TR201807076T4 - Viral enfeksiyonların ve diğer hastalıkların tedavisine yönelik pirolo[3,2-d]pirimidin derivatları. - Google Patents

Abstract

Bu buluş pirolo[3,2-d]pirimidin derivatları, bunların hazırlanmasına yönelik prosesler, farmasötik bileşimler ve bunların tedavisindeki kullanımları ve/veya hastalıkların tedavisi ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME VIRAL ENFEKSIYONLARIN VE DIGER HASTALIKLARIN TEDAVISINE YÖNELIK PIROLO[3,2-D]PIRIMIDIN DERIVATLARI Bu bulus pirol0[3,2-d]pirimidin derivatlari, bunlarin hazirlanmasina yönelik prosesler, farmasötik bilesimleri ile ilgilidir. Mevcut bulus pirolo-pirimidin derivatlari, daha spesifik olarak viral enfeksiyonlarin, bagisiklik veya infamatuvar bozukluklarin tedavisinde kullanilabilen pirolo[3,2- d]pirimidin derivatlari ile ilgilidir, burada toII benzeri reseptörlerin (TLR'Ier) modülasyonu veya agonizmasi dahildir. Toll-Benzeri Reseptörler bir korunan bölge içeren ekstraselüler Iösin zengini bir alan ve bir siktoplazmik uzanti ile karakterize edilen primer transmembran proteinlerdir. Kalitsal bagisiklik sistemi belirli bagisiklik hücrelerinin hücre yüzeyinde ifade edilen TLR'Ier yoluyla patojen iliskili moleküler modelleri içerebilir. Yabanci patojenlerin taninmasi sitokinlerin üretimini ve fagositler üstünde yardimci uyaran moleküllerinin yukari dogru düzenlenmesini aktive eder. Bu T hücresi davranisinin modülasyonuna yol açar. Memeli türlerinin çogunda on ila on bes ToII benzeri reseptör bulunur. Insanlarda ve farelerde birlikte on üç TLR (basit bir sekilde TLR1 ila TLR13 olarak adlandirilir) tespit edilmistir ve bunlarin çogunun esdeger formlari diger memeli türlerinde bulunmustur. Ancak, insanlarda bulunan bazi TLR'Ierin esdegerleri tüm memelilerde bulunmaz. Örnegin, insanlardaki TLR 10'a benzer bir proteini kodlayan bir gen farelerde bulunur, fakat geçmiste bir noktada retrovirüs ile zarar görmüs olmalidir. Diger taraftan, farelerde hiçbiri insanlarda bulunmayan TLR 11, 12 ve 13 yer alir. Diger memeliler insanlarda bulunmayan TLR'Ier içerebilir. Diger memeli olmayan türler, Takifugu kirpi baliginda bulunan TLR 14 ile gösterilen memelilerden farkli TLR'Iere sahip olabilir. Bu insan kalitsal bagisikliginin modelleri olarak deneysel hayvanlari kullanma prosesini karmasiklastirabilir. Toll benzeri reseptörler ile ilgili incelemeler hakkinda bilgi almak amaciyla, asagidaki Bazi viral enjeksiyonlarin tedavisinde, hepatit C virüsünde (HCV) oldugu gibi düzenli interferon (IFN-alfa) enjeksiyonlari uygulanabilir (Fried et. al. Peginterferon-alfa plus olarak uygulanabilen küçük molekül IFN indükleyicileri azalan imünojenisite ve uygulama kolayligi gibi potansiyel avantajlar sunar. Bu yüzden, yeni IFN indükleyicileri virüs enfeksiyonlari tedavi etmeye yönelik potansiyel olarak etkili yeni sinif ilaçlardir. Antiviral etkiye sahip IFN indükleyicide bir küçük molekül Iiteratüründe bir örnek görmek Bazi kanser türlerinin tedavisinde diger ilaçlar ile birlikte hastalara interferon alfa da Ancak, önceki teknigin bilesikleri ile karsilastirildiginda tercih edilen selektiviteye ve iyilestirilmis bir güvenlik profiline sahip olan ToII Benzeri reseptör modülatörlerine yönelik kuvvetli bir ihtiyaç da bulunur. Mevcut bulus uyarinca bir formülün (I) bilesigi ve bunlarin farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlari, solvatlari veya polimorflari saglanir, burada 2-amino-4-(N-bütilamin0)-5-(alfametilbenzil)pirolo[3,2-d] pirimidinin hariç tutulmasi kosuluyla R1, H, florin veya metildir; R2, H, halojen veya C1-3 alkildir; R3, ariloksi, halojen, aril, alkilamino, dialkilamino, heterosikloalkil, 01-6 sikloalkil, CH; alkil, karboksilik asit, karboksilik ester, karboksilik amit, nitril veya 01-5 alkoksiden bagimsiz olarak seçilen bir veya daha fazla sübstitüent ile ayrica istege bagli olarak sübstitüte edilen aril ile istege bagli olarak sübstitüe edilen 01-6 alkildir; veya heterosikloalkildir; veya R3 istege bagli olarak ayrica aril ile sübstitüe edilen C1-s alkoksi ile istege bagli olarak sübstitüe edilen C1-e alkildir; R4 hidroksil, Cu; alkoksi, Cm alkil, C3.7 sikloalkil, 02-5 alkenil, aril, istege bagli olarak C1- e alkil ile sübstitüte edilen heteroaril ve ayrica istege bagli olarak Ci-e alkil ile sübstitüte edilen C3-7 sikloalkilden bagimsiz olarak seçilen bir veya daha fazla sübstitüent ile istege bagli olarak sübstitüe edilen C1-8 alkildir. Tercih edilen bilesikler formülünkilerdir (I), burada R3 bir aril ile sübstitüte edilen (sübstitüe edilmis veya sübstitüe edilmemis) bir C1-3 alkil gruptur ve R1, R2 ve R4 yukarida açiklandigi gibidir. Bir ikinci düzenlemede, formülün (I) bilesikleridir, burada R3 ve R4 bir aril ile sübstitüe edilen, ayrica istege bagli olarak yukari açiklandigi gibi sübstitüe edilen bir 01-3 alkildir. Bir diger düzenlemede formülün (I) bilesikleridir, burada R1 hidrojen, R2 florin ve R3 ve R4 yukarida açiklandigi gibidir. Diger tercih edilen düzenlemeler formülünkilerdir (I), burada R1 florin ve R2 hidrojen ve R3 ve R4 yukarida açiklandigi gibidir. 215) Tablo I ve "de siralanan bilesikler, burada açiklanan bulusa göre özellikleri Formülün (I) bilesikleri ve farmasötik olarak kabul edilebilir tuzu, solvat veya polimorfu farmasötikler olarak, özellikle ToII-Benzeri Reseptör (özellikle TLR7 ve/veya TLR8) olarak aktiviteye sahiptir. Bir diger açida mevcut bulus formülün (I) bir bilesigini veya farmasötik olarak kabul edilebilir bir veya daha fazla eksipiyan, seyreltici veya tasiyicisi olan bir bilesigini veya bunun farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzunu, solvatini veya polimorfunu içeren bir farmasötik bilesim saglar. Ayrica, mevcut bulusa göre formülün (I) bir bilesigini veya bunun farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzu, solvati veya polimorfunu veya söz konusu formülün (I) bilesigini veya farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzunu, solvatini veya polimorfunu içeren farmasötik bir bilesim bir ilaç olarak kullanilabilir. Formülün (I) bir bilesigi veya farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzu, solvati veya polimorfu veya söz konusu formülün (I) bilesigini veya farmasötik olarak kabul edilebilir tuzu, solvati veya polimorfunu içeren söz konusu farmasötik bilesim TLR7 ve/veya TLR8'in modülasyonunun yer aldigi herhangi bir bozuklugun tedavisinde uygun bir sekilde kullanilabilir. ayrilmis zincir doymus alifatik hidrokarbona refere eder. olusan yukarida belirtildigi gibi bir alkil içerir. alkil (karbon ve hidrojen zinciri) gruba refere eder. heteroatomu içeren bir aromatik halka yapisi anlamina gelir. Söz konusu aromatik halka yapisi 5, 6 veya 7 halka atomuna sahip olabilir. Özellikle. söz konusu aromatik halka yapisi 5 veya 6 halka atoma sahip olabilir. Söz konusu aromatik halka yapisi bisiklik yapiyi destekleyen bir baska ariI halka yapisina da baglanabilir (örnekler asagidakiler ile sinirli olmamak kaydiyla sunlari içerir: kinolin, izokinolin, kinazolin, benzoksazol). oksijene tekli baglidir (örnegin fenoksi). atomunu içeren doymamis bir hidrokarbon zincirine refere eder. tetrahidrofuran, dioksan veya diger siklik eterleri içerir. Nitrojen içeren heterosiklikler arasinda örnegin azetidin, morfolin, piperidin, piperazin, pirolidin ve benzeri yer alir. Diger heterosiklikler örnegin tiomorfolin, dioksolinil ve siklik sülfonlari içerir. Formülün (l) bilesiklerinin farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlari asit katkisini ve bunun baz tuzlarini içerir. Uygun asit katki tuzlari toksik olmayan tuzlari olusturan asitlerden olusturulur. Uygun baz tuzlari toksik olmayan tuzlari olusturan bazlardan olusturulur. Bulusun bilesikleri ayrica, solvatlanmamis ve solvatlanmis formlarda mevcut olabilir. edilebilir solvent molekülünü, örnegin etanolü içeren bir moleküler kompleksi açiklamak üzere kullanilir. özelligine refere eder. Mevcut bulusun bilesikleri kristalin veya amorf ürünler olarak uygulanabilir. Presipitasyon, kristalizasyon, dondurarak kurutma, sprey kurutma veya buharla kurutma gibi yöntemler ile örnegin kati dolgu maddeleri, tozlar veya filmler olarak elde edilebilirler. Tek basina veya bulusun bir veya daha fazla bilesigi ile kombinasyon halinde veya bir veya daha fazla diger ilaç ile kombinasyon halinde uygulanabilirler. Genellikle, bir veya daha fazla farmasötik olarak kabul edilebilir eksipiyan ile birlikte bir formülasyon olarak uygulanirlar. Burada "eksipiyan" ifadesi bulusun bilesiginden(bilesiklerinden) baska herhangi bir içerik maddesini açiklamak üzere kullanilir. Eksipiyan seçimi büyük ölçüde özel uygulama modu, eksipiyanin çözünürlüge ve stabiliteye etkisi ve dozaj formunun dogasi gibi faktörlere baglidir. Mevcut bulusun veya bunun herhangi bir alt grubunun bilesikleri uygulama amaçlarina yönelik olarak çesitli farmasötik formlarda formüle edilebilir. Uygun bilesimler olarak genellikle sistematik bir sekilde kullanilan ilaçlari içeren tüm bilesimler belirtilebilir. Bu bulusun farmasötik bilesimlerini hazirlamak üzere, özel bilesiginin etkili bir miktari, istege bagli olarak katki tuzu formunda, aktif içerik maddesi olarak farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici ile siki bir karisim halinde kombine edilir, bu tasiyici uygulamaya yönelik istenen preparat formuna bagli olarak çok çesitli formda olabilir. Bu farmasötik bilesimlerin örnegin oral, rektal veya perkütan uygulama açisindan uygun birim dozaj formunda olmasi tercih edilir. Örnegin oral dozaj formunda bilesimlerin hazirlanmasinda süspansiyonlar, suruplar, eliksirler, emülsiyonlar ve solüsyonlar gibi oral sivi preparatlar durumunda örnegin su, glikoller, yaglar, alkoller ve benzeri veya tozlar, haplar, kapsüller ve tabletler durumunda nisastalar, sekerler, kaolin, seyrelticiler, yaglayicilar, baglayicilar, dagitici ajanlar ve benzeri gibi kati tasiyioilar gibi herhangi bir genel farmasötik ortam kullanilabilir. Uygulamadaki kolay kullanimi nedeniyle tabletler ve kapsüller en avantajli oral dozaj birim formlarini temsil ederi bu durumda kati farmasötik tasiyicilar belirgin sekilde kullanilir. Ayrica kullanimdan hemen önce sivi formlara dönüstürülebilen kati form preparatlari da bulunur. Perkütan uygulamaya yönelik uygun bilesimlerde, tasiyici istege bagli olarak, az oranlarda herhangi bir yapidaki uygun katki maddesi ile istege bagli olarak kombine edilen bir penetrasyon arttirma ajani ve/veya uygun bir islatma ajani içerir, bu katki maddeleri deriye karsi önemli zararli bir etkiye neden olmaz. Söz konusu katki maddeleri deriye uygulanmayi kolaylastirabilir ve/veya istenen bilesimleri hazirlamaya yararli olabilir. Bu bilesimler örnegin transdermal bir yol olarak, tam yerine uygulama olarak, bir merhem seklinde çesitli yollarla uygulanabilir. Mevcut bulusun bilesikleri bu yöntem ile uygulamaya yönelik teknikte kullanilan yöntemler ve formülasyonlar yardimiyla inhalasyon veya insuflasyon yoluyla da uygulanabilir. Böylece, genelde mevcut bulusun bilesikleri bir solüsyon, süspansiyon veya kuru toz formunda cigerlere uygulanabilir. Yukarida açiklanan farmasötik bilesimlerin uygulama kolayligi ve dozaj homojenligi bakimindan birim dozaj formunda formüle edilmesi özellikle avantajlidir. Burada kullanilan birim dozaj formu, birim dozaj formlari olarak uygun olan fiziksel açidan ayri birimlere refere eder, her bir birim gerekli farmasötik tasiyici ile iliskili olarak istenen terapötik etkiyi üretmek üzere hesaplanan aktif bilesenin önceden belirlenen bir miktarini içerir. Bu tür birim dozaj formlarinin örnekleri, tabletleri (çentiklenmis veya kaplanmis tabletler), kapsüller, haplar, toz paketler, pullar, supozituvarlar, enjekte edilebilir solüsyonlar veya süspansiyOnlar ve benzeri ve bunlarin ayrilmis katlaridir. Bulasici hastaliklarin tedavisinde uzman kisiler. buradan sonra sunulan test sonuçlarindan etkili miktari kolay bir sekilde belirleyebilecektir. Genellikle etkili bir günlük miktarin 0.01 mg/kg ila 50 mg/kg vücut agirligi, daha çok tercih edildigi üzere 0.1 mg/kg ila 10 mg/kg vücut agirligi arasinda olmasi beklenir. Gerekli dozun gün boyunca uygun araliklarda iki, üç, dört veya daha fazla alt dozlar olarak uygulanmasi uygun olabilir. Söz konusu alt dozlar örnegin birim dozaj formu basina örnegin 1 ila 1000 mg, özellikle 5 ila 200 mg aktif içerik içeren birim dozaj formlari olarak formüle edilebilir. Uygulamanin tam dozaji ve sikligi, teknikte uzman kisilerce iyi bilindigi üzere kullanilan formülün (I) özel bilesigine, tedavi edilen belirli duruma, tedavi edilen durumun ciddiyetine, belirli hastanin yas, agirlik ve genel fiziksel durumu ve ayrica bireyin aldigi diger ilaç tedavisine baglidir. Ayrica etkili günlük miktarin tedavi edilen kisinin yanitina bagli olarak ve/veya mevcut bulusa ait bilesikleri reçete ile veren hekimin degerlendirilmesine bagli olarak düsürülebildigi veya artirilabildigi bilinir. Bu yüzden yukarida belirtilen etkili miktar araliklari sadece anahatlari saglamaya yöneliktir ve bulusun kapsamini veya kullanimini hiçbir sekilde sinirlamayi amaçlamaz. Deneysel Bölüm Sema 1. Tüm reaksiyon semasi C N Er^ Il _1 I, \ MWHI N J ` I :i :I kû - _f.._ rh?" kil/â ci: CIPEA DMF i ,- «'-'›== ` f, V NMPJ'H_ C 9" V ' KTC. 42- 5.531 [J, (t /1 Semadaki (1) tip (A) bilesikleri bir polar aprotik solvent, örnegin DMF kullanilarak benzil bromitler ile alkillenebilir. Alkil halitlerin ara ürün (A) ile reaksiyonu daha kuvvetli bir baz (örnegin sezyum karbonat) ve muhtemelen daha uzun bir reaksiyon süresi ve/veya daha yüksek sicaklik gerektirir. Tipte (C) bilesikler olusturmak üzere ara üründeki (B) klorinin bir amin ile degistirilmesi aminoalkoller ile gözlendigi gibi daha fazla isitma veya uzun reaksiyon süresi gerektirebilir (aminoalkollerin hazirlanmasi hakkinda bilgi klorinin bir amin ile degistirilmesi oda sicakliginda bir polar solvent (örnegin DMF veya asetonitril) içinde de gerçeklesebilir. Reaksiyonda (B'den C'ye) destek olmak amaciyla asagidakiler ile sinirli olmamak kaydiyla çesitli bazlar kullanilabilir: trietilamin, diizopropilamin, sezyum karbonat, potasyum karbonat veya sodyum hidrit. Ara ürün (D) ile ifade edilen bilesiklerdeki azido grubun azalmasi bir hidrojen atmosferinde Pd/C üstünden de gerçeklesebilir. Florin içeren ara ürünler (B, C ve D) sübstitüe edilmemis analoglar gibi ayni protokoller altinda sübstitüe edilebilir, bu yüzden açiklanan reaksiyon semalari her iki bilesik türünde de geçerlidir. Ara ürün B'nin hazirlanmasi (3. H 01955. DMF_ U mmol), DMF (10 mL), DIPEA ( koyulmustur. Viyal kapatilmistir ve 16 saat boyunca oda sicakliginda çalkalanmistir. Solventler azaltilmis basinç altinda çikarilmistir. Ham ürün heptan ila etil asetat gradiyent kullanilarak silika jel sütun kromatografisi yoluyla saflastirilmistir. En iyi kesitler toplanmis ve B'yi saglamak üzere azaltilmis basinç altinda solventler çikarilmistir. LC-MS (M+H) m/z = 278 Ara ürün BZ'nin hazirlanmasi O YNIS BrNO\ IYI/S 7/ " C` CO CI k` Bir manyetik karistirma çubugu bulunan 50 lelik bir viyale, A (50 mg, 0.27 mmol), susuz DMF (1 mL), sezyum karbonat (0.259 9, 0.8 mmol) ve sonra 2-bromoetil metil eter ( koyulmustur. Balon kapatilmis ve reaksiyon 2 saat boyunca 70°C'de karistirilmaya birakilmistir. Solventler azaltilmis basinç altinda çikarilmistir. Ham ürün heptan ila etil asetat gradiyent kullanilarak silika jel sütun kromatografisi yoluyla saflastirilmistir. En iyi kesitler toplanmis ve BZ'yi saglamak üzere azaltilmis basinç altinda solventler çikarilmistir. LC-MS (M+H) m/z = 246 Ara ürün Clnin hazirlanmasi 100°C. "3 5.551 1/ `\ / Bir manyetik karistirma çubugu bulunan 50 mL'lik bir yuvarlak tabanli balona, B (1.4 9, 5.03 mmol), n-bütilamin ( koyulmustur. Balonda bir reflü kondensatör kullanilmistir ve 16 saat boyunca 100°C`de karistirilarak isitilmistir. Oda sicakligina sogutulduktan sonra, solventler azaltilmis basinç altinda çikarilmistir. Ham ürün heptan ila etil asetat gradiyent kullanilarak silika jel sütun kromatografisi yoluyla saflastirilmistir. En iyi kesitler toplanmis ve C'yi saglamak üzere azaltilmis basinç altinda solventler çikarilmistir. LC-MS (M+H) m/z = 315 Ara ürün Dlnin hazirlanmasi KI( ik:) NMPIHZOA 911 /"I E* 1709C_ î Esat Bir manyetik karistirma çubugu bulunan bir cam viyale, C (1 9, 3.18 mmol), sodyum karisim 5 saat boyunca karistirilarak 170°C`ye isitilmistir. Oda sicakligina sogutulduktan sonra, karisim etil asetat (20 mL) ile seyreltilmis ve su (5 x 15 mL) ile yikanmistir. Organik katman magnezyum sülfat ile kurutulmus, kati maddeler filtrasyon ile çikarilmistir ve filtratin solventleri azaltilmis basinç altinda çikarilmistir. Ham ürün heptan ila etil asetat gradiyent kullanilarak silika jel sütun kromatografisi yoluyla saflastirilmistir. En iyi kesitler toplanmis ve D'yi saglamak üzere azaltilmis basinç altinda solventler çikarilmistir. LC-MS (M+H) m/z = 322 1'in Hazirlanmasi Bir manyetik karistirma çubugu bulunan cam viyale, D (100 mg, 0.311 mmol), 1,4- dioksan (4 mL), su (1 mL) ve trifenilfosfin (245 mg, 0.93 mmol) koyulmustur. Cam viyal kapatilmis ve karisim 48 saat boyunca karistirilarak 120°C'ye isitilmistir. Oda sicakligina sogutulduktan sonra, solventler azaltilmis basinç altinda çikarilmistir. Ham ürün diklorometan gradiyent içinde diklorometan %10 metanol kullanilarak silika jel sütun kromatografisi yoluyla saflastirilmistir. En iyi kesitler toplanmis ve 1'i saglamak üzere azaltilmis basinç altinda solventler çikarilmistir. LC-MS (M+H) m/z = 296 86'nin Hazirlanmasi Nsîê _ .iv/LX( (3 oya; I Bir manyetik karistirma çubugu bulunan cam viyale, 1 (110 mg, 0.372 mmol), nitrometan ( koyulmustur. Cam viyal kapatilmis ve karisim 16 saat boyunca oda sicakliginda karistirilmistir. Solventler azaltilmis basinç altinda çikarilmistir. Ham ürün ters azaltilmis basinç altinda saflastirilmistir. En iyi kesitler toplanmis ve 86'yi saglamak üzere azaltilmis basinç altinda solventler çikarilmistir. Ara ürün E'nin hazirlanmasi Bir manyetik karistirma çubugu bulunan cam viyale, A (600 mg, 3.19 mmol), nitrometan (10 mL) ve selektflor (5.67 9, 16 mmol) koyulmustur. Cam viyal kapatilmis ve karisim 48 saat boyunca oda sicakliginda karistirilmistir. NaHCOs (doymus aköz, mL) eklenmis ve etil asetat (3 x 15 mL) ile ayristirilmistir. Organik katmanlar toplanmis, magnezyum sülfat ile kurutulmus, kati maddeler filtrasyon ile çikarilmis ve sonraki adimda kullanildigi gibi E'yi saglamak üzere filtratin solventi azaltilmis basinç altinda çikarilmistir. LC-MS (M+H) m/z = 206 Ara ürün G'nin hazirlanmasi »4 M »4 HOAN N ` BORDBU HN N N)k H yim-..v ci): H üzere kullanilan yönteme göre hazirlanmistir. Bunun tek istisnasi asetil grup trimetilasetil grupta kullanilmistir. Adim 2. Ara ürün G'nin hazirlanmasiBir manyetik karistirma çubugu bulunan 50 mL'Iik cam viyale, F (200 mg, 0.97 mmol), susuz DMF (5 mL), DBU ( koyulmustur. Reaksiyon karisimi birkaç dakika boyunca karistirildiktan sonra bir solüsyon haline gelir, sonra n-bütilamin ( eklenmis ve karistirma oda sicakliginda 16 saat boyunca devam eder. Solvent azaltilmis basinç altinda çikarilmis ve ham ürün ters faz kromatografisi ile saflastirilmistir. LC-MS (M+H) m/z = 262 Sema 2. Tüm reaksiyon semasi . _ "PO îî ti_ JJ. ,C .. _ L N›- i , -44` f , m_ /HVL li," l`, `T `r \ 4 3 . / '] w _I M i'/\|/ w N 4 .-_... N fg" i :i r Genel prosedür. Semadaki (2) tip (X) bilesikleri bir polar aprotik solvent, örnegin THF içinde Mitsunobu kosullari kullanilarak alkoller ile fonksiyonellestirilebilir. Metil karbamatin klevaji ara ürünü (Z) olusturmak üzere 1,4-dioksan içinde temel kosullar altinda gerçeklestirilmistir. Formülün (l) bilesiklerini olusturmak üzere ara üründeki (Z) klorinin bir polar solvent (örnegin NMP) içindeki bir amin ve bir baz (örnegin NaH) ile degistirilmesi gerçeklestirilmistir. Ara ürün X'in hazirlanmasi 0 / o o- HN POCI3 "N \ NH NaOCHg. ci-eioi-i "0 N H 0 CH3CN H 2 ::a sinda& 'ê-ssat 70`C NaHC03 arasinda ayrilmis, MgSO4 ile kurutulmus ve kurutuluncaya kadar mmol) ve asetik asit (39 mL, 677 mmol) ile birlikte metanol içinde çözündürülmüs ve oda sicakliginda 1 saat boyunca karistirilmistir. Bir presipitat ortaya çikmistir ve karistirma gece boyunca devam ettirilmistir. Sodyum metoksit (73.1 9, 1353 mmol) eklenmistir. Bir egzoterm gözlenmis ve reaksiyon karisimi gece boyunca karistirilmistir. Reaksiyon karisimi asetik asitin eklenmesi yoluyla pH 5 derecesine getirilmis ve presipitat filtrelenmis, su (2 x ve diizopropileter (1 x ile toz haline getirilmistir. Elde edilen metil N-(4-hidroksi-5H-pir0lo[3.2- d]pirimidin-2-il)karbamat firinda kurutulmustur. çok boyunlu bir balon içinde oda sicakliginda asetonitrile ( dagitilmistir. POCI3 ( eklenmis ve reaksiyon karisimi bir üstten, mekanik karistirici (300 rpm) ile karistirilarak 70°C'ye isitilmistir. Hunig bazi ( 0.2 mL/dakika akis oraninda bir siringa pompasi ile damla damla eklenmistir. Reaksiyon karisimi oda sicakligina sogutulmus ve su içinde ( 45°C'de bir karistirilmis sodyum asetat solüsyonuna (78.8 9, 961 mmol) dökülmüstür. Organik maddeler buharlastirilmis ve kalan sivi bir buz banyosunda sogutulmustur. Olusturulan kati madde filtrasyon ile ayrilmis, asetonitril ile yikanmis ve vakum altinda kurutulan bir kati madde olarak ara ürün (X) elde etmek üzere diizopropileter ile toz haline getirilmistir. Ara ürün Y'nin hazirlanmasi H\?\i` A HO/\//" i pS~Pph1 ...- !da ci NANÄO/ D'AO ciÄivi//Nako/ oda sicakiiginda. 30 dakika Susuz (THF) (, 2- piridinmetanol ( oda sicakliginda DlAD ( eklenmis ve reaksiyon karisimi 30 dakika boyunca karistirilmis sonra azaltilmis basinç altinda konsantre edilmistir. Ürün kromatografisi yoluyla saflastirilmistir. Ürün kesitleri toplanmis ve basinç altinda konsantre edilmistir. Ürün asetonitril içinde tekrar kristalize edilmis, filtrasyon ile ayrilmis ve bir beyaz kati madde olarak Y`yi saglamak üzere vakum altinda kurutulmustur. Ara ürün Z'nin hazirlanmasi Ä / 14 iolsan 60'C.-saat CINNO HZ çözündürülmüs ve 1 N NaOH (34 mL) eklenmistir. Karisim, 5 saat boyunca 60°C'ye isitilmistir. Karisim sogutulmustur ve azaltilmis basinç altinda konsantre edilmistir. Kalinti su ile islenmistir ve presipitat filtrasyon ile ayrilmis ve Z'yi saglamak üzere kurutulmustur. Ürün sonraki adimda bu sekilde kullanilmistir. 1001215 saat 0 diizopropiletilamin ( içinde çözündürülmüstür. Karisim 2 saat boyunca 100°C'de karistirilmistir sonra sogutulmus ve vakumda konsantre edilmistir. Prep HPLC (su, metanol Içinde Sabit faz: RP Vydac Denali ile saflastirilmis, istenen kesitler toplanmis ve vakum altinda konsantre edilmistir. Ürün asetonitril içinde toz haline getirilmis, filtrasyon ile ayrilmis ve bir beyaz kati madde olarak 155"i elde etmek üzere vakum altinda kurutulmustur. Tablo 1. Formülün (I) bilesikleri ve ilgili analitik veriler. Bilesikler deneysel bölümde açiklanan yöntemlere göre hazirlanmistir. *R, R konfigürasyonunda çizilen, bilinmeyen bir konfigürasyonun saf bir enantiyomerini belirtir. *8, S konfigürasyonunda çizilen, bilinmeyen bir konfigürasyonun saf bir enantiyomerini belirtir. Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( 23 ppm 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- 1H NMR ( ö ppm 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- A, 1.95 264 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- J=8.0, 5.8 Hz, 1 H) 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- A, 2.78 372 1H NMR ( ö ppm 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 7.28 (d, J=2.9 Hz, 1 H) J=7.1, 5.6 Hz, 2 H), 4.07 (t, 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- A, 2.14 297 1H NMR ( ö ppm 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( ö ppm 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- 1.2 Hz, 1 H) A, 2.47 330 1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM- 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( ö 9.14 (dd, J=4.9, 1.6 Hz,1 H) 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- 7.12 (m, 2 H) 1H NMR ( ö ppm 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( ö ppm 1 H), , 7.23 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 1H NMR ( ö ppm 7.57 (d, J=3.2 Hz, 1 H) A, 1.51 248 1H NMR ( ö ppm A, 1.45 301 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( ö ppm 7.36 (d, J=3.0 Hz, 1 H) 1H NMR ( ö ppm 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- A, 2.15 282 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 732-747 (m, 3 H) 1H NMR ( ö ppm J=4.00, 0.80 Hz, 1 H) 1H NMR ( ö ppm B, 0.8 355 1.09 - 1.18 (m, 2 1H NMR 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 12.35 (br. s., 1 H) 1H NMR ( ö ppm A, 2.07 326 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 7.44 (d, J=3.0 Hz, 1 H) 1H NMR (300 MHZ, CHLOROFORM- 7.26 - 7.39 (m, 3 H) 1H NMR (300 MHZ, CHLOROFORM- AI 2.4 310 1H NMR ( ö ppm J=3.0 Hz, 1 H) 1H NMR ( ö ppm A, 1.96 268 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 2 H), 7.19 - 7.39 (m, 4 H) 1H NMR ( ö ppm .1:31 Hz, 1 H) 1H NMR ( ö ppm 1H NMR 1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM- 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- 1H NMR ( ö ppm LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi A, 2.26 326 A, 2.23 314 1H NMR H) 7.39 (d, J=3.02 Hz, 1 H) 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- 7.47 (m, 3 H) 1H NMR (300 MHZ, CHLOROFORM- LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi A, 2.27 314 A, 2.46 322 A, 2.09 320 1H NMR 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- 7.24 - 7.41 (m, 3 H) 1H NMR (300 MHZ, CHLOROFORM- H) 7.21 - 7.27 (m, 3 H) 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi A, 226 308 A, 2.32 308 A, 1.97 335 A, 1.83 334 1H NMR 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi A, 2.52 347 A, 2.45 310 A, 2.68 302 1H NMR 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- J=3.02 Hz, 1 H) 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi A, 2.19 260 A, 2.46 310 A, 2.47 326 C, 4.68 298 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- H) 8.10 (d, J=8.39 Hz, 1 H) 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- A, 256 310 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- A, 237 274 1H NMR 1H NMR (300 MHz. CHLOROFORM- J=3.30 Hz, 1 H) 1H NMR ( ö 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- J=3.02 Hz, 1 H) 1H NMR ( Ö ppm LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi A, 1.86 337 A, 1.28 331 A, 2.33 274 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- C, 4.21 297 8.59 (m, 1 H) 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- A, 2.61 347 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- 69 Of" 1H NMR H) 6.70 (d, J=3.02 Hz, 1 H) 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- H) 8.19 (br. s., 1 H) 1H NMR (300 MHZ, CHLOROFORM- 1H NMR (300 MHz. CHLOROFORM- LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi A, 1.16 319 A, 1.76 336 A, 2.44 326 YAPI 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- N: 1 Ü N\ d) 25 ppm 0.74 (t, J=7.4O Hz, 3 H) 8.51 - 8.59 (m, 2 H) A, 1.14 297 1H NMR (300 MHZ, CHLOROFORM- 7.79 (m, 1 H) 1H NMR (300 MHZ. CHLOROFORM- N / N\ A 1.16-1.29(m,2 ' ' 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi J=4.95, 2.89 Hz, 1 H) 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- J=5.09, 0.96 Hz, 1 H) 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- 7.23 _7.34 (m, 1 H) A, 253 328 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- A, 2.58 340 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi J=3.02 Hz, 1 H) 1H NMR ( ö ppm 7.30 (m, 3 H) 1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM- J=3.02 Hz, 1 H) 1H NMR ( 6 7.31 (t, 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 0.61 (t, J = 7.2 Hz, 3H). 1H NMR ( 6 7.34 (t, 1H NMR ( 6 7.24 (t, A, 2.25 370 1H NMR 1H NMR ( 6 6.92 (d. 1H NMR ( 6 7.44 - 0.84 (t, J = 7.3 Hz, 3H). 1H NMR ( 6 6.94 (d, LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi A, 2.22 318 A, 2.55 296 A, 2.65 332 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( 6 8.75 (d, J: 194, 7.1 Hz, 3H). A, 1.35 347 1H NMR ( 6 7.48 - A, 2.58 314 1H NMR ( 6 8.88 (d, 1H NMR ( 6 8.79 (d, 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( 6 9.55 (s, A, 1.25 336 1H NMR ( 6 9.39 (3, (5, 3H), 2.38 (5, 3H). A, 1.37 350 1H NMR ( 6 6.90 (d, 3.85 - 3.49 (m, 4H), = 14.3, 7.3 Hz, 3H). A, 222 348 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( 6 6.70 (d, A, 2.00 334 1H NMR ( 6 7.37 (t, 1H NMR ( 6 7.38 (q, 1H NMR ( 6 7.46 - A, 2.44 372 1H NMR LC Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( 6 7.49 - A, 2.55 328 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( Ö ppm 1H NMR LC Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi H) 730-744 (m, 1 H) 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( ö ppm 7.31 _7.44 (m,1 H) A,2.57 400 1H NMR ( Ö ppm J= 5.97 (d, J=2.83 HZ, 1 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1.53 (d, J= A,1.45 313 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 8.55 (d, J=4.81 Hz, 1 H) 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi H) 6.01 (d, J= 7.24 (t, J= 7.32 (d, J=3.08 HZi 1 1H NMR ( ö ppm 0.70 (t, J= 0.84 - 0.95 3.23 - D,0.8 370 1H NMR ( ö ppm 1H NMR 1H NMR ( ö ppm H) 7.32 (d, J=3.23 Hz, 1 H) 1H NMR ( Ö ppm 8.44 (d, J= 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm .79 (8, 2 H) LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi E,1.18 381 E ,1 .28 313 E,1.6 303 1H NMR H) 7.77 (d, J=3.30 Hz, 1 H) 1H NMR ( ö ppm 1.21 Hz, 1 H) 1H NMR ( 5 ppm J=2.86 Hz, 1 H) 1H NMR ( ö ppm LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR 8.91 -8.94 (m,1 H) 1H NMR ( ö ppm J=5.91 Hz, 2 H) 1H NMR ( Ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR 8.38 (d, J=5.72 Hz, 1 H) 1H NMR ( ö ppm 8.82 -8.85 (m, 1 H) 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( Ö ppm LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 8.24 (m, 1 H) 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm NH2 `\//N\0 "1/ \ < NH2 `N "tü 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 0074 388 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 7.37 Hz, 1 H) 1H NMR ( ö 1H NMR ( ö ppm 1H NMR LC Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 137 `< 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1 H), 8.42 - 8.46 (m, 1 H) 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm D,O.66 313 1H NMR LC Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( Ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi SLAST_1354_1.1.esp M07(s) 1H NMR ( ö ppm (5, 1 H) SLAST_1354_2.1.esp MO4(m) E,1.45 357 1H NMR ( Ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1114sz NH N\ 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( ö ppm J=2.9 Hz, 1 H) E,1.4 340 1H NMR ( ö 1H NMR ( ö 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( ö ppm 7.35 (d, J=2.86 Hz, 1 H) E,1.07 418 1H NMR ( Ö ppm J= 7.32 (d, J=2.86 HZ, 1 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi J=4.73, 1.43 Hz, 1 H) 1H NMR ( ö ppm 1.10 Hz, 1 H) 1H NMR ( ö ppm E,1.35 370 1H NMR ( ö ppm 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm bil-FM NH 0` 1H NMR LC Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi J=5.50 Hz, 1 H) 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( Ö ppm J= 7.20 (d, J=8.58 HZ, 1 J= 8.09 (d, J=2.64 HZ, 1 H) 5,153 366 1H NMR ( ö ppm 766 - 7.92 (m, 2 H) E,1.1 379 1H NMR ( ö ppm E,1.34 337 1H NMR 1H NMR ( ö ppm J=4.40 Hz, 1 H) 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 2H)8.57 (s, 1 H) LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi E,1.35 402 1H NMR 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm H) 7.85-7.92 (m, 1 H) 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1 H)7.27 (d,J=2.64 Hz, 1 H) LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi E,1.23 350 F,4 354 E,1.27 366 E,1.34 397 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR LC Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( ö ppm J=4.40 Hz, 1 H) 1H NMR ( Ö ppm 1H NMR ( 8 ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR LC Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( ö ppm J=4.40 Hz, 1 H) 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 51.31 346 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm J=5.7 Hz, 1 H) D,O.7 356 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm E,1.27 346 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( ö ppm E ,1 .27 346 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR 1H NMR ( ö ppm 12.51 (br. s., 1 H) 1H NMR ( ö ppm J=3.08 Hz, 1 H) 1H NMR ( ö ppm LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi E,1.09 327 1H NMR 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 8.26 -8.42 (m, 1 H) 1H NMR ( ö ppm J=4.84 Hz, 2 H) 1H NMR ( ö ppm LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 209 0-0 1H NMR LC Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm E ,1 .27 397 1H NMR ( ö ppm 1.17 (d, J= 3.23 - 3.30 1H NMR 1H NMR ( ö ppm 1H NMR ( ö ppm H) 8.36 (t, J=5.61 Hz,1 H) LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi E,1.21 280 E,1.29 366 Analitik Yöntemler. 1H NMR LC Bulunan Yöntemi, LC-MS Rt Kütlesi 1H NMR ( ö ppm 2 H) 7.29 - 1H NMR ( Ö ppm 6.90 (t, J= 7.00 (d, 1H NMR ( ö ppm Tüm bilesikler asagidaki LC-MS yöntemlerine LC-MS ile karakterize edilmistir. Yöntem A. 35°C'de tutulan bir Phenomenex Kinetex sütun (XB-C18, 50 x 4.6 mm I.D. 2.6um) kullanilmistir. MS algilama: API-ES pozitif iyonizasyon modu, kütle araligi 100- . Asagidaki gradiyent bir 2 uL enjeksiyonu ile kullanilmistir: Solvent A H2O + %0.1 Formik Asit Solvent B Asetonitril Zaman (dakika) %A %B Akis (mL/dakika) 4.2 5 95 3.0 4.9 5 95 3.0 .0 95 5 3.0 Yöntem B. Tersine çevrilmis faz UPLC (Ultra Performans Sivi Kromatografisi) C18 sütun (1.7 um, 2.1 x 50 mm; Su Berrakligi) üstünde gerçeklestirilmistir. Bir gradiyent durumunu tutmak üzere iki mobil faz (HzO/asetonitril 95/5; mobil faz B: asetonitril içinde 10 mM amonyum asetat) kullanilmistir. 0.75 ul'lik bir enjeksiyon hacmi kullanilmistir. Koni voltaji pozitif iyonizasyon modunda 30 V ve negatif iyonizasyon modunda 30 V düzeyindeydi. Yöntem C. Analizler bir Waters XTerra C18 sütununda (100 x 4.6 mm I.D. 3.5 um partikül) 40 °C'de, 1.6 mL/dakikalik bir akis orani ile gerçeklestirilmistir. Bir gradiyent elüsyonu asagidaki gibi gerçeklestirilmistir: Su/Asetonitril 90:10 içindeki %100'lük bir amonyum asetat solüsyonundan (25 mM) bir Asetonitril/Metanol 50:50 karisimina 7.5 dakikada; Su/Asetonitril 90:10 (25mM) içindeki %100 Asetonitrilden bir amonyum hacmi 3 uL'ydi. Edinim araliklari UViye yönelik 200-400 nm olarak ayarlanmistir. Yöntem D. LC ölçümü ikili pompa, bir örnek düzenleyici, bir sütun isitici (55 °C'ye ayarli), bir diyet dizi dedektörü (DAD) ve asagida ilgili yöntemlerde belirtilen gibi bir sütun içeren bir Acquity UPLC (Waters) sistemi kullanilarak yapilmistir. Sütundan akis bir MS spektrometreye ayrilmistir. MS dedektörü bir elektrosprey iyonizasyon kaynagi ile konfigüre edilmistir. Kütle spektralari 0.02 saniyelik bir bekletme süresi kullanilarak kaynak sicakligi 140 °C'de tutulmustur. Nebülizör gaz olarak nitrogen kullanilmistir. Tersine çevrilmis faz UPLC (Ultra Performans Sivi Kromatografisi) bir köprülü mL/dakika akis orani ile gerçeklestirilmistir. Bir gradiyent durumunu 1.3 dakikada %95 A ve %5 B ila %5 A ve %95 B arasinda çalistirmak ve 0.3 dakika tutmak üzere iki mobil faz (HzO/asetonitril 95/5; mobil faz B: asetonitril içinde 10 mM amonyum asetat) kullanilmistir. 0.5 ul'lik bir enjeksiyon hacmi kullanilmistir. Koni voltaji pozitif iyonizasyon modunda 10 V ve negatif iyonizasyon modunda 20 V düzeyindeydi. Yöntem E .. . . Çalisma Araç Sutun Mobil faz Gradiyent sun," __ _ sicakligi SUI'GSI Waters : %100 A'dan %5 Waters: A: 95% HzO + %5 _ Acquity® CHaCN B: CHaCN 0.5' UPLC® - içinde 10mM 55. 2.1*100 dakikada, %5 A'ya DAD ve SQD CH3COONH4 Yöntem F Çalisma Araç Sütun Mobil faz Gradiyent sumn Araç Sütun Mobil faz Gradiyent Sütun 1_ . sicakligi suresi 1 %49 B ve %50 C 6.5 Waters: CH3COOH ile %95 _ . Waters : dakikada, %1 A ve Alliance ® H20 + %5 CH3CN, Xterra MS %99 B'ye 0.5 - DAD - B: CchN, C: _ C18 dakikada, %100 D'ye 1 H› ELSD CH3CN ve %40 4.6*100m boyunca tutulmustur 2000 CHSOH ve %20 _ m) 4 _ ve %100 A'ya in 0.5 Alltech H20 içinde 25mM _ _ dakikada ve 1.5 dakika CH3COONH4 boyunca tutulmustur. Formülün (l) bilesiklerinin Biyolojik Aktivitesi Biyolojik Çalismalarin Açiklamasi TLR7 ve TLR8 aktivitesinin degerlendirilmesi Insan TLR7 ve/veya TLR8 hücrelerini aktive etmek üzere bilesiklerin özelligi bir TLR7 veya TLR8 ifade vektörü ve NFKB-Iuc raporlayici yapi ile geçici olarak transfekte edilen HEK293 hücreleri kullanilarak bir hücresel raporlayici çalismada degerlendirilmistir. Kisaca, HEK293 hücreleri kültür ortaminda (%10 FCS ve 2mM Glutamin eklenmis DMEM) büyütülmüstür. Hücrelerin 10 cm'lik kaplarda transfekte edilmesine yönelik olarak, hücreler Trypsin-EDTA ile ayrilmis, bir CMV-TLR7 veya TLR8 plazmit (750 ng), NFKB-Iuc plazmid (375 ng) karisimi ve bir transfeksiyon reaktif maddesi ile transfekte edilmistir ve 37°Cide nemlendirilmis %5 C02 atmosferde gece boyunca inkübe edilmistir. Sonra transfekte edilen hücreler Trypsin-EDTA ile ayrilmis, PBSite yikanmis ve 1.67 x 105 hücre/mL yogunlgunda bir ortamda tekrar süspanse edilmistir. Sonra otuz mikrolitre hücre her hücreye 384 gözlü plakanin her gözüne dagitilmistir, burada sonrasinda, her bosluga 15 uL Steady Lite Plus sübstrat (Perkin Elmer) eklenerek görüntüleyicide (Perkin Elmer) gerçeklestirilmistir. Doz tepki egrileri dört kopya seklinde gerçeklestirilen ölçümlerden elde edilmistir. Çalismanin standart sapmasinin en az iki kat üstünde olan bir etki baslatan konsantrasyon olarak belirlenen, her bilesigin en düsük etkili konsantrasyon (LEC) degerleri belirlenmistir. hücre/mL) ile transfekte edilen her gözde 30 uL'Iik hücreli benzer bir seyreltme serisi bilesigi kullanilarak belirlenmistir. Hücre yasayabilirligi 37°C'de, %5 C02 ile alti saat boyunca inkübasyon sonrasinda, her göze 15 uL ATP hafif (Perkin Elmer) ekleyerek ve ViewLux ultraHTS microplaka görüntüleyicide (Perkin Elmer) okuyarak ölçülmüstür. Veriler C050 olarak bildirilmistir. Ayni sekilde, sadece NFKB-luc raporlayici (1.67 x 105 hücre/mL) ile transfekte edilen her gözde 30 uL'Iik hücreli benzer bir seyreltme serisi bilesigi (%4 DMSO"da bilesigin uL'si) kullanilarak belirlenmistir. 37°C`de, %5 002 ile 6 saat boyunca inkübasyon sonrasinda, Iüsiferaz aktivitesi her göze 15 uL Steady Lite Plus sübstrat (Perkin Elmer) ekleyerek ve ViewLux ultraHTS microplaka görüntüleyicide (Perkin Elmer) okuyarak ölçülmüstür. Paralel taramadaki veriler LEC olarak bildirilmistir. Bilesiklerin lFN-I baslatma potansiyeli, PBMC`nin düzenlenen ortami ile interferon destekli tepki unsurlarinin (ISRE) aktivasyonunu ölçerek degerlendirilmistir. GAAACTGAAACT dizisinin ISRE unsuru, IFNAR (Clontech, PT3372-5W) reseptörlerine lFN-l baglanmasi sonrasinda aktive edilen STAT1-STAT2-IRF9 transkripsiyon faktörüne çok tepkiseldir. Clontech'in (ref. 631913) plazmit plSRE-Luc'u bu ISRE unsurundan 5 kopya içerir, ardindan yildiz böcegi Iüsiferazi ORF gelir. Düzenlenen PBMC hücresi kültür ortaminin profiline plSRE-Luc (HEK-ISREIuc) ile transfekte edilen bir HEK293 hücre hatti olusturulmustur. Kisaca, PBMCIer bir standart Ficoll santrifüjleme protokolü kullanilarak en az iki donörün beyaz kan hücrelerinin bir tabakasindan hazirlanmistir. Ayrilan PBMC'Ier, RPMI ortami %10 insan AB serumu ile desteklenen RPMI ortaminda tekrar süspanse edilmistir ve 2 x 105 göz/hücre bilesikleri içeren 384 gözlü plakaya dagitilmistir (70 uL toplam hacim). Gece boyunca inkübasyon sonrasinda. 30 uL içinde 5 x 103 HEK- aktarilmistir. 24 saatlik inkübasyon sonrasinda, ISRE unsurlarinin aktivasyonu 40 pL/göz Steady Lite Plus sübstrat (Perkin Elmer) kullanilarak Iüsiferaz aktivitesini inceleyerek ölçülmüstür ve ViewLux ultraHTS mikroplaka görüntüleyici (Perkin Elmer) ile ölçülmüstür. Her bilesigin HEK-ISREIuc hücreleri üstündeki uyarici aktivitesi, incelemenin standart sapmasinin en az iki kat üstünde bir Iüsiferaz aktivitesi ile sonuçlanan PBMC'Iere uygulanan bilesik konsantrasyonu olarak tanimlanan LEC degeri olarak bildirilmistir. Dolayisiyla LEC, belirli bir PBMC kültürü ortami miktarinin transferinde ISRE aktivasyonu derecesini belirtir. Rekombinant interferonu d-2a (Roferon-A) standart kontrol bilesigi olarak kullanilmistir. Tablo 2. Formülün (I) bilesiklerinin aktivitesi. Tüm bilesikler, HEK 293 NF-kB yukarida açiklanan paralel tarama çalismasinda hiçbir aktivite göstermemistir (LEC 25 uM). TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR

Claims (1)

1.