TW200400046A

TW200400046A - Viral antigens

Info

Publication number: TW200400046A
Application number: TW092105904A
Authority: TW
Inventors: Martine Anne Cecile Wettendorff
Original assignee: Glaxosmithkline Biolog Sa
Priority date: 2002-03-18
Filing date: 2003-03-18
Publication date: 2004-01-01
Also published as: AR039005A1; US20070224218A1; US7416846B2; US7217419B2; CN1642571A; OA12787A; PL372937A1; NZ535085A; IL163814A; JP2005524674A; US20080279890A1; ZA200407029B; NO20044326D0; MY139031A; ECSP045300A; BR0308444A; AP2004003136A0; EP2044953A1; EA200401064A1; IS7426A

Description

200400046 玖、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係有關預防HPV之疫苗。特別是，本發明係有關包括類似病毒顆粒（VLPs)，尤其是包括來自人類乳頭狀瘤病毒 (HPV)之蛋白質的類似病毒顆粒。【先前技術】乳頭狀瘤病毒係具高度物種專一性之小的DNA腫瘤病毒。迄今，已經記述超過100種各別的人類乳頭狀瘤病毒（HPV)基因型。一般，HPVs若非對皮膚（例如HPV-1與-2)即是對黏膜表面（例如HPV-6與-11)具專一性；而且，通常造成持續數月或數年之良性瘤（虎）。這種良性瘤對有關之個體可能很痛苦，但是，除了少數例外，似乎不會威脅生命。有些HPVs亦與癌症有關。在HPV與人類癌症間最強之正相關係存在於HPV-16與HPV-18以及子宮頸癌之間。子宮頸癌係開發中國家最常見的惡性瘤，每年全球約有500,000個新病例發生。目前利用疫苗主動打擊初級HPV-16感染已屬技術可行，甚至可針對已確立之含HPV-16的癌症。對於HPV-16之預防與治療的免疫注射展望之回顧請參照Cason J :臨床免疫治療（Clin. Immunother.) 1994; 1(4) 293-306與 Hagenesee Μ E，醫學上之感染（Infections in Medicine) 1997 14(7) 555-556, 559-564 ° 儘管，確會產生微小差異；但是，所有經記述之HPVs基因體皆有至少8個早期基因，分別為E1至E8，以及2個晚期基因，L1與L2。此外，還有一個看起來是控制大部分HPV基因 84345 200400046 體轉錄情事之容留調控序列的上游調控區域。根據 HPV L1 之疫苗在 W094/00152、WO94/20137、界〇93/02184與\^〇94/05792已有揭示。此類疫苗可包括作為單體之L1抗源、殼粒或類似病毒顆粒。VLPs的製備方法係此藝所熟知者，並包括提供增強之均質性的VLP解組-再組合方法，例如WO9913056與US6245 568所記述者。此類顆粒可能另外包括L2蛋白質。根據L2的疫苗之說明請參照例如， W093/00436。其他HPV疫苗係根據諸如E7之早期蛋白質或諸如L2_E7之融合蛋白質。儘管目前對HPV疫苗已有不少研究，迄今仍無有效的預防子宮頸癌之疫苗。【發明内容】本發明係有關改良的人類乳頭狀瘤病毒之疫苗。【實施方式】在第一方面，本發明係有關包括含有來自HPV 16、HPV 18、HPV 31與HPV 45之L1蛋白質或功能性L1蛋白質衍生物之 VLPs的疫苗組合物。本發明亦係有關疫苗製造之方法，該方法包括結合含有來自HPV 16、HPV 18、HPV 31與HPV 45之L1蛋白質或功能性 L1蛋白質衍生物之VLPs。本發明進一步係有關使用含有來自HPV 16、HPV 18、HPV 31與HPV 45之L1蛋白質或功能性L1蛋白質衍生物之VLPs混合物以製備預防子宮頸癌的疫苗。本發明進一步係有關預防子宮頸癌之方法，該方法傳送給 84345 200400046 有子宮頸癌危險之個體有效量之上述疫苗，諸如包括HPV 16、HPV 18、HPV 31與HPV 45之VLPs的混合物之疫苗。利用此藝之標準方法，例如並列於本文供參考之界〇99/13056所揭示者，可以由11?¥1^1蛋白質之全長或某些1^1 衍生物形成本發明之VLPs。形成VLP所用之L1蛋白質以切短者較佳。其中以至少有一種VLPs包括切短的L1蛋白質較隹，而且又以組合疫苗所有之 L1蛋白質皆為切短的L1蛋白質較佳。該切除動作又以去除細胞核侷限性信號較佳。該切除動作又以C端切除較佳。該C端切除又以去除少於50個胺基酸較佳，少於40個胺基酸更佳。最佳情形係該C端切除由HPV 16去除34個胺基酸；由HPV 18 去除35個胺基酸。切短的L1蛋白質係適當之功能性L1蛋白質衍生物。功能性 L1蛋白質衍生物能提升免疫反應（必要時，當經適當佐劑化後），該免疫反應可辨識由全長的L1蛋白質與/或該L1蛋白質所衍生之HPV型態所組成之VLP。本發明之VLPs可能亦包括其他型態之功能性蛋白質衍生物，包括諸如刪除、取代或插入突變體之全長或切短的HP V L1蛋白質之突變體。適當的衍生物亦包括密碼子最適化序列。L1蛋白質或衍生物亦可為融合蛋白，諸如L1蛋白質與L2 或一種早期蛋白質之融合物。融合蛋白以包括僅來自一種 HPV基因型之蛋白質較佳。由來自一種基因型之L1蛋白質與來自另一種基因型之L1蛋白質的嵌合L1蛋白質製成之VLPs 並不佳。 84345 200400046 L1蛋白質或功能性蛋白質衍生物係能適當形成vLp者，而 VLP形成情形可利用其例諸如，電顯與動態雷射光散射之標準技術評估。當利用本文所述條件以Malvern Zetasizer 3000HS測定VLPs 時，其多分散性以小於0·15較佳，小於〇·〗較佳，又以小於〇〇8 最佳。使用”蛋白質”之用語，或是指名特定蛋白質，例如，，L1，，，除非特別指明或由前後文可很清楚，否則，在本文中即欲包括指名之功能性蛋白質衍生物。在本發明一較佳方面，本發明之疫苗僅有四種vLp型態 HPV16、HPV18、HPV3mHpV45VLps。較佳情形為，該 VLPs僅為來自這4種基因型之每一種的u VLps。亀代地，亦為最佳者是，該疫苗包括另外之Hpv價以產生五價的疫苗。較佳者，該另外的價為包括來自HpV52、兄、 58、33、35、56與59之L1蛋白質或如上述之功能性衍生物的 VLP。當該疫苗係欲用於南美時，該第五個基因型為Ηρν 33 較佳，或當該疫苗係欲用於亞洲時，以ΗΡν 52、53或58較佳。本發明亦擴展至包括2或多種另外的價《疫苗，以提供疫苗 6或多種基因型。在一個較佳具體實施例，該組合排除來自HpV6a、6b4Hpv 11 之 VLPs 〇本發明之疫苗在預防予宮頸癌以至少有55%效力較佳，以至少60%、65%、70%、75%更佳，又以至少8〇%或更高之預防子宮頸癌效力錢。為避免懷疑，預防子宮頸癌之效力％ 84345 200400046 意指保護所有由HPV感染所謗導之子宮頸癌，而非僅保護由一種基因型所造成之癌症。儘管較佳疫苗在2、3、4、5或更多年後依然有效，但是可於疫苗注射後一年適當地評估預防情形。藉由選用適當HPV基因型以使疫苗調配物能尋標特定地理位置可提高效力％。疫苗内之VLPs的組合以不降低每種VLP型態之免疫性較佳。特別是，疫苗的組合内之HPV VLPs之間以無干擾最佳；俾使本發明之組合的VLP疫苗能提供對疫苗中所代表之每種 HPV基因型感染的有效保護。對組合中特定VLP型態之免疫反應，若為該相同VLP型態之個體測定時的免疫反應之至少 50%係適當的；較佳者為100%或實質上為100%。有關對HPV 16與HP V 18之VLPs的反應，本發明之組合疫苗以刺激至少 50%之組合的HPV 16/HPV 18之VLPs疫苗所提供之免疫反應較佳。由本發明疫苗所產生之免疫反應的程度以每一種VLP 型態之保護效果仍然可見為適當。該免疫反應可以適當地藉由例如本文所述之抗體反應來測定。本發明之疫苗可用來治療或預防HPV感染與/或疾病。例如，該疫苗可在醫療上用來降低造成子宮頸癌或CIN III後遺症之病毒負載與/或感染。因此，本發明係有關使用本發明疫苗以治療與HPV感染有關之疾病，並預防感染或疾病。本發明亦係有關使用本發明VLP組合以產生對HPV 16、HPV 18、 HPV 31與HPV 45之免疫反應。本發明之疫苗，可視情形與可提供預防生殖器的疣之保護性VLPs—起調配處方，諸如，含來自HPV 6a、6b與/或HPV 11 84345 200400046 基因型之L1蛋白質的VLPs。該VLPs以僅包括HPV L1蛋白質而無L2蛋白質或蛋白質片段較佳。除了 L1蛋白質或衍生物之外，本發明之疫苗可包括其他蛋白質或蛋白質片段。蛋白質/肽可採L1蛋白質位於VLP之嵌合型式傳送、包入VLP之囊中或與VLP之混合物共同調配成混合物型式。其他之蛋白質或肽亦可與本發明之疫苗共同施用。在一方面，該疫苗包括HPVL2蛋白質或諸如L2肽之L2衍生物，例如 K. Kawana 等人.，疫苗（Vaccine) 19，（2001) 1496-1502 頁所揭示者，其並列於本文供參考。在進一步之較佳具體實施例，本發明之疫苗可以與諸如El、E2、E3、E4、E5、E6、 E7、E8之HPV早期抗源或其免疫活性衍生物製成調配物。當以嵌合體型式傳送時，以使用早期抗源之約30-60個胺基酸之免疫原片段較佳。視情形，亦得將疫苗與非HPV抗原製成調配物或共同施用。這些抗原若可提供對其他疾病之保護即很適當，最佳者係對諸如疱疹單純病毒、批衣菌與HI V之性傳染病。我們特別喜愛該疫苗可包括來自HSV之gD或其切短體，又以W〇 99/45957所記述之gD2t較佳。以此方式，該疫苗提供對HPV 與HSV之保護。較佳之HIV抗原係如WO/9916884與WO/ 0154719所記述者。本發明通常係有關含諸如僅L1的VLPs之來自HPV 16、HPV 18、HPV 31與HPV 45之衣殼蛋白的VLPs混合物。在一特佳之具體實施例，本發明提供包括HPV 16 VLPs、 84345 -10- 200400046 HPV 18 VLPs、HPV 31 VLPs 與 HPV 45 >、昆合物之疫苗。本文指明之nHPV 16 VLPn，例如係指明LI VLP ;其中，該LI 蛋白質或L1衍生物係來自HPV 16。相同之命名原則藉由延伸，亦適用於本文所述之其他VLPs，諸如HPV 1 8、HPV 3 1 與 HPV 45 VLPs。每一 VLP以包含僅來自一種HPV基因型之L1蛋白質較佳。此種疫苗藉來自HPV 16、18、31與45之個別VLPs的產生，隨之組合此類VLPs可製成調配物。在該VLP，除了 L1外，以無其他之HPV蛋白質較佳。僅含來自一種HPV基因型，諸如具來自HPV 16之L1與L2的 VLPs的蛋白質之VLPs亦佳。然而，在本發明之一的替代具體實施例中，該VLPs可能為混合的VLPs，混合的VLPs包括來自一種基因型之L1蛋白質與來自第二種基因型之L1蛋白質的組合，其中該不同之L1蛋白質並非嵌合之L1蛋白質，但卻與相同之衣殼結構結合形成免疫原的VLPs。較隹之組合包括任何基因型16、18、31與45之不同排列，例如，本發明可包括混合的HPV 16/HPV 18 VLP與混合的HPV 31/HPV 45 VLP之組合；或是混合的HPV 16/31 VLPS與混合的 18/45 VLPs之組合。本文亦涵蓋1種VLP中有2種以上之L1基因型的組合。生產混合的VLPs可採取本文例示之分別表現個別的L1蛋白質質，隨之組合以形成VLPs。替代地，得由一或多種DNA 建構物，在相同細胞中表現多種L1蛋白質。例如，得將各自 84345 -11 - 200400046 載體編碼不同L1蛋白質之多種DNA建構物轉型或轉感染入宿主細胞。替代地，單一載體得具多種L1基因，由共同之啟動子控制，或亦可使用多種個別的啟動子。只要適當，亦可將IRES單元併入載體。利用這種表現策略，該共-表現之L1 蛋白質可能為了後續之VLP形成而共-純化；或是，可能自發性形成可在稍後經純化之混合的VLPs。當使用混合的VLPs時，生產混合VLP之較佳方法包括，由不同乳頭狀瘤病毒基因型製備諸如L1蛋白質之VLP L1蛋白質或衍生物；必要時混合該蛋白質並組合蛋白質以生產混合的VLPs。L1蛋白質可為粗萃取物型式，於混合前得為部分純化或已純化者。於組合前蛋白質至少為部分純化較佳。視情形，得於組合後進行混合的VLPs之進一步純化。在使用另外之抗原處，則這些可在適當時加入。在一個具體實施例，可能藉由解組2或多個VLPs，隨之為於再組合前之任何適當點組合解構的VLP成分，以製造混合白勺VLPs。當VLPs自發形成於L1蛋白質表現之時，例如在某些酵母菌品系發生者時，則此方法係適當者。當L1表現未導致 VLPs之自發形成時，則可在組合成VLPs前，合組L1蛋白質之製備物或殼粒。 VLPs之組合通常需去除還原劑。為此，在生產混合的VLP 時，最好是在由蛋白質混合物中去除還原劑前將蛋白質混合。生產混合的蛋白質時，以包括於允許VLPs形成條件下將該混合物之還原劑去除，由解離的L1蛋白質混合物形成混合的VLP之步騾較佳。 84345 -12 - 200400046 較佳者該再組合方法係源於諸如沒-巯基乙醇之還原劑的去除。然而，已知VLP之形成有賴於pH、金屬離子與鹽度以及還原劑之存在。為此，在某些條件下應想到VLPs可能在還原劑存在條件下形成。對本發明，只有在允許形成混合的VLPs之環境條件改變前，發生來自不同基因型之蛋白質的混合方為重要，不論其為pH、金屬離子、鹽度、還原環境或為這些條件之組合。當使用混合VLPs時，較佳者為VLPs之成分以終混合之VLP 所需之比例混合。例如，相同量之來自HPV 16與HPV 18之部分純化的L1蛋白質之混合物提供具有約等量之每種蛋白質的混合VLP。包括混合的VLP之疫苗溶液經由此藝已知之組合物可能安定化，諸如WO 98/44944、WO 0045 841所揭示者，其並列本文供參考。對本發明之所有疫苗，該疫苗較佳者係用來免疫注射年齡 10-1 5歲之青少女，以1(M3歲者較佳。該疫苗亦可能施予已做過不正常之乳頭狀瘤病毒抹片的女性或經手術去除HPV所造成之傷害後。較佳者，疫苗係以2-3個劑量之療法傳送，例如分別為0、1 個月療法與〇、1以及6個月療法。適當者，該免疫注射療法在 5-10年後，較佳者為10年時，合併追加注射。儘管，得將該疫苗冷凍乾燥並於施用前回沖，較佳者，該疫苗為液體疫苗調配物。 84345 -13 - 200400046 本發明之疫苗亦可包括佐劑加上VLPs。本發明之VLPs適當時係與鋁一起使用，而且，吸收或部分吸收於鋁佐劑係適當的。亦佳者為刺激諸如3DMPL或QS21之Thl型態反應的佐劑。該佐劑若為紹鹽係適當的，較佳者係加上諸如場酸館之 3DMPL與 3D-MPL。較佳佐劑為氫氧化鋁，即以氫氧化鋁加上3D-MPL尤佳。當VLPs吸附於含鋁之佐劑時，該佐劑可能係在VLPs混合以形成終疫苗產物前加入。該疫苗亦可包括鋁或鋁化合物做為安定劑，而且本發明亦係有關其中該VLPs係吸附於鋁鹽之安定化的組合疫苗。適當者該VLPs在吸附於鋁鹽後比沒有鋁之情形，經過長時間會更安定。安定化之VLPs係根據實例1之C3部分的方法取得或可得者較佳。本發明之疫苗可能利用諸如口服、局部、皮下、黏膜（典型地為陰道内）、靜脈内、肌内、鼻内、舌下、皮内與經由栓劑之多種途徑之任何一種提供。以肌内與皮内傳送較佳。 VLP與其他蛋白質之劑量視一些條件而改變諸如性別、個體之年齡與體重、施用途徑與疫苗之HP V。量亦可能隨VLP 型態之數目而改變。該傳送以適於產生免疫保護反應之VLP 的量為適當。每個疫苗劑量包括個別之VLP為1-100微克係適當的，以5-80微克較佳，個別VLP以5-30微克更佳，個別VLP 以5-20微克最佳，以5微克、6微克、10微克、15微克或20微克尤佳。本發明之多價疫苗以經由結合純化的LI VLPs所生產者為 84345 -14- 200400046 適當。生產Ll VLPs之方法係此藝所熟知，且包括例如W〇 953 1532、WO 9615247、WO 00/09671與美國專利號碼 5888526 所給之方法純化，其全文並列於此供參考。本發明之VLPs以利用解組與再組合VLPs製成較適當，俾提供均質與純的VLPs。適當方法之實例請參照WO 0057906、美國專利號碼6245568與WO 9913056。儘管，可使用任何適當之細胞諸如大腸桿菌或例如亦可使用酵母菌（S. cerevisiae)、裂殖酵母（S pombe)或巴斯德畢赤酵母（Pichia sp.)之酵母菌細胞；但是，該VLPs仍然以由諸如Sf9 或Ηι-5細胞之昆蟲細胞製備較佳。較佳者L1表現後的純化VLPs步騾包括一或多個陰離子交換色析（二甲基胺基乙基-DMAE)、陰離子交換色析（三甲基胺基乙基-TMAE)、羥磷灰石色析、諸如奈米性過濾或超過濾之過濾，或厭水性作用色析。在純化期間至少進行一種陰離子交換步騾較佳，又以使用2個陰離子交換步騾更佳。若在蛋白質混合前進行至少一種陰離子交換純化步騾較佳。視情形亦可使用UV照射步騾。為避免懷疑，本文所引用之所有文獻的全部教示皆並於本文供參考。實例1 此處詳述HPV 16與HPV 18 Ll VLPs之組合。藉此藝已熟知之類似方法可能很方便生產來自其他HPV基因型之L1蛋白質。 A HPV 16/18 Ll VLPs之製備 84345 -15 - 200400046

利用例如參照WO9913056之標準方法生產HPV 16與HPV 18乂1^3。1^卩16/18蛋白質係在以重組桿狀病毒（〇3]^〇1) 轉感染之擬尺蠖（Trichoplusia ni)(High Five™)細胞（於密度〜350000細胞/毫升）表現，以編碼感興趣之Hpv 16或18 L1 基因。細胞約於感染後72小時收取。 B 細胞收取/抗原萃取以濃縮、萃取、澄清等三步驟方法由Hi5細胞萃取抗原 (L1-16/1 8)。濃縮步驟包括去除達9〇%培養液，且其進行係利用切線流動過濾。萃取步驟係使用低張緩衝液（2〇毫莫耳濃度Tris ’ pH 8.5)進行。使用相當於培養體積之體積進行萃取。於平順攪拌下，使用最少半小時之接觸時間。進行澄清時，係利用切線流動過濾。 C.純化純化方法係於室溫進行。將vLP，s解構成殼粒以取得 L1-16/18兩種抗原，並於萃取時添加召·鐃基乙醇（4%重量/ 重置）。就在添加/3 -旒基乙醇之前，添加濃度達重量/重量 10 %之甘油。所有緩衝液於貯存在2°C-8°C前，皆滤過0 22微米濾器。於個別純化處理前之負載樣本前，皆將膠質基質去菌並經適當緩衝液平衡。純化政策係給予來自HPV 16與18分開的L1純化。這些計劃非常相似，且涉及下列步驟：陰離子交換色析（二甲基胺基乙基-DMAE)，陰離子叉換色析（三甲基胺基乙基_TMAE)， 84345 -16 - 200400046 羥磷灰石色析，奈米性過滤（Planova)，超過爐5 對HPV 18之厭水性作用色析（利用Octyl Sepharose)或對 HPV 16之陰離子交換色析（DEAE)，與除菌過滤。特定地：

Cl L1-18抗原之純化陰離子交換色析DMAE 將澄清之萃取液（蛋白質濃度為〜1克/毫升，而L1蛋白質為〜150毫克/毫升）施於陰離子交換管柱（二甲基胺基乙基）。以pH 7.9±0·2之緩衝液（20毫莫耳濃度Tris|200毫莫耳濃度NaClK%^ -鏡基乙醇BME)進行溶離。以約5倍管柱體積溶離抗原，並以280 nm偵測溶離情形。

陰離子交換色析TMAE 以1倍體積之Η20/ΒΜΕ 4%稀釋第一步騾之溶離液。然後，將稀釋之溶離液施於第二個陰離子交換管柱（三甲基胺基乙基）。以pH 7.9±0.2之緩衝液（20毫莫耳濃度Tris|200毫莫耳濃度NaCl|4%BME)進行溶離。以約4倍管柱體積溶離抗原，並以280 nm偵測溶離情形。羥磷灰石色析將TMAE步驟之溶離液施於經濟灰石（HA)管柱。施用樣本後，以約2.5倍管柱體積pH 6.0±0.2之缓衝液（100毫莫耳濃度NaH2P〇4|30毫莫耳濃度NaCl|4%BME)進行膠之溶離。 84345 -17- 200400046 奈米性過濾（Planova) 將HA溶離液進行稀釋以達下列條件·· pH 7.5± 0.2之（25 亳莫耳濃度NaH2PO4|10毫莫耳濃度NaCl|4%BME)緩衝液。然後，以0。2微米前濾器與0.12平方米之Planova 15N濾器進行連續過滤。過滤係以2 0 0毫巴± 2 0毫巴之丨亙壓進行。超過滤以配備聚醚颯膜（Centramate匣子0.1平方米，100 kD)之切線流動超過濾系統進行超過漉。處理Planova溶離液，以達下列條件：（100毫莫耳濃度NaH2PO4|30毫莫耳濃度 NaCl|4%BME) pH 6.0±0·2 ;然後，負載於系統中，濃縮5 倍並以連續注射〜10倍開始體積之pH 6.0 ±0.2的缓衝液（20 毫莫耳濃度NaH2P04|500毫莫耳濃度NaCl)進行透析。厭水性作用色析（Octyl Sepharose) 將超過滤滲透液施於Octyl Sepharose管柱。此色析步驟係以約5倍管柱體積之pH 6.0 ±0.2的缓衝液（20毫莫耳濃度 Na3P04|500毫莫耳濃度NaCl)採負向模式進行。除菌過滤以0.22微米的膜將純化之L1-18抗原過濾除菌。

C2 L1-16抗原之純化陰離子交換色析DMAE 將澄清之萃取液施於陰離子交換管柱（二甲基胺基乙基）。以pH 7.9±0.2之缓衝液（20毫莫耳濃度Tris|180毫莫耳濃度NaClj4% BME)進行溶離。以約4倍管柱體積溶離抗原，並以280 nm偵測溶離情形。 84345 -18- 200400046

陰離子交換色析TMAE •、 0 pi 以1倍體積之Η20/ΒΜΕ 4%稀釋第一步騾之溶離液 / / f基胺後，將稀釋之溶離液施於第二個陰離子交換管枉（> T ^ 基乙基）。以pH 7,9土0 2之緩衝液（20毫莫耳濃度7]：13|18()么莫耳濃度NaCl|4%BME)進行溶離。以約5倍管拄體積洛離扣^ 原，並以280 nm彳貞測溶離情形。羥磷灰石色析（HA) 將TMAE步騾之溶離液施於HA管柱。施用樣本後’以約3 倍管柱體積pH 6.0 土 0.2之緩衝液（100毫莫耳濃度 NaH2P04|3〇毫莫耳濃度NaCl|4%BME)進行膠之溶離。奈米性過濾（Planova) 將HA溶離液進行稀釋以達下列條件：PH 7.5 土 02之（25 毫莫耳濃度NaH2P〇4|10毫莫耳濃度NaCl|4%BME)緩衝液。然後，以0·2微米前滤器與0.12平方米之Planova 15N濾器進行連續過濾。過濾係以200毫巴士20毫巴之恆壓進行。超過滤以配備聚醚颯膜（Centramate匣子〇·1平方米’ 1〇〇 kD)之切線流動超過濾系統進行超過濾。處理Planova溶離液，以達下列條件：（100毫莫耳濃度NaH2P〇4|30毫莫耳濃度 NaCl|4%BME) pH 6.0±0.2 ;然後’負載於系統中’濃縮5 倍並以連續注射〜10倍開始體積之PH 6·0土0·2的緩衝液（20 毫莫耳濃度NaH2P〇4|500毫莫耳濃度NaCl)進行透析。

陰離子交換色析DEAE 將超過濾步騾之溶離液調成PH 6·〇土 0·2之平衡緩衝液（20 84345 -19- 200400046 毫莫耳濃度NaH3P〇4|250毫莫耳濃度NaCl)之導電度，並施於陰離子交換管柱（二乙基胺基乙基）。以pH 6.0±0·2之缓衝液（20毫莫耳濃度NaH2P〇4|500毫莫耳濃度NaCl)進行溶離。以約3倍管柱體積溶離抗原，並以 280 nm彳貞測溶離情形。除菌過濾以0.22微米的膜將純化之L1-16抗原過濾除菌。 C3 令個別之VLP型態獨立吸附以產生濃縮之吸附單價體。 VLP 16之濃縮的吸附性單價體之製備：令60微克來自HPV 16之純化的VLPs於室溫下、以1小時，溫和攪拌以吸附於pH 6.0±0.2之來自Alcona的150微克Al3+。將此濃縮之吸附性單價體貯存於+4°C。利用離心該製備物並定量上澄液之VLPs來檢測吸附情形。 VLP 18之濃縮的吸附性單價體之製備：令60微克來自HPV 18之純化的VLPs於室溫下、以1小時溫和攪拌以吸附於pH 6.0 土 0.2之來自ΑΚΟΗ、的150微克Al3+。將此濃縮之吸附性單價體貯存於+4°C。利用離心該製備物並定量上澄液之VLPs來檢測吸附情形。 D終疫苗製備：結合利用上述方法所製備之濃縮的吸附性單價體以形成每一劑量含20微克個別VLP之懸浮液。終疫苗貯存在+4°C。添加個別VLP濃度20微克之來自HPV 31與45之VLPs，以完成四價疫苗。 84345 -20- 200400046 可將總和之吸收的容積物（bulk)或各體之吸收的容積物與諸如3D-MPL之佐劑進一步混合。實例2 A· HPV 16/18 LI VLPs之製備利用如上述之標準方法以生產HPV 16與HPV 18 VLPs。 B 混合VLPs之形成本發明方法涉及使用解組然後再組合HP V 16與18 VLPs，使HPVL1 16與18之再組合同時進行，允許形成混合· 之 VLPs。在VLPs再組合之前，於上述方法之任何適合的點皆得結合 HPV 16與 18 VLPs。藉實例2，我們測試特定策略： 1. 於HA步騾後，混合全部兩種抗原。根據HA總合物之L1 濃度，混合該二成分以達等濃度之HPV 16與18，以開始UF 步騾。在此情形，於超過滤後進行如純化HPV 18所進行的 Octyl Speharose步驟；隨之為進行純化HPV 16方法所用的參 DEAE步騾。 2. 混合全部兩種萃取物並純化。根據萃取物之L1濃度，

將兩種價键體混合以達等濃度之HPV 16與18，以開始 DMAE步騾。再一次，於超過濾步騾後進行如HPV 18所進行的Octyl Speharose步驟；隨之為進行HPV 16方法的DEAE 步騾。 84345 -21 - 200400046 HPV 16_HPV 18 VLP於UF步驟之混合

DMAE DMAE 1 1 TMAE TMAE Ψ HA HA Ψ 4 Planova Planova HPV 16-HPV 18 VLP於DMAE步騾之混合應用同樣流程圖，但混合係於DMAE步驟而非於UF步驟進行。陰離子交換DMAE TMAE步騾所用之溶離濃度為200 毫莫耳濃度。結果 HPV 16-HPV 18 VLP於UF步騾之混合結合HPV 16與HPV 18 L1蛋白質以產生2批之混合 VLPs(批號 31bl65c 與 31bl66c)。 50% 50%-► UF ^-

Octyl IDEAE0.22μηη filtration 84345 -22- 200400046 經SDS-PAGE之純度混合的VLP、之純度與全部兩種"古典的”HPV 16或HPV 18體積者一樣好。 EM資料-圖1 比較31B165C之EM(成熟後之UF存留液）與古典的HPV 16 批號（39B122C)。VLP’s形成的很好、大小均質、無聚集，一些殼粒之裂片在兩者之實驗皆出現。大小分布利用 Malvern Zetasizer 3000 HS決定 VLP’s之大小分布。進行Malvern分析（800微升/小管）時，樣本係在一個塑膠小管未經稀釋測定。技術條件為： -雷射波長：5 3 2 nm， -雷射功率：5 0 mW， -以90°進行散射光偵測， -溫度·· 25°C， -持續期：由軟體決定， -次數：3次連續測定， -z-平均值徑：利用累積分析，大小分布：採取Contin法。 HPV 18 Ll-VLP’s之古典結果為：具好的多分散性之70-80 nm(<0 1) HPV 16 Ll-VLP’s之古典結果為：具好的多分散性之60-70 nm(<0.1) 84345 •23 - 200400046 對混合的VLP’s可得下列結果： 31 B165c :具好的多分散性之85 nm (0.08)。VLP，s幾乎完全於成熟開始時形成。 31 B166c :具好的多分散性之76 nm (0.08)。利用動態雷射光散涉所測得之31 B165c與31 B166c的大小分布，列於圖2與3。 HPV 16-HPV 18 VLP於DMAE步騾之混合批號 η。31B167B 係由批號 E18L1C005(HPV 18)與 39B167 (HPV 16)所製成。經SDS-PAGE之純度混合的VLPf s之純度與全部兩種’’古典的’’容積物一樣好。容積物之純度高於95%。大小分布 VLP’s之大小分布係利用Malvern Zetasizer 3000 HS所決定。 HPV 18 Ll-VLP’s之古典結果為：具好的多分散性之70-80 nm (<0.1) HPV 16 Ll_VLP’s之古典結果為：具好的多分散性之60-70 nm (<0·1) 對混合的VLP’s可得下列結果： HPV 16與HPV 18 31B167B :具好的多分散性之74 nm (0.07)。VLP’s幾乎完全於成熟開始時形成。實例3-混合的HPV 16、18、31、45組合疫苗之產生。引言 84345 -24- 200400046 利用C-終端切短之Ll VLPs 16、18、31與45加上鋁佐劑與 + 3D-MPL(本文”佐劑A”-50微克鋁鹽與5微克3D MPL)之組合，以Balb/C小鼠進行免疫性研究。分別於第〇與21天時，將共4組、每組各10隻的小鼠行兩次肌内免疫注射：

1. VLP 31 (2微克）/佐劑A

2. VLP 45 (2微克）/佐劑A

3. VLP 16 (2微克）與VLP 18 (2微克）/佐劑A

4. VLP 16 (2微克）、VLP 18 (2微克）、VLP 31 (2微克）、VLP 45 (2微克）/佐劑A 對抗VLPs 16、18、31與45之抗體反應係針對第35天時所採之血清（劑量II後14天）進行偵測而決定。結果列於圖4-7。對VLP 16之抗體反應 •不論是採用以佐劑A調配之VLP 16與VLP 18(第3組），或是全組合（第4組）者，於II後之血清皆發現謗發強烈抗體反應。 •對此兩組皆偵測類似量之抗VLP 16抗體，但未觀察到有干擾。對VLP 18之抗體反應 •不論是採用以佐劑A調配之VLP 18與VLP 16(第3組），或是全組合（第4組）者，於II後之血清皆發現謗發強烈抗體反應。 •對此兩組皆偵測類似量之抗VLP 18抗體（差異小於1.5 84345 -25 - 200400046 倍），但未觀察到有干擾。對VLP 31之抗體反應 •不論是採用以佐劑A單獨調配之VLP 31 (第1組），或是全組合（第4組）者，於II後之血清皆發現謗發強烈抗體反應。 •對此兩組皆偵測類似量之抗VLP 31抗體，但未觀察到有干擾。對VLP 45之抗體反應 •不論是採用以佐劑A單獨調配之VLP 45(第2組），或是全組合（第4組）者，於II後之血清皆發現謗發強烈抗體反應。 •對此兩組皆偵測類似量之抗VLP 45抗體，但未觀察到有干擾。結論當以組合物傳送4種VLPs (VLPs 16、18、31與45)時，未發現干擾情形。圖式簡單說明我們利用下列非限制性實例與圖形以說明本發明，其中：圖1說明藉EM之評估，混合的VLPs與HPV 16 VLPs之比較。圖2與3說明混合的VLPs之大小分布。圖4說明抗體對混合的HPV 16、18、31、45組合疫苗相對於HPV 16對照組之VLP 16的反應情形。圖5說明抗體對混合的HPV 16、18、31、45組合疫苗相對於HPV 18對照組之VLP 18的反應情形。圖6說明抗體對混合的HPV 16、18、31、45組合疫苗相對 84345 -26- 200400046 於HPV31對照組之VLP31的反應情形。圖7說明抗體對混合的HPV 16、18、31、45組合疫苗相對於HPV45對照組之VLP45的反應情形。 27- 84345

Claims

200400046 拾、申請專利範圍： 1. 一種疫苗組合物，其包括含有衍生自HP V 16、HP V 1 8、 HPV 31與HPV 45基因型之L1蛋白質或功能性L1蛋白質衍生物之VLPs。 2·根據申請專利範圍第1項之疫苗，其包括HPV 16 VLPs、 HPV 18 VLPs、HPV 31 VLPs與 HPV 45 VLPs的混合物，個別的VLP包括來自僅有一種hpv基因型之LI蛋白質或功能性L1蛋白質衍生物。 3根據申請專利範圍第2項之疫苗，其中該VLPs為包括 HPV L1蛋白質或功能性！^蛋白質衍生物，而無其他Hpv 蛋白質之僅含L1的VLPs。 4.根據申請專利範圍第1 -3項中任一項之疫苗組合物，其包括貫質上僅由來自HPV 16、HPV 18、HPV 31與HPV 45 之蛋白質所組成之VLPs。 5根據申請專利範圍第1-3項中任一項之疫苗組合物，其中至少一種L1蛋白質為切短之L1蛋白質。 6根據申請專利範圍第1-3項中任一項之疫苗組合物，其中该組合物包括含有來自另一種HPV基因型之L1蛋白質或其功能性衍生物之VLP。 7·根據申請專利範圍第6項之疫苗組合物，其中該另外的 VLP包括選自一種由 HPV 33、52、53、58、35、56與 59 所組成<群的L1蛋白質或功能性L1蛋白質衍生物。 8.根據申請專利範圍第丨_3項中任一項之疫苗組合物，其在預防子宮頸癌至少有60%效率。 84345 200400046 根據申明專利範圍第u項中任一項之疫苗組合物，其另外包括崎自由El、E2、E3、E4、E5、E6、E7或E8所組成之群的HPV早期抗原或其免疫活性片段。 10·根據申請專利範圍第1〇項中任一項之疫苗組合物，其系人折生自引起性傳染病之生物體的抗原一起調配。根據申請專利範圍第1〇項之疫苗組合物，其中該抗原為 HSV抗原或其免疫活性片段。 · 12根據申明專利範圍第丨〇項之疫苗組合物，其中該抗原為修-HIV抗原或其免疫活性片段。 13.根據申請專利範圍第1〇項之疫苗組合物，其中該抗原為批衣菌抗原或其免疫活性片段。 · 14根據申請專利範圍第丨_3項中任一項之疫苗組合物，其 _ 包括HPV L2蛋白質或其片段。 1 5根據申請專利範圍第丨_3項中任一項之疫苗組合物，其另外包括佐劑。 16·根據申請專利範圍第15項之疫苗組合物，其中該佐劑為_ 鋁鹽。 · 17.根據申請專利範圍第16項之疫苗組合物，其中該鋁鹽為 < 氳氧化鋁。 1 8根據申請專利範圍第16項之疫苗組合物，其另外包括 3D-MPL 〇 19根據申請專利範圍第1 _3項中任一項之疫苗組合物，其中該VLPs包含非為嵌合之L1蛋白質。 20 —種疫苗生產之方法，該方法包括結合含有以蛋白質之 84345 200400046 VLPs或衍生自 HPV 16、HPV 18、HPV 31 與 HPV 45 之功能性LI蛋白質衍生物，以形成根據申請專利範圍第1-3 項中任一項之疫苗。 21, —種包括利用L1蛋白質或其功能性衍生物之HPV 16、 HPV 18、HPV 31與HPV 45 VLPs的混合物之用途，其係用於製備預防或治療與HPV感染相關疾病之疫苗。 22. 根據申請專利範圍第1-3項中任一項之疫苗組合物，其係用以預防HPV感染或治療與HPV感染相關之疾病。 23 . —種安定化之疫苗組合物，其包括根據申請專利範圍第 1-3項中任一項之疫苗，其中該HPV 16、18、31與45之 VLPs係於混合前吸附於氫氧化鋁。 24. 根據申請專利範圍第1-3項中任一項之疫苗組合物，其中該針對疫苗中指定之VLP型態的免疫反應，為至少該相同VLP型態個別測量時之反應的50%。 25. 根據申請專利範圍第20項之方法，其中該針對疫苗中指定之VLP型態的免疫反應，為至少該相同VLP型態個別測量時之反應的50%。 26根據申請專利範圍第21項之用途，，其中該針對疫苗中指定之VLP型態的免疫反應，為至少該相同VLP型態個別測量時之反應的50%。 27.根據申請專利範圍第23項之安定化的疫苗組合物，其中該針對疫苗中指定之VLP型態的免疫反應，為至少該相同VLP型態個別測量時之反應的50%。