CN102178944A - 人乳头瘤病毒16和18型l1蛋白在昆虫细胞中的表达及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了制备针对人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的二价疫苗的方法，其包括下列步骤：优化HPV16和HPV18的L1蛋白的基因序列；将优化后的基因序列克隆入杆状病毒表达载体并转染昆虫细胞，以获得重组的杆状病毒；用所述杆状病毒感染昆虫细胞；回收和纯化表达的HPV16和HPV18的L1蛋白，并将其与佐剂混和制备成二价疫苗。本发明还提供了经优化的HPV16和HPV18的L1蛋白的基因序列，含有此类基因序列的载体，以及含有此类载体的细胞。

Description

人乳头瘤病毒16和18型L1蛋白在昆虫细胞中的表达及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，且涉及人乳头瘤病毒16和18型L1蛋白在昆虫细胞中的表达及其疫苗制备方法。

背景技术

世界卫生组织(WHO)的统计资料表明，宫颈癌是严重危害妇女健康的侵染性疾病，其发病率仅次于乳腺癌，居全世界女性恶性肿瘤第二位，在一些发展中国家甚至居于首位。宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，全球每年约有50万名妇女罹患宫颈癌，且有将近30万名妇女死于宫颈癌，其中，80％的死亡病例发生在发展中国家。据不完全统计，我国现有宫颈癌病人约13.8万，每年约有5万人死于宫颈癌，且发病率呈逐年上升、年轻化的趋势。在1995年，WHO已将人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的感染确定为宫颈癌的致病病因。几乎所有的宫颈癌都由HPV引起，其中高达99.7％的宫颈癌患者都存在HPV感染，且超过2/3的宫颈癌病例由HPV 16型和18型引起。

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一种嗜上皮性病毒，其具有高度的特异性。HPV是一组病毒的总称，其组成一个科，其中各病毒的形态类似，但DNA限制性内切酶图谱不同，核壳体蛋白质的抗原性不同。目前已经确定的HPV型别大约有160余种，依其感染的上皮所在的部位分为皮肤型HPV和生殖道上皮HPV，其中大约35种型别可感染妇女生殖道，大约20种与肿瘤相关。依据HPV导致肿瘤的危险性的高低，将HPV分为低危险型别HPV和高危险型别HPV。低危险型别HPV包括HPV6、11、42、43、44等型别，其通常引起外生殖器湿疣等良性病变，包括宫颈上皮内低度病变(CINI)。高危险型别HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型别。高危险型别HPV，特别是HPV16和18型，与宫颈癌及宫颈上皮内瘤变(CIN II/III)的发生相关。

近十几年来，HPV疫苗研究可以分为两类，即预防性疫苗研究和治疗性疫苗研究。预防性疫苗一般以HPV16主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2为靶抗原，其作用在于诱发机体产生特异性的中和抗体和有效的局部免疫应答，以阻止HPV的长期感染和再感染。HPV的衣壳蛋白在真核以及原核表达系统中表达时，能自我装配或形成病毒样颗粒(VLP)，其结构和抗原表位与天然的病毒颗粒十分相似。VLP能与细胞受体结合并进入细胞，从而有利于抗原的加工呈递以及诱发较强的细胞免疫。治疗性疫苗通常是以经修饰的HPV16早期蛋白(其转化活性被去除，但仍保留抗原性)作为靶抗原，它可诱导特异性的细胞免疫应答，从而可用于控制或消除感染HPV的良性和恶性病灶，并可作为这类疾病的手术后的辅助治疗。在大多数与HPV16相关的宫颈癌及其癌前病变中，HPV16的E6和E7蛋白持续表达，而这种持续表达是肿瘤细胞转化和维持恶性特征所必需的，并且正常组织中不存在这两种蛋白。因此，E6和E7蛋白为用于HPV16相关宫颈癌及癌前病变的治疗性疫苗的理想靶抗原。针对中晚期宫颈癌病人手术后残留的肿瘤细胞，可应用这种治疗性疫苗，以通过激发病人的细胞免疫来杀伤、清除这些肿瘤细胞和已感染的上皮细胞，从而防止或限制肿瘤的复发和扩散。预防性和治疗性HPV疫苗的作用也有交叉。例如，在良性疣和轻度CIN病变中存在HPV晚期蛋白的表达，因此，预防性疫苗对这些疾病也有一定治疗作用。近年来研制的一些疫苗，如嵌合性疫苗、HPV假病毒疫苗等，同时具备预防和治疗双重作用。

HPV疫苗在预防导致宫颈癌的持续性感染方面，有效率达到100％，它能将宫颈癌发生率降低75％，安全性好。目前国际上已有多个HPV16候选疫苗进入I/II期临床试验，这种疫苗将会拯救成千上万的妇女的生命，因此对妇女的健康产生重大影响。

默克公司于1991年从澳大利亚CSL公司获得专利授权，通过使用酿酒酵母表达，制备了针对HPV 6、11、16和18型的四价HPV疫苗。而葛兰素史克公司的HPV疫苗技术来源于MedImmune公司，该疫苗为2价疫苗，商品名为“Cervarix”(预防16、18型)，其使用昆虫细胞进行表达。这两种疫苗均可以迅速使受试动物产生对HPV病毒的中和抗体，并且对人畜安全，能够有效预防治疗HPV病毒所导致的各种疾病，特别是梅毒和宫颈癌。这些技术已在国际权威专业杂志上公开发表、部分内容已经获得美国等多个国家专利保护。

瑞士洛桑大学研究人员最近研究出一种治疗宫颈癌的喷雾剂疫苗，其效果与注射疫苗相同。通过吸入该喷雾剂疫苗，可以刺激并产生针对这种病毒的抗体，其效果与注射疫苗一样。这种喷雾剂使用方便，疗程短。病人只需使用两次，其间间隔2周，而注射疫苗需要注射3次，并且耗时6个月。

2004年还报道，一种基于7种人乳头瘤病毒(HPV)的有效疫苗可以预防全球的多数宫颈癌。然而，它的费用很高，而且针对一些不太常见的HPV亚型，其提供的保护作用也很难清楚地证实。考虑到成本问题，针对2种(HPV16、18)或3种(HPV16、18和45)最常见亚型的疫苗可能更便宜，也更现实。特别地，抗HPV16和HPV18的疫苗非常有意义，因为其可以预防70％的宫颈癌。

为此，本发明基于我国流行的高致病性HPV16/18型毒株的L1蛋白氨基酸序列，开发了新的HPV16/18二价疫苗的制备方法，其对于大规模生产HPV16/18二价疫苗以及对于我国妇女的宫颈癌预防具有重要的现实意义。

发明内容

人乳头状瘤病毒的主要衣壳蛋白L1基因在原核和真核表达后能够自我装配或形成病毒样颗粒(VLP)，从而能与细胞受体结合诱发细胞免疫。因此，L1蛋白是预防宫颈癌的最有价值的靶抗原。本发明以我国流行的高致病性HPV 16和18两种亚型的主要衣壳蛋白L1基因作为研究对象，开发了新的HPV16/18二价疫苗的制备方法。利用该方法，本发明实现了HPV 16和HPV 18的主要衣壳蛋白L1的高表达，并且获得了生物学性状较好的VLP，其具有优良的抗原性和免疫原性，对于大规模生产HPV16/18二价疫苗以及对于我国妇女的宫颈癌预防有重要的现实意义。

因此，在一个方面，本发明提供了制备针对人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的二价疫苗的方法，其包括以下步骤：

1)分别优化HPV16和HPV18的L1蛋白的基因序列；

2)将步骤1)中优化后的基因序列分别克隆入杆状病毒表达载体，以获得重组质粒；

3)用所述重组质粒，与相应的杆状病毒基因组一起，分别转染昆虫细胞，以获得重组杆状病毒；

4)用所述重组杆状病毒分别感染新鲜培养的昆虫细胞；

5)从步骤4)的昆虫细胞分别分离纯化HPV16和HPV18的L1蛋白，并将其与佐剂混合制备成二价疫苗。

在一个优选实施方案中，HPV16和HPV18的L1蛋白的优化后的基因序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。

在一个优选实施方案中，本发明的方法所使用的杆状病毒表达载体是pAcSG2，所使用的杆状病毒基因组是杆状病毒基因组AcNPV。

在一个优选实施方案中，本发明的方法所使用的昆虫细胞选自Sf-9细胞、Sf-21细胞和High Five细胞。

在一个优选实施方案中，本发明的方法将分离纯化的HPV16和HPV18的L1蛋白吸附至佐剂上，以制备二价疫苗。在一个优选实施方案中，本发明的方法所使用的佐剂优选选自氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂。

在一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含HPV16和HPV18的L1蛋白的优化后的基因序列。优选，本发明的分离的核酸分子包含SEQ ID NO.1或2所示的序列。

在一个方面，本发明提供了包含本发明的分离的核酸分子的载体。优选，本发明的载体是表达载体。在一个优选实施方案中，本发明的载体适合于在昆虫细胞例如Sf-9细胞、Sf-21细胞或High Five细胞等中表达，其优选是杆状病毒表达载体，更优选是pAcSG2。

在一个方面，本发明提供了包含本发明的分离的核酸分子或载体的细胞。在一个优选实施方案中，本发明的细胞是昆虫细胞，优选Sf-9细胞、Sf-21细胞或High Five细胞。

在一个方面，还提供了本发明的分离的核酸分子用于制备二价疫苗的用途，所述二价疫苗用于预防HPV16和HPV18的感染。

在一个方面，还提供了本发明的分离的核酸分子用于制备HPV16和HPV18的L1蛋白的用途。

发明的有益效果

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：

(1)所制备的疫苗针对我国流行的高致病性HPV16/18型毒株的L1蛋白氨基酸序列，有助于对我国妇女的宫颈癌预防；

(2)在疫苗的制备过程中，对HPV16/18L1蛋白的基因序列进行了优化，有助于提高L1蛋白在昆虫细胞中的表达水平，从而对于大规模生产HPV16/18二价疫苗以及对于HPV疫苗的临床应用具有重要的现实意义。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图概述

图1显示pVL16-L1和pVL18-L1的双酶切鉴定。其中，泳道1为DNA分子量标准；泳道2为pVL16-L1的Xho I和Nco I双酶切产物；泳道3为pVL18-L1的Xho I和Nco I双酶切产物。

图2显示重组病毒的PCR扩增产物的酶切鉴定。其中，泳道1为DNA分子量标准；泳道2为rBV16的基因组PCR扩增产物；泳道3为rBV18的基因组PCR扩增产物。

图3显示rBV16表达的HPV16 L1蛋白的SDS-PAGE鉴定。其中，泳道1为Sf-9细胞裂解液对照；泳道2和3均为rBV16感染的Sf-9细胞的裂解液；泳道4为蛋白分子量标准。

图4显示rBV18表达的HPV18 L1蛋白的SDS-PAGE鉴定。其中，泳道1为Sf-9细胞裂解液对照；泳道2、3、4和5均为rBV18感染的Sf-9细胞的裂解液；泳道6为蛋白分子量标准。

图5显示纯化的HPV16/18 L1蛋白的SDS-PAGE鉴定。其中，泳道1为蛋白分子量标准；泳道2为纯化的HPV16 L1蛋白；泳道3为纯化的HPV18 L1蛋白。

图6是HPV16/18 L1的透射电镜照片。其中，图6A显示HPV16 L1的VLP；图B显示HPV18 L1的VLP。

图7显示HPV16/18 L1蛋白的Western印迹鉴定。其中，泳道1为蛋白分子量标准；泳道2为HPV16 L1蛋白；泳道3为Sf-9细胞对照；泳道4为HPV18 L1蛋白；泳道5为Sf-9细胞对照。

图8显示制备的假病毒感染293FT细胞后的细胞内荧光。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明但不限定本发明的实施例来描述本发明。

实施例1.HPV16/18的L1蛋白的基因序列的优化

我国流行的高致病性HPV16和HPV18型毒株的L1蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7和8所示。

使用市售可得的软件OptimumGene^TM对HPV16和HPV18型的L1基因序列进行优化，以提高L1基因在昆虫细胞中的表达水平。其中，优化后的HPV16 L1基因序列如SEQ ID NO.1所示；优化后的HPV18 L1基因序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2.pVL16-L1和pVL18-L1转染质粒的构建

利用引物对5′-CTC GAG GAA TTC AGG ATG CAA GTG ACG TTTATT-3′(SEQ ID NO.3)和5′-A GAG CTC CCA TGG AGG TTA CAA CTTGCG TTT CTT-3′(SEQ ID NO.4)，以及引物对5′-CTC GAG GAA TTCAGG ATG TGC TTG TAC ACG CGC-3′(SEQ ID NO.5)和5′-A GAG CTCCCA TGG AGG TTA TTT GCG AGC TCT CAC G-3′(SEQ ID NO.6)，通过PCR分别扩增人工合成的经优化的HPV16型和HPV18型L1基因。PCR反应条件为95℃预变性5分钟；30个循环的95℃变性30秒，55℃退火45秒，72℃延伸2分钟；最后72℃延伸10分钟。PCR扩增后，获得两端分别带有Xho I和Nco I限制性内切酶酶切位点的L1基因片段。

使用商购可得的Xho I和Nco I(例如购自宝生物工程(大连)有限公司)对L1基因片段和杆状病毒载体pAcSG2(来源于美国BD公司的试剂盒，BD BaculoGold^TM，560129)分别进行双酶切，于37℃进行3小时(1μg的L1基因片段或pAcSG2载体，加入10U Xho I和10UNco I)。将酶切后的L1基因片段分别插入到同样经过Xho I和NcoI酶切的杆状病毒载体pAcSG2中。连接的反应体系为：L1基因片段100μg，pAcSG2载体150μg，T4DNA连接酶1U；反应条件为16℃连接过夜。用连接后的载体分别转化大肠杆菌(E.coli)，然后经克隆筛选、增菌培养和质粒抽提获得包含目的基因片段的转染质粒。所获得的转染质粒通过Xho I和Nco I双酶切进行鉴定。

如图1所示，获得了包含目的基因片段的重组质粒HPV16L1-pAcSG2(简称pVL16-L1)和HPV18L1-pAcSG2(简称pVL18-L1)。

实施例3.重组杆状病毒的制备

将pVL16-L1和pVL18-L1重组质粒分别与AcNPV基因组DNA(来源于美国BD公司的试剂盒，BD BaculoGold^TM，560129)一起共转染Sf-9细胞(购买自美国Invitrogen公司)。在27℃下培养4天后，在镜下观察到转染后的细胞体积增大。培养5天后，收集细胞培养上清液(其中分别含有重组病毒rBV16和rBV18)。将细胞上清液分别接种到新鲜培养的Sf-9细胞，在27℃下培养3天。取培养上清液再传代一次。之后，取培养上清液，加入等体积的2×沉淀液(含20％PEG6000、1M NaCl)，在4℃混合过夜。然后在4℃下，以13000rpm将混合物离心30分钟，并弃去上清液。所得的沉淀用100μl无菌水重悬浮，并加入5U蛋白酶K，在50℃消化过夜。向消化物中加入等体积的酚/氯仿，振荡混和，并以13000rpm离心10分钟；取上清液，加入等体积的氯仿，振荡混和，再次以13000rpm离心10分钟；取上清液，加入1/10体积的3M NaAc和0.6×的异丙醇，并于-20℃放置15分钟。然后在4℃下以13000rpm离心10分钟，并弃去上清液。所得的沉淀用预冷的70％乙醇洗涤2次，然后在室温下干燥10分钟。干燥后，沉淀用50μl无菌水悬浮，从而获得重组病毒rBV16和rBV18的基因组。取5μl重组病毒基因组，并分别用特异性引物对SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，以及SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6进行PCR鉴定。PCR反应条件如下：95℃预变性5分钟；30个循环的95℃变性30秒，55℃退火45秒，72℃延伸2分钟；最后72℃延伸10分钟。PCR鉴定的结果表明，重组病毒rBV16和rBV18的基因组中分别含有大小为1600bp的HPV16 L1和大小为1700bp的HPV18 L1的目的片段(参见图2)。

收集被感染的Sf-9细胞，加入细胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)；15mmol/L NaCl；0.1mmol/L PMSF；0.1％NP40；5mmol/LEDTA)进行裂解。将100μl细胞裂解物和100μl 2×蛋白上样缓冲液(100mmol/L Tris HCl(pH 6.8)；200mmol/L DTT；8％SDS；0.02％考马斯亮蓝R-250；24％甘油)混合，并沸水浴10分钟。然后取10μl样品在10％聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE电泳，并进行考马斯亮兰染色，以检测目的蛋白是否表达。结果显示，重组病毒rBV16和rBV18分别表达分子量为59.4KD的HPV16 L1蛋白和分子量为63.7KD的HPV18 L1蛋白(参见图3和4)。进一步通过软件Quatity One(Bio-Rad公司)进行分析，结果表明，表达的HPV16 L1蛋白占全部Sf-9细胞总蛋白的9.8％(参见图3)，表达的HPV18 L1蛋白占全部Sf-9细胞总蛋白的6.5％(参见图4)。

实施例4.HPV16/18 L1蛋白的分离纯化

向培养96小时的感染重组杆状病毒的昆虫细胞中加入细胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)；15mmol/L NaCl；0.1mmol/L PMSF；0.1％NP40；5mmol/L EDTA)，超声波破碎细胞，并于4℃以10000g离心15分钟，去除细胞碎片。以100000g 4℃离心上清液90分钟。将所得的沉淀重悬于缓冲液A(50mM Tris，pH 8.0；1M NaCl；10mMMgCl₂；10mM CaCl₂；2mM PMSF；10ug/ml Leupeptin)中，然后加入5.2克的固体CsCl，并用缓冲液A将体积调整到13ml(CsCl终浓度为0.4g/ml)，进一步以100000g 4℃离心22小时，得到经纯化的HPV16和HPV18 L1蛋白。所得的蛋白通过SDS-PAGE进行鉴定，结果示于图5中。

也可通过蔗糖密度梯度离心纯化HPV16和HPV18L1蛋白。重组蛋白带出现在50-60％的蔗糖密度梯度上。具体的纯化方法如下：将上清液铺于30％的蔗糖溶液(溶于TBS中)上，以150000g，4℃离心6小时；获得的沉淀用50mM Tris-100mM NaCl重悬浮，并铺于20％-60％的蔗糖密度梯度溶液(溶于50mM Tris-100mM NaCl中)上，以150000g，4℃离心22小时；吸出目的灰白区带，并用缓冲液A稀释，然后通过100000g，4℃离心90分钟来沉淀纯化的HPV16/18 L1蛋白。

实施例5.HPV16/18 L1蛋白的形态观察

取经纯化的HPV16/18 L1蛋白液，滴铜网，用2％磷钨酸染色，并通过透射电镜进行观察。结果表明，HPV16/18 L1蛋白呈现为病毒样颗粒(Virus-like particles，VLP)，其直径约为52nm(参见图6)。

实施例6.通过Western印迹来检测重组HPV16/18 L1蛋白

分别使用抗HPV16 L1抗体(来源于SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司，sc-18052)和抗HPV18L1抗体(来源于abcam公司，ab31492)，通过Western印迹来检测纯化后的HPV16和HPV18 L1蛋白。Western印迹结果显示，分子量为59.4KD的HPV16 L1和分子量为63.7KD的HPV18 L1蛋白的特异性蛋白带(参见图7)，这表明所表达的HPV16和HPV18 L1蛋白具有良好的抗原性。

实施例7.用重组HPV16/18 L1蛋白免疫动物

用Bio-Rad Protein Assay试剂盒定量纯化的HPV16和HPV18 L1蛋白。分别将0.1μg、2μg或20μg的HPV16 L1蛋白和HPV18 L1蛋白吸附至0.5mg Al(OH)₃，以制备成三种剂量的HPV二价疫苗。使用制备的HPV二价疫苗，分别于0、2、4周通过肌肉注射来免疫Balb/c小鼠三次。最后一次免疫后三天，处死小鼠，并收集血清。

实施例8.HPV16/18假病毒颗粒的制备

分别将HPV16和HPV18的L1和L2基因(HPV16 L2的GeneBank登录号AF084952，HPV18 L2的GeneBank登录号DQ003068)克隆入pcDNA3.1载体(购自Invitrogen公司)，以构建pcDNA3.1-16L1、pcDNA3.1-16L2、pcDNA3.1-18L1和pcDNA3.1-18L2重组载体。将pcDNA3.1-16L1和pcDNA3.1-16L2共转染293FT细胞(购买于美国ATCC)；将pcDNA3.1-18L1和pcDNA3.1-18L2共转染293FT细胞。所得的细胞在37℃培养3-5天。收获细胞并反复冻融三次，进行氯仿抽提，并收集上清液。所得的上清液即为HPV16假病毒(pseudovirus 16，psV16)和HPV18假病毒(pseudovirus 18，psV18)颗粒，冻存备用。在96孔板培养的293FT细胞上对制备的假病毒psV16和psV18进行滴度测定。简言之，取假病毒种子液进行10倍系列稀释，每个稀释度接种8个培养孔；接种后的细胞在37℃培养5天，然后于荧光显微镜下观察每个培养孔的细胞内的荧光(参见图8)，计算假病毒的滴度。

实施例9.HPV16/18 L1蛋白的免疫原性分析

用纯化的HPV16/18 L1蛋白(于碳酸盐缓冲液中)过夜4℃包被96孔板。然后用PBST(PBS溶液+0.5％Tween-20)溶液洗涤板三次，加入PBS稀释的小鼠血清，37℃孵育1小时。孵育后，用PBST溶液洗涤板三次，加入HRP标记的抗小鼠IgG抗体(购买于KPL公司)，37℃孵育1小时。孵育后，用PBST溶液洗涤板三次，加入OPD底物显色液(柠檬酸0.51％，Na₂HPO₄·12H₂O 1.84％，邻苯二胺(OPD)0.05％，H₂O₂50μl)，避光显色10分钟。之后用2N H₂SO₄终止反应，并用酶标仪(BIO-RAD公司)测定492nm处的OD值。结果显示，HPV16/18 L1蛋白可以诱导机体产生特异性抗体，这表明重组HPV16/18 L1蛋白具有良好的免疫原性(参见表1)。

将小鼠血清按1∶500稀释，将稀释液分别与100PFU的假病毒psV16和psV18混和，并在37℃温育1小时。温育后，将假病毒加入到单层的293FT细胞上，并在37℃吸附1小时。吸附后，于37℃继续培养细胞7天。最后，通过荧光显微镜观察293FT细胞内的荧光。结果显示，抗HPV16/18 L1蛋白的小鼠血清可以与假病毒psV16和psV18结合，并抑制假病毒进入293FT细胞内产生荧光，这表明小鼠血清中含有抗HPV16/18 L1蛋白的中和抗体，其能够保护机体免受HPV16/18型病毒的感染(参见表2)。

表1.HPV16 L1疫苗的免疫原性测定

表2.HPV18 L1疫苗的免疫原性测定

Claims (8)

1.制备针对人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的二价疫苗的方法，其包括以下步骤：

1)分别优化HPV16和HPV18的L1蛋白的基因序列，优选HPV16和HPV18的L1蛋白的优化后的基因序列分别如SEQ ID NO.1和2所示；

2)将步骤1)中优化后的基因序列分别克隆入杆状病毒表达载体，以获得重组质粒，优选所述杆状病毒表达载体是pAcSG2；

3)用所述重组质粒，与相应的杆状病毒基因组一起，分别转染昆虫细胞，以获得重组杆状病毒，优选所述杆状病毒基因组是杆状病毒基因组AcNPV，所述昆虫细胞优选选自Sf-9细胞、Sf-21细胞和High Five细胞；

4)用所述重组杆状病毒分别感染新鲜培养的昆虫细胞；

5)从步骤4)的昆虫细胞分别分离纯化HPV16和HPV18的L1蛋白，并将其与佐剂混合制备成二价疫苗，所述佐剂优选选自氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂。

2.分离的核酸分子，其序列如SEQ ID NO.1所示。

3.分离的核酸分子，其序列如SEQ ID NO.2所示。

4.含有权利要求2或3的核酸分子的载体，所述载体优选是表达载体，更优选是杆状病毒表达载体，更优选是pAcSG2。

5.含有权利要求4的载体的细胞，所述细胞优选是昆虫细胞，更优选是Sf-9细胞、Sf-21细胞或High Five细胞。

6.权利要求2和/或3的核酸分子用于制备二价疫苗的用途，所述二价疫苗用于预防HPV16和HPV18的感染。

7.权利要求2的核酸分子用于制备HPV16的L1蛋白的用途。

8.权利要求3的核酸分子用于制备HPV18的L1蛋白的用途。

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