[go: up one dir, main page]

CN111387058B - 一种大蒜愈伤组织超低温保存的方法及超低温保存设备 - Google Patents

一种大蒜愈伤组织超低温保存的方法及超低温保存设备

Info

Publication number
CN111387058B
CN111387058B CN202010396058.8A CN202010396058A CN111387058B CN 111387058 B CN111387058 B CN 111387058B CN 202010396058 A CN202010396058 A CN 202010396058A CN 111387058 B CN111387058 B CN 111387058B
Authority
CN
China
Prior art keywords
callus
garlic
culture
tissue
culture dish
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010396058.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111387058A (zh
Inventor
王海平
刘卓雅
李锡香
宋江萍
赵青
张晓辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences filed Critical Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN202010396058.8A priority Critical patent/CN111387058B/zh
Publication of CN111387058A publication Critical patent/CN111387058A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111387058B publication Critical patent/CN111387058B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N3/00—Preservation of plants or parts thereof, e.g. inhibiting evaporation, improvement of the appearance of leaves or protection against physical influences such as UV radiation using chemical compositions; Grafting wax

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于农产品超低温保存技术领域，公开了一种大蒜愈伤组织超低温保存的方法及超低温保存设备，取长势好的愈伤组织接进行预培养；用低温保护剂进行装载、脱水、玻璃化；低温保护剂处理后茎尖的复温；低温保护剂处理后茎尖的恢复；将恢复后的愈伤组织接入培养基进行初代培养及扩繁。通过本发明方法，有效提高大蒜组织超低温保存效果，提高了大蒜愈伤组织超低温保存后的成活率：预培养时间2天，加载介质装载时间20分钟，PVS2玻璃化溶液处理15分钟，会使愈伤组织成活率明显提高。本发明的方法可应用于大蒜愈伤组织超低温保存,其操作过程简易，易应用于生产，可用于大蒜种质资源的高效安全保存。

Description

一种大蒜愈伤组织超低温保存的方法及超低温保存设备
技术领域
本发明属于农产品超低温保存技术领域，尤其涉及一种大蒜愈伤组织超低温保存的方法及超低温保存设备。
背景技术
目前，大蒜(英文名称Garlic；拉丁名称Allium sativum L.)，为百合科(Liliaceae)葱属(Allium)植物的地下鳞茎。我国是世界上最大的大蒜种植和出口国，大蒜是重要的农作物品种之一，大蒜及其制品是人民群众喜欢的传统调味食品。
同时大蒜也是一种季节性非常强的农产品，新鲜的大蒜可以通过冷藏来保存，但也只能储存至第二年的新蒜上市而已，否则会失去其商业价值。我国是大蒜的出口大国，其每年带来的利润也尤为可观。因此，研究大蒜不同的优良品种，延长其保存时长，提高优质品种的产量十分重要。
超低温保存技术是目前长期有效保存植物资源的唯一方法，是指在-80℃以下的超低温中保存种植资源的生物学技术，其中液氮最为常用。超低温保存一般是-196℃(液氮)的超低温环境下使被保存的活细胞的物质代谢和生长活动几乎完全停滞。这种方法能够保持生物材料的遗传稳定性，而且也不会丧失其形态发生的潜能。超低温保存技术可以保存和抢救物种，能避免物种突变的发生，是长期稳定保存植物种资源以及珍贵实验材料的重要方法。到目前为止，被用于超低温保存的植物已有100多种，超低温保存早期大多使用冻结化保存技术，主要分为快和慢两种方法，随着技术的不断成熟，已有玻璃化法、干燥冷冻法、包埋脱水法等。玻璃化法超低温保存技术是目前植物种质资源长期稳定保存的理想方法。
传统的大蒜超低温保存是通过人工在显微镜下进行茎尖剥离的方法实现的，这种方法不仅需要成熟的剥离茎尖的操作技术，且在剥离过程中要在无菌条件下严格进行，不仅费时费工，且容易污染，给大蒜资源的规模化超低温保存带来较大挑战。愈伤组织是通过细胞的全能性特点，形成的组织块，不仅脱毒效果好，且容易实现大规模的繁殖，如果能够发明一种可以通过愈伤组织进行大蒜超低温保存，将为大蒜资源的安全保存提供一种新的思路和方法。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)尚未见大蒜愈伤组织的报道，无参考方法。
(2)现有技术中，大蒜其他组织超低温保存后成活率不高。
(3)现有技术中，大蒜的其他组织恢复生长速率较慢。
解决以上问题及缺陷的难度为：
(1)尚无有关大蒜愈伤组织超低温保存的方法。
(2)相关研究在我国起步较晚，现有技术中资料少且不成体系。
(3)不同的大蒜外植体，乃至不同的大蒜品种，适宜其离体诱导不定芽的基本培养基和激素配比均有所不同。但目前的研究中，关于大蒜离体再生体系广适性的探索涉及较少。
解决以上问题及缺陷的意义为：
(1)发明一种大蒜愈伤组织的超低温保存方法。
(2)愈伤组织可以作为大蒜资源保存的重要载体组织，具有广阔的应用价值。
(3)提高大蒜组织超低温保存效果，提高成活率。
(4)建立适合大蒜资源的超低温保存体系。
(5)高效安全的保存大蒜种质资源。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种大蒜愈伤组织超低温保存的方法及超低温保存设备。
本发明是这样实现的，一种大蒜愈伤组织超低温保存的方法，包括：
S1、取长势较好的愈伤组织接入在含有Gamborg B5基础培养基+NAA+2iP的培养皿上，接种好的培养皿放在黑暗中，进行预培养；
S2、PVS2作为低温保护剂进行装载、脱水、玻璃化；
S3、PVS2处理后愈伤组织的复温；
S4、PVS2处理后愈伤组织的恢复；
S5、将恢复后的愈伤组织接入培养基进行初代培养及扩繁。
进一步，所述步骤S1的实现过程如下：
步骤S11、配置含2iP和NAA的Gamborg B5培养皿：向蒸馏水中添加Gamborg B5basal medium(G3982)3.21g/L、2iP 0.05毫克/L、NAA 0.01毫克/L、蔗糖30g/L、琼脂6.5克/L；
步骤S12、接种：将愈伤组织接种在培养皿放在黑暗中5℃的条件下，分别进行预培养2天。
所述2iP保存在零下20度冻存，要提前分装避免2iP的反复冻融。
进一步，所述步骤S2的实现过程如下：
步骤S21、装载：将预培养的愈伤组织转移到加载介质的培养皿中，让愈伤组织浸泡二十分钟；
步骤S22、脱水：二十分钟后取出愈伤组织，用冷冻(0℃)过的PVS2玻璃化溶液替代，将愈伤组织置于PVS2溶液中，置于冰上十五分钟；
步骤S23、玻璃化：十五分钟后，用镊子将4～5个愈伤组织放在无菌的箔条上(0.5*15mm)。不需要从铝箔上去除多余的PVS2，立即将箔条插入含有液氮的浅容器中。
所述加载介质的培养皿为MS basal salt mixture5(M5242)2.165g/L、甘油184.2g/L、蔗糖205.4g/L、MS-G625ml和MS-vitamins610ml，其中MS-G6和MS-vitamins6需要提前配制。
所述MS-G6溶液由硫胺素0.08g/L、肌醇20g/L配制，冷冻保存。MS-vitamins6溶液由甘氨酸0.2g/L、肌醇10g/L、烟酸0.05g/L、盐酸吡哆醇0.05g/L和硫胺素0.01g/L配制，在5℃下储存。
所述PVS2玻璃化溶液由甘油300g/L、乙二醇135ml、试剂级蔗糖137g/L和DMSO136ml配制，需在超净工作台进行过滤。
进一步，所述步骤S3的具体操作过程如下：
一旦盖子受热到可以打开，立即从低温瓶中取出冰冻的箔条。将箔条浸入1.2M蔗糖+1/2MS培养基中浸泡二十分钟，十分钟后换新的溶液，一旦加热到愈伤组织脱落，立即从介质中移除箔条。二十分钟后，将组织转移到含有Gamborg B5基本培养基+NAA+2iP的新培养皿中，将培养皿用铝箔包起来(防止暴露在光线下)，放置在生长室24小时。
所述1.2M蔗糖+1/2MS培养基为MS basal medium w/vitamins5(M5192)4.43g/L、蔗糖410.76g/L。
进一步，所述步骤S4的具体操作过程如下：
24小时后，将组织移入含有Gamborg B5基本培养基+NAA+2iP的新培养皿中，用锡纸包起来，将培养皿放置在生长室四天，然后取下箔纸，在昏暗的灯光下再放置五天，五天之后，移至全光，将组织放在培养皿中，直到其生长超过培养皿的空间，然后将其移至含有Gamborg+NAA+2iP的培养皿中。
本发明的另一目的在于提供一种实施所述大蒜愈伤组织超低温保存方法的大蒜愈伤组织超低温保存设备。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的大蒜愈伤组织超低温保存的方法，取长势较好的愈伤组织接入含2iP和NAA的Gamborg B5培养皿上，接种好的培养皿放在黑暗中，进行预培养；PVS2作为低温保护剂进行装载、脱水、玻璃化；PVS2处理后愈伤组织的复温；PVS2处理后愈伤组织的恢复；将恢复后的愈伤组织接入培养基进行初代培养及扩繁。本发明在含有Gamborg B5基础培养基+NAA+2iP的培养皿黑暗预培养时间2天，2M甘油+0.6M蔗糖+1/2MS加载介质装载时间20分钟，PVS2玻璃化溶液处理15分钟，解决了大蒜愈伤组织超低温保存后成活率低的问题。
通过本发明方法，实现了大蒜愈伤组织的超低温保存；通过条件优化，有效地提高了大蒜愈伤组织超低温保存后的成活率：本发明选取的愈伤组织节省了传统茎尖超低温保存中，进行剥离茎尖的繁琐工作，具有省时省力节约成本的优势具有推广意义并有效的减少了污染率。
预培养时间2天，加载介质装载时间20分钟，PVS2玻璃化溶液处理15分钟，愈伤组织成活率明显提高。
本发明的方法简易，更易应用于生产，可应用于大蒜愈伤组织超低温保存。
可用于大蒜种质资源的保存，有效保存种质，可有效提高种质资源的利用。
结合实验或试验数据和现有技术对比得到的效果和优点：
(1)本发明使用的大蒜的愈伤组织，是创造性的发明。
(2)查找文献可知大蒜茎尖玻璃化法超低温保存的茎尖存活率在百分之七十到百分之八十左右，本发明存活率在百分之七十五到百分之九十左右，大大提高了大蒜超低温保存的存活率。
(3)茎尖等实验材料的不易获取，须经消毒等繁琐的制备工作，消毒时间过久影响茎尖的生理状况，消毒时间不足导致材料本身污染，而愈伤材料进行超低温保存便于随时使用，因此本发明简化超低温保存步骤，减少材料污染，具有省时省力节约成本的优势，具有推广意义。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的愈伤组织超低温保存正交实验分析的主效应图。
图2是本发明实施例提供的传统的方法与本发明方法对比图。
图中：A，传统的茎尖方法效果图；B本发明的愈伤组织途径效果图：
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
现有技术中，尚未有通过愈伤组织实现大蒜资源的超低温保存方法。
现有技术中，大蒜鳞茎超低温保存效果差。现有技术中，大蒜品种愈伤组织超低温保存后成活率低。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种大蒜愈伤组织超低温保存的方法及超低温保存设备，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的大蒜愈伤组织超低温保存的方法包括：
S101、取长势较好的愈伤组织接入在含有Gamborg B5基础培养基+NAA+2iP的培养皿上，接种好的培养皿放在黑暗中，进行预培养。
S102、PVS2作为低温保护剂进行装载、脱水、玻璃化。
S103、PVS2处理后愈伤组织的复温。
S104、PVS2处理后愈伤组织的恢复。
S105、将恢复后的愈伤组织接入培养基进行初代培养及扩繁。
步骤S101的实现过程如下：
步骤S11、配置含2iP和NAA的Gamborg B5培养皿：向蒸馏水中添加GamborgB5basal medium(G3982)3.21g/L、2iP 0.05毫克/L、NAA 0.01毫克/L、蔗糖30g/L、琼脂6.5克/L。
步骤S12、接种：将愈伤组织接种在培养皿放在黑暗中5℃的条件下，分别进行预培养2天。
所述2iP保存在零下20度冻存，要提前分装避免2iP的反复冻融。
所述步骤S102的实现过程如下：
步骤S21、装载：将预培养的愈伤组织转移到加载介质的培养皿中，让愈伤组织浸泡二十分钟；
步骤S22、脱水：二十分钟后取出愈伤组织，用冷冻(0℃)过的PVS2玻璃化溶液替代，将愈伤组织置于PVS2溶液中，置于冰上十五分钟；
步骤S23、玻璃化：十五分钟后，用镊子将4～5个愈伤组织放在无菌的箔条上(0.5*15mm)。不需要从铝箔上去除多余的PVS2，立即将箔条插入含有液氮的浅容器中。
所述加载介质的培养皿为MS basal salt mixture5(M5242)2.165g/L、甘油184.2g/L、蔗糖205.4g/L、MS-G625ml和MS-vitamins610ml，其中MS-G6和MS-vitamins6需要提前配制。
所述MS-G6溶液由硫胺素0.08g/L、肌醇20g/L配制，冷冻保存。MS-vitamins6溶液由甘氨酸0.2g/L、肌醇10g/L、烟酸0.05g/L、盐酸吡哆醇0.05g/L和硫胺素0.01g/L配制，在5℃下储存。
所述PVS2玻璃化溶液由甘油300g/L、乙二醇135ml、试剂级蔗糖137g/L和DMSO136ml配制，需在超净工作台进行过滤。
所述步骤S103的具体操作过程如下：一旦盖子受热到可以打开，立即从低温瓶中取出冰冻的箔条。将箔条浸入1.2M蔗糖+1/2MS培养基中浸泡二十分钟，十分钟后换新的溶液，一旦加热到愈伤组织脱落，立即从介质中移除箔条。二十分钟后，将组织转移到含有Gamborg B5基本培养基+NAA+2iP的新培养皿中，将培养皿用铝箔包起来(防止暴露在光线下)，放置在生长室24小时。
所述1.2M蔗糖+1/2MS培养基为MS basal medium w/vitamins5(M5192)4.43g/L、蔗糖410.76g/L。
所述步骤S104的具体操作过程如下：
24小时后，将组织移入含有Gamborg B5基本培养基+NAA+2iP的新培养皿中，用锡纸包起来，将培养皿放置在生长室四天，然后取下箔纸，在昏暗的灯光下再放置五天，五天之后，移至全光，将组织放在培养皿中，直到其生长到超过培养皿的空间，然后将其移至含有Gamborg+NAA+2iP的培养皿中。
下面结合具体实施例及实验对本发明作进一步描述。
实施例
本发明实施例提供的大蒜愈伤组织超低温保存的方法包括：
步骤S1、取长势较好的愈伤组织接入在含有Gamborg B5基础培养基+NAA+2iP的培养皿上，接种好的培养皿放在黑暗中，进行预培养。
选取饱满无损伤的大蒜作为实验材料，配置含2iP和NAA的Gamborg B5培养皿：向蒸馏水中添加Gamborg B5basal medium(G3982)3.21g/L、2iP 0.05毫克/L、NAA0.01毫克/L、蔗糖30g/L、琼脂6.5克/L，取长势较好的愈伤组织接入在含有Gamborg B5基础培养基+NAA+2iP的培养皿上，用封口膜封好，将接种好的培养皿放在黑暗中，进行预培养，将愈伤组织接种在培养皿放在黑暗中5℃的条件下，分别进行预培养2天。
步骤S2、PVS2作为低温保护剂进行装载、脱水、玻璃化。
提前配制加载介质的培养皿为MS basal saltmixture5(M5242)2.165g/L、甘油184.2g/L、蔗糖205.4g/L、MS-G625ml和MS-vitamins610ml，其中MS-G6和MS-vitamins6。将预培养的愈伤组织转移到加载介质的培养皿中，让愈伤组织浸泡二十分钟，二十分钟后用取出愈伤组织，用冷冻(0℃)过的PVS2玻璃化溶液替代，将愈伤组织置于PVS2溶液中，置于冰上十五分钟；十五分钟后，用镊子将4～5个愈伤组织放在无菌的箔条上(0.5*15mm)。不需要从铝箔上去除多余的PVS2，立即将箔条插入含有液氮的浅容器中。
步骤S3、PVS2处理后愈伤组织的复温。
一旦盖子受热到可以打开，立即从低温瓶中取出冰冻的箔条。将箔条浸入1.2M蔗糖+1/2MS培养基中浸泡二十分钟，十分钟后换新的溶液，一旦加热到愈伤组织脱落，立即从介质中移除箔条。二十分钟后，将组织转移到含有Gamborg B5基本培养基+NAA+2iP的新培养皿中，将培养皿用铝箔包起来(防止暴露在光线下)，放置在生长室24小时。
步骤S4、PVS2处理后愈伤组织的恢复。
24小时后，将组织头移入含有Gamborg B5基本培养基+NAA+2iP的新培养皿中，用锡纸包起来，将培养皿放置在生长室四天，然后取下箔纸，在昏暗的灯光下再放置五天，五天之后，移至全光，将组织放在培养皿中，直到其生长超过培养皿的空间，然后将其移至含有Gamborg+NAA+2iP的培养皿中。
步骤S5、将恢复后的愈伤组织接入培养基进行初代培养及扩繁。
愈伤组织超低温保存的方法通过正交实验确定，以B5培养基为基本培养基，对预培养时间、装载时间和PVS2处理时间共3种成分进行3个水平的设计，再通过正交实验设计开展实验，统计愈伤成活率，各水平实验设置如表1所示。
表1确定愈伤组织超低温保存的正交实验各处理时间
表2品种8N1279愈伤组织超低温保存的正交实验数据
由实验数据可知，品种8N1279在预培养时间为水平3，装载时间及PVS2处理时间为水平2时，成活率为最佳；在预培养时间为水平1，装载时间及PVS2处理时间为水平1时，成活率为最差。
表3品种T141愈伤组织超低温保存的正交实验数据
由实验数据可知，品种T141在预培养时间为水平3，装载时间及PVS2处理时间为水平3时，成活率为最佳；在预培养时间为水平1，装载时间及PVS2处理时间为水平1时，成活率为最差。
表4品种T167愈伤组织超低温保存的正交实验数据
由实验数据可知，品种T167在预培养时间为水平3，装载时间及PVS2处理时间为水平2时，成活率为最佳；在预培养时间为水平2，装载时间及PVS2处理时间为水平1时，成活率为最差。
表5愈伤组织超低温保存的正交实验数据
通过对表2、表3和表4的汇总，得出不同处理时间各个品种存活率的平均值，将实验数据整理如表5所示。可以得出当预培养时间为水平3、装载及PVS2处理时间为水平3时平均成活率为最佳；当预培养时间为水平1、装载及PVS2处理时间为水平3时平均成活率为最差。
在本发明中，图1是本发明实施例提供的正交实验分析的主效应图。图2是本发明实施例提供的传统的方法与本发明方法对比图。图中：A，传统的茎尖方法效果图；B本发明的愈伤组织途径效果图。
以下是传统的茎尖方法与本发明方法对比表格。
以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种大蒜愈伤组织超低温保存的方法，其特征在于，所述大蒜愈伤组织超低温保存的方法包括：
步骤一、取长势好的愈伤组织进行预培养；
步骤二、对低温保护剂进行装载、脱水、玻璃化；
步骤三、低温保护剂处理后愈伤组织的复温；
步骤四、低温保护剂处理后愈伤组织的恢复；
步骤五、将恢复后的愈伤组织接入培养基进行初代培养及扩繁：
所述步骤一具体为取长势较好的愈伤组织接入在含有Gamborg B5基础培养基+NAA+2iP的培养皿上，接种好的培养皿放在黑暗中，进行预培养，具体包括：
步骤1、配置含2iP和NAA的Gamborg B5培养皿：所述培养皿含有Gamborg B5 basalmedium 3.21 g/L、2iP 0.05mg/L、NAA 0.01mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L；
步骤2、接种：将愈伤组织接种在培养皿放在黑暗中5℃的条件下，分别进行预培养2天；
所述步骤二以PVS2作为低温保护剂进行装载、脱水、玻璃化，具体包括：
步骤S21、装载：将预培养的愈伤组织转移到加载介质的培养皿中，浸泡20~30分钟；所述加载介质的培养皿为MS 2.165g/L、甘油184.2g/L、蔗糖205.4g/L、MS-G6 25ml和MS-vitamins6 10ml；所述 MS-G6溶液由硫胺素0.08g/L、肌醇20g/L 配制；MS-vitamins6溶液由甘氨酸0.2g/L、肌醇10g/L、烟酸0.05g/L、盐酸吡哆醇0.05g/L和硫胺素 0.01g/L配制；
步骤S22、脱水：20~30分钟后取出愈伤组织，用0℃冷冻过的PVS2玻璃化溶液替代，将愈伤组织置于PVS2溶液中，置于冰上15~20分钟；
步骤S23、玻璃化：15~20分钟后，将4~5个愈伤组织放在无菌的箔条上；将箔条插入含有液氮的浅容器中；
所述步骤三具体包括：将箔条浸入1.2M蔗糖+1/2MS培养基中浸泡二十分钟，十分钟后换新的溶液，加热到愈伤组织脱落，从介质中移除箔条；二十分钟后，将组织转移到含有Gamborg B5基本培养基+NAA+2iP的新培养皿中，将培养皿用铝箔包裹，放置在生长室24小时；
所述步骤四具体包括：24小时后，将组织移入含有Gamborg B5基本培养基+NAA+2iP的新培养皿中，用锡纸包裹，将培养皿放置在生长室四天，然后取下箔纸，在昏暗的灯光下再放置五天，五天后，移至全光，将组织放在培养皿中，直到生长超过培养皿的空间，然后移至含有Gamborg B5+NAA+2iP的培养皿中。
2.如权利要求1所述的大蒜愈伤组织超低温保存的方法，其特征在于，所述2iP保存在零下20℃冻存，并分装。
CN202010396058.8A 2020-05-12 2020-05-12 一种大蒜愈伤组织超低温保存的方法及超低温保存设备 Active CN111387058B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010396058.8A CN111387058B (zh) 2020-05-12 2020-05-12 一种大蒜愈伤组织超低温保存的方法及超低温保存设备

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010396058.8A CN111387058B (zh) 2020-05-12 2020-05-12 一种大蒜愈伤组织超低温保存的方法及超低温保存设备

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111387058A CN111387058A (zh) 2020-07-10
CN111387058B true CN111387058B (zh) 2025-12-19

Family

ID=71411982

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010396058.8A Active CN111387058B (zh) 2020-05-12 2020-05-12 一种大蒜愈伤组织超低温保存的方法及超低温保存设备

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111387058B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109644874A (zh) * 2019-02-13 2019-04-19 广西壮族自治区药用植物园 绣线菊超低温保存培养方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101068971B1 (ko) * 2007-09-21 2011-09-30 주식회사 운화 분열지연중심부 유래 식물줄기세포주 및 이의 분리방법
KR20100110525A (ko) * 2009-04-03 2010-10-13 대한민국(농촌진흥청장) 국화 신초의 초저온동결보존방법 및 재생 방법
CN102094051A (zh) * 2009-12-11 2011-06-15 北京科力斯生物科技有限公司 从大蒜中提取蒜氨酸的方法
JP5867912B2 (ja) * 2011-05-11 2016-02-24 国立大学法人福井大学 細胞の凍結保存液および凍結保存方法
CN103070163B (zh) * 2013-01-30 2014-01-29 云南农业大学 云南大百合原生质体超低温保存方法及活性鉴定方法
CN104255711B (zh) * 2014-09-15 2016-03-09 上海交通大学 一种提高百合胚性愈伤组织保存效果的方法
CN104255709B (zh) * 2014-09-15 2016-03-02 上海交通大学 一种提高百子莲胚性愈伤组织保存效果的方法
CN106069174A (zh) * 2016-08-30 2016-11-09 济南市农业科学研究院 一种使用种子带的大葱育苗方法
CN106613976B (zh) * 2016-12-16 2019-02-05 天津师范大学 一种用大蒜花序轴进行脱毒快繁的方法及应用
CN109526743B (zh) * 2018-12-28 2021-04-06 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 大蒜愈伤组织快繁和良种繁育方法
CN110432148A (zh) * 2019-09-03 2019-11-12 南通大学 延长胡萝卜愈伤组织保存期的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109644874A (zh) * 2019-02-13 2019-04-19 广西壮族自治区药用植物园 绣线菊超低温保存培养方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111387058A (zh) 2020-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Withers Freeze preservation of somatic embryos and clonal plantlets of carrot (Daucus carota L)
Kartha et al. In vitro growth responses and plant regeneration from cryopreserved meristems of cassava (Manihot esculenta Crantz)
Kartha et al. Freeze-preservation of pea meristems in liquid nitrogen and subsequent plant regeneration
Brison et al. Cryopreservation of in vitro grown shoot tips of two interspecific Prunus rootstocks
Martinez et al. Cryopreservation of in vitro-grown shoot-tips of hop (Humulus lupulus L.) using encapsulation/dehydration
Zhao et al. Cryopreservation of axillary buds of grape (Vitis vinifera) in vitro plantlets
CN102379281A (zh) 一种香石竹的超低温保存方法以及再培养方法
Huang et al. Plant regeneration from rice (Oryza sativa L.) embryogenic suspension cells cryopreserved by vitrification
KR20100110525A (ko) 국화 신초의 초저온동결보존방법 및 재생 방법
Thammasiri Cryopreservation of some Thai orchid species
CN108040882A (zh) 一种大蒜试管苗的诱导方法
CN111387058B (zh) 一种大蒜愈伤组织超低温保存的方法及超低温保存设备
CN104304238A (zh) 毛葡萄茎尖的包埋干燥超低温保存方法
Bekheet In vitro preservation of Asparagus officinalis
Bajaj Casava plants from meristem cultures freeze-preserved for three years
CN106818714A (zh) 越橘植物种质的超低温保存方法
Yamada et al. Cryopreservation of apical meristems of white clover (Trifolium repens L.)
CN107853291B (zh) 一种莪术茎尖玻璃化超低温保存及解冻方法
AU2021101536A4 (en) A method and equipment for cryopreservation of garlic callus
CN104255711B (zh) 一种提高百合胚性愈伤组织保存效果的方法
CN108371179B (zh) 一种金银忍冬茎尖超低温保存方法
CN110432148A (zh) 延长胡萝卜愈伤组织保存期的方法
Pornchuti et al. Cryopreservation of Protocorms of Dendrobium cariniferum Rchb. f.
Ping et al. Development of a PVS2 droplet-vitrification cryopreservation technique for Aranda Broga Blue orchid protocorm-like bodies (PLBS)
CN112655561B (zh) 一种红芽芋试管苗离体保存的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant