SE436894B - Sett att samtidigt bestemma transaminaser (got och gpt) med kinetisk uv-metod - Google Patents

Description

80051224) över hela världen användes två metoder: 1) Den kolorímetriska metoden, baserad på omsättningen mellan oxalättiksyra och 2,U-dinitrofenylhydrazin. Denna omsättning är inte kinetisk, men efter en förutbestämd ínkuberingstíd bestämmes den bildade mängden ketosyra genom mätning av extinktionen vid 536 nm från den bildade fenylhydrazonen. Denna metod har, även om den modifierats under flera är, fortfarande nackdelar när det gäller prover från människor med gulsot. 2) Den kinetiska UV-metoden anses allmänt vara referensmetoden på grund av dess stora exakthet och specificítet.

Oxalättiksyran, som bildas vid transamineringsreaktionen, bestäm- mes genom en enzymatisk reaktion, kopplad med maleinsyradehydro- genas (MDH) genom mätning av oxidationen av NADH (nikotinamid- -adenin-dinukleotíd i reducerad form) vid BUO nm. ?ÛOH>~ çOOH C112 + MDH cH2 + NAD* à = Q + NÅDH + H ---å H-¿“ÛH OOH ¿O0H oxalättiksyra '> maleinsvra De modifieringar, som först utförts med denna metod av Karmen tillät att reaktionen kunde optimeras som en funktion av substrat- koncentrationen och bestämningstemperaturerna och att svårigheter- na på grund av den icke linjära kinetiska fasen kunde övervinnas.

Liknande betraktelse kan även göras för GPT när det gäller kolorimetriswztest, under det att den kinetiska UV-metoden, som infördes av Henley och Pollard, är baserad på bestämningen av pyrodruvsyra, som bildas under transamineringsreaktionen med en enzymatisk reaktionskoppling med mjölksyradehydrogenas (LDH), varvid återoxídationen av NADH mätes vid BÄO nm.

CH ' CH | 3 e i 3 _ ç = o + NADH-H* LDH; H-o-oH + NAD* tooH <_g-- cooH pyrodruvsyra mjölksyra' 80051 22 - 0 Även för den kinetiska UV-metoden tillät de modifieringar, som införts och beskrivits i litteraturen, att reaktionen kunde optimeras som en funktion av substratkoncentrationerna och be- stämningstemperaturerna.

Bestämningen av de GOT- och GPT-aktiviteter, som föreligger i serumet eller i andra biologiska prover, utföres med de ovan nämnda kolorimetriska eller UV-kínetiska metoderna. Dessa medför alltid att analysatorn måste utföra tvâ olika analyser för de två transaminaserna. Detta beror på den.tekniska omöjligheten att koppla de ovan två nämnda UV-kinetiska enzymerna i endast en be- stämning på grund av tvärinhiberingsfenomen.

Syftet med föreliggande uppfinning är ett nytt förfarande, som tillåter att med en enda analys med UV-kinetik spektrofotometriskt bestämma summan av de två transaminasaktiviteterna, och förfaran- det utgör sålunda den första kartläggande analysen mellan normala och patologiska värden för sådana enzymatiska aktiviteter. Dess- utom tillåter den nya metoden enligt analysatorns fordringar _ genom enkel modifiering av den ordning med vilken reaktanterna och substraten satsas i reaktionsblandningen, att aktiviteten av de två transaminaserna exakt kan bestämmas i enheter per liter i plasma- eller serumprovet, så att tidsbesparing sker i förhållan- de till de metoder, som vanligen användes i laboratorier.

Det är känt att GOT kan katalysera transaminering inte endast av dess naturliga substrat (glutaminsyra och asparaginsyra) utan även av andra aminosyror. Bland dessa transamineras även cystein- sulfinsyra aktivt i närvaro av 4-ketoglutarsyra under bildning av ß-sulfinylpyrodruvsyra, som, eftersom den är instabil i vat- tenlösning, snabbt hydrolyseras till pyrodruvsyra och sulfit enligt följande reaktionsschema: u àoos122-o Ä çH2-SOZH ?OOH . GH2-SOZH ÉOOH iGOT _ ?HNH2 + CH2 - ; É - 0 + H2 coon _ H2 (__-r- ooH oHZ i = o i _ :Hung i ooH i ooH cysteinsulfin- -ketoglutarsyra -sulfinylpyrof glutaminsyra syra :druvsyra H O H5 C = O + HESO OOH' pyrodruvsyra 3 Även i frånvaro av'dFketoglutarsyra kan GOT interagera med cysteinsulfinsyra och katalysera en aëy-elimineringsreaktion en- ligt följande schema: CH2~SO2H fH2 ÉHNHQ GOT É-NH2 * + HZSO > a 3 OOH OOH + H20 FH3 C = O + NH5 OOH cysteinsulfínsyra d-aminoakrylsyra pyrodruvsyra Även i detta fall är reaktionens slutprodukt pyrodruvsyra, och aktiviteten av GOT kan bestämmas med spektrofotometrisk kinetik vid BMG nm genom mätning av âteroxidationen av NADH i närvaro av mjölksyradehydrogenas, samma enzym, som användes för bestämning av GPT-aktiviteten.

Användningen av cysteinsulfinsyran som substrat för GOT tillåter sålunda användning av endast ett avslöjande enzym, mjölksyra- dehydrogenas (LDH), vid den kopplade bestämningen av de två transaminaserna enligt följande schema: aous122-o 5 “EHB _ CHNHQ +a(-xo COOH GPT alanin H - H = O + A LDH - - + 3 NDH H än NAD* -> Y ?H2SO2H GOT COOH COOH iza-NHE / cooH +J\KG cysteinsulfinsyra pyrodruvsyra mjölksyra Minskningen av extinktionen vid EMO nm utgör ett mått på mängden producerad pyrodruvsyra, och som en följd härav på de båda trans- aminasernas aktiviteter. Det är viktigt att notera att den sam- tidiga bestämningen av transaminaser är möjlig under dessa betingflser tack vare frånvaron av tvärinhibering mellan de an- vända substraten. De speciella kinetíska egenskaperna hos reak- tionen mellan GOT och cysteinsulfinsyra medger två olika tillämp- ningar av systemet såsom framgår av följande exempel.

Exempel 1 Sätt att bestämma de absoluta aktiviteterna hos GOT och GPT Till en reaktionsblandning om 2,5 ml innehållande L-alanin (200 mM), Ä-ketoglutarsyra (2 mM),ß-NADH (0,2H mM) och 5,6 enheter mjölksyradehydrogenas i tris-HCl-buffert (80 mM), pH 8,5 sattes 0,5 ml plasma eller serum, varefter extinktionsminskningen mättes vid BÄO nm (eller någon annan våglängd, t.ex. BBÄ eller 365 nm beroende på det använda instrumentet). Minskningen står i direkt relation till mängden omvandlad alanin till pyrodruvsyra, orsakat av GPT.

Efter några minuters omsättning tillsättes 0,1 ml av en cysteín- sulfinsyralösning så att slutkoncentrationen i blandningen är 66 mM. Ökningen ÄÄE/min beror i detta fall på omvandlingsbland- ningen av cysteinsulfinsyra till pyrodruvsyra, orsakat av GOT.

Genom dessa omvandlingskoefficíenter är det möjligt att från det observerade ¿§E/min före och efter tillsatsen av cysteinsulfin- syra beräkna de exakta värdena av de enzymatiska enheter av GOT och GPT, som föreligger i serumet, med ett enda bestämningsför- farande. I 860511224) i Exempel 2 Utvärderingsmetod för bestämning av normala och patologiska vär- den på aktiviteterna av GOT och GPT i plasma eller serum Till en reaktionsblandning av 2,5 ml innehållande L-alanin (200 mM) , :Å-ketoglutarsyra (2- mM) , ß -NADH- (0,2¿¿ mM) ,' 'cysteinsulfin- syra (7mM) och 5,6 enheter mjölksyradehydrogenas i Tris-HCl- buffert (50 mM) pH 8,5, sättes 0,5 ml serum eller plasma och extinktíonsminskningen mätes vid BUO nm (eller vid andra våg- längder, t.ex. 33ü eller 365 nm beroende på det använda instru- mentet). I detta fall står extinktionsminskningen i direkt rela- tion till omvandlad mängd av både alanin och cysteinsulfin till pyrodruvsyra, orsakat av GPT respektive GOT, och man erhåller ett mått på summan av de två enzymatiska aktiviteterna.

Analysens kinetiska egenskaper tillåter bestämning av ett gräns- värde för A E/min mellan normala och patologiska värden.

Genom lämpliga omvandlingskoefficienter är det möjligt, när det gäller normala prover, att exakt beräkna de aktuella enzymenheter- na för både GOT och GPT, under det att när det gäller patologiska prover detta förfarande har ett fel på ca 10-15%.

Claims (4)

8-005122-0 Patentkrav

1. Kinetisk UV-metod för santidig bestämning av glutanin-oxal- syra-transaninas (GOT) och glutamin-pyrodruvsyra-transalinas (GPT) i. ett enda prov av serul el-ler plasla. I I: ä n n e - t e c k n a d av att såson de specifika aninosyrasubstraten för ovan nämnda transaminaser användes L-cysteinsulfinsyra resp. L-alanin. och de vid de båda transaninasaktiviteterna bildade produkterna påvisas vid onsâttning med njölksyrade- hydrogenas på i sig känt sätt.

2. Sätt enligt krav l. k ä n n e t e c k n a t av att de totala GOT- och GPT-transaninasaktiviteterna bestämnes genom mätning av det totala AE/Iin. varvid de två alinosyra- substraten är närvarande från början i reaktionsniljön.

3. Sätt enligt krav 1. k ä n n e t e c k n a t av att AE/lin först nätes i närvaro av L-alanín son ett substrat och därefter mätes ökningen av AE/lin efter tillsatsen av cysteinsulfinsyra. vilken senare ökning av' AE/min är ett lätt på GOT-transaminasaktiviteten.

4. Diagnosutrustning för bestänning av nornala eller pato- logiska värden av glutanin-oxalsyra-transaminas (GOT) och glutanin-pyrodruvsyra-transalinas (GPT) i ett enda prov av serun eller plasla. varvid lan sâson de specifika aninosyra- substraten för ovan nännda transalinaser använder L-cystein- sulfinsyra resp. L-alanin. och påvisar de vid de båda trans- aninasaktiviteterna bildade produkterna vid omsättning med mjölksyradehydrogenas på i sig känt sätt. k ä n n e t e c - n a d av att den såsom komponent innehåller de för GOT och GPT specifika substraten cysteinsulfinsyra resp. L-alanin.