DE3221730A1 - Verfahren und analytische mittel zur aktivitaetsbestimmung von glutamat-oxalacetat-transaminase - Google Patents

Description

BOEHRINGERMANNHEIMGMBH-- -- "' · int.Nr. 2477

Verfahren und analytische Mittel zur Aktivitätsbestimmung von Glutamat-Oxalacetat-Transaminase

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und analytische Mittel zur Aktivitätsbe-Stimmung des Enzyms Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT), welches auch auf Reagenzträgern, wie Teststreifen, durchgeführt werden kann. Das Verfahren eignet sich zur Bestimmung der GOT in biologischen Flüssigkeiten, wie Serum, Urin oder in anderen Materialien.

Die Bestimmung der genannten Transaminase in Plasma, Serum,Geweben und anderem biologischem Material ist von großer diagnostischer Bedeutung-bei der Diagnose und Differenzialdiagnose, z.B. von Leber-, Herz- und Muskelerkrankungen. (Zur Bedeutung dieser Bestimmungen vergleiche z.B. H.U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, 3. Auflage, 1974, Verlag Chemie Weinheim, Band I, Seite 6 - 74). Es sind daher verschiedene Verfahren zur Bestimmung der GOT beschrieben worden, die jedoch alle mit Nachteilen behaftet sind.(Vergleiche Bergmeyer ^.oc cit. S. 769 - 799).

Die GOT katalysiert folgende Reaktionen:

1a) Aspartat +^-Ketoglutarat Ox-KG) Oxalacetat (OAA) + Glutamat

b) Alaninsulfinsäure +^-KG -^ ψ Pyruvat + SO₂ + Glutamat

-C-

Zur Bestimmung der Aktivität dieses Enzyms sind nun verschiedene Verfahren bekannt geworden, die entweder die Abnahme eines der Ausgangsprodukte oder die Geschwindigkeit mit der eines der Endprodukte der Reaktions gleichungen 1a oder 1b gebildet wird, messen.

So beschreibt A. Karmen (J. Clin. Invest. _34, 133 135 (1955) einen Test, bei dem das in Gleichung 1a) gebildete OAA wie folgt gemessen wird: 10

2) OAA + NADH + Ε^Θ

Die Abnahme der Absorption von NADH pro Minute, gemessen bei 365 nm, ist Meßsignal.
15

Ein anderes Verfahren zum Nachweis der GOT beschreiben S. Reitmann und S. Fränkel in Am. J. Clin. path. 28, (1957), 56 - 63. Hierbei wird das durch GOT nach Gleichung 2) gebildete OAA gleichzeitig mit dem im Test vorhandenen oC-KG mit Dinitrophenylhydrazin zu dem entsprechenden farbigen Hydrazon umgesetzt, welches nach Alkalisierung bei 55o nm bestimmt werden kann. Die Berechnung ist kompliziert aber möglich, weil das Hydrazon vono< -Ketoglutarat einerseits und das Hydrazon von OAA andererseits im Meßbereich unterschiedliche Extinktionen aufweisen.

Man kann das nach Gleichung 2) gebildete OAA aber auch mit Diazoniumsalzen zu einem Farbstoff kuppeln, der dann photometrisch ausgewertet werden kann. Ein solches Verfahren beschreibt A.L. Babson (Clin. Chem. _6 (196o), 394). Hiermit läßt sich die GOT-Aktivität messen. Die Menge des gebildeten Azofarbstoffes kann im sichtbaren

Licht gemessen werden.
35

.Weiter ist in der DE-A 29 11 481 ein Nachweis der GOT über OAA, ausgehend von Gleichung 1a) in folgender Reaktionskette beschrieben:

3a) OAA _{Pyruvat +} ^

Pv-OT)* b) Pyruvat + Phosphat + O₂ Acetyl-Phosphat +

CO₉ + H₇O₉

L· Lt Cu

c) 2H₂O₂ + Dimethylanilin + 4-Aminoantipyrin Chinondiiminfarbstoff + 2H₇O

Cl

Die Extinktionszunähme des gebildeten Farbstoffes wird bei 525 bis 6oo nm gemessen.

In der DE-A 28 34 7o6 ist ein GOT-Farbtest beschrieben, der das in der Rückreaktion von Gleichung 1a) gebildete tf£-KG in folgender Reaktionskette mißt:

4a) <*-KG + _r-Aminobutyrat Glutamat- -Aminobutyrat-Transaminase. Succinatsemialdehyd + Glutamat

b) Succinatsemialdehyd + NADP +■ Succinat + NADPH + H®

c) NADPH + Tetrazoliumsalz Formazan + NADP®

Das gebildete Formazan wird bei geeigneter Wellenlänge gemessen.

* PyOD = Pyruvatoxidase

·*■■*' POD = Peroxidase

U. Lippi und G. Guidi (Klin. ehem. Akta _2_8 (197o), 431 - 437) maßen die GOT mit Hilfe des in Gleichung 1a) freigesetzten Glutamats, in dem sie folgende 2 Indikatorreaktionen nachschalteten:

5a) Glutamat ₊ NAD ₊
NH₃ + NADH + H®

b) NADH ₊ Tetrazoliumsalz Formaζan + NAD*

R.B. Domecq, M. Carta und E.F. de Armorky (Biochem. Klinika ^, (1971), 25 - 36) kombinierten zur Bestimmung der GOT die Reaktionsfolge von Gleichung 1a), 2) und 5b). Dadurch wird die Abnahme der NADH-Menge, gemessen als Formazan-Farbstoff, im jeweiligen Test zur Meßgröße. Sie kann im sichtbaren Licht verfolgt werden und ist ebenfalls ein Maß für die Aktivität an GOT in

der Probe.
20

Für die Messung des nach 1b) aus Alaninsulfinsäure gebildeten Pyruvat ist z.B. in der DE-A 3o 26 854 der Nachweis mit NADH und LDH entsprechend folgender Gleichung

beschrieben:
25

6) Pyruvat + NADH ₊ H^ _Lactat + NAD®

Die Abnahme des NADH, gemessen bei 365 nm, ist Meßsignal. 30

Alle hier beschriebenen Testverfahren zur Bestimmung der GOT-Aktivität weisen verschiedene gravierende Mangel auf,

die ihre Anwendung verteuern oder erschweren. So erlauben die Verfahren nach A. Karmen bzw. nach Serono DE-A 3o 26 854) zwar die Messung der Extinktionsänderung pro Minute von NADH, was vorteilhaft ist, es muß aber ein UV-Test angewandt werden. Wie dem Fachmann bekannt ist, sind optische Meßeinrichtungen zur Messung im UV-Licht aber besonders aufwendig und daher teurer als Meßanordnungen, die Absorptionsänderungen im sichtbaren Licht messen können. Ein weiterer schwerwiegender Mangel ist die Tatsache, daß eine Abnahme der NADH-Extinktion gemessen werden muß. In einem solchen Test kann aus meßtechnischen Gründen nur eine begrenzte Konzentration an NADH vorhanden sein. Das hat zur Folge, daß die hier verwendeten Indikatorenzyme MDH bzw. LDH nicht mit ihrem Substrat NADH gesättigt sind und demnach nicht maximale Reaktionsgeschwindigkeit erreichen. Das muß durch erhöhten Enzymeinsatz ausgeglichen werden. Dies ist nicht nur unwirtschaftlich, sondern beinhaltet auch die Gefahr, daß andere, störende Enzymaktivitäten in größerem Maße in das Testsystem eingeschleppt werden. Ein weiterer Nachteil der niedrigen NADH-Konzentration ergibt sich daraus, daß sowohl an Analysenautomaten als auch bei manuellem Test zwischen Zugabe der Probe und Beginn der Messung eine gewisse Zeit vergeht. Ist nun eine große Aktivität der GOT in der Probe vorhanden, so wird bereits ein großer Teil des NADH vor Beginn der Messung verbraucht. Deshalb mißt man gerade bei stark erhöhten GOT-Werten, die ^υ Hinweise auf ein pathologisches Geschehen im Körper liefern, zu niedrige oder keine Aktivität. Dies ist ein schwerer Mangel der Bestimmungen.

Bei der Methode nach Reitmann und Fränkel werden die gebildeten Hydrazone im sichtbaren Licht bestimmt. Das ermöglicht die Anwendung einfacher und damit preisgünstiger photometrischer Einrichtungen. Dafür ist die Methode sehr unempfindlich und benötigt die sehr lange Inkubationszeit von 1 Stunde. Erst dann hat sich genügend OAA gebildet, so daß die Hydrazonbildung eingeleitet werden kann. Diese benötigt eine weitere Inkubationszeit. Außerdem wird daß im Testansatz erforderliche <5d-KG ebenfalls zu einem gefärbten Hydrazon umgesetzt. Dadurch ergeben sich für die Auswertung dieses Tests äußerst komplizierte Verhältnisse,.da gleichzeitig die Abnahme von °< -KG-Hydrazon und die Zunahme von OAA-Hydrazon berücksichtigt werden müssen. Dem Fachmann ist daher schon seit langem bekannt, daß bei dieser Methode Fehler von 2o bis 3ol hingenommen werden müssen. Grundsätzlich ähnliche Probleme ergeben sich bei der Methode nach Babson. Zwar kann auch hier im sichtbaren Licht gemessen werden und weil<*-KG mit Diazoniumsalz nicht interferiert, ist die Auswertung wesentlich einfacher, aber auch hier muß zunächst OAA durch längere Inkubation erzeugt werden. Anschließend muß die Farbbildung in einem weiteren Inkubationsschritt durchgeführt werden. Weiter ist dem Fachmann bekannt, daß viele in den

²^ zu untersuchenden Lösungen enthaltene Substanzen ebenfalls mit dem Diazoniumsalz zu Farbstoffen kuppeln, die die Bestimmung stören, weil sie zu hohe Werte vortäuschen. Diese Fehler müssen erst durch einen Leerwert eliminiert werden. So enthält z.B. Serum immer

^ wechselnde Menge Acetessigsäure, die Oxalacetat, das sich erst in der GOT-Reaktion bilden soll, vortäuscht.

Bei dem Verfahren nach DE-A 29 11 481 erweist sich

als Nachteil, daß insgesamt 4 verschiedene enzymatische 35

Reaktionen gekoppelt werden müssen. Das führt in jedem Fall zu einer längeren lag-phase, bis in der gesamten Kette alle Enzyme Substratsättigung erreicht haben. Weiter ist die Gefahr, störende Fremd- und Nebenaktivitäten in den Test einzuschleppen, um so größer, je mehr Enzyme an der Reaktionskette beteiligt sind. Außerdem steigen mit jedem Enzym die Kosten pro Test. Dagegen ist die Möglichkeit dieses Testes, kinetisch eine Farbstoffzunähme zu verfolgen, günstig.

Die gleichen Nachteile des vielfach gekoppelten Testes zeigen sich auch bei dem GOT-Test gemäß DE-A 28 34 7o6, wobei hier noch die Messung mit OAA als Substrat dazukommt. OAA als ß-Ketocarbonsäure ist recht instabil und neigt zur Decarboxilierung.

Die Methode nach Lippi und Guidi mißt ebenfalls im sichtbaren Bereich. Sie benötigt nur noch einen Inkubationsschritt, der allerdings mit einer Dauer von 55 Minuten ebenfalls sehr lang ist. Auch muß die Reaktion dann mit der unangenehm zu handhabenden Salzsäure gestoppt werden. Ein weiterer Nachteil ist, daß im Serum relativ große Mengen an Glutaminsäure enthalten sind.

Sie täuschen gemäß Gleichung 5a) im Test GOT vor.

Deshalb muß auch hier ein Leerwert mitgeführt werden.

Das Verfahren von Domecq et al benötigt wieder 2 Inkubationsschritte. Da es letztlich die Abnahme von NADH, entsprechend der Methode von Karmen mißt, gelten hier die gleichen Nachteile, wie dort aufgezeigt. Sie treten noch stärker hervor, weil aus meßtechnischen Gründen noch weniger NADH eingesetzt werden kann.

Vorteilhaft ist die Messung im sichtbaren Licht.

Auch kann hier der völlige Verbrauch von NADH durch zu hohe Aktivität von GOT die Messung verfälschen. Insgesamt aber ist, wie dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich, das Verfahren sehr aufwendig und störanfällig, da es höchste Ansprüche an die präzise Dosierung von NADH in jedem Meßwert stellt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es also, einen GOT-Farbtest zu schaffen, der mit einer möglichst kurzen Reaktionskette und damit kurzen Reaktionszeit auskommt, die Messung des Reaktionsproduktes im sichtbaren Licht erlaubt und nicht durch Nebenreaktionen der Enzyme oder Substrate gestört wird.

Versuche die in Gleichung 1b beschriebene Reaktion mit den in Gleichungen 3b und 3c beschriebenen Reaktionen zu koppeln und so eine enzymatische Reaktion (3a) zu vermeiden und ein in sichtbarem Licht meßbares Reaktionsprodukt zu erhalten, schlugen fehl. Man findet keinerlei Farbbildung, auch bei höchstens GOT-Aktivitäten. Auch bei Ersatz des Dimethylanilins durch andere Aniline oder Phenole, die als Kupplungskomponenten für die sogenannten PAP-Systeme bekannt geworden sind, erhält man keine Reaktion, ebenfalls dann nicht, wenn man 4-Aminoantipyrin durch andere kupplungsfähige, nucleophile Reagenzien wie 3-Methyl-benzthiazolonhydrazon-(2) oder dessen 6-Sulfonylverbindung ersetzt. Aber auch die gesamte Stoffklasse der heteroaromatischen Azine, die mit POD/H^O- intensiv gefärbte Radikale liefern oder o-Toluidin oder Tetramethylbenzidin, die ebenfalls tiefgefärbte Radikale bilden, geben im Test keine Reaktion. Als Ursache konnte nachgewiesen werden,

daß sowohl Alaninsulfinsäure, welche als Substrat der GOT dient und daher in großen Mengen im Test eingesetzt xverden muß, als auch das in der GOT-Reaktion gebildete Sulfit durch ihre starke Reduktionswirkung und durch ihre Fähigkeit, selbst oxidative Kupplungen einzugehen, die Farbbildung unterdrücken. Überraschend konnten jedoch Substrate gefunden werden, mit denen die Gleichung 3c weder durch SO₂ noch durch Alaninsulfinsäure gestört wird. Solche Verbindungen sind z.B. N-(3'-sulfonyl-4^!-hydroxy-5'-chlorphenyl)-4-aminoantipyrin (SHYC-AA) und 4,5-Bis-/4-dimethyl-aminophenyl_7-2-/3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl_7-imidazol (B-DDH-Imidazol).

Erfindungsgemäß wird deshalb ein Verfahren zur Aktivitätsbestimmung von Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) vorgeschlagen, bei dem Alaninsulfinsäure mit<*-Ketoglutarat unter Katalyse von GOT zu Pyruvat, SO2 und Glutamat umgesetzt wird, das Pyruvat mit Phosphat und Sauerstoff unter Katalyse mit Pyruvatoxidase zu Acetylphosphat, CO₂ und H₂O₂ reagiert und das H-O₂ mittels einer Peroxidase katalysierten Oxidation eines Chromogens bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß als Chromogen N-(3'-SuIfonyl-4'-hydroxy-5¹-chlorphenyl)-4-aminoantipyrin (SHYC-AA) und 4,5-Bis-/4-dimethyl-aminophenyl_7-2-/3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl_7 -imidazol (B-DDH-Imidazol) verwendet werden. Die Erfindung umfaßt jedoch auch die Verwendung ähnlicher Verbindungen,

die entsprechend reagieren.
30

Es mußte also sehr überraschen, daß einige spezielle Verbindungen dennoch eine ungestörte Messung erlauben. Das muß besonders beim SHYC-AA verwundern, denn die Grundreaktion zwischen 2^-Dichlorphenol-o-sulfonsäure und 35

und 4-Aminoantipyrin, die durch oxidative Kupplung den gleichen Farbstoff liefern, wird, wie alle PAP-Reaktionen, vollständig von Alaninsulfinsäure und Sulfit unterdrückt.
5

Weiterhin sind Gegenstand der Erfindung analytische Mittel zum Nachweis von GOT, die aus einer Mischung der für das obige Verfahren notwendigen Reagenzien bestehen. Ein im Sinne der Erfindung vorteilhaftes analytisches Mittel besteht aus einer Mischung der Reagenzien mit folgender Zusammensetzung:

a) 1 mmol oi-Ketoglutarat

1 -2o mmol Alaninsulfinsäure

o,o5 - 1o mmol Chromogen

1oo - lo.ooo U Peroxidase
5o ο - 2o.ooo U Pyruvatoxidase
o,5-5 mmol lösliches Phosphat
1 - 1oo mmol Puffer (pH 6-7)

1o - 1ooo ml Wasser werden zur Herstellung der Reagenzlösung zugesetzt, die je nach Größe der Testansätze und Konzentration der Untersuchungslösungen für ca. 1oo - 1ooo Teste verwendet werden kann.

Zur Aktivierung der Enzyme enthält die Reagenzmischung bevorzugterweise noch

b) o,5 - 5 mmol lösliches Magnesiumsalz o,o5 - 1 mmol Thiaminpyrophosphat

o,o1 - 0,1 mmol Flav inadenindinucleotid (FAD)

- Yr -

^ Die Reagenzien können in gebrauchsfertiger Mischung vorliegen, auf Teststreifen imprägniert sein, oder auch in aufeinander abgestimmten Mengen auf verschiedene zu einer Handelspackung vereinigte Behälter verteilt sein oder in einer oder mehreren Tabletten vorliegen, die gegebenenfalls mehrere Schichten mit unterschiedlicher Zusammensetzung aufweisen und erst zu der Reaktion durch Vermischen mit geeigneten Lösungsmitteln - beispielsweise einer Pufferlösung oder der Testflüssigkeit - zur gebrauchsfertigen Reagenzienmischung vereinigt werden.

Anhand der folgenden Beispiele sei die Erfindung weiter erläutert, ohne sie einzuschränken.

Beispiel 1

Messung der GOT im Photometer Zu 1 ml folgender Lösung:

4o mmol 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure

(HEPES)/Kaliumhydroxid, pH 6,7 2oo mmol Alaninsulfinsäure o,5 mmolKaliumdihydrogenphosphat 1o mmol Magnesiumchlorid o,5 mmol Thiaminpyrophosphat o,o1 mmol Flavinadenindinucleotid o,5 mmol Ethylendiamintetraessigsäure ο 1 mmol N-(3'- Sulfonyl-4'-hydroxy-5'-chlorphenyl)-4-aminoantipyrin 12 mmol X-Ketoglutarat

1ooo U Peroxidase 25oo U Pyruvatoxidase ^ad 1ooo ml Wasser

^ werden o,o2 ml Humanserum gegeben. Meßbeginn nach 2 Minuten,

T = 25⁰C, A= 546 nm, £= 19,6 cm²/iimol. Meßgröße ist das ΔΕ/min. bis 5 Minuten nach Meßbeginn. Die Messung kann zwischen 45o und 58o nm durchgeführt werden, jedoch muß für die gewünschten Wellenlängen das £ jeweils bestimmt werden.

Beispiel 2

GOT im Teststreifen
30

Zur Herstellung von Teststreifen werden 2 Papiere imprägniert:

A Enzympapier

o,5 mol/1 Morpholinoethansulfonsäure (MES)/Kaliumhydroxid, pH 6,5

2oo mmol/1 Alaninsulfinsäure

1 mmol/1 Kaliumdihydrogenphosphat

1ο mmol/1 Magnesiumchlorid

ο,5 mmol/1 Thiaminpyrophosphat

o,o1 mmol/1 FAD
2O.OOO U/l POD
" 25Ο.ΟΟΟ U/1 Py-QD

Mit dieser Lösung wird ein saugfähiges Papier, Dicke 5oum ,

? 2

Flächengewicht 12 g/m , Saugfähigkeit 5o g HLO/m , imprägniert und 5 Minuten bei 3o°C getrocknet.

Das Papier wird anschließend auf 1 cm Breite geschnitten.

B Indikatorpapier

1o mmol/1 4,5-Bis-/4-dime .yl-amino-phenyl-7-2-(3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl)-imidazol B-DDH-Imidazol

18 mmol/1 a-KG
o,1 mmol/1 HCl als Lösemittel

Mit dieser Lösung wird ebenfalls ein entsprechendes saugfähiges Papier imprägniert, 5 Minuten bei 3o°C getrocknet und auf 1 cm Breite geschnitten. Das Material wird in besonders vorteilhafter Weise im Teststreifen entsprechend der Figur 1 verarbeitet. Dabei wird eine 1 cm breite, durchsichtige Polycarbonat-Folie, 1oo pm dick, gemeinsam mit dem Iird±ka1^Tp'3p-te-3X..und dem Enzympapier, entsprechend Figur 1, einseitig auf einem Plastikstreifen befestigt, so daß die Folie nach außen, das Indikatorpapier in die Mitte, das Enzympapier nach innen kommt. Daneben wird ein 15 mm breites Glasfaservlies, Dicke 1,5 mm, Faserdicke ca. 2 pm aufgebracht,

■ so daß das freie Ende der Folie und der getränkten Papiere noch 6 mm über das Vlies reichen. Dann wird in 6 mm breite Teststreifen geschnitten. Bringt man nun 15,ul Vollblut auf den Probenauftragsbezirk 2a), entsprechend Figur 1, so durchdringt

innerhalb 3o bis 6o Sekunden der Plasmaanteil das gesamte Glasfaservlies auch unterhalb der durchsichtigen Folie, während die Erythrozyten im Bereich 2a) festgehalten werden. Durch Andrücken der Folie kommen nun das Enzym- und das Indikatorpapier (4) mit dem entwickelten Plasma in Berührung und werden gleichmäßig durchfeuchtet. Die im Plasma enthaltene GOT reagiert unter Blaufärbung, deren Intensität proportional zur GOT-Menge ist und gegebenenfalls in einem Remissionsphotometer gemessen werden kann. ^In gleicher Weise reagieren auch die anderen Probematerialien wie Serum, Plasma etc.

Fipur

1 =	Träger	4 =	Enzym- und Indikatorpapier
2 =	Glasfaservlies	5 =	Befestigung
2a=	Probenauftragsbezirk	6 =	hydrophobierte Zone
3 =	durchsichtige Folie

Claims (8)

Patentansprüche

1. Verfahren zur Aktivitätsbestimmung von Glutamat-

5 Oxalacetat-Transaminase (GOT) in wässrigen Lösungen, wobei

a) tX-Ketoglutarat mit Alaninsulfinsäure unter Katalyse von GOT zu Pyruvat, Schwefeldioxid und Glutamat um-

10 gesetzt wird,

b) das entstandene Pyruvat mit Phosphat und Sauerstoff unter Katalyse von Pyruvatoxidase zu Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid reagiert,

•c) das Wasserstoffperoxid und ein Chromogen unter Katalyse einer Peroxidase zu einem Farbstoff und Wasser umgesetzt wird und

20 d) die Menge des gebildeten Farbstoffes bestimmt wird,

dadurch gekennzeichnet, daß als Chromogen N-(3'-S ulfonyl-4'-hydroxy-5'-chlorphenyl)-4-aminoantipyrin (SHYC-AA) und 4,5-Bis-/4-dimethyl-aminophenyl_7-2-

25 /3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl 7-imidazol (B-DDH-Imidazol) oder ein verwandter Stoff verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionen in Gegenwart eines wasserlöslichen

30 Magnesiumsalzes, Thiaminpyrophosphat, Flavinadenindinucleotid, und/oder eines Puffers von pH 6-7 durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in einer Küvette durchgeführt wird und die Menge des gebildeten Farbstoffs

durch Messung der Lichttransmission gemessen wird. 5

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionslösung durch Auflösen eines Reagenzlyophilisats, einer Reagenztablette oder durch Ablösen der Reagenzien von einem damit imprägnierten

Träger mittels der benötigten Menge Wasser, einer Pufferlösung oder der Testflüssigkeit hergestellt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion auf einem mit den Reagenzien imprägnierten saugfähigen Träger durch Aufbringen der Testflüssigkeit stattfindet und der gebildete Farbstoff in Remission bestimmt wird.

6. Analytisches Mittel zur Aktivitätsbestimmung von GOT

bestehend ausOC-Ketoglutarat, Alaninsulfinsäure, Chromogen, Peroxidase, Pyruvatoxidase, löslichem [Phosphat, Puffer und Wasser, dadurch gekennzeichnet, daß als Chromogen N-(3'-Sulfonyl-4'-hydroxy-5'-chlorphenyl)

-4-aminoantipyrin (SHYC-AA)oder 4,5-Bis- /4-dimethylaminophenyl_7-2-/3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl_7-imidazol (B-DDH-Imidazol) enthalten ist.

7. Analytisches Mittel gemäß Anspruch 6, dadurch ge-30

kennzeichnet, daß zusätzlich lösliches Magnesiumsalz, Thiaminpyrophosphat und Flavinadenindinucleotid (FAD) enthalten ist.

8. Analytisches Mittel gemäß Anspruch 6, bestehend aus Immolix.-Ketoglutarat, 1 -2o mmol Alaninsulfinsäure, o,o5 -1ο mmol Chromogen, 1oo - I0.000 U Peroxidase, 5o.o - 2o.ooo U Pyruvatoxidase, o,5 - 5 mmol lösliches Phosphat, 1 - 100 mmol Puffer (pH 6-7) und 1o - I000 ml Wasser dadurch gekennzeichnet, daß als Chromogen N-(3'-Sulfonyl-4'-hydroxy-5'-chlorphenyl)-4-aminoantipyrin CSHYC-AA) und 4,5-Bis /4-dimethylaminophenyl_7-2-/~3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl_7-imi- dazol (B-DDH-Imidazol) oder ein verwandter Stoff enthalten ist.

9· Analytisches Mittel gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,daß zusätzlich o,5 - 5 mmol lösliches Magnesiumsalz, o,o5 - 1 mmol Thiaminpyrophosphat und/oder o,o1 - o,1 mmol Flavinadenindinucleotid (FAD) enthalten ist.

1o. Analytisches Mittel nach Anspruch 6, bestehend aus 4o mmol HEPES/KOH,CpH 6,7) ,2oo mmol Alaninsulfinsäure, o,5 mmol Kaliumdihydrogenphosphat, 1o mmol Magnesiumchlorid, o,5 mmol Thiaminpyrophosphat, o,o1 mmol Flavinadenindinucleotid, o,5 mmol Ethylendiamintetraessigsäure, o,1 mmol N-(3'-Sulfonyl-4'-hydroxy-5'chlorphenyl)-4-aminoantipyrin 12 mmol ct-Ketoglutarat, I000 U Peroxidase, 25oo Pyruvatoxidase, I000 ml Wasser.

11· Analytisches Mittel, nach Anspruch 6, bestehend aus a) einem Enzympapier welches mit einer Lösung aus o,5 mmol/1 MES/KOH, pH 6,5, 2oo mmol/1 Alaninsulfinsäure, 1 mmol/1 KH₂PO₄, 1o mmol/1 MgCl₂, o,5 mmol/1 Thiaminpyrophosphat, o,o1 mmol/1 FAD, 2o.ooo U/l POD und 25Ο.ΟΟΟ U/l Py-OD imprägniert ist und

b) einem Indikatorpapier, welches mit einer Lösung aus 1o mmol/1 B-DDH-Imidazol, 18 mmol/l^-KG und o,1 mmol/1 HCl als Lösemittel imprägniert ist, die zusammen auf einer Trägerfolie befestigt sind.