RU2458122C2 - Растительная стволовая клеточная линия, полученная из покоящегося центра, и способ ее выделения - Google Patents
Растительная стволовая клеточная линия, полученная из покоящегося центра, и способ ее выделения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2458122C2 RU2458122C2 RU2010115794/10A RU2010115794A RU2458122C2 RU 2458122 C2 RU2458122 C2 RU 2458122C2 RU 2010115794/10 A RU2010115794/10 A RU 2010115794/10A RU 2010115794 A RU2010115794 A RU 2010115794A RU 2458122 C2 RU2458122 C2 RU 2458122C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cell line
- root
- plant
- resting center
- cell
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 36
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 claims abstract description 20
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 claims description 142
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 92
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 18
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 11
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 11
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 9
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 9
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 7
- 241000234282 Allium Species 0.000 claims description 4
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 claims description 4
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 claims description 4
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 claims description 4
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 claims description 4
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 claims description 4
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 4
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 209
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 81
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 29
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 12
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 11
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 10
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- SODPIMGUZLOIPE-UHFFFAOYSA-N (4-chlorophenoxy)acetic acid Chemical compound OC(=O)COC1=CC=C(Cl)C=C1 SODPIMGUZLOIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000005971 1-naphthylacetic acid Substances 0.000 description 7
- IIDAJRNSZSFFCB-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-methoxy-2-methylbenzenesulfonamide Chemical compound COC1=CC(S(N)(=O)=O)=C(C)C=C1N IIDAJRNSZSFFCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 238000000879 optical micrograph Methods 0.000 description 7
- 239000005595 Picloram Substances 0.000 description 6
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 6
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 6
- NQQVFXUMIDALNH-UHFFFAOYSA-N picloram Chemical compound NC1=C(Cl)C(Cl)=NC(C(O)=O)=C1Cl NQQVFXUMIDALNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 5
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 5
- JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N indole-3-butyric acid Chemical compound C1=CC=C2C(CCCC(=O)O)=CNC2=C1 JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 5
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 4
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 239000001707 (E,7R,11R)-3,7,11,15-tetramethylhexadec-2-en-1-ol Substances 0.000 description 2
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BLUHKGOSFDHHGX-UHFFFAOYSA-N Phytol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C=CO BLUHKGOSFDHHGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HNZBNQYXWOLKBA-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofarnesol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)=CCO HNZBNQYXWOLKBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- BOTWFXYSPFMFNR-OALUTQOASA-N all-rac-phytol Natural products CC(C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)=CCO BOTWFXYSPFMFNR-OALUTQOASA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- -1 flavorings Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 2
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- BOTWFXYSPFMFNR-PYDDKJGSSA-N phytol Chemical compound CC(C)CCC[C@@H](C)CCC[C@@H](C)CCC\C(C)=C\CO BOTWFXYSPFMFNR-PYDDKJGSSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound C1CN(CC2=NNN=C21)CC(=O)N3CCN(CC3)C4=CN=C(N=C4)NCC5=CC(=CC=C5)OC(F)(F)F LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RHPUJHQBPORFGV-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-2-methylphenol Chemical compound CC1=CC(Cl)=CC=C1O RHPUJHQBPORFGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 230000002338 cryopreservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 235000021073 macronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000021749 root development Effects 0.000 description 1
- 230000002786 root growth Effects 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 235000001508 sulfur Nutrition 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/04—Plant cells or tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к биохимии. Культивируют содержащие покоящийся центр ткани корня растения в среде, содержащей 2,4-D. Отбирают белую недифференцированную ткань из культивируемой ткани, где ткань представляет собой клеточную линию. Указанная клеточная линия характеризуется следующим: в суспензионной культуре находится в одноклеточном состоянии, морфологически ее ядра больше, чем в клеточных линиях корня того же растения, окружена слизистыми веществами, растет стабильно и дольше по сравнению с клеточными линиями корня того же растения, демонстрирует высокую жизнеспособность при криоконсервации. Изобретение позволяет получать генетически стабильные клеточные линии для получения полезных веществ с помощью культур растительных клеток. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 11 ил., 1 табл., 3 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к клеточной линии, полученной из покоящегося центра растения, и к способу ее выделения, а более конкретно настоящее изобретение относится к гомогенной клеточной линии клонального происхождения, полученной из покоящегося центра, получение которой из покоящегося центра растения проведено без отдельного процесса дедифференцировки, и к способу выделения этой линии.
Уровень техники
Ранее растения использовались в качестве пищевых ресурсов, но в настоящее время их значимость повысилась за счет использования в качестве источника широкого спектра химических веществ, включая действующие вещества лекарственных препаратов, ароматизирующие вещества, пигменты, сельскохозяйственные химикаты и краски. В особенности из-за того, что наиболее полезные субстанции, получаемые из растений, обладают физиологической активностью, такой как антивирусная, антибактериальная, противоопухолевая и антиоксидантная активности, а растения рассматриваются как идеальные источники ресурсов, которые могут быть превращены в новые лекарственные препараты, и для выяснения отношений между химическими структурами и активностями ведутся активные исследования многих веществ растительного происхождения.
Однако физиологически активные вещества сложны для преобразования в лекарственные препараты, и основными причинами этого является следующее. Во-первых, содержание физиологически активных веществ в растениях весьма ограничено. Во-вторых, скорость роста растений очень низкая. В-третьих, физиологически активные вещества, получаемые из растений, присутствуют только в специфических органах растений в небольших количествах. В-четвертых, имеют место проблемы взаимодействия с окружающей средой, связанные с разрушением природы. В-пятых, физиологически активные вещества, получаемые из растений, обладают очень сложной химической структурой, требующей многостадийных процессов полимеризации, что приводит к экономическим проблемам, связанным с высокими издержками производства. По этим причинам очень тяжело удовлетворять потребности в получаемых из растений физиологически активных веществах в коммерческих целях.
При этом один из биоинженерных подходов, а именно способ культивирования растительных клеток, в течение длительного периода времени рассматривался как наиболее идеальный, способный удовлетворить потребности в полезных веществах растительного происхождения, не вызывая проблем с окружающей средой. В соответствии с Korean Patent Publication 1995-0000870 производство полезных веществ культурой растительных клеток дает множество преимуществ по сравнению с методами экстракции полезных веществ непосредственно из растений. В частности, способ культивирования растительных клеток рассматривается в качестве оптимального способа, позволяющего осуществлять непрерывное производство без влияния внешней среды и позволяющего, в отличие от предшествовавших экстракционных способов, обойти нерешаемые проблемы, такие как разрушение экосистем. Однако несмотря на большой интерес и усилия, предпринимаемые в культивировании растительных клеток, на данный момент существует мало примеров успешной индустриализации культуры растительных клеток. Это происходит потому, что по-прежнему серьезными проблемами являются варьирование роста клеток и производительности в ряде растительных клеточных культур.
В растительных экспрессирующих системах используются растительные клетки, а ткани, такие как, например, листья, стебли и семена, которые дифференцируются из растительных клеток, являются постоянными тканями, и клетки в них больше не делятся. По этой причине, для преобразования тканей в клеточную линию, обладающую способностью к делению, всегда заранее осуществляется процесс дедифференцировки. При культивировании растительной ткани или органа процесс дедифференцировки означает дедифференцировку ткани или клетки, которые уже были дифференцированы для выполнения специфических функций. Однако в процессе дедифференцировки в линии клеток могут происходить серьезные изменения из-за сомаклональной изменчивости.
Таким образом, получение полезных веществ с помощью растительной клеточной культуры может быть индустриализовано, только если в течение продолжительного периода времени стабильно поддерживаются быстрый клеточный рост и высокая метаболическая продуктивность. Однако большинство клеток при субкультивировании подвергаются изменениям. Таким образом, крайне необходимо преодолеть проблему изменчивости в клетках и разработать способ для получения генетически стабильной клеточной линии для получения полезных веществ с помощью культур растительных клеток.
Площадь поверхности корня достаточно большая, т.к. растения должны поглощать необходимые для их роста значительные количества воды и минеральных веществ. На концах корней находятся клетки апикальной меристемы корня, которые делятся, растут, удлиняются и дифференцируют, формируя ткань первичного корня. Апикальная меристема корня закрыта защитным корневым чехликом, а клетки в центре апикальной меристемы корня называются покоящимся центром, т.к. они очень медленно делятся. Покоящийся центр покрыт клетками-предшественниками, которые образуют первичную меристему.
Впрочем, исследований физиологических характеристик апикальной меристемы корня проводится явно недостаточно, даже несмотря на то, что эти характеристики чрезвычайно важны для работы корневой системы растений. Специально проводились исследования, в которых растения, такие как кукуруза, использовались для изучения физиологических характеристик покоящегося центра или апикальных меристем корня, и культивировались в среде для развития корней, однако при этом не было проведено ни одного исследования, в котором, для создания клеточной линии, помимо различных тканей корневой системы, таких как корневой чехлик, сосудистая ткань, перицикл, эндодермис, первичная кора и эпидермис, был использован только покоящийся центр.
Таким образом, покоящийся центр является генетически наиболее стабильной тканью и его выделение сделает возможным изучение развития растений и их генетического происхождения. Соответственно, было необходимо разработать способ выделения гомогенной клеточной линии из покоящегося центра. В последние годы во вновь появившейся области биологии стволовых клеток было проведено множество экспериментов, связанных со стволовыми клетками, включая исследования сигналов, вовлеченных в процессы развития. Однако в случае животных способы выделения и культивирования стволовых клеток были созданы давно, а в случае растений исследования по выделению стволовых клеток не проводятся, либо их проводится очень мало. Таким образом, можно считать, что индукция и выделение полученных из покоящегося центра клеточных линий будет способствовать развитию биологии стволовых клеток.
Соответственно, авторы настоящего изобретения приложили максимум усилий для разработки способа выделения из покоящегося центра клеточной линии клонального происхождения и для получения растительных клеток, которые могут быть использованы в растительных экспрессирующих системах без необходимости проведения процесса дедифференцировки. В результате, настоящие изобретатели выделили клеточную линию из покоящегося центра и обнаружили, что выделенная клеточная линия не подвергается или подвергается минимальным изменениям в течение длительного культивирования, может быть стабильно культивируемой, а также демонстрирует высокую жизнеспособность клеток в процессе криоконсервации, завершив тем самым настоящее изобретение.
Сущность изобретения
Задача настоящего изобретения заключается в предоставлении полученной из покоящегося центра клеточной линии, которую можно стабильно культивировать.
Другая задача настоящего изобретения заключается в предоставлении способа выделения получаемой из покоящегося центра клеточной линии без проведения процесса дедифференцировки.
Для достижения поставленных выше задач, в одном аспекте, настоящее изобретение предоставляет способ выделения получаемой из покоящегося центра клеточной линии, при этом способ содержит: культивирование содержащей покоящийся центр ткани корня растения, и последующий отбор из культивируемой ткани недифференцированной, белой ткани.
В другом аспекте, настоящее изобретение предоставляет полученную из покоящегося центра клеточную линию, которая выделена из покоящегося центра растения и обладает следующими характеристиками:
(а) клеточная линия в суспензионной культуре находится в одноклеточном состоянии;
(б) для нее показано, что морфологически ее ядра больше, чем в клеточных линиях, полученных из тканей, отличных от покоящегося центра;
(в) клеточная линия окружена слизистыми веществами.
(г) при длительной культивации она стабильно поддерживается без морфологических изменений; и
(д) клеточная линия демонстрирует высокую жизнеспособность при криоконсервации.
В еще одном аспекте, настоящее изобретение предоставляет способ сохранения растительной клеточной линии, который содержит этап замораживания упомянутой клеточной линии, полученной из покоящегося центра корня растения.
Другие особенности и аспекты настоящего изобретения будут видны из следующего детального описания и из приложенной формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
На фиг.1А представлена оптическая микрофотография клеточной линии, индуцированной культивированием содержащей покоящийся центр ткани корня риса, и находящейся в состоянии перед выделением из нее покоящегося центра, а на фиг.1В представлена фотография выделенной из ткани клеточной линии покоящегося центра, которую культивировали в течение 4 недель.
На фиг.2 представлено оптическое микроизображение тканей, полученных культивированием содержащей покоящийся центр ткани корня риса, в средах, содержащих 2,4-D(A), CPA(B), IAA(C), IBA(D), NAA(E) и picloram(F).
На фиг.3 представлены оптические микрофотографии, демонстрирующие морфологические наблюдения клеточной линии, полученной из отличных от покоящегося центра тканей корня, (фиг.3(a)) и клеточной линии, полученной из покоящегося центра (фиг, 3(b)).
На фиг.4 представлены оптические микрофотографии тканей, полученных культивированием содержащей покоящийся центр ткани корня риса, в средах, содержащих 2,4-D(A), CPA(B), IAA(C), IBA(D), NAA(E) и picloram(F).
На фиг.5 показаны морфологические изменения, произошедшие в клеточных линиях, полученных из тканей корня, отличных от покоящегося центра, за соответствующий период культивирования.
На фиг.6 показана морфологическая стабильность клеточной линии, полученной из покоящегося центра в соответствии за соответствующий период культивирования.
На фиг.7а представлена оптическая микрофотография (увеличение 400x) клеточной линии, полученной из покоящегося центра, а на 7B представлена оптическая микрофотография (увеличение 400x) клеточной линии, полученной из тканей корня.
На фиг.8 для сравнения представлены оптические микрофотографии клеточной линии, полученной из отличных от покоящегося центра тканей корня (фиг.8(a)), и клеточной линии, полученной из покоящегося центра (фиг.8(b)).
На фиг.9 представлена графическая диаграмма, демонстрирующая скорости агрегации клеточной линии, полученной из отличных от покоящегося центра тканей корня, и клеточной линии, полученной из ткани покоящегося центра.
На фиг.10 для сравнения жизнеспособности после криоконсервации представлены оптические микрофотографии клеточной линии, полученной из отличных от покоящегося центра тканей корня, (фиг.8(a)) и клеточной линии, полученной из покоящегося центра (фиг.8(b)).
На фиг.11 представлена графическая диаграмма, демонстрирующая жизнеспособность после криоконсервации клеточной линии, полученной из отличных от покоящегося центра тканей корня и клеточной линии, полученной из ткани покоящегося центра.
Подробное описание изобретения и предпочтительных вариантов воплощения
Если иное не определено, все использованные здесь технические и научные термины имеют тот же смысл, который вкладывается в них обычным специалистом в данной области. Как правило, определения используемых здесь различных терминов хорошо известны и традиционно используются в данной области.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу выделения получаемой из покоящегося центра клеточной линии, при этом способ содержит: культивирование содержащей покоящийся центр ткани корня растения и последующий отбор из культивируемой ткани белой недифференцированной ткани.
Предпочтительно, если содержащую покоящийся центр ткань корня растения, используемого в настоящем изобретении, получают из проросших стерилизованных семян растения или из ткани корня, дифференцированной из каллюса, полученного из части растения. Также среда, используемая в процессе культивирования, может быть любой известной специалисту в данной области средой для индукции клеточной линии, но предпочтительное культивирование ткани осуществляется в любой из перечисленных сред: среда N6, среда MS, среда Gamborg B5, среда LS и среда KAOM. Более предпочтительно, если культивирование ткани проводится в среде, содержащей 2,4-D. Более того, в настоящем изобретении отбор полученной из покоящегося центра клеточной линии предпочтительно осуществляется по прошествии 3-6 недель с начала культивирования ткани.
Используемый здесь термин "покоящийся центр" относится к группе сферических или дискообразных одиночных клеток, содержащей 500-1000 неактивных клеток и расположенной в центре апикальной меристемы корня. Клетки этой клеточной группы, как известно, задерживаются в G1-фазе клеточного цикла в течение длительного периода и делятся с интервалом около 15-20 дней. Эти клетки обычно существуют в неактивном состоянии и делятся при ранении во время иссечения или после облучения. Как правило, когда корень растения проникает в почву, корневой чехлик эффективно защищает апикальную меристему, но т.к. защита не является совершенной, корневая апикальная меристема иногда повреждается во время роста корня. После этого клетки в покоящемся центре делятся и заново образуют апикальные меристемы и корневые чехлики. Также, после воздействия рентгеновскими лучами, обычные клетки прекращают делиться, а клетки покоящегося центра наоборот немедленно начинают делиться, образуя не подвергшиеся воздействию рентгеновских лучей делящиеся клетки. Другими словами, покоящийся центр является местом, в котором хранятся генетически стабильные клеточные клетки. Покоящийся центр дифференцируется в прокамбий, основную меристему и протодерму, которые являются основными меристемами корня.
Покоящийся центр может быть получен из корней растений. Предпочтительно, если он получен из корня ростка, проросшего из стерилизованных семян, или получен из ткани корня, дифференцировавшей из каллюса, полученного из части растения. Предпочтительно, если эксплантат, полученный путем удаления корневого чехлика с кончика корня и отбора участка толщиной около 1 мм от поверхности до среза, культивируется в среде для индукции клеточной линии. Перед культивированием ткани отобранную ткань корня растения можно подвергнуть стерилизации в соответствии с общими, известными специалистам в данной области, способами. Однако при использовании корня пророщенного из стерилизованных семян ростка отобранная ткань корня не может быть подвергнута отдельному процессу стерилизации. Среда для индукции клеточной линии может быть любой известной специалистам в данной области средой, включая, в качестве неограничивающих примеров, среду N6 (Chu C.C, Proc. Symp. Plant Tissue Cult., Peking, 43, 1978), среду MS (Murashige T. and Skoog F., Physiol. Plant, 15:473, 1962), среду Gamborg B5 (Gamborg O.L. et al., Exp. Cell Res., 50:151, 1968), среду LS (Linsmaier E.M. and Skoog F., Physiol. Plantarum., 18:100, 1965), среду KAOM (Kao K.N. and Michayluk M.R., Planta. (Berl.), 126:105, 1975).
Более предпочтительно, если ткань корня культивируется в среде, содержащей помимо ауксинов 2,4-D. При этом 2,4-D содержится в концентрации 2 мг/л, а более предпочтительно - 2-7 мг/л. Специфические культуральные условия для индукции клеточной линии, период культивирования и т.д., определяются в зависимости от вида и характеристик растительных клеток, и определение таких факторов очевидно для специалиста в данной области.
В культуральной среде наблюдались морфологические различия между клеточной линией, полученной из отличной от покоящегося центра ткани корня, и клеточной линией, полученной из покоящегося центра. Клеточная линия, полученная из отличных от покоящегося центра тканей корня, была гетерогенной и демонстрировала локальную дифференцировку, а клеточная линия, полученная из покоящегося центра, была гомогенной без локальной дифференцировки. Также, при визуальном наблюдении клеточная линия, полученная из отличных от покоящегося центра тканей корня, имела желтый цвет, а клеточная линия, полученная из покоящегося центра, была белой и была окружена слизистыми веществами. Т.е. клеточная линия, полученная из покоящегося центра, имела вид "белой недифференцированной ткани". Под слизистым веществом понимаются муцигены. Муцигены известны как сложные полисахариды, в том числе сахара, органические аминокислоты, витамины, ферменты и аминокислоты, которые секретируются клетками вокруг корневого чехлика и эпидермальными клетками корня.
Соответственно, на основе морфологических различий может быть выбрана только клеточная линия, полученная из покоящегося центра. На фиг.1А представлена фотография, демонстрирующая клеточную линию из покоящегося центра перед выделением. На фиг.1А в красном овале показана клеточная линия из покоящегося центра. На фиг.1В представлена фотография, демонстрирующая полученную из покоящегося центра клеточную линию, которую выделили и культивировали в течение 4 недель.
Отбор клеточной линии, полученной из покоящегося центра, предпочтительно проводится после культивирования в течение 3-6 недель, а более предпочтительно через 4-5 недель культивирования после инокуляции в среду. Через около 3-6 недель после инокуляции, полученная из покоящегося центра клеточная линия индуцируется, и таким образом выделение линии становится легким.
Т.к. покоящийся центр является тканью, которая есть у всех растений, то предложенный способ выделения клеточной линии из покоящегося центра может быть применен ко всем растениям, и, таким образом, клеточная линия покоящегося центра может быть получена из всех растений. Т.е., в одном примере настоящего изобретения клеточную линию изолировали из покоящегося центра ткани корня риса и кукурузы, но для специалиста в данной области будет очевидно, что способ настоящего изобретения может быть применен ко всем растениям, обладающим покоящимся центром. Примерами растений, из которых может быть получена клеточная линия из покоящегося центра, могут являться в качестве неограничивающих примеров рис, кукуруза, Pisum sativum, Avena sativa, Allium сера и Arabidopsis. Примерами растений, у которых были изучены физиологические характеристики покоящегося центра, могут являться кукуруза, Arabidopsis, Allium сера, Avena sativa, Pisum sativum и т.д. [Maize: Georgina Ponce et al., Plant Cell and Environment, 28:719, 2005; Keni Jiang et al., Development, 130:1429, 2003: Arabidopsis: Noriko Kamiya et al., The Plant Journal, 35:429, 2003; Peter Doerner, Current Biology, 8:R42, 1998; Allium сера: R.Liso, New Phytol., 110:469, 1998; Avena sativa: F.A.L. [fuzzy] Clowes, New Phytol., 129, 1982; Pisum sativum: Peter Doerner, Current Biology, 8:R42, 1998].
В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенной из покоящегося центра клеточной линии, полученной из покоящегося центра растения и обладающей следующими характеристиками:
(а) клеточная линия в суспензионной культуре находится в одноклеточном состоянии;
(б) для нее показано, что морфологически ее ядра больше, чем в клеточных линиях, полученных из тканей, отличных от покоящегося центра
(в) клеточная линия окружена слизистыми веществами.
(г) клеточная линия стабильно поддерживается без морфологических изменений в процессе длительного культивирования; и
(д) клеточная линия демонстрирует высокую жизнеспособность при криоконсервации.
Клеточная линия, выделенная из покоящегося центра по настоящему изобретению, демонстрирует в качестве морфологической характеристики относительно крупных ядер. Было отмечено, что размер ядра был равен около 2-4 мкм и был больше, чем ядро в других клеточных линиях, полученных из отличных от покоящегося центра тканей.
Клеточная линия, выделенная из покоящегося центра по настоящему изобретению, также демонстрирует очень стабильный клеточный рост без каких-либо морфологических изменений, даже при длительном культивировании. В другом Примере настоящего изобретения было отмечено, что клеточная линия, полученная из покоящегося центра, стабильно культивировалась без морфологических изменений, даже при культивировании более 16 недель. С другой стороны, при длительном культивировании линии клеток, полученной из отличных от покоящегося центра тканей корня, было отмечена некоторая локальная дифференциация и, в частности, было показано отчетливое развитие придаточных корней.
К тому же клетки растений культивируются в виде клеточных агрегатов, в отличие от микробных клеток, которые культивируются в одноклеточном состоянии. В этих клеточных агрегатах существует определенная разница отношений с окружающей средой внутри и снаружи агрегата, что вносит изменения в рост клеток и в получение из них полезных веществ. Однако подобные изменения невозможны у полученной из покоящегося центра клеточной линии по настоящему изобретению, т.к. она в суспензионной культуре находится в одноклеточном состоянии.
Полученная из покоящегося центра клеточная линия по настоящему изобретению может быть использована в растительной экспрессирующей системе для стабильного получения полезных веществ. Также полученная из покоящегося центра клеточная линия по настоящему изобретению может культивироваться в соответствии со способом культивирования растительных клеток в суспензии, а специфический способ культивирования может быть осуществлен в известной в данной области манере.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу для сохранения растительной клеточной линии, который содержит этап замораживания упомянутой клеточной линии, выделенной из покоящегося центра корней растения.
Обычно растительные клетки демонстрируют низкую жизнеспособность при криоконсервации, но полученная из покоящегося центра клеточная линия по настоящему изобретению демонстрирует более чем на 85% более высокую жизнеспособность при использовании традиционного способа криоконсервации клеток. Возможность криоконсервации клеточных линий позволяет наладить стабильное предоставление сырья и позволяет создавать маточные банки клеток. Таким образом, выделенная из покоящегося центра клеточная линия по настоящему изобретению может предоставляться долгосрочно и стабильно.
Мир сейчас находится в состоянии войны за обеспечение безопасности исследовательских материалов (биологических ресурсов), а также за сохранение и идентификацию ставших важной государственной собственностью биологических ресурсов, таких как ткани человека, семена растений, микроорганизмы, клетки и гены, для разработки различных новых лекарственных средств и для улучшения качества пищи.
Соответственно, поскольку обеспечение безопасности исследовательских материалов ведет к повышению национальной конкурентоспособности, необходимо создавать банки клеточных линий для развития, сбора, сохранения и распространения клеточных линий, используемых в качестве незаменимых материалов в исследованиях в области бионаук. Таким образом, после создания таких банков растительных клеток снабжение исследовательскими материалами становится простым, а время исследований с использованием растительных клеточных линий сокращается.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Далее по тексту настоящее изобретение будет описано более подробно с отсылкой на примеры. Для специалиста в данной области будет очевидно, что эти примеры приведены исключительно в иллюстративных целях и не должны трактоваться с ограничением сферы применения настоящего изобретения, т.к. эти примеры могут модифицироваться в другие различные формы.
Пример 1. Выделение клеточной линии из покоящегося центра риса
1-1: Подготовка растительного материала
Семена риса очищали, поверхностно стерилизовали с помощью 70% этанола в течение 1 минуты, замачивали в 2% растворе гипохлорита натрия в течение 1 часа и затем отмывали один или два раза стерильной водой. Отмытые семена промывали достаточным объемом стерильной воды в течение 30 минут и затем высушивали для полного удаления влаги.
Подсушенные семена высевали в среду N6 (CHU MEDIUM, Chu C.C., Ргос. Symp. Plant Tissue Cult. Peking, 43, 1978) и культивировали при 25°C в течение 5 дней, до их прорастания. Состав среды N6 представлен в таблице 1 ниже.
| Таблица 1 | |||
| Состав | Концентрация | ||
| Макроэлементы | CaCl2*2H2O | 1,13 мМ | 125,33 мг/л |
| KH2PO4 | 2,94 мМ | 400,00 мг/л | |
| KNO3 | 29,99 мМ | 2830,00 мг/л | |
| MgSO4*7H2O | 0,75 мМ | 90,27 мг/л | |
| (NH4)2SO4 | 3,50 мМ | 463,00 мг/л | |
| Состав | Концентрация | ||
| Микроэлементы | FeNaEDTA | 0,10 мМ | 36,70 мг/л |
| H3BO3 | 25,88 мкМ | 1,60 мг/л | |
| KI | 4,81 мкМ | 0,80 мг/л | |
| MnSO4*4H2O | 19,70 мкМ | 3,33 мг/л | |
| ZnSO4*7H2O | 5,22 мкМ | 1,50 мг/л | |
| Состав | Концентрация | ||
| Витамины | Глицин | 26,64 мкМ | 2,00 мг/л |
| Тиамин-HCl | 2,96 мкМ | 1,00 мг/л | |
| Пиридоксин-HCl | 2,43 мкМ | 0,50 мг/л | |
| Никотиновая кислота | 4,06 мкМ | 0,50 мг/л | |
Затем отбирали содержащую покоящийся центр ткань корня пророщенных в течение 5-6 дней растений. Удаляли с кончика корня корневой чехлик и отбирали в качестве эксплантата фрагмент толщиной 1 мм от поверхности до линии среза.
1-2: Индукция и выделение клеточной линии из покоящегося центра
(1) Эксплантат, отобранный в примере 1-1, инокулировали в среды N6, содержащие по 2 мг/л, 3 мг/л и 4 мг/л 2,4-D, и в среды N6, содержащие другие гормоны-ауксины, а именно: IAA (индолил-3-уксусную кислоту), IBA (индолил-3-маслянную кислоту), NAA (1-нафталенуксусную кислоту), CPA(p-хлорфеноксиуксусную кислоту) или Picloram (4-амино-3,5,6-трихлорпиколиновую кислоту), в указанных выше концентрациях.
В результате, в случае 2,4-D-содержащих сред, индукция клеточных линий наблюдалась через 30 дней после инокуляции. В 2,4-D-содержащих средах скорость индукции полученных из покоящегося центра клеток не увеличивалась пропорционально концентрации химического соединения и демонстрировала сходные скорости индукции при концентрациях 2 мг/л и выше. Соответственно, было видно, что эксплантат целесообразно культивировать при концентрации более чем 2 мг/л. Дополнительно были проведены эксперименты при концентрациях 1 мг/л, 4 мг/л, 5 мг/л, 6 мг/л и 7 мг/л и в результате было показано, что наиболее целесообразно культивировать эксплантат при концентрациях 2-7 мг/л.
С другой стороны, на фиг.2 показано, что индукция не прошла с ауксинами, отличными от 2,4-D, и в эксплантатах появились придаточные корни. На фиг.2: "A" - ткань, культивируемая в средах, содержащих 2,4-D; "B" - ткань, культивируемая в средах, содержащих CPA; "C" - ткань, культивируемая в средах, содержащих IAA; "D" - ткань, культивируемая в средах, содержащих NAA; и "F" - ткань, культивируемая в средах, содержащих Picloram.
Соответственно, видно, что полученная из покоящегося центра клеточная линия, была специфично индуцирована 2,4-D.
(2) На фиг.1A показано, что при культивировании в содержащих 2,4-D средах наблюдались морфологические различия между клеточной линией, полученной из отличных от покоящегося центра тканей корня, и клеточной линией, полученной из покоящегося центра. В частности, клеточная линия, полученная из отличной от покоящегося центра тканей корня, была гетерогенной и была локально дифференцирована, а клеточная линия, полученная из покоящегося центра, была гомогенной без локальной дифференцировки. При визуальном наблюдении было отмечено, что клеточная линия, полученная из отличных от покоящегося центра тканей корня, имела желтый цвет, а клеточная линия, полученная из покоящегося центра, была белой и была окружена слизистыми веществами. Недифференцированную ткань белого цвета, т.е. клеточную линию из покоящегося центра, выделяли через 3-6 недель, основываясь на морфологической разнице. На фиг.1А в красном овале показана клеточная линия, образованная покоящимся центром.
(3) На фиг.3 представлены фотографии, демонстрирующие морфологическое наблюдение клеточной линии, образованной отличными от покоящегося центра тканями корня (a), и морфологическое наблюдение клеточной линии, образованной покоящимся центром (b). На фиг.3 видно, что клеточная линия, образованная отличными от покоящегося центра тканями корня, была гетерогенной и была локально дифференцирована, а клеточная линия, образованная покоящимся центром, была гомогенной, без дифференцированных участков.
(4) При этом, в случае, когда клеточную линию, образованную покоящимся центром, не выделяли через 3-6 недель и позволяли смешаться с клеточной линией, образованной отличными от покоящегося центра тканями корня, происходила денатурация слизистых компонентов. Считается, что эта денатурация происходит из-за фенольных соединений выделяемых образованной другими тканями клеточной линией, т.к. синтез фенольных компонентов активно идет в дифференцированных тканях.
Пример 2. Выделение клеточной линии из покоящегося центра кукурузы.
Семена кукурузы проращивали также, как и в примере 1-1, и эксплантат, содержащий покоящийся центр, отбирали из корня проросшего растения. Затем эксплантат культивировали в средах, содержащих 2,4-D, CPA, IAA, IBA, NAA и Picloram, так же, как и в примере 1-2, и наблюдали, происходит ли индукция клеточной линии из покоящегося центра.
В результате, как показано на фиг.4, при культивировании эксплантата, содержащего покоящийся центр кукурузы, индукция клеточной линии наблюдалась в средах содержащих 2,4-D, так же, как и при культивировании эксплантата, содержащего покоящийся центр риса. Однако в случае ауксинов, отличных от 2,4-D, после инокуляции эксплантата клетки не индуцировались, и в эксплантатах развивались придаточные корни. На фиг.4, "A" - ткань, культивируемая в средах, содержащих 2,4-D; "B" - ткань, культивируемая в средах, содержащих CPA; "C" - ткань, культивируемая в средах, содержащих IAA; "D" - ткань, культивируемая в средах, содержащих NAA; и "F" - ткань, культивируемая в средах, содержащих Picloram.
Соответственно, видно, что даже в случае отличных от риса содержащих покоящийся центр растений, клеточные линии могут быть специфично индуцированы из покоящегося центра при использовании 2,4-D.
Пример 3. Наблюдение характеристик клеточной линии, образованной покоящимся центром риса
3-1: Наблюдение морфологических изменений во время длительного культивирования
Выделенную из покоящегося центра клеточную линию примера 1, инокулировали в культуральную среду того же состава, что и среда для индукции клеточных линий из примера 1-2, т.е. в среду N6, содержащую 2 мг/л 2,4-D, и дали возможность клеточной линии пролиферировать в этой среде. Пролиферировавшие клетки покоящегося центра наблюдали после 4 и 16 недель клеточного роста. При этом для контроля, пролиферировали клеточные линии, полученные из отличных от покоящегося центра тканей корня, так же, как описано выше, и затем наблюдали морфологические изменения клеток.
На фиг.5, показаны морфологические изменения полученной из тканей корня клеточной линии через 4 недели культивирования (фиг.5А) и через 16 недель культивирования (все остальные фотографии фиг.5). После 16 недель культивирования в клеточном агрегате наблюдалось несколько участков локальной дифференцировки, и, в частности, можно было отчетливо наблюдать развитие придаточных корней.
С другой стороны, как показано на фиг.6, при культивировании клеточной линии полученной из покоящегося центра не было видно каких-либо морфологических изменений ни через 4 недели, ни через 16 недель культивирования.
Соответственно, можно констатировать, что клеточные линии, полученные из отличных от покоящегося центра тканей корня, претерпевают с течением времени быстрые морфологические изменения, а клеточная линия, полученная из покоящегося центра, остается морфологически стабильной. Как описано выше, клеточная линия, образуемая покоящимся центром по настоящему изобретению, являясь клональной клеточной линией, в процессе длительного культивирования остается стабильной, не претерпевая изменений. Таким образом, она весьма предпочтительна при выборе клеточной линии с высокой продуктивностью и способностью к стабильному производству веществ.
При этом выделенная из покоящегося центра клеточная линия обладает морфологически большими ядрами. Как показано на фиг.7А, размер клетки клеточной линии составляет около 10-20 мкм, а размер ядра - около 2-4 мкм. С другой стороны, как показано на фиг.7B, размер ядра клеточной линии получаемой из отличных от покоящегося центра тканей корня, был очень мал по сравнению с клеточной линией из покоящегося центра.
3-2: Наблюдение за клеточными агрегатами при суспензионном культивировании
Клетки растений культивировали в виде клеточных агрегатов без культивирования в одноклеточном состоянии, при этом клеточный агрегат состоял из нескольких сотен растительных клеток. Этот клеточный агрегат является причиной возникновения определенной разницы отношений с окружающей средой внутри и снаружи агрегата, что вносит изменения в рост клеток и в процесс получения из них полезных веществ. Соответственно, наблюдали, агрегируют ли при суспензионном культивировании клеточная линия, получаемая из покоящегося центра, и клеточная линия, полученная из отличных от покоящегося центра тканей корня.
В результате, на фиг.8 и фиг.9 было показано, что клеточная линия, полученная из отличных от покоящегося центра тканей корня, культивировалась в виде клеточных агрегатов, состоящих от нескольких клеток до нескольких сотен клеток, а клеточная линия, полученная из покоящегося центра, культивировалась в одноклеточном состоянии. На фиг.8 показаны клеточные уровни клеточной линии получаемой из отличных от покоящегося центра тканей корня (фиг.8(a)) и клеточной линии, полученной из покоящегося центра (фиг.8(b)). На фиг.9 представлена графическая диаграмма, демонстрирующая степень агрегации клеточной линии получаемой из отличных от покоящегося центра тканей корня и клеточной линии, получаемой из покоящегося центра.
3-3: Проверка жизнеспособности в процессе криоконсервации
Способ криоконсервации клеточных линий необходим для снабжения сырьевыми материалами и для создания маточных клеточных банков. Способ криоконсервации широко распространен при работе с клетками животных, но его применение при работе с клетками растений ограничено, т.к. клетки растений обладают низким уровнем жизнеспособности при криоконсервации. Соответственно, жизнеспособность клеточной линии, получаемой из покоящегося центра, при криоконсервации проверялась следующим образом.
Клеточную линию, полученную из покоящегося центра в примере 3-2, инокулировали и культивировали в суспензии в течение 6-7 дней. Суспензионную культуру прекультивировали в среде, содержащей 0,16 М маннитол, при комнатной температуре в течение 3 дней и затем инкубировали при 4°C в течение 3 часов. Обработанные низкой температурой клетки собирали, и переносили в среду с Cryobial (Duran, США), содержащую 40% этиленгликоль (Sigma, США) и 30% сорбитол (DUCHEFA, Нидерланды) и затем культивировали при 4°C в течение 3 минут. Затем, культивируемые клетки, обработанные криоконсервантом, погружали в жидкий азот и замораживали в нем. Затем, для оттаивания, выдержанные в жидком азоте, по меньшей мере 10 минут, культивированные клетки, помещали в водяную баню с температурой 40°C и выдерживали в ней в течение 1-2 минут. Для возобновления роста клеток, фильтрат, содержащий клетки, помещали в среду, содержащую 0,5 М сорбитол, и стабилизировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем клетки культивировали в среде, содержащей 0,1 М сорбитол, в течение 24 часов, затем в среде без сорбитола в течение 24 часов и затем в среде без сорбитола в течение 24 часов. После чего проверяли жизнеспособность клеток.
В результате, как показано на фиг.10 и фиг.11, жизнеспособность клеточной линии, полученной из отличных от покоящегося центра тканей корня, составляла менее чем 10%, а жизнеспособность клеточной линии по настоящему изобретению, полученной из покоящегося центра, составляла более чем около 85%. На фиг.10 представлены фотографии, демонстрирующие уровень жизнеспособности клеточной линии, полученной из отличных от покоящегося центра тканей корня (a) и уровень жизнеспособности клеточной линии, полученной из покоящегося центра (b). На фотографиях клетки окрашены после криоконсервации Синим Эванса, а на фиг.11 представлена графическая диаграмма, демонстрирующая уровни жизнеспособности линий.
Соответственно, видно, что клеточная линия по настоящему изобретению, полученная из покоящегося центра, может быть подвергнута криоконсервации, в отличие от обычных клеток растений, которые не могут быть подвергнуты криоконсервации из-за низкого уровня жизнеспособности. Это наводит на мысль о том, что полученная из покоящегося центра клеточная линия подходит для длительной консервации.
Промышленная применимость
Как описано выше, гомогенная клеточная линия, выделенная из покоящегося центра в соответствии со способом настоящего изобретения, является полезным исследовательским инструментом для изучения эволюционного и генетического происхождения растений и вносит вклад в развитие биологии растительных стволовых клеток. При этом клеточная линия по настоящему изобретению, полученная из покоящегося центра, сохраняется в течение длительного периода времени без морфологических изменений и культивируется в суспензии в виде одноклеточной культуры. Соответственно, клеточная линия позволяет производить различные полезные вещества растительного происхождения безопасно и эффективно и позволяет создавать банки растительных клеток с помощью криоконсервации, т.к. демонстрирует уровень жизнеспособности более 85% при криоконсервации, в отличие от других растительных клеток. В частности, клеточная линия, полученная по настоящему изобретению, обладает преимуществами, заключающимися в том, что из такой клеточной линии могут быть созданы банки растительных клеток, что упрощает снабжение исследовательскими материалами и сокращает время исследований с использованием растительных клеточных линий.
Хотя настоящее изобретение описано в деталях со ссылкой на специфические характеристики, для специалиста в данной области будет очевидно, что это описание является всего лишь предпочтительным воплощением и не лимитирует сферу применения настоящего изобретения. Таким образом, реальная сфера применения настоящего изобретения будет определяться приложенной формулой изобретения или ее эквивалентами.
Claims (4)
1. Способ выделения клеточной линии из покоящегося центра, включающий культивирование содержащей покоящийся центр ткани корня растения, в среде, содержащей 2,4-D, отбор белой недифференцированной ткани из культивируемой ткани, где упомянутая получаемая из покоящегося центра клеточная линия обладает следующими характеристиками:
(а) клеточная линия в суспензионной культуре находится в одноклеточном состоянии;
(б) для клеточной линии показано, что морфологически ее ядра больше, чем в клеточных линиях корня того же растения;
(в) клеточная линия окружена слизистыми веществами;
(г) клеточная линия растет стабильно и дольше по сравнению с клеточными линиями корня того же растения; и
(д) клеточная линия демонстрирует высокую жизнеспособность при криоконсервации.
(а) клеточная линия в суспензионной культуре находится в одноклеточном состоянии;
(б) для клеточной линии показано, что морфологически ее ядра больше, чем в клеточных линиях корня того же растения;
(в) клеточная линия окружена слизистыми веществами;
(г) клеточная линия растет стабильно и дольше по сравнению с клеточными линиями корня того же растения; и
(д) клеточная линия демонстрирует высокую жизнеспособность при криоконсервации.
2. Способ по п.1, где содержащую покоящийся центр ткань корня растения получают из проросших стерильных растительных семян или из ткани корня, дифференцированной из каллюса, полученного из части растения.
3. Клеточная линия, полученная из покоящегося центра растения, которая обладает следующими характеристиками:
(а) клеточная линия в суспензионной культуре находится в одноклеточном состоянии;
(б) для клеточной линии показано, что морфологически ее ядра больше, чем в клеточных линиях корня того же растения;
(в) клеточная линия окружена слизистыми веществами;
(г) клеточная линия растет стабильно и дольше по сравнению с клеточными линиями корня того же растения; и
(д) клеточная линия демонстрирует высокую жизнеспособность при криоконсервации.
(а) клеточная линия в суспензионной культуре находится в одноклеточном состоянии;
(б) для клеточной линии показано, что морфологически ее ядра больше, чем в клеточных линиях корня того же растения;
(в) клеточная линия окружена слизистыми веществами;
(г) клеточная линия растет стабильно и дольше по сравнению с клеточными линиями корня того же растения; и
(д) клеточная линия демонстрирует высокую жизнеспособность при криоконсервации.
4. Клеточная линия по п.3, где растение выбирают из группы, содержащей рис, кукурузу, Pisum sativum, Avena sativa, Allium сера и Arabidopsis.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20070096892 | 2007-09-21 | ||
| KR10-2007-0096892 | 2007-09-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2010115794A RU2010115794A (ru) | 2011-10-27 |
| RU2458122C2 true RU2458122C2 (ru) | 2012-08-10 |
Family
ID=40468637
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010115794/10A RU2458122C2 (ru) | 2007-09-21 | 2008-09-22 | Растительная стволовая клеточная линия, полученная из покоящегося центра, и способ ее выделения |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20100255585A1 (ru) |
| EP (1) | EP2188368A4 (ru) |
| JP (1) | JP2010539899A (ru) |
| KR (1) | KR101068971B1 (ru) |
| CN (1) | CN101939415A (ru) |
| AP (1) | AP2010005190A0 (ru) |
| AU (1) | AU2008301351A1 (ru) |
| CA (1) | CA2700337A1 (ru) |
| MX (1) | MX2010003027A (ru) |
| RU (1) | RU2458122C2 (ru) |
| WO (1) | WO2009038416A2 (ru) |
| ZA (1) | ZA201001571B (ru) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2006309568B8 (en) * | 2005-10-31 | 2012-04-05 | Wellkey Holdings Limited | Stability of secondary metabolite mass production through synchronized plant cell cultures |
| US8053238B2 (en) * | 2005-10-31 | 2011-11-08 | Unhwa Corporation | Isolated population of plant single cells and method of preparing the same |
| KR101064518B1 (ko) * | 2007-09-21 | 2011-09-19 | 주식회사 운화 | 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 식물줄기세포주 및 이의 분리방법 |
| KR101179171B1 (ko) | 2008-08-14 | 2012-09-03 | 주식회사 운화 | 산삼 또는 인삼을 포함한 인삼류의 형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
| RU2011117262A (ru) | 2008-09-30 | 2012-11-10 | Унхва Корпорейшн (Kr) | Композиция для профилактики или лечения спида, содержащая в качестве активного ингредиента линию стволовых клеток растений, полученную из камбия panax ginseng, в том числе из дикорастущего женьшеня или женьшеня |
| CN102209550B (zh) * | 2008-11-06 | 2013-10-16 | 云火公司 | 含有来自包括野山参或人参的人参类形成层的植物干细胞系为有效成分的用于预防或治疗癌症的组成物 |
| CN104195098A (zh) * | 2014-09-22 | 2014-12-10 | 古焕庆 | 铁皮石斛干细胞及其分离培养方法 |
| CN104531606B (zh) * | 2014-12-24 | 2017-07-28 | 广东药科大学 | 当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞及其制备和培养方法 |
| CN107836349A (zh) * | 2017-11-10 | 2018-03-27 | 淮北智淮科技有限公司 | 一种植物干细胞培养方法 |
| CN111387058B (zh) * | 2020-05-12 | 2025-12-19 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 一种大蒜愈伤组织超低温保存的方法及超低温保存设备 |
| CN113025554B (zh) * | 2021-04-20 | 2022-06-17 | 山东安然纳米实业发展有限公司 | 一种利用生物反应装置培养人参干细胞的方法 |
| CN114107167B (zh) * | 2021-11-29 | 2024-06-28 | 上海珈凯生物股份有限公司 | 一种无菌苗来源植物细胞及其制备方法 |
| CN114208437B (zh) * | 2021-12-14 | 2022-09-13 | 青岛农业大学 | 一种玉米种子根鞘分离生物力测定技术方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2126047C1 (ru) * | 1987-05-29 | 1999-02-10 | Новартис Аг | Способ получения растений zea mays l., устойчивых к повреждениям, вызываемым насекомыми |
-
2008
- 2008-09-19 KR KR1020080092201A patent/KR101068971B1/ko active Active
- 2008-09-22 US US12/679,263 patent/US20100255585A1/en not_active Abandoned
- 2008-09-22 EP EP08832681A patent/EP2188368A4/en not_active Withdrawn
- 2008-09-22 AU AU2008301351A patent/AU2008301351A1/en not_active Abandoned
- 2008-09-22 WO PCT/KR2008/005604 patent/WO2009038416A2/en not_active Ceased
- 2008-09-22 JP JP2010525768A patent/JP2010539899A/ja active Pending
- 2008-09-22 CA CA2700337A patent/CA2700337A1/en not_active Abandoned
- 2008-09-22 RU RU2010115794/10A patent/RU2458122C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-09-22 AP AP2010005190A patent/AP2010005190A0/xx unknown
- 2008-09-22 MX MX2010003027A patent/MX2010003027A/es not_active Application Discontinuation
- 2008-09-22 CN CN2008801080928A patent/CN101939415A/zh active Pending
-
2010
- 2010-03-04 ZA ZA2010/01571A patent/ZA201001571B/en unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2126047C1 (ru) * | 1987-05-29 | 1999-02-10 | Новартис Аг | Способ получения растений zea mays l., устойчивых к повреждениям, вызываемым насекомыми |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| VERDEIL JL et al: "Pluripotent versus totipotent plant stem cells: dependence versus autonomy?" Trends Plant Sci. 2007 Jun; 12(6): 45-52. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20090031299A (ko) | 2009-03-25 |
| CA2700337A1 (en) | 2009-03-26 |
| KR101068971B1 (ko) | 2011-09-30 |
| EP2188368A4 (en) | 2010-12-29 |
| US20100255585A1 (en) | 2010-10-07 |
| CN101939415A (zh) | 2011-01-05 |
| WO2009038416A3 (en) | 2009-05-07 |
| RU2010115794A (ru) | 2011-10-27 |
| AU2008301351A1 (en) | 2009-03-26 |
| ZA201001571B (en) | 2010-11-24 |
| MX2010003027A (es) | 2010-07-30 |
| EP2188368A2 (en) | 2010-05-26 |
| AP2010005190A0 (en) | 2010-04-30 |
| JP2010539899A (ja) | 2010-12-24 |
| WO2009038416A2 (en) | 2009-03-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2458122C2 (ru) | Растительная стволовая клеточная линия, полученная из покоящегося центра, и способ ее выделения | |
| CN101939414B (zh) | 来自具有储藏根的草本植物形成层的植物干细胞系及其分离方法 | |
| CN103190347B (zh) | 一种茶壶枣组织培养方法 | |
| CN112237142B (zh) | 一种建立中国石蒜或忽地笑再生体系的组培培养基及其方法 | |
| CN104206417A (zh) | 一种促进牡丹种苗生长的方法及其应用 | |
| CN101983557B (zh) | 檀香种胚苗茎段的离体快速繁殖方法 | |
| CN105993956A (zh) | 一种茅苍术快速繁殖方法 | |
| CN113331059B (zh) | 一种以鸟王茶树胚轴为外植体建立高效再生体系的方法 | |
| Rodboot et al. | Optimization of explant sterilization and plant growth regulators for enhancing the in vitro propagation of Nymphaea colorata Peter | |
| CN110663552B (zh) | 一种滇桐的组培快繁方法 | |
| CN103858768A (zh) | 一种鸡蛋花的组织培养方法 | |
| CN108323436A (zh) | 使用竹炭的克隆植物的生产方法、组织培养用添加剂以及培养基组合物 | |
| CN117581721B (zh) | 一种利用雷公藤福定提高水稻苗期耐盐性的方法 | |
| CN104082147B (zh) | 细柱五加的离体快速繁殖方法 | |
| CN112042541A (zh) | 黄杉属植物通过体细胞胚胎发生的繁殖方法 | |
| CN106577280A (zh) | 一种利用驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖无菌苗 | |
| CN109349108A (zh) | 一种甜荞体细胞胚胎发生与植株再生方法 | |
| JPS6371121A (ja) | 組織培養によるナガイモムカゴの大量生産法 | |
| CN107743868A (zh) | 一种利用自然光培养一步成苗高效繁殖金线莲的方法 | |
| CN107306727A (zh) | 一种海棠果种子育苗方法 | |
| Zhang et al. | Establishment of an efficient regeneration system for Lycium barbarum | |
| CN101496527B (zh) | 一种弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法 | |
| Bora et al. | Direct organogenesis in Dianthus caryophyllus Linn | |
| Ahmed et al. | Differential competence for in vitro rapid and reliable regeneration of potato (Solanum tuberosum L.) cultivars | |
| KR100302206B1 (ko) | 민두릅나무의 기내 대량생산방법 및 포지 이식방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150923 |