RU2523897C2

RU2523897C2 - Лекарственное средство для лечения рака печени

Info

Publication number: RU2523897C2
Application number: RU2010145177/15A
Authority: RU
Inventors: Ясуко Киносита; Масамити Сугимото; Такахиро Исигуро
Original assignee: Чугаи Сейяку Кабусики Кайся
Priority date: 2008-04-04
Filing date: 2009-03-19
Publication date: 2014-07-27
Also published as: KR101612139B1; JP5306327B2; JP5506654B2; CR11769A; HK1151734A1; AU2009233301B2; SG189754A1; PE20091655A1; TWI468175B; CN102046200A; UA103614C2; US20110104157A1; ECSP10010589A; NZ588913A; MX2010010954A; JP2011068682A; KR20100132060A; EP2275135A1; TW200950804A; AR071003A1

Abstract

Изобретение относится к медицине и касается фармацевтической композиции для усиления эффективности лечения рака печени посредством Сорафениба, причем указанная композиция содержит анти-глипикан 3-антитело в качестве активного ингредиента. Изобретение обеспечивает улучшенный противораковый эффект и уменьшение побочного эффекта, в частности потери массы тела. 13 з.п. ф-лы, 9 ил., 2 табл., 6 пр.

Description

Родственные заявки

Эта заявка заявляет приоритет в отношении японской заявки 2008-98309, поданной 4 апреля 2008 года, и РСТ/JP2008/002690, поданной 26 сентября 2008 года, содержания которых включены здесь в качестве ссылки.

Область, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к фармацевтической композиции для эффективного лечения или предупреждения рака печени, содержащей комбинацию химиотерапевтического агента и анти-глипикан 3-антитела, а также к способу лечения с использованием этой фармацевтической композиции.

Уровень техники

Ежегодное число смертей от печеночно-клеточного рака (гепатоцеллюлярной карциномы) равно 600000, делая его пятой главной причиной смерти от рака по всему свету (Llovet, J.M., Burroughs, A., Bruix, J.: Lancet 362, 1907-17 (2003)). Большинство пациентов с печеночно-клеточным раком (гепатоцеллюлярной карциномой) умирают в пределах одного года после диагностики этого заболевания. К сожалению, гепатоцеллюлярная карцинома часто диагностируется в поздней стадии, когда радикальное лечение является не очень успешным. В случае таких пациентов способы лечения, которые включают в себя химиотерапию, химиоэмболизацию, каутеризацию или дистанционную лучевую терапию, остаются недостаточными. Большинство пациентов проявляют рецидив этого заболевания, сопровождаемый васкулярной инфильтрацией и множественными внутрипеченочными метастазами, который будет быстро прогрессировать до запущенной стадии. Пятилетний срок выживания равен только 7% (Bosch, F.X., Ribes, J., Cleries, R.: Gastroenterology 127, S5-16 (2004)). Пациенты с гепатоцеллюлярной карциномой, поддающиеся хирургической резекции локализованных опухолей, имеют относительно хороший прогноз, хотя пятилетний срок выживания все еще находится между 15% и 39% (Takenaka, K., Kawahara, N., Yamamoto, K., Kajiyama, K., Maeda, T., Itasaka, H., Shirabe, K., Nishizaki, T., Yanaga, K., Sugimachi, K.: Arch Surg. 131, 71-6 (1996)). Таким образом, в данной области существует потребность в новом способе лечения этого высокозлокачественного заболевания.

Как сообщалось, гепатоцеллюлярная карцинома является ответственной за более чем 90% первичных раков печени в Японии. Способы лечения печеночно-клеточного рака включают в себя чрескатетерную аретриальную катетеризацию на основе химиотерапии (ТАЕ), где селективный некроз гепатоцеллюлярной карциномы индуцируют инфузией смеси (рентгено)контрастного вещества (Lipiodol), канцеростатического и закупоривающего вещества (Gelfoam) в печеночную артерию (служащую в качестве пути доставки нутриентов к опухоли) и посредством этого блокируют подающую нутриенты артерию. Кроме того, клинические исследования проводятся на системной химиотерапии с использованием таких химиотерапевтических агентов, как фторурацил (5-FU), урацил-тегафур (UFT), митомицин С (ММС), митоксантрон (DHAD), адриамицин (ADR), эпирубицин (EPI) и цисплатин (CDDR), или по отдельности, или в комбинации с интерфероном (IFN) (Yeo, W., Mok, T.S., Zee, B., Leung, T.W., Lai, P.B., Lau, W.Y., Koh, J., Mo, F.K., Yu, S.C., Chan, A.T., Hui, P., Ma, B., Lam. K.C., Ho, W.M., Wjng, H.T., Tang, A., Johnson, P.J.: J. Natl. Cancer Inst. 97, 1532-8 (2005)). Однако стандартная терапия для рака печени еще не была установлена (Furuse, J., Ishii, H., Nakachi, K., Suzuki, E., Xhimizu, S., Nakajima, K.: Cancer Sci., Oct. 22 (E-Pub) (2007)).

Недавно ряд лекарственных средств, нацеленных на факторы роста, исследовались для лечения рака печени. Эти исследования предполагают, что рецептор эпидермального фактора роста/эпидермальный рецептор 1 человека (EGFR/HER1) экспрессируется в активной форме в клетках рака печени человека. Эрлотиниб, ингибитор рецептора эпидермального фактора роста/эпидермального рецептора 1, и лапатиниб, ингибитор двух тирозинкиназ рецептора эпидермального фактора роста/эпидермального рецептора 1 человека и ErbB-2 (Her2/neu), исследовались в клинических исследованиях фазы II. Уровень реакции у пациентов, получавших эрлотиниб, был равен 4-9%, время прогрессирования было равно 2,1-3,2 месяцев и период выживания был равен 5,8-13 месяцев. Однако уровень реакции у пациентов, получавших лапатиниб, был равен 0% и время прогрессирования было равно 1,8 месяцев (Philip, P.A., Mahoney, M.R., Allmer, C., Thomas, J., Pitot, H.C., Kim, G., Donehower, R.C., Fitch, T., Picus, J., Erlichman, C.: J. Clin. Oncol. 23, 6657-63 (2005)). Перорально активная форма ингибитора киназ Сорафениба (Nexavar, BAY43-9006) ингибирует трансдукцию сигнала Raf/MEK/ERK в стадии киназы Raf, блокируя посредством этого рост раковых клеток. Кроме того, посредством действия на тирозинкиназу VEGFR-2, VEGFR-3 и PGHFR-β, Сорафениб индуцирует антиангиогенный эффект, и, следовательно, обнаруживались благоприятные эффекты в сравнении с перечисленными выше химиотерапевтическими агентами. В клиническом исследовании фазы II на пациентах, не являющихся японцами, и пациентах-японцах время прогрессирования было равно 4,2 - 4,9 месяцев, уровень реакции был равен 2-4% и период выживания без прогрессирования был равен 9,2 - 15,6 месяцев (Thomas, M.B., Dutta, A., Brown, T., Charnsangavej, C., Rashid, A., Hoff, P.M., Dancey, J., Abbruzzese, J.L.: J. Clin. Oncol., 2005 ASCO Annual Meetung Proceedings, 23, 16S (2005)). Сунитиниб (SU11248) является мультикиназным ингибитором, подобным Сорафенибу, который имеет активность ингибирования двух или более типов киназ (Mendel DB, Laird AD, Xin X, Louie SG, Christensen JG, Li G, Schreck RE, Abrams TJ, Ngai TJ, Lee LB, Murray LJ, CarverJ, Chan E, Moss RG, Haznedar JO, Sukbuntherng J, Blake RA, Sun L, Tang C, Miller T, Shirazian S, McMahon G, Cherrington JM; Clin Cancer Res (2003), 9, 327-37) и находится в клиническом исследовании в отношении лечения печеночно-клеточного рака (гепатоцеллюлярной карциномы).

В клиническом исследовании, в котором 34 пациента с запущенным печеночно-клеточным раком получали Сунитиниб, 1 пациент имел частичную реакцию после 12 недель лечения и 17 пациентов достигали стабильного состояния. Было продемонстрировано, что средняя общая выживаемость была равна 9,8 месяцев, средняя выживаемость без прогрессирования 3,9 месяцев (доверительный интервал 2,6-6,9), выживаемость без прогрессирования при трех месяцах была равна 56% и выживаемость без прогрессирования при шести месяцах была равна 32%, что позволяет предполагать, что Сунитиниб проявляет противоопухолевую активность против печеночно-клеточного рака (гепатоцеллюлярной карциномы) (Zhu A, Sahani D, di Tomaso E et al., 99^th AACR annual meeting. San Diego, CA, USA 12-16 April (2008)). Обычно, при прогрессировании рака печени наблюдаются различные симптомы, специфические для рака печени и ассоциированные с дисфункцией печени, такие как отсутствие аппетита, потеря массы, общее чувство усталости, пальпируемая масса в правой подреберной области, боль в правой подреберной области, ощущение увеличения живота, лихорадка и желтуха. Однако химиотерапевтические агенты, такие как Сорафениб и лапатиниб, обычно имеют ряд осложнений, включающих в себя побочные эффекты, такие как диарея или констипация (запор), анемия, супрессия иммунной системы (до такой степени, что она провоцирует инфекции или сепсис летальной тяжести), кровотечение, сердечная токсичность, печеночная токсичность, почечная токсичность, отсутствие аппетита и потеря массы.

Хотя конкретные симптомы ранней стадии обычно не замечаются в случае рака печени, по мере прогрессирования рака печени наблюдаются различные симптомы, специфические для рака печени и ассоциированные с дисфункцией печени, включающие в себя потерю аппетита, потерю массы, общее чувство усталости, пальпируемая масса в правой подреберной области, боль в правой подреберной области, ощущение увеличения живота, лихорадка и желтуха. Клинически наблюдали, что такие симптомы усиливаются при применении вышеуказанных химиотерапевтических агентов. Например, отсутствие аппетита в пациенте, в котором был обнаружен печеночно-клеточный рак, и такие симптомы, как потеря массы, которые ассоциированы с отсутствием аппетита или независимы от отсутствия аппетита, иногда усиливаются введением химиотерапевтических агентов этому пациенту. При развитии таких симптомов иногда необходимо прекращение применения химиотерапевтических агентов. Таким образом, экспансия вышеуказанных симптомов является фактором, который препятствует лечению химиотерапевтическими агентами.

Таким образом, существует потребность в обеспечении лучших способов лечения в плане усиления терапевтических эффектов и улучшения качества жизни пациента, получающего лечение.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, предметом данного изобретения является обеспечение лекарственного средства для лечения рака печени у пациентов, у которых наблюдается наличие симптомов, характерных для рака печени, таких как потеря массы, ассоциированная с прогрессированием рака, способно уменьшать побочные эффекты, характерные для химиотерапевтических агентов, такие как диарея или констипация (запор), анемия, супрессия иммунной системы (до такой степени, что она провоцирует инфекции или сепсис летальной тяжести), кровотечение, сердечная токсичность, печеночная токсичность, почечная токсичность, отсутствие аппетита и потеря массы, которые возникают с введением химиотерапевтических агентов, таких как ингибиторы киназ, и которое, кроме того, способно усиливать терапевтические действия против рака печени.

Авторы этого изобретения обнаружили, что комбинированием терапевтического антитела, которое связывает белок, который в высокой степени экспрессируется в клетках рака печени и имеет способность индуцирования цитотоксичности против таких клеток, с лекарственным средством против рака печени, содержащим в качестве активного ингредиента химиотерапевтический агент, эффективный против клеток рака печени, могут быть достигнуты лучшие терапевтические эффекты у пациента с раком печени, чем в случае, когда такой химиотерапевтический агент используется отдельно. Кроме того, авторы этого изобретения обнаружили также, что лекарственное средство данного изобретения, наряду с вызыванием вышеуказанных желаемых эффектов, значительно уменьшает побочные эффекты, характерные для химиотерапевтических агентов, такие как диарея или констипация (запор), анемия, супрессия иммунной системы (до такой степени, что она провоцирует инфекции или сепсис летальной тяжести), кровотечение, сердечная токсичность, печеночная токсичность, почечная токсичность, отсутствие аппетита и потеря массы, проявляя посредством этого хорошие терапевтические эффекты.

Кроме того, как показано в примерах ниже, при использовании модели рака печени животного не человека, имплантированного HepG2, в качестве модели таких симптомов, как отсутствие аппетита и потеря массы, ассоциированная с прогрессированием рака печени, такая потеря массы дополнительно усиливалась введением химиотерапевтического агента, в частности, Сорафениба, в то время как потеря массы подавлялась введением лекарственного средства в соответствии с этим изобретением.

Данным изобретением обеспечены:

[1] Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения рака печени, содержащая комбинацию химиотерапевтического агента и анти-глипикан 3-антитела;

[2] Фармацевтическая композиция по [1], где эта фармацевтическая композиция является комбинированным препаратом;

[3] Фармацевтическая композиция по [1], где этот химиотерапевтический агент и это анти-глипикан 3-антитело вводят совместно;

[4] Фармацевтическая композиция по [3], где этот химиотерапевтический агент и это анти-глипикан 3-антитело вводят одновременно или последовательно;

[5] Фармацевтическая композиция по [3], где этот химиотерапевтический агент и это анти-глипикан 3-антитело вводят раздельно;

[6] Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения рака печени для применения в комбинации с химиотерапевтическим агентом, причем указанная композиция содержит анти-глипикан 3-антитело в качестве активного ингредиента;

[7] Фармацевтическая композиция по [6], где это анти-глипикан 3-антитело вводят одновременно с химиотерапевтическим агентом;

[8] Фармацевтическая композиция по [6], где это анти-глипикан 3-антитело вводят до или после химиотерапевтического агента;

[9] Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения рака печени для применения в комбинации с анти-глипикан 3-антителом, причем указанная композиция содержит химиотерапевтический агент в качестве активного ингредиента;

[10] Фармацевтическая композиция по [9], где этот химиотерапевтический агент вводят одновременно с анти-глипикан 3-антителом;

[11] Фармацевтическая композиция по [9], где этот химиотерапевтический агент вводят до или после введения анти-глипикан 3-антитела;

[12] Фармацевтическая композиция по любому из [1]-[11], где этим химиотерапевтическим агентом является ингибитор киназы;

[13] Фармацевтическая композиция по [12], где этим химиотерапевтическим агентом является ингибитор мультикиназ;

[14] Фармацевтическая композиция по [12] или [13], где этим химиотерапевтическим агентом является Сорафениб (BAY43-9006);

[15] Фармацевтическая композиция по [12] или [13], где этим химиотерапевтическим агентом является Сунитиниб;

[16] Фармацевтическая композиция по любому из [1]-[15], где анти-глипикан 3-антитело обладает цитотоксичностью;

[17] Фармацевтическая композиция по любому из [1]-[16], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

вариабельный район Н-цепи, содержащий CDR 1, 2 и 3 из:

CDR1, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:5,

CDR2, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:6, и

CDR3, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:7; и

вариабельный район L-цепи, содержащий CDR 1, 2 и 3 из:

CDR1, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:8,

CDR2, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:24, и

CDR3, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:25;

[18] Фармацевтическая композиция по любому из [1]-[17], где это анти-глипикан 3-антитело способно связываться с эпитопом, с которым может связываться второе антитело, где указанное второе антитело содержит:

вариабельный район Н-цепи, содержащий CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:5, 6 и 7 соответственно, и

вариабельный район L-цепи, содержащий CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:8, 24 и 25 соответственно;

[19] Фармацевтическая композиция по любому из [1]-[16] или [18], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

CDR1, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в любой из SEQ ID NO:9-23,

[20] Фармацевтическая композиция по любому из [1]-[16] или [18], где это анти-глипикан-3-антитело содержит:

CDR2, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:26, и

CDR1, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:28,

[21] Фармацевтическая композиция по любому из [1]-[16] или [18], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

CDR2, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:30, и

CDR1, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:32,

[22] Фармацевтическая композиция по любому из [1]-[21], где это анти-глипикан 3-антитело является гуманизированным антителом;

[23] Фармацевтическая композиция по [22], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

вариабельный район Н-цепи, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:3; и

вариабельный район L-цепи, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:4;

[24] Фармацевтическая композиция по [22], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

вариабельный район L-цепи, содержащий аминокислотную последовательность, в которой 34-ый Gly SEQ ID NO:4 заменен другим аминокислотным остатком;

[25] Фармацевтическая композиция по [22], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

вариабельный район Н-цепи, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:27; и

вариабельный район L-цепи, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:29;

[26] Фармацевтическая композиция по [22], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

вариабельный район Н-цепи, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:31; и

вариабельный район L-цепи, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:33;

[27] Агент для уменьшения побочного эффекта, вызываемого лечением рака печени химиотерапевтическим агентом, причем указанный агент содержит терапевтическое антитело в качестве активного ингредиента;

[28] Уменьшающий побочный эффект агент по [27], где этим химиотерапевтическим агентом является ингибитор киназы;

[29] Уменьшающий побочный эффект агент по [27], где этим химиотерапевтическим агентом является ингибитор мультикиназ;

[30] Уменьшающий побочный эффект агент по [28] или [29], где этим химиотерапевтическим агентом является Сорафениб (BAY43-9006);

[31] Уменьшающий побочный эффект агент по [28] или [29], где этим химиотерапевтическим агентом является Сунитиниб;

[32] Уменьшающий побочный эффект агент по любому из [27]-[31], где этим побочным эффектом является потеря массы;

[33] Уменьшающий побочный эффект агент по любому из [27]-[32], где этим терапевтическим антителом является анти-глипикан 3-антитело;

[34] Уменьшающий побочный эффект агент по [33], где это анти-глипикан 3-антитело обладает цитотоксичностью;

[35] Уменьшающий побочный эффект агент по [33] или [34], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[36] Уменьшающий побочный эффект агент по любому из [33]-[35], где это анти-глипикан 3-антитело способно связываться с эпитопом, с которым может связываться второе антитело, где указанное второе антитело содержит:

[37] Уменьшающий побочный эффект агент по любому из [33], [34] или [36], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[38] Уменьшающий побочный эффект агент по любому из [33], [34] или [36], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[39] Уменьшающий побочный эффект агент по любому из [33], [34] или [36], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[40] Уменьшающий побочный эффект агент по любому из [33]-[39], где это анти-глипикан 3-антитело является гуманизированным антителом;

[41] Уменьшающий побочный эффект агент по [40], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[42] Уменьшающий побочный эффект агент по [40], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[43] Уменьшающий побочный эффект агент по [40], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[44] Уменьшающий побочный эффект агент по [40], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[45] Фармацевтическая композиция для усиления эффективности лечения рака печени химиотерапевтическим агентом, причем указанная композиция содержит анти-глипикан 3-антитело;

[46] Фармацевтическая композиция по [45], где это анти-глипикан 3-антитело вводят одновременно с химиотерапевтическим агентом;

[47] Фармацевтическая композиция по [45], где это анти-глипикан 3-антитело вводят до или после введения химиотерапевтического агента;

[48] Фармацевтическая композиция по любому из [45]-[47], где этим химиотерапевтическим агентом является ингибитор киназы;

[49] Фармацевтическая композиция по [48], где этим химиотерапевтическим агентом является ингибитор мультикиназ;

[50] Фармацевтическая композиция по любому из [45]-[49], где этим химиотерапевтическим агентом является Сорафениб (BAY43-9006);

[51] Фармацевтическая композиция по любому из [45]-[49], где этим химиотерапевтическим агентом является Сунитиниб;

[52] Фармацевтическая композиция по любому из [45]-[51], где анти-глипикан 3-антитело обладает цитотоксичностью;

[53] Фармацевтическая композиция по любому из [45]-[52], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[54] Фармацевтическая композиция по любому из [45]-[53], где это анти-глипикан 3-антитело способно связываться с эпитопом, с которым может связываться второе антитело, где указанное второе антитело содержит:

[55] Фармацевтическая композиция по любому из [45]-[52] или [54], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[56] Фармацевтическая композиция по любому из [45]-[52] или [54], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[57] Фармацевтическая композиция по любому из [45]-[52] или [54], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[58] Фармацевтическая композиция по любому из [45]-[57], где это анти-глипикан 3-антитело является гуманизированным антителом;

[59] Фармацевтическая композиция по [58], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[60] Фармацевтическая композиция по [58], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

вариабельный район L-цепи, содержащий аминокислотную последовательность, в которой 34-й Gly SEQ ID NO:4 заменен другим аминокислотным остатком;

[61] Фармацевтическая композиция по [58], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[62] Фармацевтическая композиция по [58], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[63] Способ лечения или предупреждения рака печени у субъекта, предусматривающий введение этому субъекту комбинации эффективного количества химиотерапевтического агента и анти-глипикан 3-антитела;

[64] Способ по [63], где этот химиотерапевтический агент и это анти-глипикан 3-антитело вводят одновременно или последовательно;

[65] Способ по [63], где этот химиотерапевтический агент и это анти-глипикан 3-антитело вводят раздельно;

[66] Способ по любому из [63]-[65], где этим химиотерапевтическим агентом является ингибитор киназы;

[67] Способ по [66], где этим химиотерапевтическим агентом является ингибитор мультикиназ;

[68] Способ по [66] или [67], где этим химиотерапевтическим агентом является Сорафениб (BAY43-9006);

[69] Способ по [66] или [67], где этим химиотерапевтическим агентом является Сунитиниб;

[70] Способ по любому из [63]-[69], где это анти-глипикан 3-антитело обладает цитотоксичностью;

[71] Способ по любому из [63]-[70], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[72] Способ по любому из [63]-[71], где это анти-глипикан 3-антитело способно связываться с эпитопом, с которым может связываться второе антитело, где указанное второе антитело содержит:

[73] Способ по любому из [63], [70] или [72], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[74] Способ по любому из [63], [70] или [72], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[75] Способ по любому из [63], [70] или [72], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[76] Способ по любому из [63]-[75], где это анти-глипикан 3-антитело является гуманизированным антителом;

[77] Способ по [76], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[78] Способ по [76], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[79] Способ по [76], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[80] Способ по [76], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[81] Способ уменьшения побочного эффекта, вызываемого лечением рака печени химиотерапевтическим агентом у субъекта, предусматривающий введение этому субъекту эффективного количества терапевтического антитела;

[82] Способ по [81], где этим химиотерапевтическим агентом является ингибитор киназы;

[83] Способ по [81] или [82], где этим химиотерапевтическим агентом является ингибитор мультикиназ;

[84] Способ по [82] или [83], где этим химиотерапевтическим агентом является Сорафениб (BAY43-9006);

[85] Способ по [82] или [83], где этим химиотерапевтическим агентом является Сунитиниб;

[86] Способ по любому из [81]-[85], где этим побочным эффектом является потеря массы;

[87] Способ по любому из [81]-[86], где этим терапевтическим антителом является анти-глипикан 3-антитело;

[88] Способ по [87], где это анти-глипикан 3-антитело обладает цитотоксичностью;

[89] Способ по [87] или [88], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[90] Способ по любому из [87]-[89], где это анти-глипикан 3-антитело способно связываться с эпитопом, с которым может связываться второе антитело, где указанное второе антитело содержит:

[91] Способ по любому из [87], [88] или [90], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[92] Способ по любому из [87], [88] или [89], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[93] Способ по любому из [87], [88] или [90], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[94] Способ по любому из [87]-[93], где это анти-глипикан 3-антитело является гуманизированным антителом;

[95] Способ по [94], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[96] Способ по [94], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[97] Способ по [94], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[98] Способ по [94], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[99] Способ для усиления эффективности лечения рака печени химиотерапевтическим агентом у субъекта, предусматривающий введение этому субъекту эффективного количества анти-глипикан 3-антитела.

[100] Способ по [99], где это анти-глипикан 3-антитело вводят одновременно с химиотерапевтическим агентом;

[101] Способ по [99], где это анти-глипикан 3-антитело вводят до или после химиотерапевтического агента;

[102] Способ по любому из [99]-[101], где этим химиотерапевтическим агентом является ингибитор киназы;

[103] Способ по [102], где этим химиотерапевтическим агентом является ингибитор мультикиназ;

[104] Способ по любому из [99]-[103], где этим химиотерапевтическим агентом является Сорафениб (BAY43-9006);

[105] Способ по любому из [99]-[103], где этим химиотерапевтическим агентом является Сунитиниб;

[106] Способ по любому из [99]-[103], где анти-глипикан 3-антитело обладает цитотоксичностью;

[107] Способ по [99]-[106], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[108] Способ по любому из [99]-[107], где это анти-глипикан 3-антитело способно связываться с эпитопом, с которым может связываться второе антитело, где указанное второе антитело содержит:

[109] Способ по любому из [99]-[106] или [108], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[110] Способ по любому из [99]-[106] или [108], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[111] Способ по любому из [99]-[106] или [108], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[112] Способ по любому из [99]-[111], где это анти-глипикан 3-антитело является гуманизированным антителом;

[113] Способ по [112], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[114] Способ по [112], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[115] Способ по [112], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

[116] Способ по [112], где это анти-глипикан 3-антитело содержит:

вариабельный район L-цепи, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:33.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 является графиком, показывающим подавляющие рост эффекты на клетках рака печени посредством объединенного введения доксорубицина (DOX) или митоксантрона (МХ) и антитела GC33;

Фиг.2 является графиком, показывающим противоопухолевые эффекты, на основе изменения объема опухоли, антитела hGC33 и Сорафениба в мышиной модели, имплантированной клетками клеточной линии Huh-7 рака печени человека;

Фиг.3 является графиком, показывающим противоопухолевые эффекты, на основе изменения объема опухоли, антитела hGC33 и Сорафениба в мышиной модели, имплантированной клетками клеточной линии HepG-2 рака печени человека; и

Фиг.4 является графиком, показывающим противоопухолевые эффекты антитела hGC33 и Сорафениба на потере массы мышиной модели, имплантированной клетками клеточной линии HepG2 рака печени человека, на основе изменений массы этой модели.

Фиг.5 является графиком, показывающим противоопухолевые эффекты антитела pH7L16 и Сорафениба на мышиной модели, имплантированной клеточной линией HepG2 рака печени человека, выраженные в виде изменения объема опухоли.

Фиг.6 является графиком, показывающим эффекты антитела pH7L16 и Сорафениба на потере массы в мышиной модели, имплантированной клеточной линией HepG2 рака печени человека, выраженные в виде изменения массы тела.

Фиг.7 является графиком, показывающим противоопухолевые эффекты антитела hGC33 и Сорафениба на потере массы мышиной модели, имплантированной клеточной линией HepG2 рака печени человека, выраженные в виде изменения объема опухоли (среднее ± SD).

Фиг.8 показывает аминокислотную последовательность вариабельных районов Н-цепи и L-цепи гуманизированных антител, предпочтительно используемых в данном изобретении.

Фиг.9 показывает аминокислотную последовательность CDR вариабельных районов Н-цепи и L-цепи гуманизированных антител, предпочтительно используемых в данном изобретении.

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Данное изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для лечения или предупреждения рака печени, содержащую комбинацию химиотерапевтического агента и анти-глипикан 3-антитела.

В данном контексте, фраза “фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения рака печени, содержащая комбинацию химиотерапевтического агента и анти-глипикан 3-антитела” относится к фармацевтической композиции, в которой химиотерапевтический агент и анти-глипикан 3-антитело объединены для совместного, раздельного или последовательного введения в лечении или предупреждении рака печени. Эта фармацевтическая композиция может быть обеспечена в форме объединенного препарата, который содержит как химиотерапевтический агент, так и анти-глипикан 3-антитело. Альтернативно, лекарственное средство, содержащее химиотерапевтический агент, и лекарственное средство, содержащее анти-глипикан 3-антитело, могут быть обеспечены отдельно и использоваться совместно, раздельно или последовательно. Может быть также обеспечен набор, состоящий из лекарственного средства, содержащего химиотерапевтический агент, и лекарственного средства, содержащего анти-глипикан 3-антитело.

В вышеуказанной фармацевтической композиции, когда этот химиотерапевтический агент и это анти-глипикан 3-антитело обеспечены в раздельных лекарственных средствах, эти лекарственные средства могут иметь одинаковую лекарственную форму или разные лекарственные формы. Например, оба могут быть взаимно отличающимися формами лекарственного средства, выбранными из парентеральных лекарственных средств, инъекционных растворов, капель и внутривенных жидкостей, или оба могут быть одинаковыми лекарственными формами, выбранными из парентеральных лекарственных средств, инъекционных растворов, капель и внутривенных жидкостей. Кроме того, один или несколько других типов лекарственного средства могут также объединяться в вышеуказанной фармацевтической композиции.

В другом аспекте, это изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую анти-глипикан 3-антитело в качестве активного ингредиента, для применения в комбинации с химиотерапевтическим агентом для лечения или предупреждения рака печени. При применении фармацевтической композиции, содержащей анти-глипикан 3-антитело в качестве активного ингредиента, в комбинации с химиотерапевтическим агентом, она может вводиться одновременно с этим химиотерапевтическим агентом или может вводиться до или после этого химиотерапевтического агента. При введении анти-глипикан 3-антитела до или после химиотерапевтического агента период введения доз может быть оптимизирован измерением остаточной концентрации химиотерапевтического агента в этом субъекте. Эта концентрация может быть определена подверганием проб, взятых у этого субъекта, способу анализа, известному лицам с обычной квалификацией в данной области, с использованием отдельного прибора, такого как различные типы хроматографов.

В следующем аспекте это изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую химиотерапевтический агент в качестве активного ингредиента, для применения в комбинации с анти-глипикан 3-антителом для лечения или предупреждения рака печени. При использовании этой фармацевтической композиции, содержащей химиотерапевтический агент в качестве активного ингредиента, вместе с анти-глипикан 3-антителом, она может вводиться одновременно с анти-глипикан 3-антителом или может вводиться до или после анти-глипикан 3-антитела. При введении химиотерапевтического агента до или после анти-глипикан 3-антитела, период введения доз может быть оптимизирован измерением остаточной концентрации анти-глипикан 3-антитела у этого субъекта. Эта концентрация может быть определена подверганием проб, взятых у этого субъекта, иммунологическому измерению, известному лицам с обычной квалификацией в данной области, такому как описанный ниже способ ELISA.

Химиотерапевтический агент

Химиотерапевтический агент, используемый в этом изобретении, включает в себя все химиотерапевтические агенты, которые используются или которые предположительно являются полезными в химиотерапии рака. Это химиотерапевтическое лекарственное средство может инъецироваться локально или может вводиться системно. При локальной инъекции лекарственного средства, инъекция может выполняться способом, известным квалифицированным в данной области специалистам. Например, в чрескатетерной артериальной эмболизации (ТАЕ), селективный некроз гепатоцеллюлярной карциномы индуцируют инфузией смеси контрастного вещества на основе масла (Липиодола), канцеростатического и закупоривающего вещества (рассасывающейся желатиновой губки, Gelfoam) в печеночную артерию, служащую в качестве пути доставки нутриентов к опухоли, и закупоривают посредством этого питающую аретрию. С другой стороны, в системной химиотерапии, лекарственные средства, такие как фторурацил (5-FU), урацил-тегафур (UFT), митомицин С (ММС), митоксатрон (DHAD), адриамицин (ADR) (другим названием для которого является доксорубицин (DXR)), эпирубицин (EPI) или цисплатин (CDDR), используют по отдельности или в комбинации с интерфероном (IFN). Кроме того, химиотерапевтические агенты, такие как лапатиниб, имеющие механизм действия, который включает в себя ингибирование киназ, также используют предпочтительно в качестве химиотерапевтического агента в данном изобретении. Сорафениб, который имеет механизм действия, включающий в себя ингибирование киназ, также преимущественно используют в качестве химиотерапевтического агента в данном изобретении. Независимо от механизма действия, химиотерапевтический агент, выгодным образом используемый в данном изобретении, может включать в себя химиотерапевтические агенты, которые вызывают побочные эффекты, характерные для химиотерапевтических агентов при введении субъекту, имеющему рак печени, такие как диарея или констипация (запор), анемия, супрессия иммунной системы (до такой степени, что она провоцирует инфекции или сепсис летальной тяжести), кровотечение, сердечная токсичность, печеночная токсичность, почечная токсичность, отсутствие аппетита и потеря массы.

Сорафениб (4-[4-[[4-хлор-3-(трифторметил)фенил]карбамоиламино]фенокси]-N-метилпиридин-2-карбоксиамид) является перорально активным, низкомолекулярным соединением, имеющим молекулярную массу 464,7. Тозилат сорафениба (BAY 43-9006), его тозиловая (толуолсульфонатная) соль, был одобрен в Европе и Соединенных Штатах в качестве терапевтического агента для применения в системной химиотерапии для рака печени. Кроме Сорафениба, Сунатиниб (SU11248), который, как было показано, имеет противоопухолевую активность против рака печени в клиническом исследовании на пациентах с гепатоцеллюлярным раком, может также использоваться в качестве химиотерапевтического агента в данном изобретении. Сорафениб или Сунитиниб могут быть также предпочтительно использоваться в виде их фармацевтически приемлемых солей.

Подходящие примеры таких солей включают в себя неорганические соли, такие как гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, сульфат или фосфат; соли сульфоновых кислот, такие как метансульфанат, бензолсульфонат и толуолсульфонат; соли карбоновых кислот, такие как формиат, ацетат, оксалат, малеат, фумарат, цитрат, малат, сукцинат, малонат, глюконат, манделат, бензоат, салицилат, фторацетат, трифторацетат, тартрат, пропионат и глутарат; соли щелочных металлов, такие как соль лития, соль натрий, соль калия, соль цезия и соль рубидия; соли щелочно-земельных металлов, такие как соль магния и соль кальция; и соли аммония, такие как соль аммония, соли алкиламмония, соли диалкиламмония, соли триалкиламмония и соли тетраалкиламмония. Из них особенно предпочтительным является применение BAY 43-9006, который является тозиловой солью (солью толуолсульфоновой кислоты).

В химиотерапии может предпочтительно использоваться либо пероральный, либо парентеральный способ введения, хотя предпочтительным является пероральное введение. Лекарственная форма, используемая для перорального введения, может быть подходящим образом выбрана из любых лекарственных форм, таких как жидкие препараты, порошки, гранулы, таблетки, имеющие энтеросолюбильное покрытие препараты и капсулы. Химиотерапевтические агенты, имеющие эти лекарственные формы, готовят способом, известным лицам с обычной квалификацией в данной области. Например, приготовление может проводиться подходящим объединением с фармацевтически приемлемым носителем или растворителем, таким как стерилизованная вода или физиологический раствор, растительное масло, эмульгирующий агент, суспендирующий агент, поверхностно-активное вещество, стабилизатор, ароматический агент, эксципиент, носитель, консервант и связывающий агент, и тонким смешиванием в форму унифицированной (стандартной) дозы, требуемой для общепринятой фармацевтической практики, с последующими лиофилизацией, таблетированием и другими образующими препарат операциями.

Химиотерапевтический агент может также использоваться парентерально в форме инъекционного раствора, такого как стерильный раствор или суспензия в воде или некоторой другой фармакологически приемлемой жидкости. Количество активного ингредиента в этих препаратах выбирают подходящим образом, так чтобы позволить введение подходящей дозы в пределах указанного диапазона. Стерильные композиции для инъекции могут быть приготовлены в соответствии с общепринятой фармацевтической практикой с использованием такого носителя, как дистиллированная вода для инъекции. Примеры водных растворов для инъекции включают в себя физиологический раствор и изотонические растворы, содержащие глюкозу и другие адъюванты, такие как D-сорбит, D-манноза, D-маннит и хлорид натрия; совместно могут быть использованы подходящие растворимые адъюванты, такие как спирты, например, этанол, полиолы, такие как пропиленгликоль и полиэтиленгликоль, и неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как Полисорбат 80^тм и HCO-50. Примеры жидкостей на основе масла включают в себя кунжутное масло и соевое масло; совместно могут быть использованы растворимые адъюванты, такие как бензилбензоат и бензиловый спирт. Кроме того, возможно подходящее приготовление с буферящими агентами (например, фосфатными буферами, натрий-ацетатными буферами), успокаивающими агентами (например, бензиловым спиртом, фенолом) и антиоксидантами.

Терапевтическое антитело

Любое антитело, которое связывается с белками, экспрессируемыми в клетках рака печени, и способно вызывать цитотоксичность против таких клеток, может быть подходящим образом использовано в качестве терапевтического антитела в фармацевтической композиции данного изобретения. Белками, которые являются предпочтительными в качестве молекул-мишеней для этого антитела, являются белки, которые экспрессируются на поверхности клеток рака печени. С точки зрения получения эффектов лечения антителами предпочтительно, чтобы более высокое количество молекул-мишеней экспрессировалось на клеточной поверхности, хотя такие эффекты необязательно зависят от количества молекул. Желательно выбирать в качестве мишени молекулу, которая специфически экспрессируется в клетках рака в сравнении с экспрессией в нормальных клетках. Предпочтительным примером такого белка является глипикан 3.

Глипикан 3 является одним из семейства протеогликанов гепарансульфатов, присутствующих на поверхности клеток. Предполагалось, что глипикан 3 может участвовать в клеточном делении во время развития и в пролиферации раковых клеток, хотя его функция еще хорошо не изучена. Было обнаружено, что некоторые типы антител, которые связываются с глипиканом 3, проявляют подавляющее рост клеток действие вследствие антигензависимой клеточной цитотоксичности (сокращаемой ниже как “ADCC-активность”) и комплементзависимой клеточной цитотоксичности (сокращаемой ниже как “CDC-активность”) (см. WO 2003/000883). Кроме того, известно, что антитело GC33, которое связывается со специфическим эпитопом, проявляет более высокие активности ADCC и CDC против клеток рака печени (см. WO 2006/006693). Предпочтительно анти-глипикан 3-антитела могут быть использованы в лекарственном средстве для рака печени данного изобретения. Примером такого предпочтительного анти-глипикан 3-антитела является антитело GC33 (WO 2006/006693). Аминокислотные последовательности вариабельных районов Н-цепей и L-цепей в антителе GC33 показаны в SEQ ID NO:1 и 2 соответственно.

Анти-глипикан 3-антитело может быть получено из гибридомы на основе известного способа (см. WO 2006/006693). Альтернативно, анти-глипикан 3-антитело может быть создано генной инженерией. Например, рекомбинантное антитело может быть получено с использованием способа генетической рекомбинации, которая включает в себя клонирование гена этого антитела из гибридомы, встраиванием этого гена в подходящий вектор и введением этого вектора в хозяина (например, см. Vandamme, A.M. et al.: Eur. J. Biochem. 192, 767-75 (1990)). Конкретно, мРНК, кодирующую вариабельный (V) район анти-глипикан 3-антитела, выделяют из гибридомы, которая продуцирует анти-глипикан 3-антитело. Выделение мРНК проводят получением из гибридомных клеток с использованием известного способа, такого как гуанидин-центрифугирование (Chirgiwin, J.M. et al.: Biochemie 18, 5294-5299 (1979)) или способ AGPC (Chomczynski, P. et al.: Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987)), с последующим получением мРНК-мишени с использованием, например, набора для очистки мРНК (доступного из Pharmacia). Альтернативно, мРНК может быть получена непосредственно из гибридомы с использованием набора для очистки мРНК QuickPrep (Pharmacia).

С использованием обратной транскриптазы, кДНК для V-района этого антитела синтезируют из полученной таким образом мРНК. Синтез кДНК может проводиться с использованием, например, набора AMV для синтеза первой цепи кДНК обратной транскриптазой (доступного из Seikagaku Corporation). Альтернативно, предпочтительно используют набор 5'-Ampli FINDER RACE (Clontech) и способ 5'-RACE (Frohman, M.A. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002 (1988); Belyavsky, A. et al.: Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932 (1989)), который использует полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для синтеза и амплификации кДНК. В ходе такого синтеза кДНК вводят подходящие сайты рестрикционных ферментов в оба конца этой кДНК, как описано более подробно ниже. Полученную последовательность кДНК подтверждают, затем кДНК, кодирующую V-район анти-глипикан 3-антитела-мишени, встраивают в экспрессирующий вектор, несущий константный район (С-район) желаемого антитела, для слияния в рамке считывания с ДНК, кодирующей этот С-район.

Для получения анти-глипикан 3-антитела, используемого в данном изобретении, район, который регулирует экспрессию этого гена антитела, вводят в экспрессирующий вектор таким образом, что экспрессия происходит под контролем, например, энхансеров и промоторов. Затем эту клетку-хозяина трансформируют экспрессирующим вектором для получения рекомбинантной клетки, которая экспрессирует ДНК, кодирующую анти-глипикан 3-антитело.

Экспрессию гена антитела можно проводить отдельной интеграцией ДНК, кодирующей тяжелые цепи (Н-цепи) или легкие цепи (L-цепи), в экспрессирующие векторы и котрансформацией этой клетки-хозяина, или интеграцией ДНК, кодирующей Н-цепи и L-цепи, в единственный экспрессирующий вектор и трансформацией этой клетки-хозяина (см. WO 1994/011523).

В случаях, когда ген антитела выделяют и вводят в подходящего хозяина для получения этого антитела, предпочтительно может быть использована комбинация подходящего хозяина и экспрессирующего вектора. При использовании эукариотической клетки в качестве хозяина предпочтительным является применение клетки животного, клетки растения или грибной клетки. Иллюстративные примеры клеток животных включают в себя (1) клетки млекопитающих, такие как СНО, COS, клетки миеломы, клетки золотистого (сирийского) хомячка (ВНК), HeLa и VERO; (2) клетки земноводных, такие как ооциты Африканской шпорцевой лягушки (Xenopus); и (3) клетки насекомых, такие как sf9, sf21 и Tn5. Иллюстративные примеры клеток растений включают в себя клетки, полученные из рода Nicotiana, например, Nicotiana tabacum, которые являются клетками, например, культивируемыми в виде каллуса. Иллюстративные грибные клетки включают в себя дрожжи, такие как дрожжи рода Saccharomyces (например, Saccharomyces cerevisiae); и мицелиальные грибы, такие как грибы рода Aspergillus (например, Aspergillus niger). При применении прокариотической клетки предпочтительным является применение продукционной системы, которая использует бактериальные клетки. Иллюстративные примеры подходящих бактериальных клеток включают в себя Escherichia coli и Bacillus subtilis. Экспрессирующий вектор, содержащий ген антитела-мишени, вводят в эти клетки трансформацией и трансформированные клетки культивируют in vitro. Желаемое антитело может быть получено из культуры трансформированных клеток.

Получение рекомбинантных антител не ограничивается только вышеописанными клетками-хозяевами, но могут быть предпочтительно использованы также трансгенные животные. Например, ген антитела может быть сконструирован в виде слитого гена инсертированием его в рамке считывания в ген, кодирующий белок, первично продуцируемый в молоке (например, ген β-казеина козы). ДНК-фрагменты, содержащие этот слитый ген, в котором встроен ген антитела, вводят в зародышей козы и полученные зародыши имплантируют в самку козы. Желаемые антитела могут быть получены из молока, производимого трансгенными козами, рожденными козами, которые получали эти зародыши, или из потомства этих трансгенных коз. Для увеличения количества молока, содержащего желаемое антитело, которое продуцируется трансгенными козами, в этих трансгенных козах могут быть подходящим образом использованы гормоны (Ebert, K.M., et al.: Bio/Technology 12, 699-702 (1994)).

В данном изобретении могут быть использованы генетически рекомбинантные антитела, которые были искусственно модифицированы, например, для снижения гетероантигенности в отношении человека, такие как химерные антитела и гуманизированные антитела. Эти модифицированные антитела могут быть получены с использованием известного способа. Химерным антителом является антитело, состоящее из вариабельных районов тяжелой цепи и легкой цепи, например, антитела мыши и константных районов тяжелой цепи и легкой цепи антитела человека. Такое химерное антитело может быть получено лигированием ДНК, кодирующей эти вариабельные районы мышиного антитела, с ДНК, кодирующей константные районы антитела человека, и экспрессией этого антитела в подходящем хозяине. Предпочтительным примером гуманизированного антитела является антитело hGC33 (WO 2006/006693). Аминокислотная последовательность вариабельных районов Н-цепи и L-цепи антитела hGC33 показаны в SEQ ID NO:3 и 4 соответственно.

С-районы антител человека используются в константных районах химерных антител и гуманизированных антител. Например, Сγ1, Сγ2, Сγ3 и Сγ4 могут быть использованы в качестве Н-цепей и Сκ и Сλ могут быть использованы в качестве L-цепей. Последовательности этих районов известны. Для улучшения этого антитела или его продукционной стабильности С-районы антитела человека могут быть модифицированы.

Химерные антитела состоят из V-районов из антитела млекопитающего не человека и С-районов из антитела человека. Гуманизированные антитела состоят из определяющих комплементарность районов (CDR) из антитела млекопитающего не человека, каркасных районов (FR) из антитела человека и С-районов из антитела человека. Поскольку гуманизированные антитела будут иметь более низкую антигенность в теле человека, они применимы в качестве активного ингредиента в лекарственном средстве этого изобретения.

Гуманизированные антитела, которые также называют реконструированными антителами человека, получают, например, заменой CDR антитела мыши CDR антитела человека. Общие способы генетической рекомбинации для выполнения такой замены известны. Конкретно, ДНК-последовательность конструируют таким образом, что CDR антитела мыши и FR антитела человека сливают в рамке считывания и синтезируют при помощи ПЦР-способа с использованием в качестве праймеров множества олигонуклеотидов, сконструированных таким образом, что они имеют перекрывающиеся части в их концах. Гуманизированное антитело может быть получено инсертированием в экспрессирующий вектор ДНК, полученной, как описано выше, и ДНК, кодирующей С-район антитела человека, так что они сливаются в рамке считывания, и экспрессией полученной ДНК в подходящей клетке-хозяине (см. Европейский патент № 239400 и WO 96/003576).

Произведенные из антитела человека FR-районы, используемые в получении гуманизированного антитела, выбирают таким образом, что CDR будут образовывать хороший антигенсвязывающий сайт при лигировании с этим FR. Связывающую активность полученного таким образом гуманизированного антитела измеряют качественно и количественно, и FR этого антитела человека может быть подходящим образом выбран на основе этой связывающей активности. Если необходимо, аминокислоты этого FR в V-районе этого антитела могут быть заменены таким образом, что CDR реконструированного антитела человека образует подходящий антигенсвязывающий сайт. Вышеуказанные аминокислотные замены вводят легко общепринятым ПЦР-способом. Посредством измерения и оценивания связывающей активности вариантного антитела, имеющего такую аминокислотную замену, отбирают модифицированную FR-последовательность, имеющую желаемые качества (Sato, K. et al.: Cancer Res. 53, 851-856 (1993)).

Способ получения антител человека также известны. Например, желаемое антитело человека, имеющее антигенсвязывающую активность, может быть получено сенсибилизацией лимфоцитов человека in vitro желаемым антигеном или клетками, которые экспрессируют желаемый антиген, затем слиянием этих сенсибилизированных лимфоцитов с клетками миеломы человека, такими как U266 (см. Публикацию патента Японии № Н1-59878). Альтернативно, желаемые антитела человека могут быть получены иммунизацией трансгенного животного, имеющего полный репертуар (спектр) генов антител человека, желаемым антигеном (см. Международные Публикации WO 1993/012337, WO 1992/03918, WO 1994/002602, WO 1994/025585, WO 1996/034096 и WO 1996/033735). Кроме того, известен также способ получения антител человека посредством пэннинга против библиотеки антител человека. Например, можно экспрессировать V-район антитела человека в виде одноцепочечного антитела (scFv) на поверхности фагов с использованием способов фагового дисплея и отобрать фаги, которые связываются с этим антигеном. ДНК-последовательность, кодирующая V-район антитела человека, которое связывается с этим антигеном, может быть определена анализом генов отобранных фагов. ДНК-последовательность scFv, которая связывается с этим антигеном, определяют и сливают в рамке считывания с последовательностью для С-района желаемого антитела человека. Этот слитый белок может быть экспрессирован в подходящей клетке с получением антитела человека. Такие способы уже известны в данной области и могут практиковаться со ссылкой на Международные Публикации WO 1992/001047, WO 1992/020791, WO 1993/006213, WO 1993/011236, WO 1993/019172, WO 1995/001438 и WO 1995/015388.

Ген антитела, сконструированный, как описано выше, может быть экспрессирован и выделен известными способами. При использовании клетки млекопитающего, этот ген антитела может быть экспрессирован функциональным соединением обычно используемого промотора, подлежащего экспрессии гена антитела и поли А-сигнала на 3'-конце (справа). Предпочтительным примером промотора/энхансера является немедленно ранний промотор/энхансер цитомегаловируса человека. Другие применимые промоторы/энхансеры включают в себя промотор/энхансеры ретровирусов, полиомавирусов, аденовирусов и вируса 40 обезьяны (SV40); и промотор/энхансеры, произведенные из клеток млекопитающих, такие как фактор элонгации 1α человека (HEF1α).

При использовании промотора/энхансера SV40, экспрессия гена может легко проводиться по способу Milligan et al. (Nature 277, 108 (1979)). При использовании промотора/энхансера HEF1α, экспрессия гена может легко проводиться по способу Mizushima et al. (Nucleic Acids Res. 18, 5322 (1990)).

При использовании E. coli этот ген антитела может быть экспрессирован функциональным соединением обычно используемого промотора, сигнальной последовательности для секреции антитела и гена антитела, который должен быть экспрессирован. Предпочтительные примеры этого промотора включают в себя промотор lacZ и промотор araB. При использовании промотора lacZ этот ген экспрессируют по способу Ward et al. (Nature 341, 544-546 (1989); FASEB J. 2422-2427 (1992)). При использовании промотора araB этот ген экспрессируют по способу Better et al. (Science 240. 1041-1043 (1998)).

При получении этого антитела в периплазме E. coli, в качестве сигнальной последовательности для секреции антитела может быть использована сигнальная последовательность pe1B (Lei, S.P. et al.: J. Bacteriol. 169, 4379 (1987)). После выделения антитела, продуцированного в периплазме, структура этого антитела может быть повторно уложена с использованием агента денатурации, такого как мочевина или гидрохлорид гуанидина, так что это антитело имеет желаемую связывающую активность.

Сайт инициации репликации, который должен быть инсертирован в этот экспрессирующий вектор, предпочтительно выбирают, например, из SV40, полиомавирусов, аденовирусов и бычьих папилломавирусов (BPV). Кроме того, для амплификации количества копий генов в системе клетки-хозяина в качестве селектируемого маркера в этот экспрессирующий вектор может быть инсертирован ген аминогликозидтрансферазы (APH), ген тимидинкиназы (ТК), ген ксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы Escherichia coli (Ecogpt) или ген дигидрофолатредуктазы (dhfr).

Для получения антитела данного изобретения может быть использована любая экспрессионная система, такая как эукариотическая клетка или прокариотическая клетка. Предпочтительные примеры эукариотических клеток включают в себя клетки животных, такие как установленные линии клеток млекопитающих, и линии клеток насекомых, а также мицелиальных грибных клеток и дрожжевых клеток. Предпочтительные примеры прокариотических клеток включают в себя бактериальные клетки, такие как клетки E. coli. Антитело, используемое в данном изобретении, предпочтительно экспрессируют с использованием клеток млекопитающих, таких как СНО, COS, клетки миеломы, ВНК, клетки Vero или HeLa.

Затем трансформированную клетку-хозяина культивируют in vitro или in vivo с получением антитела-мишени. Культивирование клетки-хозяина проводят в соответствии с известным способом, с использованием в качестве культуральной среды, например, DMEM МЕМ, RPMI640 или IMDM. Комплемент сыворотки, такой как фетальная телячья сыворотка (ФТС), может быть использован вместе с этой культуральной средой.

Антитело, экспрессируемое и полученное, как описано выше, может быть очищено с использованием одного известного способа или комбинации известных способов, обычно используемых в очистке белков. Например, это антитело может быть выделено и очищено при помощи выбора и объединения подходящим образом аффинной колонки, такой как Белок А-колонка, ультрафильтрации, высаливания, диализа и т.п. (Antibodies: A Labaratory Manual; Ed Harlow, David Lane (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)).

Антитела, имеющие модифицированные сахарные цепи, также могут предпочтительно использоваться в этом изобретении. Известно, что ADCC-активность антитела может быть усилена модификацией сахарной цепи этого антитела, которая будет описана подробно ниже. В случаях, когда экспрессия в клетках рака легких антигена, с которым связывается это антитело, является недостаточно высокой для возможности сильного проявления ADCC-активности, используют преимущественно антитело, имеющее модифицированную сахарную цепь. Известные антитела, в которых сахарная цепь была модифицирована, включают в себя, например, антитела с модифицированным гликозилированием (например, WO 1999/54342), антитела, с недостаточностью фукозы, добавленной к этой сахарной цепи (например, WO 2000/061739, WO 2002/031140), и антитела, имеющие сахарную цепь с делящим пополам GlcNAc (N-ацетилглюкозамином) (например, WO 2002/079255).

Связывание антитела с его мишенью (т.е. антигеном) может быть подходящим образом оценено с использованием известного способа. Конкретно, связывающая активность антитела с клетками, экспрессирующими антиген, может быть измерена способами, описанными на страницах 359-420 Antibodies: A Labaratory Manual; Ed Harlow, David Lane (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), на основе ELISA и FACS (активированного флуоресценцией сортинга клеток), с использованием этих клеток в качестве антигена. В формате ELISA, связывающую активность антитела в отношении клетки количественно определяют сравнением уровней сигнала, генерируемого ферментной реакцией. Конкретно, тестируемое антитело добавляют в планшет ELISA, на котором были иммобилизованы антигенэкспрессирующие клетки, и антитело, связанное с этими клетками, детектируют с использованием меченного ферментом вторичного антитела, способного узнавать тестируемое антитело. Альтернативно, связывающая активность антитела в отношении клетки может сравниваться в FACS, где готовят серию разведений тестируемого антитела и определяют титр связывания антитела с антигенэкспрессирующими клетками.

В формате FACS связывание между антителом и антигеном, экспрессируемым на поверхности клеток, измеряют в суспензии вместо использования клеток, связанных с носителем, таким как планшет ELISA. Проточные цитометры, используемые в формате FACS, включают в себя FACSCanto™ II, FACSAria™, FACSArray™, FACSVantage™ SE и FACSCalibur™ (все они доступны из BD Biosciences); а также EPICS ALTRA HyPErSort, Cytomics FC 500, EPICS XL-MCL ADC, EPICS XL ADC и Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (все они доступны из Beckman Coulter).

В одном предпочтительном способе измерения связывающей активности тест-антитела с антигеном, тест-антитело реагирует с антигенэкспрессирующими клетками, окрашенными FITC-меченым вторичным антителом, способным узнавать это тест-антитело, и затем связывающую активность измеряют при помощи FACSCalibur (BD) и интенсивность флуоресценции анализируют с использованием программного обеспечения CELL QUEST Software (BD). Этот способ позволяет оценивать связывающую активность тест-антитела сравнением величины геометрического среднего, полученной с использованием тест-антитела (тест-величины Geo-Mean), с контрольной величиной GeoMean, полученной с использованием контрольного антитела. Формула для расчета этой величины Geo-Mean (геометрического среднего) описана в CELL QUEST Software User's Guide (BD Biosciences).

Антитело, способное связываться с эпитопом, с которым способно связываться антитело GC33, может быть выгодным образом использовано в качестве антитела в данном изобретении. Связывающая способность антитела этого изобретения в отношении этого эпитопа может быть тестирована вышеупомянутым способом FACS или ELISA. Для тестирования, связывается ли это тест-антитело с тем же самым эпитопом, что и эпитоп, с которым связывается антитело GC33, т.е. имеет ли оно общий эпитоп с антителом GC33, может быть анализирована конкуренция между этими двумя антителами за один и тот же эпитоп. В данном изобретении конкуренция между антителами может быть определена, например, при помощи FACS или анализа перекрестного блокирования. В FACS, сначала антитело GC33 связывают с GPC3-экспрессирующими клетками и измеряют сигнал флуоресценции. Затем взаимодействует кандидатное конкурирующее антитело, затем антитело GC33 взаимодействует с теми же самыми клетками и сигнал анализируют сходным образом при помощи FACS. Альтернативно, антитело GC33 и конкурирующее антитело, подлежащее тестированию, может конкурентно реагировать с одними и теми же клетками. Если картина FACS-анализа на антитело GC33 изменяется в присутствии конкурирующего антитела, считается, что это конкурирующее антитело узнает тот же самый эпитоп, что и антитело GC33. Анализ перекрестного блокирования может проводиться в соответствии со способом, описанным конкретно здесь, или способом, известным в данной области, например, описанным в “Antibodies: A Laboratory Manual,” Cold Spring Harbor Laboratory, Ed. Harlow and David Lane (1988).

Например, конкурентный ELISA-анализ является предпочтительно анализом перекрестного блокирования. В анализе перекрестного блокирования, клетки, экспрессирующие белок GC33, иммобилизуют на лунках микропланшета, предынкубируют в присутствии или в отсутствие кандидатного конкурирующего антитела, затем к лункам добавляют антитело GC33. Количество антитела GC33, которое связывается с экспрессирующими белок GC33 клетками в этих лунках, обратно коррелирует со связывающей способностью кандидатного конкурирующего антитела (тест-антитела), которое конкурирует за связывание с тем же самым эпитопом. То есть, чем больше аффинность тестируемого антитела в отношении того же самого эпитопа, тем ниже количество антитела GC33, которое связывается с лунками, в которых иммобилизованы экспрессирующие белок GPC3 клетки. Или, наоборот, чем больше аффинность тестируемого антитела в отношении того же самого эпитопа, тем выше количество тест-антитела, которое связывается с лунками, в которых иммобилизованы экспрессирующие белок GPC3 клетки.

Количество антитела, которое связывается с лунками, может быть легко измерено посредством предварительного мечения этого антитела. Например, биотин-меченое антитело может быть измерено с использованием конъюгата авидин-пероксидаза и подходящего субстрата. В частности, анализы перекрестного блокирования, которые используют мечение фермента пероксидазой или т.п., называют “конкурентными анализами ELISA”. Это антитело может быть подходящим образом помечено другим метящим веществом, которое может быть детектировано или измерено, например, радиоактивным мечением и флуоресцентным мечением.

Кроме того, в случаях, когда тест-антитело имеет константный район, который происходит из другого вида, чем антитело GC33, антитело, связанное с лунками, может быть измерено с использованием меченого антитела, которое специфически узнает константный район, происходящий из этого вида. Когда этим антителом является антитело, которое происходит из того же самого вида, но из другого класса, антитело, связанное с лунками, может быть подходящим образом измерено с использованием меченого антитела, которое специфически различает эти соответствующие классы.

При сравнении со связывающей активностью, полученной в контрольном тесте, проводимом в отсутствие кандидатного конкурирующего антитела, когда это кандидатное антитело способно блокировать по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 20-50% и более предпочтительно по меньшей мере 50% связывания антителом GC33, это кандидатное конкурирующее антитело является антителом, которое связывается по существу с тем же самым эпитопом, что и антитело GC33, или конкурирует за связывание с тем же самым эпитопом.

Антитело, которое связывается по существу с тем же самым эпитопом, что и антитело GC33, может быть отобрано общепринятым способом при помощи анализа перекрестного блокирования, как описано выше, или при помощи других способов. Предпочтительные примеры могут включать в себя, но не ограничиваются ими:

антитело, содержащее вариабельный район Н-цепи, содержащий CDR 1, 2 и 3 из: CDR1, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:5, CDR2, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:6, и CDR3, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:7; и вариабельный район L-цепи, содержащий CDR 1, 2 и 3 из: CDR1, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в любой из SEQ ID NO:9-23, CDR2, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:24, и CDR3, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:25;

антитело, содержащее вариабельный район Н-цепи, содержащий CDR 1, 2 и 3 из: CDR1, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:5, CDR2, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:26, и

CDR3, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:7; и вариабельный район L-цепи, содержащий CDR 1, 2 и 3 из: CDR1, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:28, CDR2, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:24, и CDR3, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:25; и

антитело, содержащее вариабельный район Н-цепи, содержащий CDR 1, 2 и 3 из: CDR1, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:5, CDR2, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:30, и CDR3, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:7; и вариабельный район L-цепи, содержащий CDR 1, 2 и 3 из: CDR1, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:32, CDR2, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:24, и CDR3, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:25. Фиг.8 и 9 показывают аминокислотную последовательность вариабельных районов Н-цепи и L-цепи и CDR примерных гуманизированных антител, которые могут быть предпочтительно использованы в данном изобретении.

Антитело, используемое в данном изобретении, обладает цитотоксичностью. В данном контексте “цитотоксичность” означает, что это антитело имеет активность, которая вызывает повреждение клеток-мишеней, которые экспрессируют соответствующий антиген. Когда комплекс антиген-антитело не интернализуется в пределах клетки вследствие природы этого антигена, предпочтительные примеры цитотоксичности, проявляемой этим антителом, включают в себя антителозависимую клеточную цитотоксичность (“ADCC-активность”) и комплементзависимую клеточную цитотоксичность (“CDC-активность). С другой стороны, когда комплекс антиген-антитело интернализуется в пределах клетки вследствие природы этого антигена, может быть предпочтительно использовано конъюгированное антитело, состоящее из антитела и химиотерапевтического агента, радиоизотопа или токсичного вещества, присоединенного к этому антителу. В таком случае цитотоксичность этого антитела произведена из цитотоксичности, проявляемой этим химиотерапевтическим агентом, присоединенным к этому конъюгированному антителу.

Могут быть использованы известные способы для измерения, проявляет ли антитело, используемое в этом изобретении, ADCC-активность и проявляет ли оно CDC-активность (например, Curerent Protocols in Immunology, Chapter 7: Immunologic studies in humans; ed., John E. Coligan et al. (John Wiley & Sons, Inc.; 1993)).

Сначала проводят получение эффекторных клеток, раствора комплемента и клеток-мишеней в соответствии со следующими процедурами:

(1) Получение эффекторных клеток

Селезенку извлекают из мышей CBA/N и клетки селезенки выделяют в среде RPMI1640 (Invitrogen). Эффекторные клетки могут быть получены промыванием выделенных клеток селезенки в той же самой среде, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку (ФТС; HyClone), и доведением концентрации этих клеток до 5×10⁶/мл.

(2) Получение раствора комплемента

Раствор комплемента может быть получен 10-кратным разведением кроличьего комплемента (Baby Rabbit Complement) (CEDARPLANE) содержащей 10% ФТС средой (Invitrogen).

(3) Получение клеток-мишеней

Антигенэкспрессирующие клетки инкубируют в течение 1 часа при 37°С в 0,2 мКи ⁵¹Cr-хромате натрия (GE Healthcare Bio-Science) и содержащей 10% ФТС среде DMEM для радиоактивного мечения этих клеток-мишеней. Предпочтительные примеры антигенэкспрессирующих клеток, которые могут быть использованы в этом изобретении, включают в себя клетки, трансформированные геном, кодирующим этот антиген, клетки первичного гепатоцеллюлярного рака и клетки метастатического гепатоцеллюлярного рака. После радиоактивного мечения эти клетки промывают три раза содержащей 10% ФТС средой RPMI1640 и концентрацию этих клеток доводят до 2×10⁵ клеток/мл для получения клеток-мишеней.

ADCC-активность и CDC-активность могут быть измерены описанными ниже способами. При измерении ADCC-активности клетки-мишени и антитело по этому изобретению добавляют в 96-луночный U-донный планшет (Becton Dickinson) в количестве 50 мкл на каждую лунку, затем они взаимодействуют в течение 15 минут на льду. Затем в лунку добавляют 100 мкл эффекторных клеток. Этот планшет инкубируют в течение 4 часов в термостате с диоксидом углерода. Конечную концентрацию антитела устанавливают на 0 или 10 мкг/мл, хотя эта концентрация доводится подходящим образом на основе активности этого антитела. После инкубации, берут 100 мкл супернатанта на лунку и радиоактивность измеряют гамма-счетчиком (COBRAII AUTO-GAMMA, Model D5005; Packard Instrument Company). Полученные величины радиоактивности могут быть использованы для расчета цитотоксичности (%) в соответствии с формулой

(А-С)/(В-С)×100,

где А представляет радиоактивность (имп./мин) пробы, В представляет радиоактивность (имп/.мин) пробы, к которой был добавлен 1% NP-40 (Nakalai Tesque), и С представляет радиоактивность (имп./мин) пробы, содержащей только клетки-мишени.

При измерении CDC-активности, клетки-мишени и антитело по этому изобретению добавляют в 96-луночный плоскодонный планшет (Becton Dickinson) в количествах 50 мкл каждого компонента на лунку, затем дают им взаимодействовать в течение 15 минут на льду. Затем в каждую лунку добавляют 100 мкл раствора комплемента. Планшет инкубируют в течение 4 часов в термостате с диоксидом углерода. Конечную концентрацию антитела устанавливают на 0 или 3 мкг/мл, хотя эта концентрация доводится подходящим образом на основе активности этого антитела. После инкубации берут 100 мкл супернатанта на лунку и радиоактивность измеряют гамма-счетчиком. Цитотоксичность может быть рассчитана таким же способом, какой используется для измерения ADCC-активности.

Цитотоксичность, проявляемая конъюгированным антителом, может предпочтительно оцениваться измерением цитотоксичности, проявляемой химиотерапевтическим агентом, радиоизотопом или токсичным веществом, присоединенными к этому конъюгату антитела. При измерении цитотоксичности, проявляемой химиотерапевтическим агентом, радиоизотопом или токсичным веществом, присоединенными к этому конъюгату антитела, клетку-мишень и конъюгированное антитело по данному изобретению добавляют в 96-луночный плоскодонный планшет (Becton Dickinson) в количестве 50 мкл каждого на лунку и дают взаимодействовать в течение периода 15 минут на льду. Затем этот планшет инкубируют в течение периода 1-4 часов в термостате с диоксидом углерода. Конечную концентрацию антитела устанавливают на 0 или 3 мкг/мл, хотя эта концентрация доводится подходящим образом на основе активности этого антитела. После инкубации берут 100 мкл супернатанта на лунку и радиоактивность измеряют гамма-счетчиком. Цитотоксичность может быть рассчитана таким же способом, какой используется для измерения ADCC-активности.

Иллюстративные примеры химиотерапевтических агентов, которые могут быть конъюгированы с антителом этого изобретения и имеют цитотоксическое действие, включают в себя: азарибин, анастрозол, азацитидин, блеомицин, бортезомид, бриостатин-1, бусульфан, камптотецин, 10-гидроксикамптотецин, кармустин, целебрекс, хлорамбцил, цисплатин, иринотекан, карбоплатин, кладрибин, циклофосфамид, цитарабин, дакарбазин, доцетаксел, дактиномицин, дауномицина глюкуронид, даунорубицин, дексаметазон, диэтилстильбестрол, доксорубицин, доксорубицина глюкуронид, эпирубицин, этинилэстрадиол, эстрамустин, этопозид, этопозида глюкуронид, флоксуридин, флударабин, флутамид, фторурацил, флуоксиместерон, гемцитабин, гидроксипрогестерона капроат, гидроксимочевину, идарубицин, ифосфамид, лейковорин, ломустин, меклоретамин, медроксипрогестерона ацетат, мегестрола ацетат, мелфалан, меркаптопурин, метотрексат, митоксантрон, митрамицин, митомицин, митотан, фенилбутират, преднизон, прокарбазин, паклитаксел, пентостатин, семустин, стрептозоцин, тамоксифен, таксаны, таксол, тестостерона пропионат, талидомид, тиогуанин, тиотепа, тенипозид, топотекан, урацилдихлордиэтилсульфид (урацилиприт), винбластин, винорелбин и винкристин.

В данном изобретении предпочтительными химиотерапевтическими агентами являются низкомолекулярные химиотерапевтические агенты. Низкомолекулярные химиотерапевтические агенты все еще имеют низкую вероятность вмешательства в функцию антитела после конъюгации с этим антителом. В данном изобретении, этот низкомолекулярный химиотерапевтический агент обычно имеет молекулярную массу от 100 до 2000 и предпочтительно от 200 до 1000. Вышеупомянутые химиотерапевтические агенты, все, являются низкомолекулярными химиотерапевтическими агентами. Химиотерапевтические агенты, используемые в данном изобретении, включают в себя пролекарства, которые превращаются в теле в активные химиотерапевтические агенты. Пролекарства могут быть предпочтительно активированы ферментативным превращением или неферментативным превращением.

Кроме того, это антитело может быть предпочтительно модифицировано с использованием токсинных пептидов, таких как рицин, абрин, рибонуклеаза, онконаза, ДНКаза I, энтеротоксин-А стафилококка, антивирусный белок фитолакки американской, гелонин, дифтерийный токсин, экзотоксин Pseudomonas, L-аспарагиназа и L-аспарагиназа ПЭГ. В другом аспекте, один, или два, или более низкомолекулярных химиотерапевтических агентов и токсический пептид могут быть объединены и использованы для модификации этого антитела. Антитело этого изобретения может быть конъюгировано с вышеуказанным низкомолекулярным химиотерапевтическим агентом посредством ковалентной связи или нековалентной связи. Способы получения антител, конъюгированных с химиотерапевтическим агентом, известны в данной области.

Кроме того, белковое лекарственное средство или токсин может быть предпочтительно конъюгировано с этим антителом способом генетической инженерии. Конкретно, это может быть выполнено слиянием ДНК, кодирующей вышеупомянутый токсичный пептид, с ДНК, кодирующей антитело этого изобретения, и экспрессией этой слитой ДНК в подходящей клетке-хозяине. Антитело, конъюгированное с токсичным пептидом, может быть предпочтительно получено в виде слитого белка. Слитый белок с этим антителом обычно конструируют таким образом, что белковое лекарственное средство или токсин помещают на С-концевой стороне этого антитела. Между этим антителом и белковым лекарственным средством или токсином может быть предпочтительно инсертирован пептидный линкер.

Фармацевтическая композиция

Данное изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для эффективного лечения или предупреждения рака печени, содержащую комбинацию химиотерапевтического агента и анти-глипикан 3-антитела, а также эффективный способ лечения рака печени с использованием этой фармацевтической композиции. В другом аспекте это изобретение обеспечивает способ применения этого анти-глипикан 3-антитела для усиления терапевтических действий химиотерапевтического агента в лечении пациента с раком печени этим химиотерапевтическим агентом. В данном контексте, фраза “усиление терапевтических действий” означает, что скорость реакции улучшается, количество химиотерапевтического агента для лечения уменьшается и/или период лечения этим химиотерапевтическим агентом укорачивается. Еще в одном аспекте это изобретение обеспечивает способ применения анти-глипикан 3-антитела для приготовления фармацевтической композиции для лечения или предупреждения рака печени, причем эта композиция содержит химиотерапевтический агент и анти-глипикан 3-антитело в качестве активных ингредиентов. Кроме того, это изобретение обеспечивает способ лечения или предупреждения пациентов с раком печени, использующий химиотерапевтический агент и анти-глипикан 3-антитело.

В данном изобретении фраза “содержат химиотерапевтический агент и/или анти-глипикан 3-антитело в качестве активного ингредиента” означает содержание химиотерапевтического агента и/или анти-глипикан 3-антитела в качестве главного активного ингредиента, хотя содержание этого химиотерапевтического агента и/или этого анти-глипикан 3-антитела конкретно не ограничивается. Термин “лечение” обозначает, что посредством введения фармацевтической композиции этого изобретения субъекту клетки рака печени разрушаются или количество таких клеток уменьшается, рост клеток рака печени подавляется или различные симптомы, вызываемые раком печени, ослабляются. Термин “предупреждение” означает предотвращение увеличения количества клеток рака печени вследствие рецидива опухоли или предотвращение рецидива клеток рака печени, рост которых был подавлен.

Терапевтическое антитело этого изобретения может вводиться перорально или парентерально. Особенно предпочтительным является парентеральное введение. Иллюстративные примеры таких способов введения включают в себя введение инъекцией, назальное введение, легочное введение и чрескожное введение. Примеры введения инъекцией включают в себя внутривенную инъекцию, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию и подкожную инъекцию, где терапевтическое антитело этого изобретения может вводиться системно или локально (местно). Способ введения может быть выбран подходящим образом в соответствии с возрастом и конкретными симптомами пациента. Эта доза может быть выбрана из диапазона от 0,0001 мг до 1000 мг на килограмм массы тела на унифицированную (стандартную) дозу. Альтернативно, доза терапевтического антитела этого изобретения не ограничивается вышеупомянутыми дозами.

Объединенное применение химиотерапевтического агента и анти-глипикан 3-антитела в этом изобретении означает, что этот химиотерапевтический агент и это анти-глипикан 3-антитело вводят или используют (что называют коллективно ниже термином “вводят”) вместе; и эта фраза не должна интерпретироваться как ограничивающая порядок введения, интервал введения доз и т.п. Кроме того, эти химиотерапевтический агент и анти-глипикан 3-антитело этого изобретения могут быть использованы в виде набора, содержащего оба ингредиента. Согласно этому изобретению этот химиотерапевтический агент и это анти-глипикан 3-антитело могут использоваться в комбинации, если желательно, при более низких дозах, чем дозы каждого при раздельном применении.

Порядок введения химиотерапевтического агента и анти-глипикан 3-антитела этого изобретения может включать в себя: первое введение анти-глипикан 3-антитела, затем введение химиотерапевтического агента; введение химиотерапевтического агента и анти-глипикан 3-антитела одновременно или первое введение химиотерапевтического агента, затем введение анти-глипикан 3-антитела.

В случаях раздельного введения химиотерапевтического агента и анти-глипикан 3-антитела интервал дозирования доз химиотерапевтического агента и анти-глипикан 3-антитела может быть выбран с учетом факторов, включающих в себя способ введения и лекарственную форму. Например, интервал введения доз равен обычно 0-168 часам, предпочтительно 0-72 часам, более предпочтительно 0-24 часам и даже более предпочтительно 0-12 часам. Наряду с такими факторами, как способ введения и лекарственная форма, могут также учитываться остаточные концентрации в субъекте химиотерапевтического агента и анти-глипикан 3-антитела этого изобретения. В случаях, когда химиотерапевтический агент вводят перед введением анти-глипикан 3-антитела, может вводиться анти-глипикан 3-антитело, в то время как остаточная концентрация химиотерапевтического агента является достаточной для получения желаемого эффекта анти-глипикан 3-антитела. Эта концентрация может быть определена взятием пробы от субъекта и анализом этой пробы любыми способами, известными лицам с обычной квалификацией в данной области, с использованием разделяющего прибора, такого как любые типы хроматографов.

Напротив, в случаях, когда анти-глипикан 3-антитело вводят перед введением химиотерапевтического агента, может вводиться химиотерапевтический агент, в то время как остаточная концентрация в субъекте анти-глипикан 3-антитела является достаточной для получения желаемого эффекта химиотерапевтического агента. Эта концентрация может быть определена взятием пробы от субъекта и анализом этой пробы иммунологическим измерением, известным лицам с обычной квалификацией в данной области, таким как способ ELISA, описанный ниже.

Терапевтическое антитело этого изобретения может быть получено в соответствии с общепринятым способом (см., например, самое последнее издание Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton, USA)), и оно может также включать в себя фармацевтически приемлемые носитель и добавку. Примеры добавок, которые могут быть использованы, включают в себя, но не ограничиваются ими, поверхностно-активные вещества, эксципиенты, красители, ароматические агенты, консерванты, стабилизаторы, буферы, суспензии, агенты тоничности, связывающие агенты, дезинтегрирующие агенты, смазывающие вещества, интенсификаторы текучести и улучшающие вкус агенты. Кроме того, могут быть также использованы подходящим образом общепринятые носители. Иллюстративные примеры таких носителей включают в себя осажденный диоксид кремния, лактозу, кристаллическую целлюлозу, маннит, крахмал, кальций-кармелозу, натрий-кармелозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, поливинилацеталя диэтиламиноацетат, поливинилпирролидон, желатин, триглицериды жирных кислот со средней цепью, полиоксиэтилен-отвержденное касторовое масло 60, белый сахар (сахар-песок), карбоксиметилцеллюлозу, кукурузный крахмал и неорганические соли.

Полные содержания всех патентов и ссылок, цитируемых в этом описании, включены здесь в качестве ссылки в их полном объеме.

Данное изобретение описано подробно в следующих примерах, которые являются только иллюстративными и не должны пониматься как ограничивающие это изобретение.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Эффекты объединенного применения анти-глипикан 3-антитела и химиотерапевтического агента (митоксантрона или гидрохлорида доксорубицина) в мышиных моделях, имплантированных экспрессирующей глипикан 3 клеточной линией рака печени человека

(1) Клеточная линия

В качестве экспрессирующих глипикан 3 клеточных линий рака печени человека использовали клетки HuH-7 (Human Science Research Resource Bank) и клетки HepG2 (ATCC). Клетки HuH-7 поддерживали и субкультивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (Sigma), содержащей 10% ФТС (BIONET), и клетки HepG2 поддерживали и субкультивировали в Минимальной Эссенциальной среде Игла (Sigma), содержащей 10% ФТС, 1 ммоль/л МЕМ пируват натрия (Invitrogen) и 1 ммоль/л МЕМ заменимой аминокислоты (Invitrogen).

(2) Получение мышиных моделей, имплантированных клетками рака печени человека

Каждый тип клеток получали при количестве клеток 5х10⁷ на миллилитр раствора, содержащего равные количества среды субкультивирования и матрикса MATRIGEL (BD Science). Затем 100 мкл (т.е. 5×10⁶ клеток на мышь) этой клеточной суспензии имплантировали подкожно в области живота мышей SCID (пятинедельных самцов; CLEA Japan, Inc.), которым, за день до имплантации клеток, внутрибрюшинно вводили 100 мкл анти-асиало GM1-антитела (Wako Pure Chemical Industrts, Ltd.; растворенного в 5 мл жидкости в одном флаконе). Считали, что эти модели были установлены, когда, при расчете объема опухоли по следующей формуле, средний объем опухоли становился равным 237-298 мм³:

Объем опухоли = большая ось × малая ось × малая ось/2

(3) Приготовление антитела и химиотерапевтического агента

Мышиное моноклональное анти-глипикан 3 человека-антитело (название клона: GC33; описанное в WO 2006/006693) готовили в концентрации 0,5 мг/мл (группа 5 мг/кг) и 0,1 мг/мл (группа 1 мг/кг) с использованием PBS(-). Гидрохлорид доксорцбицина (Adriacin Injection, доступный из Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) растворяли при концентрации 10 мг/мл в дистиллированной воде для инъекции (Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd.), затем разводили до концентрации 0,5 мг/мл с использованием PBS(-). Гидрохлорид митоксантрона (Novantrone Injection; доступный из Wyeth) растворяли при 10 мг/мл в физиологическом солевом растворе (Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd.), затем разводили до концентрации 0,1 мг/мл с использованием PBS(-).

(4) Введение химиотерапевтического агента

В имплантированной раком печени человека мышиной модели, созданной в (2) выше, дозы 10 мл/кг пробы этого антитела, приготовленной в (3) выше, вводили через хвостовую (каудальную) вену один раз в неделю на протяжении периода трех недель, начиная в день 11 после имплантации для модели ксенотрансплантата клеток HuH-7 и начиная в день 20 после имплантации для модели ксенотрансплантата клеток HepG2. В качестве отрицательного контроля дозы 10 мл/кг отфильтрованного стерилизованного PBS(-) (носителя) вводили подобным образом один раз в неделю на протяжении периода трех недель через хвостовую вену. Модель ксенотрансплантата клеток HuH-7 получала единственную дозу 10 мл/кг, в день 10 после имплантации, гидрохлорида доксорубицина (DOX), приготовленного в (3) выше, или PBS(-) в качестве отрицательного контроля, причем каждая доза вводилась через хвостовую вену. Модель ксенотрансплантата клеток HepG2 получала единственную дозу 10 мл/кг в неделю на протяжении периода трех недель, начиная в день 20 после имплантации, гидрохлорида митоксантрона (МХ), приготовленного в (3) выше, или PBS(-) в качестве отрицательного контроля, причем каждая доза вводилась через хвостовую вену. Каждая группа состояла из 6 животных. Подробности, касающиеся введения этих химиотерапевтических агентов, показаны в таблицах 1 и 2.

Таблица 1
Модель ксенотрансплантата HuH-7
Группа	Количество животных	Лекарст- венное средство	Доза (мг/кг)	Способ введения	Дни введения
1	6	PBS(-)		хвостовая вена	дни 10, 17, 24 после имплантации
1	6	PBS(-)		хвостовая вена	день 10 после имплантации
2	6	GC33	5	хвостовая вена	день 10, 17, 24 после имплантации
2	6	PBS(-)		хвостовая вена	день 10 после имплантации
3	6	PBS(-)		хвостовая вена	день 10, 17, 24 после имплантации
3	6	DOX	5	хвостовая вена	день 10 после имплантации
4	6	GC33	5	хвостовая вена	дни 10, 17, 24 после имплантации

Таблица 2
Модель ксенотрансплантата HepG2
Группа	Количество животных	Лекарст- венное средство	Доза (мг/кг)	Способ введения	Дни введения
1	6	PBS(-)		хвостовая вена	дни 20, 27, 34 после имплантации
1	6	PBS(-)		хвостовая вена	день 20, 27, 34 после имплантации
2	6	GC33	1	хвостовая вена	день 20, 27, 34 после имплантации
		PBS(-)		хвостовая вена	день 20, 27, 34 после имплантации
3	6	PBS(-)		хвостовая вена	день 20, 27, 34 после имплантации
3	6	MX	1	хвостовая вена	день 20, 27, 34 после имплантации
4	6	GC33	1	хвостовая вена	день 20, 27, 34 после имплантации
4	6	MX	1	хвостовая вена	день 20, 27, 34 после имплантации

(5) Оценивание противоопухолевого эффекта

Противоопухолевые эффекты комбинации антитела GC33 и химиотерапевтического агента в мышиных моделях имплантации рака печени человека оценивали на основе объема опухоли спустя одну неделю после конечного введения. Статистический анализ проводили при помощи t-критерия с использованием объемов опухолей в конечный день измерения. Для статистического анализа использовали SAS Preclinical Package (SAS Institute, Inc.). Эти результаты показаны на фиг.1.

Фиг.1 является графиком, показывающим изменение объема опухоли при введении антитела GC33 и доксорубицина (DOX) вместе в мышиную модель, имплантированную клетками клеточной линии HuH-7 рака печени человека. Ромбы указывают изменение объема опухоли в группе, получавшей носитель. Кружки указывают изменение объема опухоли в группе, получавшей только антитело GC33. Треугольники указывают изменение объема опухоли в группе, получавшей только доксорубицин (DOX). Звездочки указывают изменение объема опухоли в группе, в которой антитело GC33 и доксрубицин (DOX) вводили вместе. Фиг.1В является графиком, показывающим изменение объема опухоли при введении антитела GC33 и доксорубицина (DOX) вместе в мышиную модель, имплантированную клеточной линией HepG2. Ромбы указывают изменение объема опухоли в группе, получавшей носитель. Кружки указывают изменение объема опухоли в группе, получавшей только антитело GC33. Треугольники указывают изменение объема опухоли в группе, получавшей только митоксантрон (МХ). Звездочки указывают изменение объема опухоли в группе, в которой антитело GC33 и митоксатрон (МХ) вводили вместе.

Как видно из фиг.1, в сравнении с ростом опухоли в группе, получавшей только GC33, рост опухоли в группах, получавших комбинацию GC33 и доксорубицина (DOX, фиг.1А) или митоксатрона (МХ, фиг.1В), был значимо подавлен.

ПРИМЕР 2

Эффекты объединенного применения анти-глипикан 3-антитела и химиотерапевтического агента (Сорафениба) в мышиных моделях, имплантированных экспрессирующей глипикан 3 клеточной линией рака печени человека

Шестинедельных самцов мышей СВ-17 SCID покупали из CLEA Japan, Inc. Перед имплантацией опухоли мышам вводили внутрибрюшинно 200 мкг анти-асиало-GM-антитело (WAKO). Клетки HepG2 или клетки HuH-7 (5×10⁵ клеток), диспергированные в 50% Матригеле (Becton Dickinson), имплантировали подкожно. При достижении объема опухоли 250 мм³, этих мышей делили на группы и начинали введение. Гуманизированное анти-глипикан 3-антитело (GC33, WO 2006/006693) готовили в подходящей концентрации в PBS(-) и вводили внутривенно в соответствии со способом, описанным в Organic Research & Development 6, 777-781 (2002), и суспендировали в чистой воде, содержащей 10% этанол и 10% Кремофор EL, и вводили перорально 5 раз в неделю в течение 3 недель. В качестве контроля-носителя служила чистая вода, содержащая PBS(-), 10% этанол и 10% Кремофор EL. Объем опухоли (мм³) рассчитывали с использованием формулы, описанной в примере 1. Эти результаты показаны на фиг.2-4.

Фиг.2 является графиком, показывающим противоопухолевые эффекты антитела hGC33 и Сорафениба на мышиной модели, имплантированной клетками клеточной линии HuH-7 рака печени человека, показанные изменением объема опухоли (среднее + стандартное отклонение). Белые кружки указывают изменение объема опухоли в группе, получавшей носитель. Сплошные кружки указывают изменение объема опухоли в группе, получавшей только антитело hGC33 в дозе 5 мг/кг. Белые квадраты указывают изменение объема опухоли в группе, получавшей только Сорафениб в дозе 80 мг/кг. Сплошные квадраты указывают изменение объема опухоли в группе, получавшей комбинацию антитела hGC33 в дозе 5 мг/кг и Сорафениба в дозе 80 мг/кг. Фиг.3 является графиком, показывающим противоопухолевые эффекты антитела hGC33 и Сорафениба на мышиной модели, имплантированной клетками клеточной линии HepG2 рака печени человека, показанные изменением объема опухоли (среднее + стандартное отклонение). Белые кружки указывают изменение объема опухоли в группе, получавшей носитель. Сплошные кружки указывают изменение объема опухоли в группе, получавшей только антитело hGC33 в дозе 5 мг/кг. Белые квадраты указывают изменение объема опухоли в группе, получавшей только Сорафениб в дозе 80 мг/кг. Сплошные квадраты указывают изменение объема опухоли в группе, получавшей комбинацию антитела hGC33 в дозе 5 мг/кг и Сорафениба в дозе 80 мг/кг. Фиг.4 является графиком, показывающим действие антитела hGC33 и Сорафениба на потерю массы тела в мышиной модели, имплантированной клетками клеточной линии HepG2 рака печени человека, показанные изменением массы этой модели (среднее + стандартное отклонение). Белые кружки указывают изменение массы тела в группе, получавшей носитель. Сплошные кружки указывают изменение массы тела в группе, получавшей только антитело hGC33 в дозе 5 мг/кг. Белые квадраты указывают изменение объема опухоли в группе, получавшей только Сорафениб в дозе 80 мг/кг. Сплошные квадраты указывают изменение объема опухоли в группе, получавшей комбинацию антитела hGC33 в дозе 5 мг/кг и Сорафениба в дозе 80 мг/кг. Звездочки на этих фигурах указывают Р<0,05, на основе критерия Дуннета.

В результате, рост опухоли подавлялся в модели ксенотрансплантата HuH-7 введением только 5 мг/кг hGC33 или только 80 мг/кг Сорафениба. Кроме того, при введении обоих вместе, наблюдали, что рост опухоли более заметно подавлялся, чем в случае введения одного hGC33 или Сорафениба (Фиг.2).

Подавляющий рост опухоли эффект был показан объемом опухоли в конечный день измерения (т.е. в день 42). В модели ксенотрансплантата HepG2, подавляющий рост опухоли эффект в группе, получавшей комбинацию 1 мг/кг гуманизированного GC33 и 80 мг/кг (максимальной переносимой дозы) Сорафениба, был значимо более высоким, чем подавляющий эффект в группах, получавших либо hGC33, либо Сорафениб отдельно в тех же самых дозах. Обычно в этой модели наблюдали потерю массы, ассоциированную с ростом опухоли, и эта потеря массы усиливалась введением одного Сорафениба. При объединении Сорафениба и гуманизированного GC33 эта потеря массы значимо ослаблялась (см., в частности, результаты в дни 39 и 42 (фиг.3)), наряду с усилением эффективности, в сравнении с одним Сорафенибом.

Ссылочный пример 3

(1) Конструирование генов точковых мутаций гуманизированного антитела H0L0

Конструировали различные гены точковых мутаций, начиная с гена, кодирующего антитело GC33, содержащее CDR гуманизированного антитела H0L0. Синтезировали олиго-ДНК на основе последовательностей смысловой и антисмысловой цепей, содержащие сайты модификации. Множество генов точковых мутаций конструировали с использованием коммерческого набора сайт-направленного мутагенеза QuickChange (Stratagene). Конструирование этих генов точковых мутаций проводили при помощи ПЦР при следующих условиях. После нагревания в течение 30 секунд при 95°С реакционную смесь из 10 нг матричной плазмиды, 10 пмоль синтетических олиго-ДНК прямой цепи и обратной цепи и 10Х буфера, смеси dNTP и ДНК-полимеразы Pfu Turbo, обеспеченную этим набором, подвергали 18 циклам 95°С 30 сек, 55°С 1 мин и 68°С 4 мин. К этой реакционной смеси добавляли DpnI и проводили рестрикционное расщепление этим рестрикционным ферментом в течение 1 часа при 37°С. DH5α-компетентные клетки (Toyobo) трансформировали полученным реакционным раствором с получением трансформантов. Введение точковой мутации подтверждали определением нуклеотидной последовательности плазмидной ДНК, выделенной из этих трансформантов. Каждый ген точковой мутации клонировали в экспрессирующие векторы, способные экспрессировать этот ген-инсерт в клетках животных. Модифицированные гены получали модификациями, описанными ниже.

Транзиторную экспрессию гуманизированного антитела H0L0 и его модифицированных точковой мутацией антител проводили с использованием полиэтиленимина (Polysciences Inc.). Клетки HEK293 отделяли смесью трипсин-ЭДТА Invitrogen и высевали в культуральную чашку 10 см² при 6×10⁶ клеток/10 мл. На следующий день, культуральную среду SFMII и полиэтиленимин смешивали с экспрессирующей тяжелую цепь плазмидной ДНК и экспрессирующей легкую цепь плазмидной ДНК в соответствии с инструкциями изготовителя и полученную смесь оставляли стоять в течение 10 минут при комнатной температуре. Всю смесь добавляли по каплям в культуральную чашку, содержащую клетки HEK293, посеянные, как описано выше. Культуральный супернатант извлекали спустя приблизительно 72 часа и экспрессированное гуманизированное антитело и его модифицированные точковой мутацией антитела очищали с использованием rProteinA-Sepharose ™ Fast Flow (GE Healthcare) в соответствии с инструкциями изготовителя.

(1-1) Модификация величины Tm гуманизированного антитела H0L0

Температуру средней точки (Tm) термической денатурации определяли по верхней точке пика денатурации в термограмме (Ср против Т), полученной после нагревания раствора тест-пробы при константной программируемой скорости нагревания. Величину Tm гуманизированного антитела H0L0 измеряли с использованием раствора пробы для измерения дифференциальной сканирующей калориметрией (DSC), как описано далее. Этот раствор антитела (соответствующий 50-100 мкг), залитый в диализную мембрану, сначала диализовали в течение 24 часов против наружного диализного раствора 20 моль/л раствора натрий-ацетатного буфера (рН 6,0), содержащего 150 ммоль/л хлорида натрия. Затем этот раствор пробы доводили до концентрации антитела 50-100 мкг/мл наружным диализным раствором и использовали в качестве раствора пробы для DSC-измерения.

Для этого эксперимента использовали подходящий DSC-прибор, например, DSC-II (Calorimetry Sciences Corporation). Раствор пробы, приготовленный, как описано выше, и ссылочный раствор (наружный диализный раствор) тщательно дегазировали и каждую из этих тест-проб помещали в ячейку калориметра и термически уравновешивали при 40°С. Затем DSC-сканирование проводили от 40°С до 100°С при скорости сканирования приблизительно 1 К/мин. Результаты этого измерения приведены в виде верхней точки пика денатурации как функция температуры. Температуру средней точки термической денатурации гуманизированного антитела рассчитывали по присваиванию пиков домена Fab согласно Rodolfo et al., Immunology Letters (1999), 47-52.

Гуманизированное антитело H0L0, содержащее тяжелую цепь, показанную в SEQ ID NO:3, и легкую цепь, показанную в SEQ ID NO:4, имеет величину Tm 76,6°С, как рассчитано по способу, описанному выше. Величины Tm Синагиса и Герцептина, обеспечиваемых в качестве примеров существующих антител, измеряли при 85,4°С и 81,8°С соответственно. Таким образом, было показано, что величина Tm гуманизированного антитела H0L0 является более низкой, чем величина Tm существующих антител.

Таким образом, модифицированные антитела получали из гуманизированного антитела H0L0 с целью повышения величины Tm. Модификации V37I, A40P, M48I и L51I вводили в SEQ ID NO:3 для получения антитела Н15 (SEQ ID NO:34), где его подкласс изменялся из VH1b в VH4. Величина Tm улучшалась до 79,1°С. Легкую цепь гуманизированного антитела H0L0, показанную в SEQ ID NO:4, также модифицировали введением модификаций L42Q, S48A и Q50R в FR2, что изменяло этот подкласс из VK2 в VK3, и введением модификации V2I для замены V2 FR1 I (последовательность зародышевой линии), посредством чего получали L4 (SEQ ID NO: 35). Величину Tm каждого антитела измеряли, как описано выше. Величина Tm H15L0 и H0L4 была равна 79,2°С и 77,2°С соответственно, что показывает улучшение относительно величины Tm 76,6°С H0L0. Величина Tm антитела H15l4, содержащего эти две модификации, улучшалась до 80,5°С.

(1-2) Модификация величины pI гуманизированного антитела H0L0

Время полжизни антитела в плазме продлевается снижением величины pI, проявляемой этим антителом. Таким образом, получали гуманизированное антитело H0L0 с пониженной pI и оценивали, обеспечивает ли эта модификация более высокую подавляющую опухоль активность.

Величину pI каждого антитела рассчитывали на основе анализа изоэлектрического электрофореза. Электрофорез проводили, как описано далее. С использованием PhastSystem Cassette (Amersham Bioscience), Phast-Gel Dry IEF (Amerhham Bioscience) гелю давали набухать в течение приблизительно 60 минут с раствором для набухания, имеющим приведенный ниже состав:

(a) Состав раствора для набухания для высокой pI:

1,5 мл 10% глицерина

100 мкл Фармалита 8-10,5 для IEF (изоэлектрического фокусирования) (Amersham Bioscience)

(b) Состав раствора для набухания для низкой pI:

1,5 мкл очищенной воды

20 мкл Фармалита 8-19,5 для IEF (изоэлектрического фокусирования) (Amersham Biosciences)

80 мкл Фармалита 5-8 для IEF (изоэлектрического фокусирования) (Amersham Bioscience)

Приблизительно 0,5 мкг антитела наносили на разбухший гель и изоэлектрический электрофорез проводили с использованием PhastSystem (Amersham Bioscience), контролируемой программой, описанной ниже. На гель добавляли пробу на стадии 2 этой программы. Для pI-маркеров использовали калибровочный набор (Amersham Bioscience).

Стадия 1: 2000 В, 2,5 мА, 3,5 Вт, 15°С 75 Вт·ч

Стадия 2: 200 В, 2,5 мА, 3,5 Вт, 15°С, 15 Вт·ч

Стадия 3: 2000 В, 2,5 мА, 3,5 Вт, 15°С 410 Вт·ч

После электрофореза гель фиксировали 20% ТХУ и затем проводили окрашивание серебром с использованием Набора для окрашивания серебром, Protein (Amersham Bioscience) в соответствии с инструкциями изготовителя, обеспечиваемыми с этим набором. После окрашивания, изоэлектрическую точку каждого антитела (каждой тест-пробы) рассчитывали на основе уже известных изоэлектрических точек pI-маркеров.

Получали Hspd1.8 (Hd1.8) (SEQ ID NO:27), в котором были дополнительно осуществлены модификации K19T, Q43E, K63S, K65Q и G66D в H15.Lspd1.6 (Ld1.6) (SEQ ID NO:29) обеспечением следующих модификаций: модификации Q27E в L4; модификации KISRVE в 79-84 FR3 в L4 в TISSLQ; и модификации S25A. Величину pI антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6), состоящего из Hspd1.8 (Hd1.8) и Lspd1.6 (Ld1.6), измеряли при 7,4. Поскольку pI равна 8,9, pI гуманизированного H0L0 человека Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) уменьшалась на 1,5.

(2) Оценивание при помощи конкурентного ELISA связывающей активности модифицированных точковыми мутациями антител из гуманизированного антитела H0L0

Гуманизированное антитело H0L0 и его модифицированные точковыми мутациями антитела, очищенные в (1), оценивали конкурентным ELISA. 100 мкл растворимого корового полипептида GPC3 (SEQ ID NO:36) при 1 мкг/мл добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета. Этот растворимый коровый полипептид GPC3 иммобилизовали на этом планшете, давая этому планшету стоять в течение ночи при 4°С. Этот растворимый коровый полипептид GPC3, иммобилизованный на планшете, промывали 3 раза промывочным буфером с использованием Scan WASHER400 (Molecular Devices) и блокировали 200 мкл блокирующего буфера при 4^оС в течение по меньшей мере 30 минут. Затем этот блокированный планшет промывали 3 раза промывочным буфером с использованием Scan WASHER400. Затем каждая лунка этого планшета получала 200 мкл смеси, содержащей 100 мкл биотинилированного гуманизированного антитела H0L0 (конечная концентрация = 0,3 мкг/мл) и 100 мкл гуманизированного антитела H0L0 или его модифицированного точковой мутацией антитела (в различных концентрациях)). Гуманизированное антитело H0L0 биотинилировали с использованием набора для мечения биотином (Roche) в соответствии с инструкциями, обеспечиваемыми с этим набором. Планшет оставляли стоять в течение 1 часа при комнатной температуре, затем промывали 5 раз промывочным буфером с использованием Scan WASHER400 (Molecular Devices). 100 мкл козьего антитела против щелочной фосфатазы стрептавидина (ZYMED), разведенные в 20000 раз субстратным буфером, добавляли в каждую лунку и полученный планшет оставляли стоять в течение 1 часа при комнатной температуре и затем промывали 5 раз промывочным буфером с использованием Scan WASHER400. Субстрат фосфатазы (Sigma) готовили при 1 мг/мл в субстратном буфере, добавляли при 100 мкг на лунку и выдерживали в течение 1 часа. Оптическую плотность при 405 нм реакционного раствора в каждой лунке измеряли с использованием Benchmark Plus (BIO-RAD), с оптической плотностью контроля 625 нм.

Было показано, что антигенсвязывающая активность антител H15L4 и Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) является приблизительно такой же, что и антигенсвязывающая активность гуманизированного антитела, подвергнутого модификации.

Ссылочный пример 4

(1) Отбор сайтов модификации для уменьшения pI для получения pI-модифицированного антитела точковой мутацией

Для улучшения подавляющей опухоль активности антитела Hd1.8Ld1.6 отбирали сайты модификации на способность уменьшения величины pI вариабельного района. Обнаружили аминокислотные остатки, участвующие в уменьшении величины pI вариабельного района. Конкретным примером этих модификаций для уменьшения величины pI, является антитело pH7pL16, которое получали следующим образом.

Эти сайты модификации создавали при помощи Assemble PCR. Синтезировали олиго-ДНК на основе смысловой и антисмысловой последовательностей, содержащих этот сайт модификации. Пару антисмысловой олиго-ДНК, содержащей сайт модификации, и смысловой олиго-ДНК, соответствующей вектору, несущему подлежащий модификации ген, или пару смысловой олиго-ДНК, содержащей сайт модификации, и антисмысловой олиго-ДНК, соответствующей вектору, несущему подлежащий модификации ген, использовали в ПЦР с PrimeSTAR (TAKARA) с получением фрагментов 5'-стороны и 3'-стороны, содержащих этот сайт модификации. Эти два фрагмента связывали с использованием Assemble PCR с получением каждого мутанта.

Полученный таким образом мутант инсертировали в экспрессирующий вектор, который позволяет экспрессировать этот инсертированный ген в клетках животных. Нуклеотидную последовательность этого экспрессирующего вектора определяли способом, известным в данной области. Введение точковой мутации подтверждали нуклеотидной последовательностью плазмидной ДНК. Ген, содержащий эту точковую мутацию, клонировали в экспрессирующий вектор, который позволяет экспрессировать этот инсертированный ген в клетках животных. Экспрессию и очистку этого антитела выполняли в соответствии со способом, описанным в примере 1, или сходным способом.

Начиная от Hspd1.8 (Hd1.8), 61-й глутамин (Q) (согласно нумерации Кабата), присутствующий в CDR2 Hspd1.8 (Hd1.8), заменяли глутаминовой кислотой (Е) с получением рН7 (SEQ ID NO:31). Начиная от Ld1.6, 24-й аргинин (R) (в соответствии с нумерацией Кабата), присутствующий в CDR1 Ld1.6, заменяли глутамином (Q), 37-й глутамин (Q) заменяли лейцином (L), 43-й аланин (А) заменяли серином (S), 45-й аргинин (R) заменяли глутамином (Q), 74-й треонин (Т) заменяли лизином (К), 77-й серин (S) заменяли аргинином (R), 78-й лейцин (L) заменяли валином (V) и 79-й глутамин (Q) заменяли глутаминовой кислотой (Е), каждый из которых присутствует в FR2 и FR3, с получением pL14. Затем, начиная от PL14, 104-й лейцин (L) (в соответствии с нумерацией Кабата) заменяли валином (V), 107-й лизин (К) заменяли глутаминовой кислотой (Е), каждый из которых присутствует в FR4 pL14, с получением pL16 (SEQ ID NO:33).

(2) Измерение величины pI pI-модифицированных антител с точковыми мутациями

Величины pI антитела Hd1.8Ld1.6 и антитела pH7hL16 измеряли электрофорезом с PhastGel ITF 4-6,5 (GE Heakthcase) с использованием способа, описанного в Ссылочном примере 3, или сходным способом. Величины pI антитела Hd1.8Ld1.6 и антитела pH7hL16 были 7,47 и 6,52 соответственно, показывая, что величина pI антитела pH7hL16 была более низкой, чем величина pI антитела Hd1.8Ld1.6, на 0,95.

(3) Измерение величины Tm pI-модифицированных антител с точковыми мутациями

Величины Tm Fab, полученных из антитела Hd1.8Ld1.6 и антитела pH7hL16, измеряли с использованием VC-DSC (Micro Cal) при помощи способа, сходного со Ссылочным примером 3. В этом эксперименте, в качестве диализного раствора использовали PBS и концентрацию антител в тест-растворе для DSC-измерения доводили до 25-100 мкг/мл. DSC-сканирование устанавливали от 20°С до 115°С при скорости сканирования приблизительно 4 К/мин, со ссылочным раствором (диализным раствором) и тест-раствором для DSC-измерения. Температура средней точки термической денатурации Fab антитела Hd1.8Ld1.6 и антитела pH7hL16 была 77,5 и 74,7°С соответственно.

(4) Оценивание связывающей активности с антигеном pI-модифицированных антител с точковыми мутациями при помощи конкурентного ELISA

Связывающую активность с антигеном глипиканом 3 каждого pI-модифицированного антитела с точковыми мутациями измеряли с использованием способа, описанного в Ссылочном примере 3. Было показано, что связывающая активность с глипиканом 3 антитела pH7hL16 является сравнимой со связывающей активностью гуманизированного антитела H0L0.

ПРИМЕР 5

(1) Испытание комбинированной терапии гуманизированного анти-глипикан 3-антитела и химиотерапевтического агента (Сорафениба) на мышиной модели, имплантированной клеточной линией рака печени человека, экспрессирующей глипикан 3

Шестинедельных самцов мышей СВ-17 SCID покупали из CLEA Japan, Inc. Непосредственно перед имплантацией опухоли мышам вводили внутрибрюшинно 200 мкг анти-асиало-GM-антитело (WAKO), затем имплантировали подкожно 5×10⁵ клеток HepG2, диспергированных в 50% Матригеле (Becton Dickinson). При достижении объема опухоли 250 мм³, этих мышей делили на группы и начинали введение. Антитело pH7hL16, приготовленное в PBS(-), в подходящей концентации вводили внутривенно один раз в неделю в течение 3 недель. Сорафениб синтезировали в соответствии с Organic Research & Development (2002) 6, 777-781. Сорафениб суспендировали в чистой воде, содержащей 10% этанол и 10% Кремофор EL, и вводили перорально 5 раз в неделю в течение 3 недель. В качестве контроля-носителя служила чистая вода, содержащая PBS(-), 10% этанол и 10% Кремофор EL. Объем опухоли V (мм³) рассчитывали с использованием формулы, описанной в примере 1.

(2) Результаты испытания комбинированной терапии гуманизированного анти-глипикан 3-антитела и химиотерапевтического агента (Сорафениба) на мышиной модели, имплантированной клеточной линией рака печени человека, экспрессирующей глипикан 3

Фиг.5 является графиком, показывающим противоопухолевый эффект комбинации антитела pH7hL16 и Сорафениба на мышиной модели, имплантированной клеточной линией HepG2 рака печени человека. Эти данные выражены изменением объема опухоли (среднее ± SD). Белые кружки указывают группу носителя; сплошные кружки указывают только антитело pH7hL16 при 1 мг/кг; белые квадраты указывают только Сорафениб при 80 мг/кг; и сплошные квадраты указывают комбинацию антитела pH7hL16 при 1 мг/кг и Сорафениба при 80 мг/кг. Звездочки указывают P<0,05 на основе критерия Дуннета.

Фиг.6 является графиком, показывающим противоопухолевый эффект комбинации антитела pH7hL16 и Сорафениба на потере массы в мышиной модели, имплантированной клеточной линией HepG2 рака печени человека. Эти данные выражены временным ходом массы тела этих мышей (среднее ± SD). Белые кружки указывают группу носителя; сплошные кружки указывают только антитело pH7hL16 при 1 мг/кг; белые квадраты указывают только Сорафениб при 80 мг/кг; и сплошные квадраты указывают комбинацию антитела pH7hL16 при 1 мг/кг и Сорафениба при 80 мг/кг. Звездочки указывают P<0,05 на основе критерия Дуннета.

Подавляющий рост опухоли эффект выражали в виде объема опухоли в конце этого испытания (день 47). В модели ксенотрансплантата HepG2, подавляющий рост опухоли эффект в группе, получавшей комбинацию антитела pH7hL16 (1 мг/кг) и Сорафениба (максимальную переносимую дозу при 80 мг/кг), был значимо более высоким, чем подавляющий эффект в группе, получавшей только это антитело или только Сорафениб (фиг.5). Обычно в этой модели наблюдали потерю массы, ассоциированную с ростом опухоли, и эта потеря массы усиливалась введением одного Сорафениба. При введении комбинации Сорафениба и антитела pH7hL16 эта потеря массы значимо ослаблялась (фиг.6), наряду с услилением эффективности в сравнении с одним Сорафенибом.

ПРИМЕР 6

(1) Испытание комбинированной терапии гуманизированного анти-глипикан 3-антитела и химиотерапевтического агента (Сунитиниба) на мышиной модели, имплантированной клеточной линией рака печени человека, экспрессирующей глипикан 3

Шестинедельных самцов мышей СВ-17 SCID покупали из CLEA Japan, Inc. Непосредственно перед имплантацией опухоли, мышам вводили внутрибрюшинно 200 мкг анти-асиало-GM-антитело (WAKO), затем имплантировали подкожно 5×10⁵ клеток HepG2, диспергированных в 50% Матригеле (Becton Dickinson). При достижении объема опухоли 250 мм³, этих мышей делили на группы и начинали введение.

Гуманизированное анти-глипикан 3-антитело (hGC33, WO 2006/006693), приготовленное в PBS(-), в подходящей концентрации вводили внутривенно один раз в неделю в течение 3 недель. Сунитиниб (покупаемый из Sequoia Research Products; cat. # SRP01785S) суспендировали в чистой воде, содержащей 10% этанол и 10% Кремофор EL, и вводили перорально 5 раз в неделю в течение 3 недель. В качестве контроля-носителя служила чистая вода, содержащая PBS(-), 10% этанол и 10% Кремофор EL. Объем опухоли V (мм³) рассчитывали с использованием формулы, описанной в примере 1.

(2) Результаты испытания комбинированной терапии гуманизированного анти-глипикан 3-антитела и химиотерапевтического агента (Сунитиниба) на мышиной модели, имплантированной клеточной линией рака печени человека, экспрессирующей глипикан 3

Фиг.7 является графиком, показывающим противоопухолевый эффект комбинации антитела hGC33 и Сунитиниба на мышиной модели, имплантированной клеточной линией HepG2 рака печени человека. Эти данные выражены изменением объема опухоли (среднее ± SD). Белые кружки указывают группу носителя; сплошные кружки указывают только антитело HepG2 при 1 мг/кг; белые квадраты указывают только Сунитиниб при 80 мг/кг; и сплошные квадраты указывают комбинацию антитела hGC33 1 мг/кг и Сунитиниба при 80 мг/кг. Звездочки указывают P<0,05 на основе критерия Дуннета.

Подавляющий рост опухоли эффект выражали в виде объема опухоли в конце этого испытания (день 53). В модели ксенотрансплантата HepG2, подавляющий рост опухоли эффект в группе, получавшей комбинацию антитела hGC33 (1 мг/кг) и Сорафениба (максимальную переносимую дозу при 80 мг/кг), был значимо более высоким, чем подавляющий эффект в группе, получавшей только это антитело или только Сорафениб (фиг.7).

Claims

1. Фармацевтическая композиция для усиления эффективности лечения рака печени посредством Сорафениба, причем указанная композиция содержит анти-глипикан 3-антитело в качестве активного ингредиента.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанное анти-глипикан 3-антитело вводят одновременно с Сорафенибом.

3. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанное анти-глипикан 3-антитело вводят до или после Сорафениба.

4. Фармацевтическая композиция по п.1, где анти-глипикан 3-антитело обладает цитотоксичностью.

5. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанное анти-глипикан 3-антитело содержит:
вариабельный район H-цепи, содержащий CDR 1, 2 и 3 из:
CDR1, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:5,
CDR2, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:6, и
CDR3, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:7; и
вариабельный район L-цепи, содержащий CDR 1, 2 и 3 из:
CDR1, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:8,
CDR2, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:24, и
CDR3, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:25.

6. Фармацевтическая композиция по п.1, где это анти-глипикан 3-антитело способно связываться с эпитопом, с которым может связываться второе антитело, где указанное второе антитело содержит:
вариабельный район H-цепи, содержащий CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:5, 6 и 7 соответственно, и
вариабельный район L-цепи, содержащий CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:8, 24 и 25 соответственно.

7. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанное анти-глипикан 3-антитело содержит:
вариабельный район H-цепи, содержащий CDR 1, 2 и 3 из:
CDR1, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:5,
CDR2, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:6, и
CDR3, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:7; и
вариабельный район L-цепи, содержащий CDR 1, 2 и 3 из:
CDR1, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в любой из SEQ ID NO:9-23,
CDR2, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:24, и
CDR3, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:25.

8. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанное анти-глипикан 3-антитело содержит:
вариабельный район H-цепи, содержащий CDR 1, 2 и 3 из:
CDR1, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:5,
CDR2, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:26, и
CDR3, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:7; и
вариабельный район L-цепи, содержащий CDR 1, 2 и 3 из:
CDR1, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:28,
CDR2, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:24, и
CDR3, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:25.

9. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанное анти-глипикан 3-антитело содержит:
вариабельный район H-цепи, содержащий CDR 1, 2 и 3 из:
CDR1, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:5,
CDR2, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:30, и
CDR3, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:7; и
вариабельный район L-цепи, содержащий CDR 1, 2 и 3 из:
CDR1, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:32,
CDR2, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:24, и
CDR3, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:25.

10. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанное анти-глипикан 3-антитело является гуманизированным антителом.

11. Фармацевтическая композиция по п.10, где указанное анти-глипикан 3-антитело содержит:
вариабельный район H-цепи, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:3; и
вариабельный район L-цепи, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:4.

12. Фармацевтическая композиция по п.10, где указанное анти-глипикан 3-антитело содержит:
вариабельный район H-цепи, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:3; и
вариабельный район L-цепи, содержащий аминокислотную последовательность, в которой 34-й Gly SEQ ID NO:4 заменен другим аминокислотным остатком.

13. Фармацевтическая композиция по п.10, где указанное анти-глипикан 3-антитело содержит:
вариабельный район H-цепи, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:27; и
вариабельный район L-цепи, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:29.

14. Фармацевтическая композиция по п.10, где указанное анти-глипикан 3-антитело содержит:
вариабельный район H-цепи, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:31; и
вариабельный район L-цепи, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:33.