所观察到的凋亡可能不涉及NMDA受体的作用(Centeno等人，Neuroreport(1998)9(18)：4199-4203；Moore等人，Br.J.Pharmacol.(2002)135(4)：1069-1077)。

综上所述，这些资料提示，神经酰胺的作用主要不是依赖于NO的产生，而且神经酰胺和NO发生剂例如SIN-1或SNAP是通过不同的路径诱导细胞凋亡的。

因此，考虑到众多与NMDA/过亚硝酸盐相关的疾病(同前)，选择性挽救接触SIN-1如神经毒素的细胞的分子，作为选择性抗凋亡剂应该是很有价值的，而且在与NMDA/过亚硝酸盐相关的神经疾病的有效治疗方法中是很有用的。

申请人鉴定了一种分泌性神经凋亡抑制蛋白(Secreted NeuralApoptosis Inhibiting Protein，SNAIP)，它具有神经保护作用并选择性地对抗例如SIN-1而非C2神经酰胺的神经毒性。

发明概述

本发明涉及一种调节过亚硝酸盐所诱导的神经元细胞凋亡的方法，该法包括使所述细胞与分泌性神经凋亡抑制蛋白(SNAIP)接触。在相关的方面，所述方法包括加入肝素。在另一相关的方面，所述方法调节谷氨酸/NMDA所诱导的凋亡。

本发明也涉及凋亡路径，包括选定基因的诱导。这些基因包括p38MAPK以及生长抑制和DNA损伤诱导基因(即GADD)。

此外，本发明涉及一种保护神经元免遭过亚硝酸盐相关的自由基介导的细胞死亡的方法，所述方法包括使所述细胞与SNAIP接触。

而且，本发明涉及一种确定与过亚硝酸盐毒性路径相关的神经保护性基因组靶标的方法。在相关的方面，这样的方法可包括以下步骤：使神经元细胞与SNAIP接触或不接触，使所述细胞与过亚硝酸盐诱导剂接触，测定接触细胞中基因表达的调节，鉴定在SNAIP和诱导剂存在或不存在下受调节的基因。这样的方法设计用于鉴定基因，并将此类基因与过亚硝酸盐诱导的凋亡的抑制相互关联起来。在相关的方面，所述方法也包括使所述细胞与肝素接触。在另一相关方面，诱导剂是SIN-1。

本发明还涉及一种治疗与自由基介导的细胞死亡相关的神经元疾病的方法，包括向需要治疗的患者给药治疗有效量的SNAIP，其中细胞死亡为凋亡。在相关的方面，与凋亡相关的疾病包括帕金森氏病、多发性硬化症、局灶性脑缺血、爱滋病相关的痴呆症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风以及阿尔茨海默氏病。在相关的方面，所述治疗方法包括施用肝素。

在本发明的另一个方面，公开了调节SNAIP表达的治疗方法，包括向需要治疗的患者给药肽类、激动剂、拮抗剂、反激动剂和/或抗体。SNAIP也可用于鉴定结合FZ的分子。这些分子可以是激动剂或拮抗剂，仅仅与FZ接合，但最好为拮抗剂，以将Wnt信号传递最小化，从而避免细胞凋亡。

在本发明的另一个方面，公开了鉴定SNAIP调节剂的方法，其包括步骤：提供化学成分，提供表达SNAIP的细胞或纯化的SNAIP，并确定所述化学成分是否与SNAIP结合。在相关的方面，所述化学基团可以包括但不限于肽类、抗体和小分子。

本发明的另一个方面包括治疗组合物，其中这样的治疗组合物包括核酸、抗体、多肽、激动剂、反激动剂以及拮抗剂。而且，本发明的方法也包括向需要治疗的患者给药这样的治疗组合物的治疗方法。活性剂可以是用SNAIP鉴定出来的分子或SNAIP本身。

通过参考本发明如下的详细说明和附图，本发明方方面面将会变得显而易见。此外，文中列出了许多更详细地描述某些操作或组合物的参考文献。每一篇参考文献都作为整体并入文中作为参考，就好象每一篇都是单独地并入一样。

发明内容

本发明的蛋白质与被称之为分泌性凋亡相关蛋白(SARP)的蛋白家族具有约60％的同一性。申请人定位了该分子在大脑中的表达，其中在胎儿脑中的丰度比成人脑中的更高。已成人的前脑、中脑和后眼区鉴定到该蛋白，但在它曾被发现的区域，即室区未鉴定到。尚没有该蛋白和任何给定的细胞类型之间详细的关联。该蛋白似乎是抗凋亡的。SNAIP可保护神经元免受自由基介导的细胞死亡。

因此，在一个实施方案中，SNAIP及其调节作用是研究神经退化性疾病治疗干预药物的目标，所述神经退化性疾病包括但不限于帕金森氏病、多发性硬化症、局灶性脑缺血、爱滋病相关的老年痴呆、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风和阿尔茨海默氏病。

NO去调控的过量产生能起始神经毒性级联。据推测NO介由过亚硝酸盐而杀死神经元。该强氧化剂被认为参与大多数NO介导的神经毒性作用。过亚硝酸盐可进一步分解为羟基和二氧化氮自由基，它们也具有高度的反应性和生物破坏性，能导致因过量产生NO而引起的各种神经紊乱。

例如，源自神经元的NO在介导局灶性缺血后神经元细胞的死亡方面起着重要作用。在脑缺血晚期(＞6h)，局部缺血后的炎症诱导了iNOS的表达，因而大量NO的持续产生导致了延迟性神经损伤(Yun等人(1997)同前)。

在相关方面，3-硝基酪氨酸(3-NT)是蛋白被过亚硝酸盐(ONOO^-)硝化的特异性标志物，而过亚硝酸盐是由NO和超氧化物产生的。据报导，患有某些神经退化性紊乱的患者，其脑中含3-NT的蛋白质(即3-NT蛋白)的含量有所增加(Yamamoto等人，J.Neural.Transm.(2002)109(1)：1-13)。因此，在一个实施方案中，3-NT被用作为鉴定SNAIP相关路径的标志物。

在另一相关方面，NO对促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号路径的激活，可能是NO如何调节神经元生长、分化、存活和死亡的关键。由于MAPK信号传递路径在神经系统生长因子反应(ERK)或应激反应(JNK，p38 MAPK)中起着主要的作用，NO-MAPK信号传递可能是在神经元发育和疾病/损伤期间，NO在神经元存活、分化以及凋亡细胞的死亡方面起作用的基础(Yun等，(1997)同前)。

已发现，过亚硝酸盐发生剂3-吗啉斯得酮亚胺(SIN-1)，在人类成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞的细胞死亡早期阶段，诱导了三种不同的生长抑制和DNA损伤诱导(GADD)的mRNAs即GADD34、GADD45和GADD153的表达。过亚硝酸盐还激活了p38 MAPK。三种GADD基因的表达以及p38 MAPK的磷酸化也被通过用自由基清除剂、超氧化物歧化酶加过氧化氢酶和谷胱甘肽的处理所抑制(Ohashi等人，Free Radic.Biol.Med.(2001)30(2)：213-221)。因此，在一个实施方案中，目的路径包括GADD34、GADD45、GADD153和p38 MAPK。

SNAIP具有神经保护作用且能选择性地防御SIN-1而非C2神经酰胺的神经毒性。SNAIP由细胞释放到介质中，特别是当肝素存在时。

在一个相关方面，NO发生剂如SIN-1或SNAP和神经酰胺通过不同的路径诱导凋亡。在优选的实施方案中，SNAIP选择性地防御NMDA诱导的凋亡。

SNAIP在这样那样的组织中的存在提示，SNAIP与涉及各种神经退化性紊乱的各种神经系统疾病状态密切相关。SNAIP在那些组织中的鉴定和SNAIP编码基因的克隆，提供了多种治疗方法以调节SNAIP的表达和活性，从而提供治疗SNAIP相关疾病的方法。

人类的SNAIP与具有某些保守结构和功能特征的分泌性凋亡相关的蛋白(SARP)分子家族只有60％的氨基酸同一性，且与之互不相关。当提及本发明的蛋白质和核酸分子时，术语“家族”旨在表示具有整体上的共同结构域且具有如本文所定义的足够的氨基酸或核苷酸序列同一性的两种或两种以上的蛋白质或核酸分子。这样的家族成员能够天然地存在且可来自于相同的或不同的物种。例如，一个家族可含有人源的第一蛋白和鼠源的该蛋白同系物，以及人源的截然不同的第二蛋白和该蛋白的鼠源同系物。家族的成员还可能具有共同的功能特点。

文中的术语“等同的氨基酸残基”表示当对两个或以上的序列进行比对分析时，这些氨基酸在蛋白质序列内基本上占据了同样的位置。

文中所用的术语“足够地相同”指的是第一氨基酸或核苷酸序列含有与第二氨基酸或核苷酸序列相比足够或最少数量的相同或等同的(如，具有相似的侧链)氨基酸残基或核苷酸，从而使得第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如，含有共同结构域的氨基酸或核苷酸序列，若具有约75％的同一性，优选80％的同一性，更优选85％、95％或98％的同一性，则在文中被定义为足够地相同。

如文中互换使用的，“SNAIP活性”、“SNAIP的生物学活性”或“SNAIP的功能活性”是指按照标准的技术或文中所教导的，SNAIP蛋白、多肽或核酸分子施加于SNAIP响应细胞的活性。SNAIP活性可以是直接活性，例如与第二蛋白的结合，或是间接活性，例如通过SNAIP蛋白与第二蛋白的相互作用而介导的细胞信号传递活性。在优选的实施方案中，SNAIP活性至少包括以下一种或多种活性：(i)与Wnt/FZ信号传递路径中的蛋白相互作用的能力；(ii)与SNAIP受体(如FZ)相互作用的能力；(iii)与胞内靶蛋白相互作用的能力；以及(iv)诱导SNAIP生物表现的能力。例如，正如由本领域众所周知的手段所测定的那样，SNAIP活性或表现包括但不限于抑制Wnt与FZ的结合。

相应地，本发明的另一个实施方案的特征在于分离的具有SNAIP活性的SNAIP蛋白和多肽。

本发明的各个方面将在以下各分节中进一步详述。

I.分离的核酸分子

本发明的一个方面涉及分离的编码SNAIPs或其生物学活性部分的核酸分子；还有足以作为杂交探针以鉴定SNAIP编码核酸(如SNAIP mRNA)的核酸分子，以及作为扩增或突变SNAIP核酸分子的PCR引物的片段。如本文所用，术语“核酸分子”旨在包括DNA分子(如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(如mRNA)，以及使用核苷酸类似物所产生的DNA或RNA类似物。核酸分子可以是单链的或双链的。

“分离的”核酸分子是指从存在于核酸天然来源之中的其它核酸分子中分离的核酸分子。优选地，“分离的”核酸不含该核酸所衍生自的生物体的基因组DNA中天然地侧接该核酸(即位于该核酸5′端和3′端的序列)的序列(优选蛋白质编码序列)。例如，在多个实施方案中，该分离的SNAIP核酸分子可以含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb该核酸所衍生自的细胞的基因组DNA中天然地侧接该核酸分子的核苷酸序列。而且，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，当以重组技术生产时，可基本上不含其它细胞材料或培养基；或者，当以化学方式合成时，可基本上不含化学前体或其它化学制品。

本发明的核酸分子或任何这些核苷酸序列的互补物，均可采用标准的分子生物学技术分离(例如，如Sambrook等人编，“Molecular Cloning：ALaboratory Manual，”第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989中所述的那样)。

通过克隆人类SNAIP基因而确定的核苷酸序列，可以产生探针和引物，所述探针和引物被设计用于鉴定和/或克隆例如来自其它组织的其它细胞类型中的SNAIP同系物，以及来自其它哺乳动物的SNAIP同系物。所述探针/引物一般包括基本上纯的寡核苷酸。寡核苷酸一般包括这样的核苷酸序列区域，它在严谨条件下与SNAIP的正义或反义序列或天然存在的SNAIP突变体的至少约12个，优选约25个，更优选约50、75、100、125、150、175、200、250、300、350或400个连续的核苷酸杂交。以人类SNAIP核苷酸序列为基础的探针可用于检测编码相似或相同蛋白的转录本或基因组序列。所述探针可包括与之相连的标记基团，例如，放射性同位素，荧光化合物，酶或酶辅因子。这样的探针可用作为诊断试验试剂盒的一部分，以鉴定不适当地表达SNAIP蛋白的细胞或组织，例如通过测量来自受试者的细胞样品中的SNAIP编码核酸的水平，例如，检测SNAIP mRNA的水平或测定基因组SNAIP基因是否已发生突变或缺失。

编码“SNAIP生物学活性部分”的核酸片段可这样制备，即分离编码具有SNAIP生物学活性(如抑制凋亡)的多肽的多核苷酸，表达SNAIP蛋白的编码部分(如通过重组表达)并评估SNAIP编码部分的活性。或者，所述片段可能与已知中和SNAIP活性的抗体结合。

本领域技术人员将会理解，群体(如人群)内可能存在导致SNAIP氨基酸序列变化的DNA序列多态性。这种SNAIP基因的遗传多态性可能由于天然的等位基因变异而存在于群体内的个体之中。等位基因是在给定遗传座位上可选地出现的一组基因中的一个。如本文所用，术语“基因”和“重组基因”指的是包含编码SNAIP蛋白(优选哺乳动物SNAIP蛋白)的开放读框的核酸分子。如本文所用，术语“等位基因变体”是指出现在SNAIP基因座上的核苷酸序列，或由所述核苷酸序列编码的多肽，其中所述核苷酸或多肽并非是给定群体中所发现的普遍形式。可选的等位基因可通过对许多不同个体中的目的基因进行测序而加以鉴定。这可以通过使用杂交探针来鉴定许多不同个体同一遗传座位而很容易地实现。作为天然等位基因变异的结果且不改变SNAIP功能活性的这类核苷酸的任何和所有变异，以及所引起的SNAIP氨基酸的多态性或变异，均旨在落入本发明的范围之内。

此外，那些具有不同于人类SNAIP的核苷酸序列的、编码其它物种的SNAIP蛋白(SNAIP同系物)的核酸分子，也旨在落入本发明的范围之内。那些对应于本发明的SNAIP cDNA的天然等位基因变体和同系物的核酸分子，可以按照严谨杂交条件下的标准杂交技术用人类cDNA或其一部分作为杂交探针，基于它与本文所公开的人类SNAIP核酸的同一性进行分离。

相应地，在另一个实施方案中，本发明分离的核酸分子长度至少为300、325、350、375、400、425、450、500、550、600、650、700、800、900、1000或1100个核苷酸，且在严谨条件下与具有SNAIP活性的核酸分子杂交。

如本文所用，术语“在严谨条件下杂交”旨在描述这样的杂交和洗涤条件，在这些条件下彼此至少60％(65％、70％，优选75％或以上)同一性的核苷酸序列通常保持互相杂交。这样的严谨条件是本领域技术人员所熟知的，而且可在文献中查到，例如，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。严谨杂交条件优选的非限制性实例是，于约45℃在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中进行杂交，随后于50-65℃在0.2x SSC，0.1％SDS中洗涤一遍或多遍。如本文所用，“天然存在的”核酸分子是指具有天然存在的核苷酸序列(如编码天然存在的蛋白)的RNA或DNA分子。

除了可能存在于群体之中的SNAIP序列的天然存在的等位基因变体，本领域技术人员还将会理解，可以通过突变而引入变化，由此导致所编码的SNAIP蛋白的氨基酸序列变化，而不改变SNAIP蛋白的生物学活性。例如，可以进行核苷酸取代以导致“非必需”氨基酸残基上的氨基酸取代。“非必需”氨基酸残基是这样的残基，它与野生型SNAIP序列相比有所改变但并不改变其生物学活性，而“必需”氨基酸残基则是生物学活性所必需的。例如，在各物种的SNAIP中不保守或仅仅半保守的氨基酸残基，对于活性可能是非必需的，因此很可能成为改变的靶点。或者，在各物种的SNAIP蛋白中保守的氨基酸残基，对于活性可能是必需的，因此不大可能成为改变的靶点。

相应地，本发明的另一个方面涉及编码SNAIP蛋白的核酸分子，其在对于活性是非必需的氨基酸残基中包含变化。在一个实施方案中，分离的核酸分子包括编码这样的蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质包括的氨基酸序列与SNAIP活性的多肽具有至少约87％的同一性、90％、93％、95％、98％或99％的同一性。

通过在天然存在的SNAIP的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失，可产生编码具有变体序列的SNAIP蛋白的分离的核酸分子，从而可将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入到所编码的蛋白中。

可以通过标准技术引入各种突变，例如定点诱变和PCR介导的诱变。优选地，在一个或多个预测的非必需氨基酸残基上进行保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是指其中氨基酸残基被替换为具有相似侧链的氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域内已有所定义。那些家族包括具有碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸和谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)、β-分支侧链(如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)以及芳香族侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)的氨基酸。因此，SNAIP中预测的非必需氨基酸残基优选被来自同一侧链家族的另一个氨基酸残基取代。可选地，可以沿着全部或部分SNAIP编码序列随机地引入突变，例如通过饱和诱变，而且可以筛选所产生的突变体的SNAIP生物学活性，以鉴定保留活性的突变体。在诱变之后，可重组表达所编码的蛋白，并可测定所述蛋白的活性。

在优选的实施方案中，可对突变SNAIP蛋白进行如下测定：(1)与SNAIP信号传递路径中的蛋白质形成蛋白质：蛋白质相互作用的能力；(2)与SNAIP受体(如FZ)结合的能力；或(3)与胞内靶蛋白结合的能力。又在另一个优选的实施方案中，可测定突变SNAIP调节细胞增殖或细胞分化的能力。

本发明涵盖反义核酸分子，即，与编码蛋白的正义核酸互补的分子，例如，与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA序列互补。相应地，反义核酸能以氢键与正义核酸结合。反义核酸可与整个SNAIP编码链或仅与其一部分互补，例如，与蛋白编码区的全部或部分(或开放读框)互补。反义核酸分子可以是编码SNAIP的核苷酸序列的编码链的非编码区的反义链。非编码区(“5′和3′非翻译区或侧翼区”)是侧接编码区且不被翻译成氨基酸的5′和3′序列。例如，反义分子可用于抑制FZ的表达。

反义寡核苷酸的长度可以是，例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。本发明的反义核酸可以利用化学合成和酶促连接反应并采用本领域公知的操作来构建。例如，反义核酸(如反义寡核苷酸)可以用天然存在的核苷酸或各种经修饰的核苷酸以化学方式合成，所述经修饰的核苷酸是设计用于增加分子的生物学稳定性，或增加反义和正义核酸之间所形成双链体的物理稳定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物、膦酸脂衍生物和吖啶取代的核苷酸。

本发明还考虑到其它抑制性RNA分子，例如RNAi分子。构建了适当的双链或发夹型RNA并用于调节SNAIP的产生。

可用于产生反义链和其它核酸的经修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙基胞核嘧啶、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖Q核苷、肌苷、N⁶-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N⁶-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖Q核苷、5-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫-N⁶-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸、butoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶以及2，6-二氨基嘌呤。

或者，反义核酸也可用表达载体以生物方式生产，其中核酸分子被以反义取向亚克隆到所述表达载体内(即相对于目的靶核酸，从插入核酸所转录的RNA将具有反义的取向，这将在以下分节里进一步描述)。

本发明的反义核酸或其它核酸分子可以是一个α-异头核酸分子。α-异头核酸分子形成特殊的带有互补RNA的双链杂交物，其中各链互相平行(Gaultier等人，Nucleic Acids Res.(1987)15：6625-6641)。所述反义核酸或其它核酸分子也可包含甲基核糖核苷酸(Inoue等人，Nucleic Acids Res(1987)15：6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等人，FEBS Lett.(1987)215：327-330)。

本发明还包括核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，它们能切割与之具有互补区的单链核酸，例如mRNA。因此，可利用核酶(例如(Haselhoff等人，Nature(1988)334：585-591中所述的)锤头状核酶)催化切割SNAIP mRNA转录本，由此抑制SNAIP mRNA的翻译。对SNAIP编码核酸具有特异性的核酶，可以基于天然存在的SNAIP cDNA的核苷酸序列设计。例如，可以构建四膜虫L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与SNAIP编码mRNA内待切割的核苷酸序列是互补的，例如参见Cech等，美国专利US 4,987,071；和Cech等，美国专利US5,116,742。或者，SNAIP mRNA可用于从RNA分子库中选择具有特异性核糖核酸活性的催化性RNA，例如参见Bartel等，Science(1993)261：1411-1418。

本发明还涵盖形成三螺旋结构的核酸分子。例如，通过靶向与SNAIP的调控区互补的核苷酸序列(例如，SNAIP启动子和/或增强子)以形成防止靶细胞中SNAIP基因转录的三螺旋结构，可以抑制SNAIP的基因表达，一般可参见Helene，Anticancer Drug Dis.(1991)6(6)：569；Helene，Ann.N.Y.Acad.Sci.(1992)660：27以及Maher，Bioassays(1992)14(12)：807。

在优选的实施方案中，本发明的核酸分子可以在碱基部分、糖基部分或磷酸主链上进行修饰，以改善例如分子的稳定性、杂交性或可溶性。例如，可以修饰核酸的脱氧核糖磷酸主链，以产生肽核酸(参见Hyrup等人，Bioorganic & Medicinal Chemistry(1996)4：5)。如本文所用，术语“肽核酸”或“PNAs”是指核酸模拟物，如DNA模拟物，其中脱氧核糖磷酸主链被替换为假核苷酸主链，而只保留四种天然核碱基。PNAs的中性主链已被证明可在低离子强度条件下与DNA和RNA特异性地杂交。PNA寡聚体的合成可使用标准的固相肽合成方案来进行，如Hyrup等人(1996)同前；Perry-O’Keefe等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93：14670中所述。

SNAIP的PNAs可用于治疗和诊断应用。例如，PNAs可作为反义或反基因剂而进行基因表达的序列特异性调节，例如，通过诱导转录或翻译的抑制或抑制复制。SNAIP的PNAs当与其它酶如S1核酸酶结合使用时可作为人工限制酶使用(Hyrup(1996)同前)，或作为DNA序列和杂交的探针或引物使用(Hyrup(1996)同前；Perry-O’Keefe等(1996)同前)，以用于基因内单碱基对突变的分析，例如，通过PNA指导的PCR夹子法(clamping)；

在另一个实施方案中，可通过将亲脂性或其它辅助基团连接在PNA上，通过形成PNA-DNA嵌合体，或通过使用脂质体或本领域已知的其它药物递送技术，来修饰SNAIP的PNA，以例如，提高稳定性、特异性或细胞摄入等。PNA-DNA嵌合体的合成可按照以下文献所述进行：Hyrup(1996)，同前；Finn等Nucleic Acids Res.(1996)24(17)：3357-63；Mag等，Nucleic Acids Res.(1989)17：5973以及Peterser等，Bioorganic Med.Chem.Lett.(1975)5：1119。

II.分离的SNAIP蛋白和抗-SNAIP抗体

本发明的一个方面涉及分离的SNAIP蛋白及其生物学活性部分，以及例如适合作为免疫原来引起抗-SNAIP抗体的多肽片段。在一个实施方案中，可通过使用标准的蛋白质纯化技术、采用适当的纯化策略，从细胞或组织分离天然的SNAIP蛋白。在另一个实施方案中，SNAIP蛋白是通过使用重组DNA技术生产的。作为重组表达的可选方案，可使用标准的肽合成技术以化学方式来合成SNAIP蛋白或多肽。

“分离的”或“纯化的”蛋白或其生物学活性部分，基本上不含细胞材料或来自于SNAIP蛋白所衍生自的细胞或组织来源的其它污染蛋白，或者，当以化学方式合成时，基本上不含化学前体或其它化学制品。用语“基本上不含细胞材料”包括SNAIP蛋白制品，其中所述蛋白自从中分离或以重组方式生产SNAIP蛋白的细胞的细胞组分中分离出来。因此，基本上不含细胞材料的SNAIP蛋白，包括其中非SNAIP蛋白(在文中也称之为“污染蛋白”)少于约30％、20％、10％或5％(干重)的SNAIP蛋白制品。当SNAIP蛋白或其生物学活性部分是以重组方式生产时，也优选基本上不含培养基，即培养基只占小于约20％、10％或5％的蛋白制品体积。当SNAIP蛋白是以化学合成方式生产时，优选基本上不含化学前体或其它化学制品，即它从参与所述蛋白合成的化学前体或其它化学制品中分离出来。相应地，这样的SNAIP蛋白制品只含少于约30％、20％、10％或5％(干重)的化学前体或非SNAIP化学制品。

SNAIP蛋白的生物学活性部分包括这样的肽，其含有与SNAIP蛋白的氨基酸序列足够相同的或自其衍生的氨基酸序列，所述肽比全长SNAIP蛋白包括更少的氨基酸，并显示出SNAIP蛋白的至少一种活性。通常，生物学活性部分包括具有SNAIP蛋白的至少一种活性的结构域或基序。SNAIP蛋白的生物学活性部分可以是长度为例如10、25、50、100个或更多个氨基酸的多肽。优选的生物学活性多肽包括一个或多个已鉴定的SNAIP结构域，例如，一个或多个其胞外结构域。

而且，其它的生物学活性部分(其中所述蛋白的其它区域已缺失)可以用重组技术来制备，并就天然SNAIP蛋白的一种或多种功能活性进行评估。

相应地，有用的SNAIP蛋白是这样的蛋白，它所包括的氨基酸序列与天然存在的SNAIP的氨基酸序列具有至少约88％、优选90％、93％、95％或99％的同一性，并且保留了SNAIP的功能活性。

为了确定两个氨基酸序列或两个核酸之间的同一性百分比，将这些序列比对以进行最佳的比较(例如，可在第一个氨基酸或核酸序列的序列中引入空位，以便与第二个氨基酸或核酸序列进行最佳的比对)。然后，将处于对应的氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一个序列中的位置为与第二个序列中对应位置上相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置上是相同的。两个序列之间的同一性百分比是这些序列所共享的相同位置数目的函数(即，同一性百分比＝相同位置数/位置总数(例如重叠的位置数)×100)。在一个实施方案中，两个序列长度相同。

两个序列之间的同源性百分比可利用数学算法来确定。比较两个序列的数学算法的优选的非限制性实例是Karlin等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87：2264中提出的，又在Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：5873-5877中改良的算法。这样的算法被纳入Altschul等人在J.Mol.Bio.(1990)215：403中提出的NBLAST和XBLAST程序中。可以用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索，例如，得分＝100，字长＝12，以获得与本发明的SNAIP核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，例如，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的SNAIP蛋白分子同源的氨基酸序列。为实现比较目的的空位比对，可使用如Altschul等人在Nucleic Acids Res.(1997)25：3389中所述的GappedBLAST。或者，PSI-Blast可用于进行检测分子之间疏远关系的迭代搜索。Altschul等，(1997)同前。当使用BLAST Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可使用相应程序的缺省参数(如XBLAST和NBLAST)，参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。

另一优选的、用于比较序列的数学算法的非限制性实例是Myers等人在CABIOS(1988)4：11-17中提出的算法。这种算法被纳入ALIGN程序(2.0版)中，它是GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可利用PAM120权重残基表(weight residue table)，空位长度罚分为12，空位罚分为4。

两个序列之间同一性百分比可采用与上述类似的技术，在允许空位或不允许空位的条件下来确定。在计算同一性百分比时，仅仅计算精确配。

在优选的实施方案中，制备了目的Wnt结合部分。SNAIP的这一部分可单独使用或与其它分子融合，例如利用本领域已知的技术和试剂与报告分子融合。这样，通过在Wnt与FZ接合之前就俘获Wnt，可溶性SNAIP可用于下调FZ。

在某些宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中，通过使用异源信号序列可提高SNAIP的表达和/或分泌。例如，杆状病毒包膜蛋白的gp6^分泌序列可用作为异源信号序列(Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人编，John Wiley & Sons，1992)。真核细胞异源信号序列的其它实例包括蜂毒肽和人类胎盘碱性磷酸酶的分泌序列(Stratagene；La Jolla，California)。又在另一实例中，有用的原核异源信号序列包括phoA分泌信号(Sambrook等，同前)和A蛋白分泌信号(Pharmacia Biotech；Piscataway，New Jercy)。

优选地，本发明的SNAIP嵌合或融合蛋白通过标准的重组DNA技术来制备。例如，按照常规技术将编码不同多肽序列的DNA片段读框一致地连接起来，例如采用平末端或粘性末端连接，利用限制性内切酶消化以提供适当的末端，根据需要补平粘性末端，利用碱性磷酸酶处理以避免不期望的连接，以及酶促连接。在另一个实施方案中，可通过常规技术合成融合基因，包括使用自动化DNA合成仪。或者，基因片段的PCR扩增可以利用锚定引物进行，在两个连续的基因片段之间产生互补的突出端，随后退火并再扩增以产生嵌合的基因序列。(例如参见Ausubel等，同前)。此外，许多早已编码融合部分(如GST多肽)的表达载体可商购获得。可将编码SNAIP的核酸克隆入这样的表达载体中，从而使所述该融合部分读框一致地连接于SNAIP蛋白。

本发明还涉及SNAIP蛋白的变体(即该蛋白序列不同于天然存在的、通常的SNAIP等位基因氨基酸序列)。这样的变体可作为SNAIP模拟物而起作用。SNAIP蛋白的变体可通过诱变而产生，例如，不连续点突变(discrete point mutation)或SNAIP蛋白的截短。SNAIP蛋白的激动剂或模拟物基本上保留了与天然存在形式的SNAIP蛋白同样的生物学活性，或一部分生物学活性。因此，用功能受限或增强的变体治疗可引发特殊的生物学效应。相对于用天然存在形式的SNAIP蛋白治疗的受试者，用具有该天然存在形式的蛋白的一部分生物学活性的变体治疗的受试者具有更小的副作用。

SNAIP蛋白的变体可通过筛选SNAIP蛋白突变体例如截短突变体组合文库的SNAIP蛋白活性予以鉴定。在一个实施方案中，通过在核酸水平上的组合诱变，产生多样化的SNAIP变体文库，并由多样化的基因文库编码。多样化分SNAIP变体文库可以这样产生：例如，将合成寡核苷酸的混合物酶促连接为基因序列，从而潜在SNAIP序列的简并集合可表达为单个多肽；或者，可表达为其中含有所述SNAIP序列集合的更大的融合蛋白的集合(例如噬菌体展示)。有多种方法可用于从一个简并的寡核苷酸序列产生潜在的SNAIP变体文库。可在自动化DNA合成仪中进行简并基因序列的化学合成，然后，将合成的基因连接到适当的表达载体上。使用简并基因集合可在一种混合物内提供编码潜在SNAIP序列的期望集合的所有序列。合成简并寡核苷酸的方法在本领域是众所周知的(例如参见，Narang，Tetrahedron(1983)39：3；Itakura等人，Ann.Rev.Biochem.(1984)53：323；Itakura等人，Science(1984)198：1056；Ike等人，Nucleic Acid Res.(1983)11：477)。

此外，可利用SNAIP蛋白编码序列片段文库产生多样化的SNAIP片段群，以进行SNAIP蛋白变体的筛选和后续选择。在一个实施方案中，编码序列片段数据库可以这样产生：在每个分子只产生大约一次缺刻的条件下用核酸酶处理SNAIP编码序列的双链PCR片段，使双链DNA变性，再使DNA复性形成双链DNA，其可包括来自不同缺刻产物的正义/反义对，然后用S1核酸酶处理以除去重新形成的双链体中的单链部分，并将所得的片段文库连到表达载体内。通过这种方法，可以产生编码SNAIP蛋白不同大小的N-末端和内部片段的表达文库。

本领域已知有数种技术可用于筛选通过点突变或截短制备的组合文库基因产物，以及筛选cDNA文库中具有选定性质的基因产物。这些技术适用于快速筛选通过SNAIP蛋白组合诱变而产生的基因文库。适于高通量分析的、筛选大型基因文库时最广泛使用的技术通常包括：将基因文库克隆到可复制的表达载体中，用所得载体文库转化适当的细胞，并在期望活性的检测可促进编码检测其产物的基因的载体的分离的条件下表达所述组合基因。递归整体诱变(Recursive ensemble mutagenesis，REM)是一种提高文库中功能突变体频率的技术，可与筛选分析联合使用以鉴定SNAIP变体(Arkin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89：7811-7815；Delgrave等人，Protein Engineering(1993)6(3)：327-331)。

利用制备多克隆和单克隆抗体的标准技术，可利用分离的SNAIP蛋白或其部分或片段作为免疫原，以产生结合SNAIP的抗体。可以使用全长的SNAIP蛋白，或者，本发明提供了SNAIP抗原肽片段用作为免疫原。所述SNAIP抗原肽至少包括8个(优选10、15、20或30个)SNAIP氨基酸残基，并包括SNAIP表位，从而产生的抗此肽的抗体与SNAIP形成特异性的免疫复合物。所述表位可连接在载体分子如白蛋白上。

SNAIP免疫原通常通过用所述免疫原免疫合适的受试者(如兔子、山羊、小鼠或其它哺乳动物)而用于制备抗体。合适的免疫原制剂可含有例如重组表达的SNAIP蛋白，或化学合成的SNAIP多肽。所述制剂还可包含佐剂，例如弗氏完全或不完全佐剂，或类似的免疫刺激剂。用免疫原性SNAIP制剂免疫合适的受试者可诱导产生抗-SNAIP多克隆抗体应答。

相应地，本发明的另一个方面涉及抗-SNAIP抗体。文中所使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合SNAIP的抗原结合部位的分子。特异性结合SNAIP的分子是结合SNAIP但基本上不结合样品(例如天然地含有SNAIP的生物样品)中其它分子的分子。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的实例包括F_(ab)和F_(ab′)2片段，它们可以通过用酶例如胃蛋白酶处理抗体而产生。本发明提供了可结合SNAIP的多克隆和单克隆抗体。本文所使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指抗体分子群，它们只含有一种能够与SNAIP的特定表位发生免疫反应的抗原结合部位。因此，单克隆抗体组合物通常只对与其发生免疫反应的特定SNAIP蛋白显示单一的结合亲合力。

多克隆抗-SNAIP抗体可以如上所述通过用SNAIP免疫原免疫适当受试者制备。免疫受试者中抗-SNAIP抗体的滴度可采用标准技术随着时间进行监测，例如采用酶联免疫吸附试验(ELISA)并使用固定化的SNAIP。

如果期望，抗SNAIP的抗体分子可从哺乳动物(例如从血液中)分离并进一步用众所周知的技术纯化，例如用A蛋白色谱法获取IgG组分。在免疫后适当的时间点，例如当抗-SNAIP抗体滴度最高的时候，可从免疫受试者中获取产生抗体的细胞，并可通过标准技术将其用于制备单克隆抗体，例如，最初由Kohler等人描述的杂交瘤技术(Kohler等人，Nature(1975)256：495-497)、人类B细胞杂交瘤技术(Kohler等人，Immunol.Today(1983)4：72)、EBV-杂交瘤技术(Cole等人，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，(1985)，Alan R.Liss，Inc.，第77-96页)或三体瘤(trioma)技术。产生杂交瘤细胞的技术是众所周知的(一般参见Current Protocols inImmunology(1994)Coligan等人(编)John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY)。简言之，将永生的细胞系(通常是骨髓瘤细胞)与用SNAIP免疫原按上述方法免疫过的哺乳动物的淋巴细胞(通常为脾细胞)融合，再筛选所得杂交瘤细胞的培养上清，以鉴定能产生与SNAIP结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞。

用于融合淋巴细胞和永生细胞系的许多众所周知方案中的任何一个都可用于产生抗-SNAIP单克隆抗体(例如参见Current Protocols inImmunology，同前；Galfre等人，Nature(1977)266：550-552；Kenneth，inMonoclonal Antibodies：A New Dimension In Biological Analyses，PlenumPublishing Corp.，New York，N.Y.(1980)以及Lerner，Yale J.Biol.Med.(1981)54：387-402)。此外，普通技术人员将会理解这类方法还有许多有用的变动。通常，永生细胞系(如骨髓瘤细胞系)与淋巴细胞源自同一种哺乳动物。例如，鼠源杂交瘤细胞可通过使源自经本发明的免疫原制剂免疫的小鼠的淋巴细胞与永生小鼠细胞系融合而制备，例如包括对含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的培养基(“HAT培养基”)敏感的骨髓瘤细胞系。很多骨髓瘤细胞系都可按照标准的技术用作为融合配偶体，例如P3-NS1/l-Ag4-1，P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Agl4骨髓瘤细胞系。这些骨髓瘤细胞可由ATCC获得。通常，对HAT敏感的小鼠骨髓瘤细胞利用聚乙二醇(“PEG”)与小鼠脾细胞融合。然后用HAT培养基选择由融合所产生的杂交瘤细胞，HAT培养基将未融合以及无产物融合的骨髓瘤细胞(未融合的脾细胞于数天后死亡，因为它们未被转化)杀死。产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞可通过筛选杂交瘤细胞培养上清中结合SNAIP的抗体而检测，例如，采用标准的ELISA试验来检测。

作为制备分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的可选方案，还可以通过用SNAIP筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如抗体噬菌体展示文库)，由此分离出结合SNAIP的免疫球蛋白文库成员，以鉴定和分离单克隆抗-SNAIP抗体。产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒可商购获得(例如，Pharmacia重组噬菌体抗体系统，Catalog No.27-9400-01；以及Stratagene SurfZAP^噬菌体展示试剂盒，Catalog No.240612)。

另外，特别适用于产生并筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例可参见例如，美国专利号US 5,223,409；PCT公开号WO 92/18619；PCT公开号WO 91/17271；PCT公开号WO 92/20791；PCT公开号WO 92/15679；PCT公开号WO 93/01288；PCT公开号WO 92/01047；PCT公开号WO92/09690；PCT公开号WO 90/02809；Fuchs等人，Bio/Technology(1991)9：1370-1372；Hay等人，Hum.Antibod.Hybridomas(1992)3：81-85；Huse等人，Science(1989)246：1275-1281以及Griffiths等人，EMBO J.(1993)2512：725-734。

此外，重组抗-SNAIP抗体，例如由可用标准重组DNA技术制备的包括人类和非人类两部分的嵌合及人源化单克隆抗体，也落入本发明的范围之内。这类嵌合及人源化单克隆抗体可使用本领域已知的重组DNA技术来生产，例如使用以下文献所述的方法：PCT公开号WO 87/02671；欧洲专利公开号No.184,187；欧洲专利公开号No.171,496；欧洲专利公开号No.173,494；PCT公开号WO 86/01533；美国专利号No.4,816,567；欧洲专利公开号No.125,023；Better等人，Science(1988)240：1041-1043；Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)84：3439-3443；Lin等人，J.Immunol.(1987)139：3521-3526；Sun等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)84：214-218；Nishimura等人，Canc.Res.(1987)47：999-1005；Wood等人，Nature(1985)314：446-449；Shaw等人，J.Natl.Cancer.Inst.(1988)80：1553-1559；Morrison，Science(1985)229：1202-1207；Oi等人，Bio/Techniques(1986)4：214；美国专利号No.5,225,539；Jones等人，Nature(1986)321：552-525；Verhoeyan等人，Science(1988)239：1534以及Beidler等人，J.Immunol.(1988)141：4053-4060。

全人抗体对于人类患者的治疗性治疗是特别期望的。这类抗体可用不能表达内源免疫球蛋白重链和轻链基因、但能表达人类重链和轻链基因的转基因小鼠来生产。这些转基因小鼠用选定的抗原例如全部或部分SNAIP以通常的方式进行免疫。针对抗原的单克隆抗体可使用常规的杂交瘤技术获得。转基因小鼠所含的人类免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，随后经历类型转换和体细胞突变。从而，例如，使用这样的表位，抑制SNAIP活性的抗体得以鉴定。非人类抗体的重链和轻链被克隆并被用于产生噬菌体展示Fab片段。例如，重链基因可被克隆入质粒载体中，从而重链可由细菌分泌。轻链基因可被克隆入噬菌体的外壳蛋白基因中，从而轻链可以表达在噬菌体表面。与噬菌体融合的人类轻链所有组成部分(随机集合)被用于感染表达非人类重链的细菌。所得的子代噬菌体展示出杂合抗体(人类轻链/非人类重链)。利用选定的抗原以淘选的方式筛选与选定抗原结合的噬菌体。鉴定这样的噬菌体可能需要经过数轮筛选。然后，从结合选定抗原的选定噬菌体中分离人类轻链基因。其后，这些选定的人类轻链基因被用于指导如下的人类重链基因的选择。将选定的人类轻链基因插入到载体中由细菌表达。表达选定的人类轻链的细菌用融合于噬菌体的人类重链所有组成部分感染。所得的子代噬菌体展示人类抗体(人类轻链/人类重链)。

其次，利用选定的抗原以淘选的方式筛选与选定抗原结合的噬菌体。在该步骤选出的噬菌体展示全人抗体，它可识别为最初选出的非人类单克隆抗体所识别的相同表位。编码重链和轻链的基因可以容易地分离，并可被进一步操作以生产人类抗体。Jespers等人描述了该项技术(Bio/Technology(1994)12：899-903)。

抗-SNAIP抗体(例如单克隆抗体)可用于以标准技术分离SNAIP，例如亲合层析法或免疫沉淀反应。抗-SNAIP抗体可促进来自细胞的天然SNAIP的纯化，以及表达在宿主细胞中的重组产生的SNAIP的纯化。而且，抗-SNAIP抗体可用于检测SNAIP蛋白(例如，在细胞裂解物或细胞上清中)，以评估SNAIP蛋白的丰度和表达模式。作为临床试验操作的一部分，抗-SNAIP抗体在诊断上可用于监测组织内的蛋白质水平，例如，确定给定治疗方法的功效。使抗体与可检测的物质偶联则可促进检测。可检测物质的实例包括各种各样的酶，辅基，荧光物质，发光物质，生物发光物质和放射性物质。适当的酶的实例包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适当的辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适当的荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸盐、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯、给定的荧光蛋白或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；生物发光物质的实例包括荧光素酶、荧光素、水母发光蛋白；适当的放射性物质的实例包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

SNAIP分子可通过例如X-射线结晶学进行分析，以鉴别例如结合Wnt的那部分的结构。基于结构方面的信息，技术人员能够构建结合Wnt的合成分子。这样的SNAIP模拟物可由各种各样的任何构件来制备，包括氨基酸、核苷酸、糖类、有机分子等，以及它们的组合。

SNAIP分子还可用作为免疫原以引起具有模仿Wnt的构象的抗体。这类抗体与直接针对FZ引起的抗体相似，将与FZ结合并将阻止Wnt与FZ的结合。优选这类抗体不会触发FZ的活化。

III.重组表达载体和宿主细胞

本发明的另一个方面涉及含有编码SNAIP(或其部分)的核酸的载体，优选表达载体。如本文所用，术语“载体”是指能够运载与之相连的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，是指其它DNA片段可以连接上去的环形双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中其它的DNA片段可以连接到该病毒的基因组内，因为病毒基因组的容量较大。某些载体能够在其被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制原点的细菌载体和游离哺乳动物载体)。其它载体(例如，非游离哺乳动物载体)在被引入到宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组内，因此与宿主基因组一起复制。而且，某些载体即表达载体，能够指导与之有效连接的基因表达。一般而言，在重组DNA技术中实用的表达载体经常是以质粒(载体)的形式存在。但是，本发明旨在包括其它形式的表达载体，例如起等同作用的病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

本发明的重组表达载体含有本发明的核酸，它以适合核酸在宿主细胞内表达的形式存在。这意味着，重组表达载体包括基于用以表达的宿主细胞所选择的一个或多个调控序列，该调控序列与待表达的核酸有效地连接。在重组表达载体内，“有效地连接”旨在表示目的核苷酸序列以允许该核苷酸序列表达(例如，在体内转录/翻译系统内，或当载体被引入宿主细胞时在宿主细胞内)的方式与调控序列连接。术语“调控序列”旨在包括启动子、增强子以及其它表达控制元件(例如，多聚腺苷酸化信号)。这样的调控序列在文献中有描述，例如Goeddel，Gene Expression Technology：Methodsin Enzymology Vol.185，Academic Press，San Diego，CA(1990)。调控序列包括在许多类型的宿主细胞内指导核苷酸序列组成型表达的调控序列(例如，组织特异性调控序列)。本领域技术人员应理解表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所期望的蛋白表达水平等因素。本发明的表达载体可导入宿主细胞中，从而生产由如本文所述的核酸所编码的蛋白或肽(例如，SNAIP蛋白、突变体形式的SNAIP、融合蛋白等)。

本发明的重组表达载体可设计用于在原核或真核细胞内表达SNAIP，例如，细菌细胞如大肠杆菌、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞。上文提到的Goeddel一文对于适合的宿主细胞作了进一步讨论。或者，重组表达载体也可以在体外转录和翻译，例如使用T7启动子调控序列和T7聚合酶。

蛋白质在原核生物中的表达最经常是在大肠杆菌内进行的，所用的载体含有指导融合或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子。融合载体向其所编码的蛋白质中添加了一定数目的氨基酸，通常添加到重组蛋白的氨基末端。这类融合载体通常用于三个目的：1)增加重组蛋白的表达；2)提高重组蛋白的溶解度；以及3)作为亲合纯化过程中的配体而辅助重组蛋白的纯化。通常，在融合表达载体内，在融合部分和重组蛋白的连接处引入蛋白水解酶切割位点，以使得重组蛋白在融合蛋白纯化之后可与融合部分分离。这类酶以及它们的同源识别序列包括Xa因子、凝血酶以及肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc.；Smith等人，Gene(1988)67：31-40)，pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)以及pRITS(Pharmacia，Piscataway，NJ)，它们将谷胱甘肽-5-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或A蛋白分别与靶重组蛋白融合。

合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amann等人，Gene(1988)69：301-315)和pET 11d(Studier等人，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology，Academic Press，San Diego，California(1990)185：60-89)。pTrc载体的靶基因表达依赖于宿主RNA聚合自杂合trp-lac融合启动子的转录。pET 11d载体的靶基因表达依赖于由共表达的病毒RNA聚合酶(T7 gnl)介导的自T7 gn1-lac融合启动子的转录。该病毒聚合酶是由宿主菌株BL21(DE3)或HMS 174(DE3)在lacUV 5启动子的转录控制下从含有T7 gn1基因的常驻λ原噬菌体提供的。

一种能使大肠杆菌内重组蛋白的表达最大化的策略是在这样的宿主细菌中表达蛋白，所述宿主细菌以蛋白水解方式切割重组蛋白的能力被削弱(Gottesman，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology，Academic Press，San Diego，California(1990)185：119-128)。另一策略是改变待插入表达载体的核酸的核酸序列，从而每个氨基酸各自的密码子是大肠杆菌偏好使用的那些密码子(Wada等人，Nucleic Acids Res.(1992)20：2111-2118)。本发明的核酸序列的所述改变可通过标准的DNA合成技术来实现。

在另一个实施方案中，SNAIP表达载体是酵母表达载体。在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的载体的实例包括pYepSecl(Baldari等人，EMBO J.(1987)6：229-234)、pMFa(Kurjan等人，Cell(1982)30：933-943)、pJRY88(Schultz等人，Gene(1987)54：113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)以及pPicZ(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)。

或者，可使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达SNAIP。可用于在经培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人，Mol.Cell.Biol.(1983)3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow等人，Virology(1989)170：31-39)。

又在另一个实施方案中，本发明的核酸利用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed，Nature(1987)329：840)和pMT2PC(Kaufman等人，EMBO J.(1987)6：187-195)。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能通常是由病毒调控元件提供的。例如，常用的启动子是从多瘤病毒、腺病毒2、细胞巨化病毒和猿病毒40衍生而来的。关于其它原核和真核细胞的适当表达系统，参见上文提及的Sambrook等人的文献的第16章和第17章。

在另一个实施方案中，重组哺乳动物表达载体能指导核酸优先在特殊类型的细胞内表达(例如，使用组织特异性调控元件表达核酸)。组织特异性调控元件是本领域众所周知的。适当的组织特异性启动子的非限制例子包括白蛋白启动子(肝特异性；Pinkert等人，Genes Dev.(1987)1：268-277)，淋巴特异性启动子(Calame等人，Adv.Immunol.(1988)43：235-275)，尤其是T细胞受体启动子(Winoto等人，EMBO J.(1989)8：729-733)和免疫球蛋白启动子(Banerji等人，Cell(1983)33：729-740；Queen等人，Cell(1983)33：741-748)，神经元特异性启动子(例如，神经细丝启动子；Byrne等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)86：5473-5477)，胰特异性启动子(Edlund等人，Science(1985)230：912-916)和乳腺特异性启动子(例如，乳清启动子；美国专利号No.4,873,316和EPO公开号No.264,166)。发育调控启动子也包括在内，例如鼠源hox启动子(Kessel等人，Science(1990)249：374-379)以及α-胎儿球蛋白启动子(Campes等人，Genes Dev.(1989)3：537-546)。

本发明进一步提供了重组表达载体，它包含以反义取向克隆进表达载体的本发明的DNA分子。也就是说，该DNA分子以这样的方式与调控序列有效地连接，从而使得与SNAIP mRNA反义的RNA分子可以表达(通过DNA分子的转录)。可以这样选择有效地连接于以反义取向克隆的核酸的调控序列，其指导反义RNA分子在各种各样细胞类型中的连续表达，例如病毒启动子和/或增强子，也可以选择指导反义RNA的组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达的调控序列。反义表达载体可采取重组质粒、噬菌粒或减毒病毒的形式，其中，在高效调控区的控制下产生反义核酸，其活性可由其中导入载体的细胞类型决定。关于使用反义基因调控基因表达的讨论，可参见Weintraub等(Reviews-Trends in Genetics，Vol.1(1)1986)。

本发明的另一个方面涉及导入了本发明的重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在文中互换使用。应该理解，这样的术语指的不仅是特定的受试细胞，还包括这样的细胞的子代或潜在的子代。事实上，由于突变或环境影响，在后代中可能发生某些修饰，所以这样的子代可能不与亲本细胞完全相同，但仍然包括在本文所用术语的范围之内。

宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，SNAIP蛋白可以在细菌细胞如大肠杆菌、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)中表达。其它适当的宿主细胞是本领域技术人员所熟知的。载体DNA可通过常规转化或转染技术导入原核或真核细胞之中。如本文所用，术语“转化”和“转染”旨在表示本领域公认的将外来核酸(如DNA)导入宿主细胞之中的各种技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染，脂转染或电穿孔。

对于哺乳动物细胞的稳定转染，取决于所使用的表达载体和转染技术，已知只有一小部分细胞可以将外来的DNA整合进基因组中。为了鉴别和选择那些整合子，通常将编码可选择标记(例如对抗生素的抗性)的基因与目的基因一起导入宿主细胞中。优选的可选择标记包括那些赋予对药物如G418、潮霉素和氨甲蝶呤的抗性的可选择标记。编码可选择标记的核酸可在编码SNAIP的同一载体上导入宿主细胞中，或可在不同的载体上导入。用导入的核酸稳定地转染的细胞可通过药物选择来鉴定(例如，整合了可选择标记基因的细胞将存活，而其它的细胞则死亡)。

本发明的宿主细胞，例如培养的原核或真核宿主细胞，可用于生产(即表达)SNAIP蛋白。相应地，本发明进一步提供了利用本发明的宿主细胞生产SNAIP蛋白的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在适当的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中已导入了编码SNAIP的重组表达载体)，从而SNAIP蛋白得以产生。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括从培养基或宿主细胞中分离SNAIP。

本发明的宿主细胞也可用于繁殖非人转基因动物。例如，在一个实施方案中，本发明的宿主细胞是其中导入了SNAIP编码序列的受精的卵母细胞或胚胎干细胞。然后，可利用这样的宿主细胞产生其基因组内导入了外源SNAIP序列的非人转基因动物，或其内源SNAIP序列被改变的同源重组动物。这样的动物可用于研究SNAIP的功能和/或活性，以及鉴定和/或评价SNAIP活性的调节剂。如本文所用，“转基因动物”优选为哺乳动物，更优选啮齿动物，例如大鼠或小鼠，其中该动物的一个或多个细胞包含转基因。转基因动物的其它实例包括非人灵长类动物、绵羊、狗、奶牛、山羊、鸡、两栖动物等。转基因是被整合进细胞基因组的外源DNA，由此发育为转基因动物，且转基因仍保留在成熟动物的基因组内，从而指导编码的基因产物在转基因动物的一种或多种细胞类型或组织中表达。如本文所用，“同源重组动物”优选为哺乳动物，更优选小鼠，其中内源SNAIP基因已通过内源基因和在动物发育之前引入该动物细胞例如胚胎细胞的外源DNA分子之间的同源重组而得到了改变。

通过将SNAIP编码核酸导入受精卵母细胞的雄性原核中，例如，通过显微注射、逆转录病毒感染以及让该卵母细胞在假孕雌性代育动物体内发育，可以产生本发明的转基因动物。SNAIP DNA序列，例如SEQ ID NO：1的序列，可作为转基因被导入非人动物的基因组内。或者，人类SNAIP基因的非人类同源物，例如小鼠SNAIP基因，可以基于与人类SNAIPcDNA的杂交进行分离，并用作为转基因。内含子序列和多聚腺苷酸化信号也可包括在转基因内以增加转基因的表达效率。可将组织特异性的调控序列与SNAIP转基因有效地连接，以将SNAIP蛋白的表达定向到特定的细胞中。通过胚胎操作和显微注射的方式产生转基因动物尤其是诸如小鼠的动物的方法，是本领域传统的方法，并在文献中有所描述，例如，美国专利No.4,736,866和4,870,009，美国专利No.4,873,191以及Hogan，Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。类似的方法可用于生产其它转基因动物。然后，可利用原始转基因动物繁育更多携带转基因的动物。而且，携带转基因编码的SNAIP的转基因动物可进一步繁育为携带其它转基因的其它转基因动物。

为了创建同源重组动物，制备了至少含有一部分SNAIP基因(例如人类或非人类的SNAIP基因的同系物，例如鼠源SNAIP基因)的载体，所述SNAIP基因中已引入缺失、添加或取代，由此改变例如在功能上破坏SNAIP基因。在优选的实施方案中，如此设计载体从而内源SNAIP基因在同源重组时功能上受到破坏(即不再编码功能蛋白；也称之为“敲除”动物)。或者，可如此设计载体从而内源SNAIP基因在同源重组时虽然发生了突变或其它方式的变化，但却仍可编码功能蛋白(例如，上游调控区可被改变，由此改变内源SNAIP蛋白的表达)。在同源重组载体内，SNAIP基因被改变部分的5′和3′末端侧接其它的SNAIP基因核酸，从而在载体所携带的外源SNAIP基因和胚胎干细胞中的内源SNAIP基因之间可以发生同源重组。所述其它侧接的SNAIP核酸足够长，以与内源基因进行成功的同源重组。通常，载体中包括几千个碱基的侧翼DNA(位于5′端和3′端)(例如参见，Thomas等人，Cell(1987)51：503关于同源重组载体的描述)。将载体导入胚胎干细胞系中(例如，通过电穿孔法)，并选择细胞内所导入的SNAIP基因与内源SNAIP基因发生了同源重组的细胞(例如参见，Li等人，Cell(1992)69：915)。然后，将所选的细胞注射到动物(例如小鼠)的胚泡中，以形成聚集嵌合体(例如参见，Bradley in Teratocarcinomas andEmbryonic Stem Cells：A Practical Approach，Robertson编，IRL，Oxford，(1987)第113-152页)。其后，将嵌合胚胎植入适宜的假孕雌性代育动物中，并使胚胎发育长大。生殖细胞内含有同源重组DNA的子代可用于繁育动物，通过转基因的生殖系传递，所繁育动物的所有细胞都含有同源重组DNA。构建同源重组载体和同源重组动物的方法在文献中有进一步的描述：Bradley，Current Opinion in Bio/Technology(1991)2：823-829和PCT公开号WO 90/11354，WO 91/01140，WO 92/0968及WO 93/04169。

在另一个实施方案中，可生产出含有可调控转基因表达的选定系统的非人转基因动物。这种系统的一个实例是噬菌体P1的cre/loxP重组酶系统。关于cre/loxP重组酶系统的描述，可例如参见Lakso等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89：6232-6236。重组酶系统的另一个实例是酿酒酵母的FLP重组酶系统(O′Gorrnan等人，Science(1991)251：1351-1355)。如果利用cre/loxP重组酶系统调控转基因的表达，则需要含有既可编码Cre重组酶又可编码所选蛋白的转基因的动物。这种动物可通过构建“双”转基因动物而获得，例如，使两个转基因动物交配，其中一个含有编码所选蛋白的转基因，而另一个则含有编码重组酶的转基因。

本文所述的非人转基因动物的克隆也可按照以下文献中所述的方法产生：Wilmut等人，Nature(1997)385：810-813和PCT公开号WO 97/07668以及WO 97/07669。简言之，源自转基因动物的细胞如体细胞，可被分离和诱导退出生长周期而进入G₀期。然后，该静止细胞可与来自分离所述静止细胞的同种动物的去核卵母细胞融合，例如，通过使用电子脉冲。然后，培养重新构建的卵母细胞，使其发育为桑椹胚或胚球，然后再转移到假孕雌性代育动物体内。该雌性代育动物所生的后代将是分出所述细胞如体细胞的动物的克隆。

IV.药物组合物

本发明的SNAIP蛋白、抗-SNAIP抗体和SNAIP结合分子(在本文中也称之为“活性化合物”)可掺入到适于给药的药物组合物中。这类组合物通常含有蛋白或抗体以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给药相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这样的介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。除了那些常规的介质或试剂与活性化合物不相容的情况，都将考虑其在组合物中的用途。辅助的活性化合物也可以掺入到组合物中。

本发明的药物组合物是适应预定的给药路径而配制的。给药路径的实例包括肠胃外，例如静脉、皮内、皮下、口腔(例如吸入)、透皮(局部)，经粘膜和直肠给药。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬液可包括以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、非挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如EDTA；缓冲剂，例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。酸度(pH)可用酸或碱来调节，例如HCl或NaOH。肠胃外制剂可密封于安瓿瓶、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。

适合于注射用的药物组合物包括用于临时制备无菌注射液或分散剂的无菌水溶液(若为水溶性)或分散剂以及无菌散剂。对于静脉内给药方式，适合的载体包括生理盐水，抑菌水，Cremophor EL^(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物都必须无菌而且应具有一定的流动性以便于注射。它在生产和储存条件下必须是稳定的，且必须抗微生物如细菌和真菌污染保藏。例如，载体可以是含有水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其适当混合物的溶剂或分散介质。例如，可使用包衣如卵磷脂以维持适当的流动性；若在分散剂的情况下，则可通过维持所需的粒径来维持流动性；以及使用表面活化剂来维持流动性。为了预防微生物的作用，可使用各种各样的抗菌剂和抗真菌剂来实现，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选在组合物中纳入等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇，山梨糖醇，以及氯化钠。可注射型组合物的延迟吸收，可通过在组合物中纳入延迟吸收的试剂而实现，例如单硬酯酸铝和明胶。

无菌可注射溶液的制备是将溶于适当溶剂之中的活性化合物(例如SNAIP蛋白或抗-SNAIP抗体)以所需的量根据需要与上文所列举的一种或多种成份组合掺在一起，随后进行过滤灭菌。通常，分散剂制备是将活性化合物掺入到无菌载体中，后者含有基础的分散介质以及所需的上文所列举的其它成份。在用于制备无菌注射液的无菌散剂的情况下，优选的制备方法是通过真空干燥和冷冻干燥先前无菌过滤的溶液，以产生活性成分加上任何其它所需成份的散剂。

口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用的载体。它们可被密封在明胶胶囊内或被压成片剂。为了口服治疗给药的目的，活性化合物可与赋形剂掺在一起并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物也可用液态载体制备而作为漱口液使用，其中，液态载体中的化合物经口腔施用，漱口后吐出，或者咽下。

药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料可纳入作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可包含以下任何成份，或性质类似的化合物：粘合剂，例如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩散剂，例如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotes；助滑剂，例如胶态二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或调味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调料。为了以吸入方式给药，化合物可从含有适当推进剂(例如二氧化碳之类的气体)的加压容器或分配器或雾化器以气雾剂喷雾的形式给药。

系统性给药也可通过经粘膜或透皮的方式。为经粘膜或透皮给药，在制剂中使用适于渗透障碍的渗透剂。这样的渗透剂通常是本领域公知的，例如，用于经粘膜给药，渗透剂包括清洁剂、胆汁盐，以及梭链孢酸衍生物。经粘膜给药可通过使用鼻腔喷雾或栓剂来完成。对于透皮给药，如本领域所公知的，可将活性化合物配制为软膏、药膏、凝胶或乳剂。

化合物也可制成栓剂的形式(例如使用常规的栓剂基料，如可可脂和其它甘油脂)，或制成灌肠剂的形式用于直肠递送。

在一个实施方案中，活性化合物与可防止化合物过快地从体内排出的载体一起制成药剂，例如控释剂型，包括植入物和微胶囊给药系统。可以使用生物降解、生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯共聚物、聚酸酐、聚羟基乙酸、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸。制备这类制剂的方法对于本领域技术人员将是显而易见的。各种材料也可以从Alza Corporation和NovaPharmaceuticals，Inc.商购获得。脂质体悬液(包括靶向被感染细胞的脂质体，其具有针对病毒抗原的单克隆抗体)也可用作为药学上可接受的载体。这些载体可按照本领域技术人员公知的方法制备，例如，按照美国专利No.4,522,811所述的方法制备。

为了给药方便和剂量一致，以单位剂量的形式配制口服或注射用组合物是特别有利的。本文所用的单位剂量形式是指适应于单位剂量的物理上分离的单位，每个单位含有经计算可与所需的药物载体联合产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物。取决于疾病的类型和严重性，向患者给药约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1至20mg/kg)的抗体是候选的初始剂量，无论是一次或多次地分别给药，还是连续地输注。典型的日剂量范围可从约1μg/kg至100mg/kg或以上，取决于以上提到的因素。对于数天或更长时间内的重复性给药，根据具体情况，应维持治疗直至出现所期望的疾病症状的抑制。但是，其它剂量方案可能也有用。治疗的进展情况可以常规的技术和分析很容易地监测。WO 94/04188公开了示范性的给药方案。本发明的单位剂量形式的规格受制于且直接依赖于活性化合物的独特性质和欲实现的特定治疗效果，以及本领域配制这样的活性化合物以治疗个体的固有的局限性。本发明的核酸分子可被插入载体中并用作为基因治疗载体。基因治疗载体可通过各种方式递送给受试者，例如静脉内注射、局部给药(美国专利No.5,328,470)或通过定向注射等(例如参见，Chen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)91：3054-3057)。基因治疗载体的药物制剂可包括存在于可接受的稀释剂内的基因治疗载体，或可以包括已嵌入基因递送载体的缓释性基质。或者，在可从重组细胞例如逆转录病毒载体产生全基因递送载体的情况下，药物制剂可包含一种或多种产生基因递送系统的细胞。

药物组合物可密封在容器、药包或分配器内，连同给药说明。

V.本发明的用途和方法

本文所述的核酸分子、蛋白、SNAIP结合分子和抗体可用于以下一种或多种方法：a)筛选试验；b)检测试验(例如染色体图谱分析、组织分型、法医生物学)；c)预测医学(例如诊断试验、预后试验、临床监测试验和药物基因组学)；以及d)治疗方法(例如治疗和预防)。SNAIP蛋白可与其它细胞蛋白发生相互作用，并可用于(i)细胞增生的调控；(ii)细胞分化的调控；以及(iii)细胞存活的调控。本发明的分离的核酸分子可用于表达SNAIP蛋白(例如在基因治疗应用中通过宿主细胞内的重组表达载体)、检测SNAIP mRNA(例如在生物样品中)或SNAIP基因中的基因损伤，以及调节SNAIP活性(例如通过反义链和RNAi技术)。此外，SNAIP蛋白可用于筛选那些调控或模拟SNAIP的活性或表达的药物或化合物，以及治疗其特征为SNAIP蛋白的产量或功能不足或过量的疾病，或治疗其特征为与野生型SNAIP蛋白相比所产生的SNAIP蛋白活性下降或异常的疾病。此外，本发明的抗-SNAIP抗体可用于检测和分离SNAIP蛋白以及调节SNAIP活性。本发明还涉及通过所述筛选试验鉴定的新型试剂以及如本文所述的这些试剂的治疗用途。

A.筛选试验

本发明提供了一种鉴定调节剂的方法(文中也称之为“筛选试验”)，所述调节剂即与SNAIP蛋白结合或对例如SNAIP的表达或SNAIP的活性具有刺激或抑制作用的候选或测试化合物或试剂(例如肽、肽模拟物、小分子或其它药物)，或与Wnt或FZ结合的、阻止Wnt与FZ的结合以及阻止凋亡的SNAIP模拟物。

在一个实施方案中，本发明提供了筛选候选或测试化合物的试验方法，所述候选或测试化合物与SNAIP或多肽或其生物学活性部分结合、调节或模拟其活性。本发明的测试化合物可通过本领域已知的众多组合文库方法中的任何方法制备，包括：生物文库；可空间寻址的平行的固相或溶液相文库；需要去重叠的合成文库方法；天然产品文库；“一珠一化合物”(one-bead one compound)文库方法；以及利用亲合层析选择的合成文库方法。其中生物文库方法局限于肽文库，而其它四种方法则可用于肽、非肽寡聚物或小分子化合物文库(Lam，Anticancer Drug Des.(1997)12：145)。

分子文库合成方法的实例可在本领域中查到，例如：DeWitt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：6909；Erb等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)91：11422；Zuckermann等人，J.Med.Chem.(1994)37：2678；Cho等人，Science(1993)261：1303；Carrell等人，Angew Chem.Int.Ed.Engl.(1994)33：2059；Carell等人，Angew Chem.Int.Ed.Engl.(1994)33：2061；以及Gallop等人，J.Med.Chem.(1994)37：1233。

化合物文库可存在于溶液中(例如Houghten，Bio/Techniques(1992)13：412-421)，或存在于珠(Lam，Nature(1991)354：82-84)、芯片(Fodor，Nature(1993)364：555-556)、细菌(美国专利No.5,223,409)、孢子(美国专利No.5,571,698；5,403,484以及5,223,409)、质粒(Cull等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89：1865-1869)或噬菌体(Scott等人，Science(1990)249：386-390；Devlin，Science(1990)249：404-406；Cwirla等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87：6378-6382；以及Felici，J.Mol.Biol.(1991)222：301-310)上。

由于SNAIP是配体，故可用已知的方法来研究SNAIP以确定它与例如FZ或Wnt接合的特定部分。该特定区域可用已知的生物合成方法来合成，例如结合使用碳水化合物合成和酶促反应。SNAIP的该部分等同于“表位”。可以使用其它单体或非碳水化合物部分来变修饰SNAIP表位，以产生经修饰的具有增强的特性(例如血清半衰期，与FZ/Wnt的结合常熟等)的携带表位的结构。任何一种表位变体的适用性可通过实施本文所教导的结合试验和筛选试验来确定。

在一个实施方案中，试验是以细胞为基础的试验，其中，将在其细胞表面表达膜结合形式FZ或其生物学活性部分的细胞与测试化合物接触，并测定测试化合物在SNAIP蛋白存在时竞争性结合FZ的能力。例如，细胞可以是酵母细胞或哺乳动物来源的细胞。对测试化合物与FZ结合的能力的测定可通过以下方式来实现：例如使测试化合物与放射性同位素或酶标记偶联；从而测试化合物与FZ或其生物学活性部分的结合可通过检测复合物中标记化合物来测定。例如，测试化合物可以直接地或间接地用¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³H标记，且放射性同位素可通过直接计数放射性发射或通过闪烁计数而检测。或者，测试化合物可用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶等进行酶促标记，且酶标记可通过确定适当底物向产品的转换而检测。在优选的实施方案中，所述试验包括在其细胞表面表达膜结合形式FZ或其生物学活性部分的细胞同与FZ结合形成试验混合物的已知化合物接触，再使试验混合物与测试化合物接触，并确定测试化合物在SNAIP蛋白存在时与FZ相互作用的能力，这包括确定测试化合物与SNAIP相比优先与FZ或其生物学活性部分结合的能力。

在另一个实施方案中，本发明的试验是无细胞试验，包括使SNAIP蛋白或其生物学活性部分与测试化合物接触，并确定测试化合物与SNAIP蛋白或其生物学活性部分结合的能力。测试化合物与SNAIP蛋白的结合可如上所述直接地或间接地确定。在优选的实施方案中，所述试验包括使SNAIP蛋白或其生物学活性部分同与SNAIP结合形成试验混合物的已知化合物接触，再使该试验混合物与测试化合物接触，并确定测试化合物与SNAIP蛋白相互作用的能力，其中，确定测试化合物与SNAIP蛋白相互作用的能力，包括确定测试化合物与已知化合物相比优先与SNAIP或其生物学活性部分结合的能力。

在另一个实施方案中，所述试验是无细胞试验，包括使SNAIP蛋白或其生物学活性部分与测试化合物接触，并确定测试化合物调节(例如刺激或抑制)SNAIP蛋白或其生物学活性部分的活性的能力。例如，确定测试化合物调节SNAIP活性的能力可这样实现，即通过上文所述的测定直接结合的方法来测定SNAIP蛋白与SNAIP靶分子结合能力。在可选的实施方案中，确定测试化合物调节SNAIP活性的能力可通过确定SNAIP蛋白进一步调节SNAIP靶分子的能力来实现。例如，靶分子对适当底物的催化/酶促活性可按如前所述的方法来确定。

在另一个实施方案中，所述无细胞试验包括使SNAIP蛋白或其生物学活性部分与结合SNAIP而形成试验混合物的已知化合物接触，使试验混合物与测试化合物接触，并测定测试化合物与SNAIP蛋白相互作用的能力，其中，确定该测试化合物与SNAIP蛋白相互作用的能力包括确定SNAIP蛋白与SNAIP靶分子优先结合或调节其活性的能力。

在本发明的所述试验方法的不止一个实施方案中，可能期望固定SNAIP或Wnt以易化其中任一种或两种蛋白的复合形式与非复合形式之间的分离，并便于实现试验的自动化。在候选化合物存在或不存在的情况下测试化合物与SNAIP的结合，或SNAIP与Wnt之间的相互作用，可在任何适合于容纳反应物的容器内实现。这类容器的实例包括微滴定板、试管和微离心管。在一个实施方案中，可以提供增加了结构域的融合蛋白，它使得所述任一种或两种蛋白可与基质结合。例如，可将谷胱甘肽-S-转移酶/SNAIP融合蛋白、或谷胱甘肽-S-转移酶/Wnt融合蛋白吸附在谷胱甘肽琼脂糖珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生的微滴定板上，然后再与该测试化合物混合，或与测试化合物以及未被吸附的Wnt或SNAIP蛋白中的任一种蛋白混合，将混合物在有利于复合物形成的条件下(例如在生理条件的盐和pH条件下)孵育。孵育后，洗涤珠或微滴定板孔以除去任何未结合的组分，并且，例如，如上所述直接或间接地测量复合物的形成。或者，可将复合物从基质上解离下来，并使用标准技术测定SNAIP结合或活性水平。

其它将蛋白质固定在基质上的技术也可用于本发明的筛选试验中。例如，可利用生物素和链霉抗生物素蛋白的缀合固定SNAIP或Wnt。生物素化的SNAIP或靶分子可以用本领域众所周知的技术(例如生物素化试剂，Pierce Chemicals，Rockford，IL)，从生物素-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)来制备，并固定在链霉抗生物素蛋白包被的96孔培养板的孔中(PierceChemicals)。或者，可与SNAIP或Wnt反应但不干扰SNAIP蛋白与Wnt结合的抗体可在该培养板的孔内衍生，并通过抗体缀合将未结合的Wnt或SNAIP捕获在孔内。检测这类复合物的方法，除了上文所述的用于GST固定的复合物的方法以外，还包括使用与SNAIP或靶分子反应的抗体进行复合物的免疫检测，以及依赖于检测SNAIP或靶分子相关酶活的酶联试验。

在另一个实施方案中，SNAIP表达的调节剂以这样的方法鉴定：在该方法中使细胞与候选化合物接触，并测定SNAIP mRNA或蛋白在细胞中的表达。比较在候选化合物存在和不存在下SNAIP mRNA或蛋白的表达水平。然后，在所述比较的基础上，候选化合物可被鉴定为SNAIP表达的调节剂。例如，如果候选化合物存在时SNAIP mRNA或蛋白的表达水平高于(统计学意义地更高)候选化合物不存在时的表达水平，则候选化合物即被鉴定为SNAIP mRNA或蛋白表达的刺激物。SNAIP mRNA或蛋白在细胞内的表达水平可通过本文中所述的检测SNAIP mRNA或蛋白的方法而确定。

又在本发明的另一个方面，SNAIP蛋白可在双杂合试验或三杂合试验中用作为“诱饵蛋白”(例如参见美国专利No.5,283,317；Zervos等人，Cell(1993)72：223-232；Madura等人，J.Biol.Chem.(1993)268：12046-12054；Bartel等人，Bio/Techniques(1993)14：920-924；Iwabuchi等人，Oncogene(1993)8：1693-1696；以及PCT公开号WO 94/10300)，以鉴定与SNAIP结合或与其相互作用(“SNAIP结合蛋白”或“SNAIP-bp”)以及调节SNAIP活性的其它蛋白。这类SNAIP结合蛋白也很可能参与SNAIP蛋白信号的传播，例如作为SNAIP路径的上游或下游元件。

又在另一个实施方案中，例如，使用了SNAIP抗体或结合SNAIP的分子如Wnt来筛选文库以鉴定SNAIP样分子。然后，例如，使用本文所教导的方法测试被结合分子的SNAIP活性。这样的筛选方法可揭示作为SNAIP激动剂、反激动剂或拮抗剂的SNAIP样分子。

本发明进一步涉及通过所述筛选试验而鉴定的新型试剂以及如本文所述的其在治疗中的用途。

B.检测试验

此处所鉴定的cDNA序列的部分或片段(以及对应的完整基因序列)可以许多方式作为多核苷酸试剂使用。例如，这些序列可用于：(i)绘制染色体上相应基因的图谱，从而定位与遗传疾病相关的基因区域；(ii)由微小的生物样品来鉴定个体(组织分型)；以及(iii)辅助生物样品的法医鉴定。

文中所述的各种抗体可用于检测SNAIP或FZ。

C.预测医学

本发明还涉及预测医学领域，在该领域中，将诊断试验、预后试验、药物基因组学和临床监测试验等用于预后(预测)的目的，由此预防性地治疗个体。相应地，本发明的一个方面涉及确定SNAIP蛋白和/或核酸的表达以及SNAIP活性的诊断试验，就生物样品(例如血液、尿液、粪便、血清、细胞、组织)而言，可确定个体是否患有与SNAIP的表达或活性异常或下降相关的疾病或紊乱，或正处于发病的风险之中。例如，在受伤之后在体内存活的神经元或光感受器区域可以见到SNAIP。

本发明还提供了预后(或预测)试验方法，以确定个体是否正处于与SNAIP蛋白、核酸表达或活性相关的发病风险之中。例如，可从生物样品中测定出SNAIP基因中的突变。这类试验可用于预后或预测之目的，从而可在以SNAIP蛋白、核酸表达或活性为特征的或与其相关的紊乱发作之前，预防性地治疗患者。

本发明的另一方面提供了确定个体SNAIP蛋白、核酸表达或SNAIP活性的方法，从而可为该个体选择适宜的治疗剂或预防剂(文中称之为“药物基因组学”)。药物基因组学可根据个体的基因型(例如研究个体的基因型以确定该个体对特定试剂反应的能力)，为治疗性或预防性治疗该个体而选择试剂(例如药物)。

本发明的又一个方面涉及在临床试验中监视试剂(例如药物或其它化合物)对SNAIP表达或活性的影响。

D.治疗方法

本发明为治疗正处于发病风险之中(或容易罹患)或者已经患有与神经系统尤其是中枢神经系统中SNAIP的表达或活性异常或下降相关的紊乱的个体，提供了预防和治疗方法。这样的紊乱包括但不限于阿尔茨海默氏病和精神分裂症。

I.预防疾病的方法

在一个方面，通过向患者给药调节SNAIP表达或至少一种SNAIP活性的试剂，本发明为个体提供了预防与SNAIP表达或活性异常或下降相关的疾病或病情的方法。例如，通过如文中所述的任何诊断试验或预后试验或其组合，可以鉴定出由于SNAIP表达或活性异常或下降而处于相关疾病发病风险之中的个体。可以在以SNAIP异常为特征的症状出现之前，就给药预防剂，从而可以预防疾病或紊乱，或延迟其进程。

II.治疗方法

本发明的另一个方面涉及为了治疗目的而调节SNAIP表达或活性的方法。本发明的调节方法涉及使细胞与这样的试剂接触，所述试剂调节与细胞相关的SNAIP蛋白的一种或多种活性。试剂可以是SNAIP的模拟物。模拟物可以是多核苷酸、多肽、多糖、有机分子、无机分子或其组合，只要模拟物具有本文所定义的SNAIP活性即可。这种SNAIP活性可以是任何已知的SNAIP活性，例如与特定的Wnt分子结合，在细胞内诱导特定应答，例如抑制凋亡等等。

因此，调节SNAIP蛋白活性的试剂可以是如本文所述的试剂例如核酸或蛋白、天然存在的SNAIP蛋白的同源配体、肽、SNAIP肽模拟物或其它小分子。在一个实施方案中，试剂可刺激SNAIP蛋白的一种或多种生物学活性。这类刺激剂的实例包括活性SNAIP蛋白和导入细胞中的编码SNAIP的核酸分子。所述调节方法可以在体外实施(例如通过用试剂培养细胞)，或者，在体内实施(例如通过向受试者给药试剂)。这样，本发明提供了治疗患有以SNAIP蛋白或核酸分子的表达或活性异常或下降为特征的疾病或紊乱的个体的方法。在一个实施方案中，所述方法包括给药试剂(例如通过本文所述的筛选试验而鉴定的试剂)或试剂联合，所述试剂可调节(例如上调或下调)SNAIP的表达或活性。在另一个实施方案中，所述方法包括给药SNAIP蛋白或核酸分子作为治疗方法，以补偿下降或异常的SNAIP表达或活性。

在SNAIP被异常下调和/或SNAIP活性下降的情况下，期望刺激SNAIP的活性。反之，降低对SNAIP活性的抑制。

本发明将通过以下实施例进一步举例说明，但这些例子不应被解释为是限制性的。特此将本申请通篇所引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容并入本文作为参考。

实施例

RNA提取：将所培养的细胞或组织匀浆分别按每10cm培养皿或50mg组织匀浆在1.5ml Trizol(Gibco，Cat.No.15596)中裂解。用移液管吸放裂解产物多次，以使裂解物(随后将细胞裂解产物转移至试管中)均质化。在均质化之后，裂解物于30℃孵育5分钟以使核蛋白复合物完全解离。孵育后，按每1ml Trizol试剂0.2ml氯仿(Sigma，Cat.No.C53 12)的比例将氯仿加入裂解物，且剧烈震荡试管15秒钟。然后裂解物于30℃孵育3分钟。孵育后，裂解物于4℃以12,000xg离心15分钟。离心后，除去上清并用70％乙醇淋洗余下的RNA沉淀。然后将淋洗后的样品于4℃以7500xg离心10分钟，并弃去所得的上清。将余下的RNA沉淀干燥，然后重悬于不含RNAase的水中(Life Technologies，Cat.No.10977-015)。

DNA酶处理：按照制造商所提供的方案用DNAse I(Gibco)处理总RNA。

差异展示：使用Clontech的Advantage RT-for-PCR试剂盒从经DNAse处理的总RNA合成第一链cDNA。每次反应使用2μg总RNA。将cDNA产物按1∶10和1∶100的比例稀释，取每种稀释液各1μl用随机引物进行PCR反应。使用了来自Hieroglyph与Fluoro DD引物试剂盒(Beckman公司)的随机引物。所述引物含有oligodT或与M13或T7部分融合的随机序列。用荧光报告分子标记一组引物。PCR反应是按照制造商推荐的方案使用Advantage cDNA PCR试剂盒(Clontech)进行的。荧光PCR产物用GenomyxLR DNA测序仪(Beckman)经HR-1000丙烯酰胺凝胶(Beckman)电泳分离。来自不同实验变体的样品至少做一式两份试验，并与对照样品进行比较。凝胶在1600V电泳6小时，在玻璃板上干燥，洗涤数次以除去尿素结晶并用GenomyxSC扫描仪进行扫描。用Adobe Photoshop对图像进行分析，并确定差异表达条带的坐标。使用这些坐标，在干燥的凝胶上定位差异表达条带。将条带切下，浸泡于100μl水中并离心沉降。取5μl上清，用Advantage聚合酶混合物和T7/M13引物(Clontech公司)进行PCR反应，对条带进行再扩增。再扩增的条带用T7/M13引物直接测序，或者先克隆进Invitrogen的pCR2.1-TOPO载体中然后再测序。

反转录：使用Clontech的“RT for PCR”试剂盒(Cat.No.K1402-1)进行反应。按所述步骤分离出1μg RNA并用DNA酶处理，然后与20pmololigodT引物混合，总体积为13.5μl。混合物于70℃孵育2min，冷却至4℃使引物退火。退火后，将含有反应缓冲液、dNTP混合物、RNA酶抑试剂和MMLV反转录酶(均取自RT for PCR试剂盒)的反应混合物6.5μl加入Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9700中，并按制造商提供的方案进行反应。所得cDNA产物储存于20℃备用。

实时PCR：TaqMan^或实时RT-PCR是检测样品中信使RNA的强大工具。该技术利用AmpliTaq Gold^DNA聚合酶的5′核酸酶活性在PCR期间切割TaqMan^探针。TaqMan^探针在探针5′-端含有荧光报告染料(本实验中为6-FAM(6-羧基荧光素))，而在3′-端含有荧光淬灭染料(本实验中为TMRA(6-羧基-N，N，N′，N′-四甲基罗丹明))。TaqMan^探针是为了在正向引物和反向引物位点之间与目的靶cDNA杂交而专门设计的。当探针完整的时候，3′-末端淬灭染料抑制了5′-末端报告染料的荧光。在PCR过程中，AmpliTaq Gold^DNA聚合酶的5′→3′活性使探针在5′-末端报告染料和3′-末端淬灭染料之间切割，从而导致报告染料易位。一旦易位，报告染料的荧光不再被淬灭染料所抑制。因此，从靶cDNA模板得到的PCR产物的累积可以通过监测报告染料荧光的增加而检测。

使用了Perkin Elmer Applied Biosystems的ABI Prism序列检测系统(Model No.ABI7700)监测PCR过程中报告荧光的增加。报告信号用惰性参照(passive reference)发射的荧光标准化。RT-PCR反应按上文所述进行，产物用水按1∶100稀释后在TaqMan^分析中作为模板。

引物用Primer Express软件(Perkin Elmer)设计，由Sigma Genosys合成。用每对引物进行的PCR反应均经4％琼脂糖凝胶电泳证实单个条带的存在。对于大多数引物对来说，反应最佳的最终引物浓度为0.2μM。

TaqMan^分析在96孔MieroAmp光学板(Perkin Elmer，Catalog No.N801-0560)中进行。将包括25μl TaqMan^CybrGreen PCR混合物(PerkinElmer公司，Catalog No.4309155)、2μl正向引物、2μl反向引物、5μl cDNA和17μl水的反应混合物置于每个孔中。然后，用MicroAmp optical 8-strip封闭盖(Perkin Elmer，Catalog No.N801-0935)密封板。对每一个实验样品均用随机标准基因的引物(β肌动蛋白，Perkin Elmer Cat.No.N801-0935)单独进行TaqMan^反应，以使结果标准化。实时PCR反应在ABI PrizmSystem 7700序列检测仪(Perkin Elmer)上进行。

RNA标记和Affymetrix芯片杂交：RNA标记和芯片杂交系按照Affymetrix标准操作进行。

微阵列数据分析：微阵列数据分析系用Gecko(Aventis)和GeneSpring(Silicon Genetics)芯片分析软件进行。

用人类SNAIP进行神经保护试验：将人类成神经细胞瘤细胞系SK-N-SH和SY5Y植入96孔板，让其贴壁过夜。试剂一式三份进行测试。未经加工的293 T细胞上清用以下物质瞬时转染：1)真核TopoTA质粒中的全长SNAIP cDNA，不含肝素；2)同(1)，但介质中有肝素；3)空白载体对照；4)无载体对照，含或不含肝素；以及5)未经293条件化的培养基，含或不含肝素，24小时后收集，以1∶5稀释度使用。神经保护阳性对照物包括5μM黄酮吡醇(flavopiridol，一种细胞周期抑制剂)。10mM SIN-1和500μM C2神经酰胺为神经毒剂，于加入神经保护剂后立即加入。板孵育培养过夜。然后收集上清，并用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测定细胞的死亡。SNAIP可以对抗SIN-1，但不能对抗C2神经酰胺的神经毒性。

克隆SNAIP：使用由Sigma Genosys合成的基因特异引物和AdvantagecDNA PCR试剂盒(Clontech)，从收集的大脑皮层和室区cDNAs扩增基因序列。按照本领域已知的方法将cDNA克隆入真核表达载体。cDNA与V5表位读码一致地克隆，从而能够用可商购获得的V5抗体(Invitrogen)检测蛋白的表达。也对克隆进行测序以确认基因的身份和不存在突变。

表达SNAIP的细胞的产生：为了提供足够量的SNAIP以进行进一步的实验，将编码SNAIP的cDNA克隆入表达载体并转染至CHO细胞内。

为了产生过量表达SNAIP的CHO细胞，将CHO细胞以每孔3×10⁵个细胞的密度涂布于6孔35mm组织培养板(Costar公司Catalog No.3516)，每孔2ml存在10％胎牛血清(Gibco/BRL Catalog No.1600-044)的F12 HAM培养基(Gibco/BRL，Catalog No.11765-054)。

然后将细胞置入CO₂培养箱内于37℃培养，直至细胞达到50-80％汇合。用上文所述的操作插入所克隆的SNAIP的cDNA核酸序列。取13μgDNA，用含78μl PLUS试剂的无血清Optimem培养基稀释至1.2ml。另取52μl Lipofectamine Plus试剂(Life Technologies，Catalog No.109064-013)，用无血清Optimem培养基稀释至1.25ml。然后，将DNA溶液和Lipofectamine溶液于室温孵育15分钟。将两种溶液混合后再孵育15分钟，以形成DNA-脂质复合物。

用2ml无血清Optimem冲洗细胞一次。分别以0.8ml Optimem替换每份转染样品(一块6孔板上共6份转染样品)中的细胞培养基。每孔加入200μl体积的DNA-脂质复合物(以下称为“转染混合物”)。不加入任何抗菌试剂。然后将细胞与脂质-DNA复合物置入CO₂培养箱于37℃培养6小时，以进行转染。

孵育期结束后，加入1ml含20％胎牛血清的Optimem，无需首先去除转染混合物。转染后18小时，吸出覆盖在细胞上层的培养基。然后用PBS pH2-4(Gibco/BRL，Catalog No.10010-023)洗涤细胞，将PBS替换为含10％血清的F12 HAM培养基(“选择培养基”)。转染后72小时，用胰蛋白酶消化细胞，然后转入T150烧瓶。24小时后，培养基替换为含10％FBS、抗生素和1 mg/ml G418的F12 HAM培养基。选择持续3天，之后培养基替换为含200μg/ml G418的培养基。

Western印迹分析：将转染细胞系的细胞培养上清或裂解的转染细胞与Invitrogen蛋白上样缓冲液混合，并上样到来自Invitrogen的10％Tris-甘氨酸凝胶上。电泳于100V运行2.5小时。分离后，利用Invitrogen的转膜装置于80V运转1小时，以将蛋白转移至来自Invitrogen的PVDF膜上。如制造商(Invitrogen)所述将膜封闭后再用抗-V5抗体杂交。用Amersham的化学发光底物ECL(Cat.No.1059250)和Hyperfilm ECL(Cat.No.HP79NA)，如Amersham所述检测蛋白条带。

条带显现。

虽然本发明是通过参照以上实施例详细描述的，但应该理解，可以进行各种各样的修饰而不会背离本发明的精神。因此，本发明只受如下权利要求的限制。

特此将本申请中所引用的所有专利和出版物均以其整体并入作为参考。

Claims (17)

1.一种在神经元细胞内调节过亚硝酸盐所诱导的凋亡的方法，包括使所述细胞与分泌性神经凋亡抑制蛋白(SNAIP)接触。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括使所述细胞与肝素接触。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述凋亡包括SIN-1(3-吗啉斯得酮亚胺)过氧亚硝酸盐相关路径的诱导。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述路径包括一种或多种p38MAPK以及生长抑制和DNA损伤诱导基因(GADDs)的活化。

5.如权利要求3所述的方法，其中所述路径通过鉴定蛋白硝化的特异性标志物检测。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述特异性标志物为3-硝基酪氨酸(3-NT)。

7.如权利要求4所述的方法，其中所述GADDs为GADD34、GADD45或GADD153。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述凋亡包括线粒体功能紊乱。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述线粒体功能紊乱包括线粒体复合物I亚单位的硝化。

10.一种保护神经元免遭与过亚硝酸盐相关的自由基介导的细胞死亡的方法，包括使所述细胞与分泌性神经凋亡抑制蛋白接触。

11.一种确定与过亚硝酸盐毒性路径相关的神经保护性基因靶标的方法，包括：

i)使各个神经元细胞样品分别与分泌性神经细胞凋亡抑制蛋白(SNAIP)接触或不接触；

ii)使步骤(i)中的细胞与过亚硝酸盐诱导剂接触；

iii)测定步骤(ii)中细胞内基因或蛋白质表达的变化；和

iv)鉴定在SNAIP和诱导剂存在或不存在下受调节的基因或蛋白质，

其中，如此鉴定的基因或蛋白质与过亚硝酸盐所诱导的凋亡的抑制相关联。

12.如权利要求11所述的方法，其中步骤(i)还包括使细胞与肝素接触或不接触。

13.如权利要求11所述的方法，其中所述过亚硝酸盐诱导剂为SIN-1。

14.如权利要求11所述的方法，其中所述鉴定的基因或蛋白质与凋亡相关联。

15.一种治疗与自由基介导的细胞死亡相关的神经元疾病的方法，包括向给需要此治疗的患者给药治疗有效量的分泌性神经凋亡抑制蛋白(SNAIP)。

16.如权利要求15所述的方法，其中与所述自由基介导的细胞死亡相关的所述疾病选自帕金森氏病、多发性硬化症、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风和阿尔茨海默氏病。

17.如权利要求15所述的方法，其中所述给药还包括肝素给药。