TR201803560T4 - Bitkiden türetilen proteinlerin hazırlanma metotları. - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş bitkiden türetilen proteinlerin hazırlanmasına yönelik metotlarla ilgilidir. Daha spesifik olarak, mevcut buluş, bitkilerden ve bitki dokularından proteinlerin, örneğin protein üst yapılarının elde edilmesine yönelik metotlar sağlar.

Description

TARIFNAME BITKIDEN TÜRETILEN PROTEINLERIN HAZIRLANMA METOTLARI BULUSUN ALANI Mevcut bulus bitkiden türetilen proteinlerin hazirlanmasina yönelik metotlarla ilgilidir. Daha spesifik olarak, mevcut bulus, bitkilerden ve bitki dokularindan proteinlerin, örnegin protein üst yapilarinin elde edilmesine yönelik metotlar saglar. BULUSUN ARKAPLANI E. coli, böcek hücre kültürü ve memeli hücre kültürü gibi konak hücrelerde mevcut rekombinant ifade stratejileri, proteinleri kültür ortaminda çok yüksek düzeyde ifade etmekte ve salgilamaktadir. Bu sistemler kullanilarak yüksek düzeyde ifade, uygun protein katlanmasi ve post-translasyonal protein modifikasyonu saglanir. Ayrica, ifade edilen proteinin saflastirilmasi basitlestirilir; çünkü hücre içi proteinler diger bilesenlerinden (DNA, kesecik, membranlar, pigmentler ve benzeri) kolaylikla ayrilabilir. Bitki veya maya ifade sistemlerinde, hücre duvari, ifade edilen proteinin kültür ortamina salgilanmasini engeller. Bilimde hücre ekstraktlarini üretmek için farkli yaklasimlar yaygin olarak kullanilmaktadir. Hücre duvarini bozmaya ve hücre içerigini serbest birakmaya yönelik mekanik yaklasimlar genellikle belirli protein sinifi veya hücresel bilesenler bakimindan seçici degildir. Iliskin bir proteinin ifadesinin hücre kültür ortamina yöneltilmesi, hücre içi kirleticilerin santrifügasyon veya filtreleme yoluyla uzaklastirilmasi iliskin proteinin basit ve hizli bir biçimde zenginlestirilmesine olanak tanir. Ayrica, iliskin protein üst yapisi asi formülasyonunda kullanilmadan önce iliskin bir proteinin veya protein üst yapisinin, örnegin rozetler (rosette), nanoparçaciklar, büyük protein kompleksleri, antikorlar veya virüs benzeri parçaciklar (VLP'Ier) ve benzerlerinin, bitki veya bitki maddesinde bulunan proteinler, DNA, membran fragmanlari, kesecikler, pigmentler, karbohidratlar ve benzerlerinin bazilarindan veya tamamindan ayrilmasi da istenebilir. Immünoglobülinler (IgG'Ier) çesitli yapilarda spesifik antijenik karsiliklar için karakteristik afiniteye sahip olan kompleks heteromultimerik proteinlerdir. Günümüzde, lgG üreten hücre hatlarinin rutin izolasyonu ve IgG tarafindan yönlendirilen evrim ve moleküler mühendislik için teknolojilerin gelistirilmesi bunlarin biyoterapötikler olarak ve genel olarak canli bilimleri pazarinda evrimini önemli ölçüde etkilemistir. Terapötik monoklonal egemendir ve yüzlerce yeni aday, gelismis veya özgün uygulamalar için günümüzde arastirma ve klinik gelistirme altindadir. mAb'ler için yillik market talebi birkaç gamdan (tanilayici) birkaç kilograma (antitoksin) ve hatta bir veya birkaç yüz kilograma (biyo- savunma, anti-kanser, anti-enfeksiyöz, anti-inflamatuvar) kadar degisiklik göstermektedir. Bitkilerden modifiye edilmis glikoproteinlerin üretim metotlari WO Bitkilerin hücreler arasi boslugundan protein ekstrakte etmeye yönelik olarak, iliskin proteini içeren bir intersitisyel sivi ekstrakti saglamak üzere bir vakum ve santrifügasyon prosesi Içeren bir metot PCT Yayini WO 00/09725 belgesinde (Turpen ve ark.) tarif edilmistir. Bu yaklasim vakum ve santrifügasyon altinda mikrofiber agi içerisinden geçen küçük proteinler (50 kDa veya daha küçük) için uygundur; ancak daha büyük proteinler, süper yapili proteinler, protein rozetleri, nanoparçaciklar, büyük protein kompleksleri, örnegin antikorlar veya VLP'ler için uygun degildir. McCormick ve ark., , ifade edilen proteini hücre disi bölüme hedeflemek için bir tek Zincirli Fv (scFv) epitopuna kaynasmis bir pirinç amilaz sinyal peptidinin kullanimini ve ardindan scFv polipeptitlerin geri kazanimi için yaprak ve gövde dokusunun vakum infiltrasyonunu açiklamaktadir. Moehnke et al., bir apoplastik ekstraksiyon kullanilarak bir rekombinant bitki alerjeni elde etmek üzere McCormick'in vakumlu infiltrasyon metodunun kullanimini tarif etmektedir. PCT Yayini WO , scFv immünoglobülinlerin bitkilerde ifadesini, murin sinyal sekanslari kullanilarak apoplastik bosluga hedeflemeyi açiklamaktadir. Fischer ve ark., 1999 (J Imm Meth 226:1-10) bir tütün süspansiyon kültüründen bir rekombinant tam boy antikorun afinite saflastirmasini açiklamaktadir. influenza asilarinin hazirlanmasinda virüs benzeri parçaciklar (VLP'ler) kullanilabilir. VLP'ler gibi üst yapilar viral kapsidin yapisini taklit eder; ancak bunlarin bir genomu eksiktir ve bu nedenle ikincil enfeksiyon için bir araci kopyalayamaz veya saglayamazlar. VLP'ler, güçlü bir bagisiklik yanitini stimüle etmek üzere, izole (çözünür) rekombinant antijenler için gelismis bir alternatif sunar. VLP'ler spesifik viral proteinlerin ifadesinin ardindan birlesir ve ayni kökenli virüslerine benzeyen bir dis yüzeye sahip olur; ancak gerçek viral parçaciktan farkli olarak genetik malzeme barindirmaz. Antijenlerin bir parçacik ve natif virüse benzeyen çok degerlikli bir yapi içine sunulmasi, bagisiklik yanitinin stimülasyonunun, dengeli humoral ve hücresel bilesenlerle birlikte gelistirilmesini saglar. Izole antijenler vasitasiyla stimülasyonda meydana gelen bu tür bir gelismenin özellikle zarfli virüsler için geçerli oldugu düsünülür; çünkü zarfli VLP'ler yüzey antijenlerini dogal membrana bagli durumlarinda sunar (Grgacic and Anderson, rekombinant hemaglutininle (HA) (yani, monomerik HA veya rozetler halinde düzenlenmis HA; karsilastirildiginda daha iyi asi adaylari olduklari ve hem hümoral hem de hücresel bagisiklik yanitini influenza VLP'ler, kültürlenmis memeli hücrelerinden tüm 10 influenza proteinlerinin üretiminde çok sayida viral protein önemsizdir ve asi gelistirme programlarinda influenza VLP'leri 2 ana antijenik zarf proteinin (HA ve NA) M1 ile birlikte ifadesinden veya yalnizca HA ve M1'in birlikte ifadesinden üretilmistir (Kang et al., 2009, Virus Res. olusumunu gerçeklestirebilecegini göstermistir ve öne sürdükleri sistemlerinde asilama ve M1 birlikte ifadesi çikarilabilmektedir. Ancak, HA'nin, VLP'leri üreten memeli hücrelerinin yüzeyi üzerindeki siyaliklesmis glikoproteinleri bagladigi bulundugundan dolayi, hücre asilamasinin ardindan üretim yapan hücreden VLP'lerin salimina olanak tanimak amaciyla bir viral siyalidaz birlikte ifade edilmistir. PCT Yayini WO belgesinde, bitkilerde lnfluenza A/Vietnam/1194/2004'ün tam boy ve basi kesik insan kodonuyla optimize ifadesi açiklanmaktadir. Basi kesik yapida membran demirleme alani eksiktir. En yüksek HA protein birikimi ER'ye hedeflenmis olan yapilarla elde edilmistir. Bir membran hedefleme alani olmayan yapilar saptanabilir HA vermemistir. VLP'Ierin üretimi rapor edilmemistir. belgelerinde ve D'Aoust ve ark. tarafindan tarif edilmistir Zarfli virüslerde, bir lipit katmani veya membranin virüs tarafindan tutulmasi avantajli olabilir. Lipidin bilesimi sisteme göre degisiklik gösterebilir (öm., bir bitkiden türetilen zarfli virüs, zarfin içinde bitki Iipitlerini veya fitosterolleri içerebilir) ve gelismis bir bagisiklik yanitina katkida bulunabilir. Zarfli VLP'Ierin, HBV yüzey antijenini (HBsAg) ifade eden transgenik tütün içinde birlesmesi Mason ve ark. tarafindan tarif edilmistir (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, farelerde etkili B- ve T-hücre bagisiklik yanitlarini baslattiklari gösterilmistir (Huang et bagisiklik yetmezligi virüsü (HIV) epitoplarinin, transgenik tütün ve Arabidopsis içinde ifade edildiginde VLP olarak biriktigini ve bir çift degerlikli VLP asisi ürettigini göstermistir. Viral kapsit proteinin (NVCP) transgenik tütün ve patates bitkileri içinde ifadesi zarfsiz VLP'Ierin birlesmesiyle sonuçlanmistir (Mason et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA oral uygulamanin ardindan immünojenikligi gösterilmistir (Santi et al., 2008, Vaccine 26, saglikli yetiskin gönüllülere uygulanmasi, immünize edilen gönüllülerin %95'inde bir bagisiklik yanitinin gelismesiyle sonuçlanmistir (Tacket et al. 2000, J. lnfect. Dis. 182. ana kapsit protein L1'in (Varsani et al., 2003, Daha basit bir protein veya protein üst yapisi üretim sistemi, örnegin, yalnizca bir veya birkaç proteinin ifadesine dayali bir sistem arzu edilir. Proteinlerin veya protein üst yapilarinin, örnegin, sinirlandirma olmaksizin rozetler, nanoparçaciklar, büyük protein kompleksleri, örnegin antikorlar veya VLP'Ier, bitki sistemlerinde üretilmesi, bitkilerin bir sera veya tarlada yetistirilebilmesinden ve aseptik doku kültür metotlari ve idaresi gerektirmemesinden dolayi avantajlidir. Bitki proteinlerini büyük Ölçüde içermeyen veya bunlardan kolaylikla ayrilan, ancak yine de proteinin yapisini ve özelliklerini koruyan proteinler veya protein üst yapilarinin hazirlanma metotlari arzu edilir. BULUSUN ÖZETI Mevcut bulusun kapsami ekte verilen istemlerle tanimlanmaktadir. Mevcut bulus bitkiden türetilen proteinlerin hazirlanmasina yönelik metotlarla ilgilidir. Daha spesifik olarak, mevcut bulus, bitkilerden ve bitki dokularindan proteinlerin, örnegin protein üst yapilarinin elde edilmesine yönelik metotlar saglar. Mevcut bulusun bir amaci bitkiden türetilen proteinlerin hazirlanmasina yönelik gelismis bir metodun saglanmasidir. Mevcut bulus bitkiden türetilen proteinler veya proteinler veya üst yapi proteinlerinin hazirlanmasina yönelik bir metot (A) saglamakta olup, bu metot apoplast içinde lokalize edilmis olan bitkiden türetilen proteinleri veya üst yapi proteinlerini içeren bir bitki veya bitki maddesinin elde edilmesini; bir protoplast ve bir apoplast fraksiyonunun üretilmesini, apoplast fraksiyonunun bitkiden türetilen proteinler ya da üst yapi proteinler içermesini; ve apoplast fraksiyonun geri kazanilmasini içerir. Bu metot ayrica bitkiden türetilen proteinler ya da proteinler ya da üst yapi proteinlerin, apoplast fraksiyondan saflastirilmasi adimini da içerebilir. Bitkiden türetilen proteinler ya da proteinler ya da üst yapi proteinler kimerik bitkiden türetilen proteinler veya üst yapi proteinler olabilir. Bitkiden türetilen proteinler ya da proteinler ya da üst yapi proteinler bikiye heterolog olabilir. Bitkiden türetilen proteinler ya da proteinler ya da üst yapi proteinler, bir protein rozeti, bir protein kompleksi, bir proteazom, bir metabolon, bir transkripsiyon kompleksi, bir rekombinasyon kompleksi, bir fotosentetik kompleks, bir membran tasima kompleksi, bir nükleer gözenek kompleksi, bir protein nanoparçacigi, bir glikoprotein, bir antikor, bir poliklonal antikor, bir monoklonal antikor, bir tek zincirli monoklonal antikor, bir virüs benzeri parçacik, bir viral zarf proteini, bir viral yapisal protein, bir viral kapsit protein, bir viral kaplama proteini, bir kimerik protein, bir kimerik protein kompleksi, bir kimerik protein nanoparçacigi, bir kimerik glikoprotein, bir kimerik antikor, bir kimerik monoklonal antikor, bir kimerik tek zincirli monoklonal antikor, bir kimerik hemaglutinin, bir viral zarf proteini, bir viral yapisal protein, bir viral kapsit protein ve bir viral kaplama proteini içerebilir. Bitkiden türetilen monoklonal antikor bir kimerik fare insan monoklonal antikoru, örnegin, sinirlandirma olmaksizin 0288 içerebilir. Bitkiden türetilen VLP'ler influenza hemaglutinin içerebilir. Apoplast ve protoplast fraksiyonlar, bitki veya bitki maddesiin bir enzim bilesimiyle isleme tabi tutulmasiyla birlikte üretilebilir. Enzim bilesimi bir ya da daha fazla selülaz veya bir ya da daha fazla pektinaz ve bir ya da daha fazla selülaz içerir. Ayrica, istendigi takdirde, enzim bilesimi bir lipaz veya proteaz içermez veya bilesim ilave edilen bir lipaz veya proteaz içermez. Bitki veya bitki maddesi bitkinin yetistirilmesiyle, hasat edilmesiyle veya yetistirilip hasat edilmesiyle elde edilebilir. Bitki maddesi bitkinin bir kismini veya tamamini ya da yapraklar, gövdeler veya köklerden bir veya daha fazlasini içerebilir. Mevcut bulus yukarida tarif edilen sekilde (Metot A) bitkiden türetilen proteinler ya da proteinler ya da üst yapi proteinlerin hazirlanmasina yönelik bir metot saglamakta olup, içerisinde proteinler veya üst yapi proteinleri kodlayan bir nükleik asit, bitkiye geçici bir sekilde sunulur. Alternatif olarak, nükleik asit bitkinin bir genomu içine stabil olarak entegre edilir. Mevcut bulus yukarida tarif edilen sekilde (Metot A) bitkiden türetilen proteinler ya da üst yapi proteinlerin hazirlanmasina yönelik bir metot saglamakta olup, ayrica bitkiden türetilen proteinler ya da üst yapi proteinlerin apoplast fraksiyondan saflastirilmasi adimini da içerir. Saflastirma adimi, durultulmus bir ekstrakt üretmek üzere derinlik filtrasyonu kullanilarak apoplast fraksiyonun filtrelenmesini ve ardindan durultulan ekstraktin bir katyon degistirici reçine, afinite kromatografisi, büyüklük dislanimli kromatografi veya bunlarin bir kombinasyonu kullanilarak kromatografisini içerebilir. Teoriyle sinirli kalmaksizin, apoplasttan elde edilen proteinler daha homojendir; çünkü post-translasyonal olarak modifiye edilen proteinlerin ara ürün biçimleri veya çesitli hücre içi bölümlerde, örnegin mitokondriya, kloroplast ve diger organellerde meydana gelen diger isleme tiplerini içeren proteinler birlikte ekstrakte edilmez. Bir rekombinant proteinin daha yüksek düzeyde homojenligi tipik olarak proteini içeren preparasyonun daha yüksek kalitede olmasini saglar ve daha etkili olma, daha uzun ömürlü olma veya daha iyi immünojenik kapasiteye sahip olma gibi yararli özelliklere sahip olan bir ürün saglayabilir. Örnegin, yüksek mannoz glikozilasyonu içeren kan proteinleri kari dolasimindan, kompleks glikozilasyon içeren proteinlere göre daha hizli elimine edilir. Apoplastik fraksiyonda üretilen glikozile bir protein daha kompleks türde glikozilasyon gösterir. Bu nedenle, burada tarif edilen metotlar, örnegin hücre duvari sindirimi/parçalanmasi kullanilarak hazirlanan apoplasttan türetilmis bir protein, örnegin dolasimda daha iyi bir yari ömür gösterir. Bitkiden türetilen proteinler veya üst yapi proteinleri protein rozetleri, protein kompleksleri, protein nanoparçaciklari, antikorlar, monoklonal antikorlar, VLP'Ieri içerebilir. VLP'Ier bir ya da daha fazla influenza HA polipeptitlerini içerebilir. Üst yapi proteini bir kimerik üst yapi proteini olabilir, örnegin monoklonal antikor bir kimerik monoklonal antikor olabilir veya influenza HA polipeptidi bir kimerik HA polipeptidi olabilir. Üst yapi proteini bir VLP'dir ve bitkiden türetilen VLP ayrica hemaglutine edici aktivite içerebilir. Bitki veya bitki maddesi bitkinin yetistirilmesiyle, hasat edilmesiyle veya yetistirilip hasat edilmesiyle elde edilebilir. Bitki maddesi bitkinin bir kismini veya tamamini ya da yapraklar, gövdeler veya köklerden bir veya daha fazlasini içerebilir. Mevcut bulus ayrica bitkiden türetilen proteinler veya üst yapi proteinlerin hazirlanmasina yönelik bir metot (B) saglamakta olup, bitkiden türetilen proteinleri veya üst yapi proteinlerini içeren bir bitki veya bitki maddesinin elde edilmesini; bitki maddesinin bir hücre duvari parçalayici enzim bilesimi kullanilarak sindirilmesini ve böylece bir sindirilmis/parçalanmis fraksiyon üretilmesini; ve parçalanan fraksiyonun filtrelenmesini ve böylece bir filtrelenmis fraksiyon üretilmesini ve bitkiden türetilen proteinler ya da üst yapi proteinlerin, bu filtrelenmis fraksiyondan geri kazanilmasini Enzim bilesimi bir ya da daha fazla selülaz veya bir ya da daha fazla pektinaz ve bir ya da daha fazla selülaz içerir. Ayrica, istendigi takdirde, enzim bilesimi bir Iipaz veya proteaz içermez veya bilesim ilave edilen bir Iipaz veya proteaz içermez. Bitkiden türetilen üst yapi proteini bir kimerik bitkiden türetilen üst yapi proteini olabilir. Bitkiden türetilen protein üst yapisi, bir protein rozeti, bir protein kompleksi, bir proteazom, bir metabolon, bir transkripsiyon kompleksi, bir rekombinasyon kompleksi, bir fotosentetik kompleks, bir membran tasima kompleksi, bir nükleer gözenek kompleksi, bir protein nanoparçacigi, bir glikoprotein, bir antikor, bir poliklonal antikor, bir monoklonal antikor, bir tek Zincirli monoklonal antikor, bir virüs benzeri parçacik, bir viral zarf proteini, bir viral yapisal protein, bir viral kapsit protein, bir viral kaplama proteini, bir kimerik protein, bir kimerik protein kompleksi, bir kimerik protein nanoparçacigi, bir kimerik glikoprotein, bir kimerik antikor, bir kimerik monoklonal antikor, bir kimerik tek Zincirli monoklonal antikor, bir kimerik hemaglutinin, bir viral zarf proteini, bir viral yapisal protein, bir viral kapsit protein ve bir viral kaplama proteini içerebilir. Bitkiden türetilen monoklonal antikor bir kimerik fare insan monoklonal antikoru, örnegin, sinirlandirma olmaksizin 0288 içerebilir. Bitkiden türetilen VLP'ler influenza hemaglutinin içerebilir. Mevcut bulus yukarida tarif edilen sekilde (Metot B) bitkiden türetilen proteinler ya da üst yapi proteinlerin hazirlanmasina yönelik bir metot saglamakta olup, içerisinde proteinler veya üst yapi proteinleri kodlayan bir nükleik asit, bitkiye geçici bir sekilde sunulur. Alternatif olarak, nükleik asit bitkinin bir genomu içine stabil olarak entegre edilir. Mevcut bulus yukarida tarif edilen sekilde (Metot B) bitkiden türetilen VLP'lerin hazirlanmasina yönelik bir metot saglamakta olup, ayrica filtrelenmis fraksiyon içindeki proteinler ya da üst yapi proteinlerin, hücre kalintisindan ve çözünmez malzemelerden ayrilmasi adimini içerir. Ayirma adimi santrifügasyonla, derinlik filtrasyonuyla veya hem santrifügasyon hem de derinlik filtrasyonu ile yapilarak durultulmus bir fraksiyon üretilir. Bitkiden türetilen proteinler veya üst yapi proteinler ayrica kromatografiyle saflastirilabilmekte olup, örnegin temizlenen ekstrakt bir katyon degistirici reçine, bir afinite reçine, büyüklük dislanimli kromatografi veya bunlarin bir kombinasyonu kullanilarak saflastirilabilir. Bitkiden türetilen proteinler veya üst yapi proteinleri protein rozetleri, protein kompleksleri, protein nanoparçaciklari, glikoproteinler, antikorlar, monoklonal antikorlar, VLP'Ieri içerebilir. VLP'Ier bir ya da daha fazla influenza HA polipeptitlerini içerebilir. Üst yapi proteini bir kimerik üst yapi proteini olabilir, örnegin monoklonal antikor bir kimerik monoklonal antikor olabilir veya influenza HA polipeptidi bir kimerik HA polipeptidi olabilir. Üst yapi proteini bir VLP'dir ve bitkiden türetilen VLP ayrica hemaglutine edici aktivite içerebilir. Teoriyle sinirli kalmaksizin, bitkiden türetilen lipitler içeren bitkiden elde edilen VLP'Ier, diger üretim sistemlerinde elde edilen VLP'Ierden daha kuvvetli bir bagisiklik yaniti baslatabilir ve bu bitkiden elde edilen VLP'Ier tarafindan baslatilan bagisiklik yaniti, canli veya atenüe tam virüs asilariyla baslatilan bagisiklik yanitiyla karsilastirildiginda daha güçlüdür. Bir konak hücreden elde edilen bir protein ekstraktinin bilesimi komplekstir ve tipik olarak izole edilecek olan iliskin bir protein veya üst yapiyla birlikte hücreler arasi veya hücre içi bilesenler içerir. Bir apoplastik fraksiyonun hazirlanisi ve ardindan gelen hücre içi proteinler ve bilesenlerin ayrilmasi adimi avantajlidir; çünkü iliskin protein veya üst yapi zenginlestirilebilir ve bir üretim prosesinde etkinligi arttirabilir. Daha az sayida etkili adima sahip olan daha basit bir prosese sahip olunmasi verimde önemli düzeyde artislar ve maliyette azalma saglayabilir. Ayrica, hücre duvari bozucu enzimler kullanilarak hücre duvarinin parçalanmasi prosesinin, ekstraksiyon prosedürü sirasinda protoplastlarin bütün halde kalmamasi durumunda bile üst yapi protein verimini arttirdigi da bulunmustur. Teoriyle sinirli kalmaksizin, hücre duvari bozma adimi hücre duvarinin polimerik bilesenlerini gevsetebilir ve aksi takdirde hücre duvari içinde kalacak olan proteinler ya da üst yapi proteinlerinin salimina yardimci olabilir. Bu protokol ayrica proteinler ya da üst yapi proteinlerinin, hücre içi bilesenlerin içinde kirlenmesini de en aza indirebilir. Bitki hücre duvarini parçalama metotlari bilinmektedir ve hücre duvarlarini parçalayan enzim kokteyl karisimlari degisiklik gösterebilir. Burada tarif edilen metotlar, bitkiden türetilen üst yapi proteininin hazirlanmasi için kullanilan ve homojenizasyon, harmanlama veya ögütme içeren metotlarla karsilastirildiginda, daha az bozulmaya ve bitkiden türetilen üst yapi proteininde daha az kirlenmeye yol açar. Burada tarif edilen metotlar bitki dokusunun bir apoplast fraksiyonunu saglar ve bu da protoplastlar ve bunlarin bilesenlerinin bütünlügünü koruyabilir. Burada tarif edilen sekildeki metot, protoplastlarin veya protoplastlarin bir kisminin bütünlüklerini kaybetmeleri ve daha fazla bütün halde (intakt) kalamamalari durumunda bile proteinler veya üst yapi proteinlerin saflastirilmasinda etkilidir. Bu metotlar, örnegin homojenizasyon, harmanlama veya ögütme gibi standart doku bozma tekniklerini içeren üst yapi proteinlerin ekstraksiyon metotlariyla karsilastirildiginda daha yüksek protein veya üst yapi proteini verimi saglar. Daha yüksek verim kismen proteinlerin veya üst yapi proteinlerinin ve VLP'Ierde lipit zarfin yapisal bütünlügünü bozan kesme kuvvetlerinin azalmasindan kaynaklaniyor olabilir. Bir apoplastik fraksiyondan proteinler veya üst yapi proteinlerin hazirlanmasi avantajli olabilir; çünkü apoplastik fraksiyonlarda sitoplazmik proteinler büyük ölçüde azaltilmistir veya sitoplazmik protein içermezler. Bu nedenle, üst yapi proteinin diger proteinler ve maddelerden, örnegin monomerler. dimerler, trimerler veya üst yapi proteininin fragmanlarindan apoplastik fraksiyonda ayrilmasi kolaylikla gerçeklestirilir. Ancak, protoplast preparasyonu veya protoplast preparasyonunun bir kismi intakt olmasa bile, burada tarif edilen metotlar kullanilarak proteinler veya üst yapi proteinlerin verimlerinde artis da elde edilebilir. Apoplasta salgilanan glikoproteinler, örnegin üst yapi glikoproteinleri, örnegin monoklonal antikorlar, hücre duvarini sindirmeyen ekstraksiyon metotlarina, örnegin blender ekstrakte edilmis bitkilere kiyasla, olgunlasmalarini tamamlamis olan daha yüksek yüzdede N-glikanlar içerir ve terminal N-asetilglükozamin veya galaktoz kalintilari (kompleks N-glikanlar) içerir. Kompleks N glikanlar içeren üst yapi glikoproteinleri, örnegin monoklonal antikorlarin, terminal mannoz kalintilari (olgunlasmamis N glikanlar) içeren monoklonal antikorlarla karsilastirildiginda, kan dolasiminda yari ömrünün arttirilmis olmasi seklinde yararli özellik gösterdigi bulunmustur. Hücre duvarinin enzimatik parçalamasi kullanilarak, olgunlasmalarini tamamlamis olan N-glikanlar içeren bir apoplastik antikor havuzunun serbest birakilmasi mümkün olabilir. Bu ekstraksiyon metodu, kompleks N-glikanlar tasiyan glikozile antikorlarin zenginlestirilmis bir popülasyonunun veya homojen bir popülasyonunun geri kazanilmasina, glikozile antikorlarin protoplast fraksiyonundaki olgunlasmamis formlarinin ayrilmasina olanak taniyabilir. Olgunlasmamis N-glikanlar tasiyan antikor havuzu istenmesi halinde, protoplast fraksiyonu korunabilir ve antikorlar protoplast fraksiyonundan saflastirilabilir. Mevcut bulusun VLP'leri ayrica standart doku bozucu teknikler kullanilarak elde edilenden daha büyük bir hemaglutine edici aktivite göstermeleriyle de karakterize edilir. Bu gelismis hemaglutine edici aktivite intakt VLP'lerin veriminin artmasindan (çözeltide serbest HA monomer veya trimerlerinin azalmasi), intakt Iipit zarfli intakt VLP'lerin veriminin artmasindan veya bunlarin bir kombinasyonundan kaynaklanabilir. VLP'ler kullanilarak yapilan asilar, tam virüslerden yapilan asilarla karsilastirildiginda, enfeksiyöz olmama avantaji saglar. Bu nedenle, biyolojik kapsama önemli degildir ve üretim için gerekli degildir. Bitkiden elde edilen VLP'ler ayrica ifade sisteminin bir sera veya tarlada yetistirilmesine olanak taniyarak önemli ölçüde daha ekonomik ve ölçek büyütmeye uygun olma avantajini saglar. Ayrica, bitkiler, siyalik asit kalintilarinin sentezlenmesinde ve proteinlere eklenmesinde rol oynayan enzimler içermez. VLP'ler ortamda nöraminidaz (NA) yokken üretilebilir ve bitkilerde VLP üretimini saglamak için NA'yi birlikte ifade etmeye veya üretim yapan hücreler ya da ekstraktin siyalidazla (nöraminidaz) isleme tabi tutulmasina gerek duyulmaz. Mevcut bulusun bu özetinin, bulusun tüm özelliklerini tarif ettigi düsünülmemelidir. SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulusun bu ve diger özellikleri asagidaki tarifnameyle birlikte daha anlasilir hale gelecek olup, içerisinde ekte verilen sekillere referansta bulunulmaktadir: Sekil 1 H5 A/Indonesia/5/05 hemaglutinin ifadesi için CPMVHT bazli ifade kasetinin (yapi 685) sematik bir temsilini göstermektedir. Sekil 2A) Pacl'dan (358 promotörün yukarisi) Asol'ya (NOS sonlandiricinin hemen asagisina) H5/Indo (yapi No 685) ifade etmek için yapinin bir kisminin nükleik asit sekansini (SEKANS lD NO: 1) göstermektedir. A/Indonesia/5/2005'ten H5'In kodlama sekansinin alti çizilidir. Sekil 23 Yapi No 685 tarafindan kodlanan H5 A/lndonesia/5/05 hemaglutinin amino asit sekansini (SEKANS ID NO: 2) göstermektedir. Sekil 3 Hemaglutinin (HA) içeren yapilarin büyüklük dislanimli kromatografiyle (SEC) karakterizasyonunu göstermektedir. Parçalanan bitki ekstraktinin santrifügasyonunun ardindan, pelet yeniden askiya alinmis ve SEO ile fraksiyonlara ayrilmistir. Sekil 3A Fraksiyon basina düsen toplam çözünür protein içerigini göstermektedir (içi dolu üçgenler; maksimumun %'si, sol taraf Y ekseni; Bradford metodu kullanilarak belirlenmistir). Toplanan fraksiyonlarin hemaglutine edici aktivitesi de ayrica gösterilmektedir (içi dolu çubuklar; sag taraf Y ekseni). Sekil 38 SEÇ ile ayristirilan fraksiyonlarin SDS-PAGE analizini göstermektedir. Fraksiyonlar aseton ile çökeltilmis ve analizden önce 1/40 hacimli indirgeyici numune yükleme tamponu içinde yeniden askiya alinmistir. Jel %O.1 Coomassie R-250 çözeltisiyle boyanmistir. Saflastirilan VLP'Ier kontrol olarak denenmistir. HAO monomerine denk düsen bant okla gösterilmektedir. MW - Moleküler agirlik standartlari (kDa); C - Saflastirilmis VLP'Ier (kontrol); serit 7 ila ve 14 ila 16, Sekil 3A'da gösterilen SEC analizinden ayristirilan fraksiyonlara denk Sekil 4 Enzimatik sindirim/parçalama ve bir ComitrolT'V' homojenizör kullanilarak yapilan mekanik homojenizasyonun ardindan elde edilen protein profillerinin karsilastirmasini göstermektedir. Numuneler denistirici numune yükleme tamponu içinde isleme tabi tutulmus ve proteinler elüsyon fraksiyonlarinin SDS-PAGE analiziyle ayrilmistir. Jeller %0.1 Coomassie R-25O çözeltisiyle boyanmistir. MW - Moleküler agirlik standartlari (kDa); serit 1 - 25 pl enzim karisimi; serit 2 - 25 ul bitki dokusunun enzimatik karisimi ve serit 3 - Comitrol homojenizör ile elde edilen 5 ul ekstrakt. Sekil 5 Alfalfa plastosiyanin promotör ve 5' UTR, H5'in A/Indonesia/5/2005'ten (Yapi No 660) hemaglutinin kodlama sekansi, alfalfa plastosiyanin 3' UTR ve sonlandirici sekanslar içeren bir HA ifade kasetinin nükleik asit sekansini (SEKANS lD NO: 9) göstermektedir. Sekil 6 HA-VLP'nin katyonik degistirici reçine üzerinde HA-VLP'nin, apoplastik fraksiyonda HA-VLP'nin ayrilmasindan dogrudan yakalanmasini göstermektedir. Numuneler indirgeyici olmayan, denistirici numune yükleme tamponu içinde isleme tabi tutulmus ve proteinler SDS-PAGE analiziyle ayrilmistir. Jeller %O.1 Coomassie R-250 çözeltisiyle boyanmistir. Serit 1: Santrifügasyonun ardindan apoplastik fraksiyon, Serit 2-3: Art arda mikrofiltrasyonun ardindan apoplastik fraksiyon; Serit 4: Katyonik degisim yükü; Serit 5: Katyonik degisimin akim yönü fraksiyonu. Serit 6; katyonik degisimden elüsyon, konsantre 10X; Serit 7: Moleküler agirlik standartlari (kDa). Sekil ?Sindirim tamponuna NaCI eklemeden yapilan durultmanin ardindan H5/Indo VLP ( Sekil 7A) ve HI/Cal VLP (Sekil 78) için ve bu ekleme yapilarak H1/Cal VLP (Sekil 7C) için Nanoparçacik Izleme Analiz (NTA) profilini göstermektedir. NTA deneyleri NanoSight LM20 (NanoSight, Amesbury, UK) ile gerçeklestirilmistir. Alet bir mavi lazerle (405 nm), bir numune haznesiyle ve bir Viton floroelastomer o-halka ile donatilmistir. Videolar oda sicakliginda kaydedilmis ve NTA 2.0 yazilimi kullanilarak incelenmistir. Numuneler 60 saniye boyunca kaydedilmistir. Perde ve artis manüel olarak seçilerek optimal parçacik rezolüsyonu elde edilmistir. Sekil 8 Farkli tamponlar kullanilarak yapilan enzimatik parçalama ile olusturulan H3/Brisbane VLP ekstraktinin bir Western blotunu göstermektedir. Serit 1) Saf asagidaki tamponlarda gerçeklestirilen 7 ul santrifüjlenmis enzimatik ekstrakt içerir: Serit EDTA + 0.03% bisülfit pH6.2. Ok HAO'nun immünosaptama sinyalini temsil eder. Sekil 9, yapi No. 590'in kurulumu için sentezlenen DNA fragmaninin sekansini gösterir (LC fragmani; SEKANS ID NO: 15). Sekil 10, yapi No. 592'nin kurulumu için sentezlenen DNA fragmaninin sekansini gösterir (HC fragmani; SEKANS lD NO: 16). yapilarinin sematik temsillerini gösterir. Sekil 12, hücre duvarlarinin mekanik bozulumu (blender ekstraksiyonu) ve enzimatik parçalamasi ile üretilen ekstraktlardan saflastirilan antikorlarin SDS-PAGE karsilastirmasini gösterir. Her bir ekstraksiyon metodunda, iki parti islenmis ve bagimsiz olarak saflastirilmistir. Sekil 13A, C288 üzerinde, mekanik bozunma (blender ekstraksiyonu) ve hücre duvarlarinin enzimatik parçalamasi ile saflastirilan oligomannozidik N-glikanlarin oraninin karsilastirmasini göstermektedir. Sekil 138, 0288 üzerinde, mekanik bozunma (blender ekstraksiyonu) ve hücre duvarlarinin enzimatik parçalamasi ile saflastirilan kompleks N-glikanlarin oraninin karsilastirmasini göstermektedir. BULUSUN AYRINTILI AÇIKLAMASI Mevcut bulus bitkiden türetilen proteinlerin hazirlanmasina yönelik metotlarla ilgilidir. Daha spesifik olarak, mevcut bulus bitkilerden ve bitki dokularindan proteinler veya proteinler veya üst yapi proteinlerin elde edilmesine yönelik metotlar saglar. Asagida tercih edilen bir uygulamanin tarifi verilmektedir. Mevcut bulus bir proteinin veya iliskin proteinin üst yapisinin elde edilmesine yönelik bir metot saglar. Iliskin protein apoplastta veya bitki hücresinin protoplast/sferoplast haricindeki bölümüne denk düsen hücre disi bölümünde bulunabilir. Metot bitki hücrelerini çevreleyen selülozik bitki hücre duvarinin uzaklastirilmasini, parçalanmasini veya hem parçalanip hem de uzaklastirilmasini içerir. Hücre duvarinin parçalanmasiyla birlikte, hücre duvarinin polimerik bilesenleri gevsetilir ve iliskin protein veya proteinler veya proteinler ya da üst yapi proteinleri daha kolaylikla salinabilir. Bu metot kullanilarak, temel olarak konak hücre proteinlerini ve bilesenlerini içeren protoplast/sferoplast bölümü apoplasttan ayrildigindan dolayi, iliskin protein veya proteinler ya da proteinler veya üst yapi proteinleri zenginlestirilmis olur. Asagida belirtildigi gibi, proses sirasinda protoplast/sferoplast bölümünün bütünlügünün kaybolmasi, protoplast/sferoplast bölümünün intakt olmamasi halinde ve protoplast/sferoplast bölümünden konak hücre proteinleri ve bilesenlerinin bir kisminin apoplast fraksiyonunda bulunmasi halinde, burada saglanan metot iliskin bir protein veya protein üst yapisinin elde edilmesinde yine de etkili olur. Asagida tarif edilen metotlar kullanilarak, protoplast/sferoplast bölümünün bütünlügü kaybolmus ise, protein veya protein üst yapisi hala saglam organellerden, örnegin mitokondriya, kloroplast ve diger organellerden ayrilabilir ve hala yararli sonuçlar elde edilebilir. bitki veya bitkinin bir kismi içinde ifade edilmek üzere bir nükleotit sekansi veya kodlama bölgesi tarafindan kodlanmis olan bir protein veya protein alt birimi anlatilmak istenmektedir. Proteinler yaklasik 1 ila yaklasik 100 kDa arasinda veya bunlarin arasindaki herhangi bir miktardaki düzeyde bir moleküler agirliga sahip olabilir. Bir protein monomerik, dimerik, trimerik veya multimerik olabilir. Bir protein üst yapisi, ayrica üst yapi proteini, protein superstrüktürü veya süperstrüktür protein olarak da adlandirilmakta olup, iki veya daha fazla polipeptitten olusan bir protein yapisidir. Polipeptitler ayni ya da farkli olabilir ve farkli olmalari halinde, yaklasik 1:1 ila yaklasik 10:1 veya daha büyük bir oranda bulunabilirler. Üst yapi proteinleri arasinda, sinirlandirma olmaksizin protein rozetleri, protein kompleksleri, protein nanoparçaciklari, glikoproteinler, antikorlar, poliklonal antikorlar, monoklonal antikorlar, tek zincirli monoklonal antikorlar ya da virüs benzeri parçaciklar, proteazomlar, metabolonlar, transkripsiyon kompleksleri, rekombinasyon kompleksleri, fotosentetik kompleksler, membran tasima kompleksleri, nükleer gözenek kompleksleri, kimerik proteinler, kimerik protein kompleksleri, kimerik protein nanoparçaciklari, kimerik glikoproteinler, kimerik antikorlar, kimerik monoklonal antikorlar, kimerik tek zincirli monoklonal antikorlar ya da kimerik hemaglutinin (HA) bulunur. Bitkiden türetilen protein üst yapisinin bir VLP olmasi durumunda, VLP viral zarf proteinleri, viral yapisal proteinler, viral kapsid proteinleri ve viral kaplama proteinleri grubundan seçilebilir. Bitkiden türetilen VLP'ler influenzayi (HA) içerebilir. Tipik olarak, bir protein üst yapisi (protein süperstrüktürü), birlestiginde, büyük olup, örnegin moleküler agirligi 75 kDa'nin üzerinde, örnegin yaklasik 75 kDa ila yaklasik 1500 kDa düzeyinde veya bunlarin arasindaki herhangi bir moleküler agirliktadir. bunlarin arasindaki herhangi bir miktarda olabilir. Protein üst yapisini olusturmak üzere birlesen alt birimler daha küçük moleküler agirliga sahip olabilmekte olup, her bir alt birimin moleküler agirligi yaklasik 1 kDa ila yaklasik 500 kDa arasinda veya bunlarin arasindaki herhangi bir miktardadir. Bir protein üst yapisi, hidrojen bagli bir ya da daha fazla amino asitle birlikte ikincil bir yapi, örnegin protein sarmallari içinde kalintilar, 3 boyutlu bir konfigürasyona sahip üçüncül bir yapi veya çok alt birimli bir kompleks olusturan çok katli proteinler veya sarmal protein molekülleri seklinde bir düzenlemeye sahip dördüncül bir yapi gösteren bir protein içerebilir. Bir çoklu protein kompleksi (veya bir protein kompleksi) iki ya da daha fazla iliskili polipeptit zincirinden olusan bir grup içerebilir. Farkli polipeptit zincirlerinin farkli protein alanlari içermesi durumunda, elde edilen çoklu protein kompleksi çoklu katalitik fonksiyonlara sahip olabilir. Protein kompleksi ayrica, tek bir polipeptit zinciri içinde çok sayida katalitik alan içeren bir çok enzimli polipeptit de olabilir. Protein kompleksleri tipik olarak dördüncül yapi biçimindedir. Standart izolasyon protokolleri kullanilarak tipik olarak saglam kalmayabilecek, ancak burada tarif edilen metotlar kullanilarak elde edilebilecek olan protein komplekslerinin örnekleri arasinda proteazomlar (peptitler ve proteinlerin degradasyonu için), metabolonlar (oksidatif enerji üretimi için), ribozomlar (protein sentezi için; örnegin, Pereira-Leal,J.B.; et. al., 2006, Philos Trans R 800 Lond B rekombinasyon kompleksleri, fotosentetik kompleksler, membran tasima kompleksleri, nükleer gözenek kompleksleri bulunur. Mevcut metot stabil veya zayif protein alani - protein alani etkilesimlerine sahip olacak sekilde karakterize edilen protein komplekslerinin elde edilmesinde kullanilabilir. Bir protein veya protein üst yapisinin örnekleri arasinda, sinirlandirma olmaksizin, bir endüstriyel enzim, örnegin selülaz, ksilanaz, proteaz, peroksidaz, subtilisin, bir protein takviyesi, bir nutrasötikal, bir katma degerli ürün veya bunlarin yem, gida veya hem yem hem de gida kullanimina yönelik bir parçacigi, farmasötik olarak aktif bir protein, örnegin, sinirlandirma olmaksizin, büyüme faktörleri, büyüme düzenleyiciler, antikorlar, antijenler ve bunlarin parçaciklari veya bunlarin immünizasyon veya asilama için kullanisli türevleri ve benzerleri bulunur. Diger iliskin proteinler arasinda, sinirlandirma olmaksizin, interlökinler, Örnegin lL-1 ila IL-24, IL-26 ve IL-27'den bir ya da daha fazlasi, sitokinler, eritropoietin (EPO), insülin, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF ya da bunlarin kombinasyonlari, interferonlar, örnegin, interferon-alfa, interferon-beta, interferon-gama, kan pihtilayici faktörler, örnegin, Faktör VIII, Faktör IX ya da tPA hGH, reseptörler, reseptör agonistler, antikorlar, nöropolipeptitler, insülin, asilar, büyüme faktörleri, örnegin, sinirlandirma olmaksizin, epidermal büyüme faktörü, keratinosit büyüme faktörü, transformasyon büyüme faktörü, büyüme düzenleyiciler, antijenler, otoantijenler, bunlarin parçaciklari ya da bunlarin kombinasyonlari bulunur. Bir protein üst yapisinin sinirlandirici olmayan bir örnegi bir antikordur. Antikorlar moleküler agirligi 100 ila yaklasik 1000 kDa veya bunlarin arasindaki herhangi bir düzeyde olan glikoproteinlerdir. Antikorlar dört polipeptit zinciri, iki hafif zincir ve iki agir zincir içermekte olup, bunlar disülfit baglari ile baglidir. Örnegin, sinirlandirici olarak ele alinmamak kaydiyla, her bir hafif zincirin moleküler agirligi yaklasik 25 kDa, örnegin yaklasik 20 ila yaklasik 30 kDa veya bunlarin arasindaki herhangi bir miktarda olabilir veya örnegin yaklasik 20 ila yaklasik 300 kDa veya bunlarin arasindaki herhangi bir miktarda olabilir ve bir degisken alan (VL) ve bir sabit alan (CL) olmak üzere iki alandan olusur. Her bir agir zincirin moleküler agirligi yaklasik 50 kDa olup, örnegin yaklasik 30 ila yaklasik 75 kDa veya bunlarin arasindaki herhangi bir miktardadir veya örnegin yaklasik 30 ile yaklasik 500 kDa veya bunlarin arasindaki herhangi bir miktardadir ve bir sabit ve bir degisken bölgeden olusur. Agir ve hafif zincirler benzer ancak özdes amino asit sekansi gruplarindan olusan birkaç homolog kesim içerir. Homolog birimler yaklasik 110 amino asitten olusur ve bunlara immünoglobülin alanlari adi verilir. Agir zincir bir degisken alan (VH) ve üç veya dört sabit alan (antikor sinifina veya Izotipine bagli olarak CH1, CH2, CH3 ve CH4) içerir. CH1 ve CH2 alanlari arasindaki bölgeye mentese bölgesi adi verilir ve bu bölge, Y sekilli antikor molekülünün Fab kollari arasinda esneklik saglayarak bunlarin açilip kapanmasina olanak tanir ve böylece sabit bir mesafe ile ayrilan iki antijenik belirleyicinin baglanmasini saglar. Bir protein üst yapisinin bir baska sinirlandirici olmayan örnegi ise bir VLP'dir. VLP bir HAO öncül biçimini içerebilir veya HA1 veya HA2 alanlari disülfit köprüleriyle bir arada tutulan biçimde olabilir. VLP'Ierin ortalama boyu yaklasik 20 nm ile 1 um arasinda veya herhangi bir degerde olup, örnegin 100 nm'dir ve bir Iipit membran içerebilir. Proteinler veya üst yapi proteinleri bir ya da daha fazla Iipit, fosfolipit, nükleik asit, membran veya benzerini içerebilir. Iki veya daha fazla polipeptit bir kovalent bagla, bir disülfit köprüsüyle, yük etkilesimiyle, hidrofobik çekimle, van der waals kuvvetleriyle, hidrojen baglariyla ve benzerleriyle baglanabilir. Bir protein üst yapisina örnek olarak bir monoklonal antikor, bir kimerik monoklonal antikor, bir tek zincirli monoklonal antikor veya zarfli veya zarfsiz bir virüs benzeri yapi (VLP), örnegin bir viral zarf proteini, bir viral yapisal protein, bir viral kapsit proteini veya bir viral kaplama proteini verilebilir. Proteinler veya üst yapi proteinleri uygun konak hücrelerde, örnegin bitki konak hücrelerinde üretilebilir ve istendigi takdirde daha fazla saflastirilabilir. Bir kimerik monoklonal antikor, bir influenza VLP ve kimerik influenza VLP burada örneklendirilmekle birlikte, burada tarif edilen metotlar herhangi bir sitosolik bitkiden türetilen protein veya üst yapi protein için veya apoplastta lokalize olan veya bunun içine salgilanan herhangi bir bitkiden türetilen protein veya üst yapi proteini için kullanilabilir. Mevcut bulus ayrica bitkiden türetilen proteinler ya da üst yapi proteinlerin hazirlanmasina yönelik bir metot saglar. Bu metot, apoplast içinde lokalize edilmis olan bitkiden türetilen proteinleri veya üst yapi proteinlerini içeren bir bitki veya bitki maddesinin elde edilmesini; bitki maddesinden bir protoplast/sferoplast fraksiyonunun ve bir apoplast fraksiyonunun üretilmesini, apoplast fraksiyonunun bitkiden türetilen proteinler ya da üst yapi proteinleri içermesini ve apoplast fraksiyonun geri kazanilmasini içerir. istendigi takdirde, bitkiden türetilen proteinler veya üst yapi proteinler apoplast fraksiyonundan saflastirilabilir. Mevcut bulus ayrica bir protein veya üst yapi proteinin hazirlanmasina yönelik bir metot saglamakta olup, içerisinde protein veya üst yapi proteini bitkiden türetilen bir Iipit zarf, örnegin bitkiden türetilen bir lipit zarf içeren bir VLP içerir. Metot iliskin üst yapi proteinini, örnegin VLP'yi içeren bir bitki veya bitki maddesinin elde edilmesini, bu bitki veya bitki maddesinin bir enzim bilesimiyle isleme tabi tutulmasiyla birlikte bir ya da daha fazla apoplastik protein kompleksinin ve bir protoplast/sferoplast fraksiyonunun üretilmesini; ve bir ya da daha fazla apoplastik protein kompleksinin protoplast fraksiyondan ayrilmasini içerir. Bu bir ya da daha fazla apoplastik protein kompleksi, bir bitkiden türetilen Iipit zarf içeren üst yapi proteini veya VLP'yi içerir. Mevcut bulus ayrica bitkiden türetilen proteinler veya üst yapi proteinlerin hazirlanmasina yönelik bir metot saglamakta olup, bitkiden türetilen proteinler ya da üst yapi proteinlerini içeren bir bitki veya bitki maddesinin elde edilmesini, bitki maddesinin bir hücre duvari parçalayici enzim bilesimi kullanilarak sindirilmesini ve böylece bir sindirilmis/parçalanmis fraksiyon üretilmesini; ve parçalanan fraksiyonun filtrelenmesini ve böylece bir filtrelenmis fraksiyon üretilmesini ve bitkiden türetilen proteinler ya da üst yapi proteinlerin, bu filtrelenmis fraksiyondan geri kazanilmasini içerir. Bu metotta protoplastlarin bütünlügü gerekli olmayabilir. Bir protoplast, hücre duvari tamamiyla veya kismen çikarilmis olan bir bir bitki hücresidir. Bir sferoplastta hücre duvari kismen çikarilmis olabilir. Bir protoplast, bir sferoplast veya hem bir protoplast hem de sferoplast (protoplast/sferoplast) burada tarif edilen sekilde kullanilabilir ve burada kullanildigi sekliyle bu terimler birbirlerinin yerine kullanilabilir. Hücre duvari mekanik olarak bozulup çikarilabilir (örn., homojenizasyon, harmanlama ile), hücre duvari enzimatik olarak tamamiyla veya kismen parçalanabilir veya hücre duvari mekanik ve enzimatik metotlarin bir kombinasyonu kullanilarak, örnegin homojenizasyon ve ardindan hücre duvarinin parçalanmasi için enzimlerle isleme tabi tutma yoluyla çikarilabilir/uzaklastirilabilir. Bitki doku kültürü, kültürlenmis bitki hücreleri ve protoplast, sferoplast ve benzerlerinin üretimine yönelik genel ilkeleri ortaya koyan standart referanslar asagidaki gibidir: veya, örnegin, bkz., URL: molecular-plant-biotechnology.info/plant-tissue- culture/protoplast-isolation.htm. Protoplast (veya sferoplast) üretimi ve manipülasyonuyla iliskili metotlar ve teknikler, örnegin, Davey MR et al., belgesinde incelenebilir. Protein biyokimyasi, moleküler biyoloji ve benzerleriyle ilgili genel metotlar ve ilkelerin ortaya kondugu standart referanslar arasinda, örnegin Ausubel et al, Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1998 and Supplements to 2001); Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, New York, 1989; Kaufman et al , Eds., Handbook Of Molecular And Cellular Methods lri Biology And Medicine, CRC Press, Boca Raton ,1995; McPherson, Ed., Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1991 bulunur. Protoplastlar veya sferoplastlarin salimi için bitki hücre duvarlarini parçalamada veya bozmada kullanisli enzimler teknikte uzman kisiler tarafindan bilinir ve selülaz (EC hemiselülaz veya bunlarin bir kombinasyonunu içerebilir. Uygun enzimlerin sinirlandirici olmayan örnekleri arasinda. selülaz, hemiselülaz ve pektinaz içeren çok bilesenli bir enzim karisimi, örnegin MACEROZYMET" bulunur (yaklasik olarak: Selülaz: 0.1U/mg, Hemiselülaz: 0.25U/mg ve Pektinaz: 0.5U/mg). Piyasada bulunan enzimler, enzim karisimlari ve tedarikçilerin diger örnekleri Tablo 1'de listelenmistir (bkz.: Introduction to Plant Tissue Culture, by MK Razdan 2. baski, Science Publishers, 2003). Alternatif selülaz adlari ve türleri arasinda endo-1,4-ß-D-glukanaz; P-1,4-glukanaz; ß- 1,4-endoglukan hidrolaz; selülaz A; selülozin AP; endoglukanaz D; alkali selülaz; selülaz A 3; seludekstrinaz; 9.5 selülaz; aviselaz; panselaz SS ve 1,4-(1,3;1,4)-ß-D- glukan 4-glukanohidrolaz bulunur. Pektinazlarin (poligalakturonazlar) alternatif adladir ve türleri arasinda pektin depolimeraz; pektinaz; endopoligalakturonaz; pektolaz; pektin hidrolaz; pektin poligalakturonaz; endo-poligalakturonaz; poIi-d-1,4-galaktur0nit glikanohidrolaz; endogalakturonaz; endo-D-galakturonaz ve poli(1,4-0i-D-galakturonit) glikanohidrolaz bulunur. Ksilanazlarin alternatif adlari ve türleri arasinda hemiselülaz, endo-(1e4)-®-ksilan 4-ksilan0hidrolaz; endo-1,4-ksilanaz; ksilanaz; ®-1,4-ksilanaz; ksilanohidrolaz; ®-ksilanaz; ®-1,4-ksilan ksilanohidrolaz; endo-1,4-®-ksilanaz; ®-D- ksilanaz bulunur. Kitinazlarin alternatif adlari ve türleri arasinda kitodekstrinaz; 1,4-®- poli-N-asetilglukozaminidaz; poII-®-glukozaminidaz; ®-1,4-p0li-N-asetil glukozamidinaz; poli[1,4-(N-asetil-®-D-glukozaminit)] glikanohidrolaz bulunur. Tablo 1: Piyasada bulunan protoplast izolasyonu enzimlerinin sinirlandirici olmayan örnekleri Enzim Kaynak Tedarikçi Selülazlar Selülaz Trichoderma Kinki Yakult Mfg. Col. Ltd. 8- 12, Shinglkancho ONOZUKA R- 10 viride Nishinomiya, Japonya Selülaz T. viride Yakult Honsha C0., Tokyo, Japonya ONOZUKA RS Seishin Pharma Co. Ltd. 9- 500- 1, Selülaz YC T. viride Nagareyama Nagareyama- shi, Chiba- kan, Japonya Selülaz CEL T. viride Cooper Biomedical Inc. Malvern, PA, ABD Selülizin T. viride Calbiochem, San Diego, CA, ABD Driselaz Irpex /octeus Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd., Tokyo, Japonya Meiji Seiki Kaisha Ltd. No. 8, 2- Chome Melselaz P- 1 T. viride Kyobashi, Chou- Ku, Japonya Multifect CX GC T. viride Genencor Multifect CX B T. viride Genencor Enzim Kaynak Tedarikçi Hemiselülazlar . _ ' Industrie Biologique Francaise, Gennevilliers, Helikaz Helix pomatia Hemiselülaz Aspergi/Ius niger Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, ABD Hemiselülaz H- 2125 Rhizopus sp. Sigma, Munchen Rhozyme HP 150 Aspergi/Ius niger Genencor Inc., South San Francisco, CA, ABD Pektinazlar Rhizopus MACERASE _ Calbiochem, San Diego, CA, ABD arrhizus MACEROZYME R 10 R. arrhi'zus Yakult Honsha Co., Tokyo, Japonya Multifect Pectinase A. niger Genencor Baccilus PATE Farbwerke- Hoechst AG, Frankfurt, FRG polymyza Pectinol Aspergillus sp. Philadelphia, PA 19105, ABD Pektoliaz Y- 23 Aspergillus Seishin Pharma Co. Ltd., Japonya Enzim Kaynak Tedarikçi ioponicus Zimoliaz Sigma Chemical C0., ABD Belirli bir enzim veya enzim kombinasyonunun ve konsantrasyon ve tepkime kosullarinin seçimi, VLP'leri içeren protoplast ve apoplast fraksiyonunun elde edildigi bitki dokusunun türüne bagli olabilir. Selülaz, hemiselülaz ve pektinazin bir karisimi, örnegin bir pektinaz MACEROZYMETM veya Multifect, %0.01 ile %2.5 (hacim/hacim) 2.3, 2.4 veya 2.5 konsantrasyonunda (hacim/hacim) veya bunlarin arasindaki herhangi bir miktarda kullanilabilir. MACEROZYMETM veya Multifect tek baslarina veya diger enzimlerle, örn. selülaz, pektinaz, hemiselülaz veya bunlarin bir kombinasyonuyla .0 (agirlik/hacim) konsantrasyonunda veya bunlarin arasindaki herhangi bir miktarda kullanilabilir. Enzim çözeltisi (alternatif olarak bir hücre duvari bozucu bilesim, parçalayici çözelti olarak adlandirilir) genellikle bir tampon veya tampon sistemi, bir ozmotikum ve bir ya da daha fazla tuz, çift degerlikli katyon veya diger katki maddesini içerir. Tampon veya tampon sistemi, enzim aktivitesine uygun araliktaki bir pH'in ve proteinin/proteinlerin veya VLP'nin stabilitesinin korunacagi sekilde seçilmekte olup, örnegin, yaklasik pH 5.0 ile yaklasik pH 8.0 araliginda veya bunlarin arasindaki herhangi bir degerde saflastiracak sekilde seçilir. Seçilen pH degeri geri kazanilacak olan VLP'ye bagli olarak Tamponlar veya tampon sistemlerinin örnekleri arasinda, sinirlandirma olmaksizin, MES, fosfat, sitrat ve benzerleri bulunur. Bir veya daha fazla tampon veya tampon sistemi bir enzim çözeltisi (parçalayici çözelti) içinde birlestirilebilmekte olup; bir ya da daha fazla tampon 0 mM ile yaklasik 200 mM arasindaki bir konsantrasyonda veya bunlarin arasindaki herhangi bir miktarda bulunabilir. Uygunluga bagli olarak, istendigi takdirde bir ozmotikum bileseni eklenebilir. Ozmotikum ve bunun konsantrasyonu, enzim çözeltisinin ozmotik kuvvetini arttiracak sekilde seçilir. Ozmotikum örnekleri arasinda manitol, sorbitol veya diger seker alkolleri, degisen polimer uzunluklarinda polietilen glikol (PEG) ve benzerleri bulunur. Ozmotikumun konsantrasyon araliklari bitki türüne, kullanilan ozmotikum tipine ve seçilen bitki dokusu tipine (tür veya organ kökeni, örn., yaprak veya kök) göre degisiklik göstermekte olup, genellikle araligi 0 M ile miktarda olabilir. Ozmotikum konsantrasyonu ayrica yüzde olarak da ifade edilebilir (agirlik/hacim). Bazi bitki veya doku türlerinde, hafif hipertonik bir preparasyon kullanilmasi yararli olabilir ve bu da bitki hücre plazma membraninin hücre duvarindan ayrilmasini kolaylastirabilir. Ozmotikum ayrica sindirim/parçalanma sirasinda da çikarilabilir. Bitki sindirimi için ayarlanacak bir baska parametre ise sicakliktir. Sicaklik, sindirme prosesi sirasinda istendigi takdirde kontrol edilebilir. Kullanisli sicaklik araligi 4°C ve 40 °C arasinda veya bunlarin arasindaki herhangi bir sicaklikta, örnegin yaklasik 4 °C ile yaklasik 15 °C arasinda veya yaklasik 4 °C ile yaklasik 22 °C arasindaki herhangi bir düzeyde olabilir. Seçilen sicakliga bagli olarak, diger deneysel sindirim parametreleri, optimal ekstraksiyon kosullarinin korunacagi sekilde ayarlanabilir. Plazma membran stabilitesini arttirmak için katyonlar, tuzlar ya da her ikisi birden eklenebilmekte olup, örnegin çift degerlikli katyonlar, örnegin Ca2+ veya Mg2+ 0.5-50mM araliginda veya bunlarin arasindaki herhangi bir miktarda, tuzlar, örnegin CaClz, NaCl, CuSO4, KN03 ve benzerleri yaklasik 0 ile yaklasik 750 mM araliginda veya bunlarin 600, 700 veya 750 mM düzeyinde eklenebilir. Diger katki maddeleri, örnegin bir çelatlayici, örnegin sinirlandirma olmaksizin, EDTA, EGTA, yaklasik 0 ile yaklasik 200 mM araliginda veya bunlarin arasindaki herhangi bir miktarda, örnegin 5, 10, 15, 20, 25, oksidasyonu önlemek üzere bir indirgeyici ajan, örnegin sinirlandirma olmaksizin, sodyum bisülfit veya askorbik asit, %0.005-0.4 araliginda veya bunlarin arasindaki spesifik enzim inhibitörleri (bkz. asagida) ve istendigi takdirde, bir yaprak yaslanmasi inhibitörü, örnegin siklohekzimit, kinetin veya bir ya da daha fazla poliamin eklenebilir. Sindirim çözeltisi ayrica yaklasik 0 ile yaklasik 600 mM manitol, yaklasik 0 ila yaklasik 500 mM NaCI, yaklasik 0 ile yaklasik 50 mM EDTA, yaklasik %1 ila yaklasik %2 hacim/hacim selülaz, yaklasik %0 ile yaklasik %1 hacim/hacim pektinaz, yaklasik %003 ila yaklasik %004 sodyum metabisülfit, yaklasik 0 ila yaklasik 125 mM sitrat veya yaklasik 0 ila yaklasik 75 mM NaPO4 içerebilir. Bitki maddesi, enzimlerin veya enzim bilesiminin bitki hücre duvarina erisimini gelistirecek sekilde isleme tabi tutulabilir. Örnegin, bir enzim bilesimi ile isleme tabi tutmadan önce yapragin epidermi çikarilabilir veya "soyulabilir". Bitki maddesi küçük parçalar halinde kesilebilir (elle veya bir dograma veya kesme cihaziyla, örnegin bir Urschel dilimleyiciyle), kesilen bitki maddesi bir kismi vakum altinda ayrica bir enzim isleme tabi tutmadan önce veya bu islem sirasinda bitki dokusunun mekanik olarak Lipaz veya proteazlari bulunmayan veya inaktive edilmis olan bir enzim bilesiminin kullanilmasi da istenebilir. Bazi uygulamalarda, enzim bilesimine bir ya da daha fazla proteaz veya Iipaz inhibitörü dahil edilebilir. Lipaz inhibitörlerinin örnekleri arasinda RHC; proteaz inhibitörlerinin örnekleri arasinda E-64, Na2EDTA, Pepstatin, aprotinin, PMSF, Pefabloc, Leupeptin, bestatin ve benzerleri bulunur. Bitki maddesinin enzim bilesimi içinde karistirilmasi veya çalkalanmasi için herhangi bir uygun metot kullanilabilir. Örnegin, bitki maddesi bir tabla veya tepsi içinde bir döner çalkalayici vasitasiyla hafifçe burgaçlanabilir veya çalkalanabilir, bir döner veya sallanan tambur içinde yuvarlanabilir. Protoplast sindirim sivisindan çikarilana kadar protoplast (ve/veya sferoplast) hasarinin minimize edilmesine özen gösterilmelidir. Sindirim kabi buna uygun olacak sekilde seçilmelidir. Sinirlandirici olmayan bir örnek olarak, 500 mM mannitol içinde %1.5 selülaz (Onozuka R-10) ve % içeren bir enzim bilesimi, bazi Nicoti'ana dokularindan protoplast (veya sferoplast) üretimi için kullanilabilir. Burada tarif edilen sekilde, manitol konsantrasyonu ayrica yaklasik 0 ila yaklasik 500 mM arasinda veya bunlarin arasindaki herhangi bir düzeyde degisebilir. Burada açiklanan bilgiyle donatilan teknikte uzman bir kisi Nicotiana sp'nin veya VLP'lerin üretiminde kullanilan bir baska türün yasina ve susuna uygun bir enzim bilesimini belirleyebilir. Hücre duvarinin bozulmasinin veya hücre duvarinin kismen parçalanmasinin ardindan, bir protoplast fraksiyonu (protoplastlari ve/veya sferoplastlari içerir) ve bir "apoplast fraksiyonu" elde edilir. Alternatif olarak, bir "parçalanmis/sindirilmis fraksiyon" elde edilebilir. Asagida belirtildigi gibi, protoplast fraksiyonunun bütünlügünün burada tarif edilen sekilde yüksek verim üretmesi gerekmeyebilir ve bu nedenle, proteinlerin, örnegin sinirlandirma olmaksizin, VLP'ler, viral zarf proteinleri, viral yapisal proteinler, viral kapsid proteinleri, viral kaplama proteinlerinin ekstraksiyonunda bir apoplast fraksiyonu veya bir parçalanmis fraksiyon kullanilabilir. protoplastin bütünlügünü korumaya yardimci olarak kullanilabilecek olan diger içerik maddeleri mevcutken, bitki maddesinin hücre duvarini bozucu enzimler kullanilarak enzimatik parçalanmasinin veya kismi enzimatik parçalanmasinin ardindan elde edilen bir fraksiyondur. Apoplast fraksiyonu bozulmus protoplastlardan (veya sferoplastlar) kaynaklanan bazi bilesenler içerebilir. Örnegin, apoplast fraksiyonu, protoplast fraksiyonundan bilesenleri yaklasik %0 ila yaklasik %50 (hacim/hacim) veya bunlarin arasindaki herhangi bir miktarda veya protoplast fraksiyonundan bilesenleri %0, 0.1, 0.5, herhangi bir miktarda içerebilir. Bir "parçalanmis/sindirilmis fraksiyon" ile anlatilmak istenen, bitki maddesinin hücre duvari bozucu enzimler kullanilarak enzimatik parçalama veya kismi enzimatik parçalama ile bozundurulmasinin ardindan geriye kalan fraksiyondur; ancak, protoplastin bütünlügüne ihtiyaç duyulmaz ve parçalanan fraksiyon intakt, bozulmus veya hem intakt hem de bozulmus protoplastlar içerebilir. Parçalanmis fraksiyonun üretilmesi amaciyla kullanilan hücre duvari bozucu enzimler içeren bilesim bir ozmotikum içerebilir veya bu ozmotikum, protoplastlarin elde edilmesinde kullanilan standart prosedürlerde bulunan miktarla karsilastirildiginda düsük bir miktarda bulunabilir veya ozmotikum bilesimde bulunmayabilir. Parçalanan fraksiyon apoplast fraksiyonunu ve protoplast/sferoplast fraksiyonunu içerir; ancak protoplast/sferoplast fraksiyonu intakt olabilir veya olmayabilir. Parçalanan fraksiyon hücre içi bilesenler ve hücre disi bilesenler içerir. Eger protoplast/sferoplastin intakt kalmasi amaciyla bir ozmotikum kullanilmis ise, hücre içi bilesenler protoplastlar/sferopIastlar biçiminde bulunabilir. Parçalama çözeltisinde ozmotikum kullanilmamis ise, protoplastlar/sferoplastlar bozulabilir ve hücre içi ve hücre disi bilesenler parçalanan fraksiyon içinde birlesebilir. Burada tarif edilen sekilde, iliskin proteinler veya iliskin protein üst yapilari, parçalanan fraksiyonun bilesenlerinden, herhangi bir uygun teknik kullanilarak ayrilabilir. Teoriyle sinirli kalmaksizin, hücre duvari bozma adimi hücre duvarinin polimerik bilesenlerini gevsetebilir ve aksi takdirde hücre duvari içinde kalacak olan proteinler ya da üst yapi proteinlerinin salimina yardimci olabilir. Bu protokol ayrica proteinlerin veya üst yapi proteinlerin hücre içi bilesenlerle kirlenmesini en aza indirir. Proteinler veya üst yapi proteinleri, iliskin proteinleri veya proteinlerin üst yapisini içeren ayrilmis bir fraksiyon elde etmek üzere düsük hizda santrifügasyon ve ardindan filtrasyon, derinlik filtrasyonu, sedimentasyon, çöktürme, örnegin, sinirlandirma olmaksizin amonyum sülfat çöktürmesi veya bunlarin bir kombinasyonu kullanilarak enzimatik parçalamanin ardindan hücre kalintilarindan ayrilabilir. Ozmotikum kullanilmasi halinde, protoplast/sferoplast fraksiyonu veya protoplastlari içeren fraksiyon, apoplast fraksiyonundan herhangi bir uygun teknikle, örnegin sinirlandirma olmaksizin, santrifügasyon, filtrasyon, derinlik filtrasyonu veya bunlarin bir kombinasyonu kullanilarak ayrilabilir ve böylece iliskin proteinleri veya üst yapi proteinlerini içeren ve/veya iliskin proteinleri veya üst yapi proteinlerini içeren protoplastlari/sferoplastlari içeren bir ayrilmis fraksiyon elde edilir. Ayrilan fraksiyon, örnegin bir süzüntü (santrifüjlenmesi, çökeltilmesi veya çöktürülmesi halinde) veya bir filtrat (filtrelenmesi halinde) olabilir ve proteinler veya üst yapi proteinleri bakimindan zenginlestirilmistir. Ayrilan fraksiyon daha fazla islenerek, proteinler veya üst yapi proteinlerinin, örnegin ilave santrifügasyon adimlari, çöktürme, kromatografik adimlar (örn., büyüklük dislanimli, iyon degisimi, afinite kromatografisi), tegetsel akis filtrasyonu veya bunlarin bir kombinasyonu ile izole edilmesi, saflastirilmasi, konsantre edilmesi saglanabilir. Saflastirilan proteinler veya üst yapi proteinlerinin mevcut oldugu, örnegin natif veya SDS-PAGE, Western analizi ile, uygun bir saptama antikoru, kapiler elektroforezi veya teknikte uzman bir kisi tarafindan açikça görülecek olan herhangi bir baska metot kullanilarak dogrulanabilir. Apoplast bitki hücresinin plazma membranin disindaki kismidir ve hücre duvarini ve bitkinin hücreler arasi bosluklarini içerir. Parçalama ve daha fazla isleme sirasinda protoplastlarin (ve/veya sferoplastlarin) bütünlügünün korunmasi tercih edilse de, proteinler veya üst yapi proteinleri için zenginlestirme yapmak üzere protoplastlarin bütün halde (intakt) kalmasi gerekli degildir. Sentez sirasinda, proteinler veya üst yapi proteinleri plazma membranin disinda salgilanabilir. Üst yapi proteininin bir VLP olmasi durumunda, bunlar ortalama boyutu yaklasik 20 nm ila 1 pm veya bunlarin arasindaki herhangi bir miktardadir. Üst yapi proteininin bir antikor olmasi durumunda, bunlarin moleküler agirligi yaklasik 100 kDa ila yaklasik 1000 kDa veya bunlarin arasindaki herhangi bir miktardadir. Boylarindan dolayi, proteinler veya üst yapi proteinleri, sentezlendiklerinde plazma membrani ve hücre duvari arasinda sikisip kalirlar ve bitki proteinlerinin elde edilmesinde kullanilan standart mekanik metotlar kullanilarak izolasyon veya daha fazla saflastirma için erisilemez durumda olabilirler. Verimleri maksimize etmek, üst yapi protein fraksiyonunun hücresel proteinlerle kirlenmesini minimize etmek, proteinler veya üst yapi proteinlerinin ve gerektiginde iliskin Iipit zarfi veya membranin bütünlügünü korumak için, protoplasta ve/veya sferoplastlara mekanik hasari minimize eden proteinler veya üst yapi proteinlerini salgilamak üzere hücre duvarini bozma metotlari, örnegin burada tarif edilen enzimatik metotlar kullanisli olabilir. Ancak, prosedür sirasinda tüm protoplastlarin bütünlügünün korunmasi gerekli degildir. Bir bitkide türetilen bir üst yapi proteini, örnegin bir VLP, bitkiden türetilen Iipitlerle kompleks hale getirilebilir. Bitkiden türetilen Iipitler bir Iipit çift katmani biçiminde olabilir ve ayrica VLP'yI çevreleyen bir zarf içerebilir. Bitkiden türetilen Iipitler, VLP'nin üretildigi bitkinin plazma membraninin lipit bilesenlerini içerebilmekte olup, bunlarin arasinda, sinirlandirma olmaksizin, fosfatidilkolin (PC), fosfatidiletanolamin (PE), glikosfingolipitler, fitosteroller veya bunlarin bir kombinasyonu bulunur. Bir bitkiden türetilen Iipit alternatif olarak bir "bitki lipidi" olarak adlandirilabilir. Fitosterollerin örnekleri teknikte bilinmektedir ve bunlarin arasinda, örnegin, stigmasterol, sitosterol, 24-metilkolesterol ve kolesterol Polipeptit ifadesi, istenen sekilde bitkinin herhangi bir hücre içi veya hücre disi alanina, organeline veya dokusuna hedeflenebilir. Ifade edilen polipeptidin belirli bir konuma lokalize edilmesi için, polipeptidi kodlayan nükleik asiti bir sinyal peptidini veya lider sekansini kodlayan bir nükleik asit sekansina baglanabilir. Bir sinyal peptidi alternatif olarak bir geçis peptidi, sinyal sekansi veya lider sekansi olarak da adlandirilabilir. Ifade edilen bir polipeptidin apoplasta Iokalizasyonunu yönlendirmek için sinyal peptitleri veya peptit sekanslari arasinda, sinirlandirma olmaksizin, bir natif (proteine göre) sinyal veya lider sekans veya bir heterolog sinyal sekansi, örnegin, sinirlandirma olmaksizin bir pirinç amilaz sinyal peptidi (McCormick , asagidaki amino asit sekansina sahip olan bir protein disülfit izomeraz sinyal peptidi MAKNVAlFGLLFSLLLLVPSQIFAEE; SEKANS ID NO: 10. Tütün bitkisi patojeneziyle iliskili protein 2 (PRP), insan monoklonal antikor sinyal peptidi (SP veya lider sekans) veya proteine göre natif olan herhangi bir sinyal peptidi bulunur. Bazi örneklerde, ifade edilen bir polipeptit, örnegin ortamda bir sinyal peptidi veya geçis peptidi olmadan ifade edilip salgilandiginda spesifik hücreler arasi veya hücre disi alanda (örnegin apoplast), organel veya dokuda birikebilir. kendiliginden birlesen ve örnegin bir influenza HA proteini veya bir kimerik influenza HA proteini gibi viral yüzey proteinlerini içeren yapilari belirtir. VLP'Ier ve kimerik VLP'Ier genellikle bir enfeksiyonda üretilen viryonlara morfolojik olarak ve antijenik olarak benzerdir; ancak kopyalanmak için gereken genetik bilgileri eksiktir ve bu nedenle enfeksiyöz degildirler. olarak kaynasmis olan iki veya ikiden fazla kaynaktan, örnegin sinirlandirma olmaksizin iki ya da daha fazla influenza tipi veya alt tipinden amino asit sekanslari içeren bir protein veya polipeptittir. Kimerik protein veya polipeptit, polipeptit veya proteinin geri kalaniyla ayni olan (yani, natif) veya heterolog olan bir sinyal peptidini içerebilir. Kimerik protein veya kimerik polipeptit bir kimerik nükleotit sekansindan bir transkript olarak üretilebilir ve intakt olarak kalabilir veya gerektigi takdirde, kimerik protein veya kimerik polipeptit sentezin ardindan yarilabilir. Intakt kimerik protein veya kimerik proteinin yarilan kisimlari birleserek bir multimerik protein olusturabilir. Bir kimerik protein veya bir kimerik polipeptit ayrica disülfit köprüleri (yani bir multimerik protein) vasitasiyla iliskilendirilen alt birimler içeren bir protein veya polipeptidi de içerebilir. Örnegin, iki veya ikiden fazla kaynaktan amino asit sekanslari içeren bir kimerik polipeptit alt birimler halinde islenebilir ve bu alt birimler disülfit köprüleri vasitasiyla birlestirilerek bir kimerik protein veya kimerik polipeptit üretilir. Bir kimerik proteinin sinirlandirici olmayan bir örnegi bir kimerik monoklonal antikor, örnegin 0288 veya bir kimerik VLP, örnegin, sinirlandirma olmaksizin, ABD geçici basvurulari US 61/220,161 ve sayili yapilardan üretilen proteinler ve VLP'Ier bulunur. Protein veya üst yapi proteini bir glikoprotein olabilir ve burada tarif edilen sekilde hücre duvari parçalamasiyla ekstraksiyonu içeren metot, modifiye edilmis olgun N-glikanlar (Bitkilerde glikoprotein üretimini modifiye etme) N-glikozilasyon profilini modifiye etmek üzere bir glikoprotein ve bir ya da daha fazla enzimi birlikte ifade eden bitkilere uygulanabilir. Örnegin, olgun N-glikanlar ksiloz ve fukoz kalintilari içermeyebilir veya düsük fukozile, ksilozile veya hem fukozile hem de ksilozile N-glikanlar gösterebilir. Alternatif olarak, modifiye edilmis bir glikozilasyon deseni içeren iliskin bir protein elde edilebilmekte olup, içerisinde bu proteinde fukozilasyon, ksilozilasyon ya da her ikisi birden görülmez ve galaktozilasyonda artis içerir. Modifiye edilen N-glikozilasyon profili, bir bitki veya bir bitki kismi içinde, beta-1,4- galaktoziltransferazin bir katalitik alanina kaynasmis olan N-asetilglukozaminil transferazin (GNT1) bir CTS alanini (yani, sitoplazmik kuyruk, transmembran alani, gövde bölgesi) içeren bir hibrit protein kodlayan ve bitkide aktif olan bir birinci düzenleyici bölge ile çalisir biçimde bgali olan bir birinci nükleotit sekansi ve iliskin üst yapi proteinini kodlamak için, bitkide aktif olan ikinci bir düzenleyici bölge ile çalisir biçimde bagli olan ikinci bir nükleotit sekansinin birlikte ifade edilmesi ve birinci ve ikinci modifiye edilmis N-glikozilasyon profiline sahip glikanlari içeren iliskin bir üst yapi proteininin sentezlenmesi yoluyla elde elde edilebilir. Üst yapi proteini influenza hemaglutinin (HA) olabilir ve polipeptidi olusturan iki veya ikiden fazla amino asit sekansindan her biri farkli HA'Iardan elde edilerek bir kimerik HA veya kimerik influenza HA üretilebilir. Bir kimerik HA ayrica sentezin ardindan yarilan heterolog sinyal peptit (bir kimerik HA pre-protein) içeren bir amino asit sekansi da içerebilir. Burada tarif edilen mevcut bulusta kullanilabilecek olan HA proteinlerinin bulunabilir. Bir kimerik polipeptit kodlayan bir nükleik asit bir "kimerik nükleik asit" veya bir "kimerik nükleotit sekans" olarak tarif edilebilir. Kimerik HA'dan olusan bir virüs benzeri parçacik bir "kimerik VLP" olarak tarif edilebilir. Kimerik VLP'Ier ayrica 25 edilmektedir. VLP'Ier natif veya kimerik HA'nin ifadesinden elde edilebilir. Mevcut bulusta tarif edilen bir metoda göre hazirlanan VLP'lerin HA'si bilinen sekanslari ve gelistirilebilecek veya tanimlanabilecek olan varyant HA sekanslarini içerir. Ayrica, burada tarif edilen sekilde üretilen VLP'ler nöraminidaz (NA) veya diger bilesenleri, örnegin M1 (M proteini), M2, NS ve benzerlerini içermez. Ancak, HA ve NA içeren VLP'lerin istenmesi durumunda, NA ve M1, HA ile birlikte ifade edilebilir. Genel olarak, "lipit" terimi yagda çözünebilen (lipofilik) dogal olarak meydana gelen molekülleri belirtir. Mevcut bulusun bazi yönlerine göre bir bitki içinde üretilen bir kimerik VLP, bitkiden türetilen lipitlerle kompleks haline getirilebilir. Bitkiden türetilen Iipitler bir lipit çift katmani biçiminde olabilir ve ayrica VLP'yi çevreleyen bir zarf içerebilir. Bitkiden türetilen Iipitler, VLP'nin üretildigi plazma membranin lipit bilesenlerini içerebilmekte olup, bunlarin arasinda fosfolipitler, tri-, di- ve monogliseritler bulunur; ve ayni zamanda yagda çözünebilen sterol veya sterolleri içeren metabolitleri de içerir. Örnekler arasinda fosfatidilkolin (PC), fosfatidiletanolamin (PE), fosfatidilinozitol, fosfatidilserin, glikofingolipitler, fitosteroller veya bunlarin bir kombinasyonu bulunur. Bir bitkiden türetilen lipit alternatif olarak bir "bitki Iipidi" olarak adlandirilabilir. Fitosterollerin örnekleri arasinda kampesterol, stigmasterol, ergosterol, brasikasterol, delta-7- stigmasterol, delta-7-avenasterol, daunosterol, sitosterol, 24-metilk0lester0l, kolesterol Teknikte uzman bir kisinin kolaylikla anlayacagi üzere, bir hücrenin plazma membraninin lipit bilesimi, bu hücre veya organizmanin kültür veya büyüme kosullarina göre veya hücrenin elde edildigi türe göre degisiklik gösterebilir. Hücre membranlari genel olarak lipit çift katmanlar ve ayni zamanda çesitli fonksiyonlar için proteinler içerir. Belirli lipitlerin lokalize konsantrasyonlari lipit çift katmaninda bulunabilmekte olup, bunlara "lipit raftlari" adi verilir. Bu lipit raft mikroalanlari sfingolipitler ve sterollerde zenginlestirilebilir. Teoriyle sinirli kalmaksizin, lipit raftlari endo ve ekzositozda, virüsler veya diger enfeksiyöz ajanlarin girisi veya çikisinda, hücreler arasi sinyal transdüksiyonunda, hücre veya organizmanin diger yapisal bilesenleriyle, örnegin hücre içi ve hücre disi matrislerle etkilesimde önemli roller oynayabilir. belgelerinde tarif edilmistir. influenza virüsüne referans olarak, "hemaglutinin" veya "HA", burada kullanildigi sekliyle, influenza viral parçaciklarinin yapisal bir glikoproteinini belirtir. Mevcut bulusun HA'si herhangi bir alt tipten elde edilebilir. Örnegin, HA'nin alt influenza tip B veya C olabilir. Mevcut bulusun rekombinant HA'si ayrica herhangi bir hemaglutinin sekansina dayali olarak bir amino asit sekansi içerebilir. Influenza hemaglutinin yapisi çok uygundur ve ikincil, üçüncül ve dördüncül yapida yüksek düzeyde korunum gösterir. Amino asit sekansi degisiklik gösterebilse bile, bu yapisal Vaccaro et al 2005). HA kodlayan nükleotit sekanslari iyi bilinmektedir ve örnegin BioDefense and Public Health Database'den (artik influenza Research biohealthbase.org/GSearCh/home.do?decorator=Influenza adresinden veya National Center for Biotechnology Information tarafindan tutulan veritabanlarindan (NCBI; örnegin URL: ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=nuccore&cmd=search&term=influenza adresinden) alinabilir. Mevcut bulus ayrica VLP'lerin, örnegin insanlari veya konak hayvanlari, örnegin primatlar, atlar, domuzlar, kuslar, koyunlar, su kuslari, göçmen kuslar, bildircin, ördek, kugu, kümes hayvanlari, tavuk, deve, köpekgiller, köpekler, kedigiller, kediler, kaplan, leopar, misk kedisi, vizon, sansar, daggelincigi, ev hayvanlari, besi hayvanlari, fareler, siçanlar, fok, balina ve benzerlerini enfekte eden virüslerin influenza VLP'lerinin hazirlanma, izole edilme veya hem hazirlanma hem de izole edilme metotlariyla ilgilidir. Bazi influenza virüsleri birden fazla sayida konak hayvanini enfekte edebilir.Amino asit varyasyonu influenza virüslerinin hemaglutininlerinde tolere edilir. Bu varyasyon sürekli olarak tanimlanan yeni suslar saglar. Yeni suslarin arasindaki infektivite degisiklik gösterebilir. Ancak, daha sonra VLP'leri olusturan hemaglutinin trimerlerinin olusumu korunur. Mevcut bulus ayrica HA alt tipi veya sekansindan veya VLP'yi içeren kimerik HA'dan veya türün kökeninden bagimsiz olarak herhangi bir bitkiden türetilen VLP'nin hazirlanma metotlarini da içerir. Üst yapi proteininin dogru katlanmasi proteinin stabilitesi, multimerlerin olusumu ve proteinin olusumu ve fonksiyonu bakimindan önemli olabilir. Bir proteinin katlanmasi bir ya da daha fazla faktörden etkilenebilmekte olup, bunlarin arasinda, sinirlandirma olmaksizin, proteinin sekansi, proteinin nispi bollugu, hücre içi yükleme düzeyi, katlanmis, kismen katlanmis veya açilmis proteine baglanabilecek veya geçici olarak iliskilendirilebilecek kofaktörlerin mevcudiyeti, bir ya da daha fazla saperon proteinin bulunmasi veya benzerleri bulunur. protein sentezi, hücre içi tasima, yanlis katlanmayi önleme, protein birikiminin önlenmesi, protein komplekslerinin birlesmesi ve sökülmesi, protein katlanmasi ve protein bozundurulmasi gibi çesitli hücresel proseslerde rol oynayabilirler. Bu tür saperon proteinlerin örnekleri arasinda, sinirlandirma olmaksizin, Hsp60, Hsp65, Hsp FKBPs, siklofilinler, CIpP, GrpE, ubikitin, kalneksin ve protein disülfit izomerazlar bulunur (örnegin, bkz., Macario, A.J.L., Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25:59-70. kimerik HA'nin katlanmasini saglamak amaciyla kullanilabilir (PCT Basvuru ayrica kullanilabilir. Geri kazanildiktan sonra, proteinler veya üst yapi proteinleri, örnegin sinirlandirma olmaksizin elektron mikroskobu, isik saçilimi, büyüklük dislanimli kromatografi, HPLC, Western blot analizi, elektroforezi, ELISA, aktiviteye dayali deneyler, örnegin hemaglutinasyon deneyi veya herhangi bir baska uygun deney ile yapi, büyüklük, etkinlik veya aktivite bakimindan degerlendirilebilir. VLP'Ierin büyüklügü, konsantrasyonu, aktivitesi ve bilesiminin degerlendirilmesine yönelik bu ve diger metotlar teknikte bilinmektedir. Hazirlayici büyüklük dislanimli kromatografi için, burada tarif edilen metotlarla proteinler veya üst yapi proteinlerini içeren bir preparasyon hazirlanabilir ve çözünmez malzeme santrifügasyon ile uzaklastirilabilir. PEG veya amonyum sülfat ile çökeltme de ayrica yararli olabilir. Geri kazanilan proteinin miktari konvansiyonel metotlarla (örnegin, Bradford deneyi, BCA) ölçülebilir ve ekstrakt bir SEPHACRYLTM, SEPHADEXTM veya benzer bir ortam kullanilarak bir büyüklük dislanimli kolon içerisinden geçirilir, bir iyon degisim kolonu kullanilarak kromatografi veya bir afinite kolonu kullanilarak kromatografi yapilir ve aktif fraksiyonlar toplanir. Protein kompleksleri ayrica afiniteye dayali manyetik ayirma kullanilarak, örnegin Dynabeads TM (Invitrogen) ile ve protein kompleksinin DynabeadsTM'ten ayristirilmasi ile elde edilebilir. Kromatografik ve ayirma protokollerinin bir kombinasyonu da ayrica kullanilabilir. Kromatografi veya ayirmanin ardindan, fraksiyonlar protein elektroforezisi, immünoblot, ELISA, aktiviteye dayali deneylerle istenen sekilde daha fazla incelenerek üst yapi proteininin bulundugu dogrulanabilir. Üst yapi proteininin bir VLP olmasi halinde, VLP içeren fraksiyonlarin hemaglutine edici aktivitesinin teknikte iyi bilinen metotlar kullanilarak degerlendirilmesi için bir hemaglutine edici deney kullanilabilir. Teoriyle sinirli kalmaksizin, HA'nin farkli hayvanlardan RBC'ye baglanma kapasitesi, HA'nin siyalik asitler 02,3 veya 02,3'e olan afinitesiyle ve bu siyalik asitlerin RBC yüzeyinde bulunmasiyla saglanir. influenza virüslerinden domuz ve kus HA'si tüm çesitli türlerden, örnegin hindiler, tavuklar, ördekler, kobay fareleri, insanlar, koyunlar, atlar ve ineklerden eritrositleri birlestirirken; insan HA'Iar ise hindi, tavuk, ördek, kobay faresi, insan ve koyun eritrositlerine 289:?4-85). Bir asi ile uyarilan antikorlarin etkinligini ortaya koymak üzere bir hemaglutinasyon inhibisyon (HI veya HAl) deneyi de kullanilabilir veya kimerik HA veya kimerik VLP içeren asi bilesimi, alyuvarlarin (RBC) aglutinasyonunu rekombinant HA ile inhibe edebilir. Serum numunelerinin hemaglutinasyon inhibe edici antikor titreleri mikrotitre HAl (Aymard ve ark., 1973) ile degerlendirilebilir. Çesitli türlerden herhangi birinden eritrositler kullanilabilir - örn. at, hindi, tavuk veya benzeri. Bu deney HA trimerin VLP'nin yüzeyi üzerinde birlestirilmesiyle ilgili dolayli bilgi vermekte olup, HA'larin üzerindeki antijenik bölgelerin uygun sekilde sunumunu dogrular. Çapraz reaktiviteli HAI titreleri de yine asi alt tipiyle ilgili virüsün diger suslarina bir bagisiklik yanitinin etkinliginin gösterilmesinde kullanilabilir. Örnegin, bir birinci influenza tipi veya alt tipinin bir HDC'sini içeren bir kimerik hemaglutinin içeren bir asi bilesimiyle immünize edilen bir hastadan alinan serum, bir HAI deneyinde, tam virüs veya virüs parçaciklarinin ikinci bir susuyla birlikte kullanilabilir ve HAI titresi belirlenir. Mevcut bulusun metotlariyla hazirlanan influenza VLP'Ier mevcut bir influenza asisiyla birlikte kullanilarak asi desteklenebilir, daha etkili kilinabilir veya gereken uygulama dozajlari azaltilabilir. Teknikte uzman bir kisi tarafindan bilinecegi üzere, asi bir ya da daha fazla influenza virüsüne yönelik olabilir. Uygun asilarin örnekleri arasinda, sinirlandirma olmaksizin, piyasada Sanofi-Pasteur, ID Biomedical, Merial, Sinovac, Chiron, Roche, Medlmmune, GIaxoSmithKline, Novartis, Sanofi-Aventis, Serono, Shire Pharmaceuticals ve benzerlerinden alinabilecek olanlar bulunur.Istendigi takdirde, mevcut bulusun VLP'IerI, teknikte uzman bir kisi tarafindan bilinen sekilde uygun bir adjuvanla karistirilabilir. Ayrica, mevcut bulusa göre üretilen VLP diger protein bilesenleriyle birlikte Ifade edilebilir veya diger VLP'Ier veya influenza protein bilesenleriyle, örnegin nöraminidaz (NA), M1 ve M2 ile yeniden yapilandirilabilir. Ayrica sitma antijenleri, HlV antijenleri, respiratuvar sinsitiyal virüsü (RSV) antijenleri ve benzeri asi proteinlerinden yapilan diger VLP'Ierle birlikte ifade edilebilir veya yeniden yapilandirilabilir. Proteinler veya üst yapi proteinleri içeren transgenik bitkiler, bitki hücreleri, bitki maddesi veya tohumlarin transformasyonu ve rejenerasyonu teknikte uzman bir kisi tarafindan bilinir. Dönüstürülmüs ve rejenere edilmis bitkilerin elde edilme metotlari mevcut bulus bakimindan önemli degildir. sekilde ortaya konulan genetik bilginin (nükleotit sekansi) interspesifik transferidir. Genetik bilginin bir kimerik yapidan bir konaga interspesifik transferi kalitsal olabilir (yani, konagin genomu içine entegre edilebilir) ve genetik bilginin transferinin stabil oldugu düsünülür veya transfer geçici olabilir ve genetik bilgi transferi kalitsal degildir. Bitki maddesi bir bitkinin tamami, dokusu veya bunun herhangi bir kismindan olusur. Ayrica, bitki maddesi hücre içi bitki bilesenleri, hücre disi bitki bilesenleri, sivi veya kati bitki ekstraktlari veya bunlarin bir kombinasyonunu içerebilir. Ayrica, bitki maddesi bitkiler, dokular, bir sivi ekstrakt veya bunlarin bir kombinasyonundan, bitki yapraklari, gövdeleri, meyveleri, kökleri veya bunlarin bir kombinasyonundan olusur. Bitki maddesi herhangi bir isleme adimina tabi tutulmamis olan bir bitki veya bitki kismi içerebilir. Bir bitkinin bir kismi bitki maddesi içerebilir. Bitkiler veya bitki maddesi herhangi bir metotla hasat edilebilmekte veya elde edilmekte olup, örnegin, tüm bitki kullanilabilir veya yapraklar veya diger dokular tarif edilen metotlarda kullanilmak üzere spesifik olarak çikarilabilir. VLP'leri ifade eden ve salgilayan transgenik bitkiler de yine burada tarif edilen sekilde isleme için bir baslangiç malzemesi olarak kullanilabilir. Mevcut bulusun yapilari bitki hücrelerinin içine Ti plazmitler, Ri plazmitler, bitki virüs vektörleri, dogrudan DNA transformasyonu, mikro enjeksiyon, elektroporasyon, infiltrasyon ve benzerleri kullanilarak sunulabilir. Bu tür tekniklerin incelenmesi için, örnegin, bkz. Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Molecular Biology, 2d Ed. (1988); ve Miki and lyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell arasinda dogrudan DNA alimi, lipozom kullanimi, elektroporasyon, örnegin protoplastlarin kullanimi, mikro enjeksiyon, mikroprojektiller veya ignecikler ve vakum Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds., Academic Press Inc., Mevcut bulusun yapilarini ifade etmek için geçici ifade metotlari kullanilabilir (see Liu sekilde bir vakuma dayali geçici ifade metodu kullanilabilir. Bu metotlar, örnegin, sinirlandirma olmaksizin, bir Agro-inokülasyon veya Agro-infiltrasyon metodunu içerebilir; ancak yukarida belirtildigi gibi diger geçici metotlar da kullanilabilir. Agro- asilama veya Agro-infiltrasyondan biriyle birlikte, istenen nükleik asidi içeren bir Agrobacteria karisimi bir dokunun, örnegin yapraklarin hücreler arasi bosluguna, bitkinin hava kismina (gövde, yapraklar ve çiçek dahil), bitkinin diger kismina (gövde, kök, çiçek) veya tüm bitkiye girer. Epidermi geçtikten sonra, Agrobacteriumt-DNA kopyalarini hücrelerin içine enfekte eder ve aktarir. t-DNA epizomal olarak kopyalanir ve mRNA çevrilerek iliskin proteinin enfekte hücrelerin içinde üretimine yol açar; ancak t- DNA'nin çekirdegin içine geçisi geçicidir. Burada tarif edilen sekanslar asagida özetlenmistir. SEKANS Tanim Sekil 1 Nükleik asit sekansi (yapi 685) 2A 2 SEKANS ID NO: 1 tarafindan kodlanan amino asit sekansi 28 3 pBinPIus.2613c: AGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAG Mut-ATO I I5.r: (iT(.`i(T(`(.`iz\AGCACGA'l'("l`(i.-\(IAACGT Mut- ATG161.c: SEKANS Tanim Sekil 7 Apal- H5 (A- lndo).|c: TG!'(I(Ii(I`i("iC`("CA'l(KIAGAAÂATAGTGC H5 (A- Indo)- Stul.1707r:AAATAGGCCTTTAAATGCAAATTC 8 TGCATTGTAACGA 9 nükleik asit sekansi (yapi 660) 5 PDI sinyal peptit: MAKNVAIFGLLFSLLLLVPSQIFAEE 11 Plasto- 4430 12 supP19- plast0.r 13 supP19- 10 14 SupP19- Sacir C288'in LC fragmani 9 16 CZB8'in HC fragmani 10 Mevcut bulus asagidaki örneklerle birlikte daha fazla örneklendirilecektir. Ancak, bu örneklerin yalnizca örneklendirme amaci tasidigi ve mevcut bulusun kapsamini herhangi bir sekilde sinirlandirmamasi gerektigi anlasilmalidir. Ifade kasetlerinin birlestirilmesi VLP'Ierin üretiminde kullanilabilecek olan yapilar ABD Geçici Basvuru No 61/220,161 ve belgelerinde tarif edilmektedir. Yapilar ayrica Tablo 2'de listelenenleri içerir. Bu yapilarin 61/220,161 belgelerinde tarif edilmektedir. Ancak, örnegin, sinirlandirma olmaksizin, Tablo 2'de saglananlar gibi bilinen HA'lari içeren ve benzer veya farkli düzenleyici elemanlar ve promotörlerle birlestirilen diger yapilar da burada tarif edilen sekildeki VLP'Ierin üretiminde kullanisli olabilir. Tablo 2: Hemaglutinin üretiminde kullanilabilecek olan yapilarin sinirlandirici olmayan örnekleri Kaset Karsilik gelen HA HA kisaltmasi numarasi 2X358/ CPMV- HTifade kaseti içinde SpPDI- HI A/ 560 H1/Cal WT California/ 4/ 2009 2x35S/ CPMV- HT ifade kaseti içinde SpPDI- H1 A/ New 580 Caledonia/ 20/ 99 H1/ NC 660 A/ indonesia/ 5/ susundan H5 H1/ Indo 663 HS A/ Indonesia/ 5/ 2005 H1/ Indo CPMV- HTifade kaseti içinde SpPDI- H5 A/ Indonesia! 5/ 686 2005 H1/ Indo Kaset Karsilik gelen HA HA kisaltmasi numarasi H5 A/ Indonesia/ 5/ 05 omurgasi içinde H1 A/ Brisbane/ 690 H1/ Bris 59/ 07 reseptör baglayici (RB) alan H5 A/ Indonesia/ 5/ 05 omurgasi Içinde H1 A/ Brisbane/ 691 H1/ Bris 59/ 07 esteraz ve reseptör baglayici alanlar (E1- RB- E2) H1 A/ New Caledonia/ 20/ 99 omurgasi içinde H5 A/ 696 H1/ Indo CPMV- HTifade kaseti içinde SpPDI- H1 A/ Brishane/ 59/ 733 H1/ Bris CPMV- HT ifade kaseti içinde H5 A/ Indonesia/ 5/ 05 734 omurgasi içinde H1 A/ Brisbane/ 59/ 07 reseptör H1/ Bris baglayici (RB) alan CPMV- HTifade kaseti içinde SpPDI- H3 A/ Brisbane/ 10/ 736 H3/ Bris CPMV- HT ifade kaseti içinde kimerik SpPDI- H3 A/ H3/ Bris- H5/ birlesimi 738 CPMV- HT ifade kaseti Içinde HA B/ Florida/ 4/ 2006 B/ Flo Kaset Karsilik gelen HA HA kisaltmasi numarasi CPMV- HT ifade kaseti içinde SpPDI- HA B/ Florida/ 4/ 739 B/ Flo CPMV- HT ifade kaseti içinde SpPDI- HA B/ Florida/ 4/ Cyto kuyruk) 2X358- CPMV- HTifade kaseti içinde SpPDI- HA B/ 774 A/ Brisbane/ 59/ HA'si H1/ Bris 775 A/ Solomon Islands 3/ HA'si H1/ Solomon 776 A/ Brisbane HA'si H3/ Bris 779 B/ Florida/ 4/ 2006 HA'si B/ Flo 780 A/ Singapore/ 1/ 57 (H2N2) HA'si H2/ Sing 782 A/ Vietnam/ 1194/ HA'si H5/ Vietnam Kaset Karsilik gelen HA HA kisaltmasi numarasi 784 A/ Equine/ Prague/ 56 (H7N7) HA'si H7/ Prague 798 HA B/ Florida/ 4/ 2006 B/ Flo CPMV-HT ifade kasetleri, 5' tarafinda, 115 ve 161 pozisyonlarinda mutasyona ugramis ATG'Ii Cowpea mozaik virüsü (CPMV) RNA2'den 1-512 nükleotitlerle ve 3' tarafinda, sonlandiriciyla çevrelenmis olan iliskin bir kodlama sekansi içeren bir mRNA'nin ifadesini kontrol etmek üzere 358 promotörü içermistir. Plasmit pBD-C5-1LC, (Sainsbury ve ark., 2008; Plant Biotechnology Journal 6: 82-92 ve PCT Publication WO kullanilmistir. CPMV RNA2'nin 115 ve 161 pozisyonlarindaki ATG'Ierin mutasyonu, Darveau ve ark. tarafindan sunulan bir PCR bazli ligasyon metodu kullanilarak kullanilarak iki ayri PCR gerçeklestirilmistir. Birinci amplifikasyon için primerler pBinPlus. olmustur. Ikinci amplifikasyon için primerler Mut-ATG ve LC-05-1.110r (SEKANS lD NO: 6) olmustur. Iki fragman daha sonra karistirilmis ve primer olarak pBinPIus. kullanilarak üçüncü bir amplifikasyonda sablon olarak kullanilmistir. Elde edilen fragman Pacl ve Apal ile parçalanmis ve ayni enzimle parçalanan pBD-C5-1LC içine klonlanmistir. Olusturulan ifade kaseti 828 olarak adlandirilmistir. H5 AIIndonesia/ içinde birlestirilmesi. belgelerinde tarif edilmektedir. Özetle, A/Indonesia/5/2005'ten H5'in kodlama sekansi CPMV-HTiçine asagidaki biçimde klonlanmistir: sablon olarak yapi no 660 (D'Aoust et al., Plant Biotechnology Journal ve H5 (A-Indo)-Stul. primerleriyle bir PCR amplifikasyonu gerçeklestirilerek hemaglutinin kodlama sekansina Apal (ilk ATG'nin hemen yukarisina) ve Stul (bir stop kodonunun hemen asagisina) kisitlama bölgeleri eklenmistir. Yapi 660 UTR hemaglutinin kodlama sekansi, alfalfa plastosiyanin 3' UTR ve sonlandirici sekanslar (SEKANS ID NO: 9; Sekil 5) içerir. Elde edilen fragman Apal ve Stul restriksiyon enzimleriyle parçalanmis ve daha önceden ayni enzimlerle parçalanmis olan yapi no 828 içine klonlanmistir. Elde edilen kasede yapi No 685 adi verilmistir Susturma supresörleri. Transkripsiyon sonrasi gen susturma (PTGS), transgenlerin bitkilerin içinde ifadesinin kisitlanmasinda rol oynayabilir ve patates virüsü Y'den (HcPro) bir susturma supresörünün birlikte ifadesi, transgen mRNA'larin spesifik degradasyonuna karsi etki gösterme amaçli olarak kullanilabilir (Brigneti et al., 1998). Alternatif susturma supresörleri teknikte iyi bilinir ve burada tarif edilen sekilde kullanilabilmekte olup (Chiba TEV-p1/HC-Pro (Tobacco etch virüsü-p1/HC-Pro), BYV -p21, p19 Domates bushy stunt virüsü (TBSV p19), Domates crinkle virüsü kapsit proteini (TCV -CP), 2b Salatalik mozaik virüsü; CMV-2b), p25 Patates virüsü X (PVX-p25), pa11 Patates virüsü M (PVM-p11), pa11 Patates virüsü S (PVS-p11), p16 Yabanmersini scorch virüsü, (BSCV - p16), p23 Turunçgil tristeza virüsü (CTV-p23), p24 Üzüm asmasi leafroll ile iliskili virüs- 2, (GLRaV-Z p24), p10 Üzüm asmasi virüsü A, (GVA-p10), p14 Üzüm asmasi virüsü B (GVB-p14), p10 Heracleum Iatent virüsü (HLV-p10) veya p16 Sarimsak yaygin Iatent virüs (GCLV-p16) bulunur. Bu nedenle, bir susturma supresörü, örnegin, sinirlandirma olmaksizin, HcPro, TEV -pI/HC-Pro, BYV-p21, TBSV p19, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, p16 veya GVA-p10, iliskin proteini kodlayan nükleik asit sekansiya birlikte ifade edilerek bir bitki içinde yüksek düzeyde protein üretimi saglanabilir. stunt virüsünün (TBSV) p19 proteininin kodlama sekansi, Darveau ve ark. tarafindan sunulan PCR'ye dayali Iigasyon metoduyla alfalfa plastosiyanin ifade kasetine plastosiyanin promotörün bir segmenti Plasto-443c: GTATTAGTAATTAGAATTTGGTGTC (SEKANS lD NO:11) ve supP19-plasto.r CCTTGTATAGCTCGTTCCATTTTCTCTCAAGATG (SEKANS lD NO:12) edilen) ile güçlendirilmistir. Buna paralel olarak, p19'un kodlama sekansini içeren bir baska fragman, supP19-1c ATGGAACGAGCTATACAAGG (SEKANS ID NO: 13) ve SupP19-Sacl.r AGTCGAGCTCTTACTCGCTTTCTTTTTCGAAG (SEKANS ID NO:14) primerleriyle, Voinnet ve ark. tarafindan tarif edilen sekilde, sablon olarak yapi 3582p19 ürünleri daha sonra karistirilmis ve Plasto-4430 ve SupP19-Sacl.r primerleriyle birlikte ikinci tur amplifikasyonda (birlestirme tepkimesi) sablon olarak kullanilmistir. Elde edilen fragman BamHI (plastosiyanin promotör içinde) ve Saol (p19 kodlama sekansinin sonunda) ile parçalanmis ve ayni restriksiyon enzimleriyle önceden parçalanmis olan yapi No 660 içine klonlanarak yapi No R472 elde edilmistir. Agrobacteium tumefaci'ens'leri (AGL1; ATCC, Manassas, VA elektroporasyon yoluyla dönüstürmek için plazmitler kullanilmistir (Mattanovich ve ark., 1989). Tüm A. Iumefaci'ens suslarinin bütünlügü restriksiyon eslestirme ile dogrulanmistir. R472 içeren A. tumefaci'ens susu (Sekil 118) "AGL1/R472" olarak adlandirilir. HcPro yapisi (35HcPro) Hamilton ve ark. (2002) tarafindan tarif edilen sekilde hazirlanmistir. Tüm klonlar sekanslanarak yapilarin bütünlügü dogrulanmistir. Agrobacteium tumefaciens'leri(AGL1; ATCC, Manassas, VA elektroporasyon yoluyla dönüstürmek için plazmitler kullanilmistir (Mattanovich ve ark., 1989). Tüm A. tumefaci'ens suslarinin bütünlügü restriksiyon eslestirme ile dogrulanmistir. Bitki biyokütlesi preparasyonu, inokülüm, agroinfiltrasyon ve hasat Nicotiana benthamiana bitkileri, piyasada bulunan peat moss yosunuyla doldurulan düz tüpler içinde tohumlardan yetistirilmistir. Bitkiler 16/8'Iik bir isik süresi ve gündüz 25°C / gece 20°C sicaklik altinda serada yetismeye birakilmistir. Tohumlamadan üç hafta sonra, genç bitkilerin her biri toplanmis, saksilarak aktarilmis ve ayni çevresel kosullar altinda üç hafta daha sera içinde yetismeye birakilmistir. Alti hafta sonra, bitkilerin ortalama agirligi 80 g ve yüksekligi 30 cm olmustur. 940) tarafindan tarif edilen metotlar kullanilarak, asagida tanimlanan sekildeki yapilarla transfekte edilmistir (elektroporasyon). Transfekte edilen Agrobacterium, 10 mM 2-(N- morfolino)etansülfonik asit (MES), 20 pM asetosiringon, 50 pg/ml kanamisin ve 25 ug/ml karbenisilin pH 5.6 ve ODeoo 0.6 ila 1.6 destekli YEB ortaminda yetistirilmistir. Agrobacterium süspansiyonlar kullanilmadan önce santrifüjlenmis ve infiltrasyon ortami içinde yeniden askiya alinmistir (10 mM MgCl2 ve 10 mM MES pH 5.6). Bitkiler D'Aoust ve ark. (supra) tarafindan tarif edilen sekilde agroinfiltre edilmistir. Özetle, vakum infiltrasyon için, A. tumefaci'ens süspansiyonlari santrifüjlenmis, infiltrasyon ortami içinde yeniden askiya alinmis ve 4 °C'de gece boyunca saklanmistir. Infiltrasyon gününde, kültür yiginlari 2.5 kültür hacmi içinde seyreltilmis ve kullanimdan önce isinmaya birakilmistir. N. benthami'ana bitkileri bütün olarak bakteriyel süspansiyon içine ters biçimde hava sizdirmaz paslanmaz çelik bir tank içinde 20-40 Torr vakum altinda 2 dakika boyunca yerlestirilmistir. Aksi belirtilmedigi sürece, tüm infiltrasyonlar R ile 1:1 oraninda dönüstürülen bir bakteriyelle birlikte infiltrasyon olarak gerçeklestirilmistir. Vakum infiltrasyonun ardindan, bitkiler hasata kadar 4-6 günlük bir inkübasyon süresi boyunca seraya geri getirilmistir. Yaprak numuneleme ve toplam protein ekstraksiyonu (mekanik homojenizasyon) 4, 5, 6, 7 ve 8 günlük inkübasyonun ardindan, bitkilerin havali kisimlari hasat edilmis ve hemen kullanilmistir. Toplam çözünür proteinler bitki dokusunun, %1 Trition X-100 içinde homojenize edilmesiyle ekstrakte edilmistir. Bitki dokulari bir POLYTRONT'V' kullanilarak, havan ve tokmak ile ögütülerek veya 1 ölçek soguk 50 mM Tris pH 8, 0.15 M NaCl içinde COMlTROLTM kullanilarak homojenize edilmistir. COMITROLTM ile birlikte kullanilan tampon ayrica %004 sodyum metabisülfit içermistir. Homojenizasyonun ardindan, ögütülmüs bitki malzemesi bulamaci 5,000 9'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjlenmis ve islenmemis ekstraktlar (süzüntü) analiz için tutulmustur. Temizlenen islenmemis ekstraktlarin toplam protein içerigi Bradford deneyi ile (Bio-Rad, Hercules, CA), referans standart olarak bovin serum albumin kullanilarak belirlenmistir. Hücre duvari parçalama ile VLP ekstraksiyonu Yaprak dokusu Nicotiana benthami'ana bitkilerinden toplanmis ve yaklasik 2 cm2'lik parçalar halinde kesilmistir. Yaprak parçalari 500 mM manitol içine 30 dakika boyunca oda sicakliginda (RT) daldirilmistir. Manitol çözeltisi daha sonra uzaklastirilmis ve enzim karisimiyla degistirilmistir (protoplast yapici çözelti (500 mM mannitol, 10mM CaCIz ve 5 mM MES/KOH (pH 5.6) içinde Trichoderma vi'ride'den selülazlarin karisimi (Onozuka R-10; %3 hacim/hacim) ve Rhizopus sp.'den pektinazlarin bir karisimi (MACEROZYMEW %075 hacim/hacim; her ikisi de Yakult Pharmaceuticals'dan)). Kullanilan oran 100 mL çözelti için 20 9 yaprak parçasidir. Bu preparasyon sig bir kap (yaklasik 11x18 cm) içine esit olarak dagitilmis ve bir döner çalkalayici üzerinde 16 saat boyunca 40 rpm ve 26 °C'de inkübe edilmistir. Alternatif olarak, VLP ekstraksiyonu asagidaki gibi gerçeklestirilebilir: bitkiler Örnek 1'de tarif edilen sekilde AGL1/#685 ile agroinfiltre edilebilir. Yaprak dokusu N. benthamiana bitkilerinden toplanmis ve infiltrasyondan sonra 6. günde yaklasik 2 cm2'lik parçalar halinde kesilmistir. Multifect Pectinase FE, Multifect CX CG ve Multifect CX B içinde her biri %10 (hacim/hacim) olacak sekilde 1:2.5 (agirlik/hacim) taze biyokütle:sindirim tamponu orani kullanilarak eklenmistir. Biyokütle 15 saat boyunca oda sicakliginda orbital bir çalkalayici içinde parçalanmistir. Inkübasyonun ardindan, yaprak kalintilari filtreleme yoluyla uzaklastirilmistir (250 veya 400 um aggözlü naylon filtre). Süspansiyon içindeki protoplastlar 200xg'de (15 dk.) santrifügasyonla toplanmis, ardindan 5000xg'de (15 dk.) santrifügasyon yapilarak süzüntü daha fazla temizlenmistir. Alternatif olarak, 5000 xg'de 15 dakika boyunca tek bir santrifügasyon adimi uygulanabilir. 70 mL süzüntü daha sonra 70,000xg'de 30 dakika boyunca santrifüjlenmistir. Elde edilen pelet 1.7 mL PBS içinde yeniden askiya alinmis ve hemen incelenmis veya dondurulmustur. Protein Analizi H5 için bir hemaglutinasyon deneyi Nayak ve Reichl (2004) tarafindan tarif edilen bir metoda dayandirilmistir. Özetle, test örneklerinin ( seri çift seyreltimleri, 100 pL PBS içeren V tabanli 96 kuyucuklu mikrotitre plakalar içinde yapilmis ve geriye kuyucuk basina 100 uL seyreltilmis numune kalmistir. Yüz mikrolitre %025 hindi alyuvar süspansiyonu (Bio Link lnc., Syracuse, NY) her bir kuyucuga eklenmis ve plakalar 2 saat oda sicakliginda inkübe edilmistir. Tam hemaglutinasyon gösteren en yüksek seyreltimin karsiligi hemaglutinasyon aktivitesi olarak kaydedilmistir. Buna paralel Corporation, Meriden, CT) PBS içinde seyreltilmis ve her bir plaka üzerinde kontrol olarak çalistirilmistir. HA5 standardi saflastirilmis virüs benzeri parçaciklarla hazirlanmis olup, bunlar %1 Triton X-1OO ile isleme tabi tutularak bozulmus ve ardindan bir Tissue LyserTM (Qiagen) ile 1 dakika boyunca mekanik karistirma yapilmistir. U tabanli 96 kuyucuklu mikrotitre plakalar, 50 mM karbonat-bikarbonat kaplama tamponu (pH 9.6) içinde 10 ug/mL boyunca 4 °C'de kaplanmistir. Tüm yikamalar, %0.1 Tween-20 içeren 0.01M PBS (fosfat tamponlu salin), pH 7.4 ile gerçeklestirilmistir. Inkübasyonun ardindan, plakalar üç kez yikanmis ve PBS içinde %1 kazein ile 1 saat boyunca 37 °C'de bloke edilmistir. Bloke etme adiminin ardindan, plakalar üç kez yikanmistir. HA5 standardi bir sahte ekstrakt içinde seyreltilmis (yalnizca AGL1/R472 ile infiltre edilen yaprak dokusundan hazirlanmistir) ve böylece 500 ila 50 ng/mL'lik bir standart egri olusturulmustur. Ölçülecek olan numuneler, mikroplaka yüklenmeden önce %1 Triton X-100 içinde isleme tabi tutulmustur. Plakalar 1 saat boyunca 37 °C'de daha fazla inkübe edilmistir. Yikamanin ardindan, karsi yetistirilen koyun poliklonal antikor eklenmis ve plakalar 37 °C'de 1 saat boyunca inkübe edilmistir. Yikamanin ardindan, 1:1000 oraninda seyreltilmis olan yabanturbu peroksidazla konjüge edilmis tavsan anti-koyun antikoru eklenmis ve plakalar 1 saat boyunca 37 °C'de inkübe edilmistir. Son yikamalarin ardindan, plakalar SureBIue TMB peroksidaz substratla (KPL) 20 dakika boyunca oda sicakliginda inkübe edilmistir. Tepkime 1N HCI eklenerek durdurulmus ve A450 degerleri bir Multiskan Ascent plaka okuyucu (Thermo Scientific) kullanilarak ölçülmüstür. Örnek 1: Bitki dokusunun enzimatik ekstraksiyonu, bagil aktivitesi arttirilmis olan yüksek miktarda HA salimi yapar Mevcut enzimatik ekstraksiyon metodundan elde edilen HA'nin miktari ve bagil aktivitesi, yaygin mekanik ekstraksiyon metotlarindan elde edilen HA ile karsilastirilmistir. N. benthamiana bitkileri AGL1/685 ile infiltre edilmis ve yapraklar bes ila alti günlük bir inkübasyon süresinin ardindan hasat edilmistir. Yaprak homojenatlari asagidaki sekilde hazirlanmistir: Iki gram yaprak bir Polytron homojenizör ile homojenlestirilmis; 4 gram yaprak bir havan ve tokmak ile ögütülmüs; ve 25 kg yaprak bir COMITROLTM isleyici (Urschel Laboratories) ile bir ekstraksiyon tamponu (50 mM Tris. 150 mM NaCl pH 8.0, 1:1 agirlik/hacim orani) içinde homojenlestirilmistir. Enzimatik ekstraksiyon asagidaki sekilde gerçeklestirilmistir: Hasat edilen 20 gram yaprak, yukarida tarif edilen sekilde Makerozim pektinazlar ve Onozuka R-10 selülazlarla sindirime tabi tutulmustur. Sindirimin ardindan, yaprak kalintilari filtreleme yoluyla uzaklastirilmistir (naylon filtre, 250 pm aggözü). Süspansiyon içindeki protoplastlar 200xg'de santrifügasyon ile uzaklastirilmis (15 dakika) ve süzüntü 5000xg'de (15 dakika) santrifügasyonla daha fazla temizlenmistir. Bu bitki ekstraktlarinin her birinin içindeki HA miktari ve bagil aktivitesi Tablo 3`te gösterilmistir. Hücre duvarinin enzimatik parçalamasi ile salinan HA miktari, kullanilan diger tekniklerle karsilastirildiginda önemli ölçüde daha fazladir. Tablo 3: Farkli mekanik veya enzimatik metotlarla üretilen bitki ekstraktindan geri kazanilan HA-VLP. Aktiviteye dayali ve ELISA karsilastirmalari için, veriler taze biyokütlenin sivi ekstraktinin bagil hacmine göre normalize edilmistir. Komitrol ekstraksiyonu kullanilarak elde edilen protein %100'e ayarlanmis ve diger metotlar bu degerle karsilastirilmistir. Ekstraksiyon metodu Bagil aktivite Miktar* ComitrolTM ekstrakti % 100 % 100 Politron ekstrakti % 50 % 150 Mortar ekstrakti % 100 % 220 Miktar ELISA analizi ile degerlendirilmistir. Örnek 2: Bitki dokusunun enzimatik parçalamasi VLP'Ierin içine organize HA salimi yapar Burada tarif edilen enzimatik ekstraksiyon metoduyla elde edilen HA'nin VLP'Ier biçiminde organize edildiginin gösterilmesi amaciyla diferansiyel santrifügasyon ve büyüklük dislanimli kromatografisi (SEC) kullanilmistir. N. benthamiana bitkileri, Örnek 1'de tarif edilen sekilde AGL1/685 ile agroinfiltre edilmistir. Yapraklar infiltrasyondan 6 gün sonra bitkilerden toplanmis, 2 cm2'lik parçalar halinde kesilmis ve ardindan parçalanmis, kaba filtrelenmis ve Örnek 1'de tarif edilen sekilde santrifüjlenmistir. Temizlenen numuneler daha sonra 70,000xg'de santrifüjlenerek VLP'Ierin ayrilmasi saglanmistir. VLP'leri içeren santrifügasyon peleti 1:50 hacim fosfat tamponlu salin (PBS; 0.1M sodyum fosfat, 0.15M NaCl pH 7.2) içinde nazikçe yeniden askiya alinmis ve ardindan bir SEC kolona yüklenmistir. GE Healthcare, Uppsala, Sweden, Kat. No. 17-0613-10) dengeleme/elüsyon tamponu (50 mM Tris, ile hazirlanmistir. SEC kromatografisi ekilibre edilmis (dengelenmis) kolon üzerine 1.5 mL VLP yüklenerek ve bunun 45 mL dengeleme/elüsyon tamponu ile elüsyonu ile gerçeklestirilmistir. Elüat 1.7 mL'lik fraksiyonlar halinde toplanmis ve her bir fraksiyonun protein içerigi 10 uL elüat fraksiyonunun ile karistirilmasiyla degerlendirilmistir. Her bir ayirmanin öncesinde Blue Dextran ile kalibrasyon yapilmistir. Hem Blue Dextran 2000 hem de konak proteinlerin elüsyon profillerinin karsilastirilmasi, ayirmalarin tekbiçimliligini saglamak amaciyla her bir ayirmada yapilmistir. SEC ile ayristirilan fraksiyonlarin protein analizi Temizlenen islenmemis ekstraktlarin protein içerigi Bradford deneyi ile (Bio-Rad, Hercules, CA), referans standardi olarak bovin serum albumin kullanilarak belirlenmistir. SEC elüat fraksiyonlarinda bulunan proteinler asetonla çökeltilmis (Bollag et al., 1996), SDS-PAGE analizi veya immünoblot analizi için sirasiyla 0.25 ölçek veya 0.05 ölçek denatüre edici numune yükleme tamponu (0.1M Tris pH 6.8, %005 bromofenol mavi, % içinde yeniden askiya alinmistir. SDS-PAGE ile ayirma indirgeyici kosullar altinda gerçeklestirilmis ve protein boyama için Coomassie Brillant Blue R-250 kullanilmistir. H5 için bir hemaglutinasyon deneyi Nayak ve Reichl (2004) tarafindan tarif edilen bir metoda dayandirilarak gerçeklestirilmistir. Özetle, test örneklerinin ( art arda çift seyreltimleri, 100 pL PBS içeren V tabanli 96 kuyucuklu mikrotitre plakalar içinde yapilmis ve geriye kuyucuk basina 100 uL seyreltilmis numune kalmistir. Yüz mikrolitre %025 hindi alyuvar süspansiyonu (Bio Link Inc., Syracuse, NY) her bir kuyucuga eklenmis ve plakalar 2 saat oda sicakliginda inkübe edilmistir. Tam hemaglutinasyon gösteren en yüksek seyreltimin karsiligi hemaglutinasyon aktivitesi olarak kaydedilmistir. Buna paralel olarak, bir rekombinant H5 standardi seyreltilmis ve her bir plaka üzerinde kontrol olarak çalistirilmistir. Sekil 3A, hemaglutinasyon aktivitesinin, kolonun bos hacmine denk düsen fraksiyonlarda konsantre edildigini göstermekte olup, hemaglutinasyon aktivitesinin yüksek moleküler agirlikli bir yapisal organizasyondan kaynaklandigini dogrular. SDS- PAGE analizi (Sekil 38) bu bos hacimli fraksiyonlarin (fraksiyon 7-10) ayni zamanda en yüksek HA içerigini sundugunu ve HAO monomerinin yaklasik olarak 75 kDa'da saptanabilir oldugu bir bandi ortaya çikarmistir. Örnek 3: Bitki dokusunun enzimatik parçalanmasi HA-VLP'Ieri daha az kirleticiyle birlikte salar N. benthami'ana bitkileri, Örnek 1'de tarif edilen sekilde AGL1/685 ile agroinfiltre edilmistir. Yapraklar infiltrasyondan 6 gün sonra toplanmis, 2 cm2'lik parçalar halinde kesilmis, parçalanmis, kaba filtrelenmis ve Örnek 1'de tarif edilen sekilde santrifüjlenmistir. Yapraklarin kontrollü enzimatik parçalanmasi hücre duvarlarini, en azindan kismen uzaklastirmis ve böylece hücre duvari ve plazma membrani arasindaki boslukta bulunan proteinler ve bilesenlerin ekstraksiyon ortamina salimina olanak tanimistir. Çogu hücre içi protein ve bilesen hala hasarsiz kaldigindan ve çogunlukla intakt protoplastlarin içinde bulundugundan dolayi, baslangiçtaki bir santrifügasyon adimi bunlarin uzaklastirilmasini saglamis ve böylece hücre duvari bozucu enzimleri ve bunlarin yani sira, Sekil 4'te gösterildigi gibi hücre disi bitki proteinlerini ve bilesenlerini (apoplastik fraksiyon) içeren bir çözelti saglamistir. Sekil 4'te, yukarida tarif edilen sekilde yaprak dokularinin kontrollü enzimatik parçalanmasinin ardindan elde edilen çözeltinin bir SDS-PAGE analizi gösterilmekte olup, serit 1'de kullanilan enzim karisimi ve serit 2'de enzimatik parçalamanin ardindan elde edilen çözelti gösterilmektedir. ComitrolTM'den bir islenmemis ekstraktin protein içerigi karsilastirma amaciyla serit 3'te saglanmistir. Serit 2'de sunulan ekstrakt için biyokütle:tampon orani 1:5 (agirlik/hacim) iken, serit 3'te sunulan için 1:1 (agirlik/hacim) olmustur. Serit 2 ve 3'ün her ikisi de bu nedenle esdeger miktardaki bir baslangiç malzemesinden türetilen proteinleri içerir. Yaklasik olarak ayni tampon:bitki oraninda, bir mekanik bitki ekstrakti yaklasik olarak 3.5-4 mg/ml'lik bir protein konsantrasyonu içerirken, mevcut metoda göre elde edilen enzimatik bitki ekstrakti ise yaklasik olarak 1 mg/ml'lik bir protein konsantrasyonu göstermistir. Serit 3'te sunulan ana kirleticinin RubisCo (Ribuloz-1,5-bisfosfat karboksilaz oksijenaz) oldugu bulunmus olup, bu, iki protein alt biriminden olusur: bir büyük zincir (L, yaklasik 55 kDa) ve bir küçük zincir (S, yaklasik 13 kDa). Toplam sekiz büyük zincirli ve sekiz küçük zincirli dimer birleserek 540 kDa'lik daha büyük bir RubisCo kompleksi olusturur. Bu bitki protein kirleticisi mekanik ekstraksiyon metodundan kaynaklanan bitki ekstraktlarinda daha büyük miktarda bulunurken (bkz., asagidaki Sekil 4), burada tarif edilen enzimatik parçalama metoduyla elde edilen bitki ekstraktlarinda neredeyse hiç bulunmaz. Bu nedenle, mevcut metot bu ana bitki protein kirleticisinin, digerlerinin yani sira, prosesin erken bir asamasinda eliminasyonuna olanak tanir. Örnek 4: Bitki dokusunun enzimatik parçalanmasi, bir katyon degistirici reçine üzerinde dogrudan yakalanabilecegi durumlarda HA-VLP salimi yapar N. benthamiana bitkileri, Örnek 1'de tarif edilen sekilde AGL1/685 ile agroinfiltre edilmistir. Yapraklar infiltrasyondan 6 gün sonra toplanmis, 2 cm2'lik parçalar halinde kesilmis ve oda sicakliginda orbital bir çalkalayici içinde 15 saat boyunca parçalanmistir. Parçalama tamponu %1.0 (hacim/hacim) Multifect Pectinase FE, %1.0 (hacim/hacim) Multifect CX CG ve/veya %1.0 (hacim/hacim) Multifect CX B (tamami Genencor'dan) içermis olup, bunlarin her biri 600 mM Mannitol, 75 mM Sitrat, %0.04 sodyum bisülfit pH 6.0 tampon çözeltisi içinde bulunur ve biyokütle : seyreltme tamponu orani 1:2.5 (agirlik/hacim) olarak kullanilmistir. Parçalamanin ardindan, apoplastik fraksiyon 400 um naylon filtre içerisinden filtrelenerek kaba parçalanmamis bitkisel doku (baslangiç biyokütlesinin TR TR TR TR TR TR TR TR TR

Claims (1)

1.