RU2445365C1 - Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus - продуцент моноклональных антител, специфичных к протеину с человека (варианты) - Google Patents
Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus - продуцент моноклональных антител, специфичных к протеину с человека (варианты) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2445365C1 RU2445365C1 RU2010145028/10A RU2010145028A RU2445365C1 RU 2445365 C1 RU2445365 C1 RU 2445365C1 RU 2010145028/10 A RU2010145028/10 A RU 2010145028/10A RU 2010145028 A RU2010145028 A RU 2010145028A RU 2445365 C1 RU2445365 C1 RU 2445365C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- rhpc
- human protein
- antibodies
- monoclonal antibodies
- Prior art date
Links
- 101500025568 Homo sapiens Saposin-D Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 229940100689 human protein c Drugs 0.000 title claims abstract description 28
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 title abstract description 8
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 title description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 5
- 101000658081 Mus musculus U2 small nuclear ribonucleoprotein auxiliary factor 35 kDa subunit-related protein 1 Proteins 0.000 claims 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 7
- 241001529936 Murinae Species 0.000 abstract description 2
- 238000012443 analytical study Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 abstract 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 51
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 48
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 48
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 30
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 13
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 108010008250 drotrecogin alfa activated Proteins 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 9
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 9
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 7
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 7
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 7
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 5
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 5
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 5
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 4
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 3
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 201000005660 Protein C Deficiency Diseases 0.000 description 3
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 3
- 229930194936 Tylosin Natural products 0.000 description 3
- 239000004182 Tylosin Substances 0.000 description 3
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 3
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 3
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 3
- 208000013746 hereditary thrombophilia due to congenital protein C deficiency Diseases 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- WBPYTXDJUQJLPQ-VMXQISHHSA-N tylosin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)O[C@H]([C@@H]([C@H]1N(C)C)O)O[C@@H]1[C@@H](C)[C@H](O)CC(=O)O[C@@H]([C@H](/C=C(\C)/C=C/C(=O)[C@H](C)C[C@@H]1CC=O)CO[C@H]1[C@@H]([C@H](OC)[C@H](O)[C@@H](C)O1)OC)CC)[C@H]1C[C@@](C)(O)[C@@H](O)[C@H](C)O1 WBPYTXDJUQJLPQ-VMXQISHHSA-N 0.000 description 3
- 229960004059 tylosin Drugs 0.000 description 3
- 235000019375 tylosin Nutrition 0.000 description 3
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 3
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 3
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100026966 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 108091005605 Vitamin K-dependent proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 230000003462 zymogenic effect Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800001401 Activation peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000069 Activation peptide Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229940105774 coagulation factor ix Drugs 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000002826 coolant Substances 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 201000005380 purpura fulminans Diseases 0.000 description 1
- 230000020964 regulation of blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- JJGWLCLUQNFDIS-GTSONSFRSA-M sodium;1-[6-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]hexanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)CCCCCNC(=O)CCCC[C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1 JJGWLCLUQNFDIS-GTSONSFRSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009424 thromboembolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 1
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000034365 zymogen activation Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и биофармакологии и предоставляет штаммы гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus Sp2/0-BC/rhPC-4F10, Sp2/0-BC/rhPC-1C6, Sp2/0-BC/rhPC-3H6, - продуценты моноклональных антител, специфичных к протеину С человека. Штаммы депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетика под номерами (ВКПМ Н-110), (ВКПМ Н-111), (ВКПМ Н-112), соответственно. Антитела относятся к иммуноглобулинам класса G мыши, специфичным к hPROC и обладающим низкой кросс-реактивностью, избирательно связываются с протеином С человека и образуют стабильный комплекс. Антитела по изобретению могут быть использованы для фармацевтических и биомедицинских аналитических исследований, в частности для количественного обнаружения рекомбинантного фактора С человека. 1 ил., 4 табл., 4 пр.
Description
Область техники.
Изобретение относится к области биотехнологии и биофармакологии, а именно к технологии получения моноклональных антител (МКА) методами клеточной гибридизации, точнее к методам получения МКА, специфичных к протеину С человека (hPROC), с использованием штаммов гибридных культивируемых клеток Mus musculus и создания на основе этих МКА иммуноаффинных реагентов для количественного определения протеина С человека в кондиционированной культуральной жидкости линий-продуцентов рекомбинантного протеина С (rhPROC) и в других растворах, в том числе в плазме крови.
Предшествующий уровень техники.
Протеин С является витамин К-зависимым белком плазмы крови. Он входит в систему гемостаза и играет исключительно важную роль при регулировании свертывания крови. Протеин С синтезируется в виде неактивной молекулы предшественника, проходит многостадийный посттрансляционный процессинг в клеточных компартментах и секретируется в виде интактной (зимогенной) формы. Активация протеина С происходит в кровотоке при участии тромбомодулин-тромбинового комплекса. Активированный протеин С вместе с кофактором - протеином S выполняет антикоагулянтную функцию. Активированный протеин С может предотвращать внутрисосудистый тромбоз и подавлять рост имеющихся тромбов. Механизм действия активированного протеина С и механизм активации зимогена в активную протеазу изложен в работе Esmon Т. Charles ("Protein-C: biochemistry, physiology, and clinical implications" Blood, 1984, Vol.62(6) - P.1155-8).
Активация протеина С непосредственно осуществляется тромбином, последней сериновой протеиназой каскада свертывания крови и опосредована связанным с мембраной эндотелиальных клеток гликопротеином тромбомодулин. Тромбомодулин образует прочный нековалентный комплекс состава 1:1 с тромбином и полностью меняет функциональные свойства тромбина. Свободный тромбин в нормальных условиях активирует тромбоциты, конвертирует фибриноген до фибрина и факторы свертывания крови V и VIII до активных формы Va и VIIIa. В то же время тромбин в комплексе с тромбомодулином теряет все вышеуказанные свойства, но эффективно активирует интактный протеин С при физиологических концентрациях ионов кальция.
Активированный протеин C, в свою очередь, избирательно инактивирует активированные формы факторов свертываемости крови V и VIII, но не их исходные формы.
Следует отметить, что основные события при запуске каскада свертывания крови происходят на поверхности клеток и требуют участия мембранно-связанных белков и фосфолипидов, в то время как факторы V и VIII свободно циркулируют в кровотоке и участвуют в петле положительной обратной связи при работе системы свертывания. При их активации тромбином они ускоряют активацию фактора X и протромбина на 5 порядков и резко ускоряют генерацию тромбина в месте запуска каскада свертывания.
Таким образом, физиологическая роль активированного протеина С может быть описана как ограничение области запуска системы свертывания крови.
Основным кофактором активированного протеина С является протеин S, другой витамин K - зависимый белок плазмы крови. Протеин S более чем в 10 раз усиливает вызываемую активированным протеином C деградацию факторов Va и VIIIa.
Протеин С является важным терапевтическим агентом (EP 215549, EP 0191606) в качестве специфического антикоагулянта, имеющего потенциально более широкую область применения, чем традиционные антикоагулянты гепарин, варфарин (оксикумарин) или производные последнего. В отличие от традиционных антикоагулянтов активированный или интактный протеин С не воздействует на систему свертывания крови до момента появления тромбина и не вызывает падения концентрации зимогенных белков системы свертывания. Вследствие этого антикоагулянтная терапия протеином С потенциально является более безопасной, поскольку не вызывает постоянного риска возникновения кровотечений. Экзогенный интактный протеин С также может использоваться для заместительной терапии при наследственном дефиците протеина С, вызывающего смерть в младенческом возрасте при гомозиготном дефиците и частые тромбоэмболические состояния при гетерозиготной форме дефицита.
Основной областью клинического применения активированного протеина С являются опасные для жизни тромботические состояния, в первую очередь синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдром), возникающий в том числе при развитии острого сепсиса.
Активированный протеин С является маркером сепсиса, а его уровень и дефицит коррелируют с тяжестью течения заболевания. Так, дефицит протеина С наблюдается более чем у 85% больных с тяжелым сепсисом; а также дефицит протеина С коррелирует с неблагоприятными клиническими исходами, такими как септический шок (тяжелый сепсис, сопровождающийся развитием артериальной гипотонии), ДВС-синдромом и полиогранной недостаточностью.
Поскольку концентрация протеина C в плазме крови очень мала и его отделение от других витамин K-зависимых белков системы гемостаза представляется весьма затруднительным, единственным способом получения активированного протеина C для медицинского применения является биосинтез, активация и очистка рекомбинантного белка. Создание аналитических систем для количественного определения протеина С является важным элементом как промышленных решений этой задачи для биотехнологического производства, так и для клинического применения получаемых фармпрепаратов протеина C и сопутствующей диагностики коагулопатий. Одним из важных методов определения природного или рекомбинантного протеина C в биомедицинских приложениях является использование МКА, продуцируемых гибридомами, отобранных таким образом, что секретируемые иммуноглобулины не кросс-реактивны.
Известно применение моноклональных антител к фактору протеину C, описанное в патенте США 5549893 (Johann Eibl et al; "Use of protein С in the treatment of purpura fulminans"; 1995), при этом патент защищает терапевтическое применение активированного и интактного протеина С природного происхождения.
Применение конформацинно-зависимых антител для очистки и активации протеина С является объектом защиты в патенте США 4981952 (Betty Yan S.; "Method for the purification of vitamin K-dependent proteins", 1989), однако применяемое технологическое решение основано на серии последовательных раундов хроматографической очистки протеина С, где основой иммуноаффинного сорбента являются МКА, аффинность которых блокируется ионами кальция, что оставляет значительный потенциал для оптимизации технологического процесса. Известно применение конформационно-зависимых антител для анализа биологической активности и разделения модифицированных форм протеина С. Для таких целей могут быть использованы антитела хелатор-зависимой аффинности (патент США 5549893; Ohsawa K. et al. Purification of sufficiently gamma-carboxylated recombinant protein С and its derivatives. Calcium-dependent affinity shift in immunoaffinity and ion-exchange chromatography. // J Chromatography - 1992 - Vol.597(l-2) P.285-91) и кальцийзависимой аффинности (Stearns D.J. et al. The interaction of a Ca2+-dependent monoclonal antibody with the protein С activation peptide region. Evidence for obligatory Ca2+binding to both antigen and antibody. // Biol Chem- 1988 - Vol.263(2) P.826-32; Nakamura S., Sakata Y. Immunoaffinity purification of protein С by using conformation-specific monoclonal antibodies to protein C-calcium ion complex. // Biochim Biophys Acta. Biochim Biophys Acta - 1987 - Vol.925(2) P.85-93; Wakabayashi K. Conformation-specific monoclonal antibodies to the calcium-induced structure of protein C. // J Biol Chem - 1986 - Vol.261(24) P.11097-105; Tharakan J.P. Effect of feed flow rate, antigen concentration and antibody density on immunoaffinity purification of coagulation factor IX. // J Chromatography - 1990 - Vol.522 - P.153-62).
Моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами, также используются как инструмент для получения деплетированной по протеину С плазмы человека, используемой в качестве реактива для коагулометрической диагностики. Дефицит соответствующей природной плазмы обусловлен чрезвычайной редкостью врожденных генетических коагулопатий типа PROC-, встречающихся в 1 случае из миллиона.
Существует широкий спектр возможностей для дальнейшего усовершенствования известных решений по количественному определению протеина C человека и его рекомбинантных вариантов. Возможность такого усовершенствования обусловлена тем, что при отборе клонов гибридом, продуцирующих различные МКА к протеину C, можно учитывать влияние различных факторов на ход определения протеина C и проводить отбор клонов по чувствительности или резистентности к действию этих факторов. Примерами таких факторов может быть присутствие в анализируемой смеси других витамин К-зависимых белков плазмы, протеина C крупного рогатого скота, разное соотношение интактной и активированной формы протеина C, доля протеина C в комплексе с протеином S, концентрация продуктов инактивации активированного протеина C и т.д.
Подробное описание настоящего изобретения
Технической задачей, решаемой авторами, являлось получение высокоаффинных не кросс-реактивных антител к протеину C человека, применимых для фармацевтических и биомедицинских аналитических исследований, в частности количественного обнаружения рекомбинантного фактора C человека (rhPROC).
Технический результат достигался путем создания новых штаммов гибридных культивируемых клеток Sp2/0-BC/rhPC-4F10, Sp2/0-BC/rhPC-lC6, Sp2/0-BC/rhPC-3H6, секретирующих моноклональные антитела к протеину С человека и создания на их основе иммуноаффинных реагентов для количественного анализа протеина С человека (hPROC) и его рекомбинантных вариантов (rhAPC). Полученные штаммы депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ФГУП ГосНИИГенетика 17 сентября 2010 г. под регистрационными номерами H-110, H-111 и H-112, соответственно.
Основным методическим подходом к созданию штаммов клеточных линий, продуцирующих моноклональные антитела, является клонирование гибридных культивируемых клеток - гибридом. Гибридомы согласно настоящему изобретению получают слиянием несекретирующих клеток миеломы мыши (Mus musculus) и антителпродуцирующих В-лимфоцитов в присутствии полиэтиленгликоля. Клетки миеломы дефицитны по гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазе (HGPRT) или тимидинкиназе (ТК). Таким образом, они не могут выжить при культивации в среде, содержащей HAT (гипоксантин, аминоптерин и тимидин). В то же время, любые не слитые В-лимфоциты селезенки сами по себе не стабильны в культуре более 3 дней. Часть гибридных клеток B-лимфоцитов и миеломы, получивших соответствующие хромосомы родительских клеток, обладает стабильностью в селективной среде, содержащей HAT. Такие клетки могут культивироваться продолжительное время и продуцировать потенциально неограниченное количество антител.
Супернатанты культуры гибридом анализируются на наличие целевых антител методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA). Затем отобранные гибридомы клонируются для того, чтобы получить субклоны, продуцирующие антитела, не обладающие кросс-реактивностью в аналитических тестах. Для этого применяется непрямой ИФА таким образом, что каждое из отобранных антител попарно сравнивается другими как в качестве адсорбированного на поверхности иммунопланшета, так и связывающегося из раствора с антигеном, уже связавшимся с другими адсорбированными антителами. Отобранные продуценты моноклональных антитела могут быть масштабированы in vivo в виде асцита мыши или in vitro в суспензионной культуре (Pepper S.D. Selection antibodies for immunoaffinity chromatography // Methods in molecular biology ed. by Kenney A. and Fowell S. - 1992 - Vol.11 - P.136-171).
Термин «моноклональное антитело» означает антитело, искусственно получаемое из клеточного клона и поэтому содержащее только один тип иммуноглобулина.
Антитело, специфичное к белку "протеин C человека", означает молекулу, которая селективно, избирательно связывается с протеином C человека и образует стабильный комплекс. Стабильным комплексом является комплекс, в котором связывание между партнерами происходит на период времени, достаточный для того, чтобы произвести детектирование указанного комплекса. Термин "селективно связывается с протеином C человека" означает способность указанной молекулы предпочтительно связываться с протеином C человека в отличие от связывания с белками, не имеющими отношения к протеину C человека, или связывания с небелковыми компонентами, присутствующими в образце. Антителом, которое предпочтительно связывается с протеином C человека, является антитело, которое связывается с протеином C человека, но не связывается в существенной степени с другими молекулами или компонентами, которые могут присутствовать в образце. Существенное связывание предполагает, например, связывание антитела, связывающегося с ротеином C человека, с молекулой, не являющейся протеином C человека, с аффиностью или силой, достаточной для того, чтобы помешать способности антитела, связывающегося с протеином C человека.
Способность антитела к связыванию с антигеном может быть определена специалистом в данной области с использованием методов, включающих, но не ограничивающихся методами ELISA и равновесного диализа. Методы определения аффинности и силы связывания хорошо известны специалисту в данной области техники и подробно описаны, например, Janeway и др. (Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Publishing Company, 1996)).
Методика иммунизации. Штаммы гибридомы получают путем иммунизации мышей линии BALB/c рекомбинантным протеином C человека в течение 49 суток. На третьи сутки после последней бустер-инъекции проводят гибридизацию спленоцитов иммуннизированных мышей (1.2×108 клеток) с клетками мышиной миеломы Sp2/0-Agl4 (3×107 клеток). В качестве агента для слияния применяют полиэтиленгликоль с молекулярным весом 1450 (Sigma, Германия). После гибридизации проводят селекцию, скрининг, клонирование и криоконсервацию гибридомы.
Морфологическая характеристика полученных штаммов гибридомы. Культура гибридных клеток состоит из слабоприкрепленных к подложке округлых клеток с размером с исходную миеломную клетку.
Культуральные свойства. Культивирование штаммов гибридом Sp2/0-BC/rhPC-4F10, Sp2/0-BC/rhPC-3H6 и Sp2/0-BC/rhPC-lC6 ведут раздельно, не допуская кросс-контаминации, при температуре 37°C в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI-1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 8 мкг/мл тилозина. Клетки культивируют в виде стационарной суспензии в вентилируемых пластиковых флаконах с адгезионной поверхностью площадью 25 см2 и рабочим объемом среды 5-10 мл. Пассирование клеток гибридомы проводят 3 раза в неделю с кратностью разведения 1:4-1:6. Посевная концентрация клеток составляет 3×105 в 1 мл среды. Максимальная концентрация гибридных клеток при культивировании составляет 1,2×106 на 1 мл среды. Гибридный клон не теряет способности синтеза антител при 12 последовательных пассажах in vitro.
Культивирование гибридомы в организме животного. Вид животного - инбредные мыши линии BALB/c. Доза клеток при прививке составляет 2×106 клеток в 0,5 мл фосфатно-солевого буферного раствора на одну мышь при первичном введении. За 1 сутки до введения клеток гибридомы мышам внутрибрюшинно вводят 1 мл неполного адъюванта Фрейнда.
Иммуноасцитическая жидкость образуется на 12-16 сутки в объеме 3-5 мл. Количественное определение иммуноглобулина, продуцируемого гибридомой, производят методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА).
Характеристика полезного продукта. Гибридомы Sp2/0-BC/rhPC-4F10, Sp2/0-BC/rhPC-3H6 и Sp2/0-BC/rhPC-lC6 продуцируют специфичные моноклональные антитела к hPROC, титр которых составляет в культуральной жидкости (КЖ) около 1:90000, в иммуноасцитической жидкости (ИАЖ) не менее 1:200000. Моноклональные антитела из КЖ и ИАЖ выделяют с помощью дробного осаждения сульфатом аммония с последующей аффинной хроматографией на протеин A- или протеин G-сефарозе. Гомогенность выделенных антител проверяется с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Принадлежность к классу иммуноглобулинов G определяется по иммуноферментному анализу класс-специфическими антивидовыми антителами.
Продуктивность штаммов. Продукция МКА в среде культивирования составляет 20-50 мкг/мл при времени культивирования 72 ч и посевной концентрации гибридомы 0,3 млн кл/мл; в асцитической жидкости - 2-4 мг/мл. Продукция МКА в культуральной жидкости сохраняется на протяжении 12 последовательных пассажей и воспроизводится при прививании в виде асцитных опухолей на мышах.
Контаминация штамма. Контаминанты гибридных линий, включая бактерии и грибы (определение методом прямого посева на питательные среды LB и Сабуро-Эммонса), не обнаружены; микоплазма по ПЦР и флуоресцентному анализу не обнаружена; вирусы - нет данных.
Криоконсервация производится аликвотами ресуспендированных клеток по 3×106 клеток/мл. Ампулы содержат 1,0 мл криозащитной среды, содержащей эмбриональной телячьей сыворотки - 90%, диметилсульфоксида - 10%.
Режим криоконсервации и отогрева. Гибридные клетки вносят в криоампулы, помещают в специальный контейнер с теплоносителем изопенталом и оставляют в низкотемпературном морозильнике на 3-4 часа. По достижении температуры минус 70°C криоампулы переносят в жидкий азот. Размораживание проводят быстро на водяной бане при температуре +37°C. Жизнеспособность восстанавливаемых гибридом после криоконсервации составляет 80-90%.
Полезным продуктом являются штаммы гибридом и продуцируемые ими моноклональные антитела, относящиеся к классу IgG иммуноглобулинов мыши, специфичные к hPROC и обладающие низкой кросс-реактивностью. Особенности полученных моноклональных антител (МКА) и результаты их практического применения изобретения приведены на следующих фигурах.
Краткое описание рисунков
На Фиг.1 показано определение rhAPC твердофазным ИФА с использованием пар МКА 3H6 + IC6 и 4B12 + 4F10.
Практическая применимость заявляемого изобретения иллюстрируется следующими примерами, не ограничивающими каким-либо образом рамки настоящего изобретения.
Пример 1. Получение гибридомы.
Иммунизация.
Мышей линии BALB/c возраста 8-10 недель в количестве 8 штук иммунизируют rhAPC по схеме:
- внутрибрюшинное введение мышам 200 мкг rhAPC в полном адъюванте Фрейнда;
- через 21 сутки повторное введение мышам 500 мкг rhAPC в неполном адъюванте Фрейнда;
- через 35 суток внутривенная инъекция мышам 500 мкг rhAPC в неполном адъюванте Фрейнда;
- через 42 суток отбор образцов крови из орбитального синуса, определение животных с наилучшим титром антител к протеину C в сыворотке по ИФА;
- выбранным животным еще через 7 суток производится бустерная внутривенная инъекция 200 мкг rhAPC в физиологическом растворе;
- через 7 суток содержания бустированных мышей производится повторный отбор образцов крови из орбитального синуса на ИФА. Производится финальное бустирование животного с максимальным титром антител к rhAPC: внутривенная инъекция 200 мкг rhAPC в физиологическом растворе.
Через 3 дня после повторного бустирования производится сравнение титров поликлональных антител в сыворотке бустированных животных. Титры, то есть разведения сыворотки, при которых OD450=l составили для бустированного животного №1 1/82500, №2 1/19000, №3 1/615000. Для слияния первичной культуры спленоцитов с клетками миеломы Sp2/0-Agl4 выбрали животное №3.
Гибридизация.
Через 3 суток после последней внутривенной инъекции животных убивают цервикальной дислокацией, асептически извлекают селезенку и проводят гибридизацию спленоцитов иммунных мышей (1.2×108 клеток) с клетками мышиной миеломы Sp2/0-Agl4 (3×107 клеток) в присутствии 1 мл 50% раствора полиэтиленгликоля (Sigma) с молекулярным весом 1450 в течение 1 минуты. Затем в течение 15 минут последовательными двойными разведениями доводят объем до 16 мл, добавляя по каплям безсывороточную среду RPMI-1640. Разведенную гибридизационную суспензию инкубируют 1 час при 37°C в 150 мл полной среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки.
Селекция.
После инкубации клетки высевают на 96-луночные планшеты на слой культивируемых перитонеальных макрофагов, взятых у мышей линии BALB/c. Селекцию гибридных клеток проводят на селективной в среде с системой HAT (10 мМ гипоксантина, 40 мкМ аминоптерина, 1,6 мМ тимидина). Через 14 суток из состава среды убирают аминоптерин. В последующем культивирование проводят на среде A-DMEM/F-12 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/L-глутамина, 8 мкг/мл тилозина.
Оценка продуктивности первичных пулов.
Для отбора положительных первичных пулов, продуцирующих МКА, используют прямой ИФА. Для проведения ИФА в лунки 96-луночного полистиролового планшета для ИФА вносят по 100 нг rhAPC в фосфатно-солевом буферном растворе (ФБР; рН=7.4; КН2РO4 1,7 мМ, Na2HPO4 5,2 мМ, NaCl 150 мМ) в объеме 100 мкл и затем выдерживают при температуре 6°C в течение 16 ч. Лунки планшета трижды отмывают фосфатно-солевым буферным раствором, содержащим 0,05% Твин-20 (ФБР-Тв). Вносят в лунки по 300 мкл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина в ФБР (1% БСА) и инкубируют при температуре 37°C в течение 60 мин. Три раза промывают лунки ФБР-Тв и вносят в лунки супернатант культуральной жидкости в объеме 100 мкл, при необходимости делая разведения в 1% БСА. Планшет инкубируют при температуре 37°C в течение 1 часа. После этого лунки планшета трижды отмывают раствором ФБР-Тв и добавляют в лунки антитела против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой хрена в рабочем разведении 1/3500. Планшет инкубируют при температуре 37°C в течение 60 минут, затем 5 раз отмывают лунки раствором ФБР-Тв. Положительную реакцию оценивают по развитию желто-коричневого окрашивания при добавлении хромогенного субстрата ТМБ (4 мкл 30% Н2O2, 4 мг 3,3',5,5-тетраметилбензидина на 100 мл 0,1 M натрий-цитратного буфера рН 5,0). Реакцию останавливают добавлением в лунки по 100 мкл 5% раствора Н3РO4. Измеряют оптическую плотность при длине волны λ=450 нм (OD450). Строят калибровочную кривую зависимости OD450 от концентрации заранее охарактеризованных антител к hPROC в диапазоне линейной чувствительности метода. Определяют титр исследуемых антител и аффинность проб.
По результатам прямого ИФА первичных пулов гибридом максимальный сигнал поликлональной колонии в ИФА составил OD450=3,304, 6 образцов имели сигнал OD450>2.0, при этом верхний 5% процентиль покрывал диапазон активности OD450=3,304-0,150. Для масштабирования было отобрано 48 колоний (т.е. лунок) с сигналом на ИФА OD450>0,100.
Отобранные для масштабирования 48 поликлональных пулов в течение следующих 10 дней были масштабированы до культивационного объема 5 мл. Масштабированные до культивационного объема 5 мл колонии были тестированы на производство поликлональных антител к протеину C в двух последовательных тестах прямого ИФА с интервалом в 48 часов. Результаты представлены в Таблице 1.
Для дальнейшего клонирования были отобраны 4 первичных клона с максимальным сигналом на ИФА (OD450 от 0,257 до 2,265).
Пример 2. Клонирование и селекция, моноклональных гибридом секретирующих протеин C специфичные антитела.
Клонирование гибридных клеток проводили методом серийных разведений в 96-луночных планшетах на слое перитонеальных макрофагов из расчета 104 клеток на первую лунку и последующих двукратных разведений в вертикальном ряду, а затем в горизонтальных рядах. Детекцию МКА в лунках проводили прямым ИФА, как описано выше.
Культивирование клонов гибридомы вели при температуре 37°C в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI-1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/L-глутамина, 8 мкг/мл тилозина.
Клоны гибридомы криоконсервировали в среде замораживания, состоящей из 90% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% диметилсульфоксида по 1-3 млн клеток/мл. Процедура замораживания описана выше.
Отобранные по методике, описанной в примере 1, клеточные пулы с максимальным уровнем продукции антител были клонированы в предельных разведениях, было использовано по пять 96-луночных планшетов на 1 пул. Через 8 дней было обнаружено суммарно 23 лунки с одиночными колониями. Колонии были суспендированы пипетированием и пересажены в лунки 24-луночного планшета в культивационном объеме 1 мл/лунка.
Через 7 дней после пересева было зафиксировано 7 лунок, для которых сигнал в прямом ИФА превышал OD450=1 и сохранялся при последующей культивации колоний в среде, содержащей HAT. Результаты ИФА первичных клонов приведены в таблице 2.
Отобранные первичные клоны были масштабированы до объема 5 мл, часть клеток заморожена, остатки использованы для повторного клонирования, рассев проведен на 5 96-луночных планшетов для каждого клона.
Через 8 дней после повторного клонирования было обнаружено суммарно 12 лунок с одиночными колониями. В последующие 14 дней было проведено ступенчатое масштабирование до культивационного объема 10 мл и определено 7 жизнеспособных клонов.
Через 24 дня после второго клонирования было проведен прямой ИФА в присутствии ионов кальция и параллельный ИФА в присутствии ЭДТА для супернатантов клонов с временем культивирования 48 часов. Были зафиксированы 5 клонов второй генерации, продуцирующие МКА к протеину С человека с высоким титром и постоянным сигналом в присутствии и отсутствии ионов кальция (сигнал для ИФА с 2 мМ Са2+ OD450=2.165-1.571, сигнал с 2 мМ EDTA-Na >88%). Результаты ИФА представлены в таблице 3.
Масштабированные клоны гибридом второй генерации были криопрезервированы, выживаемость после разморозки составила не менее 60% по окраске трипановым синим.
Для выделения МКА с каждого конечного клона второй генерации было получено по 30 мл кондиционированной среды.
Пример 3. Выделение, очистка и биотинилирование МКА.
Для исследуемых 5 МКА проводили отделение глобулиновой фракции, аффинную хроматографическую очистку при помощи протеин G-сефарозы и обессоливание диализом. Для этого культуральную жидкость (48 ч культивирования) смешивали с насыщенным раствором сульфата аммония до 45% насыщения. Суспензию перемешивали и выдерживали 2 ч при температуре 4°C, а затем центрифугировали при 14500 м-1 в течение 20 мин. Удаляли супернатант, осадок растворяли в ФБР, 1/8 начального объема, отделяли осадок денатурированных белков повторным центрифугированием. Полученный супернатант повторно осаждали сульфатом аммония при насыщении 50%, осаждение-растворение повторяли дважды.
Хроматографическую очистку проводили при помощи колонки с протеин G-сефарозой (GE Life Sciences, США) по протоколу производителя. Для удаления аминосодержащих соединений нейтрализованный элюат с колонки концентрировали при помощи ультрафильтрации в центрифужных пробирках Vivaspin 500 3 кДа (Сарториус Стедим, Германия) до объема 75 мкл, концентраты диализовали против ФБР на мембране с отсечением по седиментационной массе 7000 Да в течение 24 ч при температуре 4°C. Было приготовлено 5 препаратов очищенных МКА, концентрация белка в растворах составила для МКА из Sp2/0-BC/rhPC-4F10 370 мкг/мл, Sp2/0-BC/rhPC-lC6 250 мкг/мл, Sp2/0-BC/rhPC-2F8 77 мкг/мл, Sp2/0-BC/rhPC-3H6 93 мкг/мл, Sp2/0-BC/rhPC-4B 12 239 мкг/мл, объем образцов 75 мкл. Степень концентрирования относительно исходной среды составила 400х.
Полученные растворы очищенных МКА были разделены на 2 аликвоты объемами 20 мкл и 55 мкл. Меньшая аликвота была использована для модификации сульфо-N-гидроксисукцинимидбиотином (Sulfo NHS-LC-biotin, Пирс, США) в молярном соотношении 1:100 в ФБР при рН 7.0. Реакцию проводили в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем терминировали добавлением раствора Трис-HCl рН 7.5 до 50 мМ.
Для определения сохранности аффинности МКА при выделении и конъюгации сравнивали образцы исходных кондиционированных сред в разведении 1/400, полученные препараты очищенных МКА в разведении 1/16000 (т.е. предположительно в одинаковой концентрации) и биотинилированные МКА в разведении 1/160000. Тестирование проводилось методом прямого ИФА по методике, приведенной в примере 1 с использованием конъюгата антивидовых антител с пероксидазой хрена (антимышь - ПХ) и конъюгата нейтравидина и пероксидазы хрена (Neu-ПХ, Pierce, США). Результаты представлены в таблице 4. По полученным данным был сделан вывод о том, что биотинилированные МКА применимы в качестве элемента аналитической системы только для клонов гибридом 4F10 и 1С6, при этом в качестве адсорбционных антител можно использовать МКА гибридом 1С6, 3H6 и 4B12. Полные названия соответствующих клонов гибридом: Sp2/0-BC/rhPC-4F10 и т.д.
Таким образом, возможный набор аналитических реагентов на основе полученных МКА к протеину C включает в себя биотинилированные МКА в качестве детекционного реагента и немодифицированные очищенные антитела для адсорбции антигена в непрямом тИФА анализе.
Пример 4. Определение чувствительности системы детекции протеина C на основе пар МКА.
Определение чувствительности прототипов системы детекции протеина C, то есть пар МКА, проводили при помощи непрямого ИФА по схеме "сендвич". Для этого в лунки 96-луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа наносили "адсорбционные" антитела в ФБР в концентрации 4 мкг/мл, по 100 мкл на лунку и выдерживали при температуре 4°C в течение 16 часов. Затем, после блокировки неспецифической адсорбции раствором 1% БСА в ФБР в течение 1 ч, в лунки вносили по 100 мкл раствора рекомбинантного активированного протеина С в 1% БСА в концентрации от 78 нг/мл до 10 мкг/мл, двукратными разведениями (нормальная концентрация протеина C в плазме крови человека - 4 мкг/мл). Последующие стадии анализа проводили аналогично стадиям, описанным для скрининга клонов гибридом. Биотинилированные МКА использовали в разведении 1/1000, Neu-ПХ в разведении 1/8000. В качестве отрицательного контроля вместо биотинилированных МКА использовали сыворотку интактной мыши в разведении 1/1000.
Было показано, что при такой постановке реакции биотинилированные МКА клона 4F10 специфически взаимодействуют с активированным протеином C, при этом предел обнаружения антигена много ниже 0,15 мкг/мл при использовании в качестве адсорбционных антител МКА гибридом 1С6 и 3H6 (фиг.1).
Эти свойства моноклональных штаммов Sp2/0-BC/rhPC-4F10, Sp2/0-BC/rhPC-lC6 и Sp2/0-BC/rhPC-3H6, а также взаимодействие продуцируемых ими МКА с протеином C человека свидетельствует о возможности использования данных МКА для получения иммуноаффинных реагентов для количественного анализа протеина C.
| Таблица 2. | ||
| Ранжированная активность антител к rhAPC для первичных клонов гибридом. | ||
| Пул № | Адрес | Активность, ОЕ |
| Отобраны к повторному клонированию | ||
| 2 | 2/26 | 3,690 |
| 3 | 2/13 | 3,615 |
| 4 | 4/G7 | 3,219 |
| 1 | 1/D2 | 2,918 |
| 3 | 5/D7 | 2,834 |
| 3 | 10/С8 | 2,411 |
| 2 | 2/Н7 | 1,707 |
| Отбракованы | ||
| 2 | 2NS | 0,583 |
| 2 | 2/F1 | 0,410 |
| 2 | 11/Н2 | 0,117 |
| 4 | 24/Н8 | 0,176 |
| 1 | 24/D4 | 0,155 |
| 1 | 25/Е7 | 0,149 |
| 3 | 23/С9 | 0,139 |
| 2 | 25/Е9 | 0,129 |
| 4 | 22/С11 | 0,127 |
| 2 | 24/A3 | 0,124 |
| 1 | 25/Н5 | 0,115 |
| 2 | 2/12 | 0,114 |
| 4 | 21/D10 | 0,112 |
| 3 | 21/А7 | 0,101 |
| 1 | 24/Н12 | 0,100 |
| 3 | 25/А6 | 0,085 |
| Таблица 3. | |||||
| Активность антител к rhAPC для конечных масштабированных клонов гибридом по ИФА | |||||
| Конечный № | Адрес первичного клона | Адрес конечного клона | Активность | ||
| Промывочный буфер содержит | Остаточная активность | ||||
| 2 мМ Са2+, OD450 | 2 мМ EDTA, OD450 | ||||
| 1 | 2/13 | 1/С6 | 2,165 | 2,148 | 99,2% |
| 2 | 2/26 | 4/F10 | 2,216 | 1,968 | 88,8% |
| 3 | 2/13 | 2/F8 | 2,009 | 1,944 | 96,8% |
| 4 | 5/D7 | 3/Н6 | 1,649 | 1,577 | 95,6% |
| 5 | 2/13 | 4/В12 | 1.571 | 1.402 | 89.2% |
| Таблица 4. | ||||
| Изменение активности полученных МКА при выделении и модификации биотином. | ||||
| Образец | Культуральная жидкость | Афинно-очищенные IgG | Биотинилированные IgG | Биотинилированные IgG |
| Адрес клона | Активность, ОЕ | |||
| Антимышь - ПХ | Neu - ПХ | |||
| 4F10 | 2,57 | 0,90 | 0,85 | 1,44 |
| 1С6 | 2,39 | 2,35 | 1,06 | 1,71 |
| 3H6 | 2,85 | 1,30 | 0,92 | 0,51 |
| 2F8 | 2,75 | 0,38 | 0,45 | 0,06 |
| 4B12 | 2,86 | 1,54 | 0,89 | 0,10 |
Claims (3)
1. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus Sp2/0-BC/rhPC-4F10 - продуцент моноклональных антител, специфичных к протеину С человека, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика, регистрационный номер Н-110.
2. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus Sp2/0-BC/rhPC-1C6 - продуцент моноклональных антител, специфичных к протеину С человека, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика, регистрационный номер Н-111.
3. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus Sp2/0-BC/rhPC-3H6 - продуцент моноклональных антител, специфичных к протеину С человека, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика, регистрационный номер Н-112.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010145028/10A RU2445365C1 (ru) | 2010-11-03 | 2010-11-03 | Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus - продуцент моноклональных антител, специфичных к протеину с человека (варианты) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010145028/10A RU2445365C1 (ru) | 2010-11-03 | 2010-11-03 | Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus - продуцент моноклональных антител, специфичных к протеину с человека (варианты) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2445365C1 true RU2445365C1 (ru) | 2012-03-20 |
Family
ID=46030121
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010145028/10A RU2445365C1 (ru) | 2010-11-03 | 2010-11-03 | Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus - продуцент моноклональных антител, специфичных к протеину с человека (варианты) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2445365C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5549893A (en) * | 1991-05-14 | 1996-08-27 | Immuno Aktiengesellschaft | Use of protein C in the treatment of purpura fulminans |
| EP0913156A1 (en) * | 1997-10-20 | 1999-05-06 | Eli Lilly And Company | Methods for treating hypercoagulable states or acquired protein C deficiency |
| RU2345789C2 (ru) * | 2002-05-01 | 2009-02-10 | Шеринг Акциенгезельшафт | Новые антитела к тканевому фактору в качестве антикоагулянтов |
-
2010
- 2010-11-03 RU RU2010145028/10A patent/RU2445365C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5549893A (en) * | 1991-05-14 | 1996-08-27 | Immuno Aktiengesellschaft | Use of protein C in the treatment of purpura fulminans |
| EP0913156A1 (en) * | 1997-10-20 | 1999-05-06 | Eli Lilly And Company | Methods for treating hypercoagulable states or acquired protein C deficiency |
| RU2345789C2 (ru) * | 2002-05-01 | 2009-02-10 | Шеринг Акциенгезельшафт | Новые антитела к тканевому фактору в качестве антикоагулянтов |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TWI702226B (zh) | 治療性蛋白質藥物物質之整合連續製造 | |
| JPH0636741B2 (ja) | ヒト・プロテインｃの分離方法 | |
| JPS60120825A (ja) | 抗プロテインｃモノクロ−ナル抗体およびそれを産生するハイブリド−マ | |
| JP5984670B2 (ja) | Ｆｄｐ測定用試薬及び試薬キット、並びに測定方法 | |
| US20190316133A1 (en) | Anti-Fibrinogen Aptamers and Uses Thereof | |
| EP0162078A4 (en) | Method for isolating a protein from a mixture containing said protein and a conformation specific antibody useful therein. | |
| EP0285511B1 (en) | Immunoassay of thrombomodulin | |
| JP2022519807A (ja) | 抗凝固因子ＸＩ活性型因子ＸＩａ抗体並びにその調製方法及び使用 | |
| US20190161756A1 (en) | Anti-Immunoglobulin G Aptamers and Uses Thereof | |
| KR100207351B1 (ko) | 항 인체 플라스민-알파2-플라스민 억제물질 복합체 항체, 하이브리도마 및 면역학적 측정방법 | |
| RU2445365C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus - продуцент моноклональных антител, специфичных к протеину с человека (варианты) | |
| NO171169B (no) | Monoklonale antistoffer eller fragmenter derav, spesifikke for alfa2-plasmininhibitor | |
| JP4448754B2 (ja) | Ｄダイマー測定用試薬およびこれに用いるモノクローナル抗体 | |
| JPS63123395A (ja) | 抗ｐｃｉモノクローナル抗体、これを用いた抗ｐｃｉの精製法及び免疫学的測定法 | |
| RU2455360C1 (ru) | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК МЫШИ Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К ПРОТЕИНУ C ЧЕЛОВЕКА, МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, СПЕЦИФИЧНОЕ К ПРОТЕИНУ C ЧЕЛОВЕКА, И ИММУНОСОРБЕНТ ДЛЯ СОРБЦИИ ПРОТЕИНА C ЧЕЛОВЕКА, СОДЕРЖАЩИЙ МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО | |
| FI86255C (fi) | Monoklonal antiurokinase-antikropp, den innehaollande matris och biokemiska testpackningar, i vilka den anvaendes. | |
| KR100583537B1 (ko) | 활성화된 응고 인자 ｖｉｉ에 특이적인 모노클로날 항체 및 이의 용도 | |
| RU2768838C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus 365e11, продуцирующий моноклональные антитела к шигаподобному токсину ii типа | |
| US6258938B1 (en) | Method for the purification and isolation of blood clotting proteins using conformation specific antibodies | |
| CN103966173B (zh) | 一种杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体和应用 | |
| RU2584582C1 (ru) | Моноклональное антитело сс3-4 к конформационному эпитопу с3 человека, штамм гибридной днк мыши рккк(п)764д - продуцент моноклонального антитела сс3-4 | |
| RU2451071C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину человека (варианты) | |
| SU1514769A1 (ru) | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ: КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ ΜΙΙ5 МиЗОТ ПК-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОМУ АКТИВАТОРУ ПЛАЗМИНОГЕНА УРОКИНАЗНО | |
| US6365155B1 (en) | Ancrod-specific monoclonal antibodies, antibody fragments, mixtures or derivatives thereof and use of the same | |
| RU2342428C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных - продуцент моноклональных антител крысы к гипогликозилированным и дегликозилированным изоформам опухоль-ассоциированного антигена человека muci |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20120723 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20161104 |