SU1514769A1 - ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ: КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ ΜΙΙ5 МиЗОТ ПК-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОМУ АКТИВАТОРУ ПЛАЗМИНОГЕНА УРОКИНАЗНО - Google Patents
ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ: КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ ΜΙΙ5 МиЗОТ ПК-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОМУ АКТИВАТОРУ ПЛАЗМИНОГЕНА УРОКИНАЗНО Download PDFInfo
- Publication number
- SU1514769A1 SU1514769A1 SU874361768A SU4361768A SU1514769A1 SU 1514769 A1 SU1514769 A1 SU 1514769A1 SU 874361768 A SU874361768 A SU 874361768A SU 4361768 A SU4361768 A SU 4361768A SU 1514769 A1 SU1514769 A1 SU 1514769A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- strain
- urokinase
- cells
- prourokinase
- monoclonal antibodies
- Prior art date
Links
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 title claims description 18
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 title claims description 18
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 title claims description 17
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 title 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 title 1
- 108010073863 saruplase Proteins 0.000 claims description 23
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 4
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 claims description 4
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 claims description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 4
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 claims description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 4
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims description 3
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 claims description 2
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 claims description 2
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000012432 Collagen Type V Human genes 0.000 claims 1
- 108010022514 Collagen Type V Proteins 0.000 claims 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims 1
- 235000019988 mead Nutrition 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000003625 amylolytic effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920006327 polystyrene foam Polymers 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
ГО ТИПА
(57) Изобретение относится к гибридом-, ной технологии. Цель изобретения получение нового штамма культивируемых
2
клеток, продуцирующего моноклональные антитела (монАТ) к человеческой проурокиназе, способных ингибировать ее ферментативную активность. Штамм получен путем иммунизации мышей человеческой урокиназой, гибридизацией клеток селезенки с клетками миеломы мыши X 63.Ρ3/Αβ.8.653. Штамм дейонирован под номером ВСКК (II) № 150ϋ.
Штамм продуцирует монАТ-иммуноглобулины мыши класса С. Продукция монАТ сохраняется в течение 40 пассажей. Секреция монАТ на 3-4 день культивирования варьируется в пределах 130 мкг/мл культуральной среды и 1030 мг/мл асцитной жидкости. МонАТ, е иммобилизованные на сефарозе, могут быть использованы для одностадийного выделения проурокиназы из культуральной среды. 2 табл.
Изобретение относится к гибридомной технологии.
Цель изобретение - получение нового штамма культивируемых клеток, продуцирующего моноклональные антитела к человеческой проурокинаэе, способных ингибировать ее ферментативную активность.
Штамм получают следующим образом.
Мышей линии ΒΑΙΒ/С иммунизируют подкожно введением 30 мкг человеческой урокиназы в 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда.Через 10-20 дн после первого введения проводят дополнительные иммунизации аналогичным образом. Четвертую иммунизацию проводят, вводя внутрибрюшинно (в/бр) 50 мкг урокина1514769 А1
зы в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) , содержащем 5 мМ ЫаН.РО. , ’ ,140 мМ ЦаС1, рН 7,4. Через 3 дн после последней иммунизации иммунных мышей забивают, 15х10Т клеток селезенки гибридизируют с 5x10 клеток миеломы мыши Χ63.Ρ3/Αβ.8.653 в течение 1 мин в присутствии 0,7 мл раствора, содержащего 45 об.% полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол.массы 1000 и 15Ζ диметилсульфоксида в ЗФР. После Гибридизации и отмывки клеток средой ДМЕМ от ПЭГ клетки высевают в 96-луночные панели по 1x10У клеток в лунку.
Для культивирования и селекции
гибридов используют среду ДМЕМ с добавлением 20% эмбриональной телячьей
1514769
сыворотки, 2 мМ ί-глуч амина, 10 мМ
пирувата натрия, 100 мкг/мл канамицина, 5 мкг/мл фунгизона0,05 мМ 2-меркаптоэтанола и 0,15% гидрокарбоната
натрия, 100 мкМ гипоксантина,
0,4 мкМ аминоптерина и 1 6 мМ тимидина, в атмосфере 5%-ного углекислого газа при 37°С.
С помощью иммуноферментного метода ю отбирают гибриды по способности продуцировать антитела к проурокиназе. Отобранные гибриды дважды клонируют методом конечных разведений. После повторного клонирования практически 15 100% субклонов продуцируют антитела к проурокинаэе. Продукция этих антител сохраняется, по крайней, мере, до 40 пассажа. Гибридома получила условное название иыС-4. 20
Культуральные признаки. Стандартные условия культивирования. Среда ДМЕМ с бикарбонатом и 20% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ Ь-глутамина, 2 мМ пирувата натрия, 25
100 мкг/мл канамицина, 5 мкг/мл фунгиэона,0,05 мМ 2-меркаптоэтанола при 37°С в атмосфере 5%-ного углекислого газа. Для выращивания штамма используют пластиковую посуду. Посевная 30 доза 100 тыс.клеток в 1 мл. Плотность в монослое 106 клеток на 1 мл. Клетки пассируют в дозе 100 тыс. в 1 мл 1 раз в 5 дн или в дозе 200 тыс. в 1 мл и более - 1 раз в 3 дн. Культу- 35 ра суспензионная, в микрообъемах может выращиваться как монослойная, Культивирование в организме животных. Интактным мышам линии ВА1В/С за 10 дн до инъекции штамма вводят по 0,5 мл .40 прйстана в/бр. Штамм инъецируют в/бр. по 1-5x106 клеток в 1 мл среды Игла. Асцит образуется через 8-10 дн. Возможна по крайней мере двухкратная перевивка штамма с сохранением про- 45 дукции антител.
Продуктивность штамма. Секреция моноклональных антител на 3-4 дн культивирования зависит от посевной дозы и варьирует в диапазоне 1-30 мкг/мл культуральной среды и 10-30 мг/мл асцитной жидкости.
I
Характеристика полезного продукта штамма. Штамм продуцирует моноклональные антитела - иммуноглобулины мыши класса С. Эти антитела специфически связываются с человеческой проурокиназой. Взаимодействие не сопровождается ингибированием ферментативной активности проурокиназы. В пределах чувствительности использованных методов не обнаружено связывание с человеческими альбумином, фибриногеном и коллагенами I, III, IV, V типов. Показано наличие перекрестной реакции с урокиназой. Присутствие плазмы крови не влияет на взаимодействие моноклональных антител с проурокиназой .
Методы оценки сохранения специфичности .
Иммуноферментный метод (ЕЫ5А) .
В качестве антигена используют иммобилизованные на подложку из полистирола человеческие коллагены I, III, IV, V типов, альбумин, фибриноген, фибронектин, проурокиназу и урокиназу. Степень чистоты исследуемых антигенов, проверяющаяся электрофоретически, составляет более 95%, связывание моноклональных антител с исследуемыми антигенами определяют с помощью антител против иммуноглобулинов мыши.
I
Криоконсервирование. Клетки штамма консервируют по 1х106 клеток/мл коровьей эмбриональной сыворотки с добавлением 10% диметилсульфоксида в пластиковых ампулах. Замораживание ампул проводят в коробке из вспененного полистирола с толщиной стенок 1 см. Коробку с ампулами оставляют при -70°С и через 1 сут переносят ампулы в жидкий азот для хранения. Размораживание проводят быстро в водяной бане при 37вС. Жизнеспособность после размораживания по включению трипанового синего 60%.
Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды.
Пример 1. Определение связывания антител ϋΝΟ-4 с коллагенами I, ИД, IV и V типов, фибриногеном, альбумином, фибронектином, урокиназой и проурокиназой человека.
На дно ячеек 96-ячеечной полистироловой панели сорбируют белки, с которыми определяют связывание антител. Для этого в ячейки вносят по 50 мкл раствора белка в 200 мМ бикарбонатном буферном растворе, рН 9,0 с концентра цией 10 мкг/мл и оставляют на 16 ч. при 4 С. После пятикратной промывки
1 514 769
6
забуферовным физпологическим раствором (ЗФРТ), содержащим 5 мМ ИаН^РО^,
140 мМ МаС1, 0,057 твина 20, рН 7,4, в ячейки вносят по 50 мк.ч культураль- $ ной среды от штамма υΝΟ-4 или раствора ЗФРТ, содержащих моноклональное антитело в различной концентрации, и инкубируют 30 мин при 37°С. Несвязавшиеся антитела отмывают ЗФРТ 5 раз. 10 В ячейки вносят ковалентно связанные с пероксндазон хрена антитела кролика против иммуноглобулинов мыши в концентрации 2 мкг в 1 мл в 50 мкл раст-. вора ЗФРТ, Через 30 мин инкубации 15
при 37°С несвязавшиеся антитета отмывают указанным способом, а количество оставшейся в ячейках пероксидазы, пропорционально количеству молекул антител υΝΟ-4, определяют по расщепле-20 нию субстрата для пероксидазы (Н^0г) в присутствии хромогена - ортофенилендиамина. Реакцию останавливаю!’ добавлением 507 серной кислоты до конечной концентрации 57. 25
Положительная реакция проявляется изменением окрашивания от желтого до коричневого и просчитывается на спектрофотометре при длине волны 490 нм. Результаты исследований пред- 30 ставлены в табл. 1. Приведенные в табл. 1 цифры - средние величины из не менее, чем трех зависимых определений, выраженные в единицах оптической плотности при длине волны 35
490 нм. Результаты первого примера свидетельствуют о высокой специфичности взаимодействия антител с проурокиназой в диапазоне исследованных концентраций. 40
Пример 2. Ингибирование фибринолитической активности проурокиназы моноклональными антителами υΝ0-4.
Проурокиназу или урокиназу в концентрации 1 мкг в 1 мл (87 междуна- 45 родных единиц активности (МЕА) в 1 мл для урокиназы и 50 МЕА в 1 мл для проурокиназы) инкубируют в ЗФР, содержащем 50 мг БСА в 1 мл ЗФР,
30 мин при 37°С в присутствии υΝΟ-4 50 или иммуноглобулинов С (1§С) мыши в различной концентрации. После инкубации по 10 мкл исследуемых растворов наносят на фибриновую пластину и выдерживают 16 ч при 37°С. Диаметр 55 зон лизиса на фибриновой пластине пропорционален активности активатора плазминогена. Результаты экспериментов представлены в табл. 2. Приведенные в табл. 2 цифры - средние величины зон лизиса из трех независимых определений, выраженные в миллиметрах
Результаты примера свидетельствуют, что антитела υΝΟ-4 в диапазоне исследованных концентраций ингибируют ферментативную активность проурокиназы, но не влияют на активность урокиназы. Для проурокиназы связывание, а следовательно, ингибирование обратимо, так как при элюции проурокиназы с иммобилизованных МА υΝΟ-4 активность проурокиназы сохраняется.
Пример 3. Использование моноклональных антител υΝΟ-4 для вьщеления проурокиназы из культуральных сред.
Моноклональные антитела 13Ν0-4 иммобилизуют на ΒΓθΝ-активированную сефарозу. Через 200 мкл полученного сорбента пропускают 10 мл культуральной среды от эмбринальных клеток почки человека, культивируемых ϊη νϊϋτο, содержащей проурокиназу в количестве 200 МЕА в 1 мл. Элюцию проводят раствором 0,1 М ацетата натрия с 0,4М хлоридом натрия, рН 2,5, с последующей нейтрализацией элюата трисом до рН 7,0. Амилолитическую активность проскоков и элюатов анализируют с помощью низкомолекулярного субстрата для урокиназы до и после активации проскоков плазмином.^Появление активности только после активации плазмином (т.е. после превращения проурокиназы в урокиназу) свидетельствует об отсутствии в среде урокиназы. В качестве стандарта используют урокиназу из мочи человека (87 000 МЕА/мг).
Из этого примера следует, что моноклональное антитело, иммобилизованное на сефарозу, может быть использовано для одностадийного выделения проурокинаэы из культуральной среды.
Результаты приведенных примеров однозначно свидетельствуют о высокой специфичности моноклонального антитела υΝΟ-4, вырабатываемого штаммом υΝΟ-4, показывают, что это антитело способно при взаимодействии с проурокиназой ингибировать ее ферментативную активность, но не влиять на ферментативную активность урокиназы, что может быть применено при исследовании механизма действия проурокиназы. мд υΝΟ-4 в иммобилизованном .состоянии пригодны для одностадийного
1514769
№ 150Ώ - продуцент моноклональных
выделения проурокиназы из кондиционированных сред.
Claims (1)
- Формула изобретенияШтамм гибридных культивируемыхклеток животных Мид тидси!ид ВСКК(П)антител к человеческому одноцепочеч,ному активатору плазминогена урокина зного типа.Концентрация антител, мкг/млТаблица 1Определение специфичности связывания монАТАнтиген
,0 "Γ“ϊ | 1,25 |0.62 Коллаген I типа 0,020 0,010 о о о 0,010 0,010 Коллаген III ти- па 0,020 0,010 0,010 0,010 0,010 Коллаген IV ти- па 0,020 0,010 0,010 0,010 0,010 Коллаген V типа 0,030 0,020 0,010 0,010 0,010 Фибриноген 0,020 0,010 0,010 0,010 0,010 Фибронектин 0,020 0,010 0,010 0,010 0,010 Альбумин 0,020 0,010 0,010 0,010 0,010 Урокиназа 0,750 0,740 0,710 0,650 0,310 Проурокиназа 0,800 0,780 0,760 0,690 0,380 Таблица 2Определение ингибиции фибринолитической активности проурокиназыКонцентрация мкг/мл антител, 100 Г5» г 25 12,5 6,25 Урокиназа + МА 15 16 16 15 16 Урокиназа + 16 15 16 16 15 Проурокиназа + МА 0 2 2 3 5 Проурокиназа + 12 13 12 12 13 ν
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU874361768A SU1514769A1 (ru) | 1987-12-02 | 1987-12-02 | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ: КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ ΜΙΙ5 МиЗОТ ПК-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОМУ АКТИВАТОРУ ПЛАЗМИНОГЕНА УРОКИНАЗНО |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU874361768A SU1514769A1 (ru) | 1987-12-02 | 1987-12-02 | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ: КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ ΜΙΙ5 МиЗОТ ПК-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОМУ АКТИВАТОРУ ПЛАЗМИНОГЕНА УРОКИНАЗНО |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1514769A1 true SU1514769A1 (ru) | 1989-10-15 |
Family
ID=21348960
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU874361768A SU1514769A1 (ru) | 1987-12-02 | 1987-12-02 | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ: КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ ΜΙΙ5 МиЗОТ ПК-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОМУ АКТИВАТОРУ ПЛАЗМИНОГЕНА УРОКИНАЗНО |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| SU (1) | SU1514769A1 (ru) |
-
1987
- 1987-12-02 SU SU874361768A patent/SU1514769A1/ru active
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SU1514769A1 (ru) | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ: КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ ΜΙΙ5 МиЗОТ ПК-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОМУ АКТИВАТОРУ ПЛАЗМИНОГЕНА УРОКИНАЗНО | |
| SU1521776A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент моноклонального антитела, нейтрализующего биологическую активность человеческого фактора некроза опухолей-альфа | |
| SU1500669A1 (ru) | ыгБФФ їЛєЧЛјИпз ТлОогЛВЛЧлЕФпз ТОЕгЦТ мЛВЦгИпз Фдв ФдвГдУдв ` ЬЧЦјл»ЕИг ФЦИЦТОЦИБОоИпз БИгЛгЕО Т юЕОЦВЕюЕГТЦФл ЦјИЦ»ЕЬЦюЕюИЦФл БТгЛВБгЦЧл ЬОБъФЛИЦїЕИБ лЧЦТЛИБъИЦїЦ гЛЬБ | |
| SU1514768A1 (ru) | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ клеток животных ми5 миБсиьи5-продуцент моноклонального антитела к ре2 КОМБИНАНТНОМУ ФАКТОРУ НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ-БЕТА ЧЕ | |
| RU2271010C2 (ru) | Способ иммуноферментного анализа для определения фактора виллебранда, моноклональное антитело к фактору виллебранда (варианты) и штамм гибридных культивируемых клеток животных mus. musculus l. - продуцент моноклональных антител к фактору виллебранда (варианты) | |
| SU1602867A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, используемый дл получени моноклональных антител к человеческому коллагену I и III типа | |
| SU1315473A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток мыши @ @ ,используемый дл получени моноклональных антител к ангиотензинпревращающему ферменту легких человека | |
| SU1530638A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент моноклонального антитела к фактору некроза опухолей - альфа человека | |
| SU1555360A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS.мUSсULUS, используемый дл получени моноклональных антител к @ -субъединице гонадотропных гормонов человека | |
| JPH06121695A (ja) | 抗ヒトマンノース結合蛋白モノクローナル抗体およびその利用 | |
| SU1312097A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток мыши @ @ ,используемый дл получени моноклональных антител к ангиотензин-превращающему ферменту легких человека | |
| SU1362746A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток мыши MUS мUSсULUS,используемый дл получени моноклональных антител к поверхости эндотелиальных клеток пупочной вены человка | |
| SU1507791A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS-продуцент моноклонального антитела к фактору некроза опухолей-альфа человека | |
| SU1712412A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L - продуцент моноклонального антитела к пирофосфатазе ЕSснеVIнIа coLI | |
| RU2265051C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l. pkkk (п) 679d-продуцент моноклональных антител, специфичных к белково-полисахаридному антигену yersinia enterocolitica о3 и о9 сероваров | |
| SU1308625A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток мыши @ @ ,используемый дл получени моноклональных антител к ангиотензинпревращающему ферменту легких человека | |
| RU2445365C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus - продуцент моноклональных антител, специфичных к протеину с человека (варианты) | |
| SU1381158A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток мыши MUS мUSсULUS,используемый дл получени моноклональных антител к урокиназе человека | |
| SU1602866A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, используемый дл получени моноклональных антител к человеческому коллагену IY типа | |
| SU1446154A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS,используемый дл получени моноклональных антител к мембранному белку ЕSснеRIснIа coLI в препарате рекомбинантного интерлейкина-2 человека | |
| SU1666532A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L., продуцирующий моноклональные антитела к нуклеокапсидному белку коронавируса крупного рогатого скота | |
| SU1384614A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток мыши мUS мUSсULUS,используемый дл получени моноклональных антител к урокиназе человека | |
| SU1710577A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к инсулину человека | |
| RU1778184C (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток MUS мUSсULUS L., используемый дл получени моноклональных антител к легким цеп м иммуноглобулинов кролика | |
| RU2117042C1 (ru) | Штамм культивируемых гибридных клеток животного mus musculus - продуцент моноклонального антитела к термостабильному компоненту капсулоподобной субстанции возбудителя мелиоидоза |