RU2445365C1 - Mus musculus cultivated hybrid cell strain producer of monoclonal antibodies specific to human protein c (versions) - Google Patents
Mus musculus cultivated hybrid cell strain producer of monoclonal antibodies specific to human protein c (versions) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2445365C1 RU2445365C1 RU2010145028/10A RU2010145028A RU2445365C1 RU 2445365 C1 RU2445365 C1 RU 2445365C1 RU 2010145028/10 A RU2010145028/10 A RU 2010145028/10A RU 2010145028 A RU2010145028 A RU 2010145028A RU 2445365 C1 RU2445365 C1 RU 2445365C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- rhpc
- human protein
- antibodies
- monoclonal antibodies
- Prior art date
Links
- 101500025568 Homo sapiens Saposin-D Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 229940100689 human protein c Drugs 0.000 title claims abstract description 28
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 title abstract description 8
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 title description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 5
- 101000658081 Mus musculus U2 small nuclear ribonucleoprotein auxiliary factor 35 kDa subunit-related protein 1 Proteins 0.000 claims 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 7
- 241001529936 Murinae Species 0.000 abstract description 2
- 238000012443 analytical study Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 abstract 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 51
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 48
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 48
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 30
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 13
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 108010008250 drotrecogin alfa activated Proteins 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 9
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 9
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 7
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 7
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 7
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 5
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 5
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 5
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 4
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 3
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 201000005660 Protein C Deficiency Diseases 0.000 description 3
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 3
- 229930194936 Tylosin Natural products 0.000 description 3
- 239000004182 Tylosin Substances 0.000 description 3
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 3
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 3
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 3
- 208000013746 hereditary thrombophilia due to congenital protein C deficiency Diseases 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- WBPYTXDJUQJLPQ-VMXQISHHSA-N tylosin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)O[C@H]([C@@H]([C@H]1N(C)C)O)O[C@@H]1[C@@H](C)[C@H](O)CC(=O)O[C@@H]([C@H](/C=C(\C)/C=C/C(=O)[C@H](C)C[C@@H]1CC=O)CO[C@H]1[C@@H]([C@H](OC)[C@H](O)[C@@H](C)O1)OC)CC)[C@H]1C[C@@](C)(O)[C@@H](O)[C@H](C)O1 WBPYTXDJUQJLPQ-VMXQISHHSA-N 0.000 description 3
- 229960004059 tylosin Drugs 0.000 description 3
- 235000019375 tylosin Nutrition 0.000 description 3
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 3
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 3
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100026966 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 108091005605 Vitamin K-dependent proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 230000003462 zymogenic effect Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800001401 Activation peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000069 Activation peptide Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229940105774 coagulation factor ix Drugs 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000002826 coolant Substances 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 201000005380 purpura fulminans Diseases 0.000 description 1
- 230000020964 regulation of blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- JJGWLCLUQNFDIS-GTSONSFRSA-M sodium;1-[6-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]hexanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)CCCCCNC(=O)CCCC[C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1 JJGWLCLUQNFDIS-GTSONSFRSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009424 thromboembolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 1
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000034365 zymogen activation Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Область техники.The field of technology.
Изобретение относится к области биотехнологии и биофармакологии, а именно к технологии получения моноклональных антител (МКА) методами клеточной гибридизации, точнее к методам получения МКА, специфичных к протеину С человека (hPROC), с использованием штаммов гибридных культивируемых клеток Mus musculus и создания на основе этих МКА иммуноаффинных реагентов для количественного определения протеина С человека в кондиционированной культуральной жидкости линий-продуцентов рекомбинантного протеина С (rhPROC) и в других растворах, в том числе в плазме крови.The invention relates to the field of biotechnology and biopharmacology, and in particular to a technology for producing monoclonal antibodies (MABs) by cell hybridization methods, more specifically to methods for producing MABs specific for human protein C (hPROC), using strains of hybrid cultured Mus musculus cells and creating based on these MCA of immunoaffinity reagents for the quantitative determination of human protein C in conditioned culture fluid of producer lines of recombinant protein C (rhPROC) and in other solutions, including plasma blood.
Предшествующий уровень техники.The prior art.
Протеин С является витамин К-зависимым белком плазмы крови. Он входит в систему гемостаза и играет исключительно важную роль при регулировании свертывания крови. Протеин С синтезируется в виде неактивной молекулы предшественника, проходит многостадийный посттрансляционный процессинг в клеточных компартментах и секретируется в виде интактной (зимогенной) формы. Активация протеина С происходит в кровотоке при участии тромбомодулин-тромбинового комплекса. Активированный протеин С вместе с кофактором - протеином S выполняет антикоагулянтную функцию. Активированный протеин С может предотвращать внутрисосудистый тромбоз и подавлять рост имеющихся тромбов. Механизм действия активированного протеина С и механизм активации зимогена в активную протеазу изложен в работе Esmon Т. Charles ("Protein-C: biochemistry, physiology, and clinical implications" Blood, 1984, Vol.62(6) - P.1155-8).Protein C is a vitamin K-dependent plasma protein. It enters the hemostatic system and plays an extremely important role in the regulation of blood coagulation. Protein C is synthesized as an inactive precursor molecule, undergoes multi-stage post-translational processing in cell compartments and is secreted in the form of an intact (zymogenic) form. Protein C activation occurs in the bloodstream with the participation of the thrombomodulin-thrombin complex. Activated protein C, together with cofactor - protein S, performs an anticoagulant function. Activated protein C can prevent intravascular thrombosis and inhibit the growth of existing blood clots. The mechanism of action of activated protein C and the mechanism of zymogen activation into an active protease is described in Esmon, T. Charles ("Protein-C: biochemistry, physiology, and clinical implications" Blood, 1984, Vol.62 (6) - P.1155-8) .
Активация протеина С непосредственно осуществляется тромбином, последней сериновой протеиназой каскада свертывания крови и опосредована связанным с мембраной эндотелиальных клеток гликопротеином тромбомодулин. Тромбомодулин образует прочный нековалентный комплекс состава 1:1 с тромбином и полностью меняет функциональные свойства тромбина. Свободный тромбин в нормальных условиях активирует тромбоциты, конвертирует фибриноген до фибрина и факторы свертывания крови V и VIII до активных формы Va и VIIIa. В то же время тромбин в комплексе с тромбомодулином теряет все вышеуказанные свойства, но эффективно активирует интактный протеин С при физиологических концентрациях ионов кальция.The activation of protein C is directly carried out by thrombin, the last serine protease of the blood coagulation cascade and is mediated by the thrombomodulin glycoprotein associated with the membrane of endothelial cells. Thrombomodulin forms a strong non-covalent complex of 1: 1 composition with thrombin and completely changes the functional properties of thrombin. Under normal conditions, free thrombin activates platelets, converts fibrinogen to fibrin and coagulation factors V and VIII to active forms Va and VIIIa. At the same time, thrombin in combination with thrombomodulin loses all of the above properties, but effectively activates intact protein C at physiological concentrations of calcium ions.
Активированный протеин C, в свою очередь, избирательно инактивирует активированные формы факторов свертываемости крови V и VIII, но не их исходные формы.Activated protein C, in turn, selectively inactivates the activated forms of coagulation factors V and VIII, but not their original forms.
Следует отметить, что основные события при запуске каскада свертывания крови происходят на поверхности клеток и требуют участия мембранно-связанных белков и фосфолипидов, в то время как факторы V и VIII свободно циркулируют в кровотоке и участвуют в петле положительной обратной связи при работе системы свертывания. При их активации тромбином они ускоряют активацию фактора X и протромбина на 5 порядков и резко ускоряют генерацию тромбина в месте запуска каскада свертывания.It should be noted that the main events at the start of the blood coagulation cascade occur on the cell surface and require the participation of membrane-bound proteins and phospholipids, while factors V and VIII circulate freely in the bloodstream and participate in the positive feedback loop during the operation of the coagulation system. When activated by thrombin, they accelerate the activation of factor X and prothrombin by 5 orders of magnitude and dramatically accelerate the generation of thrombin at the site of the coagulation cascade.
Таким образом, физиологическая роль активированного протеина С может быть описана как ограничение области запуска системы свертывания крови.Thus, the physiological role of activated protein C can be described as limiting the start area of the blood coagulation system.
Основным кофактором активированного протеина С является протеин S, другой витамин K - зависимый белок плазмы крови. Протеин S более чем в 10 раз усиливает вызываемую активированным протеином C деградацию факторов Va и VIIIa.The main cofactor of activated protein C is protein S, another vitamin K is a dependent plasma protein. Protein S enhances degradation of factors Va and VIIIa caused by activated protein C by more than 10 times.
Протеин С является важным терапевтическим агентом (EP 215549, EP 0191606) в качестве специфического антикоагулянта, имеющего потенциально более широкую область применения, чем традиционные антикоагулянты гепарин, варфарин (оксикумарин) или производные последнего. В отличие от традиционных антикоагулянтов активированный или интактный протеин С не воздействует на систему свертывания крови до момента появления тромбина и не вызывает падения концентрации зимогенных белков системы свертывания. Вследствие этого антикоагулянтная терапия протеином С потенциально является более безопасной, поскольку не вызывает постоянного риска возникновения кровотечений. Экзогенный интактный протеин С также может использоваться для заместительной терапии при наследственном дефиците протеина С, вызывающего смерть в младенческом возрасте при гомозиготном дефиците и частые тромбоэмболические состояния при гетерозиготной форме дефицита.Protein C is an important therapeutic agent (EP 215549, EP 0191606) as a specific anticoagulant having a potentially wider scope than traditional anticoagulants heparin, warfarin (oxycoumarin) or derivatives of the latter. Unlike traditional anticoagulants, activated or intact protein C does not affect the blood coagulation system until the appearance of thrombin and does not cause a decrease in the concentration of zymogenic proteins of the coagulation system. As a result, protein C anticoagulant therapy is potentially safer because it does not cause a constant risk of bleeding. Exogenous intact protein C can also be used for replacement therapy with hereditary protein C deficiency, which causes death in infancy with homozygous deficiency and frequent thromboembolic conditions with a heterozygous form of deficiency.
Основной областью клинического применения активированного протеина С являются опасные для жизни тромботические состояния, в первую очередь синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдром), возникающий в том числе при развитии острого сепсиса.The main area of clinical use of activated protein C is life-threatening thrombotic conditions, primarily disseminated intravascular coagulation syndrome (DIC), which also occurs during the development of acute sepsis.
Активированный протеин С является маркером сепсиса, а его уровень и дефицит коррелируют с тяжестью течения заболевания. Так, дефицит протеина С наблюдается более чем у 85% больных с тяжелым сепсисом; а также дефицит протеина С коррелирует с неблагоприятными клиническими исходами, такими как септический шок (тяжелый сепсис, сопровождающийся развитием артериальной гипотонии), ДВС-синдромом и полиогранной недостаточностью.Activated protein C is a marker of sepsis, and its level and deficiency correlate with the severity of the disease. Thus, protein C deficiency is observed in more than 85% of patients with severe sepsis; and protein C deficiency correlates with adverse clinical outcomes, such as septic shock (severe sepsis, accompanied by the development of arterial hypotension), DIC, and polyhedral insufficiency.
Поскольку концентрация протеина C в плазме крови очень мала и его отделение от других витамин K-зависимых белков системы гемостаза представляется весьма затруднительным, единственным способом получения активированного протеина C для медицинского применения является биосинтез, активация и очистка рекомбинантного белка. Создание аналитических систем для количественного определения протеина С является важным элементом как промышленных решений этой задачи для биотехнологического производства, так и для клинического применения получаемых фармпрепаратов протеина C и сопутствующей диагностики коагулопатий. Одним из важных методов определения природного или рекомбинантного протеина C в биомедицинских приложениях является использование МКА, продуцируемых гибридомами, отобранных таким образом, что секретируемые иммуноглобулины не кросс-реактивны.Since the concentration of protein C in the blood plasma is very small and its separation from other vitamin K-dependent proteins of the hemostatic system seems very difficult, the only way to obtain activated protein C for medical use is the biosynthesis, activation and purification of the recombinant protein. The creation of analytical systems for the quantitative determination of protein C is an important element of both industrial solutions to this problem for biotechnological production, and for the clinical application of the obtained pharmaceutical preparations of protein C and the concomitant diagnosis of coagulopathies. One of the important methods for determining natural or recombinant protein C in biomedical applications is the use of MCAs produced by hybridomas, selected in such a way that secreted immunoglobulins are not cross-reactive.
Известно применение моноклональных антител к фактору протеину C, описанное в патенте США 5549893 (Johann Eibl et al; "Use of protein С in the treatment of purpura fulminans"; 1995), при этом патент защищает терапевтическое применение активированного и интактного протеина С природного происхождения.The use of monoclonal antibodies to factor C protein is known to be described in US Pat. No. 5,549,893 (Johann Eibl et al; "Use of protein C in the treatment of purpura fulminans"; 1995), and the patent protects the therapeutic use of activated and intact protein C of natural origin.
Применение конформацинно-зависимых антител для очистки и активации протеина С является объектом защиты в патенте США 4981952 (Betty Yan S.; "Method for the purification of vitamin K-dependent proteins", 1989), однако применяемое технологическое решение основано на серии последовательных раундов хроматографической очистки протеина С, где основой иммуноаффинного сорбента являются МКА, аффинность которых блокируется ионами кальция, что оставляет значительный потенциал для оптимизации технологического процесса. Известно применение конформационно-зависимых антител для анализа биологической активности и разделения модифицированных форм протеина С. Для таких целей могут быть использованы антитела хелатор-зависимой аффинности (патент США 5549893; Ohsawa K. et al. Purification of sufficiently gamma-carboxylated recombinant protein С and its derivatives. Calcium-dependent affinity shift in immunoaffinity and ion-exchange chromatography. // J Chromatography - 1992 - Vol.597(l-2) P.285-91) и кальцийзависимой аффинности (Stearns D.J. et al. The interaction of a Ca2+-dependent monoclonal antibody with the protein С activation peptide region. Evidence for obligatory Ca2+binding to both antigen and antibody. // Biol Chem- 1988 - Vol.263(2) P.826-32; Nakamura S., Sakata Y. Immunoaffinity purification of protein С by using conformation-specific monoclonal antibodies to protein C-calcium ion complex. // Biochim Biophys Acta. Biochim Biophys Acta - 1987 - Vol.925(2) P.85-93; Wakabayashi K. Conformation-specific monoclonal antibodies to the calcium-induced structure of protein C. // J Biol Chem - 1986 - Vol.261(24) P.11097-105; Tharakan J.P. Effect of feed flow rate, antigen concentration and antibody density on immunoaffinity purification of coagulation factor IX. // J Chromatography - 1990 - Vol.522 - P.153-62).The use of conformational-dependent antibodies for the purification and activation of protein C is the subject of protection in US Pat. No. 4,981,952 (Betty Yan S .; "Method for the purification of vitamin K-dependent proteins", 1989), but the technological solution used is based on a series of sequential chromatographic rounds purification of protein C, where the basis of the immunoaffinity sorbent is MCA, the affinity of which is blocked by calcium ions, which leaves considerable potential for optimizing the process. The use of conformation-dependent antibodies for the analysis of biological activity and the separation of modified forms of protein C is known. For such purposes antibodies of chelator-dependent affinity (US Pat. No. 5,549,893; Ohsawa K. et al. Purification of sufficiently gamma-carboxylated recombinant protein C and its derivatives.Calcium-dependent affinity shift in immunoaffinity and ion-exchange chromatography. // J Chromatography - 1992 - Vol.597 (l-2) P.285-91) and calcium-dependent affinity (Stearns DJ et al. The interaction of a Ca 2+ -dependent monoclonal antibody with the protein C activation peptide region. Evidence for obligatory Ca 2+ binding to both antigen and antibody. // Biol Chem- 1988 - Vol.263 (2) P.826-32; Nakamura S., Sakata Y. Immunoa ffinity purification of protein C by using conformation-specific monoclonal antibodies to protein C-calcium ion complex. // Biochim Biophys Acta. Biochim Biophys Acta - 1987 - Vol.925 (2) P.85-93; Wakabayashi K. Conformation-specific monoclonal antibodies to the calcium-induced structure of protein C. // J Biol Chem - 1986 - Vol. 261 (24) P.11097-105; Tharakan JP Effect of feed flow rate, antigen concentration and antibody density on immunoaffinity purification of coagulation factor IX. // J Chromatography - 1990 - Vol.522 - P.153-62).
Моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами, также используются как инструмент для получения деплетированной по протеину С плазмы человека, используемой в качестве реактива для коагулометрической диагностики. Дефицит соответствующей природной плазмы обусловлен чрезвычайной редкостью врожденных генетических коагулопатий типа PROC-, встречающихся в 1 случае из миллиона.Monoclonal antibodies produced by hybridomas are also used as a tool for obtaining depleted protein C of human plasma, used as a reagent for coagulometric diagnosis. Deficiency of the corresponding natural plasma is due to the extreme rarity of congenital genetic coagulopathies of the PROC-type type, occurring in 1 out of a million cases.
Существует широкий спектр возможностей для дальнейшего усовершенствования известных решений по количественному определению протеина C человека и его рекомбинантных вариантов. Возможность такого усовершенствования обусловлена тем, что при отборе клонов гибридом, продуцирующих различные МКА к протеину C, можно учитывать влияние различных факторов на ход определения протеина C и проводить отбор клонов по чувствительности или резистентности к действию этих факторов. Примерами таких факторов может быть присутствие в анализируемой смеси других витамин К-зависимых белков плазмы, протеина C крупного рогатого скота, разное соотношение интактной и активированной формы протеина C, доля протеина C в комплексе с протеином S, концентрация продуктов инактивации активированного протеина C и т.д.There is a wide range of possibilities for further improving the known solutions for the quantification of human protein C and its recombinant variants. The possibility of such an improvement is due to the fact that when selecting clones of hybridomas producing various MCAs for protein C, one can take into account the influence of various factors on the course of determination of protein C and select clones by sensitivity or resistance to the action of these factors. Examples of such factors can be the presence in the analyzed mixture of other vitamin K-dependent plasma proteins, cattle protein C, different ratios of the intact and activated forms of protein C, the proportion of protein C in complex with protein S, the concentration of activated protein C inactivation products, etc. d.
Подробное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention
Технической задачей, решаемой авторами, являлось получение высокоаффинных не кросс-реактивных антител к протеину C человека, применимых для фармацевтических и биомедицинских аналитических исследований, в частности количественного обнаружения рекомбинантного фактора C человека (rhPROC).The technical problem solved by the authors was to obtain high-affinity non-cross-reactive antibodies to human protein C, applicable for pharmaceutical and biomedical analytical studies, in particular the quantitative detection of recombinant human factor C (rhPROC).
Технический результат достигался путем создания новых штаммов гибридных культивируемых клеток Sp2/0-BC/rhPC-4F10, Sp2/0-BC/rhPC-lC6, Sp2/0-BC/rhPC-3H6, секретирующих моноклональные антитела к протеину С человека и создания на их основе иммуноаффинных реагентов для количественного анализа протеина С человека (hPROC) и его рекомбинантных вариантов (rhAPC). Полученные штаммы депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ФГУП ГосНИИГенетика 17 сентября 2010 г. под регистрационными номерами H-110, H-111 и H-112, соответственно.The technical result was achieved by creating new strains of hybrid cultured cells Sp2 / 0-BC / rhPC-4F10, Sp2 / 0-BC / rhPC-lC6, Sp2 / 0-BC / rhPC-3H6, secreting monoclonal antibodies to human protein C and creating their basis of immunoaffinity reagents for the quantitative analysis of human protein C (hPROC) and its recombinant variants (rhAPC). The obtained strains were deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), Federal State Unitary Enterprise GosNIIGenetika September 17, 2010 under registration numbers H-110, H-111 and H-112, respectively.
Основным методическим подходом к созданию штаммов клеточных линий, продуцирующих моноклональные антитела, является клонирование гибридных культивируемых клеток - гибридом. Гибридомы согласно настоящему изобретению получают слиянием несекретирующих клеток миеломы мыши (Mus musculus) и антителпродуцирующих В-лимфоцитов в присутствии полиэтиленгликоля. Клетки миеломы дефицитны по гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазе (HGPRT) или тимидинкиназе (ТК). Таким образом, они не могут выжить при культивации в среде, содержащей HAT (гипоксантин, аминоптерин и тимидин). В то же время, любые не слитые В-лимфоциты селезенки сами по себе не стабильны в культуре более 3 дней. Часть гибридных клеток B-лимфоцитов и миеломы, получивших соответствующие хромосомы родительских клеток, обладает стабильностью в селективной среде, содержащей HAT. Такие клетки могут культивироваться продолжительное время и продуцировать потенциально неограниченное количество антител.The main methodological approach to creating strains of cell lines producing monoclonal antibodies is the cloning of hybrid cultured cells - hybridomas. Hybridomas according to the present invention are obtained by fusion of non-secreting mouse myeloma cells (Mus musculus) and antibody-producing B lymphocytes in the presence of polyethylene glycol. Myeloma cells are deficient in hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) or thymidine kinase (TC). Thus, they cannot survive cultivation in a medium containing HAT (hypoxanthine, aminopterin and thymidine). At the same time, any non-fused spleen B-lymphocytes per se are not stable in culture for more than 3 days. Some hybrid cells of B-lymphocytes and myeloma, which received the corresponding chromosomes of the parent cells, are stable in a selective medium containing HAT. Such cells can be cultured for a long time and produce a potentially unlimited amount of antibodies.
Супернатанты культуры гибридом анализируются на наличие целевых антител методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA). Затем отобранные гибридомы клонируются для того, чтобы получить субклоны, продуцирующие антитела, не обладающие кросс-реактивностью в аналитических тестах. Для этого применяется непрямой ИФА таким образом, что каждое из отобранных антител попарно сравнивается другими как в качестве адсорбированного на поверхности иммунопланшета, так и связывающегося из раствора с антигеном, уже связавшимся с другими адсорбированными антителами. Отобранные продуценты моноклональных антитела могут быть масштабированы in vivo в виде асцита мыши или in vitro в суспензионной культуре (Pepper S.D. Selection antibodies for immunoaffinity chromatography // Methods in molecular biology ed. by Kenney A. and Fowell S. - 1992 - Vol.11 - P.136-171).Hybridoma culture supernatants are analyzed for the presence of target antibodies by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Then, the selected hybridomas are cloned in order to obtain subclones producing antibodies that do not have cross-reactivity in analytical tests. For this, indirect ELISA is used in such a way that each of the selected antibodies is compared in pairs by others, both as adsorbed on the surface of an immunoplate and as it binds from a solution to an antigen that has already bound to other adsorbed antibodies. Selected producers of monoclonal antibodies can be scaled in vivo as mouse ascites or in vitro in suspension culture (Pepper SD Selection antibodies for immunoaffinity chromatography // Methods in molecular biology ed. By Kenney A. and Fowell S. - 1992 - Vol. 11 - P.136-171).
Термин «моноклональное антитело» означает антитело, искусственно получаемое из клеточного клона и поэтому содержащее только один тип иммуноглобулина.The term "monoclonal antibody" means an antibody artificially derived from a cell clone and therefore containing only one type of immunoglobulin.
Антитело, специфичное к белку "протеин C человека", означает молекулу, которая селективно, избирательно связывается с протеином C человека и образует стабильный комплекс. Стабильным комплексом является комплекс, в котором связывание между партнерами происходит на период времени, достаточный для того, чтобы произвести детектирование указанного комплекса. Термин "селективно связывается с протеином C человека" означает способность указанной молекулы предпочтительно связываться с протеином C человека в отличие от связывания с белками, не имеющими отношения к протеину C человека, или связывания с небелковыми компонентами, присутствующими в образце. Антителом, которое предпочтительно связывается с протеином C человека, является антитело, которое связывается с протеином C человека, но не связывается в существенной степени с другими молекулами или компонентами, которые могут присутствовать в образце. Существенное связывание предполагает, например, связывание антитела, связывающегося с ротеином C человека, с молекулой, не являющейся протеином C человека, с аффиностью или силой, достаточной для того, чтобы помешать способности антитела, связывающегося с протеином C человека.An antibody specific for the human protein C protein refers to a molecule that selectively binds selectively to human protein C to form a stable complex. A stable complex is a complex in which binding between partners occurs for a period of time sufficient to detect the specified complex. The term "selectively binds to human protein C" means the ability of said molecule to preferably bind to human protein C, as opposed to binding to proteins unrelated to human protein C, or to binding to non-protein components present in the sample. An antibody that preferably binds to human protein C is an antibody that binds to human protein C but does not substantially bind to other molecules or components that may be present in the sample. Significant binding involves, for example, the binding of an antibody that binds to human rotin C to a non-human protein C molecule with an affinity or strength sufficient to interfere with the ability of the antibody to bind to human protein C.
Способность антитела к связыванию с антигеном может быть определена специалистом в данной области с использованием методов, включающих, но не ограничивающихся методами ELISA и равновесного диализа. Методы определения аффинности и силы связывания хорошо известны специалисту в данной области техники и подробно описаны, например, Janeway и др. (Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Publishing Company, 1996)).The ability of an antibody to bind to an antigen can be determined by one of skill in the art using methods including, but not limited to, ELISA and equilibrium dialysis. Methods for determining affinity and binding strength are well known to those skilled in the art and are described in detail, for example, by Janeway et al. (Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Publishing Company, 1996)).
Методика иммунизации. Штаммы гибридомы получают путем иммунизации мышей линии BALB/c рекомбинантным протеином C человека в течение 49 суток. На третьи сутки после последней бустер-инъекции проводят гибридизацию спленоцитов иммуннизированных мышей (1.2×108 клеток) с клетками мышиной миеломы Sp2/0-Agl4 (3×107 клеток). В качестве агента для слияния применяют полиэтиленгликоль с молекулярным весом 1450 (Sigma, Германия). После гибридизации проводят селекцию, скрининг, клонирование и криоконсервацию гибридомы.Immunization Technique. Hybridoma strains are obtained by immunization of BALB / c mice with recombinant human protein C for 49 days. On the third day after the last booster injection, splenocytes of immunized mice (1.2 × 10 8 cells) are hybridized with Sp2 / 0-Agl4 murine myeloma cells (3 × 10 7 cells). Polyethylene glycol with a molecular weight of 1450 (Sigma, Germany) was used as a fusion agent. After hybridization, selection, screening, cloning, and cryopreservation of the hybridoma are performed.
Морфологическая характеристика полученных штаммов гибридомы. Культура гибридных клеток состоит из слабоприкрепленных к подложке округлых клеток с размером с исходную миеломную клетку.Morphological characteristics of the obtained hybridoma strains. The hybrid cell culture consists of rounded cells weakly attached to the substrate with the size of the original myeloma cell.
Культуральные свойства. Культивирование штаммов гибридом Sp2/0-BC/rhPC-4F10, Sp2/0-BC/rhPC-3H6 и Sp2/0-BC/rhPC-lC6 ведут раздельно, не допуская кросс-контаминации, при температуре 37°C в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI-1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 8 мкг/мл тилозина. Клетки культивируют в виде стационарной суспензии в вентилируемых пластиковых флаконах с адгезионной поверхностью площадью 25 см2 и рабочим объемом среды 5-10 мл. Пассирование клеток гибридомы проводят 3 раза в неделю с кратностью разведения 1:4-1:6. Посевная концентрация клеток составляет 3×105 в 1 мл среды. Максимальная концентрация гибридных клеток при культивировании составляет 1,2×106 на 1 мл среды. Гибридный клон не теряет способности синтеза антител при 12 последовательных пассажах in vitro.Cultural properties. The cultivation of hybrid strains Sp2 / 0-BC / rhPC-4F10, Sp2 / 0-BC / rhPC-3H6 and Sp2 / 0-BC / rhPC-lC6 are carried out separately, avoiding cross-contamination, at a temperature of 37 ° C in an atmosphere containing 5% carbon dioxide. The cultivation medium is RPMI-1640 medium containing 10% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 8 μg / ml tylosin. Cells are cultured as a stationary suspension in ventilated plastic bottles with an adhesive surface of 25 cm 2 and a working volume of 5-10 ml of medium. Passage of hybridoma cells is carried out 3 times a week with a dilution ratio of 1: 4-1: 6. The inoculum concentration of cells is 3 × 10 5 in 1 ml of medium. The maximum concentration of hybrid cells during cultivation is 1.2 × 10 6 per 1 ml of medium. The hybrid clone does not lose the ability to synthesize antibodies in 12 consecutive passages in vitro.
Культивирование гибридомы в организме животного. Вид животного - инбредные мыши линии BALB/c. Доза клеток при прививке составляет 2×106 клеток в 0,5 мл фосфатно-солевого буферного раствора на одну мышь при первичном введении. За 1 сутки до введения клеток гибридомы мышам внутрибрюшинно вводят 1 мл неполного адъюванта Фрейнда.The cultivation of hybridomas in the body of the animal. Animal species - inbred mice of the BALB / c line. The dose of cells inoculation is 2 × 10 6 cells in 0.5 ml of phosphate-buffered saline per mouse in the initial administration. 1 day before the introduction of hybridoma cells, mice were intraperitoneally injected with 1 ml of Freund's incomplete adjuvant.
Иммуноасцитическая жидкость образуется на 12-16 сутки в объеме 3-5 мл. Количественное определение иммуноглобулина, продуцируемого гибридомой, производят методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА).Immunoascitic fluid is formed on days 12-16 in the volume of 3-5 ml. Quantification of the immunoglobulin produced by the hybridoma is performed by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Характеристика полезного продукта. Гибридомы Sp2/0-BC/rhPC-4F10, Sp2/0-BC/rhPC-3H6 и Sp2/0-BC/rhPC-lC6 продуцируют специфичные моноклональные антитела к hPROC, титр которых составляет в культуральной жидкости (КЖ) около 1:90000, в иммуноасцитической жидкости (ИАЖ) не менее 1:200000. Моноклональные антитела из КЖ и ИАЖ выделяют с помощью дробного осаждения сульфатом аммония с последующей аффинной хроматографией на протеин A- или протеин G-сефарозе. Гомогенность выделенных антител проверяется с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Принадлежность к классу иммуноглобулинов G определяется по иммуноферментному анализу класс-специфическими антивидовыми антителами.The characteristic of a useful product. Hybridomas Sp2 / 0-BC / rhPC-4F10, Sp2 / 0-BC / rhPC-3H6 and Sp2 / 0-BC / rhPC-lC6 produce specific monoclonal antibodies to hPROC, the titer of which in the culture fluid (CL) is about 1: 90,000 , in an immunoascitic fluid (IAI) of at least 1: 200000. Monoclonal antibodies from QOL and IAG are isolated by fractional precipitation with ammonium sulfate followed by affinity chromatography on protein A- or protein G-sepharose. The homogeneity of the isolated antibodies is checked by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate. Belonging to the class of immunoglobulins G is determined by enzyme-linked immunosorbent assay with class-specific antispecies antibodies.
Продуктивность штаммов. Продукция МКА в среде культивирования составляет 20-50 мкг/мл при времени культивирования 72 ч и посевной концентрации гибридомы 0,3 млн кл/мл; в асцитической жидкости - 2-4 мг/мл. Продукция МКА в культуральной жидкости сохраняется на протяжении 12 последовательных пассажей и воспроизводится при прививании в виде асцитных опухолей на мышах.The productivity of the strains. The production of MCA in the cultivation medium is 20-50 μg / ml with a cultivation time of 72 hours and a seed hybridoma concentration of 0.3 million cells / ml; in ascitic fluid - 2-4 mg / ml. The production of MCA in the culture fluid is maintained for 12 consecutive passages and is reproduced by inoculation in the form of ascites tumors in mice.
Контаминация штамма. Контаминанты гибридных линий, включая бактерии и грибы (определение методом прямого посева на питательные среды LB и Сабуро-Эммонса), не обнаружены; микоплазма по ПЦР и флуоресцентному анализу не обнаружена; вирусы - нет данных.Strain contamination. Hybrid line contaminants, including bacteria and fungi (determination by direct culture on LB and Saburo-Emmons culture media) were not detected; Mycoplasma by PCR and fluorescence analysis was not detected; viruses - no data.
Криоконсервация производится аликвотами ресуспендированных клеток по 3×106 клеток/мл. Ампулы содержат 1,0 мл криозащитной среды, содержащей эмбриональной телячьей сыворотки - 90%, диметилсульфоксида - 10%.Cryopreservation is made by aliquots of resuspended cells at 3 × 10 6 cells / ml. Ampoules contain 1.0 ml of cryoprotective medium containing fetal calf serum - 90%, dimethyl sulfoxide - 10%.
Режим криоконсервации и отогрева. Гибридные клетки вносят в криоампулы, помещают в специальный контейнер с теплоносителем изопенталом и оставляют в низкотемпературном морозильнике на 3-4 часа. По достижении температуры минус 70°C криоампулы переносят в жидкий азот. Размораживание проводят быстро на водяной бане при температуре +37°C. Жизнеспособность восстанавливаемых гибридом после криоконсервации составляет 80-90%.Cryopreservation and heating mode. Hybrid cells are introduced into cryoampules, placed in a special container with isopental coolant and left in a low-temperature freezer for 3-4 hours. Upon reaching a temperature of minus 70 ° C, the cryo-ampoules are transferred to liquid nitrogen. Defrosting is carried out quickly in a water bath at a temperature of + 37 ° C. The viability of restored hybridomas after cryopreservation is 80-90%.
Полезным продуктом являются штаммы гибридом и продуцируемые ими моноклональные антитела, относящиеся к классу IgG иммуноглобулинов мыши, специфичные к hPROC и обладающие низкой кросс-реактивностью. Особенности полученных моноклональных антител (МКА) и результаты их практического применения изобретения приведены на следующих фигурах.A useful product are hybrid strains and the monoclonal antibodies produced by them, belonging to the IgG class of mouse immunoglobulins, specific for hPROC and having low cross-reactivity. Features of the obtained monoclonal antibodies (MCAs) and the results of their practical application of the invention are shown in the following figures.
Краткое описание рисунковBrief Description of Drawings
На Фиг.1 показано определение rhAPC твердофазным ИФА с использованием пар МКА 3H6 + IC6 и 4B12 + 4F10.Figure 1 shows the determination of rhAPC solid-phase ELISA using pairs of MCA 3H6 + IC6 and 4B12 + 4F10.
Практическая применимость заявляемого изобретения иллюстрируется следующими примерами, не ограничивающими каким-либо образом рамки настоящего изобретения.The practical applicability of the claimed invention is illustrated by the following examples, not limiting in any way the scope of the present invention.
Пример 1. Получение гибридомы.Example 1. Obtaining a hybridoma.
Иммунизация.Immunization.
Мышей линии BALB/c возраста 8-10 недель в количестве 8 штук иммунизируют rhAPC по схеме:8 to 10 week old BALB / c mice in an amount of 8 were immunized with rhAPC according to the scheme:
- внутрибрюшинное введение мышам 200 мкг rhAPC в полном адъюванте Фрейнда;- intraperitoneal administration to mice of 200 μg rhAPC in complete Freund's adjuvant;
- через 21 сутки повторное введение мышам 500 мкг rhAPC в неполном адъюванте Фрейнда;- after 21 days, repeated administration to mice of 500 μg rhAPC in incomplete Freund's adjuvant;
- через 35 суток внутривенная инъекция мышам 500 мкг rhAPC в неполном адъюванте Фрейнда;- after 35 days, an intravenous injection in mice of 500 μg rhAPC in incomplete Freund's adjuvant;
- через 42 суток отбор образцов крови из орбитального синуса, определение животных с наилучшим титром антител к протеину C в сыворотке по ИФА;- after 42 days, the selection of blood samples from the orbital sinus, determination of animals with the best titer of antibodies to protein C in serum by ELISA;
- выбранным животным еще через 7 суток производится бустерная внутривенная инъекция 200 мкг rhAPC в физиологическом растворе;- after 7 days, the selected animals are given an intravenous booster injection of 200 μg rhAPC in physiological saline;
- через 7 суток содержания бустированных мышей производится повторный отбор образцов крови из орбитального синуса на ИФА. Производится финальное бустирование животного с максимальным титром антител к rhAPC: внутривенная инъекция 200 мкг rhAPC в физиологическом растворе.- after 7 days of keeping boosted mice, re-sampling of blood from the orbital sinus for ELISA is performed. Final boosting of the animal is performed with the maximum titer of antibodies to rhAPC: intravenous injection of 200 μg rhAPC in physiological saline.
Через 3 дня после повторного бустирования производится сравнение титров поликлональных антител в сыворотке бустированных животных. Титры, то есть разведения сыворотки, при которых OD450=l составили для бустированного животного №1 1/82500, №2 1/19000, №3 1/615000. Для слияния первичной культуры спленоцитов с клетками миеломы Sp2/0-Agl4 выбрали животное №3.3 days after re-boosting, the titers of polyclonal antibodies in the serum of boosted animals are compared. Titers, that is, serum dilutions, at which OD 450 = l amounted for a boosted animal No. 1 1/82500, No. 2 1/19000, No. 3 1/615000. Animal No. 3 was chosen to fuse the primary culture of splenocytes with Sp2 / 0-Agl4 myeloma cells.
Гибридизация.Hybridization.
Через 3 суток после последней внутривенной инъекции животных убивают цервикальной дислокацией, асептически извлекают селезенку и проводят гибридизацию спленоцитов иммунных мышей (1.2×108 клеток) с клетками мышиной миеломы Sp2/0-Agl4 (3×107 клеток) в присутствии 1 мл 50% раствора полиэтиленгликоля (Sigma) с молекулярным весом 1450 в течение 1 минуты. Затем в течение 15 минут последовательными двойными разведениями доводят объем до 16 мл, добавляя по каплям безсывороточную среду RPMI-1640. Разведенную гибридизационную суспензию инкубируют 1 час при 37°C в 150 мл полной среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки.3 days after the last intravenous injection, the animals are killed by cervical dislocation, the spleen is aseptically removed, and splenocytes of immune mice (1.2 × 10 8 cells) are hybridized with Sp2 / 0-Agl4 mouse myeloma cells (3 × 10 7 cells) in the presence of 1
Селекция.Selection.
После инкубации клетки высевают на 96-луночные планшеты на слой культивируемых перитонеальных макрофагов, взятых у мышей линии BALB/c. Селекцию гибридных клеток проводят на селективной в среде с системой HAT (10 мМ гипоксантина, 40 мкМ аминоптерина, 1,6 мМ тимидина). Через 14 суток из состава среды убирают аминоптерин. В последующем культивирование проводят на среде A-DMEM/F-12 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/L-глутамина, 8 мкг/мл тилозина.After incubation, cells were plated on 96-well plates per layer of cultured peritoneal macrophages taken from BALB / c mice. The selection of hybrid cells is carried out on a selective HAT system medium (10 mM hypoxanthine, 40 μM aminopterin, 1.6 mM thymidine). After 14 days, aminopterin is removed from the medium. Subsequently, the cultivation is carried out on medium A-DMEM / F-12 with 10% fetal calf serum, 2 mm / L-glutamine, 8 μg / ml tylosin.
Оценка продуктивности первичных пулов.Primary Pool Productivity Assessment.
Для отбора положительных первичных пулов, продуцирующих МКА, используют прямой ИФА. Для проведения ИФА в лунки 96-луночного полистиролового планшета для ИФА вносят по 100 нг rhAPC в фосфатно-солевом буферном растворе (ФБР; рН=7.4; КН2РO4 1,7 мМ, Na2HPO4 5,2 мМ, NaCl 150 мМ) в объеме 100 мкл и затем выдерживают при температуре 6°C в течение 16 ч. Лунки планшета трижды отмывают фосфатно-солевым буферным раствором, содержащим 0,05% Твин-20 (ФБР-Тв). Вносят в лунки по 300 мкл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина в ФБР (1% БСА) и инкубируют при температуре 37°C в течение 60 мин. Три раза промывают лунки ФБР-Тв и вносят в лунки супернатант культуральной жидкости в объеме 100 мкл, при необходимости делая разведения в 1% БСА. Планшет инкубируют при температуре 37°C в течение 1 часа. После этого лунки планшета трижды отмывают раствором ФБР-Тв и добавляют в лунки антитела против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой хрена в рабочем разведении 1/3500. Планшет инкубируют при температуре 37°C в течение 60 минут, затем 5 раз отмывают лунки раствором ФБР-Тв. Положительную реакцию оценивают по развитию желто-коричневого окрашивания при добавлении хромогенного субстрата ТМБ (4 мкл 30% Н2O2, 4 мг 3,3',5,5-тетраметилбензидина на 100 мл 0,1 M натрий-цитратного буфера рН 5,0). Реакцию останавливают добавлением в лунки по 100 мкл 5% раствора Н3РO4. Измеряют оптическую плотность при длине волны λ=450 нм (OD450). Строят калибровочную кривую зависимости OD450 от концентрации заранее охарактеризованных антител к hPROC в диапазоне линейной чувствительности метода. Определяют титр исследуемых антител и аффинность проб.For the selection of positive primary pools producing ICA, direct ELISA is used. For ELISA, 100 ng of rhAPC in phosphate buffered saline (PBS; pH = 7.4; KH 2 PO 4 1.7 mM, Na 2 HPO 4 5.2 mM, NaCl 150 are added to the wells of a 96-well polystyrene ELISA plate) mM) in a volume of 100 μl and then kept at 6 ° C for 16 hours. The wells of the plate are washed three times with phosphate-buffered saline containing 0.05% Tween-20 (FBI-TV). Add 300 μl of 1% bovine serum albumin solution to the FBI (1% BSA) to the wells and incubate at 37 ° C for 60 minutes. Wash wells FBI-Tw three times and add supernatant of culture fluid to the wells in a volume of 100 μl, if necessary, make dilutions in 1% BSA. The plate is incubated at 37 ° C for 1 hour. After this, the wells of the tablet are washed three times with FBI-TV solution and antibodies against mouse immunoglobulins labeled with horseradish peroxidase in working dilution 1/3500 are added to the wells. The plate is incubated at 37 ° C for 60 minutes, then the wells are washed 5 times with FBI-Tw solution. A positive reaction is evaluated by the development of yellow-brown staining with the addition of a TMB chromogenic substrate (4 μl of 30% H 2 O 2 , 4 mg of 3.3 ', 5.5-tetramethylbenzidine per 100 ml of 0.1 M sodium citrate buffer pH 5, 0). The reaction is stopped by adding to the wells of 100 μl of a 5% solution of H 3 PO 4 . Measure the optical density at a wavelength of λ = 450 nm (OD 450 ). A calibration curve is constructed for the OD 450 versus the concentration of previously characterized anti-hPROC antibodies in the linear sensitivity range of the method. The titer of the studied antibodies and the affinity of the samples are determined.
По результатам прямого ИФА первичных пулов гибридом максимальный сигнал поликлональной колонии в ИФА составил OD450=3,304, 6 образцов имели сигнал OD450>2.0, при этом верхний 5% процентиль покрывал диапазон активности OD450=3,304-0,150. Для масштабирования было отобрано 48 колоний (т.е. лунок) с сигналом на ИФА OD450>0,100.According to the results of direct ELISA of primary hybridoma pools, the maximum signal of the polyclonal colony in ELISA was OD 450 = 3.304, 6 samples had an OD 450 > 2.0 signal, while the top 5% percentile covered the activity range OD 450 = 3.304-0.150. For scaling, 48 colonies (i.e., wells) were selected with a signal on ELISA OD 450 > 0.100.
Отобранные для масштабирования 48 поликлональных пулов в течение следующих 10 дней были масштабированы до культивационного объема 5 мл. Масштабированные до культивационного объема 5 мл колонии были тестированы на производство поликлональных антител к протеину C в двух последовательных тестах прямого ИФА с интервалом в 48 часов. Результаты представлены в Таблице 1.The 48 polyclonal pools selected for scaling over the next 10 days were scaled to a cultivation volume of 5 ml. 5 ml colonies scaled to a cultivation volume were tested for the production of polyclonal antibodies to protein C in two consecutive direct ELISA tests with an interval of 48 hours. The results are presented in Table 1.
Для дальнейшего клонирования были отобраны 4 первичных клона с максимальным сигналом на ИФА (OD450 от 0,257 до 2,265).For further cloning, 4 primary clones were selected with the maximum signal on ELISA (OD 450 from 0.257 to 2.265).
Пример 2. Клонирование и селекция, моноклональных гибридом секретирующих протеин C специфичные антитела.Example 2. Cloning and selection of monoclonal hybridomas secreting protein C specific antibodies.
Клонирование гибридных клеток проводили методом серийных разведений в 96-луночных планшетах на слое перитонеальных макрофагов из расчета 104 клеток на первую лунку и последующих двукратных разведений в вертикальном ряду, а затем в горизонтальных рядах. Детекцию МКА в лунках проводили прямым ИФА, как описано выше.Hybrid cells were cloned by serial dilutions in 96-well plates on a layer of peritoneal macrophages at the rate of 10 4 cells per first well and subsequent two-fold dilutions in a vertical row and then in horizontal rows. The detection of MCA in the wells was performed by direct ELISA, as described above.
Культивирование клонов гибридомы вели при температуре 37°C в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI-1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/L-глутамина, 8 мкг/мл тилозина.Hybridoma clones were cultured at a temperature of 37 ° C in an atmosphere containing 5% carbon dioxide. The cultivation medium is RPMI-1640 medium containing 10% fetal calf serum, 2 mM / L-glutamine, 8 μg / ml tylosin.
Клоны гибридомы криоконсервировали в среде замораживания, состоящей из 90% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% диметилсульфоксида по 1-3 млн клеток/мл. Процедура замораживания описана выше.Hybridoma clones were cryopreserved in a freezing medium consisting of 90% fetal calf serum and 10% dimethyl sulfoxide, 1-3 ml cells / ml. The freezing procedure is described above.
Отобранные по методике, описанной в примере 1, клеточные пулы с максимальным уровнем продукции антител были клонированы в предельных разведениях, было использовано по пять 96-луночных планшетов на 1 пул. Через 8 дней было обнаружено суммарно 23 лунки с одиночными колониями. Колонии были суспендированы пипетированием и пересажены в лунки 24-луночного планшета в культивационном объеме 1 мл/лунка.Selected according to the method described in example 1, the cell pools with the maximum level of antibody production were cloned at the maximum dilutions; five 96-well plates per 1 pool were used. After 8 days, a total of 23 wells with single colonies were detected. Colonies were suspended by pipetting and transplanted into the wells of a 24-well plate in a cultivation volume of 1 ml / well.
Через 7 дней после пересева было зафиксировано 7 лунок, для которых сигнал в прямом ИФА превышал OD450=1 и сохранялся при последующей культивации колоний в среде, содержащей HAT. Результаты ИФА первичных клонов приведены в таблице 2.7 days after reseeding, 7 wells were recorded for which the signal in the direct ELISA exceeded OD 450 = 1 and was preserved during subsequent cultivation of the colonies in a medium containing HAT. The results of ELISA of primary clones are shown in table 2.
Отобранные первичные клоны были масштабированы до объема 5 мл, часть клеток заморожена, остатки использованы для повторного клонирования, рассев проведен на 5 96-луночных планшетов для каждого клона.The selected primary clones were scaled to a volume of 5 ml, part of the cells were frozen, the residues were used for re-cloning, sieving was carried out on 5 96-well plates for each clone.
Через 8 дней после повторного клонирования было обнаружено суммарно 12 лунок с одиночными колониями. В последующие 14 дней было проведено ступенчатое масштабирование до культивационного объема 10 мл и определено 7 жизнеспособных клонов.8 days after re-cloning, a total of 12 wells with single colonies were detected. In the next 14 days, a stepwise scaling was carried out to a cultivation volume of 10 ml and 7 viable clones were determined.
Через 24 дня после второго клонирования было проведен прямой ИФА в присутствии ионов кальция и параллельный ИФА в присутствии ЭДТА для супернатантов клонов с временем культивирования 48 часов. Были зафиксированы 5 клонов второй генерации, продуцирующие МКА к протеину С человека с высоким титром и постоянным сигналом в присутствии и отсутствии ионов кальция (сигнал для ИФА с 2 мМ Са2+ OD450=2.165-1.571, сигнал с 2 мМ EDTA-Na >88%). Результаты ИФА представлены в таблице 3.24 days after the second cloning, direct ELISA was performed in the presence of calcium ions and parallel ELISA in the presence of EDTA for clone supernatants with a cultivation time of 48 hours. Five clones of the second generation were recorded, producing MCAs for human protein C with a high titer and a constant signal in the presence and absence of calcium ions (signal for ELISA with 2 mM Ca 2+ OD 450 = 2.165-1.571, signal with 2 mM EDTA-Na> 88%). The results of ELISA are presented in table 3.
Масштабированные клоны гибридом второй генерации были криопрезервированы, выживаемость после разморозки составила не менее 60% по окраске трипановым синим.Scaled clones of the second generation hybridomas were cryopreserved, the survival rate after defrosting was at least 60% by trypan blue staining.
Для выделения МКА с каждого конечного клона второй генерации было получено по 30 мл кондиционированной среды.To isolate MCA from each final clone of the second generation, 30 ml of conditioned medium was obtained.
Пример 3. Выделение, очистка и биотинилирование МКА.Example 3. Isolation, purification and biotinylation of MCA.
Для исследуемых 5 МКА проводили отделение глобулиновой фракции, аффинную хроматографическую очистку при помощи протеин G-сефарозы и обессоливание диализом. Для этого культуральную жидкость (48 ч культивирования) смешивали с насыщенным раствором сульфата аммония до 45% насыщения. Суспензию перемешивали и выдерживали 2 ч при температуре 4°C, а затем центрифугировали при 14500 м-1 в течение 20 мин. Удаляли супернатант, осадок растворяли в ФБР, 1/8 начального объема, отделяли осадок денатурированных белков повторным центрифугированием. Полученный супернатант повторно осаждали сульфатом аммония при насыщении 50%, осаждение-растворение повторяли дважды.For the studied 5 MCAs, the globulin fraction was separated, affinity chromatographic purification using protein G-Sepharose and desalination by dialysis were performed. For this, the culture fluid (48 h of cultivation) was mixed with a saturated solution of ammonium sulfate to 45% saturation. The suspension was stirred and kept for 2 hours at 4 ° C, and then centrifuged at 14500 m -1 for 20 minutes. The supernatant was removed, the precipitate was dissolved in PBS, 1/8 of the initial volume, the denatured protein precipitate was separated by repeated centrifugation. The resulting supernatant was re-precipitated with ammonium sulfate at a saturation of 50%, precipitation-dissolution was repeated twice.
Хроматографическую очистку проводили при помощи колонки с протеин G-сефарозой (GE Life Sciences, США) по протоколу производителя. Для удаления аминосодержащих соединений нейтрализованный элюат с колонки концентрировали при помощи ультрафильтрации в центрифужных пробирках Vivaspin 500 3 кДа (Сарториус Стедим, Германия) до объема 75 мкл, концентраты диализовали против ФБР на мембране с отсечением по седиментационной массе 7000 Да в течение 24 ч при температуре 4°C. Было приготовлено 5 препаратов очищенных МКА, концентрация белка в растворах составила для МКА из Sp2/0-BC/rhPC-4F10 370 мкг/мл, Sp2/0-BC/rhPC-lC6 250 мкг/мл, Sp2/0-BC/rhPC-2F8 77 мкг/мл, Sp2/0-BC/rhPC-3H6 93 мкг/мл, Sp2/0-BC/rhPC-4B 12 239 мкг/мл, объем образцов 75 мкл. Степень концентрирования относительно исходной среды составила 400х.Chromatographic purification was performed using a protein G-Sepharose column (GE Life Sciences, USA) according to the manufacturer's protocol. To remove amine-containing compounds, the neutralized eluate from the column was concentrated by ultrafiltration in Vivaspin 500 3 kDa centrifuge tubes (Sartorius Stedim, Germany) to a volume of 75 μl, the concentrates were dialyzed against the FBI on a membrane with a cut-off of 7000 Da for 24 h at 4 ° C. Five preparations of purified MAB were prepared, the protein concentration in solutions for MAB from Sp2 / 0-BC / rhPC-4F10 was 370 μg / ml, Sp2 / 0-BC / rhPC-lC6 250 μg / ml, Sp2 / 0-BC / rhPC -2F8 77 μg / ml, Sp2 / 0-BC / rhPC-3H6 93 μg / ml, Sp2 / 0-BC / rhPC-4B 12,239 μg / ml, sample volume 75 μl. The degree of concentration relative to the starting medium was 400x.
Полученные растворы очищенных МКА были разделены на 2 аликвоты объемами 20 мкл и 55 мкл. Меньшая аликвота была использована для модификации сульфо-N-гидроксисукцинимидбиотином (Sulfo NHS-LC-biotin, Пирс, США) в молярном соотношении 1:100 в ФБР при рН 7.0. Реакцию проводили в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем терминировали добавлением раствора Трис-HCl рН 7.5 до 50 мМ.The resulting solutions of purified MAB were divided into 2 aliquots with volumes of 20 μl and 55 μl. A smaller aliquot was used to modify the sulfo-N-hydroxysuccinimidibiotin (Sulfo NHS-LC-biotin, Pierce, USA) in a 1: 100 molar ratio in the FBI at pH 7.0. The reaction was carried out for 1 hour at room temperature, and then terminated by adding a solution of Tris-HCl pH 7.5 to 50 mm.
Для определения сохранности аффинности МКА при выделении и конъюгации сравнивали образцы исходных кондиционированных сред в разведении 1/400, полученные препараты очищенных МКА в разведении 1/16000 (т.е. предположительно в одинаковой концентрации) и биотинилированные МКА в разведении 1/160000. Тестирование проводилось методом прямого ИФА по методике, приведенной в примере 1 с использованием конъюгата антивидовых антител с пероксидазой хрена (антимышь - ПХ) и конъюгата нейтравидина и пероксидазы хрена (Neu-ПХ, Pierce, США). Результаты представлены в таблице 4. По полученным данным был сделан вывод о том, что биотинилированные МКА применимы в качестве элемента аналитической системы только для клонов гибридом 4F10 и 1С6, при этом в качестве адсорбционных антител можно использовать МКА гибридом 1С6, 3H6 и 4B12. Полные названия соответствующих клонов гибридом: Sp2/0-BC/rhPC-4F10 и т.д.To determine the preservation of the affinity of MCA during isolation and conjugation, samples of the source conditioned media in a dilution of 1/400, the obtained preparations of purified MCAs in a dilution of 1/16000 (i.e., presumably at the same concentration) and biotinylated MCAs in a dilution of 1/160000 were compared. Testing was carried out by direct ELISA according to the procedure described in example 1 using a conjugate of antispecies antibodies with horseradish peroxidase (anti-mouse - HRP) and a conjugate of neutravidin and horseradish peroxidase (Neu-HR, Pierce, USA). The results are presented in table 4. According to the data obtained, it was concluded that biotinylated MABs are applicable as an element of the analytical system only for 4F10 and 1C6 hybrid clones, while 1A6, 3H6 and 4B12 hybridomas can be used as adsorption antibodies. The full names of the corresponding clones of the hybrid: Sp2 / 0-BC / rhPC-4F10, etc.
Таким образом, возможный набор аналитических реагентов на основе полученных МКА к протеину C включает в себя биотинилированные МКА в качестве детекционного реагента и немодифицированные очищенные антитела для адсорбции антигена в непрямом тИФА анализе.Thus, a possible set of analytical reagents based on the obtained MCAs for protein C includes biotinylated MCAs as a detection reagent and unmodified purified antibodies for antigen adsorption in indirect ELISA.
Пример 4. Определение чувствительности системы детекции протеина C на основе пар МКА.Example 4. Determination of the sensitivity of the protein C detection system based on MCA pairs.
Определение чувствительности прототипов системы детекции протеина C, то есть пар МКА, проводили при помощи непрямого ИФА по схеме "сендвич". Для этого в лунки 96-луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа наносили "адсорбционные" антитела в ФБР в концентрации 4 мкг/мл, по 100 мкл на лунку и выдерживали при температуре 4°C в течение 16 часов. Затем, после блокировки неспецифической адсорбции раствором 1% БСА в ФБР в течение 1 ч, в лунки вносили по 100 мкл раствора рекомбинантного активированного протеина С в 1% БСА в концентрации от 78 нг/мл до 10 мкг/мл, двукратными разведениями (нормальная концентрация протеина C в плазме крови человека - 4 мкг/мл). Последующие стадии анализа проводили аналогично стадиям, описанным для скрининга клонов гибридом. Биотинилированные МКА использовали в разведении 1/1000, Neu-ПХ в разведении 1/8000. В качестве отрицательного контроля вместо биотинилированных МКА использовали сыворотку интактной мыши в разведении 1/1000.The sensitivity of the prototypes of the protein C detection system, that is, pairs of MCAs, was determined using indirect ELISA according to the sandwich scheme. To do this, in the wells of a 96-well polystyrene plate for enzyme-linked immunosorbent assay "adsorption" antibodies were applied in the FBI at a concentration of 4 μg / ml, 100 μl per well and kept at 4 ° C for 16 hours. Then, after blocking nonspecific adsorption with a solution of 1% BSA in the FBI for 1 h, 100 μl of a solution of recombinant activated protein C in 1% BSA at a concentration of 78 ng / ml to 10 μg / ml, in two dilutions (normal concentration) was added to the wells protein C in human plasma - 4 μg / ml). Subsequent analysis steps were carried out similarly to the steps described for screening hybrid clones. Biotinylated MCAs were used in 1/1000 dilutions, Neu-HR in 1/8000 dilutions. 1/1000 diluted intact mouse serum was used as a negative control instead of biotinylated MCAs.
Было показано, что при такой постановке реакции биотинилированные МКА клона 4F10 специфически взаимодействуют с активированным протеином C, при этом предел обнаружения антигена много ниже 0,15 мкг/мл при использовании в качестве адсорбционных антител МКА гибридом 1С6 и 3H6 (фиг.1).It was shown that with this formulation of the reaction, the biotinylated MCA of clone 4F10 specifically interact with activated protein C, while the detection limit of the antigen is much lower than 0.15 μg / ml when MCA hybridomas 1C6 and 3H6 are used as adsorption antibodies (Fig. 1).
Эти свойства моноклональных штаммов Sp2/0-BC/rhPC-4F10, Sp2/0-BC/rhPC-lC6 и Sp2/0-BC/rhPC-3H6, а также взаимодействие продуцируемых ими МКА с протеином C человека свидетельствует о возможности использования данных МКА для получения иммуноаффинных реагентов для количественного анализа протеина C.These properties of the monoclonal strains Sp2 / 0-BC / rhPC-4F10, Sp2 / 0-BC / rhPC-lC6 and Sp2 / 0-BC / rhPC-3H6, as well as the interaction of their produced MKA with human protein C indicates the possibility of using MKA data to obtain immunoaffinity reagents for the quantitative analysis of protein C.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010145028/10A RU2445365C1 (en) | 2010-11-03 | 2010-11-03 | Mus musculus cultivated hybrid cell strain producer of monoclonal antibodies specific to human protein c (versions) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010145028/10A RU2445365C1 (en) | 2010-11-03 | 2010-11-03 | Mus musculus cultivated hybrid cell strain producer of monoclonal antibodies specific to human protein c (versions) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2445365C1 true RU2445365C1 (en) | 2012-03-20 |
Family
ID=46030121
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010145028/10A RU2445365C1 (en) | 2010-11-03 | 2010-11-03 | Mus musculus cultivated hybrid cell strain producer of monoclonal antibodies specific to human protein c (versions) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2445365C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5549893A (en) * | 1991-05-14 | 1996-08-27 | Immuno Aktiengesellschaft | Use of protein C in the treatment of purpura fulminans |
| EP0913156A1 (en) * | 1997-10-20 | 1999-05-06 | Eli Lilly And Company | Methods for treating hypercoagulable states or acquired protein C deficiency |
| RU2345789C2 (en) * | 2002-05-01 | 2009-02-10 | Шеринг Акциенгезельшафт | New tissue factor antibodies as anticoagulants |
-
2010
- 2010-11-03 RU RU2010145028/10A patent/RU2445365C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5549893A (en) * | 1991-05-14 | 1996-08-27 | Immuno Aktiengesellschaft | Use of protein C in the treatment of purpura fulminans |
| EP0913156A1 (en) * | 1997-10-20 | 1999-05-06 | Eli Lilly And Company | Methods for treating hypercoagulable states or acquired protein C deficiency |
| RU2345789C2 (en) * | 2002-05-01 | 2009-02-10 | Шеринг Акциенгезельшафт | New tissue factor antibodies as anticoagulants |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TWI702226B (en) | Integrated continuous manufacturing of therapeutic protein drug substances | |
| JPH0636741B2 (en) | Method for separating human protein C | |
| JPS60120825A (en) | Antiprotein c monoclonal antibody and hybridoma producing the same | |
| JP5984670B2 (en) | Reagent for FDP measurement, reagent kit, and measurement method | |
| US20190316133A1 (en) | Anti-Fibrinogen Aptamers and Uses Thereof | |
| EP0162078A4 (en) | METHOD FOR ISOLATING A PROTEIN FROM A MIXTURE CONTAINING THIS PROTEIN, USING A INFORMATION-SPECIFIC ANTIBODY. | |
| EP0285511B1 (en) | Immunoassay of thrombomodulin | |
| JP2022519807A (en) | Anticoagulation factor XI active factor XIa antibody and its preparation method and use | |
| US20190161756A1 (en) | Anti-Immunoglobulin G Aptamers and Uses Thereof | |
| KR100207351B1 (en) | Antibody against human plasmin-alpha 2-plasmin inhibitor complex, hybridoma and immunoassay | |
| RU2445365C1 (en) | Mus musculus cultivated hybrid cell strain producer of monoclonal antibodies specific to human protein c (versions) | |
| NO171169B (en) | MONOCLONAL ANTIBODIES OR FRAGMENTS THEREOF, SPECIFIC TO ALFA2 PLASMIN INHIBITOR | |
| JP4448754B2 (en) | D-dimer measurement reagent and monoclonal antibody used therefor | |
| JPS63123395A (en) | Anti-pci monoclonal antibody | |
| RU2455360C1 (en) | CULTIVATED HYBRID CELL STRAIN OF MOUSE Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO HUMAN PROTEIN C, MONOCLONAL ANTIBODY SPECIFIC TO HUMAN PROTEIN C AND IMMUNOSORBENT FOR HUMAN PROTEIN C SORPTION CONTAINING MONOCLONAL ANTIBODY | |
| FI86255C (en) | Monoclonal antiurokinase antibody, containing matrix and biochemical test gaskets in which it was used | |
| KR100583537B1 (en) | Monoclonal antibodies specific for activated coagulation factor GII and uses thereof | |
| RU2768838C1 (en) | Strain of hybrid cultured cells mus musculus 365e11 producing monoclonal antibodies to shiga-like toxin type ii | |
| US6258938B1 (en) | Method for the purification and isolation of blood clotting proteins using conformation specific antibodies | |
| CN103966173B (en) | Hybridoma cell, monoclonal antibody generated by hybridoma cell and application of monoclonal antibody | |
| RU2584582C1 (en) | Monoclonal antibody ss3-4 to conformation human epitope c3, strain of hybrid mouse dna rkkk(p)764d - producer of monoclonal antibody ss3-4 | |
| RU2451071C1 (en) | Mus musculus cultivated hybrid cell strain producer of monoclonal antibodies specific to human recombinant erythropoietin (versions) | |
| SU1514769A1 (en) | Strain of hybrid cultivable mus musculus cells as producer of monoclonal antibodies to human single-chain activator of plasminogene of urokinase type | |
| US6365155B1 (en) | Ancrod-specific monoclonal antibodies, antibody fragments, mixtures or derivatives thereof and use of the same | |
| RU2342428C1 (en) | Strain of hybrid cultured animal cells-producer of rat monoclonal antibodies to hypoglycosylated and deglycosylated isoforms of tumours associated with human muci antigen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20120723 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20161104 |